CN113710323A - 偶联物及癌治疗剂 - Google Patents

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Abstract

一种偶联物，其中去铁胺类与生物相容性聚合物结合，所述去铁胺类是从去铁胺或者其离子或盐、及它们的衍生物所组成的群组中选择的至少一种化合物，所述生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链、及与所述第1生物相容性聚合物链不同的第2生物相容性聚合物链。

Description

偶联物及癌治疗剂
技术领域
本发明涉及一种与去铁胺类的偶联物、及癌治疗剂。
本案基于2019年4月24日在日本提出申请的特愿2019-083250号主张优先权，将其内容援引于此。
背景技术
癌细胞增殖所需的铁的要求量高，将铁螯合剂应用于癌治疗药的铁螯合疗法作为癌症治疗的新方法，正受到关注。在众多铁螯合剂中，对铁(III)离子显示出特异性的螯合作用的去铁胺(DFO)因为被广泛用作铁过载症的治疗药，所以迄今为止对其研究最为盛行，报告称去铁胺对各种癌细胞株显示出通过细胞周期停滞抑制细胞增殖的效果(非专利文献1-3)。另外，还进行了临床研究，显示出一定的抗肿瘤效果(非专利文献4及5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Becton DL.,Bryles P.Deferoxamine Inhibition of HumanNeuroblastoma Viability and Proliferation.Cancer Research 48,7189-7192,(1988)；
非专利文献2：Yang Y.,Xu Y.,Su A.,Yang D.,Zhang X.Effects ofDeferoxamine on Leukemia In Vitro and Its Related Mechanism.Med Sci Monit.24,6735-6741,(2018)；
非专利文献3：Bajbouj K.,Shafarin J.,Hamad M.High-Dose DeferoxamineTreatment Disrupts Intracellular Iron Homeostasis,Reduces Growth,and InducesApoptosis in Metastatic and Nonmetastatic Breast Cancer Cell Lines.TechnolCancer Res Treat 17,1-11,(2018)；
非专利文献4：Yamasaki T.,Terai S.,Sakaida I.Deferoxamine for AdvancedHepatocellular Carcinoma.The New England Journal of Medicine 365,576-578,(2011)；
非专利文献5：Donfrancesco A.,Deb G.,Dominici C.,Pileggi D.,CastelloMA.,Helson L.Effects of a Single Course of Deferoxamine in NeuroblastomaPatients.Cancer Research 50,4929-4930,(1990)；
非专利文献6：Hamilton JL.,Kizhakkedathu JN.Polymeric nanocarriers forthe treatment of systemic iron overload.Mol.Cell.Ther.3,3,(2015)；
非专利文献7：Hallaway PE.,Eaton JW.,Panter SS.,Hedlund BE.Modulationof deferoxamine toxicity and clearance by covalent attachment tobiocompatible polymers.Proc Natl Acad Sci USA 86,10108-10112,(1989)；
非专利文献8：Blatt J.,Boegel F.,Hedlund BE.,Arena VC.,ShadduckRK.Failure to alter the course of acute myelogenous leukemia in the rat withsubcutaneous deferoxamine.Leukemia Research 15,391-394,(1991)；
非专利文献9：Wang W.,Tabu K.,Hagiya Y.,Sugiyama Y.,Kokubu Y.,MurotaY.,Ogura S.,Taga T.Enhancement of 5-aminolevulinic acid-based fluorescencedetection of side population-defined glioma stem cells by ironchelation.Scientific Reports 7:42070,(2017)。
发明内容
发明要解决的课题
然而，DFO的血中浓度半衰期极短，为20分钟以下，为了获得充分的治疗效果，必须通过点滴来花长时间(8h～)施用(非专利文献4-6)。另外，由于不具有对肿瘤的选择性蓄积，所以也担心会对全身有副作用。
前面的早期消失性问题可通过使DFO与葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)等聚合物结合而改善(非专利文献7)，有报告称施用了与HES结合的DFO(HES-DFO)的白血病大鼠的存活时间延长(非专利文献8)。但并没有研究HES-DFO的肿瘤蓄积性，尚未报告经聚合物修饰的DFO对实体癌显示出抗肿瘤效果的例子。
本发明是为了解决如上所述的问题而完成的，其目的在于提供一种血中滞留性优异、而且具有肿瘤蓄积性、发挥优异的抗肿瘤效果的偶联物及癌治疗剂。
解决课题的技术手段
即，本发明具有以下形态。
＜1＞一种偶联物，其中去铁胺类与生物相容性聚合物结合，所述去铁胺类是从去铁胺或者其离子或盐、及它们的衍生物所组成的群组中选择的至少一种化合物，所述生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链、及与所述第1生物相容性聚合物链不同的第2生物相容性聚合物链。
＜2＞根据上述＜1＞所述的偶联物，其中，所述去铁胺类与所述第2生物相容性聚合物链结合。
＜3＞根据上述＜1＞或＜2＞所述的偶联物，其中，所述第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸。
＜4＞根据上述＜1＞至＜3＞中任一项所述的偶联物，其中，所述第1生物相容性聚合物链为聚乙二醇。
＜5＞根据上述＜1＞至＜4＞中任一项所述的偶联物，其包含下述通式(1)或(1-1)所表示的结构：
[化1]
Figure BDA0003308669310000031
(式(1)～(1-1)中，
A表示所述第1生物相容性聚合物链，
L表示接头部分，
B表示所述第2生物相容性聚合物链，包含下述(b2)所表示的重复结构、或者(b1)所表示的重复结构及(b2)所表示的重复结构)
[化2]
Figure BDA0003308669310000032
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是氨基酸侧链与所述去铁胺类结合而成的，
n表示(b1)及(b2)的合计数，n为1～1000的整数，m为1～1000的整数(其中，m≤n)，当n－m为2以上的情况下，多个R1相互可以相同，也可以不同，当m为2以上的情况下，多个R2相互可以相同，也可以不同)。
＜6＞根据所述＜5＞所述的偶联物，其包含下述通式(1-2)所表示的结构：
[化3]
Figure BDA0003308669310000033
(式(1-2)中，
B表示所述第2生物相容性聚合物链，包含下述(b2-1)所表示的重复结构、或者(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构)
[化4]
Figure BDA0003308669310000034
(式(b1-1)～(b2-1)中，
R11表示氨基酸侧链，
R12是-CH2-COOH所表示的天冬氨酸侧链或者-CH2-CH2-COOH所表示的谷氨酸侧链中的羧基与所述去铁胺类结合而成的，
n1表示(b1-1)及(b2-1)的合计数，n1为1～1000的整数，m1为1～1000的整数(其中，m1≤n1)，当n1－m1为2以上的情况下，多个R11相互可以相同，也可以不同，当m1为2以上的情况下，多个R12相互可以相同，也可以不同)。
＜7＞根据上述＜1＞至＜6＞中任一项所述的偶联物，其数均分子量为2,000～200,000。
＜8＞一种癌治疗剂，其含有作为有效成分的上述＜1＞至＜7＞中任一项所述的偶联物。
发明效果
根据本发明，能够提供一种血中滞留性优异、而且具有肿瘤蓄积性、发挥优异的抗肿瘤效果的偶联物及癌治疗剂。
附图说明
图1是实施例中制作的PEG-PBLA35的1H NMR谱。
图2是PEG-PBLA35的GPC曲线。
图3是实施例中制作的PEG-PBLA78的1H NMR谱。
图4是PEG-PBLA78的GPC曲线。
图5是实施例中制作的PEG-PAsp35的1H NMR谱。
图6是PEG-PAsp35的GPC曲线。
图7是实施例中制作的PEG-PAsp78的1H NMR谱。
图8是PEG-PAsp78的GPC曲线。
图9是实施例中制作的PEG-P[Asp(DFO)10]35的1H NMR谱。
图10是PEG-P[Asp(DFO)10]35的GPC曲线。
图11是实施例中制作的PEG-P[Asp(DFO)26]78的1H NMR谱。
图12是PEG-P[Asp(DFO)26]78的GPC曲线。
图13是说明钙黄绿素(Calcein)-AM法的原理的概要图。
图14是DFO/Fe及PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)/Fe的UV-Vis谱。
图15A是表示通过流式细胞术所获取的钙黄绿素荧光的荧光强度的图表。
图15B是表示通过流式细胞术所获取的钙黄绿素荧光的荧光强度的图表。
图16是表示添加Cy5-PEG-PAsp(DFO)培养24小时后的DLD-1细胞的情况的共聚焦显微镜的观察图像。
图17A是表示DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35的细胞摄入量的图表。
图17B是表示DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35的细胞摄入量的图表。
图18A是表示对添加DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞的细胞周期进行分析所得的结果的图表。
图18B是表示对添加DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞的细胞周期进行分析所得的结果的图表。
图19是表示在添加PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)培养后的DLD-1细胞中抑制了细胞增殖的图表。
图20是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中比较DFO与PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)的血中滞留性的结果的图表。
图21是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中比较DFO与PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)的肿瘤蓄积性的结果的图表。
图22是表示在DLD-1皮下肿瘤小鼠模型中，由施用DFO或者PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)所引起的肿瘤尺寸的经时变化的图表。
图23是表示在DLD-1皮下肿瘤小鼠模型中，由施用DFO或者PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)所引起的体重的经时变化的图表。
图24是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中，由施用DFO或者PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)所引起的肿瘤尺寸的经时变化的图表。
图25是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中，由施用DFO或者PEG-P[Asp(DFO)m]n(n＝35，78)所引起的体重的经时变化的图表。
图26是说明使用5-氨基乙酰丙酸的光动力学诊断和/或治疗的原理的概要图。
图27A是表示添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35、及FerroOrange培养后的DLD-1细胞的情况的共聚焦显微镜的观察图像。
图27B是表示对添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞质内游离铁的量进行分析所得的结果的图表。
图28A是表示添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35、及FITC-抗BrdU抗体培养后的DLD-1细胞的情况的共聚焦显微镜的观察图像。
图28B是表示对添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞的细胞周期进行分析所得的结果的图表。
图29A是表示对添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞中的诱导细胞凋亡的状况通过FCM进行分析所得的结果的图表。
图29B是表示将添加DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35培养后的DLD-1细胞换算成活细胞、细胞凋亡初期细胞、或者细胞凋亡后期/坏死细胞所得的结果的图表。
图30是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中，由施用DFO或者PEG-P[Asp(DFO)10]35所引起的肿瘤中的原卟啉IX累积的经时变化的图表。
图31是表示在CT26细胞的培养液中添加维生素C及PEG-P[Asp(DFO)36]76而确认到癌细胞的杀伤效果的图表。
图32是表示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中，由施用维生素C、或者维生素C及PEG-P[Asp(DFO)36]76所引起的肿瘤尺寸的经时变化的图表。
具体实施方式
以下，对本发明的一实施方案中的偶联物及癌治疗剂进行说明。
《偶联物》
实施方案的偶联物是去铁胺类与生物相容性聚合物结合而成的，所述生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链、及与所述第1生物相容性聚合物链不同的第2生物相容性聚合物链。
实施方案的偶联物具有来自去铁胺类的铁螯合作用，优选对铁(III)离子具有特异性的螯合作用。
实施方案的偶联物是去铁胺类与聚合物结合而成的，所述聚合物可以包含第1聚合物链、及与所述第1聚合物链不同的第2聚合物链，所述聚合物可以是生物相容性聚合物。
＜去铁胺类＞
本说明书中“去铁胺类”意指从去铁胺或者其离子或盐、及它们的衍生物所组成的群组中选择的至少一种化合物。
