CN115990136A - 一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种药物制剂技术领域，具体是涉及一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途，包括阿帕替尼和日蟾毒它灵，本发明将阿帕替尼与日蟾毒它灵复配，有效的提高了抗肿瘤的效果，特别是在效果提升的同时，还有效的降低了阿帕替尼剂量，实现了剂量降低的同时提升药效的目的。本发明的阿帕替尼与日蟾毒它灵复配时，日蟾毒它灵的用量仅仅为阿帕替尼的很小一部分，就可以有效的提高药效，且在药效相同时，复配后的组合物中阿帕替尼的剂量明显低于单独的阿帕替尼的剂量，实现降剂量增效的目的。

Description

一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途

技术领域

本发明属于一种药物制剂技术领域，具体是涉及一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途。

背景技术

阿帕替尼(Apatinib)(Apa)，又名艾坦，是全球第一个在晚期胃癌被证实安全有效的小分子抗血管生成靶向药物，也是晚期胃癌靶向药物中唯一一个口服制剂，同时也是被证实在晚期胃癌标准化疗失败后安全有效的口服药物。经大量的临床研究表明，通过抑制肿瘤组织新血管的生成，艾坦能够显著延长晚期胃癌患者生存期。然而单一口服阿帕替尼的生物利用度较差，为此常常需要采用高剂量(850mg/d)治疗手段来提高临床治疗效果，这不仅给患者带来沉重的经济压力，也在一定程度上提高了药物的毒副作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抗肿瘤组合物、纳米制剂、制备方法和用途。

本发明实施例提供一种抗肿瘤组合物，包括阿帕替尼和日蟾毒它灵，可以由阿帕替尼和日蟾毒它灵组成。

一个实施例中，阿帕替尼和日蟾毒它灵的摩尔比为600-700:1，优选为667:1。

本发明实施例提供一种纳米制剂，包括负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒，包裹阿帕替尼的脂质体，以及靶向剂。

其中，负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒位于包裹阿帕替尼的脂质体的内部，靶向剂黏附在包裹阿帕替尼的脂质体的外部。

所述靶向剂优选为磷脂化的透明质酸，其他靶向剂，比如具有主动靶向能力的多肽，如核酸适配体或杂化细胞膜。其中，所述负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒和包裹阿帕替尼的脂质体的总重量为磷脂化的透明质酸的重量的4倍。

纳米制剂的粒径为100～120nm。

本发明实施例提供一种纳米制剂的制备方法，步骤为，将磷脂化的透明质酸和纳米颗粒混合，得到纳米制剂，所述纳米颗粒的制备方法为，将负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液和包裹阿帕替尼的脂质体混合，离心，洗涤，得到纳米颗粒。

负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液和包裹阿帕替尼的脂质体混合后，超声处理，探头超声的功率为20W，超声时间为1min，静置时间为20min。所述离心的转速为16000rpm，离心温度为24℃，离心时间为30min，洗涤的次数为3次。

透明质酸和卵磷脂的质量比为1:4。卵磷脂是指包裹阿帕替尼的脂质体中的卵磷脂。

一个实施例中，所述负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液的制备方法为，将日蟾毒它灵溶液和普鲁士蓝纳米颗粒混合，离心，溶解，得到负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液。所述日蟾毒它灵和普鲁士蓝的质量比为1:1-10。

负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液的溶剂为水，将负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒和水混合，超声处理，得到。超声处理的功率为20-40W，所述的探头超声时间为1min，所述探头超声反应温度为25℃～30℃。

本申请的负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒，负载率达到32％。

一个实施例中，所述包裹阿帕替尼的脂质体的制备方法为，将胆固醇、卵磷脂、磷脂-聚(2-乙基-2-噁唑啉)(DSPE-PEO)、阿帕替尼和溶剂混合，减压蒸馏，得到包裹阿帕替尼的脂质体。包裹阿帕替尼的脂质体中，阿帕替尼的包封率可达95％。

