CN117210407B

CN117210407B - 一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用

Info

Publication number: CN117210407B
Application number: CN202310865381.9A
Authority: CN
Inventors: 王玲; 叶琳; 梅军
Original assignee: Shenzhen Eye Hospital (shenzhen Institute Of Eye Disease Prevention And Control)
Current assignee: Shenzhen Eye Hospital (shenzhen Institute Of Eye Disease Prevention And Control)
Priority date: 2023-07-13
Filing date: 2023-07-13
Publication date: 2024-06-07
Anticipated expiration: 2043-07-13
Also published as: CN117210407A

Abstract

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE‑001，保藏编号为CCTCC NO：C202380。本发明提供的人视网膜母细胞瘤细胞在显微镜下观察细胞的形态，为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、神经胶质细胞样的肿瘤细胞，细胞增殖核心成漩涡状生长，这种均一的细胞形态可一直保持到91天，而且仍能处于增殖状态正常生长；同时，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞在三维的培养条件下呈现一定的向周围侵袭特性，可用于人视网膜母细胞瘤的相关基础研究，抗肿瘤药物有效性研究和检测，视网膜母细胞瘤治疗的相关方法研究。

Description

一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用。

背景技术

近几年来，由于恶性肿瘤的发病率及死亡率逐年升高，极大的引起了全世界医疗工作者的重视。研究发现由于肿瘤具有的异质性、复杂性以及其存在的不同种族和地域差异性等特点，其相关研究也并不能完全反映相应疾病的全部特点，并且许多肿瘤细胞系会随着培养时间或培养环境的改变而发生特性改变，甚至完全失去本来特性，这些因素使得不断进行肿瘤细胞体外原代培养研究、不断优化培养方法、来利于原代细胞的增殖与生长显得尤为重要。

但是迄今为止，视网膜母细胞瘤的研究领域没有分化的人视网膜母细胞瘤原代细胞。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用，旨在解决现有视网膜母细胞没有人分化的视网膜母细胞瘤原代细胞，缺少良好的实验材料等问题。

本发明的技术方案如下：

一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞，命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001，保藏编号为CCTCC NO：C202380。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在制备视网膜母细胞瘤动物模型中的应用。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在视网膜的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究中的应用。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在体外正常细胞的药物毒性研究和检测中的应用。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测中应用。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在研究溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料中的应用。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在制备治疗人视网膜母细胞瘤的药物中的应用。

所述的应用，其中，所述药物包括药学上可接受的载体或赋型剂。

所述的应用，其中，所述药物包括片剂、胶囊剂、注射剂、口服液体制剂、颗粒剂。

所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在眼部肿瘤的发病机理研究中的应用。

有益效果：本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001，保藏编号为CCTCC NO：C202380。本发明提供的人视网膜母细胞瘤细胞，原代分离培养自人的视网膜母细胞瘤组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞；并且，本发明提供的人视网膜母细胞瘤细胞在显微镜下观察细胞的形态，为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、神经胶质细胞样的肿瘤细胞，细胞增殖核心成漩涡状生长，这种均一的细胞形态可一直保持到91天，而且仍能处于增殖状态正常生长；同时，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞在三维的培养条件下呈现一定的向周围侵袭特性，可用于人视网膜母细胞瘤的相关基础研究，抗肿瘤药物有效性研究和检测，视网膜母细胞瘤治疗的相关方法研究，包括溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料等方面的研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中人视网膜母细胞瘤细胞的细胞形态图；

