JPWO2020027227A1

JPWO2020027227A1 - オリゴヌクレオチドを含有する小細胞肺癌治療薬

Info

Publication number: JPWO2020027227A1
Application number: JP2020534724A
Authority: JP
Inventors: 正仁下條; 聡小比賀; 勇矢笠原; 高尾鈴木; 正輝山上; 忠士梅本
Original assignee: Luxna Biotech Co., Ltd.; Osaka University NUC; National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
Current assignee: Luxna Biotech Co., Ltd.; Osaka University NUC; National Institutes of Biomedical Innovation Health and Nutrition
Priority date: 2018-07-31
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2039-07-31
Also published as: EP3831837A1; JP7473113B2; US20210277398A1; EP3831837A4; CN112513062A; CN112513062B; WO2020027227A1; US11866705B2

Abstract

所定のヌクレオシド構造を少なくとも１つ含み、ヒトnSR100遺伝子と結合し得、該ヒトnSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩が開示される。このオリゴヌクレオチドの長さは、１２〜２０塩基であり、そして該オリゴヌクレオチドは所定の標的領域と相補的である。さらに、オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有するnSR100遺伝子発現抑制剤および癌治療薬が開示される。この癌治療薬は、小細胞肺癌、前立腺癌または乳癌の治療に用いられ得る。

Description

本発明は、nSR100遺伝子発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチドを含有する癌（例えば、小細胞肺癌（SCLC））の治療薬に関する。

癌関連死の主要原因である肺癌は、小細胞肺癌（SCLC）と非小細胞肺癌（NSCLC）の２種類に分類される。一般に、SCLCは、悪性度が高く、急速に癌細胞の成長および転移が起こり、外科的切除が困難な場合が多い。さらに、小細胞肺癌は、治療開始初期では殺細胞性抗腫瘍薬は奏功するが再発が頻発し、再発すると、既存の抗腫瘍薬耐性が問題となる場合が多く予後不良である。一方、NSCLCには分子標的治療薬が開発され一定の治療効果が認められているが、患者によってはNSCLCからSCLCへの変異が起こり得るため、適切に治療されていない場合も多い。最近、PM2.5などの発癌性物質の増加に伴って、多くの子供を含む肺癌患者の数が急激に増えているという報告がある。

SCLCは、NSCLCとは異なり、神経内分泌細胞に由来する腫瘍であり、神経内分泌細胞は、多くの神経系遺伝子産物を発現している。転写抑制因子REST（RE1-Silencing Transcription factor）は、神経系遺伝子のマスター分子であり、かつ腫瘍抑制因子であるという報告がある。nSR100（neural-specific SR-related protein of 100 kDa）、別名SRRM4（Serine Arginine Repetitive Matrix 4）は、RESTのスプライシングを制御する機能を有することが知られている。SCLCでは、nSR100（SRRM4）の異常発現がその悪性度に影響していることが分かっている（非特許文献１および特許文献１）。このように、nSR100（SRRM4）遺伝子は、SCLCのマーカー遺伝子として有用である（特許文献１）。

現在のSCLCの治療では、PE療法（シスプラチンとエトポシド併用）およびPI療法（シスプラチンとイリノテカン併用）が使用されている。しかし、両者とも、下痢などの副作用の発現率が著しく高いことが問題である。さらに、イリノテカンは、間質性肺炎を有する患者には禁忌であるという制限がある。また、SCLCは、化学療法で治療後、再発した場合には化学療法に対する耐性が起こる。

したがって、SCLCに対する新しい治療薬の開発が求められている。

ＷＯ２０１５／０１２１７５

Mol. Cancer Res., vol. 11, no. 10, 2013:1258-1268

本発明は、小細胞肺癌（SCLC）の治療に有効な核酸医薬を提供することを目的とする。

本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を提供し、該オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造：

を少なくとも１つ含み、
ここで、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ａは、以下：

で表される二価の基であり、
Ｒ^１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^２およびＲ^３は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ^１１）Ｒ^１２［式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ^８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；
Ｒ^９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ^１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

であるか、あるいは−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９［式中、Ｒ^１７、Ｒ^１８およびＲ^１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である］であり；
Ｒ^１３およびＲ^１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
ｍは、０から２の整数であり；
ｎは、０から１の整数であり；
Ｒ^１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である場合、ｐは１であり、かつＲ^１５およびＲ^１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

であり、あるいは
Ｒ^１０が−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９である場合、ｐは０であり；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｙは酸素原子または硫黄原子であり、
該オリゴヌクレオチドが、ヒトnSR100遺伝子と結合し得、該ヒトnSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有し、
該オリゴヌクレオチドの長さが、１２〜２０塩基であり、そして
該オリゴヌクレオチドが、配列番号１の６００位から６２０位、６４０位から７００位、７１０位から８００位、１０６０位から１０８０位、１５６０位から１６００位、１６３０位から１６６０位、１６８５位から１７２０位、１８５０位から１９００位、２９００位から２９２５位、３８３５位から３８７５位、４８００位から４８３０位、５９００位から５９７０位、６０１０位から６０３５位、６２３０位から６２７０位、６３００位から６３２０位、６４４０位から６４７０位、６７５０位から６７７２位、６８６５位から６８９０位、７０４５位から７０８０位、７１３０位から７１５５位、７１６０位から７２２０位、７３６０位から７３９０位、７６８０位から７８５０位、７９５０位から７９８０位、７９９５位から８０２０位または８１６０位から８１８０位の塩基配列の中の１２〜２０塩基の連続した配列からなる標的領域と相補的である配列を含む。

