TW202022115A - 乙醯輔酶a羧化酶的反義寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本案提供一種胜肽核酸衍生物，其靶向人類ACC2前體mRNA「外顯子12」之5’剪接位點。在本案中，胜肽核酸衍生物強烈誘導細胞中人類ACC2 mRNA之剪接變體且非常適用於治療與人類ACC2蛋白質相關聯之皮膚老化的狀況或疾病。

Description

乙醯輔酶A羧化酶的反義寡核苷酸
本案係有關一種以互補方式靶向人類乙醯輔酶A羧化酶2前體mRNA之胜肽核酸衍生物，以改進乙醯輔酶A羧化酶2介導之皮膚老化。
皮膚老化由於老化跡象在皮膚上最為明顯而備受關注。皮膚老化始於二十歲中期或晚期，其中皮膚之膠原蛋白與彈性蛋白減少，導致皮膚乾燥與低彈性甚至起皺紋。肥胖為一由血液循環衰退引起的發炎反應，其來自體內脂肪之過度堆積。血管內之脂肪抑制血液循環與各種激素之分泌，以促進全身之老化，包括皮膚。在此意義上，必須監控與肥胖相關之健康狀況與疾病，以獲得健康與美麗的皮膚。
脂肪酸之生合成與降解依據生理條件而很好地調節，以符合身體之需求。乙醯輔酶A羧化酶(ACC)為一生物素依賴性酵素，其催化乙醯輔酶A之羧化作用，以產生丙二醯輔酶A (malonyl-CoA)，此為脂肪酸生物合成第一階段之速率決定步驟。
Figure 02_image003
ACC具有以二方式控制脂肪酸代謝之功能。ACC最重要之功能為提供丙二醯輔酶A受質，作為其脂肪酸生合成之活化狀態的新建構單元。另一功能為通過抑制脂肪酸之醯基轉移，以阻斷粒線體中脂肪酸之氧化作用。
在人類中，表現二個ACC之主要異構型，乙醯輔酶A羧化酶1 (ACC1、ACACA、乙醯輔酶A羧化酶α)與乙醯輔酶A羧化酶2 (ACC2、ACACB、乙醯輔酶A羧化酶β)。二個ACC彼此具有不同的功能，即ACC1維持脂肪酸合成之調節作用，而ACC2主要調節脂肪酸氧化作用。
調節脂肪酸生合成與氧化的ACCs，為用於治療許多疾病的之潛在標靶，如利用細菌與人類ACC之結構差異的新穎抗生素、糖尿病與肥胖症之代謝症候群、癌細胞之脂肪生成相關之生長抑制劑等（Recent Patents Cardiovasc. Drug Discov. Vol 2, 162-80 (2007)；PLoS One Vol 12, e0169566 (2017)）。
其中，一項關於ACC2-/- 突變體小鼠之研究引起許多關注，其中ACC2缺失小鼠由於脂肪酸氧化率較高，因此脂肪量較低，儘管食物消耗變多，但體重減輕或維持，且降低糖尿病風險（Science Vol 291, 2613-6 (2001)）。彼等結果顯示，ACC2抑制劑具有肥胖與糖尿病治療效果之可能性。此外，以抑制劑治療皮膚，預期可去除脂肪之效果，且最終預防皮膚中之肥胖及改進皮膚老化。
考慮到皮膚老化過程中肥胖之重要性，依據ACC2表現之機制，開發ACC2抑制劑或藥物或化妝品非常有趣且必要，其可改進與預防皮膚老化情況。
前體 mRNA ：遺傳訊息係儲存在DNA (2-去氧核糖核酸)。在細胞核中，DNA經轉錄以產生前體mRNA (前體信使核糖核酸)。哺乳類動物前體mRNA通常由外顯子與內含子組成，且外顯子與內含子彼此互連，如下面示意圖所示。外顯子與內含子之編號如下圖所示。
前體mRNA之結構
Figure 02_image005
前體 mRNA 之剪接 ：前體mRNA在以一系列複雜反應(統稱「剪接」)刪除內含子之後加工成mRNA，如以下示意圖之總結（Ann. Rev. Biochem . 72(1), 291-336 (2003 )；Nature Rev. Mol. Cell Biol . 6(5), 386-398 (2005 )；Nature Rev. Mol. Cell Biol . 15(2), 108-121 (2014 )）。
Figure 02_image007
剪接始於在前體mRNA與剪接轉接子因子之間形成「剪接體E複合體」 (即早期剪接體複合體)。在「剪接體E複合體」中，U1結合至外顯子N與內含子N之連接點，且U2AF35 結合至內含子N與外顯子(N+1)之連接點。因此，外顯子/內含子或內含子/外顯子之連接點對於早期剪接體複合體之形成至關重要。「剪接體E複合體」在與U2進一步複合時演變成「剪接體A複合體」。「剪接體A複合體」經歷一系列複雜反應，以刪除或剪接內含子，以鄰接相鄰之外顯子。
核糖體蛋白質合成 ：蛋白質由DNA (2-去氧核糖核酸)編碼。響應於細胞刺激或自發性，在細胞核中，DNA經轉錄以產生前體mRNA (前體信使核糖核酸)。前體mRNA之內含子以酵素方式剪接，以產生mRNA (信使核糖核酸)，其隨後轉位至細胞質。在細胞質中，一稱作核糖體之轉譯機制複合體結合至mRNA，並在掃描沿著mRNA編碼之遺傳訊息時進行蛋白質合成（Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002 )；Cancer Res . vol 48, 2659-2668 (1988 )）。
反義寡核苷酸 (ASO) ：以序列特異性方式(即互補方式)結合至核酸(包括DNA、mRNA、及前體mRNA)之寡核苷酸稱作反義寡核苷酸(ASO)。
若ASO與細胞質中之mRNA緊密結合，舉例而言，則ASO能夠抑制沿著mRNA之核糖體蛋白質合成。ASO須存在於細胞質之內，以抑制其標靶蛋白質之核糖體蛋白質合成。
剪接之反義抑制作用 ：若ASO與細胞核中之前體mRNA緊密結合，則ASO可抑制或調控前體mRNA之剪接成為mRNA。ASO需要存在於細胞核之內，以抑制或調控前體mRNA之剪接成為mRNA。此剪接之反義抑制作用產生mRNA或缺乏ASO靶向之外顯子的mRNAs。此(複數個)mRNA稱作「(複數個)剪接變體」，且(複數個)編碼之蛋白質比全長mRNA編碼之蛋白質更小。
原則上，藉由抑制「剪接體E複合體」之形成，可中斷剪接。若ASO與(5'→3')外顯子-內含子之連接點(即「5'剪接位點」)緊密結合，則ASO阻斷前體mRNA與因子U1之間的複合體形成，因此形成「剪接體E複合體」。同樣地，若ASO與(5'→3')內含子-外顯子之連接點(即「3'剪接位點」)緊密結合，則無法形成「剪接體E複合體」。
以下提供3'剪接位點與5'剪接位點之示意圖。
Figure 02_image009
非天然寡核苷酸 ：DNA或RNA寡核苷酸易受內源性核酸酶之降解，侷限其治療用途。迄今為止，已有深入開發與研究許多類型之非天然(天然不存在)寡核苷酸（Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006 )）。相較於DNA與RNA，其中一些顯示出延長的代謝穩定性。下面提供一些代表性非天然寡核苷酸的化學結構。此類寡核苷酸以可預測方式與互補核酸結合，如DNA或RNA。
Figure 02_image011
硫代磷酸酯寡核苷酸 ：硫代磷酸酯寡核苷酸(PTO)為一DNA類似物，其中各單體之磷酸氧原子骨架之一者經硫原子取代。此一小的結構變化，使得PTO相對地不易被核酸酶降解（Ann. Rev. Biochem . vol 54, 367-402 (1985 )）。
PTO與DNA之骨架結構相似性反映出，其二者在大多數哺乳類動物細胞類型中很難通透細胞膜。然而，針對一些大量表現DNA (複數個)運輸蛋白的細胞類型，DNA與PTO顯示良好之細胞通透性。全身性投予之PTOs已知易於分佈至肝臟與腎臟（Nucleic Acids Res . vol 25, 3290-3296 (1997 )）。
欲促進PTO之體外細胞通透性，普遍實施脂質轉染法(lipofection)。然而，脂質轉染在會物理性地改變細胞膜，引起細胞毒性，因此對於長期體內治療用途而言不甚理想。
過去30年來，反義PTOs與PTOs之變體已有評估用於臨床上治療癌症、免疫失調、代謝疾病等（Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002 )；Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006 )）。許多此類反義候選藥物尚未成功開發，部分原因為PTO的細胞滲透性差。欲克服細胞通透性差的問題，需要投予高劑量之PTO以達到治療活性。然而，已知PTO與劑量限制型毒性相關聯，包括凝血時間增加、補體活化作用、腎小管腎病、庫弗氏細胞(Kupffer cell)活化作用、及免疫刺激作用，包括脾腫大(splenomegaly)、淋巴組織增生、單核細胞浸潤（Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. vol 33, 533-540 (2006 )）。