去铁胺作为下述式(I)所表示的化合物(以下，称为“化合物(I)”)而为人所知。在多种铁螯合剂之中，去铁胺对铁(III)离子显示特异性的螯合作用，也被广泛用作铁过载症的治疗药。
[化5]
Figure BDA0003308669310000061
去铁胺能够以离子或盐的形式提供。作为所述化合物(I)的去铁胺的离子，化合物(I)可以是阳离子，化合物(I)也可以是阴离子。
化合物(I)作为阳离子时，可以列举向化合物(I)中“-NH2”所表示的基团添加质子而变成“-NH3 +”所表示的阳离子部分。
作为化合物(I)的离子，例如，可列举下述式(I-1)所表示的化合物。
[化6]
Figure BDA0003308669310000062
作为去铁胺的盐，例如，可列举药理学上可接受的盐，优选为下述式(I-2)所表示的去铁胺甲磺酸盐。
[化7]
Figure BDA0003308669310000071
作为药理学上可接受的盐，可列举：药理学上可接受的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐等。作为酸加成盐，例如可例示：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐等各无机酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐等各有机酸加成盐。作为金属盐，可例示：锂盐、钠盐、钾盐等各碱金属盐、镁、钙盐等各碱土金属盐、铝、锌等各金属盐。作为铵盐，可例示：铵盐、四甲基铵盐等烷基铵盐等。作为有机胺盐，可例示：三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐、甲苯胺盐等各盐。此外，这些盐在使用时也可以制成溶液使用。
作为去铁胺的衍生物，只要具有所述铁螯合作用便没有特别限制。作为去铁胺的衍生物，可列举在去铁胺或者其离子或盐中，1个以上的氢原子或基团被其以外的基团(取代基)取代而获得的衍生物。另外，在去铁胺或者其离子或盐中，可以添加或去除氢原子。这里，作为取代基，可列举：羟基、氨基、碳数1～4的1价链饱和烃基、卤素原子等。作为碳数1～4的1价的链饱和烃基，例如，可列举：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等。作为卤素原子，可列举：氟原子、氯原子等。
认为去铁胺的铁螯合作用是通过下述式(I-3)中所示的3个异羟肟酸结构部分而发挥。因此，从难以对铁螯合作用造成影响的方面而言，例如，优选在上述化合物(I)中，构成末端的“-NH2”所表示的基团(上述化合物(I-1)中，末端的“-NH3 +”所表示的基团)的氢原子中的1个以上被取代为其以外的基团(上述取代基)。
[化8]
Figure BDA0003308669310000072
＜生物相容性聚合物＞
本实施方案的偶联物中，生物相容性聚合物意指对生物体施用的情况下，不会或不易产生强烈的炎症反应或伤害等显著有害作用或不良影响的聚合物。
作为生物相容性聚合物，只要可获得本发明的效果，便没有特别限制，例如，可列举：聚乙二醇(PEG)、丙烯酸系树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚氨基酸、多核苷酸、聚丙烯酰胺、聚醚、聚酯、聚氨酯、多糖类、它们的共聚物等。生物相容性聚合物可以在一部分具有在其合成过程中导入的任意基团。作为这种基团，例如，可列举一部分聚合引发剂等。
本实施方案所涉及的生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链及第2生物相容性聚合物链。此外，所述第1生物相容性聚合物链与第2生物相容性聚合物链不同，本实施方案的生物相容性聚合物可以包含第1生物相容性聚合物链的嵌段与包含第2生物相容性聚合物链的嵌段的嵌段共聚物的形式提供。另外，本实施方案所涉及的生物相容性聚合物除了第1生物相容性聚合物链及第2生物相容性聚合物链以外，还可以进一步包含其它聚合物链。
本实施方案中，“嵌段共聚物”是指多种嵌段(同种结构单元反复结合所得的部分构成成分)结合而成的聚合物。构成嵌段共聚物的嵌段可以是2种，也可以是3种以上。
生物相容性聚合物的数均分子量(Mn)也可以根据本实施方案的偶联物的分子量适当确定，
第1生物相容性聚合物链的利用1H NMR所算出的数均分子量优选为700～100,000，更优选为2,000～50,000，进一步优选为7,000～30,000。
第2生物相容性聚合物链的利用1H NMR所算出的数均分子量优选为700～100,000，更优选为2,000～50,000，进一步优选为7,000～30,000。
第1生物相容性聚合物链与第2生物相容性聚合物链的数均分子量比(第1生物相容性聚合物链：第2生物相容性聚合物链)例如可以是10：1～1：10，也可以是10：3～3：10。
生物相容性聚合物的分散度(Mw/Mn)优选为1.0以上且小于2.0，更优选为1.0～1.5，进一步优选为1.0～1.3，特别优选为1.0～1.2。从实施方案的偶联物能够更有效地发挥优异的肿瘤蓄积性的观点而言，优选生物相容性聚合物的分散度在上述范围内。
本说明书中，聚合物的数均分子量可以采用根据由1H NMR谱所获得的波峰积分值的比算出的值。作为算出方法，例如可以如下述实施例中所示那样，根据来自聚合物链末端存在的引发剂的结构的波峰积分值、与来自算出对象部分的单体的结构的波峰积分值的比，算出单体的聚合度，并将来自聚合的单体结构的合计分子量与来自引发剂的结构的分子量相加，由此而算出数均分子量。
关于下述偶联物的数均分子量，也可以部分采用根据由1H NMR谱所得的波峰积分值的比算出的值。作为算出方法，例如可以如下述实施例中所示那样，通过如下方式算出：根据来自聚合物链末端存在的引发剂的结构的波峰积分值、与来自算出对象部分的DFO的结构的波峰积分值的比，算出DFO的结合数，并将来自结合的DFO的结构的合计分子量与聚合物链的数均分子量相加。
从生物相容性及通用性优异的观点而言，第1生物相容性聚合物链或第2生物相容性聚合物链优选为聚乙二醇。
从生物相容性及生物稳定性与生物分解性的平衡优异的观点而言，第1生物相容性聚合物链或第2生物相容性聚合物链优选为聚氨基酸。
作为生物相容性聚合物所包含的第1生物相容性聚合物链与第2生物相容性聚合物链的组合，例如优选：第1生物相容性聚合物链为聚乙二醇(PEG)，第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸的组合。
本实施方案的偶联物中，生物相容性聚合物优选为生物分解性。
生物分解性意指能够在生物体内被吸收或分解的性质。作为生物分解性的生物相容性聚合物，只要能够获得本发明的效果，便没有特别限制，例如可列举：聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等。
本说明书中，生物相容性聚合物为生物分解性意指，生物相容性聚合物的至少一部分为生物分解性。因此，聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等与PEG、丙烯酸系树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚丙烯酰胺、聚醚、聚氨酯等的嵌段共聚物等也属于生物分解性的生物相容性聚合物。
通过使用生物分解性的聚合物，能够抑制偶联物向生物体内累积，能够减少副作用。
本说明书中，生物稳定性意指在生物体内不会被即时吸收或即时分解，能够存在。当生物相容性聚合物具有生物分解性及生物稳定性的情况下，意指在生物体内被吸收或分解前的期间，能够存在于生物体内。
本说明书中，生物相容性聚合物为生物稳定性意指，生物相容性聚合物的至少一部分为生物稳定性。因此，聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等与PEG、丙烯酸系树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚丙烯酰胺、聚醚、聚氨酯等的嵌段共聚物等也属于生物稳定性的生物相容性聚合物。
包含第1生物相容性聚合物链与第2生物相容性聚合物链的生物相容性聚合物的制造方法没有特别限制。例如，能够通过如下方法制造：利用公知的聚合反应合成第1生物相容性聚合物链后，使第2生物相容性聚合物链的单体聚合至第1生物相容性聚合物链。利用聚合反应所获得的所述聚合物链可以分别是前体(例如具有保护基)的状态，可以对利用聚合反应所获得的前体进行由本领域技术人员选择的通常处理，制造第1生物相容性聚合物链及第2生物相容性聚合物链。
或者，可以使预先作为聚合体提供的第1生物相容性聚合物链或其前体与第2生物相容性聚合物链或其前体利用公知的反应结合。此时，可以利用反应性的官能团彼此的结合将两者结合。在使用前体的情况下，可以同样地适当进行处理而制造第1生物相容性聚合物链及第2生物相容性聚合物链。
＜偶联物＞
本实施方案的偶联物是去铁胺类与生物相容性聚合物结合而成的。
另外，关于生物相容性聚合物与去铁胺类的结合，生物相容性聚合物与去铁胺类可以直接结合，也可以经由任意的接头结合，只要能够获得本发明的效果，那么其结合方式没有特别限制。
为了保证在体内的结合稳定性，优选生物相容性聚合物与去铁胺类通过共价键结合。
例如，可以利用生物相容性聚合物与去铁胺类的互为反应性的官能团彼此的结合而结合。反应性的官能团可以是生物相容性聚合物和/或去铁胺类原本就具有的，也可以是修饰或导入的。
在生物相容性聚合物与去铁胺类的结合中，只要去铁胺类及生物相容性聚合物分别能够获得本发明的效果，则可以接受为了它们的结合而必须的结构变化。
在实施方案的偶联物中，可以与生物相容性聚合物仅结合1个去铁胺类，也可以结合2个以上。
本实施方案的偶联物中的去铁胺类的个数是1以上的整数即可，可以是1～1000的整数，可以是3～100的整数，可以是5～50的整数。
通过使所述个数为所述下限值以上，从而良好地发挥去铁胺类的铁螯合作用，通过使所述个数为所述上限值以下，偶联物的亲水性适度地提高，因而是优选的。
本实施方案的偶联物中，去铁胺类能够与生物相容性聚合物中的任意部位结合。去铁胺类可以结合于第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链。
例如，去铁胺类可以与第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链所具有的官能团结合。
该结合方式没有特别限定，例如在所述化合物(I)的去铁胺中，若与“-NH2”所表示的基团(氨基)结合，则不易对去铁胺的铁螯合作用产生影响，且无需对去铁胺进行修饰或制成衍生物。因此，例如，去铁胺类可以通过去铁胺类的氨基与第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链所具有的“能够与氨基结合的基团”结合。
作为能够与氨基结合的基团，可列举：羧基、羟基、醛基或羰基。这些基团可以是所述聚合物链的侧链所具有的基团。
其中，从与氨基的结合稳定性及合成容易性的观点而言，作为能够与氨基结合的基团，优选为羧基。第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链可以具有羧基。通过使第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链的羧基与去铁胺类的氨基形成酰胺键，能够使第1生物相容性聚合物链和/或第2生物相容性聚合物链与去铁胺类结合。
作为分子内具有羧基的生物相容性聚合物链，可列举：聚氨基酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素、透明质酸等。
羧基可以是被保护基保护的羧基。
在不具有羧基或被保护基保护的羧基的生物相容性聚合物链的情况下，可以通过使用氯乙酸、琥珀酸酐、氯甲酸对硝基苯酯等的公知方法导入羧基。
例如，在生物相容性聚合物为聚丙烯酰胺的情况下，可以将丙烯酸或丙烯酸苄酯作为原料，通过自由基聚合或活性自由基聚合等公知制造方法，制造具有羧基或被保护基保护的羧基的生物相容性聚合物。
作为利用羧基与氨基形成酰胺键的方法，例如，可列举：使具有羧基的生物相容性聚合物链与具有氨基的去铁胺类在N,N’-二环己基碳二酰亚胺等缩合剂的存在下进行缩合反应。另外，在具有被保护基保护的羧基的生物相容性聚合物链的情况下，可以利用公知的反应使保护基脱保护，获得具有羧基的生物相容性聚合物链后，同样地进行缩合反应。
另外，去铁胺类可以仅与第1生物相容性聚合物链或第2生物相容性聚合物链的任一方结合。例如，去铁胺类可以结合于第2生物相容性聚合物链。例如，第2生物相容性聚合物链具有侧链，去铁胺类可以与第2生物相容性聚合物链的侧链结合。
作为本实施方案的偶联物的一例，可以列举包含下述通式(1)或(1-1)所表示的结构的偶联物。
[化9]
Figure BDA0003308669310000111
(式(1)～(1-1)中，A表示所述第1生物相容性聚合物链，L表示接头部分，B表示与所述去铁胺类结合的所述第2生物相容性聚合物链。)
所述接头部分优选为碳原子数1～20的亚烷基，优选为碳原子数1～20的直链的亚烷基，更优选为碳原子数1～5的直链的亚烷基。该亚烷基中的1个或2个以上的-CH2-可分别独立地被取代为-CH＝CH-、-O-、-CO-、-S-、-NH-、或者-CONH-。作为亚烷基，可例示：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基等。
本实施方案的偶联物中，去铁胺类所结合的第2生物相容性聚合物链优选为聚氨基酸。
当第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸的情况下，作为所述通式(1)或(1-1)中的B，优选以下。
B表示与所述去铁胺类结合的所述第2生物相容性聚合物链，第2生物相容性聚合物链优选包含下述(b2)所表示的重复结构、或者(b1)所表示的重复结构及(b2)所表示的重复结构。
[化10]
Figure BDA0003308669310000121
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是氨基酸侧链与所述去铁胺类结合而成的，
n表示(b1)及(b2)的合计数，n为1～1000的整数，m为1～1000的整数(其中，m≤n)，当n－m为2以上的情况下，多个R1相互可以相同，也可以不同，当m为2以上的情况下，多个R2相互可以相同，也可以不同)。
氨基酸侧链是以该领域中的通常含义使用，指多肽的酰胺键所涉及的氨基与羧基以外的结构，例如若为甘氨酸则指氢原子，若为丙氨酸则指甲基，若为缬氨酸则指异丙基。
当第2生物相容性聚合物链包含(b1)所表示的重复结构及(b2)所表示的重复结构的情况下，(b1)与(b2)的排列可以随机。m表示第2生物相容性聚合物链中的(b2)的合计数，n－m表示第2生物相容性聚合物链中的(b1)的合计数。n－m可以是0(即，第2生物相容性聚合物链可以仅具有(b1)及(b2)中的与去铁胺类结合的(b2)。)。
第2生物相容性聚合物链可以由所述(b2)所表示的重复结构、或者(b1)所表示的重复结构及(b2)所表示的重复结构组成。
另外，R1的氨基酸侧链与R2的氨基酸侧链相互可以相同，也可以不同。
式(b1)～(b2)中，n为1～1000的整数，可以是10～500的整数，也可以是20～100的整数。通过使所述n的值在所述范围内，第2生物相容性聚合物链的分子量的值变得适宜，因而是优选的。
式(b1)～(b2)中，m为1～1000的整数，可以是3～100的整数，也可以是5～50的整数。通过使所述m的值为所述下限值以上，从而良好地发挥去铁胺类的铁螯合作用，通过使所述m的值为所述上限值以下，偶联物的亲水性变良好，因而是优选的。
此外，这里，虽然也例示了n大于m的情况的数值范围，但n与m可以是同一数字。
