JP2015533132A

JP2015533132A - 眼状態を処置するためのｖｅｇｆ中和プロドラッグ

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Publication number: JP2015533132A
Application number: JP2015536101A
Authority: JP
Inventors: ラウ，ハラルト; クナッペ，トーマス; ラウファー，ブルクハルト; ライマン，ロミー; ヴァイスブロット，ザームエル; スプローエ，ケネット; ビセク，ニコラ; シュタルク，セバスティアン; フォイクト，トビアス
Original assignee: アセンディスファーマオフサルモロジーディヴィジョンエー／エス
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-11-19
Also published as: HK1209374A1; AU2013328782C1; MX2015003970A; KR102235868B1; EP2906246B1; ES2959385T3; HK1208814A1; CA2884910A1; NZ706853A; MY177912A; RU2015117536A; KR20150065891A; ZA201502410B; CA2884910C; BR112015007778B1; BR112015007778A2; AU2013328782B2; MX370543B; SG11201501914XA; RU2673881C2

Abstract

本発明は、1つ以上の眼状態を処置する方法において使用するための、1種以上の薬学的に許容される賦形剤及びVEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物であって、このプロドラッグが、VEGF中和生物活性部分を含む、医薬組成物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、1つ以上の眼状態（ocular condition）を処置する方法において使用するための医薬組成物に関する。

失明する主な原因は、ある種の眼疾患を十分に処置できないことにある。主な制約は、眼の中に薬物又は治療剤を導入し、必要な期間、これらの薬物又は治療剤を治療上有効な濃度で眼中に維持する好適な選択肢がないことである。全身投与は、多くの場合、有効な眼内濃度を実現するために、許容しがたい薬物の副作用の出現率向上を伴う、許容しがたい高レベルの全身投与を必要とするので、理想的な解決策にはなり得ない。単回の点眼法又は眼適用は、涙作用により薬物が速やかに洗い流される恐れがあること、又は眼内から体循環へと消費されるので、多くの場合、許容される代替法とはならない。局所性の点眼薬治療は、不十分な吸収、数日から数年の期間をかけた頻繁且つ/又は慢性的な投与の必要性、房水の迅速な代謝回転、治療が完了するか又は適切な用量が送達されるよりもずっと前に治療剤が効果的に排除される恐れがある涙液膜及び他の原因物(cause)の生成及び移動により制約を受ける。

眼内注射は、局所送達などの他の送達機構に比べて、眼の標的位置(例えば、網膜)への生体利用率の向上を実現することができるという点で有利である。しかし、眼内注射は欠点も有しており、様々な異なる合併症を示す恐れがある。例えば、硝子体内注射は、特に治療剤が比較的、可溶性である場合、治療剤を望ましくない程高い濃度で、標的位置又は他の位置に送達する恐れがある。さらに、眼内注射は、患者にとってかなり不快である。さらに、眼内注射自体は、眼内炎及び網膜剥離などの合併症を引き起こす恐れがあるので、治療レベルの薬物を眼内に維持しながら、各注射間の期間をできる限り長く持たせることが非常に望ましい。

上記に加え、硝子体内注射により送達される治療剤は、注射後に、薬剤が眼内に速やかに分散し得るので、作用持続期間が不足し得る。こうした持続期間の欠如は、注射回数をより多くする必要があり得るので、特に望ましくない。ラニビズマブ及びペガプタニブは、例えば、それぞれ4週間及び6週間ごとに、眼内注射によって患者に投与され、患者にとって非常に不快な経験となる。

したがって、より持続性の高い製剤により、眼科学分野は恩恵を受けると思われる、という認識が広がっている。それらの製剤は、処方治療用医薬レジメンに対する患者コンプライアンスに関連する問題を最小限にしながら、眼への治療剤の持続送達を実現することにより、患者のケア及び眼健康に恩恵をもたらすと思われる。

脈管形成及び血管形成を刺激する細胞によって産生されるシグナルタンパク質である血管内皮増殖因子(VEGF)の発現は、黄斑変性及び網膜症のある種の形態における場合などの、様々な眼状態における重要な役割を果たしている。

ラニビズマブ、アフリベルセプト及びペガプタニブなど、そのような眼状態を処置するための様々な医薬が上市されている。患者への適用は、4週間及び8週間ごとに、眼内注射によって行われる。

上記を鑑みると、これらの欠点を少なくとも一部克服する、投与形態を実現する必要性がある。

本目的は、1つ以上の眼状態を処置する方法において使用するための、1種以上の薬学的に許容される賦形剤及びVEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物であって、このプロドラッグが、共有結合により結合されているVEGF中和生物活性部分を含む、医薬組成物により達成される。

本発明内において、用語は、以下の意味で使用される。

本明細書で使用する場合、用語「VEGF中和薬物」とは、血管内皮増殖因子(VEGF)の作用を中和することにより、医薬効果を示す薬物を意味する。VEGFの作用は、VEGF受容体に結合する薬物、又はVEGF自体に結合する薬物により中和することができ、こうしてVEGFがその受容体に効果的に結合するのを遮断又は低減する。或いは、この中和作用は、VEGFの発現及び産生を阻害若しくは妨害することにより、又はVEGFシグナル伝達を妨害することにより得ることができる。

本明細書で使用する場合、用語「ヒドロゲル」とは、ホモポリマー又はコポリマーからなる親水性又は両親媒性ポリマーネットワークを意味し、共有結合性の化学架橋の存在により不溶性である。この架橋により、ネットワーク構造及び物理的な一体性(integrity)が実現される。ヒドロゲルは、水性媒体中で膨潤することが可能な、水との熱力学的適合性を示す。

本明細書で使用する場合、用語「試薬」とは、別の官能基と反応する官能基を備えた化学化合物を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「骨格鎖試薬(backbone reagent)」とは、ヒドロゲルを形成する出発原料として好適な試薬を意味する。本明細書で使用する場合、骨格鎖試薬は、好ましくは、生分解性結合を含んでいない。

本明細書で使用する場合、用語「架橋試薬」とは、骨格鎖試薬を架橋する出発原料として好適な直鎖状又は分岐状試薬を意味する。好ましくは、架橋試薬は、直鎖状の化学化合物である。架橋試薬は、本明細書で使用する場合、少なくとも1つの生分解性結合を含む。

本明細書で使用する場合、用語「部分」とは、対応する試薬と比較すると、1個以上の原子がない分子の一部を意味する。例えば、式「H-X-H」の試薬が、別の試薬と反応して、反応生成物の一部になる場合、この反応生成物の対応する部分は、構造「H-X-」又は「-X-」を有しており、この場合、各「-」は、別の部分に結合していることを示している。

したがって、「結合形態の」という言い回しは、試薬の対応する部分を指すために使用され、すなわち「結合形態のリシン」とは、リシン試薬の1個以上の原子がなく、分子の一部となっている、リシン部分のことを指す。

本明細書で使用する場合、用語「官能基」とは、他の官能基と反応することができる原子群を意味する。官能基には、以下の基に限定されないが、カルボン酸(-(C=O)OH)、又はカルボン酸エステル若しくは酸ハロゲン化物のようなその活性化形態、一級又は二級アミン(-NH₂、-NH-)、マレイミド、チオール(-SH)、スルホン酸(-(O=S=O)OH)、カーボネート、カーバメート(-O(C=O)N<)、ヒドロキシ(-OH)、アルデヒド(-(C=O)H)、ケトン(-(C=O)-)、ヒドラジン(>N-N<)、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸(-O(P=O)OHOH)、ホスホン酸(-O(P=O)OHH)、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、アクリロイル、フッ化アリール、ヒドロキシルアミン、ジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、オキシラン、及びアジリジンが含まれる。

官能基が、別の官能基に結合している場合、得られた構造は、「連結」と呼ばれる。例えば、アミン基とカルボキシル基との反応は、アミド連結となる。

本明細書で使用する場合、用語「活性化官能基」とは、活性基に結合している官能基を意味する。好ましい活性化官能基には、以下に限定されないが、活性化エステル基、活性化カーバメート基、活性化カーボネート基、及びチオカーボネート基が含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「キャッピング基」とは、不可逆性すなわち永久に官能基に結合して、他の試薬又は部分の官能基との反応ができないようになされている部分を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「ポリマー」とは、繰り返し構造単位を含む分子、すなわち直鎖状、環状、分岐状、架橋状、若しくはデンドリマー状、又はそれらを組み合わせた化学結合によって結合しているモノマーを意味し、合成由来若しくは生物由来、又はそれらの両方の組合せであってもよい。ポリマーは、例えば、官能基又はキャッピング部分も含み得ることが理解される。好ましくは、ポリマーは、少なくとも0.5kDaの分子量、例えば少なくとも1kDaの分子量、少なくとも2kDaの分子量、少なくとも3kDaの分子量、又は少なくとも5kDaの分子量を有する。

本明細書で使用する場合、用語「ポリマー状の」とは、1つ以上のポリマーを含む試薬又は部分を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「数平均分子量」とは、個々のポリマーの分子量の通例の算術的な平均を意味する。当業者は、重合反応から得られた重合生成物は、必ずしもすべて同じ分子量を有しているわけではないが、分子量分布を示すことを理解している。したがって、本明細書で使用されるポリマーにおける、分子量範囲、分子量、ポリマー中のモノマー数の範囲、及びモノマーの数とは、数平均分子量及びモノマーの数平均を指す。

本明細書で使用する場合、用語「重合」とは、化学反応中のモノマー又はマクロモノマー試薬が反応して、ヒドロゲルを含む(これには限定されない)ポリマー鎖又はネットワークを形成する過程を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「マクロモノマー」とは、モノマー試薬の重合から得られた分子を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「縮合重合」又は「縮合反応」とは、2つの試薬の官能基が反応して、単一分子である反応生成物が形成され、低分子量分子、例えば水が放出される、化学反応を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「懸濁重合」とは、モノマー試薬が溶媒A中で溶解して、溶媒B中で乳化している分散相を形成して、連続相を形成する、不均一及び/又は二相重合反応を意味する。本発明では、モノマー試薬は、骨格鎖試薬及び架橋試薬である。溶媒Aとモノマー試薬の両方が、溶媒Bに可溶ではない。こうしたエマルションは、撹拌、振とう、超音波暴露、又はMicrosieve(商標)乳化により、より好ましくは撹拌又はMicrosieve(商標)乳化により、より好ましくは撹拌により形成される。このエマルションは、適切な乳化剤により安定化する。重合は、溶媒Aに可溶な開始剤を追加することによって開始される。適切な一般に公知の開始剤は、テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)などの三級塩基とすることができる。

本明細書で使用する場合、用語「不活性な」とは、化学的な反応性を示さない部分を指し、すなわち他の部分又は試薬と反応しないものである。当業者は、用語「不活性な」とは、それ自体が官能基の存在を排除するものではないことを理解するが、不活性部分中に潜在的に存在している官能基は、例えば後の反応において、不活性部分と接触する部分/試薬の官能基とは反応性を示さないものと理解する。特に、不活性部分ZはA^x0若しくはA^x2と反応しないか、又は、例えば、本発明のヒドロゲル連結プロドラッグを得るための本発明のヒドロゲルに共有結合によりコンジュゲートされ得る、可逆性プロドラッグリンカー試薬、薬物、可逆性プロドラッグリンカー部分-生物活性部分コンジュゲート試薬、若しくはスペーサー試薬中に存在している官能基とは反応しない。

本明細書で使用する場合、用語「非混和性」とは、2種の物質が混合して均一な混合物を形成することができない、特性を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「ポリアミン」とは、2つ以上のアミン基(-NH-又は-NH₂)、例えば2〜64個のアミン基、4〜48個のアミン基、6〜32個のアミン基、8〜24個のアミン基、10〜16個のアミン基を含む、試薬又は部分を意味する。特に好ましいポリアミンは、2〜32個のアミン基を含む。

本明細書で使用する場合、部分又は試薬に関する、「少なくともX%のPEGを含む、PEGをベースとする」という用語は、前記部分又は試薬が、少なくともX%(w/w)のエチレングリコール単位(-CH₂CH₂O-)を含んでおり、この場合、エチレングリコール単位は、ブロックで、交互に配列し得るか、又は該部分若しくは試薬内にランダムに分布することができ、好ましくは前記部分又は試薬のエチレングリコール単位がすべて、1つのブロック中に存在しており、PEGをベースとする部分又は試薬の残りの重量百分率は、以下の置換基及び連結からとりわけ選択される他の部分であることを意味する。
・C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、C_2〜50アルキニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニル、並びに
・以下を含む基から選択される連結

(式中、
点線は、分子、部分、又は試薬の残部に結合していることを示しており、
R¹及びR^1aは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルから選択される)。

本明細書で使用する場合、用語「C_1〜4アルキル」とは、単独又は組み合わせて、1〜4個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。分子の末端に存在している場合、直鎖及び分岐C_1〜4アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、及びtert-ブチルである。一分子の2つの部分がC_1〜4アルキル基により連結されている場合、そのようなC_1〜4アルキル基に関する例は、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH(C₂H₅)-、-C(CH₃)₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-、及び-CH₂-CH₂-CH₂(CH₃)-である。C_1〜4アルキル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「C_1〜6アルキル」とは、単独又は組み合わせて、1〜6個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。分子の末端に存在している場合、直鎖及び分岐C_1〜6アルキル基の例は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、2-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、n-ヘキシル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、及び3,3-ジメチルプロピルである。一分子の2つの部分がC_1〜6アルキル基により連結されている場合、そのようなC_1〜6アルキル基に関する例は、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH(C₂H₅)-、及び-C(CH₃)₂-である。C_1〜6アルキル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。

同じように、本明細書で使用する場合、用語「C_1〜20アルキル」とは、単独又は組み合わせて、1〜20個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。用語「C_8〜18アルキル」とは、単独又は組み合わせて、8〜18個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。同じように、本明細書で使用する場合、用語「C_1〜50アルキル」とは、単独又は組み合わせて、1〜50個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。C_1〜20アルキル基、C_8〜18アルキル基、及びC_1〜50アルキル基の各水素原子は、置換基によって置きかえられていてもよい。各場合において、このアルキル基は、分子の末端に存在していてもよく、又は一分子の2つの部分が、このアルキル基により連結されていてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「C_2〜6アルケニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜6個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素部分を意味する。分子の末端に存在している場合、例は、-CH=CH₂、-CH=CH-CH₃、-CH₂-CH=CH₂、-CH=CHCH₂-CH₃、及び-CH=CH-CH=CH₂である。一分子の2つの部分がC_2〜6アルケニル基により連結されている場合、そのようなC_2〜6アルケニルに関する例は、-CH=CH-である。C_2〜6アルケニル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。場合により、1つ以上の三重結合が出現してもよい。

同じように、本明細書で使用する場合、用語「C_2〜20アルケニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜20個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。用語「C_2〜50アルケニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜50個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在している場合、例は、-CH=CH₂、-CH=CH-CH₃、-CH₂-CH=CH₂、-CH=CHCH₂-CH₃、及び-CH=CH-CH=CH₂である。一分子の2つの部分がアルケニル基によって連結されている場合、例は、例えば-CH=CH-である。C_2〜20アルケニル基又はC_2〜50アルケニル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。場合により、1つ以上の三重結合が出現してもよい。

本明細書で使用する場合、用語「C_2〜6アルキニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜6個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む、直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在している場合、例は、-C≡CH、-CH₂-C≡CH、CH₂-CH₂-C≡CH、及びCH₂-C≡C-CH₃である。一分子の2つの部分が、アルキニル基によって連結されている場合、例は、-C≡C-である。C_2〜6アルキニル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。場合により、1つ以上の二重結合が出現してもよい。

同じように、本明細書で使用する場合、用語「C_2〜20アルキニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜20個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味しており、「C_2〜50アルキニル」とは、単独又は組み合わせて、2〜50個の炭素原子を有する少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖又は分岐炭化水素残基を意味する。分子の末端に存在している場合、例は、-C≡CH、-CH₂-C≡CH、CH₂-CH₂-C≡CH、及びCH₂-C≡C-CH₃である。一分子の2つの部分が、アルキニル基によって連結されている場合、例は、-C≡C-である。C_2〜20アルキニル基又はC_2〜50アルキニル基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。場合により、1つ以上の二重結合が出現してもよい。

本明細書で使用する場合、用語「C_3〜7シクロアルキル」又は「C_3〜7シクロアルキル環」とは、3〜7個の炭素原子を有する環式アルキル鎖を意味しており、飽和又は不飽和であってもよく、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルである。シクロアルキル炭素の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。用語「C_3〜7シクロアルキル」又は「C_3〜7シクロアルキル環」はまた、ノルボルナン又はノルボルネンのような架橋二環も含む。同じように、「C_3〜5シクロアルキル」とは、3〜5個の炭素原子を有するシクロアルキルを意味し、C_3〜10シクロアルキルは、3〜10個の炭素原子を有する。

同じように、本明細書で使用する場合、用語「C_3〜10シクロアルキル」とは、3〜10個の炭素原子を有する炭素環式環系を意味し、飽和又は不飽和であってもよく、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルである。用語「C_3〜10シクロアルキル」はまた、少なくとも一部が飽和の炭素単環及び炭素二環も含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「ハロゲン」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードを意味する。特に好ましいのは、フルオロ又はクロロである。

本明細書で使用する場合、用語「4〜7員のヘテロシクリル」又は「4〜7員の複素環」とは、最大数までの二重結合を含有してもよい(完全に飽和、部分的に飽和又は不飽和の芳香族環又は非芳香族環)、4、5、6又は7個の環原子を有する環であって、少なくとも1個から最大4個の環原子が硫黄(-S(O)-、-S(O)₂-を含む)、酸素及び窒素(=N(O)-を含む)からなる群から選択されるヘテロ原子によって置きかえられており、且つこの環が炭素原子又は窒素原子を介して分子の残りに連結している環を意味する。4〜7員の複素環の例には、以下に限定されないが、アゼチジン、オキセタン、チエタン、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、チアゾール、チアゾリン、イソチアゾール、イソチアゾリン、チアジアゾール、チアジアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、スルホラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、イミダゾリジン、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、テトラゾール、トリアゾール、トリアゾリジン、テトラゾリジン、ジアゼパン、アゼピン及びホモピペラジンが含まれる。4〜7員のヘテロシクリル又は4〜7員の複素環式基の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。

本明細書で使用する場合、用語「8〜11員のヘテロビシクリル」又は「8〜11員の複素二環」とは、少なくとも1個の環原子が両方の環により共有され、最大数までの二重結合を含有してもよい(完全に飽和、部分的に飽和又は不飽和の芳香族環又は非芳香族環)、8〜11個の環原子を有する複素環式二環系であって、少なくとも1個から最大6個の環原子が硫黄(-S(O)-、-S(O)₂-を含む)、酸素及び窒素(=N(O)-を含む)からなる群から選択されるヘテロ原子によって置きかえられており、且つこの環が炭素原子又は窒素原子を介して分子の残りに連結している複素環式二環系を意味する。8〜11員の複素二環の例は、インドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾイミダゾリン、キノリン、キナゾリン、ジヒドロキナゾリン、キノリン、ジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、デカヒドロキノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロイソキノリン、ベンズアゼピン、プリン、及びプテリジンである。8〜11員の複素二環という用語には、1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカンのような2個の環のスピロ構造、又は8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタンのような架橋複素環も含まれる。8〜11員のヘテロビシクリル又は8〜11員の複素二環の各水素原子は、以下に定義されている置換基によって置きかえられていてもよい。

用語「置換されている」とは、分子の1つ以上の-H原子が、「置換基(単数)」又は「置換基(複数)」と呼ばれる、異なる原子又は原子群により置きかえられていることを意味する。適切な置換基は、ハロゲン、CN、COOR⁹、OR⁹、C(O)R⁹、C(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂N(R⁹R^9a)、S(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂R⁹、S(O)R⁹、N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b)、SR⁹、N(R⁹R^9a)、NO₂、OC(O)R⁹、N(R⁹)C(O)R^9a、N(R⁹)S(O)₂R^9a、N(R⁹)S(O)R^9a、N(R⁹)C(O)OR^9a、N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b)、OC(O)N(R⁹R^9a)、T、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルからなる群から選択され、T、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-、及び-OC(O)N(R¹¹R^11a)からなる群から選択される1つ以上の基によって場合により中断されており
式中、
R⁹、R^9a、R^9bは、H、T、及びC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルからなる群から独立して選択され、T、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-、及び-OC(O)N(R¹¹R^11a)からなる群から選択される1つ以上の基によって場合により中断されており、
Tは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、又は8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、この場合、Tは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、
R¹⁰は、ハロゲン、CN、オキソ(=O)、COOR¹²、OR¹²、C(O)R¹²、C(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂N(R¹²R^12a)、S(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂R¹²、S(O)R¹²、N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)、SR¹²、N(R¹²R^12a)、NO₂、OC(O)R¹²、N(R¹²)C(O)R^12a、N(R¹²)S(O)₂R^12a、N(R¹²)S(O)R^12a、N(R¹²)C(O)OR^12a、N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)、OC(O)N(R¹²R^12a)、又はC_1〜6アルキルであり、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されており、
R¹¹、R^11a、R¹²、R^12a、R^12bは、H又はC_1〜6アルキルからなる群から独立して選択され、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されている。

一実施形態では、R⁹、R^9a、R^9bは、互いに独立してHとすることができる。

一実施形態では、R¹⁰は、C_1〜6アルキルである。

一実施形態では、Tは、フェニルである。

本明細書で使用する場合、用語「中断されている」とは、2個の炭素原子間又はそれぞれの炭素原子と水素原子との間にある炭素鎖の末端において、1個以上の原子が挿入されていることを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「プロドラッグ」とは、その薬理学的効果を示す前に、生体内変換を受ける化合物を意味する。したがって、プロドラッグは、一時的に使用される特別な非毒性保護基に結合している生物活性部分として見なされ、親分子における望ましくない特性を変化させるか、又はなくすことができる。これには、薬物における望ましい特性の増強、及び望ましくない特性の抑制も含まれる。

本明細書で使用する場合、用語「担体連結プロドラッグ」とは、物理化学特性又は薬物動態特性の改善を生じさせて、且つ通常、加水分解開裂によりインビボで容易に除去され得る、一過性担体基を有する生物活性部分の一時的な連結を含有しているプロドラッグを意味する。そのような担体連結プロドラッグを哺乳動物、好ましくはヒトに投与した際、薬物分子が放出される。したがって、担体連結プロドラッグは、生物活性部分、可逆性プロドラッグリンカー部分、及び担体基を含んでおり、この場合、この生物活性部分は、可逆性プロドラッグリンカーを介して担体基に可逆的に結合している。生物活性部分は、可逆性プロドラッグリンカーに可逆的に、且つ共有結合により連結されており、この可逆性プロドラッグリンカーは、共有結合によって担体基に連結されているものと理解される。好ましくは、可逆性プロドラッグリンカーと担体基との間の連結は、安定な共有結合性連結である。

本明細書で使用する場合、用語「可逆性プロドラッグリンカー部分」とは、その一方の末端上において、可逆的連結を介して、生物活性部分DすなわちVEGF中和生物活性部分に結合しており、且つ他方の末端上において、永久結合を介して担体に結合している部分であって、これによりVEGF中和生物活性部分を担体に連結させる部分を意味する。そのような可逆性プロドラッグリンカーは、生理的条件(pH7.4、37℃の水性緩衝液)下、例えば1時間〜12か月の範囲の半減期で、非酵素的な加水分解により分解することができるもの、すなわち開裂することができるものである。可逆性連結は、例えば、アコニチル、アセタール、アミド、カルボン酸無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、ホスホエステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホン酸エステル、芳香族カーバメート、及びそれらの組合せである。

対照的に、永久連結は、生理的条件(pH7.4、37℃の水性緩衝液)下、12か月を超える半減期で、非酵素的な加水分解により分解することができるものである。

本明細書で使用する場合、用語「痕跡を残さない(traceless)プロドラッグリンカー部分」とは、開裂時に薬物がその遊離形態で放出される可逆性プロドラッグリンカー部分を意味する。本明細書で使用する場合、薬物の「遊離形態」という用語は、その薬理学的に活性な、非修飾形態の薬物を意味する。

本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって連結しているアミノ酸モノマーの短鎖ポリマーを意味する。用語「ポリペプチド」とは、最大50個のアミノ酸モノマーを含むペプチドを意味する。用語「タンパク質」とは、51個以上のアミノ酸モノマーからなるペプチドを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、1種以上の活性成分、及び1種以上の不活性成分、及び2種以上のいかなる成分の組合せ、錯体形成、若しくは凝集から、又は1種以上の成分の解離から、又は1種以上の成分の他のタイプの反応若しくは相互作用から直接又は間接的に生じる任意の生成物を意味する。したがって、本発明の医薬組成物は、VEGF中和プロドラッグ及び1種以上の薬学的に許容される賦形剤を混合することによって作製される、任意の組成物を包含する。

本明細書で使用する場合、用語「賦形剤」は、治療用プロドラッグ、すなわちVEGF中和プロドラッグと一緒に投与される、希釈剤、アジュバント、又はビヒクルを指す。このような医薬賦形剤は、水、以下に限定されないが、ラッカセイ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む動物、植物又は合成起源の油及び石油、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、エタノール、アセテート、スクシネート、トリス、カーボネート、ホスフェート、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)、Tween(登録商標)、ポロキサマー、ポロキサミン、CHAPS、Igepal(登録商標)、(例えば、グリシン、リシン、又はヒスチジンのような)アミノ酸、トリグリセリド、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン(saccharine)ナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウムとすることができる。適切な医薬賦形剤の例は、E.W.Martinによる、「Remington's Pharmaceutical Sciences」において記載されている。製剤は、投与形式に好適となるべきである。

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、分子又は試薬が、動物において、好ましくはヒトにおいて使用するために、EMA(欧州)、及び/又はFDA(米国)、及び/又は任意の他の国の規制機関などの規制機関により承認されていることを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「眼内注射」とは、房水(前眼房又は後眼房)、硝子体、水晶体、又は眼の脈絡膜上腔への注射を意味する。

一般に、用語「含む(comprise)」又は「含んでいる(comprising)」は、「からなる(consist of)」又は「からなっている(consisting of)」も包含する。

本明細書で使用する場合、用語「タンパク質Xの活性モジュレーター」とは、アゴニスト、アンタゴニストである分子、又はタンパク質Xの活性を中和するか若しくは増強する分子を指す。

本発明は、1つ以上の眼状態を処置する方法において使用するための、1種以上の薬学的に許容される賦形剤及びVEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物であって、このプロドラッグが、共有結合により結合されているVEGF中和生物活性部分を含む、医薬組成物に関する。

好ましい実施形態では、VEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物は、眼内に、好ましくは眼内注射により投与される。

好ましい実施形態において、VEGF中和プロドラッグの2回の眼内投与の間の期間は、少なくとも1か月であり、例えばVEGF中和プロドラッグの2回の眼内投与の間の期間は、少なくとも1か月、又は少なくとも5週間、又は少なくとも6週間、又は少なくとも8週間、又は少なくとも10週間、又は少なくとも12週間、又は少なくとも16週間、又は少なくとも20週間、又は少なくとも24週間、又は少なくとも28週間、又は少なくとも32週間、又は少なくとも36週間、又は少なくとも40週間、又は少なくとも44週間、又は少なくとも48週間である。2回の眼内投与の間の最長期間は、好ましく4年以内、すなわち3年以内、2年以内、又は1年以下である。好ましくは、VEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物は、2〜12か月ごとに投与され、より好ましくは、4〜10か月ごと、最も好ましくは6か月ごとに投与される。

したがって、本発明の好ましい態様は、医薬組成物であって、該医薬組成物中に含まれるプロドラッグが、5〜200mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、例えば、5〜180mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、10〜170mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、15〜160mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、20〜150mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、25〜140mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、30〜130mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、40〜120mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、50〜110mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度、又は60〜100mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度を有する、医薬組成物である。

一実施形態では、本医薬組成物は、プロドラッグの総重量に対して、VEGF中和生物活性部分を5〜80重量%、例えば、プロドラッグの総重量に対して、VEGF中和生物活性部分を10〜70重量%、プロドラッグの総重量に対して、VEGF中和生物活性部分を15〜65重量%、プロドラッグの総重量に対して、VEGF中和生物活性部分を20〜65重量%、又はプロドラッグの総重量に対して、VEGF中和生物活性部分を、30〜65%重量含む。

一実施形態では、注射は、10〜200μlの範囲、例えば15〜150μlの範囲、20〜100μlの範囲、30〜80μlの範囲、又は40〜70μlの範囲の注射量で実施される。好ましくは、注射量は、50μlである。

VEGF中和プロドラッグは、好ましくは担体連結プロドラッグである。

VEGF中和プロドラッグには、薬物及び担体に関して、様々な化学量論が含まれる。

一実施形態では、VEGF中和生物活性部分は、可逆性プロドラッグリンカー部分の1つを介して、担体部分の1つに結合される。VEGF中和生物活性部分の可逆性プロドラッグリンカー部分への結合は、対応する薬物の官能基を介して行われる。場合により、担体部分と可逆性プロドラッグリンカー部分との間に、スペーサー部分が存在する。

別の実施形態では、VEGF中和生物活性部分は、VEGF中和生物活性部分の2つ以上の官能基を介して、2つ以上の可逆性プロドラッグリンカー部分に結合している。2つ以上の可逆性プロドラッグリンカー部分の各々は、場合により、スペーサー部分を介して様々な担体部分に結合している。したがって、この実施形態では、VEGF中和生物活性部分の1つは、2つ以上の担体部分に結合している。

別の実施形態では、担体部分の1つが、2つ以上の可逆性プロドラッグリンカー部分に直接又は任意のスペーサー部分を介して結合している。可逆性プロドラッグリンカー部分の各々は、1つ以上の、好ましくは1つのVEGF中和生物活性部分(複数可)に結合されている。

一実施形態では、担体は可溶性担体である。好ましくは、可溶性担体は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(カプロラクトン(caprolacton))、ポリ(カーボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカーボネート)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(プロピレンフマレート)、ポリ(有機ホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、リボ核酸、デスオキシ核酸（desoxynucleic acid）、アルブミン、抗体及びそのフラグメント、血漿タンパク質、コラーゲン、エラスチン、ファシン、フィブリン、ケラチン、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、プロラミン、トランスフェリン、シトクロム、フラボタンパク質、糖タンパク質、ヘムタンパク質、リポタンパク質、金属タンパク質、フィトクロム、リンタンパク質、オプシン、寒天、アガロース、アルギネート、アラビナン、アラビノガラクタン、カラギーナン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び他の炭水化物をベースとするポリマー、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、キシラン、並びにそれらのコポリマー及び官能化誘導体を含むポリマーの群から選択される、少なくとも1つのポリマーを含む。

