CN104771764A - 一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备 - Google Patents

一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备 Download PDF

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本发明属于制药领域,公开了一种巨噬细胞靶向载体的合成以及基因递送系统制备方法。巨噬细胞靶向载体为甘露糖化精蛋白,正电性的甘露糖化精蛋白荷载负电性的核酸形成一种荷正电的纳米粒子。其中甘露糖修饰的精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制备。与非病毒基因载体精蛋白相比,甘露糖化精蛋白不仅具有核定位功能且具有巨噬细胞靶向性,能够提高精蛋白在巨噬细胞中的基因转染介导效率。本发明制备方法简单,工艺成熟,具有良好的应用前景。

Description

一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备
技术领域
本发明属于制药领域,具体涉及一种巨噬细胞靶向载体系统及其制备。
背景技术
随着基因治疗技术的发展,核酸疫苗受到越来越多的关注,因其能够针对抗原诱导特异性细胞和体液免疫应答。众所周知,基因治疗过程中,基因必须进入细胞核内才能发挥作用,然而核膜是比细胞膜特异性和选择性更高的最后一道屏障。因此,有必要利用合适的递送载体保护基因免受核酸酶的降解并能穿过细胞内多层屏障到达核。近年来,许多阳离子聚合物如壳聚糖、聚赖氨酸等被用于基因递送。然而,这些阳离子聚合物介导基因的转染效率仍有待提高。
精蛋白是从雄鱼的精细胞中分离出来的富含精氨酸的多肽。在成熟雄鱼精细胞中,精蛋白能够与精子DNA凝聚形成紧密结构,递送精子DNA到卵细胞核。精蛋白具有4个可能的核定位信号肽的区域,这些区域为4至6个精氨酸重复序列,因此这些结构使精蛋白首先具有核定位的功能,能够介导经由核孔复合物的核质转运,其次强正电性的碱性氨基酸能够与带负电的DNA通过静电作用结合形成紧密的纳米级二元复合物,保护基因免受核酸酶降解,并通过胞吞途径提高细胞对基因的摄取从而提高疫苗的免疫原性。精蛋白本身具有很好的安全性,已被US FDA批准作为抗肝素药用于临床。然而,作为基因疫苗递送载体,精蛋白缺乏细胞特异性,难以将核酸疫苗靶向递送至特异性细胞。
DNA疫苗经接种后,首先将被递送至抗原递呈细胞内,在此基因编码表达抗原并被递呈,激发机体系统免疫。巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞表面大量表达甘露糖受体,采用甘露糖作为配体修饰精蛋白,通过糖类识别机制,借助受体介导的巨噬细胞主动靶向,增加巨噬细胞对疫苗的摄取,提高疫苗的免疫原性。
KR 20070029982A公布了一种直接用对异硫氰酸苯基甘露吡喃糖苷与壳聚糖进行反应,制得甘露糖化壳聚糖。但对异硫氰酸苯基甘露吡喃糖苷价格昂贵,实用性低,且经此路线合成的甘露糖化壳聚糖分子结构中,甘露糖和壳聚糖之间的架桥为N-苯基硫脲基。CN 102477107A公布了一种甘露糖化壳聚糖的简便制备方法,是以甘露糖和烯丙醇为原料,经过糖苷化反应,糖羟基的乙酰化反应,丙烯基的氧化反应,以及脱乙酰化反应后制得甲酰甲基 甘露吡喃糖苷,该中间体活性较高,与壳聚糖经还原胺化反应制得甘露糖化壳聚糖,该方法反应条件温和可控,产品得率高。因此,本发明选用甲酰甲基甘露吡喃糖苷对精蛋白进行甘露糖配体修饰,在不影响其本身的核定位功能和安全性的前提下,使其同时具有巨噬细胞靶向性,成为多功能且更有效的基因疫苗递送载体。到目前为止,尚未报道对精蛋白进行甘露糖修饰并用于递送核酸物质的相关文献或专利。
发明内容
针对以上问题,本发明首次对精蛋白进行甘露糖修饰,通过甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经由还原胺化反应制得甘露糖化精蛋白,该化合物具有强正电性,能够在水性介质中与荷负电的核酸物质通过静电结合形成结构致密的纳米粒。
因此,本发明的目的是提供一种巨噬细胞靶向载体系统。该载体系统为甘露糖化精蛋白与核酸物质形成的纳米粒。甘露糖化精蛋白分子结构中的甘露糖配体能够与巨噬细胞表面的甘露糖受体结合,通过糖类识别机制,借助受体介导的巨噬细胞主动靶向作用,增加巨噬细胞对纳米粒子的摄取,提高基因物质的转染率,以解决现有的精蛋白载体缺乏细胞特异性的问题,提高核酸疫苗的免疫原性。
