CN117377497A - 药物聚合物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于有治疗活性的二价金属离子的细胞内递送的组合物，该组合物包含多肽，该多肽具有(i)与其缀合的一个或多个靶向部分、(ii)经由可裂解的连接体与其缀合的离子载体、和(iii)与其结合的二价金属离子；以及用于制备此类组合物的方法和它们在治疗方法中的用途。

Description

药物聚合物缀合物
技术领域
本文中呈现的是可用于治疗有效量的金属离子的细胞内递送的多肽聚合物缀合物。本发明还涉及用于在组合物所针对的细胞中诱导依赖性细胞死亡(parthanatos)的组合物以及使用此类组合物的治疗方法。
背景技术
癌症的复杂性和异质性早已被认识到，但是一段时间以来，治疗方式遵循例如根据生理位置、组织学外观和谱系进行疾病分类的历史发展。最近，注意力已转向免疫疗法和其它与免疫相关的方法，例如通过接种或诱导免疫原性细胞死亡作为在肿瘤细胞中引起新抗原(neo-antigen)呈递的手段来引发抗癌T细胞免疫应答。
数种机理可能与诱导免疫原性细胞死亡的方法相关，例如坏死性凋亡、细胞焦亡或依赖性细胞死亡。虽然有数项临床前研究证明了基于坏死性凋亡的疗法的潜力，但是对于利用细胞焦亡途径或依赖性细胞死亡途径的方法，报道的进展很少。依赖性细胞死亡为由DNA损伤感受器和修复酶PARP的过度激活引发的程序性坏死模式。PARP的过度激活引起反应产物(PAR聚合物)累积，这导致核AIF易位，转而引发严重的DNA破碎并且最终引发细胞死亡。
报道表明急性锌或镉毒性涉及PARP1活性(NPL 1、2)。例如，评估锌盐的神经毒性的报道记载了来自简单锌盐的高浓度的锌离子(400μM或26μg/mL)在培养的皮层细胞中诱导PARP/PARG介导的NAD+和ATP耗竭和随后的坏死(NPL3)。相反，一项针对癌细胞系的锌活性的研究观察到某些坏死机理，但是是在已由其它人证明在大鼠中引起急性神经毒性的锌剂浓度下(NPL 4、5)。
使用这些二价金属离子的其它研究着眼于它们的吡啶硫酮(“Pyr”)复合物(即，ZnPyr2)。虽然一项研究报道了ZnPyr2表现出细胞毒性作用并且因此潜在地具有抗肿瘤特性，但是该研究发现ZnPyr2在癌细胞系中诱导细胞凋亡，并且引起PARP完全裂解，同时不引起任何DNA损伤(NPL6)。认为凋亡性细胞死亡与依赖性细胞死亡机理是正交的(缺乏任何机制上的共性)，实际上，针对ZnPyr2所报道的PARP裂解会阻止任何PAR活性，更不必说用于引发依赖性细胞死亡级联反应的过度活化。
申请人先前在2016年11月1日提交的新加坡专利申请No.10201609131Y和2017年10月30日提交的新加坡专利申请No.10201708886R中公开了可消化聚合物-锌螯合物(分别为γ-聚谷氨酸锌[Zn-γPGA]和α-聚谷氨酸锌[Zn-αPGA])的抗癌功效。随后，在2018年6月22日提交的新加坡专利申请No.10201805412T和2018年12月24日提交的新加坡专利申请No.10201811577T中，申请人公开了相关的基于锌的药剂作为单一疗法或与免疫肿瘤药剂组合针对一系列癌症适应症具有治疗益处。前述申请通过引用以其整体在此并入。
尽管如此，但是仍然需要表现出对肿瘤更大的功效和/或对其它细胞类型例如M2样巨噬细胞的活性的改进的药剂。
为了解决所提及的问题，申请人对多肽聚合物的设计以及额外的结构特征和功能特性如何可以提高金属离子在细胞(特别是用于递送金属离子的多肽缀合物所靶向的细胞类型)内发挥治疗效果的能力进行了实验。申请人对与其缀合的部分的种类和它们制备可用于能够进一步诱导依赖性细胞死亡的二价金属离子的细胞内递送的聚合物缀合物组合物的缀合方式进行了实验。申请人测试了此类组合物对癌细胞(包括实体瘤癌细胞和血液癌细胞)和M2样巨噬细胞的活性，并且发现此类组合物具有强效杀肿瘤作用并且诱导依赖性细胞死亡，由此完成了如本文中所述的本发明。
本文中公开的组合物和方法源于如下令人惊讶的发现：包含靶向部分和可裂解的离子载体部分的多肽聚合物缀合物的金属离子复合物可以在各种人和小鼠肿瘤中诱导依赖性细胞死亡并且可以在体内试验中在例如T细胞和巨噬细胞等抗肿瘤免疫区室(antitumor immune compartment)引发应答。
引文列表
NPL 1.Sheline,C.T.,Wang,H.,Cai,A.L.,Dawson,V.L.,Choi,D.W.(2002).Involvement of poly ADP ribosyl polymerase-1in acute but not chronic zinctoxicity.Eur.J.Neurosci.18,1402-1409.
NPL 2.Luo,T.,Yuan,Y.,Yu,Q.,Liu,G.,Long,M.,Zhang,K.,Bian,J.,Gu,J.,Zou,H.,Wang,Y.,Zhu,J.,Liu,X.,Liu,Z.(2017).PARP-1overexpression contributes tocadmium-induced death in rat proximal tubular cells via parthanatos and theMAPK signalling pathway.Scientific Reports 7,4331.
NPL 3.Kim,Y.H.,and Koh,J.Y.(2002).The role of NADPH oxidase andneuronal nitric oxide synthase in zinc-induced poly(ADP-ribose)polymeraseactivation and cell death in cortical culture.Experimental Neurology 177,407-418.
NPL 4.Carraway,R.E.,and Dobner,P.R.(2012).Zinc pyrithione inducesERK-and PKC-dependent necrosis distinct from TPEN-induced apoptosis inprostate cancer cells.Biochimica et Biophysica Acta 1823,544-557.
NPL 5.Snyder,D.R.,de Jesus,C.P.,Towfighi,J.,Jacoby,R.O.,and Wedig,J.H.(1979).Neurological,microscopic and enzyme-histochemical assessment ofzinc pyrithione toxicity.Food and Cosmetics Toxicology 17,651-660.
NPL 6.Zhao,C.et al.(2017).Repurposing an antidandruff agent totreating cancer:zinc pyrithione inhibits tumor growth via targetingproteasome-associated deubiquitinases.Oncotarget 8,13942-13956.
发明内容
本公开通常涉及有治疗活性的多肽聚合物缀合物组合物以及制备和使用它们的方法。更具体地，该组合物包含靶向部分和缀合至聚合物的离子载体配体、和与所述聚合物结合的有治疗活性的金属离子，并且此类组合物可用于治疗有效量的金属离子向组合物所靶向的细胞的细胞内递送。有治疗活性的金属离子选自锌(II)离子和镉(II)离子。
在一个方面，本公开提供多肽聚合物缀合物组合物及其合成方法。聚合物由经由肽键连接的单体单元构成，并且单体单元包括具有可用于将各种官能部分缀合至聚合物的官能团的侧链。在一个优选的实施方案中，单体单元侧链中存在的官能团为羧基。羧基提供多种众所周知的用于将各种部分连接至聚合物骨架的共轭化学体系(conjugationchemistries)。此外，该官能团可以其羧酸盐形式制备，并且用于使有治疗活性的金属离子与聚合物结合。
至少一个单体单元侧链缀合至靶向部分并且至少一个单体单元侧链缀合至离子载体部分。靶向部分包含能够被在组合物所针对的细胞上发现的细胞表面受体识别的分子。该部分由此用于将聚合物组合物引导至特定细胞，从而受体可以促进聚合物组合物摄取至细胞中。离子载体包含能够与有治疗活性的金属离子形成配位复合物的分子。通常，官能部分的缀合通过使侧链官能团经由连接基团与官能部分连接来完成。优选地，靶向部分经由不可裂解的共价键合的连接基团连接至聚合物，而离子载体部分经由包含可裂解的键的共价键合的连接基团连接至聚合物，由此允许离子载体部分与聚合物骨架分离并且与有治疗活性的金属离子形成复合物。
在未缀合至靶向部分或离子载体部分的剩余单体单元中，在一些实施方案中，此类单体单元中的侧链独立地处于质子化(羧酸)或非质子化(羧酸根离子)形式。羧基的形式通常取决于产生固体形式的聚合物的化学后处理—可以将聚合物制备为盐或制备为游离酸，或者是否将聚合物以溶液提供，在该情况下，羧基在水溶液中的电离状态为pH的函数。在其它实施方案中，多个剩余非缀合侧链作为羧酸根离子存在并且与有治疗活性的金属离子复合，而其它剩余侧链羧基可以质子化和/或非质子化形式存在。
在一些实施方案中，本发明的聚合物缀合物包含式(I)所示的部分结构：
其中：
A为含有具有可电离官能团的侧链的单体单元；
LQ为可裂解的连接基团；
Q为离子载体配体；
LA为第一连接基团；
T1为靶向第一受体的第一靶向部分；
M在每次出现时独立地选择并且可以为质子、阳离子性抗衡离子或有治疗活性的金属离子；并且