別の実施形態では、担体は不溶性担体であり、より好ましくは、担体連結プロドラッグの担体はヒドロゲルである。

好ましくは、VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、生分解性ヒドロゲルである。

ヒドロゲルは、好ましくはポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カーボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルオキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカーボネート)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(プロピレンフマレート)、ポリ(有機ホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、リボ核酸、デスオキシ核酸、アルブミン、抗体及びそのフラグメント、血漿タンパク質、コラーゲン、エラスチン、ファシン、フィブリン、ケラチン、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、プロラミン、トランスフェリン、シトクロム、フラボタンパク質、糖タンパク質、ヘムタンパク質、リポタンパク質、金属タンパク質、フィトクロム、リンタンパク質、オプシン、寒天、アガロース、アルギネート、アラビナン、アラビノガラクタン、カラギーナン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及び他の炭水化物をベースとするポリマー、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、キシラン、並びにそれらのコポリマー及び官能化誘導体を含むポリマーの群から選択される、少なくとも1つのポリマーを含む。

好ましくは、VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、少なくとも10%のPEG、より好ましくは少なくとも20%のPEG、最も好ましくは30%のPEGを含む、生分解性ポリ(エチレングリコール)(PEG)をベースとするヒドロゲルである。

VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、好ましくはマイクロ粒子の形状にある成形品である。より好ましくは、このヒドロゲルはマイクロ粒子ビーズの形状にある。さらにより好ましくは、こうしたマイクロ粒子ビーズは、直径が1〜1000μm、より好ましくは5〜500μm、より好ましくは10〜100μm、より好ましくは20〜100μm、さらにより好ましくは20〜80μmを有する。ビーズ直径は、該マイクロ粒子ビーズが等張水性緩衝液中に懸濁している際に測定される。

VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、好ましくは、それらの全体が参照により本明細書に包含されている、WO 2006/003014 A2及びWO 2011/012715 A1において開示されているヒドロゲルである。

さらにより好ましくは、VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、
(a) 以下を含む混合物、すなわち
(a-i)1〜100kDaの範囲の分子量を有しており、且つ少なくとも3つのアミン(-NH₂及び/又は-NH-)を含む、少なくとも1種の骨格鎖試薬
(a-ii)6〜40kDaの範囲の分子量を有しており、且つ
(i)少なくとも2つのカルボニルオキシ基(-(C=O)-O-又は-O-(C=O)-)、さらに
(ii)活性化エステル基、活性化カーバメート基、活性化カーボネート基及び活性化チオカーボネート基からなる群から選択される、少なくとも2つの活性化末端官能基を含み、
少なくとも70%のPEGを含むPEGをベースとする
少なくとも1種の架橋試薬、及び
(a-iii)第1の溶媒、及び第1の溶媒と非混和性である、少なくとも1種の第2の溶媒
を準備するステップであって、
少なくとも1種の骨格鎖試薬と少なくとも1種の架橋試薬との重量比が1:99〜99:1の範囲となるステップ、
(b) 懸濁重合でステップ(a)の混合物をヒドロゲルに重合するステップ、及び
(c) 場合により、ヒドロゲルを後処理するステップ
を含む方法により得ることができるヒドロゲルである。

ステップ(a)の混合物は、第1の溶媒及び少なくとも第2の溶媒を含む。前記第1の溶媒は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、プロピレンカーボネート、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及び水、並びにそれらの混合物を含む群から選択される。

少なくとも1種の骨格鎖試薬及び少なくとも1種の架橋試薬は、第1の溶媒、すなわち、懸濁重合の分散相に溶解される。一実施形態では、同一又は異なる溶媒のいずれかを使用して、好ましくは両方の試薬に同一の溶媒を使用して、骨格鎖試薬及び架橋試薬を個別に、すなわち異なる容器中で溶解される。別の実施形態では、骨格鎖試薬及び架橋試薬は、一緒に、すなわち同一の容器中、且つ同一の溶媒を使用して溶解される。

骨格鎖試薬に好適な溶媒は、有機溶媒である。好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、プロピレンカーボネート、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、及び水、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、骨格鎖試薬は、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール又はそれらの混合物を含む群から選択される溶媒に溶解される。最も好ましくは、骨格鎖試薬は、ジメチルスルホキシドに溶解される。

一実施形態では、骨格鎖試薬は、1〜300mg/mL、より好ましくは5〜60mg/mL、最も好ましくは10〜40mg/mLの範囲の濃度で溶媒に溶解される。

架橋試薬に好適な溶媒は、有機溶媒である。好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、プロピレンカーボネート、N-メチルピロリドン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水、又はそれらの混合物を含む群から選択される。より好ましくは、架橋試薬は、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、メタノール又はそれらの混合物を含む群から選択される溶媒に溶解される。最も好ましくは、架橋試薬は、ジメチルスルホキシドに溶解される。

一実施形態では、架橋試薬は、5〜500mg/mL、より好ましくは25〜300mg/mL、最も好ましくは50〜200mg/mLの範囲の濃度で溶媒に溶解される。

少なくとも1種の骨格鎖試薬及び少なくとも1種の架橋試薬は、1:99〜99:1の範囲の重量比、例えば、2:98〜90:10の範囲の比、3:97〜88:12の範囲の重量比、3:96〜85:15の範囲の重量比、2:98〜90:10の範囲の重量比、5:95〜80:20の範囲の重量比で混合され、特に好ましくは5:95〜80:20の重量比で混合され、この場合、最初の数値は骨格鎖試薬を指し、2番目の数値は架橋試薬を指す。

好ましくは、ステップ(a)の混合物が、架橋試薬の活性化末端官能基と比べて、モル過剰量の骨格鎖試薬由来のアミン基を含むように、比を選択する。したがって、本発明の方法から得られるヒドロゲルは、直接又はスペーサー部分を介するいずれかで、プロドラッグリンカー試薬をヒドロゲルに結合させるために使用することができる遊離アミン基を有する。

少なくとも1種の第2の溶媒、すなわち、懸濁重合の連続相は、好ましくは、有機溶媒であり、より好ましくは、直線状、分岐又は環式C_5〜30アルカン、直線状、分岐又は環式C_5〜30アルケン、直線状、分岐又は環式C_5〜30アルキン、直線状又は環式ポリ(ジメチルシロキサン)、芳香族C_6〜20炭化水素、及びそれらの混合物を含む群から選択される有機溶媒である。さらにより好ましくは、少なくとも第2の溶媒は、直線状、分岐又は環式C_5〜16アルカン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサメチルジシロキサン、又はそれらの混合物を含む群から選択される。最も好ましくは、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン及びウンデカンなどの直線状C_7〜11アルカンを含む群から選択される、少なくとも第2の溶媒である。

好ましくは、ステップ(a)の混合物は、洗剤をさらに含む。好ましい洗剤は、Cithrol DPHS、Hypermer 70A、Hypermer B246、Hypermer 1599A、Hypermer 2296、及びHypermer 1083である。

好ましくは、洗剤は、1Lの全混合物、すなわち、分散相及び連続相の合計当たり0.1g〜100gの濃度を有する。より好ましくは、洗剤は、1Lの全混合物当たり0.5g〜10gの濃度を有しており、最も好ましくは、洗剤は、1Lの全混合物当たり0.5g〜5gの濃度を有する。

好ましくは、ステップ(a)の混合物は、エマルションである。

ステップ(b)における重合は、塩基を添加することによって開始される。好ましくは、塩基は、アルカンに溶解する非求核性塩基であり、より好ましくは、塩基は、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)、1,4-ジメチルピペラジン、4-メチルモルホリン、4-エチルモルホリン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、1,1,4,7,10,10-ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、1,4,7-トリメチル-1,4,7-トリアザシクロノナン、トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミン、トリエチルアミン、DIPEA、トリメチルアミン、N,N-ジメチルエチルアミン、N,N,N',N'-テトラメチル-1,6-ヘキサンジアミン、N,N,N',N'',N''-ペンタメチルジエチレントリアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、及びヘキサメチレンテトラミンから選択される。さらにより好ましくは、塩基は、TMEDA、1,4-ジメチルピペラジン、4-メチルモルホリン、4-エチルモルホリン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、1,1,4,7,10,10-ヘキサメチルトリエチレンテトラミン、1,4,7-トリメチル-1,4,7-トリアザシクロノナン、トリス[2-(ジメチルアミノ)エチル]アミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、及びヘキサメチレンテトラミンから選択される。最も好ましくは、塩基はTMEDAである。

塩基は、混合物中の活性末端官能基当たり1〜500当量の量、好ましくは5〜50当量の量、より好ましくは5〜25当量の量、最も好ましくは10当量の量でステップ(a)の混合物に添加される。

方法ステップ(b)において、本発明のヒドロゲルの重合は、縮合反応であり、この反応は、好ましくは、ステップ(a)の混合物の連続撹拌下で行われる。好ましくは、先端速度(先端速度=π×撹拌機回転速度×撹拌機直径)は、0.2〜10メートル毎秒(m/s)、より好ましくは0.5〜4m/s、最も好ましくは1〜2m/sの範囲にある。

ステップ(b)の好ましい実施形態において、重合反応は、バッフルを装備した円筒形槽中で実施される。槽の直径と高さの比は、4:1〜1:2の範囲とすることができ、より好ましくは、槽の直径と高さの比は、2:1〜1:1の範囲とすることができる。

好ましくは、反応槽は、ピッチドブレード撹拌機(pitched blade stirrer)、船舶型プロペラ、又はLightnin A-310を含む群から選択される軸流撹拌機を装備している。より好ましくは、撹拌機は、ピッチドブレード撹拌機である。

ステップ(b)は、広い温度範囲で、好ましくは-10℃〜100℃の温度で、より好ましくは0℃〜80℃の温度で、さらにより好ましくは10℃〜50℃の温度で、最も好ましくは周囲温度で実施することができる。「周囲温度」とは、一般的な実験室環境における温度を指し、好ましくは、17〜25℃の範囲の温度を意味する。

好ましくは、重合から得られるヒドロゲルは、コーティング物、メッシュ体、ステント、ナノ粒子又はマイクロ粒子などの成形品である。より好ましくは、このヒドロゲルは、1〜500マイクロメートルの直径、より好ましくは10〜300マイクロメートルの直径、さらにより好ましくは20〜150マイクロメートルの直径、最も好ましくは30〜130マイクロメートルの直径を有するマイクロ粒子ビーズの形態にある。前記の直径は、ヒドロゲルマイクロ粒子が、水中で完全に水和されている際に測定される。

場合によるステップ(c)は、以下のステップの一つ以上を含む。
(c1)重合反応由来の過剰な液体を除去するステップ、
(c2)ヒドロゲルを洗浄して、重合中に使用した溶媒を除去するステップ、
(c3)ヒドロゲルを緩衝液に移送するステップ、
(c4)ヒドロゲルをサイズ分別/ふるい分けを行うステップ、
(c5)ヒドロゲルを容器に移送するステップ、
(c6)ヒドロゲルを乾燥するステップ、
(c7)ヒドロゲルを、滅菌に適した特定の溶媒に移送するステップ、及び
(c8)好ましくは、ガンマ線照射によりヒドロゲルを滅菌するステップ。

好ましくは、場合によるステップ(c)は、以下のステップをすべて含む。
(c1)重合反応由来の過剰な液体を除去するステップ、
(c2)ヒドロゲルを洗浄して、重合中に使用した溶媒を除去するステップ、
(c3)ヒドロゲルを緩衝液に移送するステップ、
(c4)ヒドロゲルをサイズ分別/ふるい分けを行うステップ、
(c5)ヒドロゲルを容器に移送するステップ、
(c7)ヒドロゲルを、滅菌に適した特定の溶媒に移送するステップ、及び
(c8)好ましくは、ガンマ線照射によりヒドロゲルを滅菌するステップ。

少なくとも1つの骨格鎖試薬は、1〜100kDa、好ましくは2〜50kDa、より好ましくは5〜30kDa、さらにより好ましくは5〜25kDa、最も好ましくは5〜15kDaの範囲の分子量を有する。

好ましくは、骨格鎖試薬は、少なくとも10%のPEG、より好ましくは少なくとも20%のPEG、さらにより好ましくは少なくとも30%のPEG、最も好ましくは少なくとも40%のPEGを含む、PEGをベースとするものである。

一実施形態では、骨格鎖試薬は、その酸性塩の形態、好ましくは酸付加塩の形態で存在している。適切な酸付加塩は、非毒性の塩を形成する酸から形成される。例には、以下に限定されないが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、サカレート(sacharate)、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びトシル酸塩が含まれる。特に好ましいのは、骨格鎖試薬は、その塩酸塩の形態で存在している。

一実施形態では、少なくとも1つの骨格鎖試薬は、式(I)の化合物
B(-(A⁰)_x1-(SP)_x2-A¹-P-A²-Hyp¹)_x(I)
[式中、
Bは、分岐コアであり、
SPは、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルからなる群から選択される、スペーサー部分であり、
Pは、少なくとも80%のPEG、好ましくは少なくとも85%のPEG、より好ましくは少なくとも90%のPEG、最も好ましくは少なくとも95%のPEGを含むPEGをベースとするポリマー鎖であり、
Hyp¹は、アミン(-NH₂及び/又は-NH-)を含む部分、又は少なくとも2つのアミン(-NH₂及び/又は-NH-)を含むポリアミンであり、
xは、3〜16の整数であり、
x1、x2は、互いに独立して、0又は1であるが、但し、x2が0である場合、x1は0であることを条件とし、
A⁰、A¹、A²は、互いに独立して、

(式中、R¹及びR^1aは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルから選択される)
からなる群から選択される]、
式(II)の化合物
Hyp²-A³-P-A⁴-Hyp³(II)
[式中、
Pは、式(I)の化合物において上記の通り定義され、
Hyp²、Hyp³は、互いに独立して、少なくとも2つのアミン(-NH₂及び/又は-NH-)を含むポリアミンであり、
A³及びA⁴は、

(式中、R¹及びR^1aは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルから選択される)
からなる群から独立して選択される]、
式(III)の化合物
P¹-A⁵-Hyp⁴(III)
[式中、
P¹は、少なくとも80%のPEG、好ましくは少なくとも85%のPEG、より好ましくは少なくとも90%のPEG、最も好ましくは少なくとも95%のPEGを含むPEGをベースとするポリマー鎖であり、
Hyp⁴は、少なくとも3つのアミン(-NH₂及び/又は-NH)を含むポリアミンであり、
A⁵は、

(式中、R¹及びR^1aは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルから選択される)
からなる群から選択される]、
及び
式(IV)の化合物
T¹-A⁶-Hyp⁵(IV)
[式中、
Hyp⁵は、少なくとも3つのアミン(-NH₂及び/又は-NH)を含むポリアミンであり、
A⁶は、

(式中、R¹及びR^1aは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルから選択され、
T¹は、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルからなる群から選択され、このフラグメントは、-NH-、-N(C_1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C_1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)₂-、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、又はナフチルから選択される1つ以上の基により場合により中断されている)]
からなる群から選択される。

以下の項目において、用語「Hyp^x」は、Hyp¹、Hyp²、Hyp³、Hyp⁴、及びHyp⁵をまとめて指す。

好ましくは、本骨格鎖試薬は、式(I)、(II)、又は(III)の化合物であり、より好ましくは、本骨格鎖試薬は、式(I)又は(III)の化合物であり、最も好ましくは、本骨格鎖試薬は式(I)の化合物である。

好ましい実施形態では、式(I)の化合物において、xは、4、6、又は8である。好ましくは、式(I)の化合物において、xは、4又は8であり、最も好ましくは、xは4である。

好ましい実施形態では、式(I)〜式(IV)の化合物において、A⁰、A¹、A²、A³、A⁴、A⁵、及びA⁶は、

を含む基から選択される。好ましくは、式(I)の化合物において、A⁰は、

である。好ましくは、式(I)の化合物において、A¹は、

である。好ましくは、式(I)の化合物において、A²は、

である。好ましくは、式(II)の化合物において、A³は、

であり、且つA⁴は、

である。好ましくは、式(III)の化合物において、A⁵は、

である。好ましくは、式(IV)の化合物において、A⁶は、

である。好ましくは、式(IV)の化合物では、T¹は、H及びC_1〜6アルキルから選択される。

一実施形態では、式(I)の化合物において、分岐コアBは、以下の構造

(式中、
点線は、A⁰に結合していることを示しているか、又はx1及びx2が共に0である場合は、A¹に結合していることを示しており、
tは、1又は2であり、好ましくはtは1であり、
vは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、又は14であり、好ましくはvは、2、3、4、5、6であり、より好ましくは、vは、2、4又は6であり、最も好ましくは、vは2である)
から選択される。

好ましい実施形態では、Bは、式(a-i)、(a-ii)、(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)、(a-xiv)、(a-xv)、又は(a-xvi)の構造を有する。より好ましくは、Bは、式(a-iii)、(a-iv)、(a-v)、(a-vi)、(a-vii)、(a-viii)、(a-ix)、(a-x)、又は(a-iv)の構造を有する。最も好ましくは、Bは、式(a-xiv)の構造を有する。

好ましい実施形態は、BとA⁰との組合せであるか、又はx1とx2が共に0である場合、以下の構造

(式中、
点線は、SPに結合していることを示しているか、又はx1とx2が共に0である場合、Pに結合していることを示している)
から選択される、BとA¹との組合せが好ましい。

より好ましくは、BとA⁰との組合せであるか、又はx1とx2が共に0である場合、BとA¹との組合せは、式(b-i)、(b-iv)、(b-vi)、又は(b-viii)の構造を有しており、最も好ましくは、式(b-i)の式の構造を有する。

一実施形態では、式(I)のx1及びx2は、0である。

一実施形態では、PEGをベースとするポリマー鎖Pは、0.3kDa〜40kDa、例えば0.4〜35kDa、0.6〜38kDa、0.8〜30kDa、1〜25kDa、1〜15kDa、又は1〜10kDaの分子量を有する。最も好ましくは、Pは、1〜10kDaの分子量を有する。

一実施形態では、PEGをベースとするポリマー鎖P¹は、0.3kDa〜40kDa、例えば0.4〜35kDa、0.6〜38kDa、0.8〜30kDa、1〜25kDa、1〜15kDa、又は1〜10kDaの分子量を有する。最も好ましくは、P¹は、1〜10kDaの分子量を有する。

一実施形態では、式(I)又は(II)の化合物において、Pは、式(c-i)の構造

(式中、nは6〜900の範囲であり、より好ましくはnは20〜700の範囲であり、最も好ましくは、nは20〜250の範囲である)
を有する。

一実施形態では、式(III)の化合物において、P¹は、式(c-ii)の構造

(式中、
nは6〜900の範囲にあり、より好ましくはnは20〜700の範囲にあり、最も好ましくは、nは20〜250の範囲にあり、
T⁰は、-NH-、-N(C_1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C_1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、又は-S(O)₂-から選択される、1つ以上の基により場合により中断されている、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルを含む基から選択される)
を有する。

一実施形態では、式(I)〜(IV)の化合物において、部分Hyp^xはポリアミンであり、好ましくは式(d-i)、(d-ii)、(d-iii)、及び/又は(d-iv)の部分

(式中、
z1、z2、z3、z4、z5、z6は、互いに独立して、1、2、3、4、5、6、7、又は8である)
を、結合形態で、且つ適用可能な場合、R-及び/又はS-立体配置で含む。

より好ましくは、Hyp^xは、リシン、オルニチン、二アミノプロピオン酸、及び/又は二アミノ酪酸を、結合形態で、且つR-及び/又はS-立体配置で含む。最も好ましくは、Hyp^xは、リシンを、結合形態で、且つR-及び/又はS-立体配置(configuation)で含む。

Hyp^xは、40Da〜30kDa、好ましくは0.3kDa〜25kDa、より好ましくは0.5kDa〜20kDa、さらにより好ましくは1kDa〜20kDa、最も好ましくは2kDa〜15kDaの分子量を有する。

Hyp^xは、好ましくは、式(e-i)の部分

(式中、
p1は、1〜5の整数であり、好ましくはp1は4であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示している)、
式(e-ii)の部分

(式中、
p2、p3及びp4は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、1〜5の整数であり、好ましくはp2、p3及びP4は、4であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-iii)の部分

(式中、
p5〜p11は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、1〜5の整数であり、好ましくはp5〜p11は、4であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)である場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)である場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)である場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)である場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-iv)の部分

(式中、
p12〜p26は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、1〜5の整数であり、好ましくはp12〜p26は、4であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-v)の部分

(式中、
p27及びp28は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、1〜5の整数であり、好ましくはp27及びp28は、4であり、
qは、1〜8の整数であり、好ましくはqは2又は6であり、最も好ましくは1は6であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-vi)の部分

(式中、
p29及びp30は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、2〜5の整数であり、好ましくはp29及びp30は、3であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-vii)の部分

(式中、
p31〜p36は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、2〜5の整数であり、好ましくはp31〜p36は、3であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-viii)の部分

(式中、
p37〜p50は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、2〜5の整数であり、好ましくはp37〜p50は、3であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)、
式(e-ix)の部分

(式中、
p51〜p80は、同一又は異なっており、各々は互いに独立して、2〜5の整数であり、好ましくはp51〜p80は、3であり、
点線は、骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、A²に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、A³又はA⁴に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、A⁵に結合していることを示しており、骨格鎖試薬が式(IV)の構造を有する場合、A⁶に結合していることを示している)
からなる群から選択され、
部分(e-i)〜(e-v)は、各不斉中心において、R-又はS-立体配置のいずれかをとることができ、好ましくは、部分(e-i)〜(e-v)の不斉中心はすべて、同じ立体配置をとる。

好ましくは、Hyp^xは、式(e-i)、(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vi)、(e-vii)、(e-viii)、又は(e-ix)の構造を有する。より好ましくは、Hyp^xは、式(e-ii)、(e-iii)、(e-iv)、(e-vii)、(e-viii)、又は(e-ix)の構造を有しており、さらにより好ましくは、Hyp^xは、式(e-ii)、(e-iii)、(e-vii)、又は(e-viii)の構造を有しており、最も好ましくは、Hyp^xは、式(e-iii)の構造を有する。

骨格鎖試薬が式(I)の構造を有する場合、好ましい部分-A²-Hyp¹は、式の部分

(式中、
点線は、Pに結合していることを示しており、
E¹は、式(e-i)〜(e-ix)から選択される)
である。

骨格鎖試薬が式(II)の構造を有する場合、好ましい部分Hyp²-A³-は、式の部分

(式中、
点線は、Pに結合していることを示しており、
E¹は、式(e-i)〜(e-ix)から選択される)
であり、
好ましい部分-A⁴-Hyp³は、式の部分

骨格鎖試薬が式(III)の構造を有する場合、好ましい部分-A⁵-Hyp⁴は、式の部分

(式中、
点線は、P¹に結合していることを示しており、
E¹は、式(e-i)〜(e-ix)から選択される)
である。

より好ましくは、骨格鎖試薬は式(I)の構造を有しており、Bは式(a-xiv)の構造を有する。

さらにより好ましくは、骨格鎖試薬は式(I)の構造を有しており、Bは式(a-xiv)の構造を有しており、x1及びx2は0であり、A¹は-O-である。

さらにより好ましくは、骨格鎖試薬は式(I)の構造を有しており、Bは式(a-xiv)の構造を有しており、A¹は-O-であり、Pは式(c-i)の構造を有する。

さらにより好ましくは、骨格鎖試薬は式(I)であり、Bは式(a-xiv)であり、x1及びx2は0であり、A¹は-O-であり、Pは式(c-i)であり、A²は-NH-(C=O)-であり、Hyp¹は式(e-iii)である。

最も好ましくは、骨格鎖試薬は以下の式

(式中、
nは10〜40、好ましくは10〜30、より好ましくは10〜20の範囲である)
を有する。

同等に好ましくは、nは、20〜30kDaの範囲であり、最も好ましくはnは28である。

SPは、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルを含む基から選択されるスペーサー部分であり、好ましくは、SPは、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-CH₂-、CH(C₂H₅)-、-C(CH₃)₂-、-CH=CH-又は-CH=CH-であり、最も好ましくはSPは、-CH₂-、-CH₂-CH₂-、又は-CH=CH-である。

少なくとも1つの架橋試薬は、生分解性連結である、少なくとも2つのカルボニルオキシ基(-(C=O)-O-又は-O-(C=O)-)を含む。これらの生分解性連結は、ヒドロゲルを生分解性とするために必要である。さらに、少なくとも1つの架橋試薬は、ステップ(b)の重合中に少なくとも1つの骨格鎖試薬のアミンと反応する、少なくとも2つの活性化末端官能基を含む。

架橋試薬は、6〜40kDaの範囲、より好ましくは6〜30kDaの範囲、さらにより好ましくは6〜20kDaの範囲、さらにより好ましくは6〜15kDaの範囲、最も好ましくは6〜10kDaの範囲の分子量を有する。

架橋試薬は、重合中に、骨格鎖試薬のアミン基と反応してアミド結合を形成する、活性化エステル基、活性化カーバメート基、活性化カーボネート基、及び活性化チオカーボネート基を含む基から選択される、少なくとも2つの活性化末端官能基を含む。

好ましい一実施形態では、架橋試薬は、式(V-I)の化合物

[式中、
D¹、D²、D³及びD⁴の各々は、同一又は異なっており、各々は、互いに独立して、-O-、-NR⁵-、-S-、及び-CR⁶R^6a-を含む基から選択され、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁶及びR^6aの各々は、同一又は異なっており、これら各々は互いに独立して、-H、-OR⁷、-NR⁷R^7a、-SR⁷、及びC_1〜6アルキルを含む基から選択され、場合により、ペアR¹/R²、R³/R⁴、R^1a/R^2a、及びR^3a/R^4aの各々は化学結合を独立して形成することができ、且つ/又はペアR¹/R^1a、R²/R^2a、R³/R^3a、R⁴/R^4a、R⁶/R^6a、R¹/R²、R³/R⁴、R^1a/R^2a、及びR^3a/R^4aの各々は、互いに独立して、それらが結合している原子と一緒になって、C_3〜8シクロアルキルを形成するか若しくは環Aを形成するか、又はそれらが結合している原子と一緒になって、4〜7員のヘテロシクリル又は8〜11員のヘテロビシクリル又はアダマンチルを形成し、
R⁵の各々は、-H及びC_1〜6アルキルから独立して選択され、場合により、ペアR¹/R⁵、R²/R⁵、R³/R⁵、R⁴/R⁵、及びR⁵/R⁶の各々は、独立して化学結合を形成することができ、且つ/又はそれらが結合している原子と一緒になって、4〜7員のヘテロシクリル又は8〜11員のヘテロビシクリルを形成し、
各R⁷、R^7aの各々は、H及びC_1〜6アルキルから独立して選択され、
Aは、インデニル、インダニル及びテトラリニルからなる群から選択され、
P²は

であり、
mは120〜920、好ましくは120〜460、より好ましくは120〜230の範囲であり、
r1、r2、r7、r8は、独立して0又は1であり、
r3、r6は、独立して0、1、2、3又は4であり、
r4、r5は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
s1、s2は、独立して1、2、3、4、5又は6であり、
Y¹、Y²は、同一又は異なっており、それらの各々は、互いに独立して、式(f-i)〜(f-vi)

(式中、
点線は、分子の残部に結合していることを示しており、
bは、1、2、3又は4であり、
X^Hは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される]
である。

好ましくは、架橋試薬は、式(V-II)の化合物

[式中、
D¹、D²、D³、及びD⁴は、同一又は異なっており、それらの各々は、互いに独立して、O、NR⁵、S及びCR⁵R^5aを含む基から選択され、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵及びR^5aは、同一又は異なっており、これら各々は互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルを含む基から選択され、場合により、ペアR¹/R^1a、R²/R^2a、R³/R^3a、R⁴/R^4a、R¹/R²、R³/R⁴、R^1a/R^2a、及びR^3a/R^4aの1つ以上は化学結合を形成するか、又はそれらが結合している原子と一緒になって、C_3〜8シクロアルキルを形成するか、若しくは環Aを形成するか、又はそれらが結合している原子と一緒になって、4〜7員のヘテロシクリル又は8〜11員のヘテロビシクリル又はアダマンチルを形成し、
Aは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル及びテトラリニルからなる群から選択され、
P²は

であり、
mは、120〜920、好ましくは120〜460、より好ましくは120〜230の範囲であり、
r1、r2、r7、r8は、独立して0又は1であり、
r3、r6は、独立して0、1、2、3又は4であり、
r4、r5は、独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
s1、s2は、独立して1、2、3、4、5又は6であり、
Y¹、Y²は、同一又は異なっており、それらの各々は、互いに独立して、式(f-i)〜(f-vi)

部分、

は、少なくとも2つの活性化末端官能基を表すものと理解される。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のY¹及びY²は、式(f-i)、(f-ii)、又は(f-v)の構造を有する。より好ましくは、Y¹及びY²は式(f-i)又は(f-ii)の構造を有しており、最も好ましくはY¹及びY²は、式(f-i)の構造を有する。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のY¹とY²の部分の両方が、同じ構造を有する。より好ましくは、Y¹とY²の両方の部分が、式(f-i)の構造を有する。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のr1は、0である。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のr1とs1は、共に0である。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のペアR¹/R^1a、R²/R^2a、R³/R^3a、R⁴/R^4a、R¹/R²、R³/R⁴、R^1a/R^2a、及びR^3a/R^4aの1つ以上は化学結合を形成するか、又はそれらが結合している原子と一緒になって、C_3〜8シクロアルキルを形成するか、若しくは環Aを形成する。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)のペアR¹/R²、R^1a/R^2a、R³/R⁴、R^3a/R⁴の1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、4〜7員のヘテロシクリル又は8〜11員のヘテロビシクリルを形成する。