經發現，許多反義PTOs顯示對肝臟或腎臟疾病之臨床活性有顯著貢獻。米泊美生(Mipomersen)為一PTO類似物，其抑制apoB-100 (參與LDL膽固醇運輸之蛋白質)之合成。米泊美生在動脈粥樣硬化病患中表現出應有的臨床活性，這很可能係因其優先分佈在肝臟中（Circulation vol 118(7), 743-753 (2008 )）。ISIS-113715為一種抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶1B (PTP1B)合成之PTO反義類似物，且發現對第二型糖尿病病患顯示治療活性（Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004 )）。
鎖核酸 ：在鎖核酸(LNA)中，RNA之骨架核糖環在結構上受侷限，以增加對RNA或DNA之結合親和力。因此，LNA可視為高親和力DNA或RNA類似物（Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006 )）。
磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸 ：在磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)中，DNA之骨架磷酸酯與2-去氧核糖分別經磷醯胺與嗎啉取代（Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006 )）。儘管DNA骨架帶負電，但PMO骨架不帶電。因此，PMO與mRNA之間的結合，在骨架之間沒有靜電排斥，且傾向於比DNA與mRNA之間的結合更強。由於PMO在結構上與DNA非常不同，因此PMO不會由辨識DNA之肝運輸蛋白質所辨識。PMO可表現出與PTO不同的組織分佈，但PMO (就像PTO)不易通透細胞膜。
胜肽核酸 ：胜肽核酸(PNA)為一種以N-(2-胺基乙基)甘胺酸作為單位骨架之多胜肽，由Dr. Nielsen與其同事所發現（Science vol 254, 1497-1500 (1991 )）。PNA之化學結構與縮寫命名在下面提供之圖中說明。如同DNA與RNA，PNA亦選擇性地結合至互補性核酸（Nature (London) vol 365, 566-568 (1992 )）。在與互補性核酸結合時，PNA之N端視為等同於DNA或RNA之「5'端」，且PNA之C端等同於DNA或RNA之「3'端」。
Figure 02_image013
如同PMO，PNA骨架不帶電。因此，PNA與RNA之間的結合，傾向於比DNA與RNA之間的結合更強。由於PNA與DNA在化學結構上明顯不同，PNA不會被辨識DNA之(複數個)肝運輸蛋白質所辨識，並將顯示出與DNA或PTO不同的組織分佈特徵。然而，PNA亦難以通透哺乳類動物細胞膜（Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280 (2003 )）。
經修飾之核鹼基改進 PNA 之膜通透性 ：藉由於其陽離子脂質或與其共價連接之等同物導入經修飾之核鹼基，使PNA對哺乳類動物細胞膜具有高度可通透性。下面提供此類經修飾之核鹼基的化學結構。此類經修飾之胞嘧啶、腺嘌呤、及鳥糞嘌呤之核鹼基經發現以可預測及互補之方式分別與鳥糞嘌呤、胸腺嘧碇、及胞嘧啶雜合（PCT Appl. No. PCT/KR2009/001256；EP2268607；US8680253）。
Figure 02_image015
將此經修飾之核鹼基併入PNA中，類似脂質轉染之情況。藉由脂質轉染，以如脂質轉染胺(lipofectamine)等陽離子脂質分子包裹具有磷酸酯骨架之寡核苷酸分子，且相較於裸露之寡核苷酸分子，此類脂質轉染胺/寡核苷酸複合體更容易穿透膜。
除了良好的膜通透性之外，針對互補性核酸，發現彼等PNA衍生物具有超強親和力。舉例而言，將4至5個經修飾之核鹼基導入11至13-mer PNA衍生物，易於產生20°C或更高之Tm 增益的互補性DNA雙股型態。此類PNA衍生物對單一鹼基錯配(mismatch)高度敏感。單一鹼基錯配導致Tm 損失11至22 °C，其取決於經修飾之鹼基類型及PNA序列。
小型干擾 RNA (siRNA) ：小型干擾RNA (siRNA)意指20-25個鹼基對之雙股RNA （Microbiol. Mol. Biol. Rev . vol 67(4), 657-685 (2003 )）。siRNA之反義股以特定方式與蛋白質交互作用而形成「RNA誘導之靜默複合體」 (RISC)。然後，RISC結合至mRNA之特定部分，該部分互補於siRNA之反義股。與RISC複合之mRNA係經切割。因此，siRNA以催化方式誘導其標靶mRNA之切割，且最終抑制mRNA之蛋白質表現。RISC並不總是與其標靶mRNA內之完整互補序列結合，其引發有關siRNA療法之脫靶效應的擔憂。如同其他具有DNA或RNA骨架之寡核苷酸種類，siRNA具有差的細胞通透性，因此除非適當地調劑或化學上修飾以具有良好的膜通透性，siRNA傾向於顯示較差之體外或體內治療活性。
ACC siRNA ：據記載ACC1 siRNA與ACC2 siRNA之混合物在各20 nM之脂質轉染後，抑制膠質母細胞瘤癌症細胞株（glioblastoma cancer cell line）中的ACC1與ACC2 mRNA及蛋白質之表現（PLoS One Vol 12, e0169566 (2017)）。彼等結果可用於研究ACC相關之脂肪性癌症轉移。
欲解決之問題
由於肥胖對皮膚老化有深遠之影響，因此必須監控與肥胖有關的健康狀況及疾病，以獲得健康與美麗的皮膚。
一項針對ACC2-/-突變體小鼠之肥胖研究引發許多關注。此外，儘管據記載ACCs siRNA抑制癌細胞株中ACCs mRNA與蛋白質之表達，但是將siRNA製造與開發成皮膚之抗老化藥劑太昂貴，更不用說其在皮膚遞送上的挑戰。因此，有必要基於ACC2表現之機制開發藥物或化妝品，其可改進與預防皮膚老化病況。
解決問題之方法
本發明提供一種式 I 代表之胜肽核酸(PNA)衍生物或其藥學上可接受之鹽類：式 I
Figure 02_image017
其中， n為介於10與21之間的整數； 式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA，或部分互補於人類ACC2前體mRNA，其中有一或二個錯配； S1 、S2 、
Figure 02_image019
、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
Figure 02_image021
、Tn-1 、及Tn 獨立地代表氫基、氘基、經取代或非經取代之烷基、或經取代或非經取代之芳基； X與Y獨立地代表氫基、氘基、甲醯基（H-C(=O)-）、胺基羰基（NH2 -C(=O)-）、胺基硫羰基（NH2 -C(=S)-）、經取代或非經取代之烷基、經取代或非經取代之芳基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之烷基醯基、經取代或非經取代之芳基醯基、經取代或非經取代之烷基氧基羰基、經取代或非經取代之芳基氧基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基羰基、經取代或非經取代之芳基胺基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或非經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或非經取代之烷基氧基硫羰基、經取代或非經取代之芳基氧基硫羰基、經取代或非經取代之烷基磺醯基、經取代或非經取代之芳基磺醯基、經取代或非經取代之烷基磷醯基、或經取代或非經取代之芳基磷醯基； Z代表氫基、氘基、羥基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之胺基、經取代或非經取代之烷基、或經取代或非經取代之芳基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基；以及 B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 之至少四者係獨立地選自於非天然核鹼基，其中一經取代或非經取代之胺基共價連接至核鹼基部分。
式I化合物誘導人類ACC2前體mRNA中之「外顯子12」之跳躍(skipping)，產生缺乏「外顯子12」之(複數個)人類ACC2 mRNA剪接變體，因此適用於抑制轉錄人類ACC2前體mRNA之基因的功能活性。