聚氨基酸与去铁胺类的结合方式没有特别限定，优选聚氨基酸的氨基酸侧链与去铁胺类结合。作为使去铁胺类与聚氨基酸的氨基酸侧链结合的方法，可列举：与赖氨酸侧链的氨基形成酰胺键、与半胱氨酸侧链的硫醇基形成二硫键的方法等。如上所述，例如，在所述化合物(I)的去铁胺中，若与“-NH2”所表示的基团(氨基)结合，则不易对去铁胺的铁螯合作用产生影响，且无需将去铁胺制成衍生物，因此优选使天冬氨酸侧链或谷氨酸侧链的羧基与去铁胺类的氨基形成酰胺键的方法。
当第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸，且包含天冬氨酸和/或谷氨酸作为结构单元的情况下，所述通式(1)或(1-1)中的B优选为以下结构。
B表示与所述去铁胺类结合的所述第2生物相容性聚合物链，第2生物相容性聚合物链优选包含下述(b2-1)所表示的重复结构、或者(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构。
[化11]
Figure BDA0003308669310000131
(式(b1-1)～(b2-1)中，
R11表示氨基酸侧链，
R12是-CH2-COOH所表示的天冬氨酸侧链或-CH2-CH2-COOH所表示的谷氨酸侧链中的羧基与所述去铁胺类结合而成的，
n1表示(b1-1)及(b2-1)的合计数，n1为1～1000的整数，m1为1～1000的整数(其中，m1≤n1)，当n1－m1为2以上的情况下，多个R11相互可以相同，也可以不同，当m1为2以上的情况下，多个R12相互可以相同，也可以不同)。
当第2生物相容性聚合物链包含(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构的情况下，(b1-1)与(b2-1)的排列可以是随机的。n1及m1与所述n及m的关系相同，作为n及m所说明的数值等也可以应用于n1及m1。
第2生物相容性聚合物链可以由所述(b2-1)所表示的重复结构、或者(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构组成。
另外，R11的氨基酸侧链与R12的氨基酸侧链相互可以相同，也可以不同。
第1生物相容性聚合物链优选为聚乙二醇。
当第1生物相容性聚合物链为聚乙二醇，第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸，且包含天冬氨酸和/或谷氨酸作为结构单元的情况下，所述通式(1)所表示的结构优选为下述通式(1-2)所表示的结构。
[化12]
Figure BDA0003308669310000141
(式(1-2)中，
I为1～1500的整数，B表示与所述去铁胺类结合的所述第2生物相容性聚合物链，第2生物相容性聚合物链包含下述(b2-1)所表示的重复结构、或者(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构)。
式(1-2)中，I为1～1500的整数，可以是10～1000的整数，可以是100～500的整数。
[化13]
Figure BDA0003308669310000142
(式(b1-1)～(b2-1)中，R11、R12、n1、及m1表示与上述相同的含义)。
本实施方案的偶联物优选数均分子量(Mn)为2,000～200,000，例如可以是5,000～100,000，可以是10,000～50,000，可以是17,000～45,000，也可以是20,000～40,000。
通过使偶联物的数均分子量为上述范围内，能够适度地提升偶联物的血中滞留性、向肿瘤组织的蓄积性，且防止向肝脏等正常组织的蓄积。其结果，能够将去铁胺类效率良好地递送至肿瘤组织。
认为偶联物的肿瘤蓄积性是通过利用肿瘤增强的血管渗透性向肿瘤选择性蓄积、即通过增强的渗透性和保留效应(EPR(enhanced permeability and retention)效应)而发挥，通过在肿瘤内选择性除铁，从而达成更优异的抗肿瘤效果。
另外，偶联物可以形成聚合物胶束，也可以是聚合物囊泡的形式。
本实施方案的偶联物的血中滞留性优异，进而具有肿瘤蓄积性，发挥优异的抗肿瘤效果，非常优秀。
以往，DFO缺乏血中滞留性，因此需要通过点滴来连续施用。另一方面，本实施方案的偶联物由于具有优异的血中滞留性，故而能够采用空出更长间隔的施用形式，能够容易地开处方。
本实施方案的偶联物由于具有优异的肿瘤蓄积性，故而不会诱导药物向正常组织的蓄积，能够仅提升药物向肿瘤组织的蓄积。其结果，根据本实施方案的偶联物，能够实现高药效与低副作用。
以往，虽然进行了使DFO与葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)等聚合物结合，但尚未报告经聚合物修饰的DFO对实体癌显示抗肿瘤效果的例子。
认为本实施方案的偶联物具有优异的血中滞留性及肿瘤蓄积性的原因在于：生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链、及与所述第1生物相容性聚合物链不同的第2生物相容性聚合物链。认为通过使偶联物包含不同种类的聚合物链，从而若将其向生物体内施用，则不同种类的链彼此不会相互混合，与生物体内的其它分子结合、能够稳定。认为实施方案的偶联物、例如本实施方案的偶联物与作为癌蓄积性蛋白质的血清白蛋白等的亲和性提升，发挥更优异的肿瘤蓄积性与抗肿瘤效果。
《癌治疗剂》
作为本发明的一实施方案，提供一种含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物。
作为本发明的一实施方案，提供一种含有实施方案的偶联物作为有效成分的癌治疗剂。
所述实施方案的偶联物由于具有铁螯合作用，故而期待利用铁螯合作用对各种疾病的治疗效果。
作为期待治疗效果的对象疾病，可列举：铁过载症、以及需铁性癌，例如可列举实体癌等。作为人类的实体癌，例如可列举：脑癌、头颈癌、食道癌、甲状腺癌、小细胞癌、非小细胞癌、乳癌、胃癌、胆囊/胆管癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、胰癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、绒毛上皮癌、子宫体癌、子宫颈癌、肾盂/输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、胚胎性癌、威尔姆斯癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤文氏瘤、软组织肉瘤等。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂可以进一步含有其它抗癌剂等。通过该构成，能够期待对癌治疗的协同效应。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂能够用于使用5-氨基乙酰丙酸或其衍生物、盐或酯(以下，也简称“ALA类”；关于ALA类的详情，如下文所述)的光动力学诊断和/或治疗。以下，对使用5-氨基乙酰丙酸的光动力学诊断和/或治疗的原理进行说明。
如图26所示，5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)被摄入细胞后，用于血红素生物合成途径。已知作为其代谢中间物的原卟啉IX会向癌细胞选择性地累积。原卟啉IX为光敏感性物质，故而通过照射特定波长的光，能够在癌细胞内产生造成伤害的活性氧，杀伤癌细胞(光动力学治疗)。另外，通过对原卟啉IX照射特定波长(例如，400-410nm)的光，能够发出红色荧光，从而有效地使癌细胞可见化(光动力学诊断)。
然而，例如与癌症的复发深切相关的癌干细胞由于铁的摄入量特别高，故而原卟啉IX的代谢增强。在癌干细胞中，由于原卟啉IX不会累积，故而担忧治疗效果降低。
因此，如非专利文献9所示，认为通过使用实施方案的癌治疗剂螯合癌细胞内的铁离子，从而提高癌细胞选择性的原卟啉IX累积性，能够提升光动力学诊断和/或治疗的效果。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂可以作为用于光动力学诊断和/或治疗的药物组合物或癌治疗剂单独提供，也可以作为与上述ALA类的合剂或组合制剂等剂型提供。
作为一实施方案，提供一种方法，其包括将所述ALA类与实施方案的偶联物向需要治疗的对象施用。
作为一实施方案，提供一种癌症的治疗方法，其包括将所述ALA类与实施方案的偶联物向需要治疗的对象施用。
作为一实施方案，提供一种药物组合物或癌治疗剂，其含有实施方案的偶联物作为有效成分，用于向施用或正在施用所述ALA类的对象施用。
作为一实施方案，提供一种药物组合物或癌治疗剂，其含有所述ALA类作为有效成分，用于向施用或正在施用实施方案的偶联物的对象施用。
作为一实施方案，提供一种实施方案的偶联物，其用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供所述ALA类及实施方案的偶联物，其用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供实施方案的偶联物的用途，用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供所述ALA类及实施方案的偶联物的用途，用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供一种含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供一种含有所述ALA类及实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗。
作为一实施方案，提供一种用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗的试剂盒，所述试剂盒具有：含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂、及含有所述ALA类作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂。
作为一实施方案，提供实施方案的偶联物在制备用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗的药物中的用途。
作为一实施方案，提供所述ALA类及实施方案的偶联物在制备用于针对癌症的光动力学诊断和/或治疗的药物中的用途。
作为所述对象，例示癌症患者。
所述针对癌症的光动力学诊断和/或治疗包括向施用了所述ALA类和/或实施方案的偶联物的对象所具有的细胞照射光线。所述细胞是包括肿瘤的概念。所述光线的波长是公知的，只要能够在癌细胞内产生活性氧即可。
本说明书中，ALA意指5-氨基乙酰丙酸。ALA也称为δ-氨基乙酰丙酸，是氨基酸的一种。
作为ALA的衍生物，可例示下述式(II)所表示的化合物。式(II)中，R21表示氢原子或酰基，R22表示氢原子、直链或支链烷基、环烷基、芳基或芳烷基。此外，式(II)中，ALA相当于R21及R22为氢原子的情况。
[化14]
R21-NHCH2COCH2CH2COOR22 (II)
ALA类可以在生物体内以式(II)的ALA或其衍生物的状态作为有效成分发挥作用，也可以作为被生物体内的酶分解的前药(前体)施用。
作为式(II)的R21中的酰基，可列举：甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、异戊酰基、新戊酰基、己酰基、辛酰基、苄基羰基等直链或支链的碳数1～8的烷酰基、或苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基等碳数7～14的芳酰基。
作为式(II)的R22中的烷基，可列举：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等直连或支链的碳数1～8的烷基。
作为式(II)的R22中的环烷基，可列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环十二烷基、1-环己烯基等饱和、或者可部分地存在不饱和键的碳数3～8的环烷基。
作为式(II)的R22中的芳基，可列举：苯基、萘基、蒽基、菲基等碳数6～14的芳基。
作为式(II)的R22中的芳烷基，芳基部分可作与所述芳基相同的例示，烷基部分可作与所述烷基相同的例示，具体而言，可列举：苄基、苯乙基、苯基丙基、苯基丁基、二苯甲基、三苯甲基、萘基甲基、萘基乙基等碳数7～15的芳烷基。
作为优选的ALA衍生物，可列举R21为甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基等的化合物。另外，作为优选的ALA衍生物，可列举所述R22为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等的化合物。另外，作为优选的ALA衍生物，可列举所述R21与R22的组合为(甲酰基与甲基)、(乙酰基与甲基)、(丙酰基与甲基)、(丁酰基与甲基)、(甲酰基与乙基)、(乙酰基与乙基)、(丙酰基与乙基)、(丁酰基与乙基)的各组合的化合物。
ALA类之中，作为ALA或其衍生物的盐，可列举药理学上可接受的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐等。作为酸加成盐，例如可例示：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐等各无机酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、甲苯磺酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、乙醇酸盐、甲磺酸盐、丁酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、苹果酸盐等各有机酸加成盐。作为金属盐，可例示：锂盐、钠盐、钾盐等各碱金属盐、镁、钙盐等各碱土金属盐、铝、锌等各金属盐。作为铵盐，可例示：铵盐、四甲基铵盐等烷基铵盐等。作为有机胺盐，可例示：三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐、甲苯胺盐等各盐。此外，这些盐在使用时也可以制成溶液使用。
作为ALA类的酯，可列举：甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯等，但并不限定于此。
以上ALA类之中，最理想的是ALA、及ALA甲酯、ALA乙酯、ALA丙酯、ALA丁酯、ALA戊酯等各种酯类、以及它们的盐酸盐、磷酸盐、硫酸盐。尤其是可例示ALA盐酸盐、ALA磷酸盐作为最适宜的ALA类。
所述ALA类例如可通过化学合成、利用微生物进行的生产、利用酶进行的生产等公知的方法制造。另外，所述ALA类可以形成水合物或溶剂合物，另外，也可以将ALA类单独使用或适当组合2种以上使用。
在将所述ALA类制备成水溶液的情况下，为了防止ALA类分解，必须留意使水溶液不会变成碱性。已变成碱性的情况下，通过去除氧，能够防止分解。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂也可以用于利用抗坏血酸或其衍生物或其盐(以下，也简称为“抗坏血酸类”；关于抗坏血酸类的详情，将在下文叙述)的维生素C疗法。以下，对使用抗坏血酸的维生素C疗法的原理进行说明。