１つの実施形態では、上記標的領域の５’末端が、配列番号１の７１６８位、７１７０位、７１７２位または７１７４位であり、そして上記オリゴヌクレオチドの長さが１５〜１９塩基である。

１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２〜７１のいずれかの塩基配列を含む。

１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、６〜１５塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイングおよび３〜５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、
該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして
該５’ウイングおよび該３’ウイングが、少なくとも１つの上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含む。

１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、

（ここで、Ｒ^１３およびＲ^１４がともに水素原子である）；

（ここで、ｍは０であり、そしてＲ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）；

（ここで、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^２およびＲ^３は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表す）；または

（ここで、Ｒ^１０は、−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９であり、Ｒ^１７およびＲ^１８は、それぞれ独立して、水素原子、または、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基であり、そしてＲ^１９は水素原子である）
である。

１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、
nSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)（配列番号７６）、
hnSR100L#2／hnSR100-717-LNA(15)（配列番号７７）、
hnSR100L#3／hnSR100-721-LNA(15)（配列番号７８）、
hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)（配列番号７９）、
hnSR100L#5／hnSR100-783-LNA(15)（配列番号８０）、
hnSR100L#6／hnSR100-786-LNA(15)（配列番号８１）、
hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)（配列番号９６）、
hnSR100L#22／hnSR100-7177-LNA(15)（配列番号９７）、
hnSR100-7170-LNA(19)（配列番号１２４）、
hnSR100-7172-LNA(15)（配列番号１２５）、
hnSR100-7170-LNA(17)（配列番号１２６）、
hnSR100-7168-LNA(19)（配列番号１２７）、
hnSR100-7170-LNA(15)（配列番号１２８）、
hnSR100-7168-LNA(17)（配列番号１２９）、
hnSR100-7166-LNA(19)（配列番号１３０）、
hnSR100-7176-LNA(15)（配列番号１３１）、
hnSR100-7174-LNA(17)（配列番号１３２）、
hnSR100-7172-LNA(19)（配列番号１３３）、
hnSR100-7178-LNA(15)（配列番号１３４）、
hnSR100-7174-AmNA(15)（配列番号１５２）、
hnSR100-7172-AmNA(17)（配列番号１５３）、
hnSR100-7170-AmNA(19)（配列番号１５４）、
hnSR100-7172-AmNA(15)（配列番号１５５）、
hnSR100-7170-AmNA(17)（配列番号１５６）、
hnSR100-7168-AmNA(19)（配列番号１５７）、
hnSR100-7170-AmNA(15)（配列番号１５８）、
hnSR100-7168-AmNA(17)（配列番号１５９）、
hnSR100-7174-AmNA(17)（配列番号１６２）、
hnSR100-7172-AmNA(19)（配列番号１６３）、
hnSR100-680-LNA(15)（配列番号１６８）、
hnSR100-1064-LNA(15)（配列番号１６９）、
hnSR100-3841-LNA(15)（配列番号１７０）、
hnSR100-3854-LNA(15)（配列番号１７１）、
hnSR100-604-AmNA(15)（配列番号１７２）、
hnSR100-1566-AmNA(15)（配列番号１７３）、
hnSR100-1582-AmNA(15)（配列番号１７４）、
hnSR100-1584-AmNA(15)（配列番号１７５）、
hnSR100-1633-AmNA(15)（配列番号１７６）、
hnSR100-1645-AmNA(15)（配列番号１７７）、
hnSR100-1689-AmNA(15)（配列番号１７８）、
hnSR100-1690-AmNA(15)（配列番号１７９）、
hnSR100-1697-AmNA(15)（配列番号１８０）、
hnSR100-1858-AmNA(15)（配列番号１８１）、
hnSR100-1863-AmNA(15)（配列番号１８２）、
hnSR100-2906-AmNA(15)（配列番号１８３）、
hnSR100-4810-AmNA(15)（配列番号１８４）、
hnSR100-5907-AmNA(15)（配列番号１８５）、
hnSR100-5908-AmNA(15)（配列番号１８６）、
hnSR100-5950-AmNA(15)（配列番号１８７）、
hnSR100-6015-AmNA(15)（配列番号１８８）、
hnSR100-6239-AmNA(15)（配列番号１８９）、
hnSR100-6240-AmNA(15)（配列番号１９０）、
hnSR100-6302-AmNA(15)（配列番号１９１）、
hnSR100-6448-AmNA(15)（配列番号１９２）、
hnSR100-6755-AmNA(15)（配列番号１９３）、
hnSR100-6870-AmNA(15)（配列番号１９４）、
hnSR100-7057-AmNA(15)（配列番号１９５）、
hnSR100-7060-AmNA(15)（配列番号１９６）、
hnSR100-7130-AmNA(15)（配列番号１９７）、
hnSR100-7131-AmNA(15)（配列番号１９８）、
hnSR100-7133-AmNA(15)（配列番号１９９）、
hnSR100-7134-AmNA(15)（配列番号２００）、
hnSR100-7135-AmNA(15)（配列番号２０１）、
hnSR100-7136-AmNA(15)（配列番号２０２）、
hnSR100-7203-AmNA(15)（配列番号２０３）、
hnSR100-7365-AmNA(15)（配列番号２０４）、
hnSR100-7373-AmNA(15)（配列番号２０５）、
hnSR100-7688-AmNA(15)（配列番号２０６）、
hnSR100-7733-AmNA(15)（配列番号２０７）、
hnSR100-7734-AmNA(15)（配列番号２０８）、
hnSR100-7769-AmNA(15)（配列番号２０９）、
hnSR100-7792-AmNA(15)（配列番号２１０）、
hnSR100-7794-AmNA(15)（配列番号２１１）、
hnSR100-7827-AmNA(15)（配列番号２１２）、
hnSR100-7829-AmNA(15)（配列番号２１３）、
hnSR100-7859-AmNA(15)（配列番号２１４）、
hnSR100-7860-AmNA(15)（配列番号２１５）、
hnSR100-8001-AmNA(15)（配列番号２１６）、
hnSR100-8165-AmNA(15)（配列番号２１７）、
hnSR100-7174-AmNA，scpBNA(15)（配列番号２１８）または
hnSR100-7174-AmNA，GuNA(15)（配列番号２１９）である。