图2为本发明实施例2中人视网膜细胞瘤细胞的生长曲线图；

图3为本发明实施例3中人视网膜母细胞瘤细胞的染色体核型分析图；

图4为本发明实施例4中人视网膜母细胞瘤细胞的STR基因分型图；

图5为本发明实施例5中人视网膜母细胞瘤细胞的特征鉴定图；

图6为本发明实施例6中人视网膜母细胞瘤的标志性分子Marker鉴定结果图；

图7为本发明实施例7中人视网膜母细胞瘤细胞的抗肿瘤药物卡铂有效性检测结果图。

具体实施方式

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤，严重危害患儿的生命及视功能，占儿童恶性肿瘤的2％-4％，其患病率为1/20000-1/15000，其中约95％发生在5岁以前。单侧性RB(单眼RB)约占75％，发病年龄在2-3岁；双侧性RB(双眼RB)发病更早；三侧性RB是指在双眼发病的基础上，蝶鞍或松果体出现原发肿瘤，属于双眼RB的一种特殊类型。每年全球范围新发患者约9 000例，我国每年新增患者约1 100例。作为实体瘤中应用化疗最有效的肿瘤之一，视网膜母细胞瘤原代培养在肿瘤研究中具有重要意义。研究发现对手术摘除眼球的视网膜母细胞组织标本进行原代培养，可获得高基因保留量的肿瘤细胞，又由于新鲜组织刚脱离人体，其形态、活力及代谢特点与体内极其相似，还未发生明显变化，无论是药敏实验、癌变机制等，最能反应当时的肿瘤细胞情况。

因此，本发明针对视网膜母细胞瘤细胞原代培养过程、方法及相关条件进行研究，提供了一种有效的视网膜母细胞瘤细胞原代培养方法，以期为视网膜母细胞瘤的研究及临床治疗提供更多的帮助。

基于此，本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞，命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001，保藏编号为CCTCC NO：C202380，已于2023年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)。

本实施方式中，所述人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001分离培养自中国人视网膜母细胞瘤来源的视网膜细胞瘤细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以21个“STR基因座/等位基因长度”来表示：Amel/XX，CSF1PO/11/13，D12S391/18/18，D13S317/8/11，D16S539/9/9，D18S51/12/20，D19S433/14/14.2，D21S11/29/30，D2S1338/18/23，D2S441/10/15，D3S1358/15/16，D5S818/11/12，D6S1043/14/14，D7S820/8/11，D8S1179/10/15，FGA/21/25，Penta D/11/12，Penta E/11/12，TH01/7/9，TPOX/9/9，vWA/17/18。

具体的，所述人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞；经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人的视网膜母细胞瘤细胞株。并且，该人视网膜母细胞瘤细胞在显微镜下观察，其细胞形态为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、神经胶质细胞样的肿瘤细胞，细胞增殖核心成漩涡状生长，这种均一的细胞形态可一直保持到91天，而且仍能处于增殖状态正常生长。同时，该人视网膜母细胞瘤细胞在三维的培养条件下呈现一定的向周围侵袭特性，可用于人视网膜母细胞瘤的相关基础研究，抗肿瘤药物有效性研究和检测，视网膜母细胞瘤治疗的相关方法学研究包括溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料等方面的研究。

在一些实施方式中，所述人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001的培养条件优选为用RB培养基于37℃、5％CO₂培养；所述RB培养基为：DMEM/F12培养基，同时添加10％(v/v)的FBS(胎牛血清)，以及10μM的Y27632，且所述RB培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。

在一些实施方式中，所述人视网膜母细胞瘤细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：

(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集视网膜母细胞瘤眼球摘除患者的肿瘤组织样品。

(2)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀剥离肿瘤组织。

(3)将组织样品用消化液进行消化处理；优选的，所述消化液为含胶原酶和分散酶的RB培养基。

(4)消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中进行二次消化处理。

(5)加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清。

(6)加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品。

(7)再加入含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清。

(8)重悬细胞沉淀于RB培养基中，接种于培养瓶培养，得到人视网膜母细胞瘤细胞。

具体地，所述人视网膜母细胞瘤细胞的原代分离培养方法中，所述步骤(2)中的预冷优选为在冰上预冷；所述步骤(3)中的所述消化液的用量优选为10-11倍于组织样品体积，所述消化处理的条件优选为35-37℃消化1-3小时，所述胶原酶和所述分散酶的浓度优选为均为0.2-0.3mg/mL；所述步骤(4)中的所述二次消化处理优选为在冰上消化1小时或室温消化10分钟；所述步骤(6)中的温水浴优选为35-37℃的温水浴；所述步骤(4)、(5)、(7)中的离心优选为900-1000rpm离心5-8分钟；所述步骤(8)中的培养条件优选为37℃、5％CO₂。