已知若将药理学浓度的维生素C(抗坏血酸)进行静脉注射，则在肿瘤内的细胞外域产生过氧化氢(H2O2)，该过氧化氢渗透至肿瘤细胞而产生抗肿瘤效果(维生素C疗法)[Q.Chen,M.G.Espey,M.C.Krishna,J.B.Mitchell,C.P.Corpe,G.R.Buettner,E.Shacter,M.Levine,Pharmacologic ascorbic acid concentrations selectively kill cancercells:action as a pro-drug to deliver hydrogen peroxide to tissues.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,13604-13609(2005).,Q.Chen,M.G.Espey,A.Y.Sun,J.H.Lee,M.C.Krishna,E.Shacter,P.L.Choyke,C.Pooput,K.L.Kirk,G.R.Buettner,M.Levine,Ascorbate in pharmacologic concentrations selectively generates ascorbateradical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104,8749-8754(2007).,Q.Chen,M.G.Espey,A.Y.Sun,C.Pooput,K.L.Kirk,M.C.Krishna,D.S.Khosh,J.Drisko,M.Levine,Pharmacologic doses of ascorbate actas a prooxidant and decrease growth of aggressive tumor xenografts inmice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 105,11105-11109(2008)]。
另一方面，根据最近的研究[M.Mojic,J.Bogdanovic Pristov,D.Maksimovic-Ivanic,D.R.Jones,M.Stanic,S.Mijatovic,I.Spasojevic,Extracellular irondiminishes anticancer effects of vitamin C:an in vitro study.Sci.Rep.4,5955(2014)]，报告称肿瘤内细胞外域的过剩铁离子通过芬顿反应，将过氧化氢转换为羟基自由基，该羟基自由基由于细胞内渗透性低，故而杀细胞效果降低。因此，期待若能使肿瘤内的过剩铁离子失活，则能够提高由维生素C产生的抗肿瘤效果。
本说明书中，“抗坏血酸类”是包括抗坏血酸或其衍生物或其盐的概念，也称为维生素C。另外，虽然天然存在的是L-抗坏血酸，但L-抗坏血酸、通过化学合成所获得的D-抗坏血酸都可以良好地使用。
作为抗坏血酸的盐，可列举作为所述ALA类的盐所例示的种类的盐。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂可以作为用于维生素C疗法的药物组合物或癌治疗剂单独地提供，也可以作为与所述抗坏血酸类的合剂或组合制剂等剂型提供。
作为一实施方案，提供一种方法，其包括将所述抗坏血酸类与实施方案的偶联物向需要治疗的对象施用。
作为一实施方案，提供一种癌症的治疗方法，其包括将所述抗坏血酸类与实施方案的偶联物向需要治疗的对象施用。
作为一实施方案，提供一种含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于向施用或正在施用所述抗坏血酸类的对象施用。
作为一实施方案，提供一种含有所述抗坏血酸类作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于向施用或正在施用实施方案的偶联物的对象施用。
作为一实施方案，提供一种实施方案的偶联物，其用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供所述抗坏血酸类及实施方案的偶联物，其用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供一种实施方案的偶联物的用途，用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供所述抗坏血酸类及实施方案的偶联物的用途，用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供一种含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供一种含有所述抗坏血酸类及实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂，其用于针对癌症的维生素C疗法。
作为一实施方案，提供一种试剂盒，其用于针对癌症的维生素C疗法，所述试剂盒具有：含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂、及含有所述抗坏血酸类作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂。
作为一实施方案，提供实施方案的偶联物用于制备用于针对癌症的维生素C疗法的药物的用途。
作为一实施方案，提供所述抗坏血酸类及实施方案的偶联物用于制备针对癌症的维生素C疗法的药物的用途。
作为所述对象，例示癌症患者。
所述维生素C疗法包括将抗坏血酸类向对象施用，优选包括静脉注射。所述对象是包括具有肿瘤的患者的概念。
维生素C疗法中的肿瘤内的抗坏血酸类的浓度只要具有抗肿瘤效果，便没有特别限制，作为一例，可以是1mM以上，可以是2mM以上，也可以是3mM以上。作为维生素C疗法中的肿瘤内的抗坏血酸类的浓度的上限值，没有特别限制，作为一例，可以是20mM以下，可以是15mM以下，也可以是10mM以下。作为肿瘤内的抗坏血酸类的浓度的所述数值范围的一例，例如可以是1mM以上且20mM以下，可以是2mM以上且15mM以下，也可以是3mM以上且10mM以下。
实施方案的药物组合物或癌治疗剂向对象的施用、向患者的施用例如可以通过动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等、以及以鼻腔内、经支气管、肌内、经皮、或经口方式，利用本领域技术人员所公知的方法进行。施用量根据患者的体重或年龄、施用方法等而变动，本领域技术人员可以适当选择合适的施用量。施用量、施用方法根据患者的体重或年龄、症状等而变动，本领域技术人员可以适当选择。
实施方案的药物组合物或癌治疗剂的剂型可以根据所述施用途径适当确定，没有特别限定，可以列举：注射剂、点滴剂、片剂、胶囊剂、细粒剂、散剂、液剂、溶解于糖浆等的水剂、贴敷剂、栓剂等。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的剂型优选经口剂、注射剂或点滴剂。
含有所述ALA类作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的剂型优选经口剂、注射剂或点滴剂。
含有所述抗坏血酸类作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的剂型优选注射剂或点滴剂，更优选用于静脉注射的注射剂或点滴剂。
药物组合物或癌治疗剂可以视需要添加其它药效成分、营养剂、载体等其它任意成分。作为任意成分，例如可以添加结晶纤维素、明胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物性及动物性脂肪、油脂、胶、聚亚烷基二醇等药学上可接受的通常的载体、粘合剂、稳定剂、溶剂、分散介质、增量剂、赋形剂、稀释剂、pH值缓冲剂、崩解剂、增溶剂、助溶剂、等渗剂等各种调剂用调配成分。
作为实施方案的药物组合物或癌治疗剂中的制剂的例子，可列举以视需要施以糖衣的片剂、胶囊剂、酏剂、微胶囊剂的形式使用的经口剂。
或者，可列举：以与水或其以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液或者悬浮液的注射剂形式非经口地使用的制剂。此外，可列举通过与药理学上可接受的载体或介质、具体而言杀菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载剂、防腐剂、粘合剂等适当组合，通过以通常认可的制药实施所要求的单位用量形式混合而制得的制剂。
作为能够混合在片剂、胶囊剂中的添加剂，例如可使用明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯胶之类的粘合剂、结晶纤维素之类的赋形剂、玉米淀粉、明胶、海藻酸之类的膨化剂、硬脂酸镁之类的润滑剂、蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂、薄荷、红珠树油或樱桃之类的香味剂。在制剂单位形式为胶囊的情况下，上述材料中可以进一步含有油脂之类的液状载体。用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的载剂，按照通常的制剂施用开处方。
作为注射用的水溶液，例如可列举：生理盐水、包含葡萄糖或其它佐剂的等渗液、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可以与适当的助溶剂、例如醇、具体而言乙醇、多元醇、例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂、例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50一起使用。
作为油性液，可列举：芝麻油、大豆油，可以与作为助溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇一起使用。另外，可以与缓冲剂、例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、镇痛剂、例如盐酸普鲁卡因、稳定剂、例如苄醇、苯酚、抗氧化剂进行调配。制备的注射液通常填充至合适的安瓿中。
根据对象的身高、体重、年龄、及症状，应通过药物组合物或癌治疗剂施用的偶联物的施用量，相对于对象的体重每1kg，按DFO换算，可以在0.1mg～1,000mg、优选为0.1mg～200mg、更优选为0.5mg～50mg、进一步优选为1mg～20mg的范围内施用。
根据对象的身高、体重、年龄、及症状，应通过药物组合物或癌治疗剂施用的ALA类的施用量，相对于对象的体重每1kg，按ALA换算(即，式(II)中，R21及R22为氢原子的情况下的质量换算)，可以在优选为1mg～1,000mg、优选为5mg～100mg、更优选为10mg～30mg、进一步优选为15mg～25mg的范围内施用。
根据对象的身高、体重、年龄、及症状，应通过药物组合物或癌治疗剂施用的抗坏血酸类的施用量，相对于对象的体重每1kg，按抗坏血酸换算，可以是5mg以上，可以是20mg以上，例如，可以是5mg～1,000mg，也可以是20mg～1,000mg。在研究更高浓度的抗坏血酸类的施用量的情况下，抗坏血酸类的施用量，相对于对象的体重每1kg，按抗坏血酸换算，可以是50mg～1,000mg，可以是250mg～1000mg，可以是400mg～1,000mg，也可以是500mg～800mg。
将所述ALA类或抗坏血酸类与实施方案的偶联物向对象施用时的施用次数及施用频度可以由本领域技术人员鉴于一起使用的所述ALA类或抗坏血酸类与偶联物各自的施用状況(施用间隔、施用次数、及施用期间)，从而适当地确定合适的施用次数及施用频度。在本发明的一实施方案中，含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂可以在所述ALA类或抗坏血酸类的施用前、施用时、或施用后施用。
含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂与所述ALA类或抗坏血酸类可以以各自的有效量向对象同时或不同时地、连续地或隔开间隔地施用。含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂与所述ALA类或抗坏血酸类可以在同一施用周期向肿瘤患者施用，也可以分别在不同的施用周期施用。
在本发明的一实施方案中，所述ALA类或抗坏血酸类向对象的施用是在开始施用含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂前开始。例如，所述ALA类或抗坏血酸类在含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的施用开始1周前至当天之间，可以施用一次以上，也可以连续数日施用。含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的施用开始时间点没有特别限制，含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂优选在所述ALA类或抗坏血酸类的施用开始时间点起1周以内、更优选3天以内、进一步优选1天以内施用。
本发明的另一实施方案中，所述ALA类或抗坏血酸类向对象的施用与含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的施用在同一天开始。例如，所述ALA类或抗坏血酸类可以从含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的施用开始日起施用。在将所述ALA类或抗坏血酸类与含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂同时施用的情况下，可以将它们制备成单一制剂来施用，也可以利用不同的施用途径同时地施用。
在本发明的又一实施方案中，向对象施用所述ALA类或抗坏血酸类是在施用了含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂后开始的。例如，含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂在开始施用所述ALA类或抗坏血酸类1周前起到当天之间，可以施用一次以上，也可以连续数日施用。所述ALA类或抗坏血酸类的施用开始时间点没有特别限制，所述ALA类或抗坏血酸类优选在含有实施方案的偶联物作为有效成分的药物组合物或癌治疗剂的施用开始时间点起1周以内、更优选3天以内、进一步优选1天以内施用。
本说明书中使用的术语除了特别定义的以外，均用于说明特定的实施方案，并不旨在限定发明。
另外，本说明书中使用的“包含”这一术语除了根据语境明显应作不同理解的情况外，均意指所记述的事项(构件、步骤、要素、数字等)是存在的，并不排除存在其以外的事项(构件、步骤、要素、数字等)。
[实施例]
以下，示出实施例来进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
1.PEG10k-聚[天冬氨酸(去铁胺)m]n(PEG10k-Poly[Aspartic acid(Deferoxamine)m]n)的合成
＜1.1.概要＞
记载了实施例中制造的铁螯合剂PEG10k-聚[天冬氨酸(去铁胺)m]n(以下，简称为PEG-P[Asp(DFO)m]n)的合成法。n表示Asp的聚合度，m表示DFO的导入数。
[化15]
Figure BDA0003308669310000231
PEG10k-NH2作为引发剂、BLA-NCA作为单体，通过N-羧酸酐(NCA，N-carboxyanhydride)聚合来合成PEG-PBLAn。在碱性条件下将侧链的羧基脱保护，获得PEG-PAspn。其后，将去铁胺的氨基结合于PEG-PAspn的羧基而获得PEG-P[Asp(DFO)m]n。
＜1.2.试剂＞
没有特别记述的试剂/溶剂直接使用市售品。
·α-甲氧基-ω-氨基-聚(乙二醇)(PEG-NH2)[Mw:10K]：NOF Co.,Inc.