括号表示共同形成聚合物的各类型的单体单元的一次或多次出现。如本文中所述，各单体类型的数量彼此独立，但是特定的单体类型的出现次数可以根据官能度和组合物所需的性质来选择。如本领域技术人员所理解的，特别是鉴于本文中的公开内容，该示例不旨在一级结构，这是因为各单体类型的出现通常是随机排序的。
在其它实施方案中，本发明的聚合物缀合物包含式(II)所示的部分结构：
其中：
与式(I)相同的符号具有相同的含义，并且
LB为第二连接基团；
T2为靶向第一受体或第二受体的第二靶向部分。
在其它实施方案中，本发明的聚合物缀合物包含式(III)所示的部分结构：
其中：
与式(I)和式(II)相同的符号具有相同的含义，并且
LZ为标签连接基团；
Z为标签部分。
标签部分为用于便于化学合成开发或者体外、原位或体内探究性研究的可检测标签。优选地，标签为荧光团。
在式(I)-式(III)中的每一者中，应当认识到如下程度：聚合物骨架具有与侧链官能团相同或具有与侧链官能团相似化学反应性的末端官能团，连接基团LA、LB、LQ或LZ中的一者可以键合至末端官能团位置。这可能是随机竞争、缀合反应中试剂的添加顺序、或者由于偶联剂、反应条件或特定连接基团的官能团导致的反应性偏好的结果。
在另一方面，本发明提供用存在的有治疗活性的金属离子制备的、上述式(I)-式(III)的聚合物组合物中的任意者，作为有治疗活性的聚合物缀合物药剂。此类治疗剂组合物通常配制为液体溶液，并且以与给药的途径和形式一致的药学上可接受的方式配制。在一个实施方案中，将治疗剂组合物配制为用于静脉内给药。
在另一方面，本文中提供有治疗活性的多肽聚合物缀合物的任意实施方案中的药物组合物在用于治疗受试者中的实体瘤或血液癌症的方法中的用途。在一些实施方案中，所治疗的实体瘤或血液癌症为对PARP介导的坏死性死亡敏感的那些类型。
在另一方面，本文中提供有治疗活性的多肽聚合物缀合物的任意实施方案中的药物组合物在用于治疗巨噬细胞介导的炎症的方法中的用途。在一些实施方案中，药物组合物可用于靶向M2样巨噬细胞和治疗巨噬细胞介导的炎性病况。在一些实施方案中，药物组合物可用于在各种免疫区室中引发免疫应答。
在另一方面，本文中提供有治疗活性的多肽聚合物缀合物的任意实施方案中的药物组合物在用于治疗受试者中的病况的方法中的用途，在所述受试者中，引起病状的细胞容易被叶酸部分靶向，这是因为该细胞过表达叶酸受体，或者容易被整合素的配体靶向，这是因为细胞过表达被靶向的整合素。
在另一方面，本文中提供根据本文中公开的任意实施方案的多肽聚合物缀合物组合物在制造用于本文中公开的治疗方法的药物组合物或药物中的用途。
附图说明
图1示出实施例6中描述的聚合物缀合物的一个实施方案。
图2示出实施例7中描述的聚合物缀合物的一个实施方案。
图3示出实施例8中描述的聚合物缀合物的一个实施方案。
图4示出实施例9中描述的用作对照的聚合物缀合物。
图5A示出在对4T1细胞进行24h处理之后使用LDH释放检测进行的比较性体外细胞毒性评价。
图5B示出体外时间分辨细胞凋亡-坏死流式细胞术检测的结果。
图5C示出体外剂量分辨细胞凋亡-坏死流式细胞术检测的结果。
图5D示出在具有或不具有PARP抑制剂PJ34的情况下对C010DS-Zn处理的4T1细胞的体外PAR-ELISA检测结果。
图6A示出处理1.5h的4T1细胞的代表性共聚焦荧光图像。
图6B示出针对细胞活力、核AIF易位和核TUNEL强度的荧光图像的定量分析。
图7A示出C010DS-Zn对按肿瘤部位分层的53种PDX肿瘤类型的离体IC50值。
图7B示出离体IC50值对与各PDX肿瘤碎片相关的TMB或MSI评分的图。
图7C示出来自CTG-1413肉瘤PDX肿瘤碎片的离体细胞毒性反应数据的实例。
图8示出用10％ DMSO(PC)或C010DS-Zn离体处理后PDX肿瘤碎片中的抗-γH2AX摄取的比较性荧光成像表征。
图9A示出4T1-Balb/c治疗模型方案、肿瘤生长动力学和TME中显著的免疫应答。
图9B示出CT26-Balb/c治疗模型方案、肿瘤生长动力学和TME中显著的免疫应答。
图10A示出在使用Sprague-Dawley大鼠单次静脉内推注C010DS-Zn之后分别通过Cy5.5信号追踪C010DS和追踪锌水平的C010DS-Zn的血浆药代动力学特征。
图10B示出针对4T1-Balb/c模型的13天非抗癌给药方案、其肿瘤生长动力学和收集的肿瘤中巨噬细胞对治疗的免疫应答。
图10C示出针对4T1-Balb/c模型的16天非抗癌给药方案、其肿瘤生长动力学和收集的肿瘤中巨噬细胞对治疗的免疫应答。
具体实施方式
本文中公开的聚合物缀合物由缀合至聚合物骨架的两种官能部分类型构成并且能够与有治疗活性的金属离子形成复合物。这些组分—靶向部分、离子载体部分和金属离子—当被集合在一起作为如本文中所述的金属离子聚合物缀合物复合物时能够在受试者中诱导生物学反应，赋予治疗益处。聚合物缀合物用于据信在离子载体部分的帮助下将一定剂量的金属离子递送至表达如下受体的细胞的细胞内环境，靶向部分将聚合物缀合物引导至所述受体。
存在数个有助于主题大分子组合物所需性质的主题大分子组合物的一般特征。首先，组合物包括与细胞表面受体结合的配体。该配体称为靶向部分。感兴趣的配体为与在感兴趣的细胞类型上过表达或至少丰富的细胞表面受体结合的那些。值得注意的是，发现肿瘤细胞和例如巨噬细胞等免疫细胞过表达某些受体，例如，叶酸受体或叶酸结合蛋白，从而提供使用受体配体或者其类似物或衍生物靶向这些细胞类型的方式。通常，靶向部分以不容易被裂解的方式共价连接至结构的其余部分。与结构的其余部分的连接通常是亲水性的，并且足够长以允许配体接近细胞表面受体而具有很小的来自结构的其余部分的位阻干扰。多个靶向部分可以连接至该结构，和/或可以包括多于一种类型的靶向部分。
第二，组合物包括金属离子的离子载体。该离子载体称为离子载体部分。离子载体为与金属离子可逆地结合并且辅助金属离子跨生物膜转运的分子。在优选的实施方案中，离子载体部分经由可裂解的键连接至结构的其余部分。在进一步的实施方案中，由于大分子积聚的微环境而导致键裂解。在进一步的实施方案中，离子载体由于已从结构的其余部分裂解而能够正常地与金属离子结合。即，例如，连接的裂解暴露离子载体中的官能团，所述官能团为与金属离子配位的基团之一。多个离子载体部分可以连接至该结构，和/或可以包括多于一种类型的离子载体部分。
第三，组合物包括可以引起生物学效应的金属离子。组合物的目的在于在受试者体内递送金属离子，从而引起具有治疗益处的生物学效应。通常，多个金属离子与各大分子结构缔合，从而在本质上向特定的细胞环境提供单次注射剂量的金属离子。使用本文中公开的结构递送金属离子的益处在于，在没有此类结构的情况下，金属离子无法以这样的浓度递送至细胞环境和/或无法如此缺少对细胞、组织、器官或作为整体的受试者的毒性作用。
第四，组合物由大分子构成，所述大分子提供(i)以上讨论的各种其它组分可以结合至其上的支架，从而可以作为一组来递送或起作用，以及(ii)足够的尺寸或体积，使得细胞将通过内吞作用(例如，受体介导的内吞作用、吸附性内吞作用等)摄取组合物。可以提供此类支架的常见大分子结构包括线性聚合物、支化聚合物、树状聚合物和其它类型的纳米颗粒。通常，此类大分子除了提供制备缀合物和结合金属离子所必需的官能团以外，还应当是水溶性的、无毒性的和非免疫原性的。此外，此类大分子优选为可生物降解的，但是如果不是，则应当小于～40kDa以便于高效的肾脏消除。在内吞摄取过程中，在不受理论束缚的情况下，认为核内体和溶酶体将容纳组合物并且其中的微环境例如较低的pH以及消化酶和氧化还原活性分子(例如，谷胱甘肽)的存在可以导致与离子载体的可裂解的连接裂解。结果，金属离子可以与离子载体结合，并且离子载体可以辅助金属离子从核内体和溶酶体向细胞内环境的其余部分的转运，其中金属离子可以发挥预期的生物学效应，例如引起依赖性细胞死亡。
已经描述了主题组合物的这些一般原理和性质，现在将详细参考本发明的某些实施方案。
A.聚合物缀合物。
在一个实施方案中，聚合物缀合物由式(IV)所描述：
及其金属离子复合物。
在式(IV)中，聚合物骨架为γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，其中线性骨架由一个单体的氨基和位于第二单体单元的γ位的羧酸基之间的肽键形成。因此，在各单体单元的α位处的羧酸基为悬垂的侧链，其可用于缀合并且当作为羧酸根离子存在时还能够结合金属离子或与阳离子配对。
该式的特征在于不同单体单元周围的方括号，以表示存在四种不同类型的单体单元，潜在地具有如由取代基定义的不同的结构。各括号具有下标(c、a、b和m，从左至右)，表明各单体单元类型可以存在于很多实例中。然而，该式不旨在要求聚合物骨架的连接(即，一级结构)为第一单体类型的“c”个单元、然后是第二单体类型的“a”个单元，以此类推。相反，一级结构将包含各种单体类型的随机排序，受到由于用于制备聚合物缀合物组合物的合成路线而产生的任何倾向的影响，所述倾向包括例如如本领域技术人员所理解的连接基团和侧链的添加顺序、形成在连接基团和α-羧基之间的键的性质、偶联剂和反应条件等。
考虑到末端位置，在N-末端，R1为H，并且在C-末端，R2为OH或OM或LA-T1或LB-T2或LQ-Q。
T1和T2为靶向部分。在一个实施方案中，T1和T2各自与不同类别的细胞表面受体结合，因此代表不同类别的配体。在另一实施方案中，T1和T2是不同的分子，但是它们各自与同一类别的细胞表面受体结合。T1和T2可以为天然配体(在细胞中发现的分子，其为受体的天然结合伴侣(natural binding partner))、或配体类似物(不是在细胞中天然发现的分子，但是其对受体具有结合亲和性)、或配体衍生物(天然配体的修饰形式，通常经修饰以便于缀合)。如果T1或T2存在有易于反应以形成共价键的官能团，则该官能团可以用于将所述部分连接至连接基团，或者将所述部分直接缀合至聚合物。通常，配体类似物会制备为具有合适的官能团。天然配体例如叶酸可能会具有合适的官能团，但是如果没有，可以制备配体衍生物以提供合适的官能团。