本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有する、nSR100遺伝子発現抑制剤を提供する。

本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩あるいは上記nSR100発現抑制剤を含有する、癌治療薬を提供する。

１つの実施形態では、上記癌治療薬は、小細胞肺癌、前立腺癌および乳癌よりなる群から選択される少なくとも１つの癌の治療に用いられる。

本発明によれば、nSR100遺伝子の発現抑制に有用なオリゴヌクレオチドが提供される。さらに、小細胞肺癌を包含する癌の治療薬を提供することができる。本発明によれば、nSR100遺伝子の発現抑制に基づく癌の治療薬の開発にも有用となる。

インビトロでのヒトSCLC細胞（Ａ：ヒトNCI-H82細胞；およびＢ：ヒトSTC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（NCI-N417細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。 hnSR100L#1〜#6、#21および#22の種々の濃度での添加によるインビトロでのヒトNCI-H82細胞におけるnSR100のmRNA量を示すグラフである。 hnSR100L#6および#21のそれぞれをベースに設計した塩基配列の各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるインビトロでのヒトSTC-1細胞におけるnSR100のmRNA量を示すグラフである。 hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)をベースに設計した塩基配列の各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるインビトロでのヒトSTC-1細胞におけるnSR100のmRNA量を示すグラフである。 hnSR100-7172-LNA(15)、hnSR100-7170-LNA(17)、hnSR100-7168-LNA(19)、hnSR100-7172-AmNA(17)、hnSR100-7170-AmNA(15)およびhnSR100-7168-AmNA(17)の種々の濃度での添加によるインビトロでのヒトSTC-1細胞におけるnSR100のmRNA量を示すグラフである。 hnSR100-7172-LNA(15)、hnSR100-7170-LNA(17)、hnSR100-7168-LNA(19)、hnSR100-7172-AmNA(17)、hnSR100-7170-AmNA(15)およびhnSR100-7168-AmNA(17)の添加によるインビトロでのヒトNCI-H82細胞におけるnSR100のmRNA量を示すグラフである。ヒトNCI-H82細胞（「Ａ．」）およびヒトSTC-1細胞（「Ｂ．」）のそれぞれにおいて、hnSR100L#21添加によるnSR100のmRNA量（「（ａ）」）および相対的細胞生存度（「（ｂ）」）を示すグラフである。 hSCLC-LUC細胞胸腔内移植マウス（ｎ＝３）におけるhnSR100-7168-AmNA(17)の静脈投与による腫瘍の状態の変化を示す蛍光画像である。 hSCLC-LUC細胞胸腔内移植マウス（ｎ＝３）におけるhnSR100-7172-AmNA(17)の静脈投与による腫瘍の状態の変化を示す蛍光画像である。 hSCLC-LUC細胞胸腔内移植マウス（ｎ＝３）におけるhnSR100-7174-AmNA(15)の静脈投与による腫瘍の状態の変化を示す蛍光画像である。 hSCLC-LUC細胞胸腔内移植マウスにおけるhnSR100L#21の気道投与による腫瘍の状態の変化を示す蛍光画像である。 hSCLC-LUC細胞皮下移植マウスにおけるhnSR100L#1、hnSR100L#4およびhnSR100L#21の腹腔内投与による腫瘍の状態の変化を示す蛍光画像である。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。インビトロでのヒトSCLC細胞（STC-1細胞）における各種アンチセンスオリゴヌクレオチド添加によるhnSR100のmRNA量を示すグラフである。

まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。

本明細書において、用語「炭素数１から３のアルキル基」とは、炭素数１から３の任意のアルキル基を包含する。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、およびイソプロピル基が挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を包含する。具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、およびｎ−ヘキシル基が挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ｎ−ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、上記炭素数１から６の直鎖アルコキシ基を構成する少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。

本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の直鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ジｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３から７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３から７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基、および炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基を包含する。単に、「低級アルコキシ基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｎ−ブチロキシ、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、およびｎ−ヘプチルオキシ基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基としては、イソプロポキシ基、イソブチロキシ基、ｔｅｒｔ−ブチロキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基としては、シクロブチロキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６から１２の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６から１２のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。

本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。

本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。

本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。

本明細書において、用語「ハロゲン化物イオン」としては、例えば、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、またはヨウ化物イオンが挙げられる。好適には、フッ化物イオンまたは塩化物イオンである。