·苯：Nacalai Tesque Inc.
·β-苄基L-天冬氨酸N-羧酸酐(BLA-NCA)：Chuo Kaseihin Co.,Inc.
·二氯甲烷(DCM)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
在氩气环境下蒸馏使用。(b.p.40℃)
·N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
在氩气环境下蒸馏使用。(b.p.135℃)
·己烷：Kanto Chemical CO.,Inc.
·乙酸乙酯：Kanto Chemical CO.,Inc.
·5mol/L HCl：Nacalai Tesque Inc.
·5mol/L NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·二甲基亚砜(DMSO)：Nacalai Tesque Inc.
·甲磺酸去铁胺(DFO)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·N,N'-二环己基碳二酰亚胺(DCC)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·N,N-二甲基-4-氨基吡啶(DMAP)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·氯化钠(NaCl)：Nacalai Tesque Inc.
·磷酸二氢钠(NaH2PO3)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
＜1.3.测定仪器＞
·NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)：BRUKER AVANCEIII400(400MHz,BRUKER BioSpin)
旋转：关
累计次数：24次
温度：25℃
·GPC(Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱)：Jasco InternationalCo.,Ltd.
柱：TSK-gel superAW3000(Tosoh Corporation)，
Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare)
检测器：RI-2031
＜1.4.合成方法＞
[PEG-PBLAn的合成]
称取PEG-NH2 1.00g(0.100mmol)至300mL二口茄形烧瓶中，使其溶解于苯10.0mL后，进行冷冻干燥。在氩气环境下称取BLA-NCA 1.20g(4.81mmol)(n＝35)及2.40g(9.62mmol)(n＝78)至100mL二口茄形烧瓶。向PEG-NH2添加DMF 1.36mL、DCM 13.6mL。另外，向BLA-NCA添加DMF 1.63mL(n＝35)及3.26mL(n＝78)、添加DCM 16.3mL(n＝35)及32.6mL(n＝78)，并使其溶解。将BLA-NCA溶液添加至PEG-NH2溶液，在氩气环境下、室温下搅拌48小时。将反应溶液分别滴加至己烷、乙酸乙酯混合溶剂(己烷：乙酸乙酯＝3：2)600mL(n＝35)及750mL(n＝78)，并通过再沉淀而纯化。其后，进行减压干燥，以产量1.71g(n＝35)及2.54g(n＝78)、产率97％(n＝35)及98％(n＝78)获得白色固体PEG-PBLAn。将1H-NMR谱示于图1及图3，将GPC曲线(在柱：TSK-gel superAW3000，洗脱液：NMP(50mM LiBr)，流速：0.30mL/min，测定温度：40℃的条件下获得)示于图2及图4。
·PEG-PBLA35的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.53-2.69,2.76-2.92(br,-CH2-C＝O-O-),3.42-3.67(br,-CH2-CH2-O-),4.95-5.13(br,-O-CH2-Ph),7.20-7.39(br,Ph)
·PEG-PBLA78的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):属性与上述PEG-PBLA35的1H NMR谱相同
[PEG-PBLAn的脱保护]
分别称取PEG-PBLA35 500mg(0.0284mmol)及PEG-PBLA78 500mg(0.0194mmol)至50mL茄形烧瓶中，添加5mL的0.1M NaOH，在室温下搅拌一晩。将反应溶液放入透析膜(MWCO＝6～8kDa)，利用2L的0.01M HCl、接着利用2L的纯水，各2次，进行透析。将溶液冷冻干燥，以产量367mg(n＝35)及331mg(n＝78)、产率92％(n＝35)及90％(n＝78)获得白色固体PEG-PAspn。将1H-NMR谱示于图5及图7，将GPC曲线(在柱：Superdex 200increase 10/300GL，洗脱液：10mM NaH2PO4、140mM NaCl(pH值7.4)，流速：0.75mL/min，测定温度：室温的条件下获得)示于图6及图8。
·PEG-PAsp35的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,D2O):δ2.73-2.97(br,-CH2-COOH),3.62-3.82(br,-CH2-CH2-O-)
·PEG-PAsp78的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,D2O):属性与上述PEG-PAsp35的1H NMR谱相同
[DFO与PEG-PAspn的结合]
分别称取PEG-Asp35 100mg(7.14μmol)及PEG-Asp78 100mg(5.26μmol)至50mL茄形烧瓶，溶解于DMSO 30mL。向其中添加DCC 256mg(1.24mmol)(n＝35)及407mg(1.91mmol)(n＝78)、DMAP 30.3mg(0.248mmol)(n＝35)及48.1mg(0.394mmol)(n＝78)、DFO 163mg(0.248mmol)(n＝35)及259mg(0.394mmol)(n＝78)，在室温下搅拌一晩。将反应溶液放入透析膜(MWCO＝3.5kD)，利用300mL的丙酮进行透析3次后，利用2L的0.01M NaOH、接着利用2L的纯水，各2次，进行透析。将所获得的溶液利用0.45μm的过滤器过滤后，进行冷冻干燥，以产量120mg(n＝35)及139g(n＝78)、产率87％(n＝35)及80％(n＝78)获得白色固体PEG-P[Asp(DFO)m]n。将1H-NMR谱示于图9及图11，将GPC曲线示于图10及图12。
·PEG-P[Asp(DFO)10]35的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,D2O,NaOD):δ1.13-1.96(br,-CH2-CH2-CH2-),1.98-2.09(br,-C＝O-CH3),2.43-2.55(br,-CH2-C＝O-NH-),3.08-3.33(br,-C＝O-NH-CH2-),3.52-3.62(br,-CH2-NOH-),3.66-3.90(br,-CH2-CH2-O-)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78的1H NMR谱
1H NMR(400MHz,D2O,NaOD):属性与上述PEG-P[Asp(DFO)10]35的1H NMR谱相同
＜1.5.分析＞
[PEG-PBLAn]
根据1H NMR谱的由引发剂产生的波峰[3.42-3.67ppm(-CH2-CH2-O-)]与由BLA-NCA产生的波峰[2.53-2.69,2.76-2.92ppm(-CH2-C＝O-O-),4.95-5.13(-O-CH2-Ph),7.20-7.39ppm(Ph)]的积分值的比，求出PBLA的聚合度DP＝35(n＝35)及DP＝77(n＝78)、数均分子量Mn＝17,600(PEG：PBLA＝10,000：7,600)(n＝35)及Mn＝25,800(PEG：PBLA＝10,000：15,800)(n＝78)。另外，根据GPC曲线，求出所获得的聚合物的分子量分散度Mw/Mn＝1.12(n＝35)及Mw/Mn＝1.11(n＝78)，确认具有窄分子量分布。
[PEG-PAspn]
根据1H NMR谱的由引发剂产生的波峰[3.62-3.82ppm(-CH2-CH2-O-)]与天冬氨酸的β氢的波峰(2.73-2.97ppm)的积分值的比，求出Asp的聚合度DP＝35(n＝35)及DP＝78(n＝78)、数均分子量Mn＝14,000(PEG：PAsp＝10,000：4,000)(n＝35)及Mn＝19,000(PEG：PBLA＝10,000：9,000)(n＝78)。另外，根据GPC曲线，确认所获得的聚合物具有单峰性的窄分子量分布。
[PEG-P[Asp(DFO)m]n]
根据1H NMR谱的由引发剂产生的波峰[3.66-3.90ppm(-CH2-CH2-O-)]及由DFO产生的波峰[1.13-1.96ppm(-CH2-CH2-CH2-),1.98-2.09ppm(-C＝O-CH3),2.43-2.55ppm(-CH2-C＝O-NH-),3.08-3.33ppm(-C＝O-NH-CH2-),3.52-3.62ppm(-CH2-NOH-)]的积分值的比，求出DFO的导入数为10(n＝35)及26(n＝78)、数均分子量Mn＝19,300(n＝35)及Mn＝32,900(n＝78)。另外，根据GPC曲线，确认所获得的聚合物具有单峰性的窄分子量分布。
另外，此外，与上述合成方法同样地获得PEG-P[Asp(DFO)36]76(Mn＝45,000)。
利用1H NMR(400MHz,D2O,NaOD)进行分析，确认属性与上述PEG-P[Asp(DFO)10]35的1H NMR谱相同。
2.PEG-P[Asp(DFO)m]n的铁螯合能力的评价
＜2.1.概要＞
DFO/Fe(III)络合物在420nm附近具有特征性的吸收波峰。此处，通过测定吸光谱来评价PEG-P[Asp(DFO)m]n的铁螯合能力。另外，利用作为间接地定量细胞内的铁离子量的方法所确立的钙黄绿素-AM法，评价生物环境中的PEG-P[Asp(DFO)m]n的铁螯合能力。图13简单地示出钙黄绿素-AM法的原理。
[钙黄绿素-AM法的原理]
钙黄绿素-AM是细胞膜透膜性的化合物，其本身不显示荧光，但通过细胞内的酯酶而受到水解，变成钙黄绿素。该钙黄绿素是显示强黄绿色荧光的化合物，由于为非透膜性，故保持于细胞内。另外，钙黄绿素具有铁螯合能力，若与铁形成络合物，则荧光消失，因此通过测定钙黄绿素的荧光，能够间接地测定细胞内的铁离子浓度。
＜2.2.试剂＞
没有特别记述的试剂/溶剂直接使用市售品。
·甲磺酸去铁胺(DFO)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·PEG-P[Asp(DFO)10]35(Mn＝19,300)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78(Mn＝32,900)
·FeCl3·6H2O：Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.