在字面意義上，「n為介於10與21之間的整數」之情況為，n係一選自於11、12、13、14、15、16、17、18、19、及20之整數群組的整數。
在式I之PNA衍生物中，天然或非天然核鹼基之化學結構示例於圖1a-1c。本發明之天然(即天然存在)或非天然(天然不存在)之核鹼基包含但不侷限於，圖1a-1c提供之核鹼基。提供此類非天然核鹼基旨在說明容許之核鹼基的多樣性，因此不應理解為侷限本發明之範疇。
用於說明式I之PNA衍生物之取代基係示例於圖2a-2e。圖2a提供經取代或非經取代之烷基的實例。經取代或非經取代之烷基醯基及經取代或非經取代之芳基醯基係示例於圖2b。圖2c說明經取代或非經取代之烷基胺基、經取代或非經取代之芳基胺基、經取代或非經取代之芳基、經取代或非經取代之烷基磺醯基或芳基磺醯基、及經取代或非經取代之烷基磷醯基或芳基磷醯基的實例。圖2d提供經取代或非經取代之烷基氧基羰基或芳基氧基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基羰基或芳基胺基羰基的實例。圖2e提供經取代或非經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或非經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或非經取代之烷基氧基硫羰基、及經取代或非經取代之芳基氧基硫羰基的實例。此類示例性取代基之提供旨在說明容許之取代基的多樣性，因此不應理解為侷限本發明之範疇。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可易於了解，寡核苷酸序列上之N端或C端取代基，為寡核苷酸與標靶前體mRNA序列之序列特異性結合的重要因素。
式I化合物緊密結合至互補性DNA，如先前技術（PCT/KR2009/001256）之示例。式I之PNA衍生物與其全長互補性DNA或RNA之間的雙股具有太高的Tm 值，無法在水性緩衝液中可靠地測定。式I之PNA化合物具有長度較短的互補性DNA，產生高的Tm 值。
式I化合物以互補方式結合至人類ACC2前體mRNA之「外顯子12」的5’剪接位點（NCBI參考序列：NG_046907）。（(5'→3') GCCAUUUCGUCAGUAU）的16-mer序列跨越人類ACC2前體mRNA中之「外顯子12」與「內含子12」之連接點，且由「外顯子12」的8-mer與「內含子12」的8-mer組成。因此，16-mer 前體mRNA序列常規上可表示為（(5'→3') GCCAUUUC │ gucaguau），其中外顯子與內含子序列分別以「大寫」與「小寫」字母提供，且外顯子-內含子連接點以「│」表示。前體mRNA之常規表示，係進一步以跨越人類ACC2前體mRNA中之「外顯子12」與「內含子12」之連接點的30-mer序列（(5'→3') GGAAGAGGCCAUUUC │ gucaguaucuccuuc）說明。
式I化合物緊密結合至從人類ACC2基因轉錄之人類ACC2前體mRNA中之標靶5'剪接位點，並干擾「剪接體早期複合體」之形成，以產生缺乏「外顯子12」 (外顯子12跳躍)的(複數個)ACC2 mRNA剪接變體。
即使當PNA衍生物在ACC2前體mRNA中之標靶5'剪接位點具有一或二個錯配，強的RNA親和力使得式I化合物誘導ACC2 「外顯子12」之跳躍。同樣地，在標靶剪接位點上具有一或二個SNPs (單一核苷酸多形性)的ACC2突變體前體mRNA中，式I之PNA衍生物仍可誘導ACC2 「外顯子12」之跳躍。
式I化合物具有良好細胞通透性，且可易於作為「裸露之」寡核苷酸遞送至細胞中，如先前技術（PCT/KR2009/001256）之示例。因此，本案之化合物誘導ACC2前體mRNA中之「外顯子12」的跳躍，並在以「裸露之」寡核苷酸之式I化合物處理的細胞中產生缺乏ACC2 「外顯子12」的(複數個)ACC2 mRNA剪接變體。式I化合物不需要以任何方式或配方遞送至細胞中以有效誘導細胞中標靶外顯子的跳躍。以次毫微微莫耳(sub-femtomolar)濃度之本案「裸露之」寡核苷酸化合物處理細胞，發現式I化合物易於誘導ACC2 「外顯子12」的跳躍。
由於良好的細胞或膜通透性，式I之PNA衍生物可以「裸露之」寡核苷酸局部投予，以誘導皮膚中ACC2 「外顯子12」的跳躍。式I化合物不需要針對治療或生物活性而增加經皮遞送至標靶組織的配方。通常將式I化合物溶於水與共溶劑中，且以次微微莫耳(subpicomolar)濃度局部或經皮投予，以在標靶皮膚中引發所需之治療或生物活性。本發明之化合物不需要以過度或侵入方式配製而引發局部治療活性。儘管如此，式I之PNA衍生物可與化妝品成分或佐劑配製成局部乳膏或乳液。此類局部化妝品乳膏或乳液可用於治療皮膚老化。
本發明化合物可以1 aM至高於1 nM之治療上或生物上有效濃度範圍局部投予受試者，其取決於受試者之投劑時間表、條件、或情況等。
式I之PNA衍生物可多方配製，包括但不侷限於，注射劑、噴鼻劑、經皮貼劑等。此外，式I之PNA衍生物可以治療上有效之劑量投予受試者，且投予劑量可取決於受試者之適應症、投予途徑、投劑方案、條件、或情況等。
式I化合物可與藥學上可接受之酸或鹼結合，包括但不侷限於，氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、甲磺酸、檸檬酸、三氟乙酸等。
式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽類可結合藥學上可接受之佐劑投予受試者，該佐劑包括但不侷限於，檸檬酸、鹽酸、酒石酸、硬脂酸、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、異丙醇、碳酸氫鈉、蒸餾水、(複數個)防腐劑等。
感興趣的是一種式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽類： 其中， n為介於10與21之間的整數； 式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA，或部分互補於人類ACC2前體mRNA，其中有一或二個錯配； S1 、S2 、
Figure 02_image019
、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
Figure 02_image021
、Tn-1 、及Tn 獨立地代表氫基、氘基； X與Y獨立地代表氫基、氘基、甲醯基（H-C(=O)-）、胺基羰基（NH2 -C(=O)-）、胺基硫羰基（NH2 -C(=S)-）、經取代或非經取代之烷基、經取代或非經取代之芳基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之烷基醯基、經取代或非經取代之芳基醯基、經取代或非經取代之烷基氧基羰基、經取代或非經取代之芳基氧基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基羰基、經取代或非經取代之芳基胺基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或非經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或非經取代之烷基氧基硫羰基、經取代或非經取代之芳基氧基硫羰基、經取代或非經取代之烷基磺醯基、經取代或非經取代之芳基磺醯基、經取代或非經取代之烷基磷醯基、或經取代或非經取代之芳基磷醯基； Z代表氫基、羥基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、或經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 之至少四者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基：
Figure 02_image025
其中， R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、及R6 係獨立地選自於氫基與經取代或非經取代之烷基； L1 、L2 、及L3 為一由式 V 代表之共價連接子，其以共價方式將鹼性胺基連接至核鹼基部分：式 V
Figure 02_image027
其中， Q1 與Qm 為經取代或非經取代之亞甲基(-CH2 -)，且Qm 直接連接至鹼性胺基； Q2 、Q3 、
Figure 02_image021