在一些实施方式中，所述人视网膜母细胞瘤细胞的传代培养方法，包括如下步骤：

1)当人视网膜母细胞瘤细胞增殖至90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞，再用0.05％(质量体积比)胰酶-EDTA消化单层细胞。

2)加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用RB培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。

具体地，所述人视网膜母细胞瘤细胞的传代培养方法中，所述步骤1)中的消化的时间优选为2-5分钟；所述步骤2)中的离心优选为1000rpm离心5分钟，所述培养的条件优选为37℃、5％CO₂。

在一些实施方式中，所述人视网膜母细胞瘤细胞可作为细胞模型检测抗肿瘤药物的有效性，作为一种药物筛选模型应用；还可用于视网膜母细胞瘤相关的基础研究。

除此之外，本发明还提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在制备视网膜母细胞瘤动物模型中的应用。

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在视网膜的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究中的应用。

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在体外正常细胞的药物毒性研究和检测中的应用。

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在体外筛选抗癌药物的药效学研究和检测中应用。

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在研究溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料中的应用。

本发明提供一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞在制备治疗人视网膜母细胞瘤的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述药物包括药学上可接受的载体或赋型剂。

在一些实施方式中，所述药物包括片剂、胶囊剂、注射剂、口服液体制剂、颗粒剂。

进一步地，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞可在人视网膜母细胞瘤的病理生理学研究中的应用，以及在眼部肿瘤相关疾病的发病机理研究中的应用。

下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

实施例1

原代人视网膜母细胞瘤细胞的原代分离培养

(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集视网膜母细胞瘤患者手术摘除眼球中的肿瘤组织。

(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2mg/mL的RB培养基；其中，RB培养基为：DMEM/F12培养基，同时添加10％(v/v)的胎牛血清，以及10μM Y27632，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤)。

(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH 7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。

(4)将组织样品1～2cm³放入(2)的10mL消化液的14mL或50mL离心管中，37℃消化1～3小时。

(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5分钟，去除上清。

(6)将细胞沉淀重悬于2～5mL的0.25％(质量体积比)胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温10分钟。

(7)然后加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，低速1000rmp离心5分钟；尽量将上清去除干净。

(8)加入2mL温水浴(37℃)的5mg/mL分散酶和200μL的1mg/mL DNase I，用无菌的P1000一次性塑料枪头反复吹打样品1分钟。

(9)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5分钟，去除上清。

(10)重悬细胞沉淀于RB培养基中，接种于6孔板或T25的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％ CO₂。

按照上述方法分离培养成功的原代人视网膜母细胞瘤细胞，显微镜下观察细胞的形态如图1所示，其为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、梭形的细胞。该细胞命名为“人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001”，已于2023年5月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：C202380。

实施例2

人视网膜母细胞瘤细胞的传代培养

(1)当在6孔板或T25的培养瓶中培养的人视网膜母细胞瘤细胞增殖至90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞两次，再用0.05％(质量体积比)胰酶消化单层细胞2～5分钟。

(2)加入10mL完全DMEM中和消化反应1～2分种。

(3)1000rmp离心5分钟，去上清，重悬细胞沉淀于10mL RB培养基中接种培养。

(4)必要时可将1×10⁶上皮细胞重悬于1～2mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％ DMSO，v/v)中，储存于液氮中备用。