T1和T2分别经由连接基团LA和LB通过悬垂的侧链中的α-羧基连接至聚合物骨架。LA和LB为能够将靶向部分经由共价键连接至聚合物骨架的任何化学部分。在T1或T2可以与聚合物直接形成共价键的情况下，则LA或LB分别表示键。除此以外，LA和LB分别表示具有能够与单体单元中的悬垂的α-羧基形成键的第一末端位点和能够与T1和T2中的合适官能团形成键的第二末端位点的双官能分子，其中第一末端位点和第二末端位点通过3至20个原子的链彼此连接。第一末端位点可以为-O-、-S-或-NH-，由此形成与聚合物的酯连接、硫酯连接或酰胺连接。第二末端位点可以为-O-、-S-、-NH-或-酰基。3至20个原子的链可以包含聚醚链段、醚链段例如-O(CH2CH2)O-或者任选取代的直链烃或支链烃。LA和LB的第一末端位点和第二末端位点可以相同或不同。为了方便起见，提供具有相同的第一末端位点的LA和LB可以便于同时进行LA和LB与聚合物之间的偶联反应。
T1和T2中的至少一者或两者作为靶向部分存在。角标“a”和“b”分别为T1的引入程度和T2的引入程度，其中“a”和“b”表示每个聚合物组成中的此类单体单元的平均数量。“a”和“b”中的每一者可以为零或至多约5的有限数，但是“a”和“b”不均为零。
Q为离子载体部分，包含用于制备聚合物缀合物的金属离子复合物的金属离子的离子载体。在优选的实施方案中，离子载体为双齿配体，并且配体中的一者为硫醇基或硫酮基，而另一配体通常为O-基官能团或N-基官能团。在一个实施方案中，制备离子载体部分以使其经由硫醇基或硫酮基连接至连接体LQ，并且连接体LQ具有S-基官能团，由此LQ-Q通过可以裂解的二硫键连接。
LQ表示连接基团，Q通过该连接基团连接至单体单元的α-羧基，并且LQ包含可裂解的位点。可裂解的键为在LQ和Q之间的键。LQ表示具有能够与单体单元中的悬垂的α-羧基形成键的第一末端位点和能够与Q中的合适官能团形成键的第二末端位点的双官能分子，其中第一末端位点和第二末端位点通过3至20个原子的链彼此连接。第一末端位点可以为-O-、-S-或-NH-，由此形成与聚合物的酯连接、硫酯连接或酰胺连接。可裂解的末端位点可以为-S-，从而例如与Q中的硫醇基形成二硫键。所述3至20个原子的链可以包含聚醚链段、醚链段例如-O(CH2CH2)O-或任选取代的直链烃或支链烃。LQ的第一末端位点可以与LA和LB的第一末端位点相同或不同。为了方便起见，提供具有相同的第一末端位点的LQ、LA和LB可以便于同时进行LQ、LA和LB与聚合物之间的偶联反应。
角标“c”为Q的引入程度，其中“c”表示每个聚合物组成中的此类单体单元的平均数量。“c”可以为约3至约50的有限数。
M在每种情况下独立地表示H、质子、碱离子、药学上可接受的一价阳离子、或不存在。
角标“m”为不在任何其它基团中的单体单元的引入程度，其中“m”表示每个聚合物组成中的此类单体单元的平均数量。“m”可以为约50至约700的有限数。
在一个实施方案中，聚合物缀合物由式(V)所描述：
及其金属离子复合物。
式(V)中的与式(IV)中的那些相同的符号具有相同的含义。
对于由式(IV)描述的实施方案，式(V)的实施方案进一步包含荧光团部分Z，其经由连接基团LZ在C-末端γ-羧基处连接至聚合物。
LZ为能够将荧光团部分经由共价键连接至聚合物骨架(这里，末端单体单元)的任何化学部分。在Z可以与聚合物直接形成共价键的情况下，则LZ表示键。除此以外，LZ表示具有能够与单体单元中的羧基形成键的第一末端位点和能够与Z中的合适官能团形成键的第二末端位点的双官能分子，其中第一末端位点和第二末端位点通过3至20个原子的链彼此连接。第一末端位点可以为-O-、-S-或-NH-，由此形成与聚合物的酯连接、硫酯连接或酰胺连接。第二末端位点可以为-O-、-S-、-NH-或-酰基。所述3至20个原子的链可以包含聚醚链段、醚链段例如-O(CH2CH2)O-或任选取代的直链烃或支链烃。LZ的第一末端位点和LZ的第二末端位点可以相同或不同。为了方便起见，提供具有与LA、LB和LQ中的一者、一些或全部相同的第一末端位点的LZ可以便于同时进行LZ、LA、LB和LQ中的一些或全部与聚合物之间的偶联反应。
虽然在式(V)中没有明确表示，但是荧光团部分在末端位置处的引入程度可能不是精确地为1。相反，由于不同的反应收率，引入程度可以为约0.8至1.2。
在一个实施方案中，聚合物缀合物由式(VI)描述：
及其金属离子复合物。
式(VI)中的与式(V)中的那些相同的符号具有相同的含义。
与由式(V)描述的实施方案相比，式(VI)的实施方案包含相同的组分，然而，荧光团部分Z经由连接基团LZ在悬垂的α-羧基处连接至单体单元之一。
角标“d”为Z的引入程度，其中“d”表示每个聚合物组成中的此类单体单元的平均数量。“c”可以为约(大于或小于)1的有限数。
B.聚合物缀合物的组分。
聚合物骨架。本文中设想的用作与各种部分和离子结合的大分子结构的聚合物包括对于制药用途安全的可生物降解的、非免疫原性的聚合物。聚合物包含提供羧酸官能团的单体单元，所述羧酸官能团可以用于将官能部分缀合至其上或者与例如金属离子等阳离子相互作用和结合例如金属离子等阳离子。
在一个实施方案中，聚合物基本上包含通过肽键连接的单体单元。在进一步的实施方案中，单体单元选自任何形式的谷氨酸。谷氨酸的形式包括谷氨酸的L异构体、D异构体或DL外消旋体。可以使用这些形式中的任意者，并且可以以任意比例一起使用两种或更多种不同的形式。
在另一实施方案中，可以将谷氨酸单体单元通过α-羧酸基或γ-羧酸基以肽键连接。在一个实施方案中，在聚合物中重复使用相同的羧酸基，以提供包含α-聚谷氨酸(α-PGA)或γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的均匀链段的聚合物。在进一步的实施方案中，在整个聚合物中发现相同的连接，即，聚合物可以为α-PGA或γ-PGA的均聚物。α-PGA和γ-PGA的各种异构形式可以是合成的或源自天然来源。虽然生物体通常仅由L异构体产生聚(氨基酸)，但是产生α-PGA或γ-PGA的某些细菌酶可以由任一异构体或两种异构体产生聚合物。
包含谷氨酸单体单元(包括构成α-PGA或γ-PGA的那些)的聚合物可以以各种尺寸和各种聚合物分散度提供。聚合物分子量通常为至少约5kDa且至多约100kDa。在一些实施方案中，聚合物分子量为至少约5kDa、或至少约10kDa、或至少约20kDa、或至少约30kDa、或至少约35kDa、或至少约40kDa、或至少约50kDa。在一些实施方案中，聚合物分子量为至多约100kDa、或至多约90kDa、或至多约80kDa、或至多约70kDa、或至多约60kDa。可接受的聚合物分子量范围可以选自上述聚合物分子量值中的任意者。在一个实施方案中，聚合物分子量在约5kDa至约50kDa的范围内。在一个实施方案中，聚合物分子量在约50kDa至约100kDa的范围内。在一个实施方案中，聚合物分子量为约50kDa。聚合物分子量通常以基于借助凝胶渗透色谱(GPC)的测量的数均分子量(Mn)给出。将上述聚合物质量表示为Mn；可以使用其它测量技术来确定例如，质(重)均分子量(Mw)，并且任意给定聚合物的规格可以在各种聚合物质量表示之间转换。
靶向部分。设想的靶向部分包括叶酸受体配体例如叶酸及其类似物或衍生物、和整合素靶向肽例如RGD肽及其类似物或衍生物。
叶酸受体蛋白通常在很多人类肿瘤中表达。叶酸天然地对叶酸受体具有高的亲和性，此外，结合后，可以通过内吞作用将叶酸和连接的缀合物转运至细胞中。以这种方式，包含叶酸部分的聚合物缀合物可以靶向肿瘤细胞并且积聚在肿瘤细胞处，并且将金属离子递送至肿瘤细胞的附近和/或内部。
还已知N5,N10-二甲基四氢叶酸(DMTHF)对叶酸受体具有高的亲和性。DMTHF的制备记载于Leamon,C.P.等人，Bioconjugate Chemistry 13,1200-1210中。此外，存在叶酸受体(FR)的两种主要亚型FR-α和FR-β，并且已证明DMTHF对FR-α具有高于FR-β的亲和性(Vaitilingam,B.等人，The Journal of Nuclear Medicine 53,1127-1134.)。这有益于靶向肿瘤细胞，这是因为FR-α在很多恶性细胞类型中过表达，而FR-β在与炎性疾病相关的巨噬细胞上过表达。因此，基于叶酸的靶向部分可以提供选择性地与由肿瘤细胞或巨噬细胞表达的叶酸受体结合的手段。
类似地，已知RGD肽与在肿瘤内皮细胞以及一些肿瘤细胞上表达的α(V)β(3)整合素强结合。因此，RGD缀合物可以用于将抗肿瘤药剂靶向和递送至肿瘤部位。最近对关于细胞表面受体的整合素家族、它们在各种病状(包括癌症、炎性疾病或自身免疫性疾病)中的作用、与其结合的天然配体和类似物或模拟物以及缀合方法的进一步信息进行了综述(Wu,P-H.等人，(2019)Targeting integrins in cancer nanomedicine:applications incancer diagnosis and therapy.Cancers 11,1783)。
关于将靶向部分缀合至聚合物骨架，叶酸具有环外胺基，其可以与单体(例如谷氨酸单体单元)的游离羧酸基偶联以形成连接二者的酰胺键。DMTHF中与叶酸中相同的环外胺基可用于酰胺键形成。RGD缀合物也是本领域众所周知的，并且也可以经由例如RGD中的游离α-氨基类似地共价连接至游离羧酸基。可选地，可以将任一部分经由连接基团(例如，LA或LB)，如，例如，聚乙二醇胺缀合至聚合物骨架。α-PGA的γ-碳羧酸根基团与氨基之间的缀合反应的实例可以在Bai等人的美国专利No.9,636,411中找到，并且与氨基和羟基之间的缀合反应的实例可以在Van等人的美国授权前公开No.2008/0279778中找到。与γ-PGA的缀合反应(包括叶酸和柠檬酸与γ-PGA的缀合反应)的实例可以在WO 2014/155142(2014年10月2日公开)中找到。其他合成方案在以下实施例中提供。