·D-PBS(-)：Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.
·罗斯威尔帕克纪念研究所培养基(RPMI，Roswell Park Memorial Institutemedium)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·胎牛血清(FBS，Fetal bovine serum)：Biosera Inc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液：Sigma life science Co.,Ltd.
·青霉素/链霉素：Sigma life science Co.,Ltd.
·钙黄绿素-AM：Dojindo Molecular Technologies Inc.
·CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
·DLD-1细胞(人类结肠腺癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
＜2.3.测定仪器＞
·NanoDrop One：Thermo Fisher ScientificInc..
·Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
·LSM710：Carl Zeiss Co.,Ltd.
·Guava(注册商标)easyCyte流式细胞仪(FCM)：Merck Millipore
＜2.4.通过吸收谱测定进行的评价＞
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78、FeCl3溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：0.625mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.0635mM(DFO浓度＝0.625mM)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.0245mM(DFO浓度＝0.625mM)
·FeCl3/D-PBS溶液：2.50mM
分别向800μL的DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液及PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液添加200μL的FeCl3溶液。利用D-PBS进行2倍稀释后，充分地搅拌，并利用Nanodrop测定吸收谱。将其结果示于图14。
由于PEG-P[Asp(DFO)10]35/Fe及PEG-P[Asp(DFO)26]78/Fe均显示出DFO/Fe的特征性吸收波峰，因此确认具有优异的铁螯合能力。
＜2.5.利用钙黄绿素-AM法进行的评价＞
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：2.00mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.203mM(DFO浓度＝2.00mM)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.0714mM(DFO浓度＝2.00mM)
将DLD-1或CT26细胞以成为5.0×104个细胞/孔的方式接种至24孔板，在37℃、5％CO2下预培养24小时。将上述制备溶液利用RPMI进行10倍稀释后，向各孔分别添加500μL，培养24小时。利用D-PBS 500μL洗净后，添加0.100μM钙黄绿素-AM溶液，在暗处，将DLD-1细胞培养30min，将CT26细胞培养15min。利用D-PBS 500μL洗净2次后，添加150μL胰蛋白酶-EDTA溶液，将DLD-1细胞培养10min，将CT26细胞培养3min。利用光学显微镜确认细胞剥落后，添加包含10％FBS的D-PBS 300μL，使其充分悬浮。将悬浮液利用细胞滤网过滤，并利用FCM测定钙黄绿素荧光。将所获得的结果示于图15。图15A为DLD-1细胞的测定结果，图15B为CT26细胞的测定结果。结果显示平均值±S.D.(n＝3)的值，利用t检验评价统计上的显著差异(*p＜0.05，**p＜0.01)。
由于利用PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78提高了钙黄绿素的荧光强度，故而表明细胞内的铁离子浓度减少，确认PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78在生物体环境中也具有铁螯合能力。
3.对培养细胞的评价
＜3.1.概要＞
利用共聚焦显微镜观察经荧光色素(Cy5)标记的PEG-P[Asp(DFO)m]n(Cy5-PEG-P[Asp(DFO)m]n)的细胞内分布。其次，比较DFO与PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞摄入量。接着，为了调查PEG-P[Asp(DFO)m]n的癌细胞增殖抑制机制，评价对细胞周期的影响。最后，利用CCK-8分析来评价癌细胞增殖抑制作用。
＜3.2.试剂及细胞株＞
没有特别记述的试剂直接使用市售品。
·PEG-P[Asp(DFO)10]35(Mn＝19,300)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78(Mn＝32,900)
·Cy5-NHS：Thermo Fisher Scientific Inc.
以10mg/mL Cy5-NHS/DMSO的形式使用。
·二甲基亚砜(DMSO)：Nacalai Tesque Inc.
·GaCl3：Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.
·5mol/L NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·HNO3：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·罗斯威尔帕克纪念研究所培养基(RPMI)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·D-PBS(-)：Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.
·胎牛血清(FBS)：Biosera Inc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液：Sigma life science Co.,Ltd.
·青霉素/链霉素：Sigma life science Co.,Ltd.
·LysoTracker(注册商标)red DND-99：Thermo Fisher Scientific Inc.
·Hoechst 33342：Thermo Fisher Scientific Inc.
·RNase A：Macherey nagel Inc.
·碘化丙啶：Dojindo Molecular Technologies Inc.
·细胞计数试剂盒-8：Dojindo Molecular Technologies Inc.
·CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
·DLD-1细胞(人类结肠腺癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
＜3.3.测定仪器＞
·Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
·LSM710：Carl Zeiss Co.,Ltd.
·Guava(注册商标)easyCyte流式细胞仪(FCM)：Merck Millipore
·Agilent 7900ICP-MS：Agilent Technology Co.,Ltd.
＜3.4.利用共聚焦显微镜进行的PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞内分布的观察＞
将荧光色素(Cy5)导入PEG-P[Asp(DFO)m]n，使用共聚焦显微镜观察Cy5-PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞内分布。
[Cy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35的合成]
使Cy5-NHS结合于PEG-P[Asp(DFO)m]n的末端的氨基。将PEG-P[Asp(DFO)10]3520.0mg(0.99μmol)称取至6mL小瓶，溶解于2.00mL的纯水中。然后，将相对于PEG-P[Asp(DFO)10]35为1当量的Cy5-NHS(10.0mg/mL Cy5-NHS/DMSO溶液107μL)溶解于0.200mL的纯水后，添加至PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液，在室温下搅拌一晩。将反应溶液置于超滤膜(MWCO＝10kD)，进行5次超滤。其后，使用PD-10柱进一步进行纯化，使聚合物溶液进行冷冻干燥，获得蓝色固体Cy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35 18.0mg。
[利用共聚焦显微镜进行的观察]
将DLD-1细胞以成为5.0×104个细胞/皿的方式接种于35mm2玻璃底皿，在37℃、5％CO2下进行24小时预培养。将23.3μMCy5-PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液(DFO浓度＝200μM)利用RPMI进行10倍稀释后，向各皿分别添加1mL，培养24小时。利用D-PBS 1mL洗净后，添加100nM LysoTracker(注册商标)red DND-99/(D-PBS：RPMI＝1：9)溶液1mL，培养30min。利用D-PBS 1mL洗净后，添加5.0μg/mL Hoechst/D-PBS溶液1mL，培养5min。利用D-PBS 1mL洗净2次后，添加RPMI 2mL，利用CLSM进行观察。将所获得的结果示于图16。
本实施例中使用的铁螯合剂局限在内体/溶酶体中，因此提示通过内吞作用而进入细胞中。
＜3.5.PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞摄入量的评价＞
为了比较DFO与PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞摄入量，将DFO/Ga(III)络合物及PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga(III)络合物添加至细胞后，通过ICP-MS来测定细胞内的Ga含量。
[DFO/Ga溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液的制备]
·DFO/Ga溶液
向2.22mM DFO/D-PBS溶液9mL添加19.9mM GaCl3/D-PBS溶液1mL，搅拌一晩。使用NaOH将pH值调整为7.4后，利用过滤器进行过滤。最后，添加RPMI培养基90mL(DFO浓度＝200μM)。
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液
向0.226mM PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液(DFO浓度＝2.22mM)9mL添加19.9mMGaCl3/D-PBS溶液1mL，搅拌一晩。将反应溶液置于超滤膜(MWCO＝10kD)，进行5次超滤。向纯化的溶液添加D-PBS 10mL，利用过滤器进行过滤。最后，添加RPMI培养基90mL(DFO浓度＝200μM)。
[细胞内Ga含量的测定]
将DLD-1或CT-26细胞以成为5.0×106个细胞/烧瓶的方式接种至75mm2烧瓶，在37℃、5％CO2下预培养24小时。将上述的制备溶液向各烧瓶分别添加10mL，培养3小时或24小时。利用D-PBS 5mL洗净2次后，添加2.5mL胰蛋白酶-EDTA溶液，将DLD-1细胞培养10min，将CT-26细胞培养5min。利用光学显微镜确认细胞剥落后，添加RPMI培养基2.5mL进行悬浮。以1200rpm离心3min，去除上清液。添加RPMI培养基5mL，使其充分悬浮，并测量细胞数。再次在相同条件下进行离心，并去除上清液。其后，添加HNO3 200μL，在90℃下培养1小时。利用纯水定容至2mL，利用疏水性过滤器进行过滤后，利用ICP-MS测定细胞的Ga含量。将所获得的结果示于图17。图17A是DLD-1细胞的测定结果，图17B是CT26细胞的测定结果。结果是平均值±S.D.(n＝3)的值，通过t检验来评价统计上的显著差异(**p＜0.01)。
作为聚合物的PEG-P[Asp(DFO)10]35与作为小分子的DFO的摄入量未见大差异。提示PEG-P[Asp(DFO)10]35通过内吞作用而有效率地进入细胞内。
＜3.6.由PEG-P[Asp(DFO)m]n引起的细胞周期停滞＞
为了调查DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n的癌细胞增殖抑制机制，通过碘化丙啶(PI)染色来分析细胞周期。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：45.0μM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：61.0μM(DFO浓度＝600μM)
将DLD-1细胞以成为2.0×105个细胞/孔的方式接种至6孔板，在37℃、5％CO2下预培养24小时。将上述的制备溶液利用RPMI进行10倍稀释后，分别添加至各孔3mL，培养72小时。利用D-PBS 3mL洗净后，添加700μL的胰蛋白酶-EDTA溶液，培养10min。利用光学显微镜确认细胞剥落后，添加包含10％FBS的D-PBS 700μL，使其充分悬浮。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。向细胞团添加D-PBS 500μL，使其悬浮。将悬浮液滴加至4.5mL的70％乙醇，在-20℃的冷冻库中固定一晩。添加包含10.0μg/mL碘化丙啶、100μg/mL RNase的D-PBS 500mL，在暗处培养30min。最后，利用细胞滤网过滤悬浮液，使用FCM测定碘化丙啶的荧光。利用ModFit LT分析测定数据。将所获得的结果示于图18。图18A是表示通过FCM获得的荧光的分布的图表，图18B表示将其换算为细胞周期所得的结果。结果显示平均值±S.D.(n＝3)的值。
DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35诱导向S期的细胞周期停滞。
＜3.7.PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞增殖抑制作用＞
通过CCK-8分析来评价PEG-P[Asp(DFO)m]n的癌细胞增殖抑制作用。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：3.00mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：0.305mM(DFO浓度＝3.00mM)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.118mM(DFO浓度＝3.00mM)
将DLD-1细胞以成为1.0×103个细胞/孔的方式接种至96孔板，在37℃、5％CO2下预培养24小时。将上述制备溶液向各孔分别添加10μL，培养72小时。将CCK-8溶液向各孔分别添加10μL，培养2小时后，测定450nm的吸光度。将所获得的结果示于图19。结果显示平均值±S.D.(n＝5)的值，通过t检验来评价统计上的显著差异(****p＜0.0001)。
DFO、PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78显著地抑制了DLD-1细胞的增殖。
4.对皮下肿瘤小鼠模型的效果(血中滞留性/肿瘤蓄积性/抗肿瘤效果)
＜4.1.概要＞
评价CT26(小鼠大肠癌细胞)皮下肿瘤小鼠模型中的DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n的体内动态。评价DLD-1(人类大肠癌细胞)及CT26皮下肿瘤小鼠模型中的DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n的抗肿瘤效果。
＜4.2.试剂、细胞及动物＞
·甲磺酸去铁胺(DFO)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·PEG-P[Asp(DFO)10]35(Mn＝19,300)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78(Mn＝32,900)
·D-PBS(-)：Nacalai Tesque Inc.
·GaCl3：Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.
·5mol/l NaOH：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·HNO3：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.
·CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
·DLD-1细胞(人类结肠腺癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
·BALB/c裸小鼠：Charles River Japan Inc.