按照上述方法传代培养人视网膜母细胞瘤细胞，培养建系的细胞生长曲线如图2，连续传代培养91天，本实施例的人视网膜母细胞瘤细胞仍能保持增殖状态正常生长。

实施例3

人视网膜母细胞瘤细胞的核型分析鉴定

(1)当人视网膜母细胞瘤细胞(1×10⁶)处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μg/mL，继续培养3.5小时。

(2)反复吹打细胞使其脱落，2000rpm离心5分钟收获细胞。

(3)弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液8mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37℃低渗处理25分钟。

(4)加入1mL新配制的固定剂(甲醇：冰乙酸＝3：1，v/v)，小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。

(5)弃上清液，加入8mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。

(6)2000rpm离心5分钟，弃上清液，重复固定一次。

(7)弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上。

(8)将载玻片置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。

(9)2.5％(质量体积比)胰酶溶液(pH6.8～7.2)5mL处理25～45秒钟。

(10)37℃预温的生理盐水漂洗，Giemsa染色5～10分钟，做G显带分析。

(11)显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；至少观察分析20个以上有丝分裂中期细胞。

代表性的细胞核型分析结果见图3，人视网膜母细胞瘤细胞为正常二倍体，46条染色体未见异常排列。

实施例4

人视网膜母细胞瘤细胞的基因分型分析鉴定

(1)贴壁生长的人视网膜母细胞瘤细胞(1×10⁶)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。

(2)10000rpm离心1分钟，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。

(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。

(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。

(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，将提取的DNA溶液收集到离心管中。

(10)利用16HS系统(DC2101，promega公司)进行21个基因座(15个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。

(11)使用ABI3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。

(12)使用和PowerTyperTM 16Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果图4，检测21个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示：Amel/XX，CSF1PO/11/13，D12S391/18/18，D13S317/8/11，D16S539/9/9，D18S51/12/20，D19S433/14/14.2，D21S11/29/30，D2S1338/18/23，D2S441/10/15，D3S1358/15/16，D5S818/11/12，D6S1043/14/14，D7S820/8/11，D8S1179/10/15，FGA/21/25，Penta D/11/12，PentaE/11/12，TH01/7/9，TPOX/9/9，vWA/17/18。

本发明的人视网膜母细胞瘤细胞经STR基因分型鉴定，是国内外从未登记注册过的一种人源细胞系。

实施例5

人视网膜母细胞瘤细胞的Matrigel 3D培养

(1)用合适体积的matrigel包被chamber，然后37度放置15-30分钟，让胶凝固。

(2)贴壁生长的人视网膜母细胞细细胞，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2～5分钟，10mL完全DMEM中和消化反应。

(3)1000rmp离心5分钟，去上清，RB培养基重悬细胞沉淀，细胞计数，取人视网膜母细胞瘤细胞(4×10⁴)，延壁轻轻接种到凝固的胶上。

(4)37℃放置10分钟，然后吸掉没贴下去的细胞(倾斜chamber，用枪头轻轻吸掉)

(5)延壁轻轻加入含有5％(v/v)matrigel的RB培养基培养，隔天换液，培养7-14天。

(6)结束培养后，吸去培养基，用1×PBS洗涤细胞三次。

(7)4％多聚甲醛固定30min，用1×PBS洗涤细胞三次。

(8)加入Triton-X-100(5％)室温透化15min，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(9)加入DAPI(终浓度为100ng/ml)避光孵育5min，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(10)将玻片的小室查下来，上层浸润在盖玻片上，于显微镜下观察培养物形态并摄影。人视网膜母细胞瘤细胞在3D matrigel实验中，生长出来的克隆为不规则的球体，说明本实施例的人视网膜母细胞瘤SZYKE-001细胞为肿瘤细胞株。

人视网膜母细胞瘤细胞的特征鉴定图如图5所示，可知3D条件下，Matrigel培养呈现向外周侵袭现象。

实施例6

人视网膜母细胞瘤细胞的肿瘤标记物检测

(1)将人视网膜母细胞瘤细胞用0.05％胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5％ CO2培养箱培养。