离子载体部分。在本文中设想包含用于金属离子的离子载体的离子载体部分用于经由可裂解的连接基团连接至聚合物缀合物，作为提供可以辅助金属离子进入细胞的细胞内区室的配体的手段，从而增强金属离子的治疗活性。示例性离子载体包括吡啶硫酮和1-羟基吡啶-2-硫酮，并且本领域技术人员可以识别其它合适的离子载体。这些离子载体具有离子载体中的硫部分可以用于与离子载体连接基团(LQ)中的硫醇基形成二硫键的有益性质，其中离子载体会被掩蔽并且直至稍后才与金属离子结合，当二硫键裂解时，同时释放和暴露离子载体。在另一实施方案中，离子载体结合位点在裂解之前未被掩蔽，并且在使离子载体从聚合物缀合物裂解之前和之后均可以与金属离子相互作用，包括与金属离子结合。在不受理论束缚的情况下，认为这在金属离子-聚合物缀合物组合物被细胞吸收时发生，并且其中的条件有利于二硫化物的裂解。结果，金属离子-离子载体复合物可以形成，和/或离子载体可以辅助金属离子穿入细胞内区室。
标签部分。在本文中设想包含可检测标签，如，例如，荧光团的标签部分用于连接至聚合物缀合物作为容易对聚合物缀合物组合物进行检测和/或定量的手段。认为其在探究性研究中特别有用。可以使用本领域技术人员已知的任何标准荧光团，条件是荧光团结构包括允许荧光团直接地或经由连接基团(LZ)容易地缀合至聚合物的官能团。示例性荧光团包括花青染料，包括Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7染料以及商购可得的这些染料的其它类似物和衍生物。染料的特定选择可以取决于由各化合物提供的特定的激发波长和发射波长或者所提供的准备用于缀合反应的活化的合成中间体的可得性。
金属离子。在本文中设想用于金属离子-聚合物缀合物组合物的金属离子包括锌(II)离子和镉(II)离子。使用金属离子盐来制备组合物，例如，锌(II)盐(等同地，Zn2+盐)，其中抗衡离子(阴离子)可以为适合用于制造药品的任何无机阴离子或有机阴离子。合适的阴离子是人体耐受的那些，包括无毒性的那些。通常，金属离子盐可以由式M2+X2-或M2+(X-)2或甚至M2+(X-)(Y-)表示，其中M2+为Zn2+或Cd2+，并且X2-/1-和Y2-/1-为合适的阴离子。阴离子可以选自作为FDA批准的药品的组分的阴离子的组。在一些实施方案中，金属(II)盐为药学上可接受的金属盐。锌盐的实例包括氯化锌、硫酸锌、柠檬酸锌、乙酸锌、吡啶甲酸锌、葡萄糖酸锌、氨基酸-锌螯合物例如甘氨酸锌或本领域已知和使用的其它氨基酸。镉盐的实例包括氯化镉、硫酸镉和如本领域已知和使用的其它盐。
C.金属离子-聚合物缀合物复合物。
金属离子-聚合物缀合物复合物可以通过将金属离子与本文中所述的聚合物缀合物组合物组合来制备。根据本发明的复合物中的金属离子量可以表示为金属离子与单体单元(“MU”)的摩尔比或金属离子与聚合物缀合物的重量比。设想了设想范围为1:2、1:5、1:10、1:20的摩尔比，并且甚至更低的比率也是可以的，但是递送合适剂量的金属离子所需的剂量中包含的PGA量增加。剂量与非锌组分的量之间的适当的平衡可以由本领域普通技术人员确定。在一个实施方案中，该比为约1:2和约1:10Zn:MU之间的任意值。在另一实施方案中，该比为约1:3和约1:6之间的任意值。在另一实施方案中，该比为约1:4.5。在其它实施方案中，将金属离子与聚合物缀合物以两种组分的特定的重量比组合以形成金属离子-聚合物缀合物组合物。在一个实施方案中，金属离子：聚合物缀合物重量比在约1:5至1:20之间，并且在一个优选的实施方案中，重量比为约1:10。
金属离子-聚合物缀合物复合物可以通过本领域已知的用于用水溶性聚合电解质制备金属离子复合物的技术来制备，包括如以下实施例中公开的方法。可以将此类复合物制备为溶液并且作为溶液储存，或者冻干并且作为固体储存。当制备为溶液时，组合物中提供的金属离子的浓度通常在约1μg/mL至约100mg/mL的范围内。这对应于约0.0001wt％至约10wt％的金属离子的范围。浓度可以为至少约10μg/mL、或至少约0.1mg/mL、或至少约1mg/mL、或至少约10mg/mL、或至少约50mg/mL、或者浓度可以落入这些示例性浓度中的任意两者内的范围。在一个实施方案中，浓度可以在约100μg/mL至约5mg/mL的范围内。在另一实施方案中，浓度可以在约200μg/mL至约2mg/mL的范围内。
D.药物组合物。
可以使用金属离子-聚合物缀合物组合物来制备药物组合物或药物。在一个实施方案中，可以将药物组合物或药物配制为液体剂型。合适的液体剂型包括溶液剂、混悬剂、糖浆剂和口腔喷雾剂。此类溶液剂可以口服或者通过注射给药，例如静脉内注射、皮内注射、肌内注射、鞘内注射或皮下注射或者直接注射至肿瘤内或肿瘤附近，而混悬剂、糖浆剂和喷雾剂通常适于口服给药。在另一实施方案中，可以将药物组合物或药物配制为冻干形式以在作为液体剂型给药之前重构。
优选地，药物组合物或药物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、缓冲剂、稀释剂、溶媒、赋形剂、或其任意组合，适合施用于受试者、特别是人类患者，并且适合于使药物组合物稳定并且有效用于其预期目的。
在一些实施方案中，配制液体剂型用于全身递送。在某些情况下，可能会期望使用标准递送装置在适当配制的药用溶媒中肠胃外给予金属离子-聚合物缀合物组合物，包括静脉内、皮下、肌内、鞘内、腹膜内、经皮或局部，而没有限制。在其它实施方案中，液体剂型可以通过直接注射至身体内或身体各处的一种或多种细胞、组织或器官(包括受试者、特别是人类患者的肿瘤块)中来给药。
适合于肠胃外递送或口服递送的液体剂型的实施方案包含金属离子-聚合物缀合物组合物和水。在进一步的实施方案中，液体剂型可以进一步包含缓冲剂和/或盐例如氯化钠。当包含缓冲剂时，优选的缓冲剂pH在约pH 4至约pH 9的范围内。此外，在液体剂型的一些实施方案中，溶液与溶液要注射至其中的流体等渗并且为合适的pH。在任意前述液体剂型实施方案中，可以将溶液制备为无菌溶液。此类等渗的、经缓冲的、无菌的水溶液尤其适合于静脉内给药、肌内给药、皮下(subcutaneous)给药、经皮给药、皮下(subdermal)给药和/或腹膜内给药。
可以将本文中公开的药物组合物以适合用于一种或多种药学上可接受的溶媒(包括例如无菌水性介质、缓冲剂、稀释剂)的方式配制。例如，可以将给定剂量的金属离子-聚合物缀合物组合物溶解在特定体积的等渗溶液(例如，等渗盐水溶液)中，然后在所计划的给药部位注射，或者在适合于静脉内输注的溶媒中进一步稀释。
可以将液体剂型包装在小瓶、安瓿、药筒和预填充注射器等中。在一些实施方案中，可以将液体剂型在给药之前稀释和/或从包装或递送装置转移至另一递送装置，例如从小瓶转移至输注装置。可以将冻干的形式包装在小瓶、药筒、合适的注射器装置和便于将冻干物重构为液体剂型的其它合适的混合系统中。
E.使用方法
可以给予本文中所述的药物组合物以提供治疗有效量的金属离子-聚合物缀合物组合物，从而在受试者中实现期望的生物学反应。治疗有效量意指通过金属离子、聚合物缀合物(包括与其缀合或从其释放的部分)和/或剂型的递送效率等的组合作用，递送至需要治疗的患者的金属离子会实现期望的生物学反应的量。治疗有效量也可以根据所治疗的适应症和受试者的病况而不同。
期望的生物学反应包括预防肿瘤或癌症的发作或发展，部分或完全预防、延迟或抑制肿瘤或癌症的进展，或者预防、延迟或抑制肿瘤或癌症在例如哺乳动物等受试者中、特别是在人类(也可以称为患者)中的复发。治疗方法的临床益处可以通过客观缓解率、肿瘤大小、响应持续时间、至治疗失败的时间、无进展生存期以及临床使用中评估的其它主要终点和次要终点来评估。
认为对PARP介导的坏死敏感的所有肿瘤类型或巨噬细胞介导的炎性病状是可以根据本文中公开的治疗方法治疗的适应证。各种实施例证明了使用所公开的组合物和药物制剂的实施方案的、根据所公开方法的实施方案的治疗的功效。结果证明了体外小鼠癌细胞、离体人类癌细胞的有效治疗以及在同基因小鼠癌症模型中的体内治疗效果。
达到治疗有效量将取决于制剂的特性，并且会因每个个体的性别、年龄、状况和基因组成而异。在锌金属复合物的情况下，由于例如遗传原因或者吸收不良或严重饮食限制的其它原因而导致锌不足的个体与通常具有足够锌水平的那些个体相比可能会需要不同的量以达到治疗效果。
通常对受试者给予约0.1mg/kg/天至约6mg/kg/天的金属离子量。在一些实施方案中，所给予的金属离子例如锌的量为约1.0mg/kg/天至约4mg/kg/天。可以将多种剂型在一天中一起或分开服用。治疗通常持续至达到期望的治疗效果。如果肿瘤消退或被抑制，则低剂量水平的本文中所述的组合物和制剂也可以继续作为根据本发明的实施方案的治疗，用于预防、延迟或抑制肿瘤复发的目的或者用作预防性治疗。
实施例
在以下实施例中进一步定义本发明。应当理解，实施例仅以说明的方式给出，其中实施方案旨在以非限制性方式展示本发明的各方面。由本文中公开的描述和实施例，本领域技术人员可以确定本公开的必要特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下可以做出各种改变和修改以适应本公开并且仍然获得类似的产品或结果。结果，本公开不受本文中阐述的说明性实施例限制。