本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」、「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、「１〜４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」などが挙げられる。

より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１〜３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。「シアノ基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、シアノエトキシカルボニル基などが挙げられる。「１〜４個のニトロ基で置換されたベンゼンスルホニル基」としては、２−ニトロベンゼンスルホニル基、２，４−ジニトロベンゼンスルホニル基などが挙げられる。

「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基または２−プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」を構成する保護基は１つまたはそれ以上であり得る。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。

本明細書において、Ｒ^１０基に関する「アミノ基の保護基」としては、アセチル基、第三級ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などが挙げられる。

本明細書において、−Ｐ（Ｒ^２４）Ｒ^２５［式中、Ｒ^２４およびＲ^２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ^２４が−ＯＲ^２４ａそしてＲ^２５が−Ｎ（Ｒ^２５ａ）_２として表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式−Ｐ（ＯＣ_２Ｈ_４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ_３）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。

本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合した「ヌクレオシド」を含む。天然型のヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」ともいう。修飾された非天然型のヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」ともいい、特に糖部分が修飾されたヌクレオチドを「糖修飾ヌクレオシド」という。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。

本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合または他の結合で２〜５０個結合した「ヌクレオチド」のポリマーであり、天然型のものと非天然型のものを含む。非天然型の「オリゴヌクレオチド」としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。

本明細書において、用語「その塩」とは、後述の式（ＩＩ）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。

本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」とは、以下に示す式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドの塩であって、本によるオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該オリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。

以下、本発明について詳述する。

本発明は、nSR100遺伝子と結合し得、該nSR100の発現を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、その薬理学上許容される塩であってもよい。nSR100遺伝子について、ヒトnSR100（「hnSR100」）遺伝子の塩基配列情報は、GenBankアクセッション番号：NM_194286.3により入手可能であり、配列表の配列番号１に示した通りである。本明細書において、「nSR100遺伝子との結合」とは、例えば、nSR100遺伝子への直接結合、およびnSR100遺伝子のmRNAへの結合、およびnSR100遺伝子のmRNA前駆体への結合のいずれも包含する。「nSR100遺伝子と結合し得、該nSR100の発現を抑制する活性」とは、例えば、発現抑制剤が、nSR100遺伝子より転写したnSR100のmRNAに結合し、次いで当該RNAをRNase Hの働きにより分解した結果、nSR100の発現mRNA量が抑制されることを包含する。nSR100遺伝子発現抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法（例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR））により測定することが可能である。nSR100遺伝子発現抑制活性（ノックダウン活性）を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の実施例３の３−１または実施例４の４−２に記載のインビトロにおけるmRNA発現実験または同等の実験において、濃度に依存し得るが、ヒトSLCL細胞におけるnSR100の発現mRNA量がアンチセンスオリゴヌクレオチド無添加の場合（コントロール）と比較して低く、コントロールでのヒトSLCL細胞のnSR100のmRNA量を１とした場合、例えば、０．８以下、好ましくは０．７以下、より好ましくは０．６以下となり得る。

ここで、「結合し得る」とは、異なる複数の１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が、核酸塩基の相補性により２本鎖以上の鎖の核酸を形成し得ることをいう。好適には、２本鎖の核酸を形成し得ることをいう。結合の熱安定性の指標である２本鎖以上の鎖の核酸の融解温度（Ｔ_ｍ）は特に限定されない。２本鎖核酸の融解温度（Ｔ_ｍ）は、例えば、下記のように決定され得る：緩衝液（8.1mM Na₂HPO₄，2.68mM KCl，1.47mM KH₂PO₄，pH7.2）中で、オリゴヌクレオチドと標的RNAとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成させる。２本鎖核酸の温度を20℃から95℃まで0.5℃/分の速度で加温していき、260nmにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定し、この測定結果よりｄＡ／ｄＴｖｓＴのグラフを描き、ｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴ_ｍとする。融解温度（Ｔ_ｍ）は、例えば、４０℃以上であり、好ましくは５０℃以上である。

本明細書においては「相補的」とは、異なる２つの１本鎖のオリゴヌクレオチドまたは核酸が２本鎖核酸を形成することができる対合関係にあることをいう。好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有するが、当該２本鎖核酸を形成し得、発現抑制効果作用を有する限り、１もしくは数個のミスマッチを有し得る。１もしくは数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個のミスマッチを意味している。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列に対して完全に（１００％）相補性を有するものである。

nSR100遺伝子と結合し得、かつ該nSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチドとしては、nSR100遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）とは、標的遺伝子のRNA（例えば、mRNAまたはmRNA前駆体）／DNAと結合し得、当該標的遺伝子の発現を抑制する活性を有し、その標的遺伝子のRNA（例えば、mRNAまたはmRNA前駆体）／DNAの配列に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１の一部である標的領域と結合し得る。所定の「標的領域」とは、例えば、配列番号１に示した所定領域のDNAならびにその対応するmRNAおよびmRNA前駆体のいずれも包含する。標的領域は、ヒトnSR100において、特に、nSR100の発現を抑制する活性またはノックダウン活性に関連する領域であることが好ましい。本発明によるオリゴヌクレオチドでは、標的領域は、例えば、１２〜２０塩基長、好ましくは１３〜２０塩基長、より好ましくは１４〜２０塩基長、特に好ましくは１５〜１９塩基長の領域であるが、領域の塩基長はこれらに限定されない。核酸分子またはオリゴヌクレオチドが「標的領域と結合」とは、当該核酸分子またはオリゴヌクレオチドが標的領域全体と必ずしも２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成する必要はなく、nSR100遺伝子の発現を抑制する活性またはノックダウン活性を発揮する限り、標的領域の一部である領域と２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成するものであってもよい。nSR100遺伝子と結合し得、かつ該nSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有するオリゴヌクレオチドは、例えば、標的領域と相補的であり、好ましくは完全な相補性を有する。