好ましくは、式(V-I)又は(V-II)の架橋試薬は対称であり、すなわち部分

は、部分

と同じ構造を有する。

好ましい一実施形態では、式(V-I)及び(V-II)のs1、s2、r1及びr8は、0である。

別の好ましい実施形態では、式(V-I)及び(V-II)のs1、s2、r1及びr8は0であり、式(V-I)及び(V-II)のr4、及びr5は1である。

好ましい架橋試薬は、式(V-1)〜(V-54)

(式中、
各架橋試薬は、適用可能な場合、そのラセミ混合物の形態にあってもよく、
m、Y¹及びY²は、上記の通り定義される)
である。

さらにより好ましい架橋試薬は、式(Va-1)〜(Va-54)

カルボニルオキシ基のアルファ炭素に、分岐すなわちH以外の残基を有する架橋試薬を使用すると、エステラーゼによる分解などの酵素による分解に対してより高い抵抗性を示すヒドロゲルの形成がもたらされることが、驚くべきことに見いだされた。

同様に、カルボニルオキシ基の(C=O)と、隣接活性化エステル、活性化カーバメート、活性化カーボネート、又は活性化チオカーバメートの(C=O)との間の原子が少ないほど、得られたヒドロゲルは、分解に対してより高い抵抗性を示す(エステラーゼによる分解に対してより高い抵抗性を示すなど)ことが、驚くべきことに見いだされた。

したがって、架橋試薬V-11〜V-54、V-1、V-2、Va-11〜Va-54、Va-1及びVa-2が、好ましい架橋試薬である。架橋試薬Va-11〜Va-54、Va-1及びVa-2が、最も好ましい架橋試薬である。最も好ましいのは、架橋試薬Va-14である。

別の実施形態では、架橋試薬V-1、V-2、V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-11、V-12、V-13、V-14、V-15、V-16、V-17、V-18、V-19、V-20、V-21、V-22、V-23、V-24、V-25、V-26、V-27、V-28、V-29、V-30、V-31、V-32、V-33、V-34、V-35、V-36、V-37、V-38、V-39、V-40、V-41、V-42、V-43、V-44、V-45、V-46、V-47、V-48、V-49、V-50、V-51、V-52、V-53及びV-54が、好ましい架橋試薬である。より好ましくは、少なくとも1つの架橋試薬は、式V-5、V-6、V-7、V-8、V-9、V-10、V-14、V-22、V-23、V-43、V-44、V-45又はV-46であり、最も好ましくは、少なくとも1つの架橋試薬は、式V-5、V-6、V-9又はV-14である。

別の実施形態では、架橋試薬Va-1、Va-2、Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-11、Va-12、Va-13、Va-14、Va-15、Va-16、Va-17、Va-18、Va-19、Va-20、Va-21、Va-22、Va-23、Va-24、Va-25、Va-26、Va-27、Va-28、Va-29、Va-30、Va-31、Va-32、Va-33、Va-34、Va-35、Va-36、Va-37、Va-38、Va-39、Va-40、Va-41、Va-42、Va-43、Va-44、Va-45、Va-46、Va-47、Va-48、Va-49、Va-50、Va-51、Va-52、Va-53及びV-54が、より好ましい架橋試薬である。より好ましくは、少なくとも1つの架橋試薬は、式Va-5、Va-6、Va-7、Va-8、Va-9、Va-10、Va-14、Va-22、Va-23、Va-43、Va-44、Va-45又はVa-46であり、最も好ましくは、少なくとも1つの架橋試薬は、式Va-5、Va-6、Va-9又はVa-14である。

したがって、上記の式(V-I)及び(V-II)の化合物の好ましい実施形態は、式(V-1)〜(V-53)の好ましい化合物に該当する。

別の態様では、本発明は、上記の本発明の方法により得ることができるヒドロゲルに関する。

ヒドロゲルは、0.01〜1mmol/gの一級アミン基(-NH₂)、より好ましくは、0.02〜0.5mmol/gの一級アミン基、最も好ましくは0.05〜0.3mmol/gの一級アミン基を含有する。用語「Xmmol/gの一級アミン基」とは、1gの乾燥ヒドロゲルが、Xmmolの一級アミン基を含むことを意味する。ヒドロゲルのアミン含有量の測定は、Gudeら(その全体が参照により組み込まれている、Letters in Peptide Science、2002年、9巻(4号)、203〜206頁)に従って実施することができる。

好ましくは、用語「乾燥」とは、本明細書で使用する場合、残留水の含有量を最大10%、好ましくは5%未満、より好ましくは2%未満、有することを意味する(カールフィッシャーによって求める)。好ましい乾燥方法は、凍結乾燥である。

一実施形態では、VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルは、さらに修飾された後、このヒドロゲルに可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分がコンジュゲートされる。

好ましくは、ヒドロゲルは、
(A) 同一又は異なる官能基、好ましくは同一の官能基を示す基A^x0を有するヒドロゲルを準備するステップ、
(B) 場合により、式(VI)スペーサー試薬
A^x1-SP²-A^x2(VI)
(式中、
SP²は、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルであり、これらのC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、場合により、-NH-、-N(C_1〜4アルキル)-、-O-、-S、-C(O)-、-C(O)NH、-C(O)N(C_1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)₂-、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、及びナフチルからなる群から選択される、1つ以上の基により中断されており、
A^x1は、ヒドロゲルのA^x0と反応する官能基であり、
A^x2は、官能基である)
をステップ(A)に由来するヒドロゲルのA^x0に、共有結合によりコンジュゲートするステップ、
(C) ステップ(A)又はステップ(B)のヒドロゲルを式(VII)の試薬
A^x3-Z (VII)
(式中、
A^x3は、官能基であり、
Zは、10Da〜1000kDaの範囲の分子量を有する不活性部分である)
と反応させるステップ、
を含む方法により修飾され、
こうして、最大でもA^x0又はA^x2の99mol%が、A^x3と反応する。

好ましくは、ステップ(A)のA^x0は、マレイミド、アミン(-NH₂又は-NH-)、ヒドロキシル(-OH)、カルボキシル(-COOH)、及び活性化カルボキシル(-COY¹)(式中、Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

(式中、
点線は、分子の残部に結合していることを示しており、
bは、1、2、3又は4であり、
X^Hは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される)からなる群から選択される。

より好ましくは、ステップ(A)のA^x0は、アミン又はマレイミドである。

VEGF中和プロドラッグのヒドロゲルが上記の方法によって得られる場合、ステップ(A)の官能基A^x0は、少なくとも1つの骨格鎖試薬のアミンに相当することが理解される。

好ましい実施形態では、ステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(B)のA^x1は、ClSO₂-、R¹(C=O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O=C=N-、Y¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、又はY¹-(C=O)-O-であり、
式中、
R¹は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_3〜8シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

(式中、
点線は、分子の残部に結合していることを示しており、
bは、1、2、3又は4であり、
X^Hは、Cl、Br、I、又はFである)
から選択される。

別の好ましい実施形態では、ステップ(A)のA^x0はヒドロキシル基(-OH)であり、ステップ(B)のA^x1は、O=C=N-、I-、Br-、SCN-、又はY¹-(C=O)-NH-であり、
式中、Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

別の好ましい実施形態では、ステップ(A)のA^x0は、カルボン酸(-(C=O)OH)であり、ステップ(B)のA^x1は、一級アミン又は二級アミンである。

別の好ましい実施形態では、ステップ(A)のA^x0は、マレイミドであり、ステップ(B)のA^x1は、チオールである。

より好ましくは、ステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(B)のA^x1はY¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、又はY¹-(C=O)-O-であり、最も好ましくはステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(B)のA^x1はY¹-(C=O)-である。

ステップ(B)のA^x1は、場合により、保護形態で存在していてもよい。

活性化カルボン酸を得るための適切な活性化試薬は、例えばN,N'-ジシクロヘキシル-カルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-カルボジイミド(EDC)、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBOP)、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(PyBrOP)、1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスフェート(COMU)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAT)、O-(6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、1-H-ベンゾトリアゾリウム(HBTU)、(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)、及びO-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)である。これらの試薬は市販されており、当業者に周知である。

好ましくは、ステップ(B)のA^x2は、任意の保護基を有する、-マレイミド、-SH、-NH₂、-SeH、-N₃、-C≡CH、-CR¹=CR^1aR^1b、-OH、-(CH=X)-R¹、-(C=O)-S-R¹、-(C=O)-H、-NH-NH₂、-O-NH₂、-Ar-X⁰、-Ar-Sn(R¹)(R^1a)(R^1b)、-Ar-B(OH)(OH)、Br、I、Y¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、Y¹-(C=O)-O-、

からなる群から選択され、
式中、
点線は、SP²に結合していることを示しており、
Xは、O、S、又はNHであり、
X⁰は、-OH、-NR¹R^1a、-SH、又は-SeHであり、
X^Hは、Cl、Br、I、又はFであり、
Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル又はテトラリニルであり、
R¹、R^1a、R^1bは、互いに独立して、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_3〜8シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

より好ましくは、ステップ(B)のA^x2は、-NH₂、マレイミド、又はチオールであり、最も好ましくは、ステップ(B)のA^x2はマレイミドである。同等に好ましいのは、ステップ(B)のA^x2がチオールである。

ステップ(B)のA^x2は、場合により、保護形態で存在していてもよい。

ステップ(A)のヒドロゲルが、共有結合によりスペーサー部分にコンジュゲートされている場合、得られたヒドロゲル-スペーサー部分コンジュゲートは、式(VIII)

(式中、
点線は、ステップ(A)のヒドロゲルに結合していることを示しており、
A^y1は、A^x0とA^x1との間に形成されている連結であり、
SP²及びA^x2は、式(VI)と同様に使用される)
である。

好ましくは、式(VIII)のA^y1は、安定な連結である。

好ましくは、式(VIII)のA^y1は、

(式中、
アスタリスクにより印が付けられている点線は、ヒドロゲルに結合していることを示しており、
印のない点線は、SP²に結合していることを示している)
からなる群から選択される。

適切な反応条件は、実施例の項目において記載されており、当業者に公知である。

方法ステップ(B)は、塩基の存在下で実施することができる。適切な塩基には、慣用的な無機塩基又は有機塩基が含まれる。これらには、好ましくは、アルカリ土類金属又はアルカリ金属水素化物、水酸化物、アミド、アルコキシド、酢酸塩、炭酸塩又は重炭酸塩(例えば、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム又は炭酸アンモニウムなど)、及び第三級アミン(トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、N,N-ジメチルベンジルアミン、ピリジン、N-メチルピペリジン、N-メチルモルホリン、N,N-ジメチルアミノピリジン、ジアザビシクロオクタン(DABCO)、ジアザビシクロノネン(DBN)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、ジアザビシクロウンデセン(DBU)、又はコリジンなど)が含まれる。

方法ステップ(B)は、溶媒の存在下で実施することができる。本発明の方法ステップ(B)を実施するのに適した溶媒には、有機溶媒が含まれる。これらには、好ましくは、水、及び脂肪族、脂環式又は芳香族炭化水素(例えば、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン又はデカリンなど)、ハロゲン化炭化水素(例えば、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン又はトリクロロエタンなど)、アルコール(メタノール、エタノール、n-又はi-プロパノール、n-、i-、sec-又はtert-ブタノール、エタンジオール、プロパン-1,2-ジオール、エトキシエタノール、メトキシエタノール、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジメチルエーテル、ジエチレングリコールなど)、アセトニトリル、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N-ジメチルアセトアミド、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ヘキサメチルホスホルアミド(HMPT)、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン(DMI)、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2(1H)-ピリミジノン(DMPU)、酢酸エチル、アセトン、ブタノン、エーテル(ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチルt-ブチルエーテル、メチルt-アミルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、1,2-ジエトキシエタン、又はアニソールなど)、又はそれらの混合物が含まれる。好ましくは、溶媒は、水、アセトニトリル、及びN-メチル-2-ピロリドンからなる群から選択される。

好ましくは、ステップ(C)のA^x3は、-SH、-NH₂、-SeH、-マレイミド、-C≡CH、-N₃、-CR¹=CR^1aR^1b、-(C=X)-R¹、-OH、-(C=O)-S-R¹、-NH-NH₂、-O-NH₂、-Ar-Sn(R¹)(R^1a)(R¹b)、-Ar-B(OH)(OH)、-Ar-X⁰、

からなる群から選択され、
式中、
点線は、Zに結合していることを示しており、
Xは、O、S、又はNHであり、
X⁰は、-OH、-NR¹R^1a、-SH、又は-SeHであり、
R¹、R^1a、R^1bは、互いに独立して、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_3〜8シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y¹は、活性化カルボン酸、活性化カーボネート、又は活性化カーバメートであり、好ましくは、Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

好ましい実施形態では、Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

(式中、
点線、b及びX^Hは、上記の通り使用される)
から選択される。

より好ましくは、ステップ(C)のA^x3は-SH又は-マレイミドであり、最も好ましくはステップ(C)のA^x3は-SHである。

別の好ましい実施形態では、A^x3は式(aI)

(式中、
点線は、式(VII)のZに結合していることを示しており、
PG⁰は、硫黄活性部分であり、
Sは、硫黄である)
である。

好ましくは、式(aI)のPG⁰は、

からなる群から選択され、
式中、
点線は、式(aI)の硫黄に結合していることを示しており、
Arは、場合によりさらに置換されている、芳香族部分であり、
R⁰¹、R⁰²、R⁰³、R⁰⁴は、互いに独立して、-H、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルであり、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、同一又は異なる1つ以上のR³により場合により置換されており、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、-Q-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R⁴)-、-S(O)₂N(R⁴)-、-S(O)N(R⁴)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R⁴)S(O)₂N(R^4a)-、-S-、-N(R⁴)-、-OC(O)R⁴、-N(R⁴)C(O)-、-N(R⁴)S(O)₂-、-N(R⁴)S(O)-、-N(R⁴)C(O)O-、-N(R⁴)C(O)N(R^4a)-、及び-OC(O)N(R⁴R^4a)からなる群から選択される1つ以上の基によって場合により中断されており、
Qは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、及び8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、Tは、同一又は異なる1つ以上のR³により場合により置換されており、
R³は、ハロゲン、-CN、オキソ(=O)、-COOR⁵、-OR⁵、-C(O)R⁵、-C(O)N(R⁵R^5a)、-S(O)₂N(R⁵R^5a)、-S(O)N(R⁵R^5a)、-S(O)₂R⁵、-S(O)R⁵、-N(R⁵)S(O)₂N(R^5aR^5b)、-SR⁵、-N(R⁵R^5a)、-NO₂、-OC(O)R⁵、-N(R⁵)C(O)R^5a、-N(R⁵)S(O)₂R^5a、-N(R⁵)S(O)R^5a、-N(R⁵)C(O)OR^5a、-N(R⁵)C(O)N(R^5aR^5b)、-OC(O)N(R⁵R^5a)、又はC_1〜6アルキルであり、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されており、
R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R^5bは、-H又はC_1〜6アルキルからなる群から独立して選択され、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されている。

好ましくは、R⁰¹、R⁰³、及びR⁰⁴は、互いに独立して、C_1〜6アルキルである。

好ましくは、R⁰²は、H及びC_1〜6アルキルから選択される。

好ましくは、Arは、

からなる群から選択され、
式中、
点線は、式(aI)のPG⁰の残部に結合していることを示しており、
Wは、互いに独立して、O、S、又はNであり、
W'は、Nであり、
この場合、Arは、NO₂、Cl及びFからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている。

より好ましくは、式(aI)のPG⁰は、

からなる群から選択され、
式中、
点線は、式(aI)の硫黄に結合していることを示しており、
Ar、R⁰¹、R⁰²、R⁰³、及びR⁰⁴は、上記の通り使用される。

より好ましくは、式(aI)のPG⁰は、

であり、
式中、
点線は、式(aI)の硫黄に結合していることを示している。

ステップ(C)のA^x3は、場合により、保護形態で存在していてもよい。

ステップ(B)のA^x2とステップ(C)のA^x3との好ましい組合せは、以下である。

表中、
Xは、O、S、又はNHであり、
X⁰は、-OH、-NR¹R^1a、-SH、又は-SeHであり、
R¹、R^1a、R^1bは、互いに独立して、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_3〜8シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルからなる群から選択され、
Arは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルである。

別の好ましい実施形態では、A^x2は-SHであり、A^x3は式(aI)であり、式中、PG⁰は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、又は(viii)である。より好ましくは、式(aI)のPG⁰は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、又は(v)であり、さらにより好ましくは、式(aI)のPG⁰は、式(i)である。最も好ましくは、式(aI)のPG⁰は、

(式中、
点線は、式(aI)の硫黄に結合していることを示している)
である。

好ましい一実施形態では、ステップ(B)のA^x2はアミンであり、ステップ(C)のA^x3はY¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、又はY¹-(C=O)-O-であり、最も好ましくはステップ(B)のA^x2はアミンであり、ステップ(C)のA^x3はY¹-(C=O)-である。

別の好ましい実施形態では、ステップ(B)のA^x2は、マレイミドであり、ステップ(C)のA^x3は、-SHである。

一実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(C)のA^x3は、ClSO₂-、R¹(C=O)-、I-、Br-、Cl-、SCN-、CN-、O=C=N-、Y¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、又はY¹-(C=O)-O-であり、
式中、
R¹は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_3〜8シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、又はテトラリニルであり、
Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

別の実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はヒドロキシル基(-OH)であり、ステップ(C)のA^x3は、O=C=N-、I-、Br-、SCN-、又はY¹-(C=O)-NH-であり、
Y¹は、式(f-i)〜(f-vi)

別の実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はカルボン酸(-(C=O)OH)であり、ステップ(C)のA^x3は一級アミン又は二級アミンである。

別の実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(C)のA^x3はY¹-(C=O)-、Y¹-(C=O)-NH-、又はY¹-(C=O)-O-である。

別の実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はマレイミドであり、ステップ(C)のA^x3はチオールである。

好ましい実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、ステップ(A)のA^x0はアミンであり、ステップ(C)のA^x3はY¹-(C=O)-である。

別の好ましい実施形態では、任意のステップ(B)は行われず、A^x0は-SHであり、A^x3は式(aI)であり、式中、PG⁰は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、又は(viii)である。より好ましくは、式(aI)のPG⁰は、式(i)、(ii)、(iii)、(iv)、又は(v)であり、さらにより好ましくは、式(aI)のPG⁰は、式(i)である。最も好ましくは、式(aI)のPG⁰は、式

ステップ(C)から得られたヒドロゲルは、式(IXa)又は(IXb)の構造

(式中、
点線は、ステップ(A)のヒドロゲルに結合していることを示しており、
A^y0は、A^x0とA^x3との間に形成される連結であり、
A^y1は、式(VIII)と同様に使用され、
A^y2は、A^x2とA^x3との間に形成される連結であり、
SP²は、式(VI)と同様に使用され、
Zは、式(VII)と同様に使用される)
を有する。

好ましくは、ステップ(A)のA^y0及び式(IXb)のA^y2は、アミド、カーバメート、

(式中、
アスタリスクにより印が付けられている点線は、それぞれ、ヒドロゲル又はSP²に結合していることを示しており、
印のない点線は、式(VII)のZに結合していることを示している)
からなる群から選択される。

一実施形態では、ステップ(C)のZは、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、C_2〜50アルキニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルからなる群から選択され、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、C_2〜50アルキニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、8〜11員のヘテロビシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、及びテトラリニルは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、且つC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R⁹)-、-S(O)₂N(R⁹)-、-S(O)N(R⁹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R⁹)S(O)₂N(R^9a)-、-S-、-N(R⁹)-、-OC(O)R⁹、-N(R⁹)C(O)-、-N(R⁹)S(O)₂-、-N(R⁹)S(O)-、-N(R⁹)C(O)O-、-N(R⁹)C(O)N(R^9a)-、及び-OC(O)N(R⁹R^9a)からなる群から選択される1つ以上の基により、場合により中断されており、
式中、
R⁹、R^9aは、H、T、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルからなる群から独立して選択され、T、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、これらのC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-、及び-OC(O)N(R¹¹R^11a)からなる群から選択される1つ以上の基によって場合により中断されており、
Tは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、及び8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、この場合、Tは、同一又は異なる1つ以上のR¹⁰により場合により置換されており、
R¹⁰は、ハロゲン、CN、オキソ(=O)、COOR¹²、OR¹²、C(O)R¹²、C(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂N(R¹²R^12a)、S(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂R¹²、S(O)R¹²、N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)、SR¹²、N(R¹²R^12a)、NO₂、OC(O)R¹²、N(R¹²)C(O)R^12a、N(R¹²)S(O)₂R^12a、N(R¹²)S(O)R^12a、N(R¹²)C(O)OR^12a、N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)、OC(O)N(R¹²R^12a)、又はC_1〜6アルキルであり、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されており、
R¹¹、R^11a、R¹²、R^12a、R^12bは、互いに独立して、H及びC_1〜6アルキルからなる群から選択され、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されている。

別の実施形態では、ステップ(C)のZは、0.5kDa〜1000kDaの範囲の分子量、好ましくは、0.5〜500kDaの範囲の分子量、より好ましくは0.75〜250kDaの範囲、さらにより好ましくは1〜100kDaの範囲、さらにより好ましくは5〜60kDaの範囲、さらにより好ましくは10〜50の範囲の分子量を有する不活性ポリマーであり、最も好ましくは、Zは、40kDaの分子量を有する。

好ましくは、ステップ(C)のZは、2-メタクリロイル-オキシエチルホスホイルコリン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリレート)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アルキルオキシ)ポリマー、ポリ(アミド)、ポリ(アミドアミン)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(アスパルトアミド)、ポリ(酪酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリブチレンテレフタレート、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(カーボネート)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(ジメチルアクリルアミド)、ポリ(エステル)、ポリ(エチレン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチルホスフェート)、ポリ(エチルオキサゾリン)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ヒドロキシエチルアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチル-オキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリレート)、ポリ(ヒドロキシプロピルオキサゾリン)、ポリ(イミノカーボネート)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(メタクリルアミド)、ポリ(メタクリレート)、ポリ(メチルオキサゾリン)、ポリ(有機ホスファゼン)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(シロキサン)、ポリ(ウレタン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアミン)、ポリ(ビニルメチルエーテル)、ポリ(ビニルピロリドン)、シリコーン、セルロース、カルボメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン、キトサン、デキストラン、デキストリン、ゼラチン、ヒアルロン酸及び誘導体、官能基化ヒアルロン酸、マンナン、ペクチン、ラムノガラクツロナン、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及び他の炭水化物をベースとするポリマー、キシラン、及びそれらのコポリマーからなる群から選択される不活性ポリマーである。

好ましい実施形態では、ステップ(C)のZは、少なくとも70%のPEGを含む、直鎖状又は分岐PEGをベースとする不活性ポリマー、又は少なくとも70%のヒアルロン酸を含むヒアルロン酸をベースとするポリマーである。より好ましくは、ステップ(C)のZは、少なくとも70%のPEG、さらにより好ましくは少なくとも80%のPEG、最も好ましくは少なくとも90%のPEGを含む、直鎖状又は分岐PEGをベースとする不活性ポリマーである。

別の好ましい実施形態では、ステップ(C)のZは、両イオン性ポリマーである。好ましくは、そのような両イオン性ポリマーは、ポリ(アミノ酸)及び/又はポリ(アクリレート)を含む。

本明細書で使用する場合、用語「両性イオン」及び「両イオン性の」とは、該分子内若しくは部分の異なる位置において、同時に陽電荷及び陰電荷を有する、中性分子又は部分を指す。

Zhangら(Nature Biotechnology、2013年、31巻、6号、553〜557頁)によれば、両イオン性ポリマーから作製されたヒドロゲルは、異物反応に耐性を示す。

ステップ(C)は、ステップ(A)又はステップ(B)のヒドロゲルを、A^x0又はA^x2の99mol%以下がA^x3と反応するように、式(VII)の試薬と反応させるステップを含む。これは、例えば、A^x0又はA^x2に対して、最大でも0.99化学当量の式(VII)の試薬をステップ(A)又は(B)のヒドロゲルと反応させることにより、達成することができる。

0.99を超える化学当量の反応を防ぐため、A^x0又はA^x2に対して最大でも化学当量0.99の量の式(VII)の試薬を使用し得るか、或いは、とりわけ0.99の化学当量超えで使用する場合、反応速度をモニターして、A^x0又はA^x2に対して最大でも0.99の化学当量が反応したときに、反応を中断する。不活性部分Zの立体障害、疎水特性、又は他の特徴などの物理的制約によってもやはり、もっと多くの化学当量が反応に添加された場合でさえも、0.99以下の化学当量しか、A^x0又はA^x2と反応することができないことがあることが理解される。

好ましくは、ステップ(C)は、80mol%以下のA^x0又はA^x2しかA^x3と反応しないように、さらにより好ましくは、60mol%以下のA^x0又はA^x2しかA^x3と反応しないように、さらにより好ましくは、40mol%以下のA^x0又はA^x2しかA^x3と反応しないように、さらにより好ましくは、20mol%以下のA^x0又はA^x2しかA^x3と反応しないように、最も好ましくは、15mol%以下のA^x0又はA^x2しかA^x3と反応しないように、ステップ(A)又はステップ(B)のヒドロゲルを式(VII)の試薬と反応させるステップを含む。

これは、例えば、A^x0又はA^x2に対して、最大でも0.8、0.6、0.4、0.2、又は0.15化学当量の式(VII)の試薬をステップ(A)又は(B)のヒドロゲルとそれぞれ反応させることにより、達成することができる。

より多くの化学当量の反応を防止する方法は、上に記載されている。

ステップ(A)の、及びステップ(C)後の物質A^x0の量の測定に基づいて、反応したA^x0の物質量を、式(1)を用いて算出することができる。
(1) 反応したA^x0の物質量(mmol/g)=(A^x0 ₁-A^x0 ₂)/(A^x0 ₂×MW_Z+1)
(式中、
A^x0 ₁は、ステップ(A)のヒドロゲルの官能基A^x0の物質量(mmol/g)であり、
A^x0 ₂は、ステップ(C)後のヒドロゲルの官能基A^x0の物質量(mmol/g)であり、
MW_Zは、Zの分子量(g/mmol)である)

任意のスペーサー試薬が、共有結合によりステップ(A)のヒドロゲルにコンジュゲートされている場合、反応したA^x2数の計算は、同じように行われる。

ステップ(A)のヒドロゲルの官能基A^x0に対する反応した官能基A^x0の割合は、式(2)によって算出される。
(2) 反応したA^x0のmol%=100×[(A^x0 ₁-A^x0 ₂)/(A^x0 ₂×MW_Z+1)]/A^x0 ₁
(式中、変数は、上記の通り使用される)

一実施形態では、ステップ(C)のZは、ヒドロゲルの表面にコンジュゲートされている。これは、試薬A^x3-Zが大き過ぎてヒドロゲルの細孔又はネットワークに入ることができないよう、上記試薬のサイズ及び構造を選択することにより、達成することができる。したがって、A^x3-Zの最小サイズは、ヒドロゲルの特性に依存する。しかし、当業者であれば、標準的な実験を使用する、例えば固定相としてヒドロゲルを用いるサイズ排除クロマトグラフィーを使用することによって、試薬A^x3-Zがヒドロゲル内に入り込むことができるかどうか、試験する方法を認識している。

VEGF中和プロドラッグに含まれるプロドラッグリンカー部分は、当分野で公知の任意のプロドラッグリンカー部分の構造を有することができる。

好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2005/099768 A2に開示されており、この特許に記載されている通り、得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(A)又は(B)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、対応するVEGF中和薬物のアミン基を介して、部分の残部に結合している、VEGF中和生物活性部分であり、
Xは、R₅-Y₆などのスペーサー部分であり、
Y₁、Y₂は、独立してO、S又はNR₆であり、
Y₃、Y₅は、独立してO又はSであり、
Y₄は、O、NR₆、又はC(R₇)(R₈)-であり、
Y₆は、O、S、NR₆、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素-炭素結合、若しくは自由電子対を含有している任意のヘテロ原子であるか、又は存在しておらず、
R₂、R₃は、互いに独立して、ヒドロゲル、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換又は無置換のヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキシルアルキル、アルキルカルボニル、或いはカルボキサミドアルキルから選択され、
R4は、水素、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換又は無置換ヘテロアリール、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐又は環式アルコキシ、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐又は環式ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ又はヘテロアリールオキシ、シアノ、ハロゲンから選択され、
R₅は、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換若しくは無置換のヘテロアリールから選択され、
R₆は、ヒドロゲル、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換若しくは無置換のヘテロアリールから選択され、
R₇、R₈は、水素、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換又は無置換のヘテロアリール、カルボキシアルキル、アルキルカルボニル、カルボキサミドアルキル、シアノ、或いはハロゲンから独立して選択され、
Wは、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐又は環式アルキル、アリール、置換アリール、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐又は環式ヘテロアルキル、置換又は無置換ヘテロアリールから選択され、
Nuは、求核剤であり、
nは、0又は正の整数であり、
Arは、多置換芳香族炭化水素、又は多置換芳香族複素環である)
を有する。

好ましくは、式(A)及び(B)のR₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇及びR₈は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルから独立して選択される。

好ましくは、式(A)及び(B)のY₆は、C_1〜20アルキル、C_2〜20アルケニル、又はC_2〜20アルキニルである。

好ましくは、式(A)及び(B)のNuは、一級、二級、及び三級アミノ基、チオール、カルボン酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン及び窒素含有ヘテロアリールからなる求核剤の群から選択される。

好ましくは、式(A)及び(B)のWは、-(CR₉R₁₀)_b-であり、式中、R₉及びR₁₀は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルから独立して選択され、bは、1、2、3、4又は5である。

好ましくは、式(A)及び(B)のnは、0、1又は2であり、より好ましくは、nは0又は1であり、最も好ましくは、nは0である。

好ましくは、式(A)及び(B)のArは、

から選択される。

他の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2006/136586 A2に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(C)、(D)、又は(E)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、対応するVEGF中和薬物のアミン基を介して、分子の残部に結合してアミド連結を形成する、VEGF中和生物活性部分であり、
Xは、R13-Y1などのスペーサー部分であり、
Y1は、O、S、NR6、スクシンイミド、マレイミド、不飽和炭素-炭素結合、若しくはヘテロ原子含有自由電子対であるか、又は存在しておらず、
R₁₃は、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換又は無置換のヘテロアリールから選択され、
R₂及びR₃は、水素、アシル基、又はヒドロキシル基用の保護基から独立して選択され、
R₄からR₁₂は、水素、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式アルキル又はヘテロアルキル、アリール、置換アリール、置換又は無置換ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、ハロゲン、カルボキシ、カルボキサミドから独立して選択される)
を有する。