以下使用以下缩写：ACN为乙腈；DCC为N,N’-二环己基碳二亚胺；DIC为N,N’-二异丙基碳二亚胺；DIEA为N,N-二异丙基乙胺；DMSO为二甲亚砜；EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；equiv.为当量；HBTU为2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；HOBt为羟基苯并三唑；MTBE为甲基叔丁基醚；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺；NLT为不小于；NMT为不超过；TFA为三氟乙酸。
A.聚合物缀合物及其金属离子复合物的制备
实施例1：叶酸-NH-PEG4-NH2侧链的制备
叶酸侧链(叶酸-NH-PEG4-NH2)根据以下示出的合成方案来制备：
A.叶酸-NH-PEG4-NH-Boc的合成
通过将叶酸(10g，1当量)溶解在加入有DIC(5.72g，2当量)的DMSO(350mL)/吡啶(150mL)溶液中并且在25℃下搅拌0.5小时来进行10g规模的合成。添加溶解在DMSO(10mL)中的Boc-NH-PEG4-NH2(9.15g，1.2当量)并且搅拌三天。在第四天，添加额外的DIC(1.43g，0.5当量)并且继续搅拌一天。在反应时间结束时，发现γ-异构体:α-异构体之比为95:5。通过在40℃下旋转蒸发来除去吡啶。将剩余溶液倒入MTBE(4体积当量)中然后将上层除去。添加MTBE(2体积当量)以使棕色粘稠化合物浆化两次，并且每次将上层除去。添加MTBE(1体积当量)以使橙色粘稠化合物浆化，然后将上层除去。由于重复浆化过程数次，粘稠的棕色粗制产物转变为橙色/黄色固体。在过滤并且将固体在N2下干燥之后，获得作为橙色至黄色粉末的粗制的Boc-叶酸侧链(15.1g，88％粗收率)。通过质子NMR(d6-DMSO)来确认产物。在20g规模的其它制备得到类似的结果。
B.叶酸-NH-PEG4-NH2的合成
在室温下用三氟乙酸(100mL)处理叶酸-NH-PEG4-NH-Boc(10.0g，1.0当量)，并且通过HPLC来监测反应的进程。通过在40℃下减压浓缩来除去TFA，并且获得棕色粘稠油状物。将该油状物通过使用DEAE Sephadex A-25柱的离子交换来纯化(200g；在0.1M四硼酸钾(K2B4O7)四水合物中预处理并且变为H2O相)。将油状物用水(5mL)稀释，添加至柱中，并且用一体积的H2O洗涤并用50mM碳酸氢铵溶液洗脱。收集包含产物的级分(估计的产物收率：81％)，与另一类似制备的批次合并以提供在～4.2L碳酸氢铵溶液中的～2.4g粗制产物。将该溶液使用LiChroprep RP-18(40-63μm)(100g)进一步纯化。在将物质上样至柱上之后，将柱用H2O洗涤，通过用5体积的0.1％ TFA/H2O洗涤来酸化至pH 2，并且将产物用9:1H2O(0.1％ TFA)/ACN洗脱。收集合适的级分并且在35℃下减压浓缩至～200mL，将其冻干以得到作为黄色蓬松固体的叶酸-NH-PEG4-NH2(1.988g，收率70％，纯度90.8％)。
通过质子NMR(d6-DMSO)和ESI质谱(m/z:658.29[M-H]+)来确认产物。
实施例2：cRGDfk-(O)C-PEG4-NH2侧链的制备
环状-RGD侧链(cRGDfk-(O)C-PEG4-NH2)根据以下示出的合成方案来制备：
A.Boc-NH-PEG4-CO2H的合成
向H2O(50mL)的溶液中添加NH2-PEG4-CO2H(5g，1当量)和NaHCO3(4.74g，3当量)。将混合物冷却至0-5℃，添加在THF(50mL)中的(Boc)2O(4.94g，1.2当量)，并且将所得混合物在0-5℃下搅拌1小时。将混合物加温至室温并且搅拌过夜。用MTBE(80mL×3)萃取浑浊的溶液。通过在NMT 10℃下添加42％柠檬酸将水层酸化至pH 4，然后用CH2Cl2(80mL×3)萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并且蒸发至干以提供作为无色油状物的Boc-NH-PEG4-CO2H(5.1g，收率：74％)。通过质子NMR来确认产物。
B.Boc-NH-PEG4-cRGDfk的合成
在室温下将Boc-NH-PEG4-CO2H(1300mg，1当量)溶解在DMF(120mL)中，然后添加EDC-HCl(700mg，1当量)、NHS(430mg，1当量)来活化。1小时后，将在DMF(45mL)中的cRGDfK(TFA抗衡离子)(3g，1当量)和DIPEA(870μL，1.2当量)添加至经活化的Boc-NH-PEG4-CO2H溶液中，搅拌过夜，然后添加至MTBE(3L)中以使产物沉淀。在过滤和用80mL MTBE洗涤滤液之后，获得作为白色固体的粗制产物Boc-NH-PEG4-cRGDfK(3.26g，80％收率)。使用C-18凝胶(20μm)(Diasogel级：SP-120-20-ODS-BP)通过如下来进一步纯化粗制产物(2.2g)：将溶解在水(230mL)中的粗制产物上样，并且使用0.1％ HCl(水溶液)和在ACN中的0.1％ HCl作为流动相A和B、通过将B的比例从0％增加至15％然后以5％的增量增加至25％来洗脱。将合适的级分收集、合并，并且将溶剂除去以得到产物Boc-NH-PEG4-cRGDfK(0.6g)。
C.cRGDfk-PEG4-NH2的合成
将Boc-NH-PEG4-cRGDfK(0.6g)通过在室温下用TFA(2mL)处理15分钟来脱保护，并且将TFA除去。将粗制产物溶解在水(80mL)中，并且除了通过将流动相B的比例以5％的增量从0％增加至10％来对柱进行洗脱以外，如之前对Boc保护的前体一样使用C-18凝胶来纯化。将合适的级分收集、合并，并且将溶剂除去以得到产物cRGDfK-PEG4-NH2(0.22g)。通过质子NMR和ESI质谱来确认产物(m/z：849.44[M-H]+)。
实施例3：吡啶硫酮-S-PEG3-NH2侧链的制备
离子载体侧链(Pyr-S-PEG3-NH2)根据以下示出的合成方案来制备：
A.Pyr-S-PEG3-NH-Boc的合成
将二吡啶硫酮(8g，5当量)和Boc-N-酰氨基-PEG3-硫醇(2g，1当量)溶解在甲醇(400mL)/乙酸(250mL)溶液中并且在室温下搅拌24小时。在反应完成之后，将反应混合物通过在40℃下旋转蒸发来蒸发至干以获得白色固体。将甲醇添加至固体中并且将所得混合物过滤。滤饼确认为二吡啶硫酮。将浓缩的滤液添加至100mL MTBE中，并且将所得白色沉淀物(二吡啶硫酮)通过过滤除去。MTBE滤液经测定包含吡啶硫酮和目标产物。将吡啶硫酮-PEG3-NH-Boc分离，并且使用40g LiChroprep RP-18(40-63μm)、使用水和ACN作为流动相并且将ACN以5％的增量从10％增加至30％来纯化。将合适的级分收集、合并，并且将溶剂除去以提供作为无色油状物的吡啶硫酮-PEG3-NH-Boc(2.04g，纯度：97.6％)。通过ESI质谱来确认产物(m/z 457.1[M+Na]+)。
B.Pyr-S-PEG3-NH2的合成
将吡啶硫酮-S-PEG3-NH-Boc(1.8g)通过在室温下用TFA(15mL)处理12分钟来脱保护，并且通过在40℃下旋转蒸发来除去TFA。将粗制产物溶解在水(6mL)中并且冻干以提供作为透明、浅黑色油状物的粗制产物吡啶硫酮-S-PEG3-NH2(3.0g，97％纯)。通过质子NMR和ESI质谱来确认产物(m/z：355.1[M+H]+)。
实施例4：Cy5.5-NH-(CH2)6-NH2侧链的制备
Cy5.5侧链(Cy5.5-NH-(CH2)6-NH2)根据以下示出的合成方案来制备：
A.N-Boc-1,6-二氨基己烷的合成
在NMT 5℃下，向1,6-二氨基己烷(27.8g，5当量)在CH2Cl2(200mL)中的溶液中滴加Boc酸酐(10.45g，1当量)在CH2Cl2(60mL)中的溶液。将混合物在NMT 5℃下搅拌50min，然后在室温下搅拌过夜。将混合物在85℃下、在真空下蒸发至干。将残余物用120mL 15％ Na2CO3溶液洗涤。在将H2O层除去之后，添加30mL DCM，将各相分离，并且将DCM层用52mL 15％Na2CO3溶液萃取并用50mL H2O洗涤四次以除去残留的1,6-二氨基己烷。将有机层蒸发至干，从而以70％的粗收率得到作为浅黄色油状物的粗制的N-Boc-1,6-己二胺(7.21g)。通过质子NMR来确认产物。将粗制产物(4mL)溶解在10mL DCM中、经Na2SO4干燥、然后在40℃下在真空下蒸发至干以获得所需产物。
B.Cy5.5-NH-(CH2)6-NH-Boc的合成
将Cy5.5-CO2H(2.0g，1当量)、N-Boc-1,6-二氨基己烷盐酸盐(816mg，1当量)、HBTU(3.68g mg，3当量)、HOBt水合物(1.31g，3当量)和DIEA(8.4mL，15当量)溶解在40mL DMF中。将混合物在室温下搅拌NLT 2.5小时。在通过TLC监测到反应完成之后，将DCM(25mL)添加至混合物中并且用H2O(25mL×4)萃取。将有机层经Na2SO4干燥、过滤并且蒸发至干。将残余物通过硅胶柱色谱(DCM/MeOH＝9/1)来纯化以获得Boc保护的Cy5.5侧链(2.95g，收率：112％(过量由残余溶剂解释))。通过质子NMR(CDCl3)来确认产物。
C.Cy5.5-NH-(CH2)6-NH2的合成
将在5％ HCl(37％)在2,2,2-三氟乙醇(94mL)中的溶液中的、Boc保护的Cy5.5侧链(2.95g，1当量)在室温下、在黑暗中搅拌3小时。在通过TLC监测到反应完成之后，将溶剂蒸发至干以获得粗制的Cy5.5侧链(3.44g，通过HPLC测定的纯度为90％)。通过LiChroprepRP-18(40-63μm)、使用0.1％ HCl(水溶液)和在ACN中的0.1％ HCl作为流动相A和B来纯化粗制产物。将粗制产物溶解在含有0.1％ HCl的10％(v/v)ACN中、施加至柱并且通过将B的比例以10％的增量从10％增加至60％来洗脱。将合适的级分收集、合并，并且冻干以得到作为深蓝色固体的Cy5.5-NH-(CH2)6-NH2(1.33g，收率：51％，纯度：99％)。通过质子NMR(甲醇-d4)和ESI质谱来确认产物(m/z：681.45[M+])。