·BALB/c小鼠：Charles River Japan Inc.
＜4.3.仪器/设备＞
·Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
·Agilent 7900ICP-MS：Agilent Technology Co.,Ltd.
＜4.4.DFO与PEG-PAsp(DFO)的体内动态＞
为了评价DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n的血中滞留性及肿瘤蓄积性，将DFO/Ga(III)络合物及PEG-P[Asp(DFO)m]n/Ga(III)络合物静脉注射到CT26皮下肿瘤小鼠模型，通过ICP-MS测定经过一定时间后的血液及肿瘤的Ga含量。
[DFO/Ga、PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga、PEG-P[Asp(DFO)26]78/Ga溶液的制备]
·DFO/Ga溶液
向16.9mM DFO/D-PBS溶液2.70mL添加26.8mM GaCl3/D-PBS溶液300μL，搅拌一晩。使用NaOH将pH值调整为7.4后，利用过滤器进行过滤。(DFO浓度＝15.2mM)
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/Ga溶液
向1.71mM PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液(DFO浓度＝16.9mM)2.70mL添加26.8mM GaCl3/D-PBS溶液300μL，搅拌一晩。将反应溶液置于超滤膜(MWCO＝10kD)，进行5次超滤。向纯化的溶液中添加D-PBS 3ml，并利用过滤器进行过滤。(DFO浓度＝15.2mM)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78/Ga溶液
向0.662mM PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液(DFO浓度＝16.9mM)2.70mL添加26.8mM GaCl3/D-PBS溶液300μL，搅拌一晩。将反应溶液置于超滤膜(MWCO＝10kD)，进行5次超滤。向纯化的溶液添加D-PBS 3ml，并利用过滤器进行过滤。(DFO浓度＝15.2mM)
[CT26皮下肿瘤小鼠模型的制作]
对BALB/c小鼠皮下注射100μl CT26细胞悬浮液(1.0×106个细胞/ml)。
[体内动态的评价]
对肿瘤尺寸达到约200mm3的模型小鼠，向尾静脉施用上述制备溶液100μl(DFO1.52μmol/小鼠)。试样施用1、3、6、24小时后进行解剖，将血液及各种器官回收至10mL试管(ファルコンチューブ)。添加HNO3 1mL，分别在50℃下培养15min、在70℃下培养15min、在90℃下培养1小时。利用纯水定容至10ml，并利用疏水性过滤器进行过滤后，利用ICP-MS测定血液、各种器官的镓含量。将其结果示于图20及图21。结果显示平均值±S.D.(n＝3)的值。
施用1小时后的DFO的血中浓度为0.25％剂量/mL，显示从血中迅速地消失，另一方面PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78在施用6小时后分别显示10％剂量/mL、8.6％剂量/mL的血中浓度。此外，PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78通过EPR效应向肿瘤蓄积，在施用6小时后的时间点分别显示3.9％剂量/g、4.1％剂量/g的肿瘤内浓度。另外，施用24小时后也分别维持2.0％剂量/g、3.4％剂量/g的肿瘤内浓度。根据这些结果，显示PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78除了提升DFO的血中滞留性以外，也实现了赋予肿瘤蓄积性及滞留性。
＜4.5.抗肿瘤效果＞
对DLD-1及CT26皮下肿瘤小鼠模型静脉注射DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n，评价抗肿瘤效果。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液、PEG-P[Asp(DFO)26]78溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：15.2mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：1.54mM(DFO浓度＝15.2mM)
·PEG-P[Asp(DFO)26]78/D-PBS溶液：0.596mM(DFO浓度＝15.2mM)
[DLD-1及CT26皮下肿瘤小鼠模型的制作]
分别对BALB/c小鼠、BALB/c裸小鼠皮下注射100μl DLD-1细胞悬浮液(1.0×107个细胞/ml)、CT26细胞悬浮液(1.0×106个细胞/ml)。
[抗肿瘤效果的评价]
对肿瘤尺寸达到50～100mm3的小鼠，向尾静脉施用上述制备溶液100μl(DFO 1.52μmol/小鼠)。至于对照组，尾静脉注射与治疗组等量的PBS。施用排程如下所示。
DLD-1皮下肿瘤小鼠模型：每天1次每周施用5次、共15次
CT26皮下肿瘤小鼠模型：每天1次连续施用、共14次
施用期间中每隔1～2天测定肿瘤直径及体重。将测定的肿瘤直径代入到椭圆体积近似式(ab2×1/2、a：长边、b：短边)获得肿瘤体积。将肿瘤尺寸及体重的经时变化分别示于图22及图24、图23及图25。图22及图23是DLD-1皮下肿瘤小鼠模型的测定结果，图24及图25是CT26皮下肿瘤小鼠模型的测定结果。结果显示平均值±S.D.的值。
DLD-1及CT26皮下肿瘤小鼠模型中，显示PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78产生优于DFO的抗肿瘤效果。认为这是由于PEG-P[Asp(DFO)10]35及PEG-P[Asp(DFO)26]78实现了肿瘤蓄积性。另外，由于治疗期间未确认到体重减少，故而认为未出现严重的副作用。
5.对培养细胞的评价
＜5.1.概要＞
通过吸光谱测定及钙黄绿素-AM法，确认PEG-P[Asp(DFO)m]n具有铁螯合能力，为了调查作为其结果的PEG-P[Asp(DFO)m]n处理过的细胞的细胞质内游离铁是否减少，通过FerroOrange来检测细胞质内游离铁。另外，明确了PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞增殖抑制机制是向S期的细胞周期停滞，认为其是由DNA合成抑制所造成的，所以通过BrdU染色来评价DNA合成抑制。此外，为了调查PEG-P[Asp(DFO)m]n是否诱导细胞凋亡，通过PI、膜联蛋白V染色来检测凋亡细胞。
＜5.2.试剂及细胞株＞
没有特别记载的试剂直接使用市售品。
·DFO：Sigma Aldrich Co.,llc.
·PEG-P[Asp(DFO)10]35(Mn＝19,300)
·罗斯威尔帕克纪念研究所培养基(RPMI)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·D-PBS(-)：Nacalai Tesque Inc.
·胎牛血清(FBS)：Biosera Inc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液：Sigma life science Co.,Ltd.
·青霉素/链霉素：Sigma life science Co.,Ltd.
·FerroOrange：Goryo Chemical,Inc.
·BrdU：Sigma Aldrich Co.,llc.
·5M HCl：Nacalai Tesque Inc.
·硼酸钠：Nacalai Tesque Inc.
·多聚甲醛(PFA，Paraformaldehyde)：Nacalai Tesque Inc.
·TritonX-100：Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.
·牛血清白蛋白(BSA，Bovine serum albumin)：Nacalai Tesque Inc.
·FITC-抗BrdU抗体：Thermo Fisher Scientific,Inc.
·Hoechst 33342：Thermo Fisher Scientific Inc.
·Tween20：Sigma life science Co.,Ltd.
·细胞凋亡试剂盒(膜联蛋白V-FITC试剂盒)：Medical&BiologicalLaboratories Co.,Ltd
·DLD-1细胞(人类结肠腺癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
＜5.3.测定仪器＞
·Countess：Thermo Fischer Scientific Inc.
·LSM710：Carl Zeiss Co.,Ltd.
·Guava(注册商标)easyCyte流式细胞仪(FCM)：Merck Millipore
·Spark(注册商标)：Tecan Japan Co.,Ltd,
＜5.4.PEG-P[Asp(DFO)m]n的铁螯合能力的评价＞
为了调查DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n是否使细胞质内的游离铁减少，通过FerroOrange检测经DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n处理的细胞的细胞质内游离铁。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：2.00mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：200μM(DFO浓度＝2.00mM)
[利用共聚焦显微镜进行的观察]
将DLD-1细胞以成为3.0×105个细胞/孔的方式接种至35mm2玻璃底皿中，在37℃、5％CO2下预培养24小时。去除溶液后，将利用RPMI进行了10倍稀释的上述制备溶液向各皿分别添加2mL，培养24小时。利用无血清RPMI 2mL洗净后，添加包含1μM FerroOrange的无血清RPMI 1mL，在暗处培养30min。其后，利用CLSM观察FerroOrange的荧光。将获得的结果示于图27A。
[利用读板仪进行的测定]
将DLD-1细胞以成为1.0×104个细胞/孔的方式接种至96孔板，在37℃、5％CO2下预培养24小时。去除溶液后，将利用RPMI进行了10倍稀释的上述制备溶液向各孔分别添加100μL，培养24h。利用无血清RPMI 100μL洗净后，添加包含1μM FerroOrange的无血清RPMI 100μL，在暗处培养30min。其后，通过读板仪来测定FerroOrange的荧光强度。将获得的结果示于图27B。结果显示平均值±S.D.(n＝5)的值。通过Tukey多重比较检验(Tukey's multiplecomparison test)来评价统计上的显著差异(****p＜0.0001)。
DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35使细胞质内的游离铁显著减少。
＜5.5.由PEG-P[Asp(DFO)m]n引起的DNA合成抑制＞
为了调查DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n向S期的细胞周期停滞的机制，通过BrdU染色来评价DNA合成抑制。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：450μM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：60.0μM(DFO浓度＝600μM)
[利用共聚焦显微镜进行的观察]
将DLD-1细胞以成为1.0×105个细胞/孔的方式接种至35mm2玻璃底皿，在37℃、5％CO2下预培养24小时。去除溶液后，将利用RPMI进行了10倍稀释的上述制备溶液向各孔分别添加3mL，培养72小时。其后，添加10mM BrdU/D-PBS溶液330μL，培养1小时。去除溶液后，添加1.0M HCl溶液1mL，培养10min。去除溶液后，添加0.1M四硼酸钠缓冲液(pH值8.5)1mL，培养30min。利用D-PBS 2mL洗净后，添加4％PFA/D-PBS溶液1mL，培养10min。去除溶液后，添加0.2％Triton X-100/D-PBS溶液1mL，培养5min。利用D-PBS 2mL洗净后，添加5％BSA/D-PBS溶液2mL，培养1小时。去除溶液后，添加FITC-抗BrdU抗体/1％BSA溶液，在暗处培养30min。利用D-PBS 2mL洗净后，添加5.0μg/mL Hoechst/D-PBS溶液1mL，在暗处培养5min。利用D-PBS 2mL洗净后，利用CLSM进行观察。将获得的结果示于图28A。
[利用流式细胞仪进行的测定]
将DLD-1细胞以成为2.0×105个细胞/孔的方式接种至6孔板，在37℃、5％CO2下预培养24小时。去除溶液后，将利用RPMI进行了10倍稀释的上述制备溶液向各孔分别添加3mL，培养72h。其后，添加10mM BrdU/D-PBS溶液330μL，培养1小时。利用D-PBS 3mL洗净后，添加700μL的胰蛋白酶-EDTA溶液，培养10min。利用光学显微镜确认细胞剥落后，添加RPMI700μL，使其充分悬浮。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。对细胞团添加D-PBS 500μL，并加以悬浮。测量细胞数，统一各样品的细胞数。将悬浮液滴加至4.5mL的70％乙醇，在-20℃的冷冻库中固定一晩。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。添加2.0M HCl/0.5％TritonX-100溶液500μL，培养30min。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。添加0.1M四硼酸钠缓冲液(pH值8.5)500μL，培养2min。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。利用1％BSA/0.5％Tween20/D-PBS溶液1mL洗净后，添加1％BSA/0.5％Tween20/D-PBS溶液95μL。添加FITC-抗BrdU抗体5μL，培养1小时。利用1％BSA/0.5％Tween20/D-PBS溶液1mL洗净后，添加1％BSA/0.5％Tween20/D-PBS溶液500μL。最后，利用细胞滤网来过滤悬浮液，使用FCM来测定BrdU的荧光。将所获得的结果示于图28B。
显示DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35由于显著地抑制BrdU的摄入，因此诱导DNA合成抑制，认为其结果，使细胞周期停止在S期。
＜5.6.PEG-P[Asp(DFO)m]n的细胞凋亡诱导的评价＞
为了调查DFO及PEG-P[Asp(DFO)m]n是否诱导细胞凋亡，通过PI、膜联蛋白V染色来检测凋亡细胞。
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：1.00mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：100μM(DFO浓度＝1.00mM)
将DLD-1细胞以成为1.0×105个细胞/孔的方式接种至6孔板中，在37℃、5％CO2下预培养24小时。去除溶液后，将利用RPMI进行了10倍稀释的上述制备溶液向各孔分别添加3mL，培养24小时。利用D-PBS 3mL洗净后，添加700μL的胰蛋白酶-EDTA溶液，培养10min。利用光学显微镜确认细胞剥落后，添加RPMI 700μL，使其充分悬浮。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。添加RPMI 500μL，测量细胞数，统一各样品的细胞数。将悬浮液以1200rpm离心3min，去除上清液。添加细胞凋亡试剂盒附带的结合缓冲液85μL、膜联蛋白V溶液10μL、及PI溶液5μL，在暗处培养15min。添加结合缓冲液400μL后，利用细胞滤网来过滤悬浮液，使用FCM来测定PI、膜联蛋白V的荧光。将所获得的结果示于图29。图29A是表示由FCM所获取的荧光的分布的图表，图29B表示将其换算成活细胞、细胞凋亡初期细胞、细胞凋亡后期/坏死细胞所得的结果。结果显示平均值±S.D.(n＝3)的值。通过Tukey多重比较检验来评价统计上的显著差异(****p＜0.0001)。
DFO及PEG-P[Asp(DFO)10]35显著地增加凋亡细胞及坏死细胞的比率。
6.对皮下肿瘤模型小鼠的肿瘤中原卟啉IX累积性的效果
＜6.1.概要＞
评价对CT26(小鼠大肠癌细胞)皮下肿瘤小鼠模型施用5-氨基乙酰丙酸盐酸盐与DFO或PEG-P[Asp(DFO)m]n时的肿瘤中原卟啉IX累积性。
＜6.2.试剂、细胞及动物＞
·甲磺酸去铁胺(DFO)：Sigma Aldrich Co.,llc.