好ましくは、式(C)、(D)及び(E)のR₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉、R₁₀、R₁₁及びR₁₂は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、及びC_2〜6アルキニルから独立して選択される。

好ましくは、式(C)、(D)、及び(E)において、Y1は、C_1〜20アルキル、C_2〜20アルケニル、又はC_2〜20アルキニルである。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2009/095479 A2に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(F)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、アミド連結の形成により、対応するVEGF中和薬物の芳香族アミンを介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
Xは、C(R⁴R^4a)、N(R⁴)、O、C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)、C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-N(R⁶)、N(R⁶)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-O、又はO-C(R⁴R^4a)であり、
X¹は、C又はS(O)であり、
X²は、C(R⁷,R^7a)、又はC(R⁷,R^7a)-C(R⁸,R^8a)であり、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸、R^8aは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択され、
場合により、ペアR^1a/R^4a、R^1a/R^5a、R^4a/R^5a、R^4a/R^5a、R^7a/R^8aの1つ以上は、化学結合を形成し、
場合により、ペアR¹/R^1a、R²/R^2a、R⁴/R^4a、R⁵/R^5a、R⁷/R^7a、R⁸/R^8aの1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、C_3〜7シクロアルキル又は4〜7員のヘテロシクリルを形成し、
場合により、ペアR¹/R⁴、R¹/R⁵、R¹/R⁶、R⁴/R⁵、R⁷/R⁸、R²/R³の1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、環Aを形成し、
場合により、R³/R^3aは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、4〜7員の複素環を形成し、
Aは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、及び8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択されるが、
但し、R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸又はR^8aの水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(F)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする)
を有する。

場合により、式(F)の可逆性プロドラッグリンカー部分はさらに置換されているが、但し、部分

の窒素上の水素は置きかえられていないこと、並びにR³及びR^3aは、互いに独立してHであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2011/012721 A1及びWO 2011/012722 A1に開示されており、これらの特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(G)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、アミド連結の形成により、対応するVEGF中和薬物の芳香族アミンを介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
X¹は、C(R¹R^1a)、又はC_3〜7シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、又は8〜11員のヘテロビシクリルから選択される環式フラグメントであり、
この場合、
X¹が環式フラグメントである場合、前記環式フラグメントは、2個の隣接環原子を介してL¹に組み入れられており、アミド結合の炭素原子に隣接しているX¹の環原子もやはり炭素原子であり、
X²は、化学結合であるか、又はC(R³R^3a)、N(R³)、O、C(R³R^3a)-C(R⁴R^4a)、C(R³R^3a)-N(R⁴)、N(R³)-C(R⁴R^4a)、C(R³R^3a)-O、若しくはO-C(R³R^3a)から選択され、
この場合、
X¹が環式フラグメントである場合、X²は、化学結合、C(R³R^3a)、N(R³)、又はOであり、
場合により、X¹が環式フラグメントであり、且つX²がC(R³R^3a)である場合、L¹内のX¹フラグメントとX²フラグメントの順序は変更されていてもよく、環式フラグメントは、2個の隣接環原子を介してL¹に組み入れられており、
R¹、R³、及びR⁴は、H、C_1〜4アルキル、及び-N(R⁵R^5a)からなる群から独立して選択され、
R^1a、R²、R^3a、R^4a、及びR^5aは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択され、
R⁵は、C(O)R⁶であり、
R⁶は、C_1〜4アルキルであり、
場合により、ペアR^1a/R^4a、R^3a/R^4a、又はR^1a/R^3aの1つは、化学結合を形成するが、
但し、R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、又はR⁶の水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(G)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする)
を有する。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2011/089214 A1に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(H)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、カーバメート連結の形成により、対応するVEGF中和薬物の芳香族ヒドロキシル(-OH)を介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
R¹は、C_1〜4アルキル、ヘテロアルキル、C_3〜7シクロアルキル、及び

からなる群から選択され、
R²、R^2a、R³、及びR^3aは、水素、置換若しくは無置換の直鎖状、分岐若しくは環式C_1〜4アルキル、又はヘテロアルキルから独立して選択され、
各dは、独立して、2、3又は4であるが、
但し、R¹、R²、R^2a、R³、又はR^3aの水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(H)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする)
を有する。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2011/089216 A1に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(J)の構造

[式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、アミド連結の形成により、対応する薬物の脂肪族アミンを介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
X₁は、O、S、又はCH-R^1aから選択され、
R¹及びR^1aは、H、OH、CH₃から独立して選択され、
R²、R^2a、R⁴、及びR^4aは、H及びC_1〜4アルキルから独立して選択され、
R³及びR^3aは、H、C_1〜4アルキル、及びR⁵から独立して選択され、
R⁵は、

(式中、
点線は、該部分の残部に結合していることを示している)
から選択されるが、
但し、R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、及びR⁵の水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(J)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする]
を有する。

好ましくは、式(J)のR³はHであり、式(J)のR^3aはR⁵である。

好ましくは、式(J)のR⁴/R^4aの1つはHである。

場合により、式(J)のペアR³/R^3a、R⁴/R^4a、R³/R⁴の1つ以上は、C_3〜7シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、又は8〜11員のヘテロビシクリルから選択される1つ以上の環式フラグメントを独立して形成していてもよい。

場合により、式(J)のR³、R^3a、R⁴、及びR^4aは、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、フェニル、4〜7員の複素環又はハロゲンによりさらに置換されている。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、WO 2011/089215 A1に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(K)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、アミド連結の形成により、対応するVEGF中和薬物の芳香族アミンを介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
R¹、R^1a、R²、R³、R^3a、R⁴、及びR^4aは、H及びC_1〜4アルキルから独立して選択され、
場合により、R¹、R^1a、R²、R³、R^3a、R⁴及びR^4aの任意の2つは、C_3〜7シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、又は8〜11員のヘテロビシクリルから選択される1つ以上の環式フラグメントを独立して形成してもよく、
場合により、R¹、R^1a、R²、R³、R^3a、R⁴及びR^4aは、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜C6アルキニル、C_3〜7シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、又は8〜11員のヘテロビシクリルを含む基から選択される置換基によりさらに置換されているが、
但し、R¹、R^1a、R²、R³、R^3a、R⁴、及びR^4aの水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(J)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする)
を有する。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、PCT/EP2012/065748に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(L)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分への結合を示しており、
Dは、カルボン酸エステル連結の形成により、対応するVEGF中和薬物のカルボン酸基(-(C=O)-OH)を介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
R¹は、無置換アルキル、置換アルキル、無置換フェニル、置換フェニル、無置換ナフチル、置換ナフチル、無置換インデニル、置換インデニル、無置換インダニル、置換インダニル、無置換テトラリニル、置換テトラリニル、無置換C_3〜10シクロアルキル、置換C_3〜10シクロアルキル、4〜7員の無置換ヘテロシクリル、4〜7員の置換ヘテロシクリル、8〜11員の無置換ヘテロビシクリル、及び8〜11員の置換ヘテロビシクリルの群から選択され、
R²は、H、無置換アルキル、及び置換アルキルから選択され、
R³及びR⁴は、H、無置換アルキル、及び置換アルキルからなる群から独立して選択され、
eは、0又は1であり、
場合により、R¹及びR³は、それらが結合している原子と一緒になって環Aを形成し、
Aは、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員の脂肪族ヘテロシクリル、及び8〜11員の脂肪族ヘテロビシクリルからなる群から選択され、この場合、Aは無置換であるか、又は置換されており、
Qは、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、又はC_2〜50アルキニルを含む基から選択され、このフラグメントは、-NH-、-N(C_1〜4アルキル)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)NH-、-C(O)N(C_1〜4アルキル)-、-O-C(O)-、-S(O)-、-S(O)₂-、4〜7員のヘテロシクリル、フェニル、又はナフチルから選択される1つ以上の基により場合により中断されている)
を有する。

別の好ましいプロドラッグリンカーは、EP12165516に開示されており、この特許に記載されている通り得ることができる。したがって、好ましい可逆性プロドラッグリンカー-VEGF中和生物活性部分は、式(M)の構造

(式中、
点線は、プロドラッグの残部、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Dは、エステル又はカーバメート連結の形成により、対応するVEGF中和薬物のヒドロキシル基を介して分子の残部に結合しているVEGF中和生物活性部分であり、
Yは、-C(R¹)(R^1a)-又は-N(R¹)-であり、
Xは、-C(R⁴)(R^4a)-、-N(R⁴)-、-O-、-C(R⁴)(R^4a)-C(R⁵)(R^5a)-、-C(R⁴)(R^4a)-N(R⁶)-、-N(R⁶)-C(R⁴)(R^4a)-、-C(R⁴)(R^4a)-O-、-O-C(R⁴)(R^4a)-、-C(O)-N(R⁶)-、又は-N(R⁶)-C(O)-であり、
X¹は、

であり、
X²は、-C(R⁷)(R^7a)-又は-C(R⁷)(R^7a)-C(R⁸)(R^8a)-であり、
X³は、=O、=S、又は=N-CNであり、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸、R^8aは、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、C_1〜20ヘテロアルキル、及びY₁-Tからなる群から独立して選択され、また独立して存在せず、ペアR^1a/R^4a、R^1a/R^5a、R^4a/R^5a、R^7a/R^8aの1つ以上は存在しておらず、且つそれらが結合している対応する炭素原子は、シス二重結合を形成し、
Y¹は、化学結合、又はC_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニルであり、
Tは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、又は8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、この場合、Tは、同一又は異なる1つ以上のR⁹により場合により置換されており、
R⁹は、ハロゲン、-CN、オキソ(=O)、-C(O)OH、-OH、-S(O)₂NH₂、-S(O)NH₂、-S(O)₂OH、-S(O)OH、-SH、-NH₂、-NO₂、C_1〜6アルキル、又はC_1〜10ヘテロアルキルであり、
場合により、ペアR¹/R^1a、R¹/R⁴、R¹/R⁶、R¹/R⁵、R²/R^2a、R²/R³、R⁴/R^4a、R⁴/R⁵、R⁵/R^5a、R⁷/R^7a、R⁷/R⁸、R⁸/R^8aの1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、環Tを形成し、
場合により、R³/R^3aは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、4〜7員の複素環を形成するが、
但し、R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸又はR^8aの水素の1つは、VEGF中和プロドラッグの残部を含む式(M)の部分を、すなわち担体部分又は任意のスペーサー部分に結合するための結合により置きかえられていることを条件とする)
を有する。

より好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、式(F)である可逆性プロドラッグリンカー部分-VEGF中和生物活性部分を含む。

さらにより好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、式(F)の可逆性プロドラッグリンカー部分-VEGF中和生物活性部分を含んでおり、プロドラッグの残部、すなわち担体、又は担体に結合している任意のスペーサーへの結合は、XのR⁴又は式(F)のR³を介して、最も好ましくは式(F)のR⁴を介して起こる。

さらにより好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、式(F-i)の部分

(式中、
点線は、担体又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、X¹、X²、及びDは、式(F)と同様に使用され、
場合により、式(F-i)の部分はさらに置換されているが、但し、式(F-i)中のアスタリスクが付いているヒドロゲルは、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む。

好ましくは、式(F-i)のX¹は、Cである。

一実施形態では、式(F-i)のX²は、C(R⁷R^7a)である。

別の実施形態では、式(F-i)のX²は、C(R⁷R^7a)-C(R⁸R^8a)である。

好ましくは、式(F-i)のR¹は、Hである。

好ましくは、式(F-i)のR^1aは、Hである。

好ましくは、式(F-i)のR¹及びR^1aは、共にHである。

好ましくは、式(F-i)のR²は、Hである。

好ましくは、式(F-i)のR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-i)のR²及びR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-i)のR³は、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましくは、式(F-i)のR^3aは、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましい一実施形態では、式(F-i)のR³及びR^3aは、共にHである。

別の好ましい実施形態では、式(F-i)のR³はHであり、式(F-i)のR^3aはメチルである。

別の好ましい実施形態では、式(F-i)のR³及びR^3aは、共にメチルである。

好ましくは、式(F-i)のDは、ラニビズマブである。

好ましくは、式(F-i)の担体は、ヒドロゲルであり、より好ましくはPEGをベースとするヒドロゲルである。

好ましい実施形態では、VEGF中和プロドラッグは、式(f-ii)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、X²、及びDは、式(F)において定義されている通りに使用され、
R¹⁰は、H及びC_1〜6アルキルから選択され、
SP⁰は、スペーサー部分であり、
式(F-ii)の部分は、場合によりさらに置換されているが、但し、式(F-ii)中のアスタリスクが付いているヒドロゲルは、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む。

一実施形態では、式(F-ii)のX²は、C(R⁷R^7a)である。

別の実施形態では、式(F-ii)のX²は、C(R⁷R^7a)-C(R⁸R^8a)である。

好ましくは、式(F-ii)のR¹は、Hである。

好ましくは、式(F-ii)のR^1aは、Hである。

好ましくは、式(F-ii)のR¹及びR^1aは、共にHである。

好ましくは、式(F-ii)のR²は、Hである。

好ましくは、式(F-ii)のR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-ii)のR²及びR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-ii)のR³は、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましくは、式(F-ii)のR^3aは、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましい一実施形態では、式(F-ii)のR³及びR^3aは、共にHである。

別の好ましい実施形態では、式(F-ii)のR³はHであり、式(F-ii)のR^3aはメチルである。

別の好ましい実施形態では、式(F-ii)のR³及びR^3aは、共にメチルである。

一実施形態では、式(F-ii)のR¹⁰は、Hである。

別の好ましい実施形態では、式(F-ii)のR¹⁰は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はtert-ブチルである。より好ましくは、式(F-ii)のR¹⁰は、メチル、エチル、プロピル、又はイソプロピルである。さらにより好ましくは、式(F-ii)のR¹⁰は、メチル又はエチルであり、最も好ましくは、式(F-ii)のR¹⁰はメチルである。

好ましくは、式(F-ii)のSP⁰は、C_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルから選択されこれらのC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、同一又は異なる1つ以上のR^a10により場合により置換されており、且つC_1〜50アルキル、C_2〜50アルケニル、及びC_2〜50アルキニルは、T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R^a11)-、-S(O)₂N(R^a11)-、-S(O)N(R^a11)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R^a11)S(O)₂N(R^a11a)-、-S-、-N(R^a11)-、-OC(O)R^a11、-N(R^a11)C(O)-、-N(R^a11)S(O)₂-、-N(R^a11)S(O)-、-N(R^a11)C(O)O-、-N(R^a11)C(O)N(R^a11a)-、及び-OC(O)N(R^a11R^a11a)からなる群から選択される1つ以上の基により、場合により中断されており、
Tは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、又は8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、この場合、Tは、同一又は異なる1つ以上のR^a10により場合により置換されており、
R^a10は、ハロゲン、CN、オキソ(=O)、COOR^a12、OR^a12、C(O)R^a12、C(O)N(R^a12R^a12a)、S(O)₂N(R^a12R^a12a)、S(O)N(R^a12R^a12a)、S(O)₂R^a12、S(O)R^a12、N(R^a12)S(O)₂N(R^a12aR^a12b)、SR^a12、N(R^a12R^a12a)、NO₂、OC(O)R^a12、N(R^a12)C(O)R^a12a、N(R^a12)S(O)₂R^a12a、N(R^a12)S(O)R^a12a、N(R^a12)C(O)OR^a12a、N(R^a12)C(O)N(R^a12aR^a12b)、OC(O)N(R^a12R^a12a)、又はC_1〜6アルキルであり、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されており、
R^a11、R^a11a、R^a12、R^a12a、R^a12bは、H又はC_1〜6アルキルからなる群から独立して選択され、C_1〜6アルキルは、同一又は異なる1つ以上のハロゲンにより場合により置換されている。

好ましくは、式(F-ii)のSP⁰は、C_1〜20アルキルであり、このC_1〜20アルキルは、-O-及び-C(O)N(R^1aa)-から独立して選択される1つ以上の基により場合により中断されており、このC_1〜20アルキル鎖は、OH及び-C(O)N(R^1aaR^1aaa)から独立して選択される1つ以上の基により場合により置換されており、R^1aa、R^1aaaは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択される。

好ましくは、式(F-ii)のSP⁰は、14g/mol〜750g/molの範囲の分子量を有する。

好ましくは、式(F-ii)のSP⁰は、

から選択される末端基を介して、担体に結合している。

式(F-ii)のSP⁰がそうした末端基を有する場合、そうした末端基を除いて算出すると、SP⁰が14g/mol〜500g/molの範囲の分子量を有するのがさらに好ましい。

好ましくは、式(F-ii)のDは、ラニビズマブである。

好ましくは、式(F-ii)の担体は、ヒドロゲルであり、より好ましくはPEGをベースとするヒドロゲルである。

さらにより好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、式(F-iiia)又は(F-iiib)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R²、R^2a、R³、R^3a、R⁷、R^7a、R⁸、R^8a、X²、及びDは、式(F)において定義されている通りに使用され、
R¹⁰及びSP⁰は、式(F-ii)において定義されている通りに使用され、
式(F-iiia)又は(F-iiib)の部分は、場合によりさらに置換されているが、但し、式(F-iiia)及び(F-iiib)中のアスタリスクが付いている水素は、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のSP⁰は、C_1〜20アルキルであり、このC_1〜20アルキルは、-O-及び-C(O)N(R^1aa)-から独立して選択される1つ以上の基により場合により中断されており、このC_1〜20アルキル鎖は、OH及び-C(O)N(R^1aaR^1aaa)から独立して選択される1つ以上の基により場合により置換されており、R^1aa、R^1aaaは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択される。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のSP⁰は、14g/mol〜750g/molの範囲の分子量を有する。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のSP⁰は、

から選択される末端基を介して、担体に結合している。

式(F-iiia)又は(F-iiib)のSP⁰がそうした末端基を有する場合、そうした末端基を除いて算出すると、SP⁰が14g/mol〜500g/molの範囲の分子量を有するのがさらに好ましい。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のR²は、Hである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のR²及びR^2aは、Hである。

好ましくは、式(F-iii)のR³は、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましくは、式(F-iii)のR^3aは、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましい一実施形態では、式(F-iii)のR³及びR^3aは、共にHである。

別の好ましい実施形態では、式(F-iii)のR³はHであり、式(F-iii)のR^3aはメチルである。

別の好ましい実施形態では、式(F-iii)のR³及びR^3aは、共にメチルである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のR⁷は、Hである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のR^7aは、Hである。

好ましくは、式(F-iiib)のR⁸は、Hである。

好ましくは、式(F-iiib)のR^8aは、Hである。

好ましくは、式(F-iiib)のR⁸及びR^8aは、共にHである。

好ましくは、式(F-iiia)のR¹⁰は、Hである。

好ましくは、式(F-iiib)のR¹⁰は、メチル、エチル、又はプロピルである。最も好ましくは、式(F-iiib)のR¹⁰は、メチルである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)のDは、ラニビズマブである。

好ましくは、式(F-iiia)又は(F-iiib)の担体は、ヒドロゲルであり、より好ましくはPEGをベースとするヒドロゲルである。

さらにより好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、式(F-iva)又は(F-ivb)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R³及びR^3aは、式(I)において定義されている通りに使用され、
R^10bは、C_1〜6アルキルであり、
式(F-iva)又は(F-ivb)の部分は、場合により、さらに置換されているが、但し、アスタリスクが付いている水素は、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む。

好ましくは、式(F-iva)及び(F-ivb)のSP⁰は、C_1〜20アルキルであり、このC_1〜20アルキルは、-O-及び-C(O)N(R^1aa)-から独立して選択される1つ以上の基により場合により中断されており、このC_1〜20アルキル鎖は、OH及び-C(O)N(R^1aaR^1aaa)から独立して選択される1つ以上の基により場合により置換されており、R^1aa、R^1aaaは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択される。

好ましくは、式(F-iva)及び(F-ivb)のSP⁰は、14g/mol〜750g/molの範囲の分子量を有する。

好ましくは、式(F-iva)及び(F-ivb)のSP⁰は、

から選択される末端基を介して、担体に結合している。

式(F-iva)及び(F-ivb)のSP⁰が、そうした末端基を有する場合、そうした末端基を除いて算出すると、SP⁰が14g/mol〜500g/molの範囲の分子量を有するのがさらに好ましい。

好ましくは、式(F-iva)又は(F-ivb)のR³は、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましくは、式(F-iva)又は(F-ivb)のR^3aは、H、又はメチル、エチル若しくはプロピルである。

好ましい一実施形態では、式(F-iva)又は(F-ivb)のR³及びR^3aは、共にHである。

別の好ましい実施形態では、式(F-iva)又は(F-ivb)のR³はHであり、式(F-iva)又は(F-ivb)のR^3aはメチルである。

別の好ましい実施形態では、式(F-iva)又は(F-ivb)のR³及びR^3aは、共にメチルである。

好ましくは、式(F-ivb)のR^10bは、メチル、エチル、又はプロピルである。最も好ましくは、R^10bは、メチルである。

好ましくは、式(F-iva)及び(F-ivb)のDは、ラニビズマブである。

好ましくは、式(F-iva)及び(F-ivb)の担体は、ヒドロゲルであり、より好ましくはPEGをベースとするヒドロゲルである。

一実施形態では、本VEGF中和プロドラッグは、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、抗VEGF抗体フラグメント、DARPin、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、同族VEGFR受容体及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に結合する抗VEGFR抗体フラグメントからなる薬物の群から選択される生物活性部分を結合形態で含む。

好ましい一実施形態では、本VEGF中和プロドラッグは、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、DARPin、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤からなる薬物の群から選択される生物活性部分を結合形態で含む。

好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、MP0112、KH902、ESBA1008、AL 39324、ALG-1001、及びベバシラニブ、並びに/又はそれらのフラグメントからなる群から選択される生物活性部分を結合形態で含む。

より好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、及びベバシラニブ、並びに/又はそれらのフラグメントからなる群から選択される。

最も好ましくは、本VEGF中和プロドラッグは、ラニビズマブである。

一実施形態では、本発明の医薬組成物により処置される眼状態は、眼血管新生を特徴とする疾患である。

眼内血管新生は、好ましくは視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、黄斑変性、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性黄斑浮腫、脈管性網膜症、網膜変性、後水晶体線維増殖、網膜芽細胞腫、黄斑変性の未熟児網膜症、角膜移植片血管新生、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、病的近視、眼腫瘍、ブドウ膜炎、目の炎症性疾患、及び増殖性硝子体網膜症からなる群から選択される。

一実施形態では、本医薬組成物は、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、抗VEGF抗体フラグメント、DARPin、アンチカリン、リポカリン、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、同族VEGFR受容体及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に結合する抗VEGFR抗体フラグメントを含む薬物クラスのリストから選択される1種以上の薬物を、その/それらの遊離形態でさらに含む。

好ましい実施形態では、本医薬組成物は、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、DARPin、アンチカリン、リポカリン、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤を含む薬物クラスのリストから選択される1種以上の薬物を、その/それらの遊離形態でさらに含む。

好ましくは、本医薬組成物は、ステロイド、抗炎症化合物、抗生物質及び抗ウイルス剤、抗真菌剤、又は抗血管形成化合物とすることができる、1つ以上の活性成分をさらに含む。この活性成分は、例えば、メトトレキサート、レチノイン酸、アスピリン、ジクロフェナク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトロラク、ナプロキセン、ウプロフェン、デキサメサゾン、コルチゾン、フルオシノロン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、又はトリアムシノロンとすることができる。

好ましい一実施形態では、本医薬組成物は、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、形質転換成長因子アルファ(TGFa)、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF)、アンジオゲニン、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-12、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン-I、Del-I、ホリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、肝細胞成長因子(HGF)、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン(PTN)、プログラニュリン、プロリフェリン、腫瘍破壊因子-アルファ(TNF-アルファ)、アンジオアレスチン、アンジオスタチンプラスミノーゲンフラグメント、抗血管新生性抗トロンビン(antiangiogenic anti-thrombin)III、軟骨由来阻害剤(CDI)、CDS9補体フラグメント、エンドスタチンコラーゲンXVIIIフラグメント、フィブロネクチンフラグメント、gro-ベータ、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖フラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、インターフェロンアルファ/ベータ/ガンマ、インターフェロン誘導タンパク質(IP-IO)、クリングスSプラスミノーゲンフラグメント、メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)、2-メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、血小板因子-4(PF4)、プロラクチン16kDフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、レチノイド、テトラヒドロコルチゾル-S、トロンボスポンジン-I(TSP-I)、バスキュロスタチン、バソスタチンカルレチクリンフラグメント、プロスタグランジン受容体、成長ホルモン、インスリン様成長因子-I(IGF-I)、スフィンゴシン-1-ホスフェート、因子D、RTP801、補体の阻害剤、α₂アドレナリン作動性アゴニスト、mTOR、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、水晶体上皮細胞由来成長因子(LEDGF)、桿体由来錐体生存能力因子(RdCVF)、色素上皮由来因子(PEDF)、好中球活性化タンパク質、単球走化性タンパク質、マクロファージ炎症性タンパク質、小型誘導性分泌(SIS)タンパク質、血小板因子、血小板塩基タンパク質、黒色腫増殖刺激活性、上皮成長因子、神経成長因子、骨形態形成タンパク質、骨成長軟骨誘導因子、インターロイキン、インターロイキン阻害剤、インターロイキン受容体、造血因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インヒビン、及びアクチビンを含む群から選択される1つ以上のタンパク質の活性の1つ以上のモジュレーターを、その/それらの遊離形態でさらに含む。

補体の好ましい阻害剤は、C1阻害剤、C3阻害剤、及びC5阻害剤である。

成長因子の好ましい阻害剤は、血小板由来成長因子(PDGF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、水晶体上皮細胞由来成長因子(LEDGF)、桿体由来錐体生存能力因子(RdCVF)、及び色素上皮由来因子(PEDF)である。

好ましい骨成長軟骨誘導因子は、骨成長軟骨誘導因子アルファ及び骨成長軟骨誘導因子ベータである。

好ましい造血因子は、エリスロポエチンである。

別の実施形態では、本医薬組成物は、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、DARPin、アンチカリン、リポカリン、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤からなる群から選択される生物活性部分を結合形態で含んでいる、1種以上のプロドラッグをさらに含む。

別の好ましい実施形態では、本医薬組成物は、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、酸性線維芽細胞成長因子(aFGF)、形質転換成長因子アルファ(TGFa)、形質転換成長因子ベータ(TGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF)、アンジオゲニン、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-8(IL-8)、インターロイキン-12、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオポエチン-I、Del-I、ホリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、肝細胞成長因子(HGF)、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、プレイオトロフィン(PTN)、プログラニュリン、プロリフェリン、腫瘍破壊因子-アルファ(TNF-アルファ)、アンジオアレスチン、アンジオスタチンプラスミノーゲンフラグメント、抗血管新生性抗トロンビンIII、軟骨由来阻害剤(CDI)、CDS9補体フラグメント、エンドスタチンコラーゲンXVIIIフラグメント、フィブロネクチンフラグメント、gro-ベータ、ヘパリナーゼ、ヘパリン六糖フラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、インターフェロンアルファ/ベータ/ガンマ、インターフェロン誘導タンパク質(IP-IO)、クリングスSプラスミノーゲンフラグメント、メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMP)、2-メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、血小板因子-4(PF4)、プロラクチン16kDフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質(PRP)、レチノイド、テトラヒドロコルチゾル-S、トロンボスポンジン-I(TSP-I)、バスキュロスタチン、バソスタチンカルレチクリンフラグメント、プロスタグランジン受容体、成長ホルモン、インスリン様成長因子-I(IGF-I)、スフィンゴシン-1-ホスフェート、因子D、RTP801、補体の阻害剤、α₂アドレナリン作動性アゴニスト、mTOR、毛様体神経栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、水晶体上皮細胞由来成長因子(LEDGF)、桿体由来錐体生存能力因子(RdCVF)、色素上皮由来因子(PEDF)、好中球活性化タンパク質、単球走化性タンパク質、マクロファージ炎症性タンパク質、小型誘導性分泌(SIS)タンパク質、血小板因子、血小板塩基タンパク質、黒色腫増殖刺激活性、上皮成長因子、神経成長因子、骨形態形成タンパク質、骨成長軟骨誘導因子、インターロイキン、インターロイキン阻害剤、インターロイキン受容体、造血因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インヒビン、及びアクチビンを含む群から選択される1種以上のタンパク質の活性モジュレーターである生物活性部分を結合形態で含んでいる1種以上の追加プロドラッグをさらに含む。