实施例5：γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)的制备
游离酸形式的γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)通过将γ-PGA的钠盐的溶液酸化并且使用正丙醇来辅助沉淀游离酸来制备。
将Mw～32kDa的γ-PGA-Na+(100g)溶解在水(200mL)中并且通过在LT 10℃下添加6N HCl(～65mL)将溶液酸化至约pH 3。将酸化的溶液经5分钟添加至99.5％ EtOH/正丙醇(1:3v/v)溶液(1200mL)中，然后搅拌10分钟，得到白色粘稠沉淀物。将溶液倒出，留下油状沉淀物。添加水(200mL)以溶解沉淀物，并且将所得溶液分成两部分用于进一步后处理。将各部分通过使用6N HCl经约20-25分钟调整至～pH 2来酸化，同时将溶液保持在低于10℃。然后在室温下将各部分经5分钟添加至99.5％ EtOH(1600mL)中，以获得白色蓬松沉淀物。在过滤和干燥之后，获得作为白色固体的γ-PGA-H(61.0g)。γ-PGA-H可溶于DMSO和H2O。
实施例6：C010D-Zn的制备
聚合物缀合物C010D具有图1中示出的标称结构。
多肽聚合物γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)和分别具有吡啶硫酮部分、叶酸部分、cRGDfk部分和Cy5.5部分的四个侧链如实施例1-5所述来制备，并且如下用于制备C010D。将γ-PGA-H(0.76g，1当量)溶解在DMSO(50mL)中，并且添加EDC·HCl(74mg，23当量)和NHS(45mg，23当量)，并且将溶液在室温下搅拌45min。将各侧链与6当量DIPEA(相对于侧链)在DMSO(1mL)中组合。各侧链与γ-PGA-H的标称比例为：吡啶硫酮：5当量；叶酸：2当量；cRGDfk：2当量；Cy5.5：1当量。将具有各侧链的DMSO溶液添加至活化的γ-PGA-H中，并且将溶液搅拌21小时，同时通过HPLC监测侧链的消耗。完成后，将反应物溶解在水(200mL)中，用6N NaOH/6NHCl将pH从4.2调节至8.84，通过0.22μm PVDF膜过滤，然后通过使用Millipore 3cassette(0.11m2，5kD膜)的切向流过滤、然后是6次渗滤(每次添加2000mL H2O)来纯化(包括DMSO除去)，并且提供220mL的最终体积。通过再次过滤来除去杂质，并且将滤液冻干以得到作为蓝色固体的C010D聚合物缀合物(0.874g)。各侧链的引入程度通过质子NMR(D2O/DMSO-d6)来确定。每个γ-PGA聚合物，侧链吡啶硫酮:叶酸:cRGDfk:Cy5.5以3.96:1.84:1.71:1.09的比例存在。
通过将C010D(279mg，聚合物缀合物的测定量：71.65％)与七水合硫酸锌(88mg；每个聚合物缀合物0.1当量)在30mM HEPES(pH 7)水溶液(20mL)中混合来制备C010D-Zn。在该溶液中，锌离子与C010D的γ-PGA骨架之间的重量/重量比为1:10，并且除非另有说明，否则其原样用于一些以下的生物学试验的实施例中。
实施例7：C010DS-Zn的制备
聚合物缀合物C010DS具有图2中示出的标称结构。
多肽聚合物γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)和分别具有吡啶硫酮部分、叶酸部分、cRGDfk部分和Cy5.5部分的四个侧链如实施例1-5所述来制备，并且如下用于制备C010DS。将γ-PGA-H(0.76g，1当量)溶解在DMSO(50mL)中，并且添加EDC·HCl(113mg，35当量)和NHS(68mg，35当量)，并且将溶液在室温下搅拌45min。将各侧链与6当量DIPEA(相对于侧链)在DMSO(1mL)中组合。各侧链与γ-PGA-H的标称比例为：吡啶硫酮：10当量；叶酸：2当量；cRGDfk：2当量；Cy5.5：1当量。将具有各侧链的DMSO溶液添加至活化的γ-PGA-H中，并且将溶液搅拌21小时，同时通过HPLC监测侧链的消耗。完成后，使用与实施例6中所述相同的过程对反应进行后处理和纯化以得到作为蓝色固体的C010DS聚合物缀合物(0.9g)。各侧链的引入程度通过质子NMR(D2O/DMSO-d6)来确定。每个γ-PGA聚合物，侧链吡啶硫酮:叶酸:cRGDfk:Cy5.5以7.94:1.82:1.70:0.96的比例存在。
通过将C010DS(309mg，聚合物缀合物的测定量：64.77％)与七水合硫酸锌(88mg；每个聚合物缀合物0.1当量)在30mM HEPES(pH 7)水溶液(20mL)中混合来制备C010DS-Zn。在该溶液中，锌离子与C010D的γ-PGA骨架之间的重量/重量比为1:10，并且除非另有说明，否则其原样用于一些以下的生物学试验的实施例中。
实施例8：010DS(P50)-Zn的制备
聚合物缀合物010DS(P50)具有图3中示出的标称结构。
多肽聚合物γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)和分别具有吡啶硫酮部分、叶酸部分和cRGDfk部分的三个侧链如实施例1-3和5所述来制备，并且如下用于制备010DS。将γ-PGA-H(37.1g，1当量)溶解在DMSO(2250mL)中，并且添加DIC(6.77g，65当量)、NHS(6.17g，65当量)和NaOH(2.14g，65当量)，并且将溶液在N2下、在室温下搅拌60min。将各侧链溶解在DMSO(45mL)中。各侧链与γ-PGA-H的标称比例为：吡啶硫酮：25当量；叶酸：2当量；cRGDfk：2当量。将具有各侧链的DMSO溶液添加至活化的γ-PGA-H中，并且将溶液搅拌17.5小时，同时通过HPLC监测侧链的消耗。此后，进行添加额外25当量吡啶硫酮侧链的第二阶段。在18小时，向该反应混合物中添加DIC(7.8g，相对于γ-PGA-H 75当量)，在20小时，添加在45mL DMSO中的吡啶硫酮侧链(25当量)，并且在20.5小时，添加NaOH(181mg，5.5当量)。在23小时，添加另外的NaOH(181mg，5.5当量)，并且在24小时，添加NHS(7.12g，75当量)。截至24.4小时，吡啶硫酮侧链仍未反应，但是此后反应开始。在46小时，添加额外的NaOH(350mg，10.6当量)，并且在47.5小时，吡啶硫酮侧链缀合反应进行了37％。在112.5小时之后，侧链缀合反应进行了97％，并且使反应停止。此后，将反应溶液添加至9280mL水中，通过添加6N NaOH将pH调节至7.0。将溶液使用与实施例6中所述相同的过程来纯化，适当地缩放规模，并且最后冻干以得到作为黄色固体的010DS聚合物缀合物(46.6g)。各侧链的引入程度通过质子NMR(D2O/DMSO-d6)来确定。每个γ-PGA聚合物，侧链吡啶硫酮:叶酸:cRGDfk以47.10:1.58:1.91的比例存在。分子量(Mw)测定为40,085。此外，MP为39,698，Mn为25,872，Mz为62,852，并且多分散性指数为1.55。
通过将010DS(P50)(36.7g，聚合物缀合物的测定量：68.13％)与七水合硫酸锌(11g；每个聚合物缀合物0.1当量)在水(184mL)中混合来制备010DS(P50)-Zn。将该溶液冻干以得到作为黄色固体的010DS(P50)-Zn(40.1g)。锌离子与010DS(P50)的γ-PGA骨架之间的重量/重量比为1:10。
实施例9：C005D-Zn(对照)的制备
聚合物缀合物C005D具有图4中示出的标称结构。
多肽聚合物γ-聚谷氨酸(γ-PGA-H)和分别具有叶酸部分、cRGDfk部分和Cy5.5部分的三个侧链如实施例1-2和4-5所述来制备，并且如下用于制备C005D。将γ-PGA-H(50g，1当量)溶解在DMSO(350mL)中，并且添加EDC·HCl(3.2g，15当量)和NHS(1.92g，15当量)，并且将溶液在室温下搅拌60min。将各侧链与6当量DIPEA(相对于侧链)在DMSO(50mL)中组合。各侧链与γ-PGA-H的标称比例为：叶酸：3当量；cRGDfk：3当量；Cy5.5：1当量。将具有各侧链的DMSO溶液添加至活化的γ-PGA-H中，并且将溶液搅拌30小时，同时通过HPLC监测侧链的消耗。完成后，将水(100mL)添加至DMSO反应中，并且将所有溶剂通过冻干来除去，以得到粗制产物C005D(130.34g)，使用与实施例6中所述相同的过程进行后处理和纯化以得到作为蓝色固体的C010DS聚合物缀合物(42.56g)。各侧链的引入程度通过质子NMR(D2O/DMSO-d6)来确定。每个γ-PGA聚合物，侧链叶酸:cRGDfk:Cy5.5以3.25:3.14:0.79的比例存在。
通过将C005D(10g，聚合物缀合物的测定量：79.1％)与七水合硫酸锌(3.48g；每个聚合物缀合物0.1当量)的水溶液(通过0.22μm PVDF过滤器预过滤)在水(15mL)中混合来制备C005D-Zn。使用1N NaOH(3mL)和6NHCl(350μL)将溶液的pH调节至6.37。通过冻干来除去溶液，以提供作为蓝色固体的C005D(11.89g)。
将该固体溶解在30mM HEPES(pH 7)水溶液中，用于一些以下的生物学试验的实施例中作为相对于根据主题发明的有治疗活性的金属离子聚合物缀合物组合物的一些实施方案的对照。在该溶液中，除非另有说明，否则锌离子与C005D的γ-PGA骨架之间的重量/重量比为1:10。