本発明によるオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、例えば１２〜２０塩基、好ましくは１３〜２０塩基、より好ましくは１４〜２０塩基、特に好ましくは１５〜１９塩基の長さである。オリゴヌクレオチドが上記のような長さであることにより、nSR100遺伝子への結合およびmRNA発現抑制（例えば、ノックダウン）をより効果的に行い得る。

本発明によるオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、nSR100遺伝子と結合し得、かつ該nSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有するオリゴヌクレオドであって、例えば、配列番号１の６００位から６２０位、６４０位から７００位、７１０位から８００位、１０６０位から１０８０位、１５６０位から１６００位、１６３０位から１６６０位、１６８５位から１７２０位、１８５０位から１９００位、２９００位から２９２５位、３８３５位から３８７５位、４８００位から４８３０位、５９００位から５９７０位、６０１０位から６０３５位、６２３０位から６２７０位、６３００位から６３２０位、６４４０位から６４７０位、６７５０位から６７７２位、６８６５位から６８９０位、７０４５位から７０８０位、７１３０位から７１５５位、７１６０位から７２２０位、７３６０位から７３９０位、７６８０位から７８５０位、７９５０位から７９８０位、７９９５位から８０２０位または８１６０位から８１８０位の塩基配列の中の１２〜２０塩基の連続した配列からなる標的領域と相補的である配列を含む。１つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、６０４位から６１８位、６８０位から６９４位、７１２位から８００位、１０６４位から１０７８位、１５６６位から１５８０位、１５８２位から１５９８位、１６３３位から１６５９位、１６８９位から１７１１位、１８５８位から１８７７位、２９０６位から２９２０位、３８４１位から３８６８位、４８１０位から４８２４位、５９０７位から５９２２位、５９５０位から５９６４位、６０１５位から６０２９位、６２３９位から６２５４位、６３０２位から６３１６位、６４４８位から６４６２位、６７５５位から６７６９位、６８７０位から６８８４位、７０５７位から７０７４位、７１３０位から７１５０位、７１６６位から７１９２位、７２０３位から７２１７位、７３６５位から７３８７位、７６８８位から７７０２位、７７３３位から７７４８位、７７６９位から７７８３位、７７９２位から７８０８位、７８２７位から７８４３位、７９５９位から７９７４位、８００１位から８０１５位または８１６５位から８１７９位の塩基配列の中の１２〜２０塩基の連続した配列からなる標的領域と相補的である配列を含む。１つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、その標的領域の５’末端が、配列番号１の７１６８位、７１７０位、７１７２位または７１７４位であり、その長さが１５〜１９塩基である。選定した標的領域に基づいてアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を設計することは、当業者が通常用いる方法によってなされ得る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、例えば、下記の配列（５’→３’方向で示す）が挙げられる（併せて、その標的領域を配列番号１の塩基位置の番号を用いて（５’末端位置−３’末端位置）にて示す）：
ttctttttcttcttt（配列番号２）（712−726）；
atttcttctttttct（配列番号３）（717−731）；
gtggatttcttcttt（配列番号４）（721−735）；
tcttctttttcttga（配列番号５）（780−794）；
tcttcttctttttct（配列番号６）（783−797）；
ttttcttcttctttt（配列番号７）（786−800）；
ttgtgtgactgaagc（配列番号８）（7174−7188）；
aatttgtgtgactga（配列番号９）（7177−7191）；
ttgtgtgactgaagcct（配列番号１０）（7172−7188）；
ttgtgtgactgaagcctcc（配列番号１１）（7170−7188）；
gtgtgactgaagcct（配列番号１２）（7172−7186）；
gtgtgactgaagcctcc（配列番号１３）（7170−7186）；
gtgtgactgaagcctccat（配列番号１４）（7168−7186）；
gtgactgaagcctcc（配列番号１５）（7170−7184）；
gtgactgaagcctccat（配列番号１６）（7168−7184）；
gtgactgaagcctccattt（配列番号１７）（7166−7184）；
atttgtgtgactgaa（配列番号１８）（7176−7190）；
atttgtgtgactgaagc（配列番号１９）（7174−7190）；
atttgtgtgactgaagcct（配列番号２０）（7172−7190）；
taatttgtgtgactg（配列番号２１）（7178−7192）；
caactgttggtgccc（配列番号２２）（604−618）；
tggtgtcaagtcttt（配列番号２３）（680−694）；
gcagagggtcttgga（配列番号２４）（1064−1078）；
tgctggcataggagg（配列番号２５）（1566−1580）；
tgactggaggatcgg（配列番号２６）（1582−1596）；
agtgactggaggatc（配列番号２７）（1584−1598）；
cggctttgggtgtac（配列番号２８）（1633−1647）；
gaagaggtggatcgg（配列番号２９）（1645−1659）；
acttggaggaatagc（配列番号３０）（1689−1703）；
gacttggaggaatag（配列番号３１）（1690−1704）；
cttgccagacttgga（配列番号３２）（1697−1711）；
tttctcataggcgag（配列番号３３）（1858−1872）；
ggcgctttctcatag（配列番号３４）（1863−1877）；
catgctgaggtattg（配列番号３５）（2906−2920）；
ggaaagattgggtag（配列番号３６）（3841−3855）；
ggttgataggatggg（配列番号３７）（3854−3868）；
acaagggatttcgac（配列番号３８）（4810−4824）；
tggtgatctgtcata（配列番号３９）（5907−5921）；
ctggtgatctgtcat（配列番号４０）（5908−5922）；
ggatgttggtttttg（配列番号４１）（5950−5964）；
agcgggaaggtcaaa（配列番号４２）（6015−6029）；
tcgtttttactttca（配列番号４３）（6239−6253）；
ttcgtttttactttc（配列番号４４）（6240−6254）；
aatagggggctttga（配列番号４５）（6302−6316）；
aaatgaagtgatgcg（配列番号４６）（6448−6462）；
cataagtttctcagc（配列番号４７）（6755−6769）；
acagcaaccacagat（配列番号４８）（6870−6884）；
ccaattctcaatagc（配列番号４９）（7057−7071）；
ggaccaattctcaat（配列番号５０）（7060−7074）；
gtgattctagcactc（配列番号５１）（7130−7144）；
ggtgattctagcact（配列番号５２）（7131−7145）；
ttggtgattctagca（配列番号５３）（7133−7147）；
cttggtgattctagc（配列番号５４）（7134−7148）；
gcttggtgattctag（配列番号５５）（7135−7149）；
tgcttggtgattcta（配列番号５６）（7136−7150）；
ccagtgttttagttc（配列番号５７）（7203−7217）；
aagatgaggcatagc（配列番号５８）（7365−7379）；
ctcgttagaagatga（配列番号５９）（7373−7387）；
tatatgactgtggga（配列番号６０）（7688−7702）；
caggatacaagagtt（配列番号６１）（7733−7747）；
ccaggatacaagagt（配列番号６２）（7734−7748）；
gagagaagttcaaac（配列番号６３）（7769−7783）；
atgactttggaccac（配列番号６４）（7792−7806）；
tgatgactttggacc（配列番号６５）（7794−7808）；
cagggcaaggtaagc（配列番号６６）（7827−7841）；
agcagggcaaggtaa（配列番号６７）（7829−7843）；
tgggcatgtcaactc（配列番号６８）（7959−7973）；
ttgggcatgtcaact（配列番号６９）（7960−7974）；
atgttggacattgag（配列番号７０）（8001−8015）；および
atggccttggggtgc（配列番号７１）（8165−8179）。
nSR100遺伝子と結合し得、該nSR100の発現を抑制する活性を有する限り、上記配列の５’末端および／または３’末端にさらに１〜数塩基（例えば２または３塩基）が付加されていてもよい。この付加塩基は、当該塩基が付加される配列の標的領域に隣接する配列番号１に示される配列の塩基と相補的な塩基であり得る。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたＤＮＡを含有するオリゴヌクレオチドを包含する。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性を変更し得、例えば、標的核酸に対する親和性を高め得、または核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め得る。標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。