本发明提供的一种巨噬细胞靶向载体系统主要是由甘露糖化精蛋白与核酸物质形成的纳米粒。
其中,甘露糖化精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制得。
所述精蛋白为鲑鱼精蛋白,分子量为5100Da。
所述甘露糖化精蛋白的结构为:
所述甘露糖化精蛋白分子结构中,甘露糖通过-CH2-CH2-与精蛋白桥接。
本发明的另一目的是提供一种制备前述纳米粒的方法,具体包括下列步骤:
1)甘露糖化精蛋白的合成:将甲酰甲基甘露吡喃糖苷和精蛋白硫酸盐溶于蒸馏水中,室温下搅拌至完全溶解,向反应液中加入还原胺化试剂三乙酰氧基硼氢化钠,室温下搅拌24~48h,纯化即得甘露糖化精蛋白。
合成路线如下:
2)甘露糖化精蛋白载基因纳米粒的制备:将核酸溶液在搅拌下逐滴加入等体积的前述甘露糖化精蛋白溶液中,室温静置30min,荷正电的甘露糖化精蛋白与荷负电的核酸物质通过静电结合形成稳定的纳米粒。
所述的制备方法,其中甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐的摩尔比为8.5∶1~16∶1。摩尔比过低时,甘露糖的取代度过低,使主动靶向效率降低;摩尔比过高时,甘露糖取代度过高,精蛋白分子结构中参与反应的氨基较多,用于压缩基因的氨基减少,影响制得纳米粒的稳定性。
所述的制备方法,其中甲酰甲基甘露吡喃糖苷与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1∶10。
所述的制备方法,其中甘露糖化精蛋白的纯化方法可为透析法。1000Da截留分子量的透析袋4℃透析36~48h,滤去不溶物,滤液冻干即得。
所述的制备方法,其中甘露糖化精蛋白的纯化方法可为乙醇沉淀法。向反应液中加入10~20倍体积的-20℃预冻的无水乙醇,使甘露糖化精蛋白析出,用无水乙醇洗涤沉淀3遍,12000rpm冷冻离心,真空干燥或真空冷冻干燥即得。
甘露糖化精蛋白的纯化方法优选透析法。
所述的制备方法,其中甘露糖化精蛋白与核酸物质的制备N/P比为0.8∶1~8∶1,优选的N/P比为2∶1~8∶1。
所述的核酸物质选自DNA疫苗,RNA疫苗的一种。 
所述的一种巨噬细胞靶向载体系统对核酸物质的包封率为90%~100%。
与现有技术相比,本发明至少具有如下优点:
1)与精蛋白压缩DNA得到的纳米粒相比,本发明的载体对巨噬细胞具有良好的靶向性,可通过特异性糖类识别机制增加巨噬细胞对核酸疫苗的摄取,提高基因的转染效率,增加核酸疫苗的免疫原性。
2)本发明甘露糖修饰过程并未影响精蛋白的核定位功能,修饰后的精蛋白仍然具有良好的核定位性能,能够进一步提高基因的转染效率。
3)本发明所述甘露糖化精蛋白分子结构中,甘露糖与精蛋白通过-CH2-CH2-桥接,精蛋白经修饰后细胞毒性并未增加,生物相容性良好。
4)本发明制备方法简单,工艺成熟,反应条件温和可控,合成反应收率为47%~65%,可实现放大生产,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1精蛋白(PS)与甘露糖化精蛋白(MPS)的核磁图谱
图2MPS的红外图谱
图3MPS/pDNA纳米粒的细胞毒性评价
图4MPS/pDNA纳米粒的胞内定位
图5MPS/pGL-3纳米粒的体外转染
具体实施方式
以下具体实施例是对本发明的进一步说明,但下述仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1:甘露糖化精蛋白的合成与表征
将1-α-甲酰甲基-甘露吡喃糖苷(50mg,0.23mM)和精蛋白硫酸盐(PS,113.6mg,0.02mM)加入15mL蒸馏水中,室温下搅拌至完全溶解。向反应溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(474.75mg,2.3mM),室温下搅拌48h(TLC监测反应进程,甲醇∶三乙胺∶水=3∶2∶1,v/v/v)。反应完全后将溶液在蒸馏水中4℃透析48h,然后冷冻干燥除去溶剂,得白色终产物甘露糖化精蛋白(MPS)69mg,产率65%。
对合成的MPS进行核磁共振氢谱分析,结果显示3.6和4.1ppm处出现甘露糖配基上的羟基质子峰信号,计算甘露糖的取代度为6.4%(附图1)。
对合成的MPS进行红外光谱分析,结果显示MPS的图谱在1384.7cm-1和3349.5cm-1处出现甘露糖上羟基伸缩振动峰,而且1112.5cm-1处的峰较尖锐,为醚键的伸缩振动峰。图谱出现了醚键特征峰,表明MPS中醚键的存在(附图2)。