一実施形態では、1種以上の追加薬物は、プロドラッグの形態にある。

本発明の医薬組成物は、1種以上の賦形剤を含む。賦形剤は、緩衝剤、等張性調節剤、保存剤、安定剤、吸着防止剤、酸化保護剤、増粘剤/粘度向上剤、又は他の補助剤に分類することができる。一部の場合、これらの成分は、二重又は三重の機能を有することがある。本医薬組成物は、以下からなる群から選択される、1種以上の賦形剤を含むことができる。
(i) 緩衝剤:pHを所望の範囲に維持するための生理的に許容される緩衝液(リン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジンナトリウム、クエン酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ピルビン酸ナトリウムなど)。Mg(OH)₂又はZnCO₃などの制酸剤も使用することができる。緩衝能力は、pH安定性に最も影響を受ける条件に合致するよう調節することができる。
(ii) 等張性調節剤:注射側における浸透圧差により、細胞損傷から生じる恐れがある痛みを最小化するためのもの。グリセリン及び塩化ナトリウムが例である。有効濃度は、浸透圧測定法によって決定することができる。
(iii) 保存剤及び/又は抗菌剤:注射の際に患者が感染するリスクを最小化するためのもの。典型的な保存剤には、m-クレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロゾル(thimerosol)、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾール、及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。
(iv) 安定剤:安定化は、タンパク質安定化力の強化によって、変性状態の不安定化によって、又は賦形剤のタンパク質への直接結合によって達成される。安定剤は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのポリオール、リン酸カリウム、硫酸ナトリウムなどの塩、EDTA、ヘキサホスフェートなどのキレート剤、二価金属イオン(亜鉛、カルシウムなど)などの配位子、他の塩、又はフェノール誘導体などの有機分子とすることができる。さらに、シクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、PEG若しくはPVP、又はプロタミン、又はHSAなどのオリゴマー又はポリマーを使用することができる。
(v) 吸着防止剤:主に、イオン性若しくは非イオン性界面活性剤、又は他のタンパク質、又は可溶性ポリマーを使用し、例えば医薬組成物の容器の内面を競合的にコーティングするか、又はその内面に吸着する。適切な界面活性剤は、例えば、アルキル硫酸塩(ラウリル硫酸アンモニウム及びラウリル硫酸ナトリウムなど)、アルキルエーテル硫酸塩(ラウレス硫酸ナトリウム及びミレス硫酸ナトリウムなど)、スルホン酸塩(スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、パーフルオロオクタンスルホン酸塩、パーフルオロブタンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩など)、リン酸塩(アルキルアリールエーテルリン酸塩及びアルキルエーテルリン酸塩など)、カルボン酸塩(脂肪酸塩(石鹸)又はステアリン酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、パーフルオロノナン酸塩、パーフルオロオクタン酸塩など)、オクテニジン二塩酸塩、四級アンモニウム陽イオン(臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、ポリエトキシ化獣脂アミン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、5-ブロモ-5-ニトロ-1,3-ジオキサン、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウムなど)、両イオン性物(zwitterionic)(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、アミノ酸、イミノ酸、コカミドプロピルベタイン、レシチンなど)、脂肪アルコール(セチルアルコール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコールなど)、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル(オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテルなど)、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル(デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシドなど)、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル(Triton X-100など)、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル(ノノキシノール-9など)、グリセロールアルキルエステル(グリセリルラウレートなど)、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル(ポリソルベートなど)、ソルビタンアルキルエステル、コカミドMEA及びコカミドDEA、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロックコポリマー(ポロキサマー(Pluronic F-68)、PEGドデシルエーテル(Brij 35)、ポリソルベート20及び80など)である。他の吸収防止剤は、デキストラン、ポリエチレングリコール、PEG-ポリヒスチジン、BSA及びHAS、並びにゼラチンである。選択される賦形剤の濃度及びタイプは、回避すべき影響に依存するが、通常、界面活性剤の単層が、CMC値のすぐ上の界面において形成される。
(vi) 凍結乾燥保護剤及び/又は凍結防止剤:賦形剤は、凍結又は噴霧乾燥中、水素結合の破壊及び水分除去により起こる不安定化効果を無効化することができる。この目的のために、糖及びポリオールを使用することができるが、相当する正の効果が、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒、及び他のペプチドに関しても観察されている。トレハロースは、水分によって誘発される凝集を低減するのに特に有効であり、同様に、タンパク質の疎水基が水に暴露されることにより起こり得る熱安定性も改善する。マンニトール及びスクロースは、凍結乾燥保護剤/凍結防止剤として単独又は互いに組み合わせて使用することができ、この場合、マンニトール:スクロースの比がより高いと、凍結乾燥済みケーキの物理的安定性が強化されることが知られている。マンニトールは、トレハロースと組み合わせることもできる。トレハロースは、ソルビトールとも組み合わせることができ、又はソルビトールを唯一の保護剤として使用することができる。デンプン又はデンプン誘導体も使用することができる。
(vii)酸化保護剤:抗酸化剤(アスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン(PEI)、没食子酸プロピル、ビタミンE、キレート剤(クエン酸、EDTA、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸など(such aus))など)。
(viii) 展着剤又は拡散剤:以下に限定されないが、結合組織の細胞間隙に見いだされるヒアルロン酸、多糖など、間質間隙における細胞外マトリックスの成分の加水分解によって、結合組織の透過性を調節するもの。以下に限定されないが、ヒアルロニダーゼなどの展着剤は、細胞外マトリックスの粘度を一時的に低下させて、被注射薬物の拡散を促進する。
(ix) 他の補助剤:湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼなど。塩酸及び水酸化ナトリウムなどの酸及び塩基が、製造中のpH調節のために必要な補助剤である。

本医薬組成物は、乾燥、液状、又は懸濁医薬組成物の形態で提供することができる。

乾燥、液状、又は懸濁形態のいずれかの医薬組成物を、単回又は多回用量の医薬組成物として提供することができる。

本発明の一実施形態では、乾燥、液状又は懸濁医薬組成物は、それを供給する容器が1回分の医薬用量を含有していることを意味する、単回用量として提供される。

別の実施形態では、乾燥、液状又は懸濁医薬組成物は、それを供給する容器が、2回分以上の治療用量を含有している、すなわち多回用量分の組成物が少なくとも2回分の用量を含有するしていることを意味する、多回用量分の医薬組成物である。こうした多回用量の医薬組成物は、それを必要とする様々な患者に使用することができ、又は1人の患者に使用することができ、この場合、初回用量分を服用後、残りの用量は、必要となるまで貯蔵される。

好ましくは、本医薬組成物は単回用量として提供される。

本発明の別の態様では、本医薬組成物は容器中に入っている。乾燥、液状又は懸濁医薬組成物に適する容器は、例えば、シリンジ、バイアル、ストッパー及びシール付きバイアル、アンプル、並びにカートリッジである。特に、乾燥、液状、又は懸濁医薬組成物は、シリンジ中で提供される。医薬組成物が、乾燥医薬組成物である場合、容器は、好ましくは二重チャンバーシリンジである。このような実施形態では、前記乾燥医薬組成物は、二重チャンバーシリンジの第1のチャンバー中で提供され、再構成用溶液が、この二重チャンバーシリンジの第2のチャンバー中で提供される。

それを必要とする患者に乾燥医薬組成物を適用する前に、この乾燥組成物は再構成される。乾燥組成物が提供される容器(バイアル、シリンジ、二重チャンバーシリンジ、アンプル、及びカートリッジ中など)中で、再構成を行うことができる。再構成は、所定量の再構成用溶液を乾燥組成物に添加することによって行われる。再構成用溶液は、水又は緩衝液などの滅菌液体であり、これらは、保存剤及び/又は抗菌剤(例えば、ベンジルアルコール及びクレゾールなど)などのさらなる添加剤を含有してもよい。好ましくは、再構成用溶液は滅菌水である。乾燥医薬組成物が再構成される場合、「再構成済み医薬組成物」又は「再構成済み医薬組成物」又は「再構成済み組成物」と呼ばれる。

好ましくは、本医薬組成物は液状又は懸濁液である。

本発明の別の態様は、パーツのキットである。

投与器具が、単に、皮下シリンジである場合、このキットは、シリンジ、針及びシリンジと一緒に使用する乾燥医薬組成物を含む容器、及び再構成用溶液を含む第2の容器を含むことができる。

医薬組成物が、液状又は懸濁医薬組成物である場合、このキットは、シリンジ、針及びシリンジと一緒に使用する液状又は懸濁医薬組成物を含む容器を含むことができる。

材料及び方法
ルセンティス及びラニビズマブは、以下の実施例全体にわたり、同じ意味で使用される。

材料
アミノ4-arm PEG5000を、JenKem Technology、Beijing、中国から得た。Cithrol(商標)DPHSを、Croda International Pic、Cowick Hall、英国から得た。

cis-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸を、TCI EUROPE N.V.、Boerenveldseweg 6-Haven 1063、2070 Zwijndrecht、ベルギーから得た。

イソプロピルマロン酸を、ABCR GmbH & Co. KG、76187 Karlsruhe、ドイツから得た。

N-(3-マレイミドプロピル)-39-アミノ-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-ドデカオキサ-ノナトリアコンタン酸ペンタフルオロフェニルエステル(Mal-PEG12-PFE)を、Biomatrik Inc.、Jiaxing、中国から得た。

Oxyma pure、HATU、HOAt、HOBt、PyBOP、TBTU、COMU、Fmoc-L-Asp(OBzl)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-His(OTrt)-OH、Fmoc-Ado-OH、及びRinkアミド樹脂は、Merck Biosciences GmbH、Schwalbach/Ts、ドイツから購入した。

Boc-Lys(Boc)-OSuは、Senn chemicals AG、Dielsdorf、スイスから購入した。Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OHは、Bachem、Bubendorf、スイスから購入した。Fmoc-N-Me-L-Asp(OBzl)-OHは、Peptides International、Louisville、KY、米国から購入した。1,9-ビス-Boc-1,5,9-トリアザノナンは、PolyPeptide Laboratories A/S、Hillerod、デンマークから購入した。

(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネートは、Chemzon Scientific Inc.、Lachine、QC、カナダから購入した。

α-[3-(o-ピリジルジスルフィド)プロパノイルアミド]-ω-スクシニミジルエステルドデカ(エチレングリコール)(OPSS-PEG₁₂-NHS)は、Iris Biotech GmbH、Marktredwitz、ドイツから購入した。

他の化学品はすべて、Sigma-ALDRICH Chemie GmbH、Taufkirchen、ドイツからのものであった。

方法:
反応は、Sigma-ALDRICH Chemie GmbH、Taufkirchen、ドイツから購入したモレキュラーシーブ上で貯蔵した乾燥溶媒(DCM、THF、ACN、DMF、ジオキサン、MeOH、トルエン)を用いて行った。一般に、反応物は室温で撹拌し、HPLC/MS又はTLCによってモニターした。

RP-HPLCは、それぞれ、Waters 600又は2535 HPLC System及びWaters 2487又は2489吸光度検出器を接続した、100x20mm若しくは100x40mm C18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 5μカラム(Dr.Maisch、Ammerbuch、ドイツ)又はXBridge BEH300 C18 Prep 10μm 30x150mm若しくは5μm 10x150mm(Waters、Eschborn、ドイツ)上で行った。溶液A(H₂O中の0.1%TFA)と溶液B(アセトニトリル中の0.1%TFA)との直線グラジエントを使用した。生成物を含有しているHPLCフラクションを合わせて凍結乾燥した。

フラッシュクロマトグラフィー精製は、Biotage KP-Silシリカカートリッジ、並びに溶離液としてn-ヘプタン、酢酸エチル、及びメタノールを使用し、Biotage AB(スウェーデン)製のIsolera One systemで実施した。生成物は、254nmで検出した。240nmより高い領域に吸光度を示さない生成物については、フラクションをLC/MSによってスクリーニングした。

分析用の超高速LC(UPLC)は、Thermo Scientific製の、LTQ Orbitrap Discovery質量分析計に接続したWaters BEH300 C18 column (2.1x50mm、粒子サイズ1.7μm)を装備したWaters Acquity systemで実施した。

HPLCエレクトロスプレーイオン化質量分析法(HPLC-ESI-MS)は、Thermo LTQ Orbitrap Discovery高分解能/高精密質量分析計又はWaters Micromass ZQ(どちらも、Waters ACQUITY UPLC BEH300 C18 RPカラム(2.1×50mm、300Å、1.7μm)を装備)に接続した、Acquity PDA検出器を有するWaters Acquity UPLCで実施した。流速:0.25mL/分、溶媒A:UP-H₂O+0.04%TFA、溶媒B:UP-アセトニトリル+0.05%TFA。

PEG生成物のMSスペクトルは、出発原料であるPEGの多分散性による一連の(CH₂CH₂O)_n部分を示した。より簡単な説明のために、1つの代表的なm/zシグナルだけを実施例中で示している。

緩衝液交換は、Aekta Purifier 100 systemを接続した、HiTrap又はHiPrepカラム(GE Healthcare)で行った。

陽イオン交換クロマトグラフィーは、それぞれ移動相A及びBとして、20mM MES(pH5.7)及び20mM MES、500mM NaCl(pH5.7)を使用し、Aekta Purifier 100 systemに接続したSource 15 S 6mLカラムのどちらかで実施した。

[実施例1]
骨格鎖試薬1a及び1gの合成:

骨格鎖試薬1aは、Boc-_LLys(Boc)-OHの代わりにBoc-_DLys(Boc)-OHを使用したことを除き、WO 2011/012715 A1の実施例1に記載されている通り合成した。
MS:m/z 888.50=[M+10H+]¹⁰⁺(計算値=888.54)

骨格鎖試薬1gは、以下のスキームに従って、アミノ4-arm PEG5000 1bから合成した。

化合物1bの合成のために、アミノ4-arm PEG5000(MW約5350g/mol、10.7g、2.00mmol、HCl塩)及びビス(ペンタフルオロフェニル)カーボネート(4.73g、12.0mmol)を、DCM(無水、43mL)に溶解し、DIPEA(3.10g、24.0mmol、4.18mL)を室温で加えた。10分後、1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(5.30g、16.0mmol)を加え、この混合物を15分間撹拌した。次に、追加の1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(0.33g、1.0mmol)を加えた。この反応混合物が完全に溶解した後、ろ過をして、溶媒を室温で蒸発させた。

残さをiPrOH(40mL)に溶解し、MTBE(320mL)により希釈した。この生成物を-20℃で一晩かけて沈殿させた。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(0℃)(200mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率11.1g(83%)、白色固体1b。
MS:m/z 1112.86=[M+6H]⁶⁺(計算値=1113.04)。

化合物1cの合成のために、boc保護化合物1b(11.1g、1.66mmol)をMeOH中の3M HCl(40mL)に溶解して、45℃で20分間、次に55℃で10分間撹拌した。沈殿させるために、MeOH(10mL)及びMTBE(200mL)を加え、この混合物を-20℃で16時間、保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(0℃)(200mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率9.14g(89%)、白色粉末1c(HCl塩)。
MS:m/z 979.45=[M+6H]⁶⁺(計算値=979.55)。

化合物1dの合成のために、化合物1c(9.06g、1.47mmol、HCl塩)及びビス(ペンタフルオロフェニル)カーボネート(6.95g、17.6mmol)をDCM(無水、50mL)に溶解し、DIPEA(4.56g、35.3mmol、6.15mL)を室温で加えた。10分後、1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(7.80g、23.5mmol)を加え、この混合物を15分間撹拌した。次に、追加の1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(0.49g、1.5mmol)を加えた。完全に溶解した後、溶媒を室温で蒸発させた。

残さを40℃でiPrOH(35mL)に溶解し、MTBE(200mL)により希釈した。この生成物を-20℃で一晩かけて沈殿させた。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(0℃)(200mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥させると、1dが白色固体として得られた。
収率11.6g(90%)、白色固体1d。
MS:m/z 1248.08=[M+7H]⁷⁺(計算値=1248.27)。

化合物1eの合成のために、boc保護化合物1d(11.4g、1.31mmol)をMeOH中の3M HCl(40mL)に溶解して、45℃で20分間、次に55℃で10分間撹拌した。沈殿させるために、MeOH(10mL)及びMTBE(200mL)を加え、この混合物を-20℃で16時間、保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(0℃)(200mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥させると、1eが白色粉末として得られた。
収率7.60g(75%)、白色粉末1e(HCl塩)。
MS:m/z 891.96=[M+8H]⁸⁺(計算値=892.13)。

化合物1fの合成のために、化合物1e(7.56g、0.980mmol、HCl塩)及びビス(ペンタフルオロフェニル)カーボネート(9.27g、23.0mmol)をDCM(無水、250mL)に溶解し、DIPEA(6.08g、47.0mmol、8.19mL)を35℃で加えた。10分後、1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(5.30g、16.0mmol)を加え、この混合物を15分間撹拌した。次に、追加の1,9-ビス-boc-1,5,9-トリアザノナン(0.33g、1.0mmol)を加えた。完全に溶解した後、溶媒を室温で蒸発させた。

残さを60℃でiPrOH(250mL)に溶解し、MTBE(1350mL)により希釈した。この生成物を-20℃で一晩かけて沈殿させた。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(0℃)(400mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥させると、1fがガラス状固体として得られた。
収率11.1g(83%)、ガラス状固体1f。
MS:m/z 1312.01=[M+10H]¹⁰⁺(計算値=1312.21)。

骨格鎖試薬1gの合成のために、37℃で、boc保護化合物1f(7.84g、0.610mmol)をMeOH(16mL)に溶解し、あらかじめ冷却したジオキサン中の4M HCl(4℃)溶液(55mL)を室温で加えた。この混合物を、冷却しないで20分間撹拌した。20分後、MeOH中の3M HCl(110mL)を加えた。この溶液を、24個のFalconチューブ(50mL)に分注し、各Falconチューブに冷MTBE(-20℃)(40mL)を添加することにより沈殿させた。3214rcfで1分間、遠心分離にかけた後、上澄み液をデカンテーションし、ガラス状固体をFalconチューブあたりMeOH(5mL)に溶解し、各Falconチューブに冷MTBE(-20℃)(40mL)を再度添加することにより、沈殿させた。この上澄み液を廃棄し、残留固体を真空で一晩乾燥した。
収率5.74g(87%)、白色ガラス状固体1g(HCl塩)。
MS:m/z 965.46=[M+10H]¹⁰⁺(計算値=965.45)。

[実施例2]
架橋試薬2d、2g、2k、及び2oの合成
架橋試薬2eは、以下のスキームに従い、アゼライン酸モノベンジルエステル及びPEG10000から調製した。

アゼライン酸モノベンジルエステル2aの合成のために、アゼライン酸(37.6g、200mmol)、ベンジルアルコール(21.6g、200mmol)、p-トルエンスルホン酸(0.80g、4.2mmol)、及びトルエン(240mL)の混合物をディーン-スターク装置中で7時間還流した。冷却後、溶媒を蒸発させて、飽和NaHCO₃水溶液(300mL)を加えた。この混合物をMTBE(3×200mL)により抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水し、溶媒を蒸発させた。生成物は、溶離液として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→25:75)を使用して、2×340gのシリカ上で精製した。溶離液を蒸発させて、残さを真空で一晩乾燥した。
収率25.8g(46%)、無色油状物2a。
MS:m/z 279.16=[M+H]⁺(計算値=279.16)。

化合物2bの合成のために、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(3.90g、14.0mmol)及びPEG10000(40.0g、4.00mmol)をジクロロメタン(64mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(2.89g、14.0mmol)及びDMAP(0.024g、0.020mmol)のジクロロメタン(32mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(65mL)に溶解し、室温でMTBE(308mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(250mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率40.8g(97%)、白色粉末2b。
MS:m/z 835.50=[M+14H]¹⁴⁺(計算値=835.56)。

化合物2cの合成のために、化合物2b(40.6g、3.86mmol)を酢酸メチル(250mL)に溶解し、活性炭担持パラジウム(203mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物をセライトパッドによりろ過し、ろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率37.2g(93%)、ガラス状固体2c。
MS:m/z 882.53=[M+13H]¹³⁺(計算値=882.51)。

化合物2dの合成のために、化合物2c(32.0g、3.10mmol)及びTSTU(3.73g、12.4mmol)を、室温でジクロロメタン(150mL)に溶解した。次に、DIPEA(1.60g、12.4mmol)を加え、この混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液をジクロロメタン(170mL)により希釈し、水(750g)/NaCl(197g)/NaOH(3g)の溶液(140mL)により洗浄した。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。

残さをトルエン(200mL)に溶解し、室温でMTBE(180mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(100mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率28.8g(88%)、白色粉末2d。
MS:m/z 795.47=[M+15H]¹⁵⁺(計算値=795.54)。

架橋試薬2gは、以下のスキームに従い、アゼライン酸モノベンジルエステル及びPEG6000から調製した。

化合物2eの合成のために、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(6.50g、23.3mmol)及びPEG6000(40.0g、6.67mmol)をジクロロメタン(140mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(4.81g、23.3mmol)及びDMAP(0.040g、0.33mmol)のジクロロメタン(40mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(70mL)に溶解し、室温でMTBE(300mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(500mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率41.2g(95%)、白色粉末2e。
MS:m/z 833.75=[M+8H]⁸⁺(計算値=833.74)。

化合物2fの合成のために、化合物2e(41.2g、6.32mmol)を酢酸メチル(238mL)及びエタノール(40mL)に溶解し、次に、活性炭担持パラジウム(400mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトパッドによりろ過し、ろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率38.4g(96%)、ガラス状固体2f。
MS:m/z 750.46=[M+9H]⁹⁺(計算値=750.56)。

化合物2gの合成のために、化合物2f(38.2g、6.02mmol)及びTSTU(7.25g、mmol)を、室温でジクロロメタン(130mL)に溶解した。次に、DIPEA(3.11g、24.1mmol)を加え、この混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液をジクロロメタン(100mL)により希釈し、水(750g)/NaCl(197g)/NaOH(3g)の溶液(200mL)により洗浄した。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。

残さをトルエン(210mL)に溶解し、室温でMTBE(430mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(450mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率35.8g(91%)、白色粉末2g。
MS:m/z 857.51=[M+8H]⁸⁺(計算値=857.51)。

架橋試薬2kは、以下のスキームに従い、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステル及びPEG10000から調製した。

イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2hの合成のために、イソプロピルマロン酸(35.0g、239mmol)、ベンジルアルコール(23.3g、216mmol)及びDMAP(1.46g、12.0mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解した。氷浴を用いて、混合物を0℃に冷却した。DCC(49.4g、239mmol)のアセトニトリル(150mL)溶液を0℃で15分以内に加えた。氷浴を取り除き、この反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に固体をろ別した。ろ液を真空、40℃で蒸発させて、残さをMTBE(300mL)に溶解した。この溶液を飽和NaHCO₃水溶液により抽出(2×300mL)し、次に、6N塩酸を使用して、合わせた水相を酸性にして、pH=1〜3にした。得られたエマルションをMTBEにより抽出(2×300mL)し、溶媒を蒸発させた。合わせた有機相を飽和水性NaCl(200mL)により洗浄し、MgSO₄で脱水した。生成物は、溶離液として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→20:80)を使用して、340gのシリカ上で精製した。溶離液を蒸発させて、残さを真空で一晩乾燥した。
収率9.62g(17%)、無色油状物rac-2h。
MS:m/z 237.11=[M+H]⁺(計算値=237.11)。

化合物2iの合成のために、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-2h(945mg、4.00mmol)及びPEG10000(10.0g、4.00mmol)をジクロロメタン(20mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(825mg、4.00mmol)及びDMAP(6mg、0.05mmol)のジクロロメタン(10mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(20mL)に溶解し、室温でMTBE(150mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(500mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率9.63g(92%)、白色粉末2i。
MS:m/z 742.50=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=742.51)。

化合物2jの合成のために、化合物2i(3.38g、0.323mmol)を酢酸メチル(100mL)に溶解し、活性炭担持パラジウム(105mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトパッドによりろ過し、このろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率3.25g(98%)、ガラス状固体2j。
MS:m/z 731.25=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=731.25)。

化合物2kの合成のために、化合物2j(3.10g、0.302mmol)及びTSTU(0.364g、1.21mmol)を、室温でジクロロメタン(15mL)に溶解した。次に、DIPEA(0.156g、1.21mmol)を加え、この混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、このろ液を0.5Mリン酸塩緩衝液(pH=6.5)により洗浄した(2×10mL)。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。残さをトルエン(20mL)に溶解し、室温でMTBE(10mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(250mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率2.66g(84%)、白色粉末2k。
MS:m/z 743.37=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=743.38)。

架橋試薬rac-2oは、以下のスキームに従い、cis-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸及びPEG10000から調製した。

cis-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸モノベンジルエステルrac-2lの合成のために、cis-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸(20.0g、116mmol)、ベンジルアルコール(11.3g、105mmol)及びDMAP(710mg、5.81mmol)をTHF(200mL)に溶解した。氷浴を用いて、混合物を0℃に冷却した。DCC(49.4g、239mmol)のTHF(100mL)溶液を0℃で15分以内に加えた。氷浴を取り除き、この反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に固体をろ別した。ろ液を40℃で蒸発させて、残さをMTBE(300mL)に溶解した。この溶液を飽和NaHCO₃水溶液により抽出(2×300mL)し、次に、6N塩酸を使用して、合わせた水相を酸性にして、pH=1〜3にした。得られたエマルションをMTBEにより抽出(2×300mL)し、溶媒を蒸発させた。合わせた有機相を飽和水性NaCl(200mL)により洗浄し、MgSO₄で脱水した。生成物は、溶離液として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→20:80)を使用して、340gのシリカ上で精製した。溶離液を蒸発させると、無色油状残さは、一晩の真空乾燥中に、結晶化した。
収率4.82g(16%)、無色結晶rac-2l。
MS:m/z 263.13=[M+H]⁺(計算値=263.13)。

化合物2mの合成のために、cis-1,4-シクロヘキサンジカルボン酸モノベンジルエステルrac-2l(2.10g、8.00mmol)及びPEG10000(20.0g、10.0mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(1.65g、8.00mmol)及びDMAP(0.012g、0.10mmol)のジクロロメタン(25mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(55mL)に溶解し、室温でMTBE(300mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(250mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率18.2g(87%)、白色粉末2m。
MS:m/z 745.76=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=745.77)。

化合物2nの合成のために、化合物2m(9.00g、0.857mmol)を酢酸メチル(100mL)に溶解し、活性炭担持パラジウム(157mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトパッドによりろ過し、ろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率8.83g(100%)、ガラス状固体2n。
MS:m/z 734.50=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=734.50)。

化合物2oの合成のために、化合物2n(8.92g、0.864mmol)及びTSTU(1.04g、3.64mmol)を、室温でジクロロメタン(35mL)に溶解した。次に、DIPEA(0.447g、3.46mmol)を加え、この混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液を0.5Mリン酸塩緩衝液(pH=6.5)により洗浄(2×10mL)した。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。

残さをトルエン(50mL)に溶解し、室温でMTBE(25mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(400mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率7.62g(84%)、白色粉末2o。
MS:m/z 702.60=[M+16H]¹⁶⁺(計算値=702.59)。

[実施例3]
遊離アミノ基を含有するヒドロゲルビーズ3a、3b、3c、及び3dの調製
バッフルを装備した、底に出口を有する250mL円筒型反応器(直径60mm)中、ウンデカン(100mL)中のCithrol(商標)DPHS(218mg)のエマルションを、直径50mmのイソジェット（isojet）撹拌器を用い、周囲温度で、580rpmで撹拌した。1a(250mg)及び2d(2205mg)のDMSO(22.1g)溶液を加え、室温で10分間撹拌して懸濁液を形成させた。TMEDA(1.1mL)を加えて、重合を行った。この混合物を16時間撹拌した。酢酸(1.7mL)を加え、次に、10分後、15wt%塩化ナトリウム水溶液(100mL)を加えた。10分後、撹拌器を停止し、相を分離させた。2時間後、ヒドロゲルを含有している水相を排出した。

ビーズサイズの分別のために、水-ヒドロゲル懸濁液をエタノール(40mL)により希釈し、Retsch AS200制御ふるい器を使用し、125、100、75、63、50、40、及び32μmの鋼ふるい上で15分間、湿式ふるいにかけた。ふるい幅は、1.5mmで水流は300mL/分とした。63μm及び75μmのふるい上に保持されたビーズ画分を貯めておき、0.1%AcOHにより3回、エタノールにより10回洗浄し、0.1mbarで16時間乾燥すると、3a(670mg)が白色粉末として得られた。

このヒドロゲルのアミノ基含有量は、ヒドロゲル上の遊離アミノ基にFmoc-アミノ酸をコンジュゲートし、その後にFmocを定量することにより、0.145mmol/gと求まった。

3bは、1a(350mg)、2g(2548mg)、DMSO(26.1g)、Cithrol(商標)DPHS(257mg)、TMEDA(1.5mL)、及び酢酸(2.4mL)を使用した以外、3aについて記載した通り調製し、遊離アミノ基0.120mmol/gとなる3b(550mg)が、白色粉末として得られた。

3cは、1a(250mg)、rac-2k(3019mg)、DMSO(32.7g)、Cithrol(商標)DPHS(290mg)、TMEDA(1.1mL)、及び酢酸(1.7mL)を使用した以外、3aについて記載した通り調製し、遊離アミノ基0.126mmol/gとなる3c(770mg)が、白色粉末として得られた。

3dは、1a(250mg)、rac-2o(2258mg)、DMSO(22.6g)、Cithrol(商標)DPHS(220mg)、TMEDA(1.1mL)、及び酢酸(1.7mL)を使用した以外、3aについて記載した通り調製し、遊離アミノ基0.153mmol/gとなる3d(186mg)が、白色粉末として得られた。

[実施例4]
リンカー試薬4cの合成
リンカー試薬4cは、以下のスキームに従って合成した。

4aの合成:
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.00g、2.43mmol)をDCM(25mL)中のDCC(0.70g、3.33mmol)と共に溶解した。Oxyma pure(0.51g、3.58mmol)及びコリジン(0.50mL、3.58mmol)を1回で加え、N-Boc-エチレンジアミン(0.41g、2.56mmol)のDCM(15mL)溶液をゆっくりと加えた。室温でこの混合物を90分間撹拌した後、形成した沈殿物をろ別し、ろ液を水性HCl(0.1M、50mL)により洗浄した。この水層をDCMにより抽出(2×20mL)し、合わせた有機フラクションを飽和水性NaHCO₃(3×25mL)及び飽和食塩水(1×50mL)により洗浄し、Na₂SO₄で脱水してろ過し、真空で濃縮した。粗製固体をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。中間体のN-boc-N'-(N-fmoc-4-tert.-ブチル-L-アスパルトイル)-エチレンジアミンが白色固体(0.98g、1.77mmol、73%)として得られた。
MS:m/z 554.29=[M+H]⁺(計算値=554.29)。

N-boc-N'-(N-fmoc-4-tert.-ブチル-L-アスパルトイル)-エチレンジアミン(0.98g、1.77mmol)をTHF(15mL)に溶解し、DBU(0.31mL)を加え、この溶液を室温で12分間撹拌した。この反応をAcOH(0.5mL)によりクエンチして真空で濃縮し、残さをフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、4a(0.61g、1.77mmol、2工程全体で73%)が白色固体として得られた。
MS:m/z 332.38=[M+H]⁺(計算値=332.22)。