本発明によるオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含むものであり得る。この糖修飾ヌクレオシドは、その糖環の２位と４位との間に、例えば、以下に説明するような架橋を有する。

１つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオシドとして、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む：

ここで、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ａは、以下：

で表される二価の基であり、
Ｒ^１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^２およびＲ^３は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ^１１）Ｒ^１２［式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ^８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し
Ｒ^９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ^１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

であり、あるいは
Ｒ^１０が−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９［式中、Ｒ^１７、Ｒ^１８およびＲ^１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である］である場合、ｐは０であり；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｙは酸素原子または硫黄原子である。

で表される構造である。式（Ｉ−１）および（Ｉ−２）中のＢａｓｅ、Ｒ^１、Ｘ、ｍおよびｎは、式（Ｉ）に関して上述したとおりである。２’位と４’位との間の架橋にアミド（-ＣＯＮＲ^１-）が導入されており、このようなヌクレオシド構造を、アミド架橋型核酸、アミドBNA（Bridged Nucleic Acid）、またはAmNAともいう。

式（Ｉ−１）および（Ｉ−２）において、Ｒ^１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、または該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基である。より好適には、Ｒ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Ｒ^１は、水素原子またはメチル基である。

式（Ｉ−１）において、ｍは、０から２の整数であり；そして式（Ｉ−２）において、ｎは、０から１の整数である。すなわち、２’位、３’位、４’位、および架橋部を含む環は、５員環〜７員環である。

式（Ｉ−２）において、Ｘは、酸素原子、硫黄原子、アミノ基、またはメチレン基である。好適には、Ｘは、酸素原子またはアミノ基である。なお、Ｘがアミノ基またはメチレン基である場合、低級アルキル基で置換されていてもよい。

１つの実施形態では、上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造は、上記式（Ｉ−１）で表される構造であり、そしてこの式（Ｉ−１）において、ｍは０であり、そしてＲ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である。

式（Ｉ−１）および（Ｉ−２）にてそれぞれ表される化合物においては、糖部の２’位のアミノ基と４’位から伸長したカルボニル基との間にアミド結合が形成されている。このように、構造的に揺らぎが少なくかつ親水性に優れるアミド結合を有するため、ヌクレオシドの糖部の構造が、架橋により固定化されている。