实施例2:MPS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的实施例1的甘露糖化精蛋白水溶液(56μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为0.8制备的纳米粒子。
实施例3:MPS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的实施例1的甘露糖化精蛋 白水溶液(70μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为1制备的纳米粒子。
实施例4:MPS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的实施例1的甘露糖化精蛋白水溶液(140μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为2制备的纳米粒子。
实施例5:MPS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的实施例1的甘露糖化精蛋白水溶液(280μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为4制备的纳米粒子。
实施例6:MPS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的实施例1的甘露糖化精蛋白水溶液(560μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为8制备的纳米粒子。
实施例7:PS/pDNA纳米粒的制备
将pDNA水溶液(100μg/mL)在搅拌下逐滴加入等体积的精蛋白水溶液(140μg/mL)中,室温下静置30min以形成以N/P比为2制备的纳米粒子。
实施例8:MPS/pDNA纳米粒粒径,ζ电位和包封率的测定
用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径分布以及ζ电位
MPS/pDNA纳米粒包封率的测定,取适量纳米粒溶液,在4℃条件下,12000rpm离心30min,用移液管吸取上清液0.5mL置于10mL棕色容量瓶中,加入2.5mLTNE缓冲液,以0.15μg/mL的Hoechst 33258染液定容至刻度,摇匀,室温反应5min。荧光分光光度计测定游离pDNA的量。结合率计算公式如下:
表1:MPS/pDNA纳米粒的粒径、ζ电位和包封率
从表中可以看出,随着甘露糖化精蛋白与核酸物质的N/P比的增加,MPS/pDNA纳 米粒的粒径稍有减小。当N/P比小于2时,MPS/pDNA纳米粒的ζ电位为负值,随着N/P比的增加,MPS/pDNA纳米粒的ζ电位升高为正值,并逐渐增加。pDNA的包封率均高于85%。同时实施例4与实施例7的粒径、ζ电位和包封率无显著性差异,表明甘露糖修饰精蛋白并未显著改变精蛋白本身的物理性质。
实施例9:MPS/pDNA纳米粒的体外细胞实验
1.细胞培养
分别用含10%血清的RPMI-1640培养基和DMEM培养基培养鼠巨噬细胞(RAW264.7)和人肾上皮细胞(293T),培养介质中加入青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL),细胞置于37℃,5%CO2的培养箱中培养。
2.细胞毒性评价 
细胞以5×103个/孔接种96孔细胞培养板,每孔加入100μL细胞培养液,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h,待细胞汇集度达到60~70%时,分别加入游离MPS(实施例1)、PS溶液,PS/pDNA纳米粒(实施例7)、MPS/pDNA纳米粒(实施例4)及PEI溶液,用含10%血清的培养基补足至200μL,新鲜培养基处理的细胞作为对照。置于37℃,5%CO2培养箱中培养48h,随后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL),孵育4h后吸除培养液,每孔加入150μL DMSO,摇床振荡10min使甲瓒充分溶解,在570nm波长下测定吸收值,计算细胞存活率,每组试验重复三次。
结果显示,293T和RAW264.7细胞与浓度为140μg/mL的PS、MPS溶液,以该浓度的PS、MPS制备的PS/pDNA纳米粒、MPS/pDNA纳米粒溶液共孵育4h后,细胞存活率均大于85%,细胞毒性较小,即精蛋白经甘露糖修饰后细胞毒性并未增加,生物相容性良好(附图3)。