卵磷脂：胆固醇：DSPE-PEO：阿帕替尼的质量比为8：1：2：(1～2)，溶剂为三氯甲烷。

减压蒸馏的同时进行旋转蒸发，温度为40℃，转速为45rpm，保持烧瓶内液面在水浴锅液面以下2～3cm。

磷脂化的透明质酸的制备方法为，将透明质酸水溶液在活化剂(活化剂为EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，NHS(N-羟基丁二酰亚胺))作用下搅拌，时间优选为30min-1h，加入磷脂聚乙二醇氨基，搅拌，混合液依次经透析，冷冻干燥，得到磷脂化的透明质酸。所述透明质酸与所述磷脂聚乙二醇氨基的质量比为1:1～5。

所述透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:2～8:4～16。

本发明实施例提供一种所述抗肿瘤组合物，或者所述纳米制剂在抗肿瘤方面的用途。优选的，所述肿瘤为胃癌。

本发明的有益效果是，本发明将阿帕替尼与日蟾毒它灵复配，有效的提高了抗肿瘤的效果，特别是在效果提升的同时，还有效的降低了阿帕替尼剂量，实现了剂量降低的同时提升药效的目的。本发明的阿帕替尼与日蟾毒它灵复配时，日蟾毒它灵的用量仅仅为阿帕替尼的很小一部分，就可以有效的提高药效，且在药效相同时，复配后的组合物中阿帕替尼的剂量明显低于单独的阿帕替尼的剂量，实现降剂量增效的目的。

本发明通过将阿帕替尼包封于脂质体双层中，同时将日蟾毒它灵负载于普鲁士蓝纳米颗粒上，最后利用水合法使脂质体包裹在普鲁士蓝纳米颗粒上形成目标纳米制剂。除了纳米制剂优秀的肿瘤细胞靶向性外，协同比例下的纳米制还能有效地抑制胃癌细胞的侵袭以及转移。所制备的双载药纳米制剂不仅能够延长双药的半衰期，增强其在特定靶细胞或组织部位的积聚，实现多种药物的协同效将两种药物同时递送到肿瘤组织，进而有力地抑制原位肿瘤的增殖，并且显著地降低药物的给药剂量，从而协同诱导抗肿瘤效果并且显著地降低药物的给药剂量，减少药物的毒副作用，实现增效减毒的目的。

本发明将两种亲脂性药物一起以主动载药的方式包封于脂质体-普鲁士蓝纳米制剂中，使得只能口服的阿帕替尼可以静脉注射，极大提高药物利用度，减少药用成本，具有良好的商业前景。

本发明的共载脂质体-普鲁士蓝纳米制剂具有血液中长循环的能力，胃癌细胞靶向性，以及pH响应特性，因此能保证药物半衰期的延长，减少药物在血液中的泄漏又能，保证了药物在肿瘤微环境中药物的释放，从而发挥更好的抗肿瘤效果。

本发明利用纳米材料的“EPR效应”和不同药物的作用机理，也可作为其他疾病治疗的替代平台，如动脉粥样硬化、类风湿关节炎等，故本发明可以提供多种功能和优势来治疗多种疾病。

本发明解决了胃癌治疗中治疗方式单一以及药物利用度低和剂量大造成毒副作用的问题，同时又能改善药剂的血液半衰期、肿瘤靶向效果以及微酸响应的可控释放能力。为开发新型抗癌药剂及相关临床检测和治疗提供新理论支持，具有重要的科学意义、实用价值和经济价值。