、及Qm-1 係獨立地選自於經取代或非經取代之亞甲基、氧 (-O-)、硫(-S-)、及經取代或非經取代之胺基（-N(H)-或-N(取代基)-）；以及 m為介於1與15之間的整數。
高度感興趣的是一種式 I 之PNA寡聚體或其藥學上可接受之鹽類： 其中， n為介於11與16之間的整數； 式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA； S1 、S2 、
Figure 02_image019
、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
Figure 02_image021
、Tn-1 、及Tn 為氫基； X與Y獨立地代表氫基、經取代或非經取代之烷基醯基、或經取代或非經取代之烷基氧基羰基； Z代表經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 之至少五者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基； R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、及R6 為氫基； Q1 與Qm 為亞甲基，且Qm 係直接連接至鹼性胺基； Q2 、Q3 、
Figure 02_image021
、及Qm-1 係獨立地選自於亞甲基與氧基；以及 m為介於1與9之間的整數。
更高度感興趣的是一式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽類： 其中， n為介於11與16之間的整數； 式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA； S1 、S2 、
Figure 02_image019
、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
Figure 02_image021
、Tn-1 、及Tn 為氫基； X為氫基； Y代表經取代或非經取代之烷基氧基羰基； Z代表經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
Figure 02_image021
、Bn-1 、及Bn 之至少五者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基； R1 、R2 、R3 , R4 、R5 、及R6 為氫基； L1 代表-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -、-CH2 -O-(CH2 )2 -、-CH2 -O-(CH2 )3 -、-CH2 -O-(CH2 )4 -,或-CH2 -O-(CH2 )5 -；以及 L2 與L3 係獨立地選自於-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -、-(CH2 )3 -O-(CH2 )2 -、-(CH2 )2 -O-(CH2 )3 -、-(CH2 )2 -、-(CH2 )3 -、-(CH2 )4 -、-(CH2 )5 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )7 -、及-(CH2 )8 -。
特別感興趣的是一式I之PNA衍生物，其係選自於由下列提供之化合物群組(以下分別稱作ASOs 1、2、3、4、5、及6)或其藥學上可接受之鹽類： (N→C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH2 ； (N→C) Fethoc-TA(5)C(1O2)-TGA(5)-CGA(5)-AA(5)T-G(6)GC(1O2)-C-NH2 ； (N→C) Fethoc-TA(5)C-TG(5)A-C(1O2)GA(5)-AA(5)T-G(5)G-NH2 ； (N→C) Fethoc-AC(1O2)T-GA(5)C-GA(5)A-A(5)TG(5)-GC(1O2)-NH2 ； (N→C) Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-NH2 ； (N→C) Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-C(1O2)C-NH2 其中， A、G、T、及C為分別具有腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、及胞嘧啶之天然核鹼基的PNA單體； C(pOq)、A(p)、及G(p)為分別具有由式 VI 、式 VII 、及式 VIII 代表之非天然核鹼基的PNA單體；
Figure 02_image031
其中， p與q為整數，舉例而言，在ASO 4之情況下，p為1或5且q為2；以及 「Fethoc-」為「(2-(9-茀基)乙基-1-氧基)羰基」之縮寫且「-NH2 」為未經取代之「-胺基」。
圖3共同且明確地提供用於PNA單體之化學結構，縮寫成A、G、T、C、C(pOq)、A(p)、及G(p)。如先前技術 （PCT/KR2009/001256）之討論，將C(pOq)視為「經修飾之胞嘧啶」 PNA單體，係因其與「鳥糞嘌呤」雜合。將A(p)視為「經修飾之腺嘌呤」 PNA單體，係因其與「胸腺嘧碇」雜合，並將G(p)視為「經修飾之鳥糞嘌呤」 PNA單體，係因其與「胞嘧啶」雜合。此外，欲說明此類PNA衍生物所採用之縮寫，ASO 1 「(N
Figure 02_image033
C) CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH2 」之化學結構提供在圖4。
ASO 1等同於DNA序列「(5'→3') CTG-ACG-AAA-TGG-CC」，用於互補性結合至前體mRNA。在人類ACC2前體mRNA中跨越「外顯子12」與「內含子12」之連接點的30-mer RNA序列（(5'→3') GGAAGAGGCCAUUUC │gucag uaucuccuuc）中，14-mer PNA具有14個與標有「粗體」之該14-mer序列互補重疊的鹼基。
在一些具體實施例中，本案提供一種治療受試者中與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的方法，包含投予受試者本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
在一些具體實施例中，本案提供一種治療受試者中皮膚老化的方法，包含投予受試者本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
在一些具體實施例中，本案提供一種用於治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的藥學組成物，包含本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
在一些具體實施例中，本案提供一種用於治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的化妝品組成物，包含本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
在一些具體實施例中，本案提供一種用於治療皮膚老化的藥學組成物，包含本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
在一些具體實施例中，本案提供一種用於治療皮膚老化的化妝品組成物，包含本案之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
本發明之功用
可利用投予式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽類，治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病。
可利用投予式I之PNA衍生物或其藥學上可接受之鹽類，治療皮膚老化。
實施本發明之最佳模式
製備 PNA 寡聚體之一般程序