3.MPS/pDNA纳米粒的胞内定位
以罗丹明B(RhB)分别标记MPS(RhB-MPS)和PS(RhB-PS)。RAW 264.7细胞以1×105个/孔接种激光共聚焦皿,培养24小时,待细胞汇集度达到60~70%,加入含有RhB-MPS/pDNA纳米粒(实施例4)或RhB-PS/pDNA纳米粒(实施例7)的细胞培养基,细胞与纳米粒共孵育4h后,弃去纳米粒溶液,用Hoechst 33342溶液对细胞核进行染色,用PBS溶液洗涤细胞三次,于激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取纳米粒的情况。
结果显示,细胞与纳米粒共孵育4h后,观察到细胞内RhB-MPS/pDNA纳米粒的数量明显多于RhB-PS/pDNA纳米粒的数量,同时在细胞核内定位到大量RhB-MPS/pDNA纳米粒,纳米粒的数量明显比RhB-PS/pDNA纳米粒的数量多,这表明甘露糖化精蛋白中甘露糖配基能够通过明确的受体-配体相互作用被RAW 264.7细胞表面甘露糖受体所识别,MPS通 过甘露糖受体介导的主动靶向,增加细胞对纳米粒的摄取这一推论,同时甘露糖修饰后的精蛋白仍然具有核定位信号的功能,因此在甘露糖配体和核定位的双重作用下,进一步促进了核酸的入核(附图4)。
4.MPS/pGL-3纳米粒的体外转染
以荧光素酶质粒pGL-3为报告基因,考察MPS和PS介导基因的转染率。细胞以1×105个/孔接种24孔细胞培养板,培养24h,待细胞汇集度达到60~70%,每孔分别加入含有MPS/pGL-3纳米粒(实施例4)或PS/pGL-3纳米粒(实施例7)的细胞培养基500uL,其中每孔含2ug pGL-3。培养4h后,吸除转染溶液,加入500uL新鲜的含10%血清的相应细胞培养基,继续培养48h。利用多功能酶标仪测定样品发光单位值,利用BCA方法测定的细胞总蛋白浓度进行校准,所有试验重复三次。
结果显示,在RAW264.7细胞中,MPS/pGL-3纳米粒的转染率是PS/pGL-3纳米粒转染率的2.2倍高(p<0.05)。而对于不表达甘露糖受体的293T细胞,MPS/pGL-3和PS/pGL-3的荧光强度无显著性差异(p>0.05)。这些结果进一步证实,MPS中的甘露糖靶头参与了RAW264.7细胞表面甘露糖受体的识别并改善了纳米粒在细胞中的转染率(附图5)。
实施例1-9结果表明,本发明利用甘露糖修饰精蛋白,并未增加其细胞毒性,生物相容性良好。甘露糖修饰的精蛋白与核酸物质形成的纳米粒能够有效靶向巨噬细胞,增加巨噬细胞对基因的摄取,经甘露糖修饰的精蛋白仍然具有核定位信号功能,能够促进核酸入核,从而进一步改善基因的转染率,增加核酸疫苗的免疫原性。而这种纳米粒易制备,包封率高,在基因递送和基因免疫治疗方面有着广阔的应用前景。

Claims (8)

1.一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,它主要是由甘露糖化精蛋白与核酸形成的纳米粒,其中甘露糖化精蛋白是由甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐经还原胺化反应制得。
2.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述精蛋白为鲑鱼精蛋白,分子量为5100Da。
3.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述甘露糖化精蛋白的结构为:
4.根据权利要求3所述的一种甘露糖化精蛋白,其特征在于,所述甘露糖与精蛋白通过-CH2-CH2-桥接。
5.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述甲酰甲基甘露吡喃糖苷与精蛋白硫酸盐的投料摩尔比为8.5∶1~16∶1。
6.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述甘露糖化精蛋白与核酸物质的制备N/P比为0.8∶1~8∶1。
7.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述的核酸物质选自DNA疫苗,RNA疫苗中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种巨噬细胞靶向载体系统,其特征在于,所述载体系统对核酸物质的包封率为90%~100%。
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