附图说明

图1为阿帕替尼(Apa)与日蟾毒它灵(CS-6)在不同摩尔比例下对胃癌细胞BGC-823存活率的关系图，以及不同比例下的联合指数(CI)统计图；

图2为纳米粒子的透射电镜图和粒径大小分布情况：A.为CPB-CS-6，B.为HA-Apa-Lip@CPB-CS-6；

图3为阿帕替尼(Apatinib)、日蟾毒它灵(CS-6)以及HA-Apa-Lip@CPB-CS-6对胃癌细胞(BGC-823细胞)杀伤作用效果的考查；

图4为阿帕替尼(Apatinib)、日蟾毒它灵(CS-6)以及HA-Apa-Lip@CPB-CS-6对胃癌细胞(BGC-823细胞)侵袭转移能力影响的评估；

图5为纳米制剂在小鼠体内生物分布情况和血液半衰期考察

图6为纳米制剂在胃癌细胞BGC-823皮下移植瘤模型中的肿瘤生长曲线和治疗期结束时的实体瘤照片。

图7为纳米制剂的反应路线图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。

实施例1

一、通过细胞毒性试验筛选共载制剂中阿帕替尼和日蟾毒它灵的协同比例

取对数生长期细胞BGC-823(胃癌细胞)以每孔8000个细胞铺于96孔板中，贴壁24小时，按照图1中的比例设置不同的组分，(阿帕替尼＝0μM，5μM，10μM，15μM，20μM；日蟾毒它灵＝0nM，15nM，30nM，45nM，60nM)，每孔加入100μL药溶液，每个浓度3个平行孔。培养箱中孵育24小时后，加入50μL 5mg/mL的噻唑蓝，于培养箱中继续孵育3小时，倒出溶液，加入200μL的DMSO，振摇均匀后用酶标仪在波长490nm下测定吸光度，计算细胞存活率以及各组分的联合指数(CI)，计算公式如下，实验结果如图1。

CI＝(D)₁/(Dx)₁+(D)₂/(Dx)₂。

(Dx)₁和(Dx)₂分别是药物A、药物B单独作用于细胞产生x％的抑制率时的剂量，(D)₁和(D)₂分别是药物A、药物B联合时作用于细胞产生x％的抑制率时的剂量。CI＝1代表相加作用，CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用；

实验结果表明，阿帕替尼和日蟾毒它灵在浓度分别为20μM和30nM时具有较强的协同效应，协同指数(CI)高达22.4，此外与阿帕替尼的IC₅₀相比，该比例下的阿帕替尼浓度明显降低。

实施例2

二、共载阿帕替尼和日蟾毒它灵的纳米制剂的合成

a.合成羧基化的普鲁士蓝(CPB)

配制A液：精确称取0.0541g的FeCl₃·6H₂O(分子量270.29，0.2mmol)，溶解到2mL水中(0.1M)。取其中的200μL，用柠檬酸溶液(25mM)稀释到20mL，配制成1mM的FeCl₃溶液。磁力搅拌溶解，水浴加热至60℃。

配制B液：精确称取0.0085g K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O(分子量422.39，0.02mmol)，溶解到20mL的柠檬酸溶液(25m M)中，配制成浓度为1mM K₄[Fe(CN)₆]。磁力搅拌溶解，水浴加热至60℃。

取加热的B液20mL逐滴加入到60℃水浴磁力搅拌下的A液20mL中。反应溶液会经历“浅黄色—青绿色—浅蓝色—纯蓝色”的颜色变化过程。滴加完毕后，溶液在60℃水浴下继续搅拌30min。冷却至室温得到羧基化的普鲁士蓝溶液，经15000rpm高速离心后收集沉淀，沉淀用超纯水洗涤3次，最后，利用冷冻干燥法对以纯化的材料进行冻干处理，冻干后的样品置于-20℃冰箱中备用。

b.制备负载了日蟾蜍它灵的羧基化的普鲁士蓝(CPB-CS-6)

取25mg CS-6溶于1mL细胞级DMSO溶液中形成25mg/mL的CS-6母液。精确称取10mg的CPB，用2mL无菌水溶解并用探头超声调制40W，超声1min形成CPB的母液。从上述CS-6母液中取出0.1mg的CS-6(4μL)，从CPB母液中取出1mg的CPB(200μL)，两者依次加到796μL的细胞级DMSO溶液中，在室温下，800rmp下搅拌6小时。随后，通过离心收集沉淀并且加入PBS进行浓缩(15000rpm，20min，室温)，同时利用紫外分光光度计测定离心后上清中CS-6的OD值来计算出CS-6的在CPB纳米粒子上的负载率(为32％)。

c.制备负载双药的脂质体-普鲁士蓝(Apa-Lip@CPB-CS-6)

