CN114028586A

CN114028586A - 一种基于pdx模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法

Info

Publication number: CN114028586A
Application number: CN202111416616.3A
Authority: CN
Inventors: 胡晓萍; 徐佳; 徐珮琼; 杨骏; 王莉; 贺岚; 沈婷艺
Original assignee: Affiliated Stomatological Hospital Of Nanchang University (jiangxi Stomatological Hospital)
Current assignee: Affiliated Stomatological Hospital Of Nanchang University (jiangxi Stomatological Hospital)
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-02-11

Abstract

本发明涉及药效检测技术领域。本发明提供了一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，包括如下步骤：(1)将离体的肿瘤组织移植到小鼠体内，构建P0代PDX模型；(2)P0代PDX模型传代4次获得P4代PDX模型；(3)用抗肿瘤药物处理P4代PDX模型，观察肿瘤组织抑制效果。本发明通过利用PDX模型研究了抗肿瘤药物阿帕替尼对舌癌的疗效，并研究了其在舌癌中的抗肿瘤机制。

Description

一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法

技术领域

本发明涉及药效检测技术领域，尤其涉及一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法。

背景技术

口腔癌是颌面部最常见的恶性肿瘤，发生于舌、颊、牙龈等部位，以鳞状细胞癌为主。舌癌发病率高，生长快，恶性程度高，临床治疗效果不佳，患者生存率低。由于缺乏较好的临床前期研究模型，舌癌的发病机制、药物筛选及治疗方法研究进展缓慢，临床上亟待寻找新的有效治疗方法。

人源性肿瘤异种移植(PDX)模型是直接将患者肿瘤细胞或组织通过原位或者异位(多为皮下或肾包膜)等方式移植到小鼠体内，依靠小鼠提供环境生长的一种动物模型。这种模型保留了原代肿瘤的微环境和组织病理学及遗传学特征，可以很好地筛选抗癌药物及预测临床疗效。

阿帕替尼是我国自主研发的一种小分子抗血管生成靶向药物，是首个在全球范围内证实应用于晚期胃癌患者安全有效的药物，但并没有其对舌癌治疗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，研究了抗肿瘤药物阿帕替尼对舌癌的疗效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，包括如下步骤：

(1)将离体的肿瘤组织移植到小鼠体内，构建P0代PDX模型；

(2)P0代PDX模型传代4次获得P4代PDX模型；

(3)用抗肿瘤药物处理P4代PDX模型，观察肿瘤组织的生长状况。

作为优选，所述肿瘤组织为人舌癌肿瘤组织。

作为优选，所述小鼠为6～8周龄雌性Balb/C裸鼠。

作为优选，所述步骤(1)中移植时所用肿瘤组织的规格为1.8～2.2mm×1.8～2.2mm×1.8～2.2mm。

作为优选，所述步骤(2)中传代的方法为：所述步骤(2)中传代的方法为：PDX模型体内的肿瘤组织达到1000～1500mm³时，分离肿瘤组织，分割成1.8～2.2mm×1.8～2.2mm×1.8～2.2mm的组织块并移植到小鼠体内。

作为优选，所述抗肿瘤药物为阿帕替尼和/或顺铂。

本发明还提供了阿帕替尼在制备抑制舌癌药物中的应用。

作为优选，所述阿帕替尼使用时与顺铂联用。

本发明提供了一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，包括如下步骤：(1)将离体的肿瘤组织移植到小鼠体内，构建P0代PDX模型；(2)P0代PDX模型传代4次获得P4代PDX模型；(3)用抗肿瘤药物处理P4代PDX模型，观察肿瘤组织抑制效果。本发明通过利用PDX模型研究了抗肿瘤药物阿帕替尼对舌癌的疗效，并研究了其在舌癌中的抗肿瘤机制。

附图说明

图1为实施例2构建的P0代的PDX模型；

图2为实施例2构建的P4代的PDX模型；

图3为舌癌PDX模型模型与相应临床患者肿瘤病理组织切片HE染色；

图4为舌癌PDX模型肿瘤组织DNA经PCR技术扩增后的电泳图；

图5为给药结束后解剖小鼠得到的肿瘤组织大小；

图6为给药结束后解剖小鼠得到的肿瘤组织称重结果；

图7为开始给药至给药结束的小鼠肿瘤生长曲线图；

图8为开始给药至给药结束的小鼠重量图；

图9为四组肿瘤组织CD31表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1原料的准备和处理

肿瘤组织样本：肿瘤组织样本来自南昌大学附属口腔医院经手术切除的新鲜舌癌肿瘤组织。本发明的试验过程经南昌大学附属口腔医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

实验动物：实验选取6～8周龄雌性的免疫缺陷Balb/C裸鼠。该鼠饲养在SPF动物房，IVC鼠盒内，温度为22-26℃。所有动物实验均通过南昌乐悠生物科技有限公司实验动物福利伦理委员会的批准。