(2)第二天用4％多聚甲醛固定室温固定20min，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(3)加入Triton-X-100(5％)室温透化15min，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(4)加入视网膜母细胞瘤肿瘤标志物的一抗(p63、B7H3、Ki67、GD2、CD171、CD3、EPCAM、PD-L1、SYK、p73)孵育过夜，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(5)加入对应的荧光二抗，避光孵育1小时，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(6)加入DAPI(终浓度为100ng/ml)避光孵育5min，用1×PBS洗涤细胞三次(4min/次)。

(7)将孔板放在荧光显微镜下观察并拍照记录。

本实施例中人视网膜母细胞瘤的标志性分子Marker鉴定结果如图6所示。

实施例7

利用人视网膜母细胞瘤SZYKE-001细胞检测抗肿瘤药物的半致死率

(1)将人视网膜色素上皮细胞系ARPE细胞、人视网膜母细胞瘤细胞系Y-79细胞、人视网膜母细胞瘤SZYKE-001细胞制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5％CO₂培养箱培养。

(2)第二天加卡铂处理，每孔加入100μL不同浓度药物，药物浓度梯度(μM)为由高到低：1200、1000、750、500、250、125、62.5。每个梯度设置3个复孔，并设置对照组(接种细胞不加药处理)及只加RB培养基的空白对照组，每组设置3个复孔。

(3)药物处理(37℃、5％ CO₂培养箱培养)24小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10μLCKK-8检测试剂(碧云天，上海)，即10μL CCK-8+90μL DMEM培养基。

(4)在37℃、5％ CO₂细胞培养箱内继续孵育0.5～2个小时，孵育时间跟细胞量的多少相关，具体时间根据预实验确定(可根据液体颜色变化来初步确定)，吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好。

(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

人视网膜母细胞瘤细胞对卡铂的敏感性检测结果如图7。卡铂对ARPE细胞作用48h时，半致死率浓度为356.7μM；对Y-79视网膜母细胞瘤细胞系作用的半致死率浓度为65.79μM；卡铂对SZYKE-001细胞作用的半致死率浓度为542.9μM。

综上所述，本发明提供的一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞及其应用，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001，保藏编号为CCTCCNO.C202380。本发明提供的人视网膜母细胞瘤细胞，原代分离培养自人的视网膜母细胞瘤组织，该细胞未导入任何外源基因，经核型分析鉴定为人的正常二倍体细胞；并且，本发明提供的人视网膜母细胞瘤细胞在显微镜下观察细胞的形态，为排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、神经胶质细胞样的肿瘤细胞，细胞增殖核心成漩涡状生长，这种均一的细胞形态可一直保持到91天，而且仍能处于增殖状态正常生长；同时，所述分化的人视网膜母细胞瘤细胞在三维的培养条件下呈现一定的向周围侵袭特性，可用于人视网膜母细胞瘤的相关基础研究，抗肿瘤药物有效性研究和检测，视网膜母细胞瘤治疗的相关方法研究，包括溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料等方面的研究。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种分化的人视网膜母细胞瘤细胞，其特征在于，命名为人视网膜母细胞瘤细胞SZYKE-001，保藏编号为CCTCC NO：C202380。

2.权利要求1所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在制备视网膜母细胞瘤动物模型中的应用。

3.权利要求1所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在人视网膜母细胞瘤的发病机理、侵袭和转移的分子机制研究中的应用。

4.权利要求1所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在研究溶瘤病毒、免疫治疗、抗肿瘤新材料中的应用，其特征在于，所述肿瘤为人视网膜母细胞瘤。

5.权利要求1所述的分化的人视网膜母细胞瘤细胞在眼部肿瘤的发病机理研究中的应用，其特征在于，所述眼部肿瘤为人视网膜母细胞瘤。