利用固相胜肽合成法(SPPS)合成PNA寡聚體，其係依據先前技術（US6,133,444；WO96/40685）揭示之Fmoc化學法，進行些微但適當之修改。Fmoc為((9-茀基)甲基氧基)羰基。本研究使用之固相載體(solid support)為購自PCAS BioMatrix Inc. (Quebec, Canada)之H-Rink Amide-ChemMatrix。具有經修飾之核鹼基之Fmoc-PNA單體的合成如先前技術（PCT/KR 2009/001256）所述，或些微修改。以此類具有經修飾之核鹼基之Fmoc-PNA單體及具有天然存在之核鹼基之Fmoc-PNA單體合成本發明之PNA衍生物。利用C18 逆相HPLC (水/乙腈或水/甲醇伴隨0.1% TFA)純化PNA寡聚體，並利用質譜(包括ESI/TOF/MS)確認。
流程圖1說明本研究中SPPS採用之典型單體延長循環，且下列提供合成細節。然而，針對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言，明顯可在許多小幅度的修改下，自動化胜肽合成儀或手動胜肽合成儀仍可有效地運行此SPPS反應。流程圖 1 中之各反應步驟簡要地提供如下。
流程圖 1
Figure 02_image035
（活化H-Rink-ChemMatrix樹脂）當樹脂上之胺未以Fmoc保護時，將含有0.01 mmol (約20 mg樹脂) ChemMatrix樹脂之1.5 mL 20%哌啶/ DMF置於天秤管中震盪20 min，並濾出DeFmoc溶液。樹脂以1.5 mL亞甲基氯化物(MC)、1.5 mL二甲基甲醯胺(DMF)、1.5 mL MC、1.5 mL DMF、及1.5 mL MC依序各清洗30秒。以固相載體上得到的游離胺進行偶接Fmoc-PNA單體。
（DeFmoc）當以Fmoc保護樹脂上的胺時，將含有0.01 mmol (約20 mg)樹脂之1.5 mL 20%哌啶/DMF懸浮液震盪7 min，並濾除DeFmoc溶液。樹脂以1.5 mL MC、1.5 mL DMF、1.5 mL MC、1.5 mL DMF、及1.5 mL MC依序各清洗30秒。以固相載體上得到的游離胺立即進行偶接Fmoc-PNA單體。
（偶接Fmoc-PNA單體）固相載體上游離胺之Fmoc-PNA單體偶接方式如下。將0.04 mmol PNA單體、0.05 mmol HBTU、及0.1 mmol DIEA靜置在1 mL無水DMF中2 min，並將游離胺加入樹脂中。將樹脂溶液震盪1小時，並濾除反應介質。隨後，樹脂以1.5 mL MC、1.5 mL DMF、及1.5 mL MC依序各清洗30秒。圖5提供本案使用之具有經修飾之核鹼基之Fmoc-PNA單體的化學結構。圖5提供之具有經修飾之核鹼基之Fmoc-PNA單體應視為示例，因此不應視為侷限本案所請發明之範疇。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可易於瞭解Fmoc-PNA單體的許多變化，以合成式I之PNA衍生物。
（加蓋(Capping)）在偶接反應之後，未經反應之游離胺在1.5 mL加蓋溶液(5%乙酐與含有6% 2,6-二甲吡啶之DMF)中搖晃5 min進行加蓋反應。隨後，濾除加蓋溶液，以1.5 mL MC、1.5 mL DMF、及1.5 mL MC依序各清洗30秒。
（在N端導入「Fethoc-」基）利用下列方法，使樹脂上之游離胺與「Fethoc-OSu」反應，將「Fethoc-」基導入N端。將含有樹脂懸浮液之0.1 mmol Fethoc-OSu溶液與含有0.1 mmol DIEA之1 mL無水MDF震盪1 hr，並濾除溶液。樹脂以1.5 mL MC、1.5 mL DMF、及1.5 mL MC依序各清洗30秒。本案使用之「Fethoc-OSu」 （CAS No. 179337-69-0，C20 H17 NO5 ，MW 351.36）之化學結構提供如下。
Figure 02_image037
（從樹脂切割）藉由在1.5 mL切割溶液(2.5%三異丙基矽烷與含有2.5%水之三氟乙酸)中搖晃3小時，將結合至樹脂之PNA寡聚體從樹脂上切下。將樹脂濾除，並在減壓下濃縮濾液。所得之殘餘物以乙醚研磨，過濾收集所得之沉澱物，用於逆相HPLC純化。
（HPLC分析與純化）在從樹脂上切下之後，利用C18 逆相HPLC純化PNA衍生物之粗產物，其係以含有0.1% TFA之水/乙腈或水/甲醇(梯度法)溶析。圖6a與6b分別為HPLC純化前後「ASO 1」之示例性HPLC層析圖。
式 I 之 PNA 衍生物之合成實例
為了以互補方式靶向人類ACC2前體mRNA中之「外顯子12」之5'剪接位點，依據前面提供之合成方法或稍作修改而製備本案之PNA衍生物。提供此類靶向人類ACC2前體mRNA之PNA衍生物，係旨在示例式I之PNA衍生物，且不應理解為侷限本案所請發明之範疇。
表 1 以互補方式靶向人類ACC2前體mRNA中之「外顯子12」之5'剪接位點的PNA衍生物，伴隨利用質譜分析之結構確認數據
Figure 108126009-A0304-0001
 a) 理論之精確質量，b) 觀察之精確質量
表1提供以互補方式靶向人類ACC2前體mRNA (其由人類ACC2基因（NCBI參考序列：NG_046907）判讀出)中之「外顯子12」之5'剪接位點的PNA衍生物，伴隨質譜分析之結構確認數據。表1中本發明之胜肽核酸衍生物之提供係旨在示例式I之PNA衍生物，且不應理解為侷限本發明之範疇。
在人類ACC2前體mRNA中跨越「外顯子12」與「內含子12」之連接點的30-mer RNA序列（(5'→3') GGAAGAGGCCAUUUC │gucag uaucuccuuc）中，「ASO 1」具有14個與標有「粗體」與「下劃線」之14-mer序列互補重疊的鹼基。因此，在人類ACC2前體mRNA中，「ASO 1」具有9個與「外顯子12」重疊之鹼基及5個與「內含子12」重疊之鹼基。
「 ASO 」對互補性 DNA 之結合親和力
評估式I之PNA衍生物對10-mer DNAs的結合親和力，其係以互補方式靶向N端或C端。利用PNA與10-mer互補性DNA之間雙股之Tm 值評估結合親和力。PNA衍生物與完全互補性DNAs之間的雙股顯示Tm 值太高而無法在緩衝水溶液中可靠測定，係因緩衝溶液在Tm 測定期間傾向沸騰。可預測全長PNAs之Tm 值，並依據PNA與10-mer互補性DNA之間的雙股Tm 值進行比較。
以UV/Vis光譜儀測定Tm 值，步驟如下。在15 mL聚丙烯falcon試管中，在90°C下，將含有4 μM PNA寡聚體與4 μM互補性10-mer DNA之4 mL水性緩衝液(pH 7.16，10 mM磷酸鈉，100 mM NaCl)混合溶液靜置數分鐘，並緩慢冷卻至環境溫度。隨後，將溶液移入一配備氣密蓋之3 mL石英UV比色管，並將比色管裝上Agilent 8453 UV/可見光光譜儀。隨著比色管溫度漸增(每分鐘0.5或1°C)，紀錄260 nm時的吸光值變化。從吸光值與溫度曲線中，當Tm 在PNA與10-mer DNA之間時，讀取到溫度之吸光值最大增加率。用於Tm 測定之DNAs係購自Bioneer (www.bioneer.com，Dajeon，Republic of Korea)，且使用時無須進一步純化。
如表2所提供，針對互補性結合至10-mer DNA，式I之PNA衍生物觀察到的Tm 值非常高。
表 2 PNAs與靶向PNA之N端或C端之10-mer互補性DNA之間的Tm 值
Figure 108126009-A0304-0002
舉例而言，「ASO 1」顯示靶向PNA之N端10-mer (在（(N → C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A- T G(6)G-C(1O2)C-NH2 ）中標記「粗體」與「下劃線」)之10-mer互補性DNA雙股的Tm 值為72.80°C。同時，「ASO 1」顯示靶向PNA之C端10-mer (在（(N → C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)- AA(5)A- TG(6)G-C(1O2)C -NH2 ）中標記「粗體」與「下劃線」)之10-mer互補性DNA雙股的Tm 值為79.60°C。
式 I 之 PNA 衍生物之生物學活性之實例
利用即時定量聚合酶鏈反應(RT- qPCR)等技術，評估本發明中PNA衍生物在C2C12骨骼肌細胞中的體外ACC2反義活性。提供生物樣本，以作為說明式I之PNA衍生物之生物樣貌的實例，因此不應理解為侷限本發明之範疇。
實施例 1. 在C2C12中利用「ASO 1」誘導之外顯子跳躍
如以下所述，評估「ASO 1」在C2C12中誘導ACC2 「外顯子12」跳躍的能力。