B.聚合物缀合物-金属离子复合物的生物学试验
实施例10：体外细胞毒性试验
测试了C010DS-Zn(根据实施例7制备)和包括硫酸锌、7Zn2+对1Pyr摩尔比(7Zn-1Pyr)的硫酸锌-Pyr钠混合物(以匹配C010DS-Zn负载)和C005D-Zn(具有相同结构和锌含量、没有Pyr侧链修饰的阳性对照化合物)(根据实施例9制备)的相关对照组的体外细胞毒性。
测试了各化合物对4T1鼠三阴性乳腺癌细胞系的24h体外细胞毒性，使用乳酸脱氢酶释放测定(LDH测定)获得它们的IC5024h值，其以锌浓度(μM Zn)单位表示用于比较观察。相对于硫酸锌(80.7μM Zn)或C005D-Zn(268.7μMZn)，C010DS-Zn以16.35μM Zn的IC5024h显示明显更高的效力。7Zn-1Pyr在测试的浓度范围(12.1μM Zn-300μM Zn)内未显示细胞毒性反应(图5A)。
进行使用膜联蛋白V(A5)和碘化丙啶(PI)标记物的流式细胞术分析以比较在3h处理之后在IC5024h定义的浓度梯度附近(图5C)或随时间推移在超过IC5024h的过高浓度处(图5B)观察到的细胞毒性作用的体外细胞凋亡性/坏死性细胞死亡特征。将7Zn-1Pyr从试验中排除，这是因为其IC5024h值由于其缺乏细胞毒性而无法得到。时间分辨研究处理显示C010DS-Zn(50μM Zn)组和硫酸锌(450μM Zn)组在处理后1.5h主要诱导PI+A5+和少量仅PI+坏死性细胞死亡，而C005D-Zn(600μM Zn)在处理后3h显示相似的坏死性死亡。在任意试验组或在任何时间点均未观察到仅A5+细胞凋亡性死亡响应。3h处理后的浓度分辨研究显示C010DS-Zn、C005D-Zn和硫酸锌以浓度依赖性方式分别诱导高达77％、62％、26％仅PI+获PI+A5+坏死性细胞死亡，而没有仅A5+细胞凋亡性细胞死亡的显著增加。此外，发现PI+A5+相对于仅PI+坏死的比例在C010DS-Zn组中最高(57％vs 30％)并且在硫酸锌组中最低(4％vs18％)。这些细胞毒性试验共同证明，对于4T1细胞，对于给定的锌含量，C010DS-Zn为PI+A5+坏死性细胞死亡最强效且高效的诱导剂。
实施例11：体外作用模式试验
除了特征在于同时摄取PI和A5的细胞毒性以外，Fatokun等人先前将AIF的PARP依赖性核易位和随后产生的大量DNA断裂定义为依赖性细胞死亡的标志特征(Parthanatos:mitochondrial-linked mechanisms and therapeutic opportunities.British journalof pharmacology 171,2000-2016(2014))。为了研究观察到的由锌化合物导致的PI+A5+坏死性4T1细胞死亡(图5B和图5C)是否伴有这些特征，发明人在1.5h处理之后进行共聚焦显微镜研究，用于在与强效的PARP1和PARP2抑制剂PJ34共同温育之后使用抗-AIF、TUNEL和Hoechst 33342(Hoechst)DNA染色剂的荧光探针来评估PARP依赖性细胞毒性、核AIF易位和DNA断裂的发生。然而，无法将PAR-聚合物含量的评估纳入该实验中，这是由于在该研究期间无法获得足够灵敏的用于PAR-聚合物的荧光探针。此外，无法将任何更长的处理时间应用于该实验，这是由于在C010DS-Zn处理组中观察到的广泛的细胞毒性变化。
在1.5h处理之后，硫酸锌处理和C005D-Zn处理在测试的所有浓度均未引起明显的细胞脱离，尽管较高浓度处理中的细胞形态显示出细胞毒性变化。然而，C010DS-Zn处理在60μM Zn处理组中导致细胞完全丧失并且即使在15μM Zn处理组中也导致广泛的细胞脱离。与0.5μM PJ34(选择性PARP1和PARP2抑制剂)共同处理显著地减弱C010DS-Zn 15μM Zn组中的细胞脱离，但是在60μM Zn处理组中未显示保护作用(图6B)。
随后对分别表示核AIF易位的程度和所检测的细胞核中产生的DNA损伤的平均核AIF信号和TUNEL信号的定量成像分析显示，C010DS-Zn在15μMZn下引起显著的核AIF易位和大量DNA损伤诱导，这由PJ34共同处理来消除。在C005D-Zn处理组中观察到相似但显著较低的趋势。另一方面，硫酸锌处理无法引起显著更高的核AIF易位或DNA损伤。
在对C010DS-Zn的细胞毒性中观察到的PARP酶参与的进一步验证中，发明人使用商用ELISA试剂盒进行PAR-聚合物定量，并且观察到24hC010DS-Zn处理确实产生了PAR-聚合物的剂量依赖性积聚，表明体外处理的4T1细胞中PARP酶活性过度(图5D)。
由于这些观察结果与由Fatokun等人规定的依赖性细胞死亡的细胞死亡特征一致，因此C010DS-Zn被共同证明为超过硫酸锌、C005D-Zn或测试的其它对照物质的明显更强的依赖性细胞死亡诱导剂。
实施例12：针对源自患者的实体瘤的离体筛选
为了确定C010DS-Zn药理活性对更广泛的实体癌症类型的适用性和一致性，发明人使用来自Champions Oncology/Phenovista的源自患者的异种移植物(PDX)的肿瘤碎片，采用基于成像的离体细胞毒性筛选服务平台。选择来自8种癌症类型的53种PDX模型，所述癌症类型包括三阴性乳腺癌(BrC-TNBC)、非三阴性乳腺癌(BrC-非TNBC)、结直肠癌(CRC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌(OVC)、胰腺癌(Panc)、前列腺癌(PrC)和肉瘤。C010DS-Zn对测试的全部53种模型表现出细胞毒性，IC50值在0.07μg Zn/mL至1.91μg Zn/mL的范围内，其中卵巢癌显示统计学上不显著但是比其它癌症类型更高的平均IC50值(图7A)。也没有发现C010DS-Zn IC50值与各模型的肿瘤突变负荷(TMB)或微卫星不稳定性(MSI)评分之间的统计学上显著的相关性，表明C010DS-Zn细胞毒性不取决于目标模型的先天突变负荷(图7B)，尽管传统观点认为DNA损伤介导的PARP活化是依赖性细胞死亡诱导中的第一个关键步骤(参见上文，Fatukun等人)。
诱导细胞凋亡的10％ DMSO阳性对照处理组和最高剂量C010DS-Zn处理组之间的肿瘤碎片中的γH2AX水平(双链DNA(dsDNA)断裂的指标)的比较评估显示，即使在具有测得的最高IC50值的模型中，与细胞凋亡阳性对照相比，C010DS-Zn诱导明显更多的dsDNA断裂(图7C)。在测试的53种离体PDX模型中的50种中进一步观察到这种由C010DS-Zn处理导致的dsDNA断裂的特征性大量诱导(相对于10％ DMSO阳性对照处理)，表明在多种实体癌症类型中在药理作用方面的高度一致性(图8)。
实施例13：对C010DS-Zn治疗的体内治疗响应
接下来，发明人测试了静脉内(i.v.)给药的C010DS-Zn对免疫原性同基因癌症模型CT26-Balb/c和免疫抑制同基因癌症模型4T1-Balb/c的体内治疗效果。简言之，CT26为广泛使用的免疫原性小鼠结直肠癌模型并且为抗-PD1治疗的响应者。另一方面，4T1为广泛使用的免疫抑制三阴性乳腺癌模型，其对抗-PD1治疗无响应(Kim,K.,等人，Eradication ofmetastatic mouse cancers resistant to immune checkpoint blockade bysuppression of myeloid-derived cells.Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.111,11774-11779(2014))。
在针对4T1-Balb/c模型的初步试错尝试之后，发明人发现，需要各注射剂量为2mgZn/Kg的C010DS-Zn的每天两次静脉内给药以产生可观察到的治疗功效。在未经治疗的动物中，在试点研究期间经常遇到50％+肿瘤表面溃疡问题，但是在最终研究期间没有观察到满足一般毒性定义(General Toxicity definitions)(参见下文)的毒性迹象(图9A)。虽然由于溶媒对照组(30mM HEPES，pH 7)中快速的肿瘤溃疡发展而导致直接比较肿瘤生长速率是困难的，但是终点肿瘤微环境(TME)免疫细胞分析揭示每天两次注射2mg Zn/Kg C010DS-Zn导致CD4 T细胞、CD 8T细胞、颗粒酶B+树突状细胞(GB+DC)和巨噬细胞中显著的免疫区室扩张。特别是在巨噬细胞区室中，使抗肿瘤M1样巨噬细胞的比例显著地升高(25％，相对于对照组的7％，p<0.05)，而促肿瘤M2样巨噬细胞的比例受到抑制(18％，相对于对照组的35％，p<0.005)(图9A)。C010DS-Zn以较少的量或频率给药(包括每天一次以1mg Zn/Kg静脉内注射)没有产生此类结果。C010DS-Zn治疗被良好地耐受，并且动物体重保持稳定。
针对CT26-Balb/c模型的C010DS-Zn静脉内治疗在肿瘤生长中和在终点TME免疫细胞分析中均产生更明显且剂量依赖性的响应。在研究期间未观察到满足一般毒性定义的毒性迹象(图9B)。虽然CT26-Balb/c模型在每天一次和每天两次的注射方案中均显示肿瘤生长降低，但是，与4T1-Balb/c模型不同，显著的免疫应答引发作用限于CD8 T细胞区室(图9B)。C010DS-Zn治疗被良好地耐受，并且动物体重保持稳定。