实验药品：阿帕替尼(国药准字H20140103，江苏恒瑞医药股份有限公司)、顺铂(国药准字H20040813，江苏豪森药业有限公司)。

实施例2舌癌PDX模型的构建

(1)肿瘤样本处理：手术切除下来的新鲜舌癌肿瘤样本进行消毒后修剪，冲洗干净后用手术刀分割成2mm×2mm×2mm大小的微组织块放入含DMEM高糖培养基的EP管装入冰盒中传递至动物房准备接种。

(2)皮下接种：选择雌性Balb/C裸鼠，肩胛部备皮后固定小鼠，碘伏消毒，利多卡因局麻后用套管针将肿瘤组织接种至肩胛部，记为P0代PDX模型(图1)。

(3)传代接种：待肿瘤组织长到1300mm³的时候手术剥除肿瘤组织，组织样本分割成2mm×2mm×2mm大小的组织块后接种至下一批Balb/C小鼠体内，获得P1代PDX模型，经过4次传代接种后P4代PDX模型(图2)用于后续实验。剩余一部分新鲜样本进行病理检测及分子生物学检测，另一部分组织进行组织样本冻存。

实施例3舌癌PDX模型与患者肿瘤组织一致性的鉴定

(1)HE染色检测PDX模型组织病理学特征

取患者和PDX模型的肿瘤组织，切取5mm×5mm×5mm的组织块，用通用型组织固定液固定24h后，取出组织，在乙醇-甲醛固定液中固定2h；用95％乙醇固定2次，每次2h；无水乙醇固定2次，每次1h；二甲苯固定2次，每次30min；石蜡固定3次，分别为30min，60min和90min。组织固定后，经透明剂透明；石蜡包埋组织，切取5μm厚的石蜡切片；将石蜡切片80℃烤箱脱蜡进行水化；过苏木素染液，染细胞核，冲洗，1％盐酸乙醇分化，再冲洗，过弱碱性水溶液返蓝；过伊红染液，细胞质染色，经梯度乙醇及二甲苯浸泡后，风干切片，中性树胶封片。由病理医师在光学显微镜下进行PDX模型肿瘤组织及临床患者肿瘤组织病理学分析。

对比肿瘤组织病理类型、分化程度、角化程度及核异型性。结果如图3所示，A为临床患者肿瘤组织，可见细胞间桥和角化珠，细胞排列紊乱；B为P0代移植小鼠肿瘤组织，可见细胞间桥、角化珠和病理性核分裂；C为P4代移植小鼠肿瘤组织，可见细胞间桥和角化珠及核分裂象。临床患者和PDX模型肿瘤组织病理表型极其相似。

结果显示建立的PDX模型均保留了临床患者肿瘤组织的组织病理学特征，其中分化程度相、角化程度及核异型性都高度相似。可见PDX模型与相对应临床患者的组织学上具有高度一致性。

(2)PCR鉴定PDX模型肿瘤DNA种属特异性

舌癌PDX模型组织使用Qiagen 69504血液、组织DNA提取试剂盒提取DNA；依据人与小鼠区分的housekeeping基因通GenBank公共数据库资源和Primer Primer 5.0设计人鼠基因特异性引物各2对，通过加样、DNA扩增、溶液配制、电泳等步骤，观察结果并拍照记录。

小鼠基因组特异性引物1：

mus-F1：CAGGTTGTCTCCTGCGACTT(SEQ ID NO.1)；

mus-R1：CAGCTGGATGTCAGAGCCAA(SEQ ID NO.2)；

小鼠基因组特异性引物2：

mus-F2：AAGGGCATCTTGGGCTACAC(SEQ ID NO.3)；

mus-R2：CCTGCTTCACCTCCCCATAC(SEQ ID NO.4)；

人基因组特异性引物1：

hs-F1：GGCTCTTAAAAAGTGCAGGGTC(SEQ ID NO.5)；

hs-R1：ATGGTACATGACAAGGTGCGG(SEQ ID NO.6)；

人基因组特异性引物2：

hs-F2：TAACTGTCTGCTTCTCTGCTGTAGGC(SEQ ID NO.7)；

hs-R2：GCTTCACCACCTTCTTGATGTCATCA(SEQ ID NO.8)。

结果如图4所示，其中：

Lane H#：人血样基因组DNA(人基因组阳性对照)

Lane M#：B6小鼠基因组DNA(小鼠基因组阳性对照)

Lane N#：NTC，No-Template Control为无模板的对照

DL2000 Marker：2000bp\1000bp\750bp\500bp\250bp\100bp

其结果显示：PDX模型肿瘤组织的DNA中同时含有人来源性特征性DNA产物。

实施例4阿帕替尼对舌癌PDX模型的药物敏感性检测

动物分组：选取24只P4代PDX模型小鼠进行药物敏感性检测，随机分为四组，每组6只小鼠：编号为：①空白对照组、②顺铂组、③阿帕替尼组、④阿帕替尼+顺铂组。P4代PDX模型小鼠体内的肿瘤体积达到100mm³时开始给药。