·PEG-P[Asp(DFO)10]35(Mn＝19,300)
·5-氨基乙酰丙酸盐酸盐：COSMO OIL Co.,Ltd.
·D-PBS(-)：Nacalai Tesque Inc.
·PBS(-)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd
·N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd
·原卟啉IX：Frontier Scientific,Inc.
·CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国典型培养物保藏中心
·BALB/c小鼠：Charles River Japan Inc.
＜6.3.仪器/设备＞
·infinite M200 PRO：Tecan Group Ltd.
＜6.4.肿瘤中原卟啉IX累积性的评价＞
[DFO溶液、PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液的制备]
·DFO/D-PBS溶液：15.2mM
·PEG-P[Asp(DFO)10]35/D-PBS溶液：1.54mM(DFO浓度＝15.2mM)
[5-氨基乙酰丙酸盐酸盐溶液的制备]
使5-氨基乙酰丙酸盐酸盐以成为25mg/ml的方式溶解于生理盐水中。
[CT26皮下肿瘤小鼠模型的制作]
对BALB/c小鼠皮下注射100μl CT26细胞悬浮液(1.0×106个细胞/ml)。
[肿瘤中原卟啉IX的评价]
对肿瘤尺寸达到约200mm3的模型小鼠，尾静脉注射DFO或PEG-P[Asp(DFO)10]35溶液100μl(DFO 1.52μmol/小鼠)。对照组与DFO施用组同样地将生理盐水100μl进行尾静脉注射。其后立即经口施用5-氨基乙酰丙酸盐酸盐溶液100μl(250mg/kg体重，按ALA换算为195.6mg/kg体重)。5-氨基乙酰丙酸盐酸盐溶液施用0、1、2、3、5小时后进行解剖，回收肿瘤。添加肿瘤重量的9倍量的PBS(-)，进行均质化并进行超声波破碎。将该破碎液300μl与DMF700μl加以混合并进行离心分离。测定离心上清液的荧光强度(激发波长405nm)，结果获得了在635nm具有波峰的荧光谱。原卟啉IX量是使用激发波长405nm、荧光波长630nm的荧光强度算出的。图30表示肿瘤中原卟啉IX的测定结果。结果显示平均值±S.D.(n＝3)的值。
显示在CT26皮下肿瘤小鼠模型中，PEG-P[Asp(DFO)10]35产生优于对照及DFO的肿瘤中原卟啉的累积性。
7.对维生素C疗法的效果
＜7.1.背景＞
通过将本实施例中使用的铁螯合剂与维生素C一起使用，研究由维生素C疗法所产生的治疗效果是否会提高。
＜7.2.体外(in vitro)的活性评价＞
[实验材料]
·PEG-P[Asp(DFO)36]76(Mn＝45,000)
·L-抗坏血酸钠盐(和光纯药股份有限公司)
·FeCl3(和光纯药股份有限公司)
·CT26细胞(ATCC)
·RPMI培养基(Sigma-Aldrich)，添加10％FBS+1％青霉素/链霉素而用作细胞培养用培养基
·细胞计数试剂盒-8(同仁化学)
[实验方法]
·将CT26细胞在96孔板中以5×103个细胞/孔培养24小时。
·将细胞在含有各浓度的PEG-P[Asp(DFO)36]76及5mM的L-抗坏血酸钠盐与15μM的Fe3+的培养基中培养2小时。
·更换培养基后，培养24小时。
·去除培养基后，添加含有10％的细胞计数试剂盒-8的100μL培养基，培养1.5小时。
·测定450nm的吸光度，算出细胞存活率。
将所获得的结果示于图31。
图31是表示PEG-P[Asp(DFO)36]76在体外对维生素C治疗的影响的图表。图表中的浓度表示相当于PEG-P[Asp(DFO)36]76中的DFO的浓度。结果以平均值±标准偏差(n＝9)表示。
[结果]
维生素C的杀细胞效果通过添加PEG-P[Asp(DFO)36]76，癌细胞杀伤效果大幅提高(图31)。
＜7.3.体内(in vivo)的活性评价＞
[实验材料]
·PEG-P[Asp(DFO)36]76(Mn＝45,000)
·L-抗坏血酸钠盐(和光纯药股份有限公司)
·CT26细胞(ATCC)
·RPMI培养基(Sigma-Aldrich)，添加10％FBS+1％青霉素/链霉素而用作细胞培养用培养基
·BALB/c小鼠(雌性，从日本SLC购买)
[实验方法]
·向BALB/c小鼠的皮下以3×105个细胞/小鼠注射CT26细胞而制作皮下肿瘤模型。
·在肿瘤的大小达到50mm3的时间点将PEG-P[Asp(DFO)36]76进行静脉注射(PEG-P[Asp(DFO)36]76施用量：0.9mg/小鼠＝45mg/体重kg或1.8mg/小鼠＝90mg/体重kg)。
·PEG-P[Asp(DFO)36]76施用6小时后，将溶解于纯水的L-抗坏血酸钠盐以10mg/小鼠＝500mg/体重kg进行静脉注射。
·连续5天进行上述注射，调查肿瘤尺寸的经时变化。
将所获得的结果示于图32。
图32表示PEG-P[Asp(DFO)36]76在体内对维生素C治疗的影响的图表。结果以平均值±标准偏差表示。
[结果]
通过将PEG-P[Asp(DFO)36]76与高浓度维生素C一起使用，显示高治疗效果。另外，在PEG-P[Asp(DFO)36]76施用量为0.9mg/小鼠时与1.8mg/小鼠时，显示施用量为0.9mg/小鼠时具有更高效果的倾向。
8.总结
对以上本实施例的内容进行总结，在本实施例中，构建了将DFO的不参与螯合铁的末端氨基与具有多元羧酸结构的生物相容性聚合物结合而成的铁螯合剂递送系统。通过吸收谱测定，确认本实施例中使用的铁螯合剂的侧链的DFO具有与游离DFO同等的铁螯合能力。确认本实施例中使用的铁螯合剂即便在生物环境中也维持螯合能力，对培养大肠癌细胞内的铁离子进行螯合，培养结肠腺癌细胞质内的游离铁减少。另外，调查在该细胞中对细胞周期的影响，结果确认到施用本实施例中使用的铁螯合剂抑制了DNA合成，本实施例中使用的铁螯合剂使细胞周期在S期停止，通过细胞增殖分析，确认具有增殖抑制作用及细胞凋亡诱导作用等。
对皮下肿瘤小鼠模型静脉注射DFO与本实施例中使用的铁螯合剂，比较血中滞留性，结果DFO早期从血中消失，但本实施例中使用的铁螯合剂在施用6小时后仍维持极高的血中浓度。此外，本实施例中使用的铁螯合剂蓄积于肿瘤，随着时间经过，其蓄积量增加。使用该皮下肿瘤模型研究抗肿瘤效果，结果显示获得比DFO更显著的治疗效果。
另外，通过施用本实施例中使用的铁螯合剂及5-氨基乙酰丙酸，确认到肿瘤中的原卟啉IX的累积量提升。表明本实施例中使用的铁螯合剂适合用于使用5-氨基乙酰丙酸的光动力学诊断和/或治疗。
此外，通过施用本实施例中使用的铁螯合剂及维生素C，从而发挥优异的抗肿瘤效果，表明本实施例中使用的铁螯合剂适合用于维生素C疗法。
各实施方案中的各构成及它们的组合等仅是一例，能够在不脱离本发明主旨的范围内，对构成进行附加、省略、置换、及其它变更。另外，本发明不受各实施方案限定，仅受权利要求的范围限定。

Claims (8)

1.一种偶联物，其中去铁胺类与生物相容性聚合物结合，所述去铁胺类是从去铁胺或者其离子或盐、及它们的衍生物所组成的群组中选择的至少一种化合物，
所述生物相容性聚合物包含第1生物相容性聚合物链、及与所述第1生物相容性聚合物链不同的第2生物相容性聚合物链。
2.根据权利要求1所述的偶联物，其中，所述去铁胺类与所述第2生物相容性聚合物链结合。
3.根据权利要求1或2所述的偶联物，其中，所述第2生物相容性聚合物链为聚氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的偶联物，其中，所述第1生物相容性聚合物链为聚乙二醇。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的偶联物，其包含下述通式(1)或(1-1)所表示的结构：
[化1]
Figure FDA0003308669300000012
(式(1)～(1-1)中，
A表示所述第1生物相容性聚合物链，
L表示接头部分，
B表示所述第2生物相容性聚合物链，其包含下述(b2)所表示的重复结构、或者(b1)所表示的重复结构及(b2)所表示的重复结构)
[化2]
Figure FDA0003308669300000011
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是氨基酸侧链与所述去铁胺类结合而成的，
n表示(b1)及(b2)的合计数，n为1～1000的整数，m为1～1000的整数(其中，m≤n)，当n－m为2以上的情况下，多个R1相互可以相同也可以不同，当m为2以上的情况下，多个R2相互可以相同也可以不同)。
6.根据权利要求5所述的偶联物，其包含下述通式(1-2)所表示的结构：
[化3]
Figure FDA0003308669300000021
(式(1-2)中，
B表示所述第2生物相容性聚合物链，其包含下述(b2-1)所表示的重复结构、或者(b1-1)所表示的重复结构及(b2-1)所表示的重复结构)
[化4]
Figure FDA0003308669300000022
(式(b1-1)～(b2-1)中，
R11表示氨基酸侧链，
R12是-CH2-COOH所表示的天冬氨酸侧链或者-CH2-CH2-COOH所表示的谷氨酸侧链中的羧基与所述去铁胺类结合而成的，
n1表示(b1-1)及(b2-1)的合计数，n1为1～1000的整数，m1为1～1000的整数(其中，m1≤n1)，当n1－m1为2以上的情况下，多个R11相互可以相同，也可以不同，当m1为2以上的情况下，多个R12相互可以相同，也可以不同)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的偶联物，其数均分子量为2,000～200,000。
8.一种癌治疗剂，其含有作为有效成分的权利要求1至7中任一项所述的偶联物。
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