（細胞培養與ASO處理）在37°C之5% CO2 大氣環境下，將C2C12細胞(2x105 )(Cat. No. CRL-1772，ATCC)生長在含有DMEM培養基(Dulbecco Modified Eagle Medium：DMEM) (Cat. No. 12-604F，Lonza)之60 mm培養皿中，其中補充10% FBS (胎牛血清) (Cat. No. 10099-41，GIBCO)與1%鏈黴素/青黴素(Cat. No. 15140-122，GIBCO)。細胞未經處理(陰性對照組)或以等分試樣之「ASO 1」水性儲液在100 zM至1 fM下處理5小時。
（RNA萃取與巢式PCR）依據製造商之說明，利用RNeasy Mini kit (Qiagen，Cat. No. 714106)從「ASO 1」處理之細胞萃取總RNA，並利用SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System (Cat. No. 12574-018，Invitrogen)從200 ng之RNA製備cDNA。將除菌之蒸餾水加入含有200 ng之RNA、25微升之2X反應混合緩衝液、2微升之SuperScript IIITM RT/Platinum Taq Mix、1微升之10 μM (微莫耳濃度)外顯子9正向引子(5'-TTTTCCGACAAGTGCAGAG-3')、及1微升之10 μM外顯子15反向引子(5'-AACGTCCACAATGTTCAG-3')之混合物的PCR試管中，使得總體積為50微升。在60°C下反應30分鐘與94°C下反應2分鐘之後，進行30次循環的PCR流程，其中在94°C下15秒、在50°C下30秒、及在68°C下1分鐘，得到第一批粗產物。依據製造商之說明，利用PyroHostStart Taq Polymerase Kit (Cat. No. K-2611-FCG)，在95°C下反應2分鐘，將1微升之粗產物、1微升之10 μM外顯子10正向引子(5’-GAG TAC TTA TAC AGC CAG G-3’)、及1微升之10 μM外顯子14反向引子(5’-TTC TGA A約TCG CGT CTG-3’)之混合物反應，接著進行PCR流程，包括在95°C下30秒、在47°C下1分鐘、及在72°C下20秒。
（外顯子跳躍產物電泳鑑定） PCR產物(10微升)在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。收集由「ASO 1」處理之標靶條帶，並利用桑格定序法(Sanger Sequencing)分析，以評估外顯子跳躍序列。
（「ASO 1」誘導之外顯子跳躍） 由圖8可見，細胞以0.1 aM至1 fM之濃度依賴性之「ASO 1」處理時，產生缺乏外顯子11之剪接變體ACC2 mRNA。
實施例 2. 在C2C12中利用「ASO 1」之ACC2 mRNA形成之抑制作用
如以下所述，利用即時qPCR評估「ASO 1」在C2C12中向下調節ACC2 mRNA形成之能力。
（細胞培養與ASO處理）將C2C12細胞(Cat. No. CRL-1772，ATCC)維持在Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM，Cat. No. 12-604F，Lonza)中，其中補充10%胎牛血清(Cat. No. 10099-41，GIBCO)與1%鏈黴素/青黴素(Cat. No. 15140-122，GIBCO)，其生長在37°C與5% CO2 之條件下。C2C12細胞(2x105 )在60 mm培養皿中穩定24小時，並以0 (陰性對照組)與100 zM至1 fM之「ASO 1」培養24小時。
（RNA萃取與cDNA合成）依據製造商之說明，利用RNeasy Mini kit (Qiagen，Cat. No. 714106)從「ASO 1」處理之細胞萃取總RNA，並利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，Cat. No. 6110A)從400 ng之RNA製備cDNA。將DEPC處理之水加入含有400 ng之RNA、1微升之隨機六聚體、及1微升之dNTP (10 mM)之混合物的PCR試管中，使得總體積為10微升，其在65°C下反應5分鐘。藉由將10微升之PrimeScript RTase加入反應混合物中，並成功地在30°C下反應10分鐘且在42°C下反應60分鐘，以合成cDNA。
（定量即時PCR）欲評估人類ACC2 mRNA之表現量，利用Taqman探針，以經合成之cDNA進行即時qPCR。利用CFX96 Touch即時系統(BioRad)，以含有cDNA、Taqman探針(Thermo，Mm01204651)、IQ超混合液(BioRad，Cat. No. 170-8862)、及無核酸酶之水的混合物之PCR試管進行反應，其中循環條件指定如下：在95°C下3 min (初級變性)，接著在95°C下50個循環各10 sec (變性)，及在60°C下30 sec (退火與聚合)。在各循環結束時測定螢光強度，並利用熔解曲線評估PCR的結果。在各基因之閾值循環(Ct)通過GAPDH標準化後，比較與分析Ct的變化。
（「ASO 1」使ACC2 mRNA減少）由圖9可見，相較於對照組實驗，以100 zM至1 fM之濃度依賴性之「ASO 1」處理時，ACC2 mRNA之量減少，且以1fM之「ASO 1」處理時，觀察到統計上明顯減少30% (進行Student T檢定，以確認該發現之統計顯著性)。
實施例 3. 在C2C12中利用「ASO 6」之ACC2 mRNA形成之抑制作用
如以下所述，利用即時qPCR評估「ASO 6」在C2C12中向下調節ACC2 mRNA形成之能力。
（細胞培養與ASO處理）將C2C12細胞(Cat. No. CRL-1772，ATCC)維持在Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM，Cat. No. 12-604F，Lonza)中，其中補充10%胎牛血清(Cat. No. 10099-41，GIBCO)與1%鏈黴素/青黴素(Cat. No. 15140-122，GIBCO)，其生長在37°C與5% CO2 之條件下。C2C12細胞(2x105 )在60 mm培養皿中穩定24小時，並以0 (陰性對照組)與100 zM至1 fM之「ASO 6」培養24小時。
（RNA萃取與cDNA合成）依據製造商之說明，利用RNeasy Mini kit (Qiagen，Cat. No. 714106)從「ASO 6」處理之細胞萃取總RNA，並利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，Cat. No. 6110A)從400 ng之RNA製備cDNA。將DEPC處理之水加入含有400 ng之RNA、1微升之隨機六聚體、及1微升之dNTP (10 mM)之混合物的PCR試管中，使得總體積為10微升，其在65°C下反應5分鐘。藉由將10微升之PrimeScript RTase加入反應混合物中，並成功地在30°C下反應10分鐘且在42°C下反應60分鐘，以合成cDNA。
（定量即時PCR）欲評估人類ACC2 mRNA之表現量，利用Taqman探針，以經合成之cDNA進行即時qPCR。利用CFX96 Touch即時系統(BioRad)，以含有cDNA、Taqman探針(Thermo，Mm01204651)、IQ超混合液(BioRad，Cat. No. 170-8862)、及無核酸酶之水的混合物之PCR試管進行反應，其中循環條件指定如下：在95°C下3 min (初級變性)，接著在95°C下50個循環各10 sec (變性)，及在60°C下30 sec (退火與聚合)。在各循環結束時測定螢光強度，並利用熔解曲線評估PCR的結果。在各基因之閾值循環(Ct)通過GAPDH標準化後，比較與分析Ct的變化。
（「ASO 6」使ACC2 mRNA減少）由圖10可見，以100 zM至1 fM之濃度依賴性之「ASO 6」處理時，ACC2 mRNA之量減少。相較於對照組實驗，分別以1 aM與1 fM之「ASO 6」處理時，觀察到統計上明顯減少30%與50% (進行Student T檢定，以確認該發現之統計顯著性)。
實施例 4. 在C2C12中利用「ASO 5」之ACC2 mRNA形成之抑制作用
利用下列所述之相同方法評估「ASO 5」。
（細胞培養與ASO處理）將C2C12細胞(Cat. No. CRL-1772，ATCC)維持在Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM，Cat. No. 12-604F，Lonza)中，其中補充10%胎牛血清(Cat. No. 10099-41，GIBCO)與1%鏈黴素/青黴素(Cat. No. 15140-122，GIBCO)，其生長在37°C與5% CO2 之條件下。C2C12細胞(2x105 )在60 mm培養皿中穩定24小時，並以0 (陰性對照組)與100 zM至1 fM之「ASO 5」培養24小時。