有趣的是，当在4T1-Balb/c对照模型和CT26-Balb/c对照模型之间比较终点肿瘤免疫特征时，发明人观察到，相对于CT26模型，T细胞水平(在4T1中为1E+3个，相对于在CT26中为9E+3个)、CD11b+髓样细胞水平(在4T1中为1E+4个，相对于在CT26中为4E+4个)和M1巨噬细胞水平(在4T1中为5％的CD11b+细胞，相对于在CT26中为11％的CD11b+细胞)在4T1模型中明显受到抑制。另一方面，4T1和CT26的每天两次C010DS-Zn处理组之间的相同的比较显示两种肿瘤模型免疫组成在T细胞(在4T1中为8E+3个，相对于在CT26中为2E+4个)和CD11b+细胞(在4T1中为4E+4个，相对于在CT26中为5E+4个)之间较窄的差距。4T1模型和CT26模型中的治疗后M2样巨噬细胞水平是相似的，为18％和15％。这些观察结果共同表明，每天两次C010DS-Zn治疗的抗肿瘤免疫引发作用在4T1-Balb/c模型和CT26-Balb/c模型的肿瘤抑制免疫区室中更明显。
一般毒性。从第0天开始，每天观察动物并且使用电子秤每周称重三次；对各组记录包括个体克重和平均克重的数据、相对于第0天的平均重量变化百分比(％vD0)并且在研究完成时标绘％vD0。为与第0天相比表现出≥10％体重减轻的动物(如果有的话)自由地提供DietGelTM(Westbrook，ME)。记录动物死亡(如果有的话)。对于所评价的方案，认为报告平均减轻为％vD0>20和/或>10％死亡率的组高于该治疗的最大耐受剂量(MTD)。其它研究毒性终点为发现小鼠濒死或在持续7天的时间段表现出>20％净重减轻或者如果小鼠表现出>30％净重减轻。在研究完成时报告各处理组的最大平均％vD0(体重最低点)。
实施例14：低剂量的C010DS-Zn的巨噬细胞清除作用
发明人的观察结果(需要每天两次使用C010DS-Zn的静脉内治疗以在4T1-Balb/c模型中产生抗肿瘤免疫应答引发)促使发明人测试静脉内注射的C010DS-Zn的药代动力学特征(图10A)。在非荷瘤Sprague-Dawley大鼠中单次静脉内推注C010DS-Zn之后大鼠体内的PK特征的评价揭示，在血液的不含细胞的血浆区室中仅发现一部分由C010DS-Zn注射的锌，Tmax为2h，表明注射的C010DS-Zn被单核吞噬细胞系统(MPS)快速全身清除(Song,G.等人，Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system:pharmacokinetics andapplications for inflammatory diseases.Curr.Rheumatol.Rev.10,22-34(2014))。由于MPS主要由肝巨噬细胞和脾巨噬细胞构成，因此该观察结果表明C010DS-Zn对巨噬细胞可能有直接的细胞毒性相互作用。
为了评估C010DS-Zn是否能够直接减少TME中的活巨噬细胞，发明人决定在不会产生抗肿瘤活性或免疫引发作用的较低剂量下测试其对活TME巨噬细胞群的作用。并且，由于4T1癌症模型据报道经历了从早期的免疫抑制状态到晚期的促进转移的M2样巨噬细胞富集状态的TME免疫转变，因此，发明人决定在治疗后13天和治疗后16天表征TME免疫。(Steenbrugge,J.,等人，Anti-inflammatory signaling by mammary tumor cellsmediates prometastatic macrophage polarization in an innovative intraductalmouse model for triple-negative breast cancer.J.Exp.Clin.Cancer Res.37,191(2018)；Yang,Y.等人，Celastrol inhibits cancer metastasis by suppressing M2-like polarization of macrophages.Biochem.Biophys.Res.Comm.503,414-419(2018).)与先前的报道一致，在第13天收集的4T1肿瘤的特征在于M1样类型和M2样类型二者的T细胞含量和巨噬细胞含量均受到大幅抑制。在这些动物中，在研究期间未观察到满足一般毒性定义的毒性迹象(参见实施例13)(图10B)。相反，在第16天收获的那些包含大幅增加的量的巨噬细胞(在13天肿瘤中为1E+2个，相对于在16天肿瘤中为1.3E+5个)，这主要是由于M2样巨噬细胞群的扩增、连同表明存在活动性炎症的大幅扩增的T细胞含量(图10B和图10C)。很多16天处死的动物直至研究结束发生50％+肿瘤表面溃疡，并且因此在第16天之前被申报为濒死。当用降低的C010DS-Zn剂量各自以每天一次静脉内注射2mg Zn/Kg或每天两次注射1mg Zn/Kg来治疗时，在13天治疗小鼠和16天治疗小鼠二者中该治疗均导致TME中显著降低的巨噬细胞含量。值得注意的是，在16天治疗组中，每天一剂2mg Zn/Kg导致M2样巨噬细胞的优先减少，而每天两剂各1mg Zn/Kg导致M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞二者的明显减少。16天小鼠的两个C010DS-Zn治疗组也显示TME中明显降低的T细胞含量水平，表明炎症减轻(图10C)。
在前述公开内容中，除非另有说明或上下文需要，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”包括复数指示物。因此，除非这些术语的完整范围会被上下文排除，否则这些冠词可以意指“一个/一种”、“一个/一种以上”或“一个/一种或多于一个/一种”。在通过术语“或”引入替代物的情况下，除非替代物是相互排斥的选项，否则应当将术语“或”理解为包括含义“和/或”。尽管术语“和/或”可以用于本公开，但是这样做是为了强调并且不意味着应当将“或”仅理解为反意连词(disjunctive)。
虽然针对特定的实施方案和实施例在本文中公开了本发明，但是本发明在不偏离其精神或必要特征的情况下可以以其它特定形式来实施。因此，说明书和附图应当视为说明性的并且不应当解释为限制本发明。本发明的范围由权利要求确定，并且在权利要求之内的所有适当的修改和等同物均包含在其中。

Claims (14)

1.一种聚合物缀合物或者其盐或溶剂化物，所述聚合物缀合物包含：
包含聚谷氨酸的聚合物骨架，其包含通过肽键连接的谷氨酸单体单元；
多个第一受体靶向部分，其各自经由第一连接体部分共价键合至所述聚合物骨架中的单体单元并且从所述单体单元悬垂；
多个离子载体，其各自经由可裂解的连接体部分共价键合至所述聚合物骨架中的单体单元并且从所述单体单元悬垂。
2.根据权利要求1所述的聚合物缀合物，其进一步包含：
多个第二受体靶向部分，其各自经由第二连接体部分共价键合至所述聚合物骨架中的单体单元并且从所述单体单元悬垂。
3.根据权利要求1或2所述的聚合物缀合物，其进一步包含：
多个标签部分，其各自经由标签-连接体部分共价键合至所述聚合物骨架中的单体单元并且从所述单体单元悬垂。
4.根据权利要求1、2或3所述的聚合物缀合物，其中所述盐为其锌(II)复合物。
5.根据权利要求4所述的聚合物缀合物，其中锌(II)与所述聚合物缀合物的重量比在1:5至1:20的范围内。
6.根据权利要求4所述的聚合物缀合物，其中每个聚合物缀合物的锌(II)离子数平均为至少20。
7.根据式IV、V或VI的聚合物缀合物或其金属离子复合物：
其中：
R1为H；
R2为OH或OM或LA-T1或LB-T2或LQ-Q；
LA为键或具有键合至所述聚合物的第一末端位点和键合至T1的第二末端位点的双官能连接基团，其中所述第一末端位点和所述第二末端位点通过3至20个原子的链连接；
LB为键或具有键合至所述聚合物的第一末端位点和键合至T2的第二末端位点的双官能连接基团，其中所述第一末端位点和所述第二末端位点通过3至20个原子的链连接；
LQ为具有键合至所述聚合物的第一末端位点和键合至Q的可裂解的末端位点的双官能连接基团，其中所述第一末端位点和所述可裂解的末端位点通过3至20个原子的链连接；
当存在时，LZ为键或具有键合至所述聚合物的第一末端位点和键合至Z的第二末端位点的双官能连接基团，其中所述第一末端位点和所述第二末端位点通过3至20个原子的链连接；
T1为第一靶向部分；
T2为第二靶向部分；
Q为离子载体部分；
当存在时，Z为荧光团部分；
M的各实例独立地为H、质子、碱离子、药学上可接受的一价阳离子、或不存在；
a和b为零或至多约5的有限数，但是a和b不均为零；
c为在约3至约50的范围内的有限数；
当存在时，d为约1；和
m为在约50至约700的范围内的有限数。
8.一种药物组合物，其包含根据权利要求7所述的聚合物缀合物和药学上可接受的稀释剂、载体、缓冲剂、溶媒、或其任意组合。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中将所述药物组合物配制用于肠胃外给药。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合物为所述聚合物缀合物的锌(II)复合物。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中锌(II)与所述聚合物缀合物的重量比在1:5至1:20的范围内。
12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中每个聚合物缀合物的锌(II)离子数平均为至少20。
13.一种用于治疗患者中的肿瘤的方法，其包括对所述患者给予治疗有效量的根据权利要求8至12中任一项所述的药物组合物。
14.一种在患者的肿瘤中诱导依赖性细胞死亡的方法，所述方法包括对所述患者给予治疗有效量的根据权利要求8至12中任一项所述的药物组合物。
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