4bの合成:
6-アセチルチオヘキサン酸(0.37g、1.95mmol)をDCM(19.5mL)に溶解し、Oxyma pure(0.35g、2.48mmol)及びDCC(0.40g、1.95mmol)を1回で加えた。この溶液を室温で30分間撹拌してろ過し、ろ液を4a(0.61g、1.77mmol)のDCM(10.5mL)溶液に加えた。DIPEA(0.46mL、2.66mmol)をこの溶液に加え、この反応物を室温で2時間撹拌した。この溶液を水性H₂SO₄(0.1M、2×30mL)、飽和水性NaHCO₃(2×20mL)及び飽和食塩水(1×20mL)により洗浄した。有機層をNa₂SO₄で乾燥してろ過し、真空で濃縮した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、N-boc-N'-(N-6-アセチルチオヘキシル-4-tert.-ブチル-L-アスパルトイル)-エチレンジアミン(0.65g、1.30mmol、2工程全体で73%)が白色固体として得られた。
MS:m/z 504.27=[M+H]⁺(計算値=504.28)。

N-boc-N'-(N-6-アセチルチオヘキシル-4-tert.-ブチル-L-アスパルトイル)-エチレンジアミン(0.60g、1.18mmol)をTFA(5mL)に溶解し、TES(0.13mL)及び水(0.13mL)を加えた。この混合物を室温で30分間撹拌した。TFAをN₂通気中で除去し、粗製4bをH₂O/ACN(1:1)に溶解して、RP-HPLCにより精製した。
収率:0.39g、0.85mmol(TFA塩)、72%。
MS:m/z 348.25=[M+H]⁺(計算値=348.16)。

4cの合成:
4b(TFA塩、0.38g、0.80mmol)をDMF(5mL)に溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(0.26g、0.88mmol)及びDIPEA(0.28mL、1.6mmol)を加えた。得られた懸濁液をDCM(5mL)により希釈し、室温で3時間撹拌した。さらに多くのDIPEA(0.28mL 1.6mmol)を加え、2時間撹拌を継続した。DCMを真空で濃縮し、残さをH₂O/ACN(3:1)により希釈し、RP-HPLCにより精製すると、N-(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル-オキソカルボニル-N'-(N-6-アセチルチオヘキシル-L-アスパルチル)-エチレンジアミン(0.31g、0.62mmol、77%)が、無色油状物として得られた。
MS:m/z 504.16=[M+H]⁺(計算値=504.17)。

N-(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチルオキソカルボニル-N'-(N-6-アセチルチオヘキシル-L-アスパルチル)-エチレン-ジアミン(150mg、0.30mmol)をDCM(17.5mL)に溶解し、NHS(41mg、0.36mmol)、DCC(74mg、0.36mmol)、及びDMAP(4mg、0.03mmol)を1回で加えた。この反応物を室温で1時間撹拌し、得られた懸濁液をろ過した。沈殿物を少量のDCMにより洗浄し、合わせたろ液を真空で濃縮した。4cをRP-HPLCにより精製すると、無色油状物(144mg、0.24mmol、80%)が得られた。
MS:m/z 601.18=[M+H]⁺(計算値=601.18)。

[実施例5]
マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5aの調製
乾燥ヒドロゲルビーズ3a(259.3mg)をNMP中の1%n-プロピルアミン(10mL)中で15分間インキュベートし、続いて、NMP中の1%n-プロピルアミンにより2回、NMP中の2%DIPEAにより2回洗浄した。マレイミド-NH-PEG₁₂-PFE(171mg)をNMP(1mL)に溶解し、洗浄済みヒドロゲルビーズ3aに加えた。このヒドロゲル懸濁液を、室温で2時間インキュベートした。得られたマレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5aを、各回、NMP、続いて20mMスクシネート、1mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH3.0)、続いて水、続いて0.1%酢酸、0.01%Tween20を用いて、5回洗浄した。

こうして、3b、3c、及び3dを使用して、マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5b、5c、及び5dを調製した。

[実施例6]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ6cの合成
ルセンティス(4.6mg)(以下のスキームでは、ルセンティス-NH₂として示している)(10mMヒスチジン、10重量%α,α-トレハロース、0.01%Tween20(pH5.5)中のルセンティス10mg/mLを460μL)を10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、ルセンティス濃度が16.4mg/mLになるよう調節した。リンカー試薬4c(6mg)をDMSO(100μL)に溶解すると、100mMの濃度が得られた。ルセンティスの量に対してリンカー試薬4cが1モル当量となる分を、ルセンティス溶液に加えた。この反応混合物を注意深く混合し、室温で5分間インキュベートした。続いて、さらに2モル当量のリンカー試薬4cを、1モル当量ずつルセンティス溶液に加え、各当量を加えた後、この反応混合物を室温で5分間インキュベートすると、非修飾ルセンティス及び保護ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6aの混合物が得られた。

1Mクエン酸ナトリウム(pH5.0)を添加することにより、この反応混合物のpHを6.5に調節し、Na₂EDTAを加えて、最終濃度5mMとした。6aの保護基を除去するため、0.5M NH₂OH(10mMクエン酸ナトリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH6.5に溶解した)を加えて、最終濃度を45mMにし、脱保護反応物を室温で4時間インキュベートすると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6bが得られた。ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6bの混合物を、10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH6.5)へと緩衝液の交換を行い、2種のルセンティス種の全濃度を11.8mg/mLに調節した。混合物中のルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6bの含有量は、ESI-MSにより決定したところ、20%であった。

マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5a(1mg)に、10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH6.5)中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6b混合物(4mg)を加えて、室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ6cが得られた。

[実施例7]
インビトロ放出速度-インビトロ半減期の決定
ルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ6c(約1mgのルセンティスを含有)を、60mMリン酸ナトリウム、3mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH7.4)により5回洗浄し、前記緩衝液(1mL)中で最後に懸濁させた。この懸濁液を37℃でインキュベートした。懸濁液の緩衝液を異なる時間間隔の後に交換し、220nmにおいてHPLC-SECにより分析した。遊離ルセンティスに相当するピークを積算し、遊離ルセンティスの総量を総インキュベート時間に対してプロットした。曲線のあてはめ用ソフトウェアを適用し、一次開裂速度を求めた。

[実施例8]
リンカー試薬8eの合成
リンカー試薬8eは、以下のスキームに従って合成した。

シリンジポンプによって、N-Boc-エチレンジアミン(2.08g、12.98mmol)及びNaCNBH₃(775mg、12.33mmol)のMeOH(20mL、無水)溶液に、2,4,6-トリメトキシベンズアルデヒド(2.29g、11.68mmol)の無水MeOH/DCM(1:1 v/v)(40mL)溶液を2時間かけて加えた。この混合物を90分間撹拌し、0.4M HCl(60mL)を用いて酸性にし、さらに15分間撹拌した。この反応混合物を酢酸エチルにより抽出(5×)した。合わせた有機相を飽和NaHCO₃及び飽和食塩水により洗浄し、Na₂SO₄で脱水した。溶媒を真空で除去し、残さを高真空(<0.1mbar)で乾燥した。粗製N-Boc-N'-Tmob-エチレンジアミン8aをさらに精製することなく次の反応工程に使用した。収率:3.70g(10.87mmol、84%)の無色固体。MS:m/z 341.21=[M+H]⁺(計算値=341.21)。

DCM(40mL、無水、モレキュラーシーブ)中のDCC(1.34g、6.50mmol)、Oxyma pure(995mg、7.00mmol)、Fmoc-L-Asp(OBn)-OH(2.22g、4.98mmol)、及び2,4,6-コリジン(1.24mL、9.53mmol)の溶液に、8a(1.7g、4.99mmol)のDCM(40mL、無水、モレキュラーシーブ)溶液を加えた。この反応混合物を、室温で3時間撹拌した。沈殿物をろ別し、ろ液を0.1M HCl、飽和NaHCO₃、及び飽和食塩水により洗浄した。有機相をNa₂SO₄で脱水し、溶媒を真空で除去した。粗製物質をフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、オフホワイトの固体として8b(3.19g、4.15mmol、83%)が得られた。MS:m/z 768.35=[M+H]⁺(計算値=768.35)。

8b(8.59g、11.19mmol)のTHF(98mL)溶液に、DBU(2mL)を加えた。この溶液を室温で12分間撹拌し、溶媒を真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーにより、8c(4.89g、8.96mmol、80%)が得られた。MS: m/z546.28=[M+H]⁺(計算値=546.28)。

6-トリチルメルカプトヘキサン酸(2.04g、5.22mmol)をDCM(20mL、無水、モレキュラーシーブ)に溶解し、DCC(1.08g、5.22mmol)及びOxyma pure(945mg、6.65mmol)を加えた。30分後、8c(2.59g、4.75mmol)及びDIPEA(1.24mL、7.12mmol)を加えた。この反応混合物を、室温で22時間撹拌した。この混合物を1N H₂SO₄(2x)、飽和NaHCO₃(2×)、及び飽和食塩水により抽出した。有機相をNa₂SO₄で脱水して真空で濃縮し、8dをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率:4.10g(4.47mmol、94%)。MS:m/z 940.12=[M+Na]⁺(計算値=940.43)。

8d(4.10g、4.47mmol)のi-PrOH(60mL)溶液に、水(20mL)及びLiOH(322mg、13.41mmol)を加え、この反応混合物を室温で1時間撹拌した。トルエン(300mL)を加え、有機相を0.1N HCl及び飽和食塩水と一緒にした。有機相をNa₂SO₄で脱水してろ過し、真空で濃縮した。8eをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率:3.53g(4.26mmol、95%)。MS:m/z 827.93=[M+H]⁺(計算値=828.39)。

[実施例9]
リンカー試薬9cの合成
リンカー試薬9cは、以下のスキームに従って合成した。

8e(300mg、0.36mmol)を、HFIP/水/TES(39:1:1 v/v/v、4.1mL)に溶解した。撹拌下、TFA(0.35mL)を加え、反応物を75分間撹拌した。この溶媒をアルゴン通気中で蒸発させた。残さを水(20mL)とDCM(40mL)との間に分配した。水相を集め、DCM相を水(5mL)により洗浄し、両方の水相を合わせた。リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)(0.5M、5mL)により、得られた溶液のpHを調節し、1mL中の2,2'-ジチオジピリジン溶液を添加し、得られた懸濁液を30分間撹拌した。この混合物を凍結乾燥し、残さをACN/水(7:3 v/v、9mL)中に懸濁してろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、9aが得られた。収率:90mg、0.17mmol(TFA塩)、47%。MS:m/z 415.25=[M+H]⁺(計算値=415.15)。

9a(90mg、0.17mmol)をDCM(1.2mL)に溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(138mg、0.47mmol)及び2,4,6-コリジン(129μL、0.98mmol)を撹拌しながら加えた。DMF(1mL)を加えて、形成した沈殿物の溶解を促進した。2時間及び8時間後、DIPEA(各19μL、0.11mmol)を加え、反応物を48時間撹拌した。この反応をAcOH(38μL)によりクエンチし、窒素通気中でDCMを蒸発させた。残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v)により希釈し、RP-HPLCにより精製すると、9bが得られた。収率:64mg、0.11mmol、65%、MS:m/z 571.09=[M+H]⁺(計算値=571.15)。

9b(32mg、56μmol)をDCMに溶解した。撹拌しながら、NHS(8mg、67μmol)、DCC(14mg、67μmol)、及びDMAP(0.7mg、6mmol)を加えた。この反応物を撹拌し、1.5時間後及び3.5時間後にDCC(それぞれ、3.5mg、11μmol、及び2.3mg、7μmol)を加えた。溶媒をアルゴン通気中で蒸発させ、残さを水/ACN/TFA(1:9:0.01 v/v/v、3mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、9c(28mg、42μmol、75%)が得られた。MS:m/z668.17=[M+H]⁺(計算値=668.17)。

[実施例10]
リンカー試薬10fの合成
リンカー試薬10fは、以下のスキームに従って合成した。

Fmoc-N-Me-L-Asp(OtBu)-OH(1g、2.35mmol)をDCM(35mL)及びDCC(0.68g、3.29mmol)に溶解し、Oxyma pure(0.5g、3.53mmol)及び2,4,6-コリジン(0.49mL、3.76mmol)を加えた。N-Boc-N-メチル-エチレンジアミンをDCM(15mL)に溶解し、シリンジにより上記の反応混合物にゆっくりと加えた。反応物を16時間撹拌し、沈殿物をろ別してろ液を0.1M HCl(50mL)により洗浄した。水層をDCM(20mL)により2回、再抽出した。有機層を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(1x50mL、2x25mL)及び飽和食塩水(1×50mL)により洗浄した。有機相をNa₂SO₄で脱水して真空で濃縮し、10aをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率:1.36g(2.33mmol、99%)。MS:m/z 582.32=[M+H]⁺(計算値=582.32)。

10a(1.36g、2.33mmol)をTHF(20mL)に溶解してDBU(0.4mL)を加え、この反応物を12分間撹拌した。AcOH(0.5mL)を加え、この混合物を真空で濃縮し、10bをフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率:0.82g(2.28mmol、98%)。MS:m/z 360.25=[M+H]⁺(計算値=360.25)。

6-アセチルメルカプトヘキサン酸(0.49g、2.58mmol)をDCM(25mL)に溶解し、DCC(0.53g、2.58mmol)、Oxyma pure(0.47g、3.19mmol)を加えた。この反応物を45分間撹拌し、フリット付きシリンジを用いてろ過して、10b(0.82g、2.28mmol)のDCM(12mL)溶液に入れた。DIPEA(0.61mL、3.42mmol)を加え、この反応物を撹拌した。転化が不十分であったので、Oxyma pure(0.2g、1.4mmol)及びDIPEA(0.25mL、1.4mmol)を加え、この反応物を16時間撹拌した。転化が不十分であったので、6-アセチルメルカプトヘキサン酸(0.49g、2.58mmol)、DCC(0.53g、2.58mmol)、及びOxyma pure(0.47g、3.19mmol)を30分間撹拌し、ろ過して上記の反応物に入れた。DIPEA(0.6mL、3.42mmol)を加え、反応物を2.5時間撹拌した。この反応混合物を0.1M H₂SO₄(20mL)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(2×20mL)、及び飽和食塩水(20mL)により洗浄した。有機相をNa₂SO₄で脱水して真空で濃縮し、10cをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率:0.74g(1.39mmol、60%)。MS:m/z 532.30=[M+H]⁺(計算値=532.31)。

10c(0.74g、1.39mmol)をTFA/TES/水(95:2.5:2.5 v/v/v、5.25mL)に溶解し、30分間撹拌した。この混合物を真空で濃縮し、RP-HPLCにより精製すると、10d(0.38g、0.78mmol、56%)が得られた。MS:m/z 376.19=[M+H]⁺(計算値=376.19)。

10d(0.38g、0.78mmol)をDCM(7mL)に溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(0.35g、1.17mmol)及び2,4,6-コリジン(0.45mL、3.51mmol)を加え、反応物を撹拌した。1時間後、2,4,6-コリジン(0.2mL、1.56mmol)を加え、反応物を20時間撹拌した。この反応物を真空で濃縮し、RP-HPLCにより精製すると、10e(0.26g、0.49mmol、63%)が得られた。MS:m/z 532.20=[M+H]⁺(計算値=532.20)。

10e(0.26g、0.49mmol)をDCM(3.6mL)に溶解し、DCC(0.12g、0.59mmol)、NHS(68mg、0.59mmol)、及びDMAP(6mg、0.05mmol)を加えた。この反応物を1時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、沈殿物をDCM(2mL)により洗浄した。ろ液をフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、白色発泡体として10fが得られた。収率:0.27g(0.43mmol、87%)。MS:m/z 629.21=[M+H]⁺(計算値=629.21)。

[実施例11]
リンカー試薬11dの合成
リンカー試薬11dは、以下のスキームに従って合成した。

塩化2-クロロトリチル樹脂(1.4mmol/g、357mg、0.5mmol)を、フリット付き10mLシリンジに秤量した。この樹脂をDCM(2mL)により2倍に膨潤させた。N-Fmoc-N-メチル-L-アスパルテート(OtBu)-OH(532mg、1.25mmol)及びDIPEA(305μL、1.75mmol)をDCM(3mL)に溶解し、シリンジに抜き取った。このシリンジを1時間振盪攪拌（agitate）した。このシリンジにMeOH(0.5mL)を抜き取り、シリンジを30分間振盪攪拌した。樹脂をDCM(4mL)により5回、DMF(4mL)により5回洗浄した。樹脂を、DMF:DBU:ピペリジン(96:2:2 v/v/v、4mL)により5分間で3回振盪攪拌した。樹脂をDMF(4mL)により5回洗浄した。6-トリチルメルカプトヘキサン酸(488mg、1.25mmol)及びHATU(475mg、1.25mmol)をDMF(3mL)に溶解し、DIPEA(436μL、2.5mmol)を加えた。1分の予備インキュベート後、上記の溶液をシリンジに抜き取り、このシリンジを1時間振盪攪拌した。樹脂をDMF(4mL)により5回、DCM(4mL)により5回、及びMeOH(4mL)により2回洗浄し、真空で乾燥した。HFIP/TES/酢酸(90/5/5 v/v/v、3mL、各々)の溶液をシリンジに抜き取り、このシリンジを30分間2回振盪攪拌した。採集したろ液の溶媒を窒素通気中で蒸発させた。この残さをACN/水(1:1 v/v、5mL)中に懸濁させて、ろ別した。ACN(0.5mL)中の2,2'-ジチオジピリジン(220mg、1mmol)をろ液に加えた。pH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液(0.5M、1.2mL)により、この反応物のpHを7に調節し、15分間撹拌した。生成物をRP-HPLCにより直接精製すると、11a(117mg、0.27mmol、53%)が得られた。MS:m/z 443.30=[M+H]⁺(計算値=443.17)。

11a(117mg、0.27mmol)をDCM(2.4mL)に溶解した。PyBOP(166mg、0.32mmol)、DIPEA(185μL、1.06mmol)、及びN-Boc-N-メチルエチレンジアミン(57μL、0.32mmol)を加え、この反応物を45分間撹拌した。酢酸(185μL)を加え、窒素通気中で溶媒を除去した。この残さをACN/水/TFA(2:1:0.003 v/v/v)に溶解し、RP-HPLCにより精製すると、11b(135mg、0.23mmol、85%)が得られた。MS:m/z 599.27=[M+H]⁺(計算値=599.29)。

11b(135mg、0.23mmol)をTFA/TES/水(95:2.5:2.5 v/v/v、5mL)に溶解した。15分後、溶媒を窒素通気中で蒸発させた。残さをACN/水1:1により希釈し、凍結乾燥した。残さをDCM(1.5mL)に溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(80mg、0.27mmol)を加えた。撹拌しながら、DIPEA(78μL、0.46mmol)をゆっくりと加え、反応物が薄黄色を維持するようにした。さらなるDIPEA(39μL、0.23mmol)を加え、反応物を1時間撹拌した。DIPEA(20μL、0.12mmol)の添加後、この反応物を30分間撹拌した。酢酸(140μL)を加え、窒素通気中で溶媒を除去した。この残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、3mL)により希釈し、RP-HPLCにより精製すると、11c(69mg、0.12mmol、51%)が得られた。MS:m/z 599.19=[M+H]⁺(計算値=599.19)。

11c(69mg、0.12mmol)をDCMに溶解し、NHS(16mg、0.14mmol)、DCC(29mg、0.14mmol)及びDMAP(1.4mg、0.012mmol)を加え、この反応物を75分間撹拌した。溶媒を窒素通気中で蒸発させ、残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、3.5mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、11d(60mg、0.09mmol、75%)が得られた。MS:m/z 696.20=[M+H]⁺(計算値=696.20)。

[実施例12]
リンカー試薬12eの合成
リンカー試薬12eは、以下のスキームに従って合成した。

N-Boc-N-メチルエチレンジアミン(2g、11.48mmol)及びNaCNBH₃(819mg、12.63mmol)のMeOH(20mL)溶液に、2,4,6-トリメトキシベンズアルデヒド(2.08mg、10.61mmol)を小分けにして加えた。この混合物を室温で90分間撹拌し、3M HCl(4mL)を用いて酸性にし、さらに15分間撹拌した。この反応混合物を飽和NaHCO₃溶液(200mL)に加え、CH₂Cl₂により抽出した(×5)。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。得られたN-Boc-N-メチル-N'-tmob-エチレンジアミン(12a)を高真空で完全に乾燥し、さらに精製することなく次の工程に使用した。収率:3.76g(11.48mmol、純度89%、12a:二Tmob保護生成物=8:1)。MS:m/z 355.22=[M+H]⁺(計算値=355.23)。

12a(2g、5.65mmol)のCH₂Cl₂(24mL)溶液に、COMU(4.84g、11.3mmol)、N-Fmoc-N-メチル-L-Asp(OBn)-OH(2.08g、4.52mmol)、及び2,4,6-コリジン(2.65mL、20.34mmol)を加えた。この反応混合物を室温で3時間撹拌し、CH₂Cl₂(250mL)により希釈し、0.1M H₂SO₄(100mL)(3×)及び飽和食塩水(100mL)(3×)により洗浄した。水相をCH₂Cl₂(100mL)により再抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水してろ過し、残さを濃縮して体積24mLにした。12bをフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製した。収率:5.31g(148%、6.66mmol)。MS:m/z 796.38=[M+H]⁺(計算値=796.38)。

12b[5.31g、N-Fmoc-N-Me-L-Asp(OBn)-OHを基準にすると最大4.51mmol]のTHF(60mL)溶液に、DBU(1.8mL、3% v/v)を加えた。この溶液を室温で12分間撹拌し、CH₂Cl₂(400mL)により希釈し、0.1M H₂SO₄(150mL)(3×)及び飽和食塩水(150mL)(3×)により洗浄した。水相をCH₂Cl₂(100mL)により再抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水してろ過した。溶媒を蒸発させて12cを単離し、これをさらに精製することなく、次の反応に使用した。MS:m/z 574.31=[M+H]⁺(計算値=574.31)。

12c(5.31g、4.51mmol、粗製)をアセトニトリル(26mL)及びCOMU(3.87g、9.04mmol)に溶解し、6-トリチルメルカプトヘキサン酸(2.12g、5.42mmol)及び2,4,6-コリジン(2.35mL、18.08mmol)を加えた。この反応混合物を室温で4時間撹拌し、CH₂Cl₂(400mL)により希釈し、0.1M H₂SO₄(100mL)(3×)及び飽和食塩水(100mL)(3×)により洗浄した。水相をCH₂Cl₂(100mL)により再抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水してろ過し、溶媒を蒸発させて12dを単離した。生成物7iをフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製した。収率2.63g(62%、純度94%)。MS:m/z 856.41=[M+H]⁺(計算値=856.42)。

i-PrOH(33mL)及びH₂O(11mL)中の12d(2.63g、2.78mmol)の溶液に、LiOH(267mg、11.12mmol)を加え、この反応混合物を室温で70分間撹拌した。この混合物をCH₂Cl₂(200mL)により希釈し、0.1M H₂SO₄(50mL)(3×)及び飽和食塩水(50mL)(3×)により洗浄した。水相をCH₂Cl₂(100mL)により再抽出した。合わせた有機相をNa₂SO₄で脱水してろ過し、溶媒を蒸発させて12eを単離した。12eをフラッシュクロマトグラフィーを用いて精製した。収率:2.1g(88%)。MS:m/z 878.4=[M+Na]⁺(計算値=878.40)。

[実施例13]
リンカー試薬13gの合成
リンカー試薬13gは、以下のスキームに従って合成した。

N,N-ジメチルエチレンジアミン(441mg、5mmol)及びNaCNBH₃(439mg、7mmol)のMeOH(21mL)溶液に、シリンジを用いて、DCM及びMeOH(各17mL)中の2,4,6-トリメトキシベンズアルデヒド(1.34g、6.85mmol)の溶液を加えた。この混合物を室温で60分間撹拌し、0.5M HCl(50mL)を用いて酸性にし、さらに15分間撹拌した。1M NaOHを添加することにより、この反応混合物をpH>12にし、酢酸エチル(1x100mL、3×50mL)により4回抽出した。合わせた有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。得られたN,N-ジメチル-N'-tmob-エチレンジアミン(13a)を高真空で完全に乾燥し、さらに精製することなく次の反応工程に使用した。収率:1.63g(二価Tmob保護生成物を含有)。MS:m/z 269.19=[M+H]⁺(計算値=269.19)。

13a(268mg、約0.83mmol)をTHF(5mL)及び2,3-ピリジンジカルボン無水物(149mg、1mmol)に溶解し、DIPEA(362μL、2.08mmol)及びDMF(1mL)を加えた。この溶液を15分間撹拌し、AcOH(362μL)によりクエンチして、窒素通気中でTHFを除去した。この残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、4mL)により希釈し、RP-HPLCにより精製すると、13b(244mg、0.46mmol、55%)が得られた。MS:m/z 418.20=[M+H]⁺(計算値=418.20)。

12e(500mg、0.58mmol)をTFA/TES/DTT/水(85:5:5:5 v/v/v/v、10mL)に溶解し、4時間撹拌した。溶媒を窒素通気中で除去し、残さをACN/水中で懸濁させてろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、13c(71mg、0.21mmol、36%)が得られた。MS:m/z 334.43=[M+H]⁺(計算値=334.18)。

13c(71mg、0.21mmol)をACN/水(1:1、1mL)に溶解し、ACN/水(1:1、1mL、懸濁液)中の2,2'-ジチオジピリジン(93mg、0.42mmol)及びリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)(0.5M、1mL)を加えた。得られた溶液を15分間撹拌し、RP-HPLCによって直接精製すると、13d(64mg、0.15mmol、68%)が得られた。MS:m/z 443.30=[M+H]⁺(計算値=443.18)。

13b(91mg、0.22mmol)をDMF(1mL)に溶解し、PyBOP(113mg、0.22mmol)を加えた。DIPEA(50μL、0.29mmol)を加え、この溶液を15分間撹拌した。13d(64mg、0.145mmol)をDCM(1.5mL)に溶解し、上記のDMF溶液に加えた。この反応物を100分間撹拌し、AcOH(50μL)を加えた。窒素通気中でDCMを除去し、残さをACN/水/TFAに溶解して、RP-HPLCによって精製すると、13e(26mg、31μmol、21%)が得られた。MS:m/z 842.14=[M+H]⁺(計算値=842.36)。

13e(26mg、31μmol)をHFIP/TES/水(39:1:1 v/v/v、1mL)に溶解し、撹拌しながらTFA(83μL)を加えた。90分後、溶媒を真空で蒸発させ、残さをRP-HPLCにより精製すると、13f(11mg、17μmol、54%)が得られた。MS:m/z 662.28=[M+H]⁺(計算値=662.28)。

13f(11mg、17μmol)をDCM(1.5mL)に溶解し、DCC(4.2mg、20μmol)、NHS(2.3mg、20μmol)、及びDMAP(0.2mg、1μmol)を加え、懸濁液を撹拌した。1時間後及び2時間後、上記の量のDCC及びNHSを再度加えた。3時間後、溶媒を窒素通気中で蒸発させた。この残さをACN/水/TFA (1:1:0.002、3mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、13g(14mg、16μmol(TFA塩)、94%)が得られた。MS:m/z 759.30=[M+H]⁺(計算値=759.30)。

[実施例14]
リンカー試薬14fの合成
リンカー試薬14fは、以下のスキームに従って合成した。

3-(メチルアミノ)プロピルアミン(4.4g、50mmol)のDCM(10mL)溶液に、撹拌しながら、塩化p-モノメトキシトリチル(1.54g、5mmol)のDCM(10mL)溶液をゆっくり加えた。2時間後、ジエチルエーテル(166mL)を加えた。飽和食塩水(100mL)をNaOH(4M、80μL)と混合し、反応物をこの混合物により洗浄(3×33mL)した。有機層を飽和食塩水(30mL)により洗浄し、MgSO₄で乾燥して真空で濃縮した。収率(14a):1.79g(4.95mmol、99%)。

14a(0.36g、1mmol)をTHF(7mL)及びDIPEA(0.44mL、2.5mmol)に溶解し、撹拌しながら、キノリン無水物(0.18g、1.2mmol)のTHF(3mL)溶液を加えた。30分後、13a(0.54g、2mmol)のDMF(2mL)溶液及びPyBOP(0.78g、1.5mmol)を加え、この反応物を1時間撹拌した。この反応物を酢酸エチル(50mL)により希釈し、NaOH(1M、20mL)により洗浄した。水相を酢酸エチル(2x20mL)により再抽出し、集めた有機相を合わせて真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製すると、14b(0.4g、0.53mmol、53%)が得られた。MS:m/z 760.41=[M+H]⁺(計算値=760.41)。

14b(0.4g、0.53mmol)をACN(3mL)に溶解してHCl(0.4M、3mL)を加え、この溶液を4時間撹拌した。この反応をNaOH(1M、15mL)によりクエンチし、DCM(5x30mL)により抽出した。合わせた有機相をMgSO₄で脱水して真空で濃縮し、14cをフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。収率:0.32g(0.42mmol、81%、MMT塩)。MS:m/z 488.31=[M+H]⁺(計算値=488.29)。

11a(49mg、0.11mmol)及び14c(114mg、0.15mmol)をDCM(1.4mL)に溶解し、撹拌しながらPyBOP(62mg、0.12mmol)及びDIPEA(38μL、0.22mmol)を加えた。2時間後、AcOH(40μL)を加え、溶媒を真空で蒸発させた。この残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、5mL)に溶解し、RP-HPLCにより精製すると、14d(104mg、0.1mmol、TFA塩、92%)が得られた。MS:m/z 912.19=[M+H]⁺(計算値=912.44)。

14d(104mg、0.1mmol)をHFIP/TES/水(39:1:1 v/v/v、3mL)に溶解し、撹拌しながらTFA(0.25mL)を加えた。2時間後、撹拌しながらTFA(0.25mL)を加え、この反応物を20時間、さらに撹拌した。この混合物を真空で濃縮し、残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、3mL)に溶解し、RP-HPLCにより精製すると、14e(28mg、35μmol、TFA塩、35%)が得られた。MS:m/z 676.13=[M+H]⁺(計算値=676.30)。

14e(25mg、32μmol)をDCM(2mL)に溶解し、DCC(10mg、48μmol)、NHS(5.5mg、48μmol)、及びDMAP(0.4mg、3.2μmol)を加え、この懸濁液を撹拌した。1.5時間後、上記の量のDCC及びNHSを再度加えた。3時間後、溶媒を窒素通気中で蒸発させた。この残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、4mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、14f(28mg、31.6μmol、TFA塩、99%)が得られた。MS:m/z 773.31=[M+H]⁺(計算値=773.31)。