将8mg卵磷脂，1mg胆固醇，2mg DSPE-PEO以及2mg的阿帕替尼(Apatinib)的溶于5mL氯仿，在40℃下减压蒸发至瓶内壁上形成均匀透明的薄膜，再加入500μg CPB-CS-6的PBS溶液，在40℃下继续恒温下旋转1小时得到混悬液。得到的溶液在超声探头下处理后静置(功率为20W，时间为1min，静置时间为20min)。

静置后的混悬液，经离心后去掉上清，再加入超纯水洗涤，最后离心后收集沉淀，得到Apa-Lip@CPB-CS-6的固体，加入PBS后重悬，复溶后得到溶液(16000rpm，离心温度为24℃，时间为30min/次，洗涤的次数为3次)。

d.制备磷脂化透明质酸(HA)

25mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，50mg NHS(N-羟基丁二酰亚胺)和5mg HA(透明质酸)溶于1mL的PBS中，室温800rmp搅拌30min，用于活化HA表面的羧基。然后，加入25mg DSPE-PEG2000-NH2(磷脂聚乙二醇氨基)于上述溶液中在室温下搅拌24h(800rpm)。将上述混合溶液置于2.5kDa的透析袋中透析24h以去除游离的EDC、NHS和DSPE-PEG2000-NH2。最后，利用冷冻干燥法对以纯化的材料进行冻干处理，冻干后的磷脂化透明质酸置于-20℃冰箱中备用。

e.制备嵌合了磷脂化透明质酸的脂质体-普鲁士蓝(HA-Apa-Lip@CPB-CS-6)

取d.所述磷脂化透明质酸2mg溶于1mL的PBS中，同时将c.中所述的Apa-Lip@CPB-CS-6固体重悬于1mL的PBS溶液中，将上述共2mL的溶液混合后，在37℃下搅拌30min，得到HA-Apa-Lip@CPB-CS-6仿生纳米制剂，粒径在100-120nm，图2为纳米制剂CPB-CS-6与HA-Apa-Lip@CPB-CS-6的电镜对比图。

在37℃下搅拌30min，得到HA-Apa-Lip@CPB-CS-6仿生纳米制剂，粒径在100-120nm，图2为纳米制剂CPB-CS-6与HA-Apa-Lip@CPB-CS-6的电镜对比图。

实施例3

三、通过细胞毒性实验以及活死染色验证共载阿帕替尼和日蟾毒它灵的纳米制剂的协同药效

取对数生长期细胞BGC-823(胃癌细胞)以每孔8000个细胞铺于96孔板中，贴壁24小时，按照Apatinib(20μM)，CS-6(30nM)，Apa(20μM)+CS-6(30nM)，HA-Apa-Lip@CPB-CS-6(1.2μg/mL)的浓度设定，往每个孔加入100μL的药溶液，每个组分设3个平行孔。培养箱孵育24小时后，加入20μL 5mg/mL的噻唑蓝，于培养箱中继续孵育3小时，倒出溶液，加入200μL的DMSO，振摇均匀后用酶标仪在波长490nm下测定吸光度，计算细胞存活率。

取对数生长期细胞BGC-823(胃癌细胞)以每孔40000个细胞铺于24孔板内的爬片上，贴壁24小时，按照Apatinib(20μM)，CS-6(30nM)，Apa(20μM)+CS-6(30nM)，HA-Apa-Lip@CPB-CS-6(1.2μg/mL)的浓度设定，往每个孔加入400μL的药溶液，每个组分设3个平行孔。培养箱孵育24小时后加入5μL的钙黄绿素，8μL的PI染料，进行染色后于激光共聚焦显微镜下观察，所得结果如图3(B.)。

实验结果表明与单药组以及双药联合组相比，共载双药的纳米制剂的药效明显提高，此外也证明了双药比例的合理性。

实施例4

细胞侵袭转移能力研究

采用Transwell小室实验测定了实施例1制备的HA-Apa-Lip@CPB-CS-6纳米制剂对人胃癌细胞BGC-823侵袭转移的抑制效果，浓度以及组分设定均与实施例1中相同。实验结果如图3所示，A.为划痕实验结果，D.为划痕实验的定量结果；B.迁移实验结果，E.为迁移实验的定量结果；C.为侵袭实验的结果，F.为侵袭实验的定量结果。