上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造としては、上記式（Ｉ−１）および（Ｉ−２）に加えて、例えば、以下の（Ｉ−３）〜（Ｉ−７）が挙げられる：

上記の各式中、Ｂａｓｅ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１３、Ｒ^１４、Ｒ^１５、Ｒ^１６およびｐは、式（Ｉ）に関して上述したとおりである。式（Ｉ−７）は、2’,4’-BNAまたはLNA（Locked Nucleic Acid）（本明細書中、「2’,4’-BNA/LNA」または「LNA」とも記載する）と称されるヌクレオシド構造に該当する（一例として、Ｒ^１３およびＲ^１４がともに水素原子である）。式（Ｉ−３）は、2’,4’-BNA/LNAの架橋構造の６’位にスピロシクロプロパン基を導入した構造を有し、スピロシクロプロパン架橋型核酸（spcBNA）とも称される。式（Ｉ−４）は、2’,4’-BNA/LNAの架橋構造にグアニジンを導入した構造を有し、グアニジン架橋型核酸（GuNA）とも称される。なお、式（Ｉ−４）は、以下の式（Ｉ−４−１）（ｐ＝０である場合）および（Ｉ−４−２）（ｐ＝１である場合）を包含する：

上記「Ｂａｓｅ」は、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。

上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、アデニニル基、グアニニル基、シトシニル基、ウラシリル基、およびチミニル基、ならびに６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。

中でも、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：

でそれぞれ表される基（すなわち、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５−メチルシトシニル基およびウラシリル基）、ならびに２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、６−アミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が好適であり、特に、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基およびチミニル基が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。

なお１つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドが、糖修飾ヌクレオシドとして上記式（Ｉ−４）あるいは式（Ｉ−４−１）または式（Ｉ−４−２）で表されるヌクレオシド構造を含む場合、これらの式（Ｉ−４）あるいは式（Ｉ−４−１）または式（Ｉ−４−２）で表されるヌクレオシド構造は、式（Ｉ−４）あるいは式（Ｉ−４−１）または式（Ｉ−４−２）内には表されていないアニオン（例えば、Ｚ⁻として表すことができる）によって電気的に中性に保持されている。このようなアニオンの例としては、ハロゲン化物イオン（例えば、塩化物イオン）、リン酸イオンなどが挙げられる。

上記のような糖修飾ヌクレオシド構造を少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドは、例えば、糖修飾ヌクレオシド化合物を用いて、例えば、国際公開第２０１１／０５２４３６号、特開２０１４−０４３４６２号公報、国際公開第２０１４／０４６２１２号および国際公開第２０１５／１２５７８３号に記載されるような方法を用いて合成することができる。

糖修飾ヌクレオシド化合物の例としては、以下の式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：

（ここで、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ａは、以下：

である］であり；
Ｒ^１３およびＲ^１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
ｍは、０から２の整数であり；
ｎは、０から１の整数であり；

Ｒ^１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である］である場合、ｐは０であり；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；
Ｙは酸素原子または硫黄原子であり；そして
Ｒ^２２およびＲ^２３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ^２４）Ｒ^２５［式中、Ｒ^２４およびＲ^２５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から５のアルコキシ基、炭素数１から５のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基で置換されたジアルキルアミノ基を表す］を表す）
が挙げられる。

上記のような糖修飾ヌクレオシドから、糖修飾ヌクレオチドを容易に調製することができる。例えば、三リン酸化は、M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008，vol.36, No.13，pp.4257−65に記載の方法に従って容易に行われ得る。

上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾もまた利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、リン酸修飾、核酸塩基修飾が知られている。このような核酸修飾は、当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。

リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、Ｄ−オリゴ（ホスホジエステル）、Ｍ−オリゴ（メチルフォスフォネイト）、ボラノホスフェート等が挙げられる。Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）は、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のリン酸基部の酸素原子が硫黄原子で置換されたＰＳ骨格を有する。この修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。この修飾をオリゴヌクレオチド中に１もしくは複数もつアンチセンスオリゴヌクレオチドをＳ−オリゴ型（ホスホロチオエート型）という。

核酸塩基修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。

本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、糖修飾ヌクレオシドの位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、互いに同じものを含むか、または異なるものを含む。

本発明のオリゴヌクレオチド（特に１本鎖オリゴヌクレオチドの場合）は、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーとは、中心領域となる「ギャップ」と該ギャップの両側の領域、２つのウイング、すなわち、５’側の「５’ウイング」および３’側の「３’ウイング」を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ギャップ領域は６〜１５塩基長、そしてウイング領域は３〜５塩基長であり得る。ギャップは、天然ヌクレオシドから構成されており、ウイングには、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが含まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、「５’ウイング」および／または「３’ウイング」に、糖修飾ヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１〜５含む。１つの実施形態では、ギャップマーは、９〜１３塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイングおよび３〜５塩基の３’ウイングからなり、ギャップ領域が５’ウイングと３’ウイングの間に位置づけられ、５’ウイングおよび３’ウイングは、少なくとも１つの上記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含み得る。さらに、リン酸修飾、塩基修飾などを含んでいてもよい。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は、他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであってもまたは異なっていてもよい。ギャップマーの「ウイング」は、当該ウイングを構成する塩基が全て修飾ヌクレオチドであっても、あるいはその中の一部に天然ヌクレオシドが含まれるものでもよく、例えば、３’ウイング中の３’末端の一塩基が天然ヌクレオシド（例えばDNA）であるもの（例えば、３−９−２−１）もまた包含する。