给药方式：

①空白对照组：生理盐水100μL/d，每天1次，口服；

②顺铂组：剂量5mg/kg，每周1次，腹腔注射；

③阿帕替尼组：剂量100mg/kg，每天1次，口服；

④阿帕替尼+顺铂组：顺铂5mg/kg，每周1次，腹腔注射，阿帕替尼100mg/kg，每天1次，口服。

观察指标：每周两次观察肿瘤体积及小鼠体重变化，绘制生长曲线。药物干预21天后，处死小鼠，剥离肿瘤组织称重，统计瘤重及抑瘤率(inhibition rate，IR)：抑制率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重x100％。

给药结束后解剖小鼠，得到的肿瘤组织大小如图5所示，从左向右依次为空白对照组、顺铂组、阿帕替尼组、阿帕替尼与顺铂组。

给药结束后解剖小鼠，得到的肿瘤组织分组称重，结果如图6所示。(*，P<0.05；**，P<0.001)

开始给药至实验结束的小鼠肿瘤生长曲线图如图7所示，横坐标为开始实验的时间(单位：d)，纵坐标为给药后移植瘤小鼠的肿瘤体积变化，肿瘤体积公式：V＝a x b2/2。

开始给药至实验结束的小鼠重量图如图8所示，横坐标为开始实验的时间(单位：d)，纵坐标为给药结束后移植瘤小鼠的重量变化(单位：g)。

实施例5免疫组织化学分析阿帕替尼抑制舌癌生长的机制(IHC)

将舌癌石蜡切片用3％H₂O₂溶液孵育10分钟，然后用1％的牛血清白蛋白在PBS缓冲液中封闭1小时，再用0.01M柠檬酸钠缓冲溶液加热，并进行抗原修复；一抗孵育：添加一抗，4℃过夜，PBS冲洗3min，重复3次；二抗孵育：添加二抗，室温孵育1小时，PBS冲洗3min，重复3次；最后进行显色，复染，封片。此过程由经验丰富的病理医师完成，将PDX模型肿瘤组织切片置于光学显微镜下观察免疫组化CD31的表达情况。

CD31是一种血管内皮标志物，可用于评估肿瘤血管生成。对PDX模型中各组肿瘤组织切片用人特异性CD31抗体进行免疫组化染色，通过观察免疫组化检测中CD31抗体对血管的标记结果，结果如图9所示。

结果显示，对照组与给药组肿瘤组织的血管内皮都较好的表达CD31。与空白组对比，顺铂组的阳性血管数有减少，而阿帕替尼组的阳性血管数明显减少，阿帕替尼与顺铂联合给药组与阿帕替尼单药组相比，阳性血管数有所减少，这些数据表明阿帕替尼可能通过抑制新生血管生成从而发挥抗癌活性。

实施例6统计学方法

使用SPSS统计软件22.0(IBM公司，美国纽约州阿蒙克市)和GraphPad Prism软件7.0(美国加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad Software Inc.)进行数据分析。结果表示为平均值±标准偏差(SD)。多组比较利于方差的单向分析(ANOVA)和Tukey事后检验进行。P<0.05表示差异具有统计学意义。

由以上实施例可知，本发明提供了一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，包括如下步骤：(1)将离体的肿瘤组织移植到小鼠体内，构建P0代PDX模型；(2)P0代PDX模型传代4次获得P4代PDX模型；(3)用抗肿瘤药物处理P4代PDX模型，观察肿瘤组织抑制效果。本发明通过利用PDX模型研究了抗肿瘤药物阿帕替尼对舌癌的疗效，并研究了其在舌癌中的抗肿瘤机制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南昌大学附属口腔医院（江西省口腔医院）

<120> 一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggttgtct cctgcgactt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggttgtct cctgcgactt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagggcatct tgggctacac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcttcac ctccccatac 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggctcttaaa aagtgcaggg tc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtacatg acaaggtgcg g 21

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taactgtctg cttctctgct gtaggc 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcttcaccac cttcttgatg tcatca 26

Claims

1.一种基于PDX模型研究阿帕替尼抗肿瘤作用效果的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将离体的肿瘤组织移植到小鼠体内，构建P0代PDX模型；

(2)P0代PDX模型传代4次获得P4代PDX模型；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤组织为人舌癌肿瘤组织。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠为6～8周龄雌性Balb/C裸鼠。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中移植时所用肿瘤组织的规格为1.8～2.2mm×1.8～2.2mm×1.8～2.2mm。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中传代的方法为：PDX模型体内的肿瘤组织达到1000～1500mm³时，分离肿瘤组织，分割成1.8～2.2mm×1.8～2.2mm×1.8～2.2mm的组织块并移植到小鼠体内。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物为阿帕替尼和/或顺铂。

7.阿帕替尼在制备抑制舌癌药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述阿帕替尼使用时与顺铂联用。