[実施例15]
リンカー試薬15fの合成
リンカー試薬15fは、以下のスキームに従って合成した。

11a(0.29g、0.65mmol)及びPyBOP(0.34g、0.65mmol)のACN(5mL)溶液に、DIPEA(0.57mL、3.27mmol)を加えた。この混合物を室温で1分間撹拌した後、N,N-ジメチルアミノプロパン-1,3-ジアミン(0.12mL、0.98mmol)を加えた。30分後、AcOH(0.7mL)を加えて、この反応をクエンチした。この混合物を水により希釈し、RP-HPLCにより精製した。得られた中間体をTFA(3mL)に溶解し、この混合物を30分間撹拌した後、N₂の通気によりTFAを除去した。この残さを真空で一晩乾燥すると、15a(0.42g、0.61mmol、(2×TFA塩)、93%)が無色油状物として得られ、これをなんらさらに精製することなく使用した。MS:m/z=471.21=[M+H]⁺、(計算値471.21)。

15a(0.23mg、0.33mmol)のDCM(5mL)溶液に、DMAP(8mg、65μmol)、NHS(75mg、0.65mmol)及びDCC(135mg、0.65mmol)を加えた。3時間撹拌した後、AcOH(10μL)を添加することにより、反応をクエンチした。溶媒をN₂の通気により除去し、残さをH₂O/ACN/TFA(1:1:0.002 v/v/v)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、15b(83mg、0.10mmol、(2×TFA塩)、32%)が無色油状物として得られた。MS:m/z=568.23=[M+H]⁺、(計算値568.23)。

[実施例16]
精製用タグ16eの合成
精製用タグ16eは、以下のスキームに従って合成した。

6,6'-ジチオジニコチン酸(0.62g、2mmol)のACN(20mL)懸濁液に、PyBOP(2.08g、4mmol)及びDIPEA(1.29g、1.74mL、10mmol)を加え、この混合物を1分間撹拌した。得られた茶色溶液を、ACN(20mL)とDMF(5mL)との混合物中の1,9-ビス-Boc-1,5,9-トリアザノナン(1.99g、6mmol)の溶液に加え、2時間撹拌した。この反応混合物をEtOAc(150mL)により希釈し、有機層を水性HCl(10mM、5×100mL)、飽和NaHCO₃溶液(3×100mL)、及び飽和食塩水(100mL)により続けて洗浄した。MgSO₄による脱水及びろ過後、溶媒を真空で除去し、粗製残さをフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、16a(1.92g、最大2mmol)が薄黄色発泡体として得られた。この生成物は少量の分離できないトリピロリジンホスホルアミドを含有しており、このアミドは次の工程で除去する。MS:m/z=935.47=[M+H]⁺、(計算値935.47)。

16a(1.92g、最大2mmol)をTFA(10mL)に溶解し、この溶液を10分間撹拌した。この反応混合物を氷冷ジエチルエーテル(160mL)に滴下して加え、生成物を沈殿させた。得られた懸濁液を7000×G及び2℃で3分間、遠心分離にかけた。上澄み液を廃棄し、沈殿物をメタノール(10mL)に溶解した。この溶液を氷冷ジエチルエーテル(160mL)に滴下して加え、形成した懸濁液を7000×G及び2℃で3分間、遠心分離にかけた。上澄み液を廃棄した後、この沈殿手順を、上記のようにさらに2回実施した。残留油状沈殿物を真空で乾燥すると、16b(1.77g、1.45mmol(6xTFA塩)、73%)が、薄茶色の吸湿性の高い粉末として得られた。MS:m/z=535.26=[M+H]⁺、(計算値535.26)。

16b(3.30g、2.7mmol)のDMF(90mL)溶液に、DIPEA(5.4mL、31mmol)及びBoc-L-Lys(Boc)-OSu(5.62g、12.7mmol)を加えた。この混合物を14時間撹拌した後、酢酸エチル(600mL)により希釈した。有機層を水性HCl(10mM、5×300mL)、飽和NaHCO₃溶液(3×300mL)、及び飽和食塩水(300mL)により洗浄し、MgSO₄で脱水した。ろ過後、溶媒を真空で除去し、粗製残さをフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、純度90%の16c(5.52g、最大2.7mmol)が薄黄色発泡体として得られた。MS:m/z924.54=[M+2H]²⁺(計算値924.53)。

16c(5.52g、最大2.7mmol)をTFA(20mL)に溶解した。15分間撹拌した後、反応混合物を氷冷ジエチルエーテル(160mL)に滴下して加えることにより、生成物を沈殿させた。得られた懸濁液を7000×G及び2℃で3分間、遠心分離にかけた。上澄み液を廃棄し、沈殿物をメタノール(10mL)に溶解した。この溶液を氷冷ジエチルエーテル(160mL)に滴下して加え、形成した懸濁液を7000×G及び2℃で3分間、遠心分離にかけた。上澄み液を廃棄した後、この沈殿手順を、上記のようにさらに2回実施した。残留油状沈殿物を真空で乾燥すると、16d(4.96g、2.27mmol(10×TFA塩)、84%)が、薄茶色の吸湿性粉末として得られた。MS:m/z=1046.64=[M+H]⁺、(計算値1046.64)。

16d(1.53g、0.7mmol)の乾燥DMF(20mL)溶液に、N,N-ジメチルグリシン(1.16g、11.2mmol)、PyBOP(5.83g、11.2mmol)、及びDIPEA(3.23g、4.36mL、25mmol)のDMF(35mL)溶液を加え、1時間撹拌した。次に、この混合物を真空で濃縮し、約10mLの体積にした。この残さに水を加え、全体積100mLにし、TFAを添加することにより、この溶液を酸性にしてpH1〜2にした。濁りのある混合物を5000×G及び2℃で3分間、遠心分離にかけた。油状沈殿物を廃棄し、上澄み液をRP-HPLCにより精製すると、16e(1.05g、0.37mmol、(10×TFA塩)、53%)が無色油状物として得られた。MS:m/z=864.54=[M+2H]²⁺(計算値864.54)。

[実施例17]
リンカー試薬17gの合成
リンカー試薬17gは、以下のスキームに従って合成した。

塩化2-クロロトリチル樹脂(1.4mmol/g、1.43g、2mmol)を、フリット付き20mLシリンジに秤量した。この樹脂をDCM(10mL)により2倍に膨潤させた。N-Fmoc-N-メチル-L-Asp(OtBu)-OH(1.06g、2.5mmol)をDCM(6mL)に溶解し、シリンジに抜き取った。DIPEA(436μL、2.5mmol)をDCM(1mL)に溶解し、シリンジに抜き取った。このシリンジを5分間振盪攪拌した。DIPEA(654μL、3.75mmol)をDCM(1mL)に溶解し、シリンジに抜き取った。このシリンジを1時間振盪攪拌した。このシリンジにMeOH(2mL)を抜き取り、このシリンジを30分間振盪攪拌した。樹脂をDMF(10mL)により5回洗浄した。この樹脂をDMF:DBU:ピペリジン(96:2:2 v/v/v、7mL)により5分間で3回振盪攪拌した。この樹脂をDMF(5mL)により5回洗浄した。6-トリチルメルカプトヘキサン酸(1.95g、5mmol)及びPyBOP(2.6g、5mmol)をDMF(6mL)に溶解し、DIPEA(3.5mL、20mmol)を加えた。1分の予備インキュベート後、このシリンジに上記の溶液を抜き取り、シリンジを3時間振盪攪拌した。樹脂をDMF(7mL)により5回、DCM(7mL)により5回洗浄した。HFIP/DCM(1/4、v/v、各8mL)の溶液をシリンジに抜き取り、このシリンジを30分間3回振盪攪拌した。採集したろ液を真空で濃縮した。粗製17a(0.84g、1.45mmol、73%)を、さらに精製することなく次の工程に使用した。MS:m/z=598.18=[M+Na]⁺、(計算値=598.26)。

17a(1.67g、2.9mmol)をDCM(20mL)に溶解し、N-Boc-N-メチルエチレンジアミン(0.62mL、3.48mmol)及びPyBOP(1.81g、3.48mmol)を加えた。DIPEA(2.02mL、11.6mmol)を加え、この反応物を1時間撹拌した。AcOH(2mL)を加え、この混合物をDCM(40mL)により希釈し、水(2x20mL)により洗浄した。有機層をMgSO₄で脱水して真空で濃縮し、粗製残さをフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、17b(1.74g、2.38mmol、82%)が得られた。MS:m/z=754.19=[M+Na]⁺、(計算値754.39)。

17b(1.74g、2.38mmol)及びトリフェニルメタノール(0.62g、2.38mmol)をDCM(7.2mL)に溶解し、撹拌しながらTFA(7.2mL)を加えた。この反応物を90分間撹拌し、溶媒を窒素通気中で45分間かけて除去した。この残さをDCMと一緒に共蒸発させた。この残さをACN/水/TFA(2:1:0.003 v/v/v、14mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、17c(0.9g、1.3mmol、TFA塩、55%)が得られた。MS:m/z=576.20=[M+H]⁺、(計算値=576.29)。

17c(0.9g、1.3mmol)をDCM(20mL)に溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(0.46g、1.56mmol)を加えた。DIPEA(0.45mL、2.6mmol)をゆっくりと加え、この反応物を30分間撹拌した。DIPEA(0.11mL、0.65mmol)を加え、反応物を30分間撹拌した。再度、DIPEA(0.11mL、0.65mmol)を加え、この反応物を60分間撹拌した。AcOH(0.68mL)を加え、この混合物を真空で濃縮し、粗製残さをフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、17d(1.04g、最大1.3mmol)が得られた。MS:m/z=754.28=[M+Na]⁺、(計算値754.28)。

17d(1.04g、最大1.3mmol)をHFIP/TES/水(39:1:1 v/v/v、8.2mL)に溶解し、TFA(0.66mL)を加えた。15分間撹拌した後、この反応物を真空で乾燥し、残さをACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、12mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、17e(0.32g、0.65mmol、50%)が得られた。MS:m/z=490.19=[M+H]⁺(計算値=490.19)。

17e(181mg、0.37mmol)をACN/水/TFA(1:1:0.002 v/v/v、3mL)に溶解した。16e(1.05g、0.37mmol(10×TFA塩))を、ACN/水(1:1 v/v、20mL)に溶解した。両方の溶液を合わせて、pH7.4のリン酸ナトリウム(0.5M、4mL)を加え、この混合物を30分間撹拌した。ACN/水/TFA(1:1:0.22 v/v/v)を添加することにより、溶液のpHをおよそpH2に調整し、ACNを真空で除去した。残さをRP-HPLCにより精製すると、17f(0.47g、0.24mmol、5×TFA塩、65%)が得られた。MS:m/z=676.86=[M+2H]²⁺、(計算値=676.86)。

17f(0.18g、94μmol)をACN(6mL)に溶解し、NHS(92mg、0.8mmol)及びDCC(166mg、0.8mmol)を加え、この反応物を1時間撹拌した。溶媒を真空で除去し、残さをACN/水/TFA(0.15:0.85:0.001 v/v/v、6mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、17g(129mg、64μmol、5×TFA塩、68%)が得られた。MS:m/z=725.37=[M+H]⁺、(計算値=725.37)。

[実施例18]
リンカー試薬18iの合成
リンカー試薬18iは、以下のスキームに従って合成した。

N-Boc-エチレンジアミン(0.77g、4.8mmol)をDCM(15mL)に溶解し、撹拌しながら、6-トリチルメルカプトヘキサン酸(2.25g、5.76mmol)及びPyBOP(3.0g、5.76mmol)を加えた。DIPEA(2.52mL、14.4mmol)を加え、反応物を1時間撹拌した。この反応物をジエチルエーテル(150mL)により希釈し、わずかに塩基性の飽和食塩水(3×30mL、飽和食塩水100mL及び3mLの0.1M水性NaOHから調製した)により洗浄した。有機相をもう1回、飽和食塩水(30mL)により洗浄し、Na₂SO₄で脱水して真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製すると、18aが白色発泡体として得られた。収率:2.55g(4.79mmol、99%)。MS:m/z 555.24=[M+Na]⁺、(計算値=555.27)。

18a(2.55g、4.79mmol)をTHF(26mL)に溶解し、オーブンで乾燥後にアルゴンを満たした丸底フラスコに移送した。THF中のボラン-THF錯体(1M、17.7mL、17.71mmol)を加え、この反応物を15時間撹拌した。MeOH(5.4mL)をゆっくりと加え、N,N'-ジメチルエチレンジアミン(3.11mL、28.8mmol)を加え、この反応物を2.5時間還流した。冷却後、この反応物を酢酸エチルにより希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(2x125mL)及び飽和食塩水(1x125mL)により洗浄した。有機相をNa₂SO₄で脱水して真空で濃縮すると、18bが得られ、これをさらに精製することなく次の工程に使用した。収率:2.38g(4.59mmol、96%)。MS:m/z 519.27=[M+H]⁺、(計算値=519.31)。

18b(1.19g、2.29mmol)をDCMに溶解し、(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-4-イル)-メチル4-ニトロフェニルカーボネート(1.02g、3.44mmol)及び2,4,6-コリジン(1.36mL、10.32mmol)を加え、この反応物を23時間撹拌した。反応物を真空で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーを使用して精製すると、18cが得られた。収率:1.19g(1.77mmol、79%)。MS:m/z 697.18=[M+Na]⁺、(計算値=697.29)。

18c(0.5g、0.74mmol)をDCM(2.5mL)に溶解し、トリフェニルメタノール(0.19g、0.74mmol)及びTFA(2.5mL)を加えた。この反応物を40分間撹拌し、アルゴンの通気中で濃縮し、真空(<0.1mbar)で乾燥した。この残さをACN/水(7:3 v/v、10mL)に溶解し、RP-HPLCにより精製すると、18d(0.50g、0.84mmol、114%)が得られた。MS:m/z 575.33=[M+H]⁺、(計算値=575.26)。

塩化2-クロロトリチル樹脂(1.22mmol/g、0.87g、1mmol)を、フリット付き10mLシリンジに秤量した。樹脂をDCM(5mL)により膨潤させて、DCM(5×4mL)により洗浄した。N-Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH(1.1g、2.7mmol)をDCM(5mL)に溶解し、DIPEA(0.66mL、3.78mmol)を加え、この溶液をシリンジに抜き取った。このシリンジを1時間振盪攪拌した。このシリンジにMeOH(0.5mL)を抜き取り、シリンジを15分間振盪攪拌した。樹脂をDCM(4mL)により5回、DMF(5mL)により5回洗浄した。DMF:DBU:ピペリジン(96:2:2 v/v/v、4mL)により、樹脂を5分間で3回振盪攪拌した。樹脂をDMF(4mL)により5回洗浄した。無水酢酸(0.51mL、5.4mmol)及びDIPEA(1.9mL、10.8mmol)をDMF(6mL)に溶解し、この溶液をシリンジに抜き取り、このシリンジを15分間振盪攪拌した。樹脂をDMF(4mL)により5回、DCM(4mL)により5回洗浄した。HFIP/DCM(1/4 v/v、各5mL)の溶液をシリンジに抜き取り、このシリンジを10分間3回振盪攪拌した。採集したろ液を真空で濃縮した。粗製18e(0.29g、1.23mmol、114%)を、さらに精製することなく次の工程に使用した。MS:m/z 254.38=[M+Na]⁺、(計算値=254.12)。

18e(65mg、0.28mmol)をDCM(3mL)に溶解し、PyBOP(0.18g、0.34mmol)及びDIPEA(0.15mL、0.84mmol)を加えた。18d(0.18g、0.31mmol)をDCM(3mL)に溶解し、上記の反応物に加えた。この反応物を1時間撹拌し、真空で濃縮した。残さをRP-HPLCにより精製すると、18f(97mg、0.12mmol、44%)が得られた。MS:m/z 810.02=[M+Na]⁺、(計算値=810.34)。

18f(97mg、0.12mmol)をTFA/TES/水(92:2.5:2.5 v/v/v、3mL)に溶解し、この溶液にアルゴンを通気しながら、反応物を激しく3時間撹拌した。3時間後、アルゴン通気中で溶媒を除去し、残さをRP-HPLCにより精製すると、18g(16mg、33μmol、27%)が得られた。MS:m/z 490.21=[M+H]⁺、(計算値=490.19)。

18g(16mg、33μmol)をACN/水(1:1 v/v、3mL)に溶解し、2,2'-ジチオジピリジン(14mg、65μmol)のACN(0.1mL)溶液、続いてpH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液(0.5M、0.1mL)を加えた。この反応物を4.5時間撹拌し、生成物をRP-HPLCによって直接精製すると、18h(14mg、23μmol、71%)が得られた。MS:m/z 598.98=[M+H]⁺、(計算値=599.19)。

18h(14mg、23μmol)をDCM(3mL)に溶解し、NHS(3mg、28μmol)、DCC(6.5mg、30μmol)、及びDMAP(0.3mg、2μmol)を加えた。この反応物を1.5時間撹拌し、溶媒をアルゴン通気中で除去した。この残さをACN/水/TFA(9:1:0.01 v/v/v、3mL)中に懸濁させて、ろ過した。ろ液をRP-HPLCにより精製すると、18i(17mg、23μmol、100%)が得られた。MS:m/z 696.20=[M+H]⁺、(計算値=696.20)。

[実施例19]
架橋試薬19c、19gの合成
架橋試薬19cは、以下のスキームに従い、スべリン酸モノベンジルエステル2a及びPEG6000から調製した。

化合物19aの合成のために、アゼライン酸モノベンジルエステル2a(6.50g、23.3mmol)及びPEG6000(40.0g、6.67mmol)をジクロロメタン(140mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(4.81g、23.3mmol)及びDMAP(0.040g、0.33mmol)のジクロロメタン(40mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、この混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(70mL)に溶解し、室温でMTBE(300mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(500mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率41.2g(95%)、白色粉末19a。
MS:m/z 833.75=[M+8H]⁸⁺(計算値=833.74)。

化合物を含有している多分散PEGの質量スペクトルに関しては、単一の質量ピークを選択した。

化合物19bの合成のために、化合物19a(41.2g、6.32mmol)を酢酸メチル(238mL)及びエタノール(40mL)に溶解し、次に、活性炭担持パラジウム(400mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトパッドによりろ過し、ろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率38.4g(96%)、ガラス状固体19b。
MS:m/z 750.46=[M+9H]⁹⁺(計算値=750.56)。

化合物19cの合成のために、化合物19b(38.2g、6.02mmol)及びTSTU(7.25g、mmol)を、室温でジクロロメタン(130mL)に溶解した。次に、DIPEA(3.11g、24.1mmol)を加え、この混合物を1時間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液をジクロロメタン(100mL)により希釈し、水(750g)/NaCl(197g)/NaOH(3g)の溶液(200mL)により洗浄した。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。

残さをトルエン(210mL)に溶解し、室温でMTBE(430mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(450mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率35.8g(91%)、白色粉末19c。
MS:m/z 857.51=[M+8H]⁸⁺(計算値=857.51)。

架橋試薬19gは、以下のスキームに従い、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステル及びPEG8000から調製した。

イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-19dの合成のために、イソプロピルマロン酸(35.0g、239mmol)、ベンジルアルコール(23.3g、216mmol)及びDMAP(1.46g、12.0mmol)をアセトニトリル(100mL)に溶解した。氷浴を用いて、混合物を0℃に冷却した。DCC(49.4g、239mmol)のアセトニトリル(150mL)溶液を0℃で15分以内に加えた。氷浴を取り除き、この反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に固体をろ別した。ろ液を真空で40℃で蒸発させて、残さをMTBE(300mL)に溶解した。この溶液を飽和NaHCO₃水溶液により抽出(2×300mL)し、次に、6N塩酸を使用して、合わせた水相を酸性にして、pH=1〜3にした。得られたエマルションをMTBEで抽出(2×300mL)し、溶媒を蒸発させた。合わせた有機相を飽和水性NaCl(200mL)により洗浄し、MgSO₄で脱水した。生成物を、溶離液として酢酸エチル/ヘプタン(10:90→20:80)を使用して、340gのシリカ上で精製した。溶離液を蒸発させて、残さを真空で一晩乾燥した。
収率9.62g(17%)、無色油状物rac-19d。
MS:m/z 237.11=[M+H]⁺(計算値=237.11)。

化合物rac-19eの合成のために、イソプロピルマロン酸モノベンジルエステルrac-19d(2.25g、9.50mmol)及びPEG8000(19.0g、2.38mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解し、氷浴により冷却した。DCC(1.96g、9.50mmol)及びDMAP(14mg、0.12mmol)のジクロロメタン(10mL)溶液を加えた。氷浴を取り除き、混合物を室温で一晩撹拌した。得られた懸濁液を0℃に冷却し、固体をろ別した。溶媒を真空で蒸発させた。

残さをジクロロメタン(40mL)に溶解し、室温でMTBE(270mL)により希釈した。この混合物を-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(500mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率18.5g(92%)、白色粉末rac-19e。
MS:m/z 737.43=[M+13H]¹³⁺(計算値=737.42)。

化合物rac-19fの合成のために、化合物rac-19e(18.4g、2.18mmol)を酢酸メチル(160mL)に溶解し、活性炭担持パラジウム(254mg)を加えた。周囲圧力の水素雰囲気下、この混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をセライトパッドによりろ過し、このろ液を蒸発させて、真空で一晩乾燥した。
収率17.7g(98%)、ガラス状固体rac-19f。
MS:m/z 723.51=[M+13H]¹³⁺(計算値=723.55)。

化合物rac-19gの合成のために、化合物rac-19f(13.6g、1.65mmol)及びTSTU(1.96g、6.60mmol)を、室温でジクロロメタン(60mL)に溶解した。次に、DIPEA(852mg、6.60mmol)を加え、この混合物を45分間撹拌した。得られた懸濁液をろ過し、ろ液を酢酸エチル(70mL)により希釈し、0.5Mリン酸塩緩衝液(pH=6.5)(70mL)により洗浄した。有機相をMgSO₄で脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。残さをトルエン(80mL)に溶解し、残存固体をろ別し、トルエン(20mL)により洗浄した。合わせたトルエンフラクションを、室温でMTBE(35mL)により希釈し、-20℃で一晩保存した。この沈殿物をガラスフィルターPor.3によりろ過することによって採集し、冷MTBE(-20℃)(600mL)により洗浄した。この生成物を真空で一晩乾燥した。
収率12.1g(87%)、白色粉末rac-19g。
MS:m/z 738.51=[M+13H]¹³⁺(計算値=738.49)。

[実施例20]
遊離アミノ基を含有しているヒドロゲルビーズ20aの調製
20aは、撹拌速度560rpmを適用し、1b(398mg)、19c(2690mg)、DMSO(27.8g)、Cithrol(商標)DPHS(274mg)、TMEDA(1.8mL)、酢酸(2.7mL)を使用した以外、3cについて記載した通りに調製し、白色粉末として、遊離アミノ基0.152mmol/gである20aが、50μmのふるい上に0.22g、63μmのふるい上に0.33g、75μmのふるい上に0.52g得られた。

遊離アミノ基を含有しているヒドロゲルビーズ20bの調製
20bは、撹拌速度580rpmを適用し、1b(250mg)、rac-19g(2168mg)、DMSO(21.8g)、Cithrol(商標)DPHS(215mg)、TMEDA(1.1mL)、酢酸(1.7mL)を使用した以外、3cについて記載した通りに調製し、白色粉末として、遊離アミノ基0.154mmol/gとなる20bが、50μmのふるい上に0.09g、63μmのふるい上に0.17g、75μmのふるい上に0.54g得られた。

[実施例21]
ヒスチジン-タグ21を含有しているマレイミドの調製

RINKアミドMBHA樹脂(100〜200メッシュ、0.64mmol/gアミン)0.78gを、フリットを備えた20mLシリンジに移送し、DCM10mL中で膨潤させた。溶媒を排出し、樹脂をNMPにより3回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。樹脂をDMF中の20%ピペリジン(5mL)により、それぞれ15分間及び5分間処理し、Fmoc保護基を除去し、溶媒を毎回廃棄した。樹脂をNMPにより10回洗浄した。Fmoc-His(Trt)-OH(775mg)及びHATU(475mg)を、DMF中の0.5M HOAT(3mL)に溶解し、DIPEA(850μL)を加えた。この溶液をシリンジに抜き取り、この懸濁液を、周囲温度で3時間、穏やかな振とう下でインキュベートした。溶媒を廃棄し、樹脂をNMPにより5回洗浄した。上記の通り、Fmoc保護基を除去した。次の5回のカップリングは、NMP(3mL)中のFmoc-His(Trt)-OH(620mg)、HOBt(77mg)、TBTU(160mg)、及びDIPEA(850μL)のカップリング溶液を用いて、毎回実施した。反応は、毎回、穏やかな振とう下、周囲温度で1時間進行させ、次いでNMPによる洗浄、及びFmoc-脱保護を行った。その後に、この樹脂を、周囲温度で1時間、DMF中の0.5M HOAt(3mL)に溶解した、Fmoc-Ado-OH(385mg)、HATU(475mg)、DIPEA(850μL)の溶液により処理し、次いでNMPによる洗浄、及びFmoc脱保護を行った。この樹脂を、穏やかな振とう下、周囲温度で8時間、DMF中の0.5M HOAt(3mL)中のマレイミドプロピオン酸(169mg)、HATU(475mg)、DIPEA(850μL)により処理した。溶媒を廃棄し、樹脂をNMPにより5回洗浄し、DCMにより10回洗浄した。溶媒は毎回、廃棄した。最後に、この樹脂を、毎回、95%TFA/2.5%TIPS/2.5%水からなる溶液(5mL)により30分間で2回、及び1時間で2回処理した。この溶液を、個別の50mL Falconチューブに排出し、連続窒素流下でTFAを蒸発させた。残さに、氷冷エーテル(45mL)を加え、Falconチューブを遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄した。沈殿物を50%ACN/水に入れ、分取HPLCにより精製して凍結乾燥すると、21が得られた。
収率:0.15g(26%)。
MS:m/z 1136.49=[M+H]⁺(計算値=1136.49)。

[実施例22]
DMSO中のPEG化ヒドロゲルビーズ22の調製
例えば、3cにおいて記載されている乾燥ヒドロゲルビーズを、フリットを備えたシリンジに移送し、NMP(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)を加えた。穏やかな振とう下、ヒドロゲルを周囲温度で10分間、膨潤させた。溶媒を排出し、ヒドロゲルを毎回、DMSOにより10回、次いで、毎回、1%TMEDA/DMSO(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)により10回洗浄し、溶媒は毎回廃棄した。

0.2当量(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に対して)のPEG-NHSを、DMSO中の2当量(ヒドロゲルビーズのアミン含有量に対して)のTMEDAを含有している溶液に、37℃で15分間溶解した。この溶液をシリンジに抜き取り、得られたヒドロゲル懸濁液を穏やかな振とう下でインキュベートした。溶媒を排出し、ヒドロゲルをDMSO(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)により5回、次いで、0.1%酢酸/0.01%Tween20(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)による5回の洗浄サイクルで洗浄した。新しい0.1%酢酸/0.01%Tween20をシリンジに抜き取ると、初期重量に基づくと10mg/mLとなるヒドロゲル懸濁液が得られた。ヒドロゲルビーズのアミン含有量は、上記の通り求めた。式(2)に基づくと、これは、PEG化度の参照となる。

実施例22aは、ヒドロゲル20a(50mg)及び40kDAのPEG-NHS(60.8mg)を使用し、上記の手順に従って調製し、アミン含有量0.141mmol/gを有するPEG化ヒドロゲルビーズが得られた。

実施例22bは、ヒドロゲル20b(51.3mg)及び40kDAのPEG-NHS(59.5mg)を使用し、上記の手順に従って調製し、アミン含有量0.118mmol/gを有するPEG化ヒドロゲルビーズが得られた。

[実施例23]
マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ23の調製
ヒドロゲルビーズの初期重量に基づくと、PEG化前に10mg/mLとなる懸濁液としてのPEG化ヒドロゲルビーズを、フリットを備えたシリンジに移送した。溶媒を排出し、ヒドロゲルを水(5mL/100mgヒドロゲルビーズ)により10回洗浄し、溶媒は、毎回廃棄した。次に、このヒドロゲルビーズをNMPにより10回洗浄し、NMP中の2%DIPEAにより5回洗浄した。5当量のMal-PEG₆-Pfp(ヒドロゲルビーズのアミン含有量基準)をNMP(1mL/50mg試薬)に溶解し、洗浄済みヒドロゲルビーズに加えた。このヒドロゲル懸濁液を、室温で2時間インキュベートした。得られたマレイミド官能基化ヒドロゲルビーズを、毎回、NMP、その後に0.1%酢酸/0.01%Tween20によって、5回洗浄した。

ヒドロゲルビーズのマレイミド含有量は、Gude, M.、J. Ryfら(2002年)、Letters in Peptide Science、9巻(4号)、203〜206頁によって記載されている、ヒドロゲル上のマレイミド基にFmoc-システインをコンジュゲートし、続いてFmoc定量することにより求めた。

実施例23aは、22a(20aの初期乾燥重量に対して)(35mg)及びMal-PEG₆-Pfp(13mg)を使用し、上記の手順に従い調製した。

実施例23bは、22b(20bの初期乾燥重量に対して)(35mg)及びMal-PEG₆-Pfp(17mg)を使用し、上記の手順に従い調製した。

[実施例24]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグの合成
ルセンティス(80mg)(以下のスキームでは、ルセンティス-NH₂として示している)(10mMヒスチジン、10重量%α,α-トレハロース、0.01%Tween20(pH5.5)中の40mg/mLルセンティスを2000μL)を10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、ルセンティスの濃度が13.5mg/mLになるよう調節した。リンカー試薬4c(6mg)をDMSO(100μL)に溶解すると、100mMの濃度が得られた。ルセンティスの量に対して1モル当量のリンカー試薬4cを、ルセンティス溶液に加えた。この反応混合物を注意深く混合し、室温で5分間インキュベートした。続いて、リンカー試薬4cの1.3モル当量の追加分をルセンティス溶液に加えると、非修飾ルセンティス及び保護ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート24aの混合物が得られた。

1Mクエン酸ナトリウム(pH5.0)を添加することにより、この反応混合物のpHを6.5に調節し、Na₂EDTAを加えて、最終濃度5mMとした。24aの保護基を除去するため、0.5M NH₂OH(10mMクエン酸ナトリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH6.5に溶解した)を加えて、最終濃度を45mMにし、脱保護反応物を室温で4時間インキュベートすると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート24bが得られた。ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート24bの混合物を、10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH6.5)へと緩衝液の交換を行い、2種のルセンティス種の全濃度を12.1mg/mLに調節した。