（RNA萃取與cDNA合成）依據製造商之說明，利用RNeasy Mini kit (Qiagen，Cat. No. 714106)從「ASO 5」處理之細胞萃取總RNA，並利用PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，Cat. No. 6110A)從400 ng之RNA製備cDNA。將DEPC處理之水加入含有400 ng之RNA、1微升之隨機六聚體、及1微升之dNTP (10 mM)之混合物的PCR試管中，使得總體積為10微升，其在65°C下反應5分鐘。藉由將10微升之PrimeScript RTase加入反應混合物中，並成功地在30°C下反應10分鐘且在42°C下反應60分鐘，以合成cDNA。
（定量即時PCR）欲評估人類ACC2 mRNA之表現量，利用Taqman探針，以經合成之cDNA進行即時qPCR。利用CFX96 Touch即時系統(BioRad)，以含有cDNA、Taqman探針(Thermo，Mm01204651)、IQ超混合液(BioRad，Cat. No. 170-8862)、及無核酸酶之水的混合物之PCR試管進行反應，其中循環條件指定如下：在95°C下3 min (初級變性)，接著在95°C下50個循環各10 sec (變性)，及在60°C下30 sec (退火與聚合)。在各循環結束時測定螢光強度，並利用熔解曲線評估PCR的結果。在各基因之閾值循環(Ct)通過GAPDH標準化後，比較與分析Ct的變化。
（「ASO 5」使ACC2 mRNA減少）由圖11可見，以100 zM至1 fM之濃度依賴性之「ASO 5」處理時，ACC2 mRNA之量減少。相較於對照組實驗，分別以1 aM與1 fM之「ASO 5」處理時，觀察到統計上明顯減少30%與42% (進行Student T檢定，以確認該發現之統計顯著性)。
實施例 5. 製備含有式I化合物(w/w%)之身體乳液
式I化合物，諸如「ASO 1」，係配製成身體乳液，用於受試者之局部應用。身體乳液之製備方法如下述。鑑於身體乳液可能存在許多變化，此製備物應視為示例，且不應理解為侷限本案所請發明之範疇。
在另一燒杯中，將A部分與B部分之混合物質分別在80 °C下溶解。將A部分與B部分混合，並利用3,600 rpm均質機在80°C下乳化5分鐘。將經乳化之C部分過濾通過50篩孔，並將濾液加入A部分與B部分之混合物中。所得之混合物利用3,600 rpm均質機在80°C下乳化5分鐘。在35 °C下將D部分加入A部分、B部分、及C部分之混合物中後，所得之混合物利用2,500 rpm均質機在25°C下乳化3分鐘。最後確保均勻分散且完全消泡。
表 3 含有式I化合物(w/w%)之身體乳液之組成物的實例
Figure 108126009-A0304-0003
實施例 6. 製備含有式I化合物(w/w%)之面霜
式I化合物，諸如「ASO 1」，係配製成面霜，用於受試者之局部應用。面霜之製備方法如下述。鑑於局部乳霜可能存在許多變化，此製備物應視為示例，且不應理解為侷限本案所請發明之範疇。
表4 含有式I化合物(w/w%)之面霜之組成物的實例
Figure 108126009-A0304-0004
在另一燒杯中，將A部分與B部分之混合物質分別在80 °C下溶解。將A部分與B部分混合，並利用3,600 rpm均質機在80°C下乳化5分鐘。在將C部分加入A部分與B部分之混合物中後，所得之混合物利用3,600 rpm均質機在80°C下乳化5分鐘。在35 °C下將D部分加入A部分、B部分、及C部分之混合物中後，所得之混合物利用3,600 rpm均質機在35°C下乳化5分鐘。最後確保在25°C下均勻分散且完全消泡。
無
圖 1a-1c 為式 I 胜肽核酸衍生物選用之天然或非天然(經修飾之)核鹼基之實例。圖 2a-2e 為式 I 胜肽核酸衍生物選用之取代基之實例。圖 3 為具有天然或經修飾核鹼基之PNA單體的化學結構。圖 4 為「ASO 1」之化學結構。圖 5 為用於合成本發明PNA衍生物之Fmoc-PNA單體的化學結構。圖 6a-6b 分別為HPLC純化前後之「ASO 1」的C18 -逆相HPLC層析圖。圖 7 為利用C18 -RP prep HPLC純化之「ASO 1」的ESI-TOF質譜圖。圖 8 為在C2C12中利用「ASO 1」之ACC2 mRNA外顯子跳躍。圖 9 為在C2C12中利用「ASO 1」之ACC2 mRNA表現量的抑制作用。圖 10 為在C2C12中利用「ASO 6」之ACC2 mRNA表現量的抑制作用。圖 11 為在C2C12中利用「ASO 5」之ACC2 mRNA表現量的抑制作用。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 108126009-A0101-11-0002-1

Claims (11)

  1. 一種式 I 代表之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類：式 I
    Figure 03_image001
    其中， n為介於10與21之間的整數； 該式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 該式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA，或部分互補於人類ACC2前體mRNA，其中有一或二個錯配； S1 、S2 、
    Figure 03_image019
    、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
    Figure 03_image021
    、Tn-1 、及Tn 獨立地代表氫基、氘基、經取代或非經取代之烷基、或經取代或非經取代之芳基； X與Y獨立地代表氫基、氘基、甲醯基（H-C(=O)-）、胺基羰基（NH2 -C(=O)-）、胺基硫羰基（NH2 -C(=S)-）、經取代或非經取代之烷基、經取代或非經取代之芳基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之烷基醯基、經取代或非經取代之芳基醯基、經取代或非經取代之烷基氧基羰基、經取代或非經取代之芳基氧基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基羰基、經取代或非經取代之芳基胺基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或非經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或非經取代之烷基氧基硫羰基、經取代或非經取代之芳基氧基硫羰基、經取代或非經取代之烷基磺醯基、經取代或非經取代之芳基磺醯基、經取代或非經取代之烷基磷醯基、或經取代或非經取代之芳基磷醯基； Z代表氫基、氘基、羥基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之胺基、經取代或非經取代之烷基、或經取代或非經取代之芳基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基；以及 B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 之至少四者係獨立地選自於非天然核鹼基，其中一經取代或非經取代之胺基共價連接至該核鹼基部分。
  2. 如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上之鹽類： 其中， n為介於10與21之間的整數； 該式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 該式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA，或部分互補於人類ACC2前體mRNA，其中有一或二個錯配； S1 、S2 、
    Figure 03_image019
    、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
    Figure 03_image021