实验结果表明，尽管此浓度下阿帕替尼和日蟾蜍它灵具有一定的抑制侵袭转移的能力，但是与双药联合组相比没有优势。此外，尽管双药物理混合组(Apa+CS-6)与纳米制剂组(HA-Apa-Lip@CPB-CS-6)在抑制胃癌细胞侵袭转移上没有显著性差异，但是在后续的体内实验中，纳米制剂的优势十分明显。

实施例5

纳米制剂的血液半衰期和生物分布测定情况

尾静脉注射100μL剂量浓度为5mg/kg的Lip@CPB-Ce6，HA-Lip@CPB-Ce6后，在不同时间段做动物活体成像的拍摄。图5中图A.的体内荧光图像显示，随着时间的推移，HA-Lip@CPB-Ce6在肿瘤组织中逐渐累积。48h后，肿瘤组织荧光定量分析结果显示，HA-Lip@CPB-Ce6组荧光强度显著高于Lip@CPB-Ce6组(图B.)。说明修饰了HA的脂质体-普鲁士蓝纳米制剂具有靶向肿瘤部位的能力。

尾静脉注射100μL剂量浓度为5mg/kg的Ce6，HA-Lip@CPB-Ce6后，在不同时间点采集血样进行荧光强度测定。结果如图5中图F.与G.所示HA-Lip@CPB-Ce6在24h时间点仍具有较稳定的荧光强度，而Ce6在12h时已经趋于消失了。说明HA修饰的脂质体-普鲁士蓝纳米制剂有利于延长血液循环时间。

实施例6

共载阿帕替尼和日蟾毒它灵的纳米制剂的体内抗肿瘤能力考查

将处于对数生长期的BGC-823(胃癌)细胞接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，共18只，当肿瘤体积达到80mm³时，将荷瘤小鼠随机分成八组：正常组、生理盐水组、阿帕替尼组(5mg/kg)，日蟾毒它灵组(1mg/kg)，阿帕替尼-日蟾毒它灵组，共载阿帕替尼-日蟾毒它灵纳米制剂组。尾静脉给药，每两天给药一次，共给药8次。每两天量一次肿瘤长、宽、计算肿瘤体积，记录一次小鼠体重。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)，实验结果如图6所示。

结果表明，相较于单药组，以及双药联合组，共载双药的纳米制剂组能够更强地起到协同抗肿瘤的效果，更好的抑制肿瘤的生长。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤组合物，其特征是，包括阿帕替尼和日蟾毒它灵。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤组合物，其特征是，阿帕替尼和日蟾毒它灵的摩尔比为600-700:1。

3.一种纳米制剂，其特征是，包括负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒，包裹阿帕替尼的脂质体，以及靶向剂。

4.如权利要求3所述的纳米制剂，其特征是，所述靶向剂为磷脂化的透明质酸；所述负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒和包裹阿帕替尼的脂质体的总重量为磷脂化的透明质酸的重量的4倍。

5.如权利要求3或4所述的纳米制剂的制备方法，其特征是，将靶向剂和纳米颗粒混合，得到纳米制剂，所述纳米颗粒的制备方法为，将负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液和包裹阿帕替尼的脂质体混合，离心，洗涤，得到纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液的制备方法为，将日蟾毒它灵溶液和普鲁士蓝纳米颗粒混合，离心，溶解，得到负载日蟾毒它灵的普鲁士蓝颗粒溶液。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，所述日蟾毒它灵和普鲁士蓝的质量比为1:1-10。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，所述包裹阿帕替尼的脂质体的制备方法为，将胆固醇、卵磷脂、磷脂-聚(2-乙基-2-噁唑啉)、阿帕替尼和溶剂混合，减压蒸馏，得到包裹阿帕替尼的脂质体。

9.一种如权利要求1或2所述的抗肿瘤组合物，或者如权利要求3或4所述的纳米制剂在抗肿瘤方面的用途。

10.如权利要求1所述的用途，其特征是，所述肿瘤为胃癌。

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