[実施例25]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ25aの合成
マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5a(2.5mg)に、10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH6.5)中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート24b混合物(20mg)を加え、室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ25aが得られた。

実施例25bは、23a(2.5mg)(20aの乾燥重量に対して)を使用して、25aについて記載されている手順に従って調製した。

実施例25cは、23b(2.5mg)(20bの乾燥重量に対して)を使用して、25bについて記載されている手順に従って調製した。

[実施例26]
ブロッキングされているヒドロゲルビーズ26
ヒドロゲルビーズは、実施例3cにおいて記載されている手順に従って合成し、実施例5aにおいて記載されている手順に従ってマレイミド基により官能基化した。その後に、10mg/mLのヒドロゲル懸濁液(4mL)を、フリットを備えた20mLシリンジに移送した。溶媒を排出し、ヒドロゲルを10mMヒスチジン/10重量%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5(5mL)により10回洗浄した。溶媒を排出し、10mMヒスチジン/10重量%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の1mMβ-メルカプトエタノール(5mL)をシリンジに抜き取った。得られた懸濁液を、穏やかな振とう下、周囲温度で5分間インキュベートした。溶媒を廃棄し、ヒドロゲルを10mMヒスチジン/10重量%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5中の1mMβ-メルカプトエタノール(5mL)によりさらに9回処理した。溶媒は、毎回廃棄した。次に、ヒドロゲルビーズを、10mMヒスチジン/10重量%α,α-トレハロース/0.01%Tween20/pH5.5(毎回5mL)により10回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。次に、ヒドロゲルビーズを、PBS-T/pH7.4(毎回5mL)により10回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。最後に、新しいPBS-T/pH7.4をシリンジに抜き取り、懸濁液をFalconチューブに移送すると、26が得られた。

[実施例27]
ルセンティスヒドロゲルビーズ27への抗体結合
PBS-T緩衝液中のヒドロゲル懸濁液25a-c(35体積%)(20μL)を1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の第1の抗体溶液(400μL)と混合し、1.5mLのEppendorfチューブ中、200rpmで1時間インキュベートした。ルセンティスヒドロゲルビーズに関しては、抗体ab771(反ヒトIgG Fabフラグメント抗体[4A11](ab771)-Abcam、Cambridge、英国)の1:100希釈液を使用した。ヒドロゲルビーズを卓上型遠心分離器において、100gで1分間の遠心分離工程によって沈殿させた。この上澄み液をピペット操作により除去し、ヒドロゲルビーズがなんら除去されないよう注意した。ビーズの洗浄を2回の一連の洗浄工程により実施し、この洗浄工程には、PBS-T緩衝液(1mL)の添加、100gで1分間の遠心分離、及びピペット操作による上澄み液の慎重な除去が含まれた。1%BSA(Sigma、A3059)を含むPBS-T中の第2の抗体(400μL)をビーズに加え、200rpmで1時間インキュベートした。ルセンティスヒドロゲルビーズに関しては、抗体ab97041(ヤギ抗マウスIgG H&L(フィコエリトリン)予備吸着済み(ab97041)-Abcam、Cambridge、英国)の1:50希釈液を使用した。上澄み液をピペット操作により除去し、ヒドロゲルビーズがなんら除去されないよう注意した。ビーズの洗浄は、4回の一連の洗浄工程により実施し、この洗浄工程には、PBS-T緩衝液(1mL)の添加、100gで1分間の遠心分離、及びピペット操作による上澄み液の慎重な除去が含まれた。洗浄済みビーズをPBS-T(200μL)中で再懸濁させ、ブラック96ウェルプレート(ブラック、非結合型、製品番号655900、Greiner bio-one GmbH、72636 Frickenhausen、ドイツ)にすべて移送した。蛍光強度は、Tecan Infinite M200蛍光プレートリーダー(励起495nm、発光575nm、フラッシュ数25、積分時間20μs、ウェル5x5あたりの多重読取り(境界250μm)、最大ゲイン)を用いて決定した。

データ分析
PEG修飾ルセンティスヒドロゲルビーズへの抗体結合の測定は、非修飾ルセンティスヒドロゲルビーズ25aの標準曲線と比較して達成した。非修飾ルセンティスヒドロゲルビーズを、プラセボのヒドロゲルビーズ26と異なる比で混合した。プロット(非修飾ルセンティスヒドロゲルビーズの割合対蛍光強度)は、直線形式に適合した。PEG化ルセンティスヒドロゲルビーズへの抗体結合の割合は、得られた検量線に従って逆算した。

結果

[実施例28]
インビトロ放出速度-28aのインビトロ半減期の決定
濃厚なルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ懸濁液25a(50.3mg)(約1.68mgのルセンティスを含有)を、60mMリン酸ナトリウム、3mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH7.4)により5回洗浄し、最後に、前記緩衝液(1mL)中で懸濁させた。この懸濁液を37℃でインキュベートした。懸濁液の緩衝液を異なる時間間隔の後に交換し、220nmにおいてHPLC-SECにより分析した。遊離ルセンティスに相当するピークを積算し、遊離ルセンティスの総量を総インキュベート時間に対してプロットした。曲線のあてはめ用のソフトウェアを適用し、一次開裂速度を求めた。

実施例28bは、濃厚なルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ懸濁液25b(約1.14mgのルセンティスを含有)(35.0mg)を使用した以外、28aにおいて記載されている手順に従って調製した。

実施例28cは、濃厚なルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ懸濁液25c(約0.73mgのルセンティスを含有)(25.3mg)を使用した以外、28aにおいて記載されている手順に従って調製した。

[実施例29]
チオール官能基化ヒドロゲルビーズ29の調製
3cにおいて記載されている、アミン含有量0.097mmol/gを有する乾燥ヒドロゲルビーズ(100mg)を、フリットを備えた20mLシリンジに移送した。ヒドロゲルをNMP中で膨潤させ、溶媒を廃棄した。ヒドロゲルを毎回5mLのNMPを用いて5回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。ヒドロゲルビーズは、NMP中の2%DIPEA(毎回5mL)により5回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。ヒドロゲルビーズをDMSO(5mL)により5回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。OPSS-PEG₁₂-NHS(17.7mg)をDMSO(1mL)に溶解し、シリンジに抜き取った。この懸濁液を穏やかな振とう下、周囲温度で2時間インキュベートした。溶媒を排出し、ヒドロゲルビーズをDMSO(毎回5mL)により5回、15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/pH4.0(毎回5mL)により5回洗浄し、溶媒は毎回廃棄した。15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/pH4.0の緩衝液(10mL)をシリンジに抜き取り、得られた懸濁液をFalconチューブに移送した。Tween20(10μL)を加えた。このヒドロゲル懸濁液(1mL)をフリットを備えた5mLシリンジに移送し、溶媒を排出した。このヒドロゲルビーズを、TCEP50mM水溶液(1mL)と共に、穏やかな振とう下、周囲温度で10分間、インキュベートした。溶媒を排出し、ヒドロゲルビーズをTCEP50mM水溶液(毎回1mL)により5回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。このヒドロゲルビーズを15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01%Tween20/pH4.0(1mL)により10回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01%Tween20/pH4.0(1mL)をシリンジに抜き取ると、ヒドロゲル懸濁液として、ヒドロゲルビーズの初期乾燥重量に対して10mg/mLの29が得られた。

[実施例30]
チオール官能基化ヒスチジンタグ30の調製

RinkアミドMBHA樹脂(100〜200メッシュ、0.64mmol/gアミン)(0.2g)を、フリットを備えた5mLシリンジに移送し、DMF(2mL)中で10分間膨潤させた。溶媒を排出し、この樹脂をDMF(5mL)により5回洗浄し、溶媒は毎回廃棄した。樹脂をDMF中の20%ピペリジン(5mL)により15分で2回、処理し、溶媒を毎回廃棄して、Fmoc保護基を除去した。樹脂をDMF(2mL)により10回洗浄した。Fmoc-His(Trt)-OH(198mg)及びHATU(146mg)を、DMF中の0.5M HOAT(1mL)に溶解し、DIPEA(223μL)を加えた。この溶液をシリンジに抜き取り、この懸濁液を、周囲温度で1.5時間、穏やかな振とう下でインキュベートした。溶媒を廃棄し、樹脂を、DMF中の0.5M HOAT(1mL)中のFmoc-His(Trt)-OH(198mg)、HATU(146mg)、及びDIPEA(223μL)の溶液により1.5時間、再び処理した。溶媒を廃棄し、この樹脂をDMF(毎回2mL)により10回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。上記の通り、Fmoc保護基を除去した。次の5回のカップリングは、DMF中の0.5M HOAt(1mL)中のFmoc-His(Trt)-OH(198mg)、HATU(146mg)、及びDIPEA(223μL)のカップリング溶液を用いて、毎回実施した。反応は、毎回、穏やかな振とう下、周囲温度で1.5時間進行させ、次いでDMFによる洗浄、及びFmoc-脱保護を行った。その後に、この樹脂を、周囲温度で1.5時間、DMF中の0.5M HOAt(1mL)に溶解した、Fmoc-Ado-OH(123mg)、HATU(122mg)、DIPEA(223μL)の溶液により処理し、次いでDMFによる洗浄、及びFmoc脱保護を行った。穏やかな振とう下、この樹脂を周囲温度で1時間、DMF中の0.5M HOAt(1mL)中の3-(トリチルチオ-)プロピオン酸(112mg)、HATU(122mg)、及びDIPEA(223μL)により処理した。溶媒を廃棄し、樹脂をDMFにより10回、DCMにより10回洗浄した。溶媒は毎回、廃棄した。95%TFA/2.5%TIPS/2.5%水の溶液(毎回3mL)により、この樹脂を30分間で2回、及び1時間で1回処理した。この溶液を、個々の50mL Falconチューブに排出し、連続窒素流下でTFAを蒸発させた。残さに、氷冷エーテル(45mL)を加え、Falconチューブを遠心分離にかけ、上澄み液を廃棄した。沈殿物を50%ACN/水に入れ、分取HPLCにより精製して凍結乾燥すると、30が得られた。
収率:8.1mg(6%)。
MS:m/z 1073.46=[M+H]⁺(計算値=1073.46)。

[実施例31]
2-(2-ピリジルジスルファニル)エタノール31の調製

アルドリチオール(aldrithiol)-2(250mg)を50mMリン酸塩/ACN(pH7.4)(10mL)に溶解し、2-メルカプトエタノール(95μL)を加えた。この溶液を周囲温度で5分間、撹拌した。次に、アルドリチオール-2(50mg)を追加で加えた。この溶液を周囲温度で16時間撹拌した。粗生成物を分取HPLCにより精製して凍結乾燥すると、31が得られた。
収率:140.6mg(55%)。
MS:m/z 188.02=[M+H]⁺(計算値=188.02)。

[実施例32]
チオール官能基化ヒドロゲル32のブロッキング
チオール官能基化ヒドロゲルビーズ29(初期ヒドロゲルの乾燥重量に対して)4mgを、15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01%Tween20/pH4.0中の10mg/mL懸濁液として、フリットを備えた5mLシリンジに移送した。溶媒を排出し、15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01%Tween20/pH4.0中の31の5mM溶液(322μL)をシリンジに抜き取った。この懸濁液を、穏やかな振とう下、周囲温度で16時間インキュベートした。溶媒を排出し、このヒドロゲルビーズを15mMコハク酸塩/100mM NaCl/5mM EDTA/0.01%Tween20/pH4.0(2mL)により10回洗浄し、溶媒を毎回廃棄した。

[実施例33]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ33dの合成
ルセンティス(360mg)(以下のスキームでは、ルセンティス-NH₂として示している)(10mMヒスチジン、10重量%α,α-トレハロース、0.01%Tween20(pH5.5)中の40mg/mLルセンティスを9mL)を10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、ルセンティスの濃度が20mg/mLになるよう調節した。リンカー試薬11dをDMSOに溶解すると、100mMの濃度が得られた。ルセンティス量に対して5モル当量のリンカー試薬11dを、2モル当量、2モル当量、及び1モル当量というステップで、ルセンティス溶液に加えた。各リンカー試薬の添加後、反応混合物を注意深く混合し、室温で5分間インキュベートすると、非修飾ルセンティスと保護ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33aとの混合物が得られた。

1Mクエン酸ナトリウム(pH5.0)を添加することにより、この反応混合物の1/4のpHを6.5に調節し、Na₂EDTAを加えて、最終濃度5mMとした。33aの(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-イル)-メチルオキソカルボニル保護基を除去するため、0.5M NH₂OH(10mMクエン酸ナトリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH6.5に溶解した)を加えて、最終濃度を45mMにし、脱保護反応物を室温で135分間インキュベートすると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33bが得られた。ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33bの混合物を15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)へと緩衝液の交換を行い、続いて濃縮し、15mg/mL濃度にした。このタンパク質溶液を4℃に冷却し、15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中の、総ルセンティス含有量に対して1モル当量の25mM DTTを加えて、Pys保護基を除去すると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33cが得られた。非修飾ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33cの混合物を15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)へと緩衝液の交換を行い、続いて、濃縮して28.7mg/mLの濃度にした。混合物中のルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33cの含有量は、Ellmanのアッセイにより決定したところ、15%であった。

15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33cの混合物79.7mgを、マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5c(5.1mg)に加え、0.5Mコハク酸(pH6.0)を添加することによりpHをpH5に調節し、室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ33dが得られた。過剰量のマレイミドは、15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中の、1モル当量(マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5cのマレイミド含有量に対して)の1mM 2-メルカプトエタノールを用いる、8回のインキュベートステップにより、室温で15分間、ブロッキングした。33dのインビトロ半減期を決定するためのインビトロ放出速度解析は、実施例7に従って実施した。

[実施例34]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート34dの合成
ルセンティス(120mg)(以下のスキームでは、ルセンティス-NH₂として示している)(10mMヒスチジン、10重量%α,α-トレハロース、0.01%Tween20(pH5.5)中の40mg/mLルセンティスを3mL)を60mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、ルセンティスの濃度が20mg/mLになるよう調節した。リンカー試薬14f(以下のスキームには、1つの位置異性体しか表記されていない)をDMSOに溶解すると、100mM濃度が得られた。ルセンティスの量に対して2モル当量のリンカー試薬14fを、ルセンティス溶液に加えた。この反応混合物を注意深く混合し、室温で5分間インキュベートした。続いて、リンカー試薬14fをさらに1モル当量添加した。室温で5分間さらにインキュベートすると、非修飾ルセンティス及び保護ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34aの混合物が得られた。4時間室温でインキュベートすると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34aが、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34bに定量的に転化した。

ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34bの混合物を15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)へと緩衝液の交換を行い、このタンパク質濃度を11.8mg/mLに調節した。このタンパク質溶液を4℃に冷却し、15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中の、総ルセンティス含有量に対して1モル当量の25mM DTTを加えて、Pys保護基を除去すると、ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34cが得られた。非修飾ルセンティス及びルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34cの混合物を15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)へと緩衝液の交換を行い、続いて、濃縮して17.2mg/mL濃度にした。

15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34cの混合物(106.5mg)に、総ルセンティス含有量に対して、1モル当量のヒスチジンタグ21含有マレイミドを加え、0.5Mコハク酸(pH6.0)を添加することにより、pHをpH5に調節した。室温で4.5時間インキュベートすると、ルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート34dが得られ、このコンジュゲートを、ルセンティス及びヒスチジンタグ21を含有している過剰量のマレイミドから、陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。

[実施例35]
インビトロ放出速度-一過性のヒスチジン-タグコンジュゲートのインビトロ半減期の決定
陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製したルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート34dを、60mMリン酸ナトリウム、3mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、この濃度を1mg/mLになるよう調節した。様々な時間間隔で、37℃でインキュベートした後、タンパク質試料200μgを陽イオン交換クロマトグラフィーにより分析した。放出ルセンティスの量は、放出ルセンティス及びルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート34dのピーク面積の比較により求め、インキュベート時間に対してプロットした。曲線のあてはめ用のソフトウェアを適用し、一次開裂速度を求めた。

[実施例36]
一過性のタグ付きルセンティス-リンカーモノコンジュゲート36bの合成及び精製
ルセンティス(400mg)(以下のスキームでは、ルセンティス-NH₂として示している)(10mMヒスチジン、10重量%α,α-トレハロース、0.01%Tween20(pH5.5)中の40mg/mLルセンティスを10mL)を60mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム(pH7.4)へと緩衝液の交換を行い、ルセンティスの濃度が20.8mg/mLになるよう調節した。リンカー試薬17gをDMSOに溶解すると、100mMの濃度が得られた。ルセンティスの量に対して4.5モル当量のリンカー試薬17gを、ルセンティス溶液に加えた。この反応混合物を注意深く混合し、室温で5分間インキュベートすると、非修飾ルセンティスと保護されているタグ付きルセンティス-リンカーモノコンジュゲート36aとの混合物が得られた。

ルセンティスと保護されているタグ付きルセンティス-リンカーモノコンジュゲート36aとの混合物を、60mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム(pH6.5)へと緩衝液の交換を行った。36aの(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-イル)-メチルオキソカルボニル保護基を除去するため、0.5M NH₂OH(10mMクエン酸ナトリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH6.5に溶解した)を加えて、最終濃度を45mMにし、脱保護反応物を室温で2.5時間インキュベートすると、タグ付きルセンティス-リンカーモノコンジュゲート36bが得られ、これを陽イオン交換クロマトグラフィーにより非修飾ルセンティスと分離した。

[実施例37]
チオール/活性化ジスルフィドコンジュゲート化学を使用する、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ37aの合成
15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH4.0中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート33b混合物(c=41mg/mL)(61.5mg)を、チオール官能基化ヒドロゲルビーズ29(6.6mg)に加えた。ヒドロゲル担持反応物を、4℃で60時間、続いて室温で16時間インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ37aが得られた。

[実施例38]
チオール/マレイミドコンジュゲート化学を使用する、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ38aの合成
20mg/mL濃度のルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34c(10mg)をマレイミド官能基化ヒドロゲル5c(5mg)に加え、この反応混合物をpH5において室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ38aが得られる。過剰量のマレイミドは、15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中の、1mM 2-メルカプトエタノールの1モル当量(マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5cのマレイミド含有量に対して)を用いる、8回のインキュベートステップにより、室温で15分間、ブロッキングする。

[実施例39]
チオール/活性化ジスルフィドコンジュゲート化学を使用する、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ39aの合成
15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、pH4.0中の40mg/mLの総ルセンティス濃度のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート34b混合物(50mg)を、チオール官能基化ヒドロゲルビーズ29(5mg)に加え、この反応混合物を室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ39aが得られる。ヒドロゲル上の過剰量のチオール基は、15mMコハク酸、100mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA(pH4.0)中の、31の1mM溶液を5モル当量(チオール官能基化ヒドロゲルビーズ29のチオール含有量に対して)用いて室温で16時間、インキュベートすることによってブロッキングする。

[実施例40]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート40aの合成
リンカー試薬9cを使用し、一過性のルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート40aを実施例33に従って調製した。マレイミド官能基化ヒドロゲル5cの代わりに、マレイミド官能基化ヒスチジン-タグ21の総ルセンティス含有量に対して1モル当量を使用した。

[実施例41]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート41aの合成
リンカー試薬13gを使用し、一過性のルセンティス-リンカー-ヒスチジン-タグコンジュゲート41aを実施例34に従って調製した。

[実施例42]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ42aの合成
リンカー試薬15bを使用し、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ42aを実施例33に従って調製した。(5-メチル-2-オキソ-1,3-ジオキソール-イル)-メチルオキソカルボニル保護基が存在しないため、ヒドロキシルアミン補助による脱保護工程は実施しなかった。

[実施例43]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ43aの合成
リンカー試薬18iを使用し一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ43aを実施例33に従って調製した。

[実施例44]
一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aの合成
マレイミド官能基化ヒドロゲルビーズ5c(153mg)に、10mMリン酸ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、5mM Na₂EDTA、0.01%Tween20(pH6.5)中のルセンティス/ルセンティス-リンカーモノコンジュゲート6b混合物(1147mg)を加え、室温で一晩インキュベートすると、一過性のルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aが得られた。

[実施例45]
ルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aから放出されるルセンティスの結合親和力の評価
ルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aから放出されるルセンティスの活性VEGF結合濃度は、Biacore表面プラズモン共鳴システム(Biacore T200、Pharmacia、Piscataway、NJ)上で測定した。VEGFは、アミンカップリングキット(GE Healthcare)を使用して、カルボキシメチル化デキストランセンサーチップ(CM5)上に共有結合で固定化した。ルセンティスのVEGFへの結合は、180秒間の注射前後における共鳴ユニットの変化をモニターすることにより求めた。活性VEGF結合濃度は、5μg/mL〜0.156μg/mLの参照物質の段階希釈液から調製された標準検量線を使用して求めた。Bradfordアッセイ又はUV-可視光吸光度によって求まった、全タンパク質濃度による、この活性結合濃度の比により、結合率が得られる。

ルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aに関しては、28日後及び121日後以降に放出されたルセンティスは、80±10%結合を示すことが示された。

[実施例46]
ラニビズマブ測定及び解析
両群に関して、定性的なリガンド-結合アッセイは、ウサギの硝子体マトリックス中のラニビズマブ濃度を測定するよう設計した。ルセンティス-リンカー-ヒドロゲルプロドラッグ44aの定性化に関しては、ヒドロゲルが、すべての試験濃度において、ラニビズマブの定量の妨げにならないよう決定した。このアッセイは、組換えヒトVEGF-Aを使用し、ウサギの硝子体試料中のラニビズマブを捕捉した。結合しているラニビズマブは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗ヒトF(ab')2を使用して検出し、ペルオキシダーゼ基質(TMB)を発色に使用した。薬物レベルは、マイクロプレートリーダを使用し、吸光度分光法を使用して定量した。本検討の試料におけるラニビズマブの濃度は、標準曲線から算出し、ウサギの硝子体マトリックス中の最小測定可能濃度(MQC)は、1.5ng/mLであった。この硝子体における濃度をプロットし、MATLABソフトウェアを使用して解析した。

略語:
aq. 水性
Asp アスパラギン酸
Boc tert-ブチルオキシカルボニル
CIEC 陽イオン交換クロマトグラフィー
COMU (1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスフェート
DBU 1,8-ジアザビシクロ(5.4.0)ウンデカ-7-エン
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMAP ジメチルアミノピリジン
DMF ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオトレイトール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
Fmoc フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU 1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスフェート
HFIP ヘキサフルオロイソプロパノール
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
iPrOH イソプロパノール
Lys リシン
max. 最大
マレイミド-NH-PEG12-PFE
N-(3-マレイミドプロピル)-39-アミノ-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-ドデカオキサ-ノナトリアコンタン酸ペンタフルオロフェニルエステル
Me メチル
MeOAc 酢酸メチル
MeOH メタノール
MES 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
MMT 4-メトキシトリフェニルメチル
MS 質量分析法
MTBE メチル-tert-ブチルエーテル
NHS N-ヒドロキシスクシンイミド
Oxyma Pure 2-シアノ-2-(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル
PEG ポリエチレングリコール
Pys 2-ピリジンスルフェニル
PyBOP ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
RP-HPLC 逆相-高速液体クロマトグラフィー
RT 室温
sat. 飽和
Su N-ヒドロキシスクシンイミジル
tBu及びt-Bu tert.-ブチル
TAN 1,5,9-トリアザノナン
TES トリエチルシラン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TLC 薄層クロマトグラフィー
TMEDA N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン
Tmob 2,4,6-トリメトキシベンジル
Trt トリチル
TSTU O-(N-スクシンイミジル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート

Claims

1つ以上の眼状態を処置する方法において使用するための、1種以上の薬学的に許容される賦形剤及びVEGF中和プロドラッグを含む医薬組成物であって、プロドラッグが、共有結合により結合されているVEGF中和生物活性部分を含む、医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、担体連結プロドラッグである、請求項1に記載の医薬組成物。

担体連結プロドラッグの担体が、ヒドロゲルである、請求項2に記載の医薬組成物。

担体が、PEGをベースとするヒドロゲルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。

処置が、プロドラッグの眼内投与を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬組成物。

眼内投与が、眼内注射によるものである、請求項5に記載の医薬組成物。

医薬組成物中に含まれるプロドラッグが、5〜200mgプロドラッグ/mL医薬組成物の濃度を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。

組成物が、プロドラッグの総重量に対して、8〜80重量%のVEGF中和生物活性部分を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬組成物。

注射が、1回の注射あたり、10〜200μlの範囲の注射量で実施される、請求項6から8のいずれか一項に記載の医薬組成物。

2回のVEGF中和プロドラッグの眼内投与間の期間が、少なくとも1か月である、請求項5から9のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、抗VEGF抗体フラグメント、DARPin、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、同族VEGFR受容体及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に結合する抗VEGFR抗体フラグメントからなる薬物の群から選択される生物活性部分を結合形態で含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、MP0112、KH902、ESBA1008、AL39324、ALG-1001、及びベバシラニブ、並びに/又はそれらのフラグメントからなる群から選択される生物活性部分を結合形態で含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、ラニビズマブを結合形態で含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、式(F-i)の部分

(式中、
Dは、ラニビズマブであり、
点線は、担体又は任意のスペーサー部分に結合していることを示しており、
Xは、C(R⁴R^4a)、N(R⁴)、O、C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)、C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-N(R⁶)、N(R⁶)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-O、又はO-C(R⁴R^4a)であり、
X¹は、C又はS(O)であり、
X²は、C(R⁷,R^7a)又はC(R⁷,R^7a)-C(R⁸,R^8a)であり、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸、R^8aは、H及びC_1〜4アルキルからなる群から独立して選択され、
場合により、ペアR^1a/R^4a、R^1a/R^5a、R^4a/R^5a、R^4a/R^5a、R^7a/R^8aの1つ以上は、化学結合を形成し、
場合により、ペアR¹/R^1a、R²/R^2a、R⁴/R^4a、R⁵/R^5a、R⁷/R^7a、R⁸/R^8aの1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、C_3〜7シクロアルキル、又は4〜7員のヘテロシクリルを形成し、
場合により、ペアR¹/R⁴、R¹/R⁵、R¹/R⁶、R⁴/R⁵、R⁷/R⁸、R²/R³の1つ以上は、それらが結合している原子と一緒になって、環Aを形成し、
場合により、R³/R^3aは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、4〜7員の複素環を形成し、
Aは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、テトラリニル、C_3〜10シクロアルキル、4〜7員のヘテロシクリル、及び8〜11員のヘテロビシクリルからなる群から選択され、
場合により、式(F-i)の部分はさらに置換されているが、但し、式(F-i)中のアスタリスクが付いているヒドロゲルは、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の医薬組成物。

X¹がCである、請求項14に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、式(f-ii)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、X²、及びDは、請求項14において定義されている通りに使用され、
R¹⁰は、H及びC_1〜6アルキルから選択され、
SP⁰は、スペーサー部分であり、
式(F-ii)の部分は、場合によりさらに置換されているが、但し、式(F-ii)中のアスタリスクが付いているヒドロゲルは、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む、請求項14又は15に記載の医薬組成物。

好ましくは、R¹及びR^1aが共にHである、請求項14から16のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、式(F-iiia)又は(F-iiib)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R²、R^2a、R³、R^3a、R⁷、R^7a、R⁸、R^8a、X²、及びDは、請求項14において定義されている通りに使用され、
R¹⁰及びSP⁰は、請求項16において定義されている通りに使用され、
式(F-iiia)又は(F-iiib)の部分は、場合によりさらに置換されているが、但し、式(F-iiia)及び(F-iiib)中のアスタリスクが付いている水素は、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)を含む、請求項14から17のいずれか一項に記載の医薬組成物。

VEGF中和プロドラッグが、式(F-iva)又は(F-ivb)の部分

(式中、
点線は、担体に結合していることを示しており、
R³及びR^3aは、請求項14において定義されている通りに使用され、
R^10bは、C_1〜6アルキルであり、
式(F-iva)又は(F-ivb)の部分は、場合によりさらに置換されているが、但し、アスタリスクが付いている水素は、置換基により置きかえられていることはなく、且つR³及びR^3aは、互いに独立して、Hであるか、又はSP³混成炭素原子によってNに結合していることを条件とする)
を含む、請求項14から18のいずれか一項に記載の医薬組成物。

R³がHであり、R^3aがメチルである、請求項14から19のいずれか一項に記載の医薬組成物。

R³とR^3aが共にHである、請求項14から19のいずれか一項に記載の医薬組成物。

眼状態が、眼血管新生を特徴とする疾患である、請求項1から22のいずれか一項に記載の医薬組成物。

眼内血管新生が、視神経乳頭血管新生、虹彩血管新生、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、角膜血管新生、硝子体血管新生、緑内障、パンヌス、翼状片、黄斑浮腫、黄斑変性、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性黄斑浮腫、脈管性網膜症、網膜変性、後水晶体線維増殖、網膜芽細胞腫、黄斑変性の未熟児網膜症、角膜移植片血管新生、網膜中心静脈閉塞症、病的近視、眼腫瘍、ブドウ膜炎、目の炎症性疾患、及び増殖性硝子体網膜症からなる群から選択される眼疾患である、請求項23に記載の医薬組成物。

医薬組成物が、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、抗VEGF抗体フラグメント、DARPin、アンチカリン、リポカリン、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、同族VEGFR受容体及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に結合する抗VEGFR抗体フラグメントからなる群から選択される1種以上の薬物を、その/それらの遊離形態でさらに含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の医薬組成物。

医薬組成物が、VEGF核酸を標的とするアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、リボザイム又はRNAi分子、VEGFがその同族受容体に結合するのを阻止する抗VEGFアプタマー、抗VEGF抗体、抗VEGF抗体フラグメント、DARPin、アンチカリン、リポカリン、及び可溶性VEGF受容体デコイ、同族VEGF受容体(VEGFR)核酸を標的とするアンチセンス、リボザイム、及びRNAi分子、同族VEGFR受容体に結合する抗VEGFRアプタマー又は抗VEGFR抗体、同族VEGFR受容体及びVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤に結合する抗VEGFR抗体フラグメントからなる群から選択される生物活性部分を結合形態で含む1種以上のプロドラッグをさらに含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の医薬組成物。