    、Tn-1 、及Tn 獨立地代表氫基、氘基； X與Y獨立地代表氫基、氘基、甲醯基（H-C(=O)-）、胺基羰基（NH2 -C(=O)-）、胺基硫羰基（NH2 -C(=S)-）、經取代或非經取代之烷基、經取代或非經取代之芳基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、經取代或非經取代之烷基醯基、經取代或非經取代之芳基醯基、經取代或非經取代之烷基氧基羰基、經取代或非經取代之芳基氧基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基羰基、經取代或非經取代之芳基胺基羰基、經取代或非經取代之烷基胺基硫羰基、經取代或非經取代之芳基胺基硫羰基、經取代或非經取代之烷基氧基硫羰基、經取代或非經取代之芳基氧基硫羰基、經取代或非經取代之烷基磺醯基、經取代或非經取代之芳基磺醯基、經取代或非經取代之烷基磷醯基、或經取代或非經取代之芳基磷醯基； Z代表氫基、羥基、經取代或非經取代之烷基氧基、經取代或非經取代之芳基氧基、或經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 之至少四者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基：
    Figure 03_image025
    其中， R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、及R6 係獨立地選自於氫基與經取代或非經取代之烷基； L1 、L2 、及L3 為一由式 V 代表之共價連接子，其以共價方式將鹼性胺基連接至核鹼基部分：式 V
    Figure 03_image027
    其中， Q1 與Qm 為經取代或非經取代之亞甲基(-CH2 -)，且Qm 直接連接至鹼性胺基； Q2 、Q3 、
    Figure 03_image021
    、及Qm-1 係獨立地選自於經取代或非經取代之亞甲基、氧 (-O-)、硫(-S-)、及經取代或非經取代之胺基（-N(H)-或-N(取代基)-）；以及 m為介於1與15之間的整數。
  3. 如請求項2之胜肽核酸衍生物或其藥學上之鹽類： 其中， n為介於11與16之間的整數； 該式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 該式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA； S1 、S2 、
    Figure 03_image019
    、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
    Figure 03_image021
    、Tn-1 、及Tn 為氫基； X與Y獨立地代表氫基、經取代或非經取代之烷基醯基、或經取代或非經取代之烷基氧基羰基； Z代表經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 之至少五者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基； R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、及R6 為氫基； Q1 與Qm 為亞甲基，且Qm 係直接連接至鹼性胺基； Q2 、Q3 、
    Figure 03_image021
    、及Qm-1 係獨立地選自於亞甲基與氧基；以及 m為介於1與9之間的整數。
  4. 如請求項3之胜肽核酸衍生物或其藥學上之鹽類： 其中， n為介於11與16之間的整數； 該式I化合物與人類ACC2前體mRNA中之18-mer前體mRNA序列（(5'→3') GGCCAUUUCGUCAGUAUC）具有至少10-mer的互補重疊； 該式I化合物係完全互補於人類ACC2前體mRNA； S1 、S2 、
    Figure 03_image019
    、Sn-1 、Sn 、T1 、T2 、
    Figure 03_image021
    、Tn-1 、及Tn 為氫基； X為氫基； Y代表經取代或非經取代之烷基氧基羰基； Z代表經取代或非經取代之胺基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 係獨立地選自於天然核鹼基，包括腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、及尿嘧啶，及非天然核鹼基； B1 、B2 、
    Figure 03_image021
    、Bn-1 、及Bn 之至少五者係獨立地選自於由式 II 、式 III 、或式 IV 代表之非天然核鹼基； R1 、R2 、R3 、R4 、R5 、及R6 為氫基； L1 代表-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -、-CH2 -O-(CH2 )2 -、-CH2 -O-(CH2 )3 -、-CH2 -O-(CH2 )4 -、或-CH2 -O-(CH2 )5 -；以及 L2 與L3 係獨立地選自於-(CH2 )2 -O-(CH2 )2 -、-(CH2 )3 -O-(CH2 )2 -、-(CH2 )2 -O-(CH2 )3 -、-(CH2 )2 -、-(CH2 )3 -、-(CH2 )4 -、-(CH2 )5 -、-(CH2 )6 -、-(CH2 )7 -、及-(CH2 )8 -。
  5. 如請求項4之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類，其係選自於由下列提供之胜肽核酸衍生物群組： (N→C) Fethoc-CTG(6)-ACG(6)-AA(5)A-TG(6)G-C(1O2)C-NH2 ； (N→C) Fethoc-TA(5)C(1O2)-TGA(5)-CGA(5)-AA(5)T-G(6)GC(1O2)-C-NH2 ； (N→C) Fethoc-TA(5)C-TG(5)A-C(1O2)GA(5)-AA(5)T-G(5)G-NH2 ； (N→C) Fethoc-AC(1O2)T-GA(5)C-GA(5)A-A(5)TG(5)-GC(1O2)-NH2 ； (N→C) Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-NH2 ； (N→C) Fethoc-CTG(6)-AC(1O2)G-A(5)AA(5)-TG(6)G-C(1O2)C-NH2 其中， A、G、T、及C為分別具有腺嘌呤、胸腺嘧碇、鳥糞嘌呤、及胞嘧啶之天然核鹼基的胜肽核酸單體； C(pOq)、A(p)、及G(p)為分別具有由式 VI 、式 VII 、及式 VIII 代表之非天然核鹼基的胜肽核酸單體；
    Figure 03_image031
    其中， p與q為整數，且在(N→C) Fethoc-AC(1O2)T-GA(5)C-GA(5)A-A(5)TG(5)-GC(1O2)-NH2 中p為1或5且q為2；以及 「Fethoc-」為「(2-(9-茀基)乙基-1-氧基)羰基」之縮寫。
  6. 一種治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的方法，包含投予受試者如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
  7. 一種治療皮膚老化的方法，包含投予受試者如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
  8. 一種用於治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的藥學組成物，包含如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
  9. 一種用於治療與人類ACC2基因轉錄作用相關聯之狀況或疾病的化妝品組成物，包含如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
  10. 一種用於治療皮膚老化的藥學組成物，包含如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
  11. 一種用於治療皮膚老化的化妝品組成物，包含如請求項1之胜肽核酸衍生物或其藥學上可接受之鹽類。
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