このようなギャップマーとしては、例えば、３−６−３、３−６−２−１、３−７−３、３−７−２−１、３−８−２−１、３−８−３−１、３−８−３、３−９−２−１、３−９−３、３−９−３−１、３−１０−２−１、３−１０−３、３−１１−２−１、３−１１−３、３−１２−２−１、３−１２−３、３−１３−２−１、３−１３−３、４−１１−３−１、４−１１−４、５−１０−５などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、３−９−２−１の表記の場合、ギャップの９塩基が天然ヌクレオシド（DNA）であり、５’ウイング（５’末端から３塩基）が糖修飾ヌクレオシドであり、そして３’ウイング（３’末端から３塩基）のうち中心側からの３塩基が糖修飾ヌクレオシドであり、最後の１塩基（３’末端塩基）が天然ヌクレオシド（DNA）である。例えば、３−９−３の表記の場合、ギャップの９塩基が天然ヌクレオシド（DNA）であり、５’ウイング（５’末端から３塩基）が糖修飾ヌクレオシドであり、そして３’ウイング（３’末端から３塩基）が糖修飾ヌクレオシドである。配列に依存し得るが、３−９−２−１、３−９−３、３−１０−２−１、３−１０−３、３−１１−２−１、３−１１−３、３−１２−２−１、３−１２−３、３−１３−２−１、または３−１３−３が好ましい。

（ここで、ｍは０であり、そしてＲ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）である。

１つの実施形態では、本発明におけるオリゴヌクレオチドは、上述した配列番号２〜７１のいずれかの塩基配列により表される塩基配列を含み、かつその塩基の少なくとも１つが上記糖修飾ヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドとして、例えば、以下が挙げられる：
nSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)（配列番号７６）、
hnSR100L#2／hnSR100-717-LNA(15)（配列番号７７）、
hnSR100L#3／hnSR100-721-LNA(15)（配列番号７８）、
hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)（配列番号７９）、
hnSR100L#5／hnSR100-783-LNA(15)（配列番号８０）、
hnSR100L#6／hnSR100-786-LNA(15)（配列番号８１）、
hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)（配列番号９６）、
hnSR100L#22／hnSR100-7177-LNA(15)（配列番号９７）、
hnSR100-7170-LNA(19)（配列番号１２４）、
hnSR100-7172-LNA(15)（配列番号１２５）、
hnSR100-7170-LNA(17)（配列番号１２６）、
hnSR100-7168-LNA(19)（配列番号１２７）、
hnSR100-7170-LNA(15)（配列番号１２８）、
hnSR100-7168-LNA(17)（配列番号１２９）、
hnSR100-7166-LNA(19)（配列番号１３０）、
hnSR100-7176-LNA(15)（配列番号１３１）、
hnSR100-7174-LNA(17)（配列番号１３２）、
hnSR100-7172-LNA(19)（配列番号１３３）、
hnSR100-7178-LNA(15)（配列番号１３４）、
hnSR100-7174-AmNA(15)（配列番号１５２）、
hnSR100-7172-AmNA(17)（配列番号１５３）、
hnSR100-7170-AmNA(19)（配列番号１５４）、
hnSR100-7172-AmNA(15)（配列番号１５５）、
hnSR100-7170-AmNA(17)（配列番号１５６）、
hnSR100-7168-AmNA(19)（配列番号１５７）、
hnSR100-7170-AmNA(15)（配列番号１５８）、
hnSR100-7168-AmNA(17)（配列番号１５９）、
hnSR100-7174-AmNA(17)（配列番号１６２）、
hnSR100-7172-AmNA(19)（配列番号１６３）、
hnSR100-680-LNA(15)（配列番号１６８）、
hnSR100-1064-LNA(15)（配列番号１６９）、
hnSR100-3841-LNA(15)（配列番号１７０）、
hnSR100-3854-LNA(15)（配列番号１７１）、
hnSR100-604-AmNA(15)（配列番号１７２）、
hnSR100-1566-AmNA(15)（配列番号１７３）、
hnSR100-1582-AmNA(15)（配列番号１７４）、
hnSR100-1584-AmNA(15)（配列番号１７５）、
hnSR100-1633-AmNA(15)（配列番号１７６）、
hnSR100-1645-AmNA(15)（配列番号１７７）、
hnSR100-1689-AmNA(15)（配列番号１７８）、
hnSR100-1690-AmNA(15)（配列番号１７９）、
hnSR100-1697-AmNA(15)（配列番号１８０）、
hnSR100-1858-AmNA(15)（配列番号１８１）、
hnSR100-1863-AmNA(15)（配列番号１８２）、
hnSR100-2906-AmNA(15)（配列番号１８３）、
hnSR100-4810-AmNA(15)（配列番号１８４）、
hnSR100-5907-AmNA(15)（配列番号１８５）、
hnSR100-5908-AmNA(15)（配列番号１８６）、
hnSR100-5950-AmNA(15)（配列番号１８７）、
hnSR100-6015-AmNA(15)（配列番号１８８）、
hnSR100-6239-AmNA(15)（配列番号１８９）、
hnSR100-6240-AmNA(15)（配列番号１９０）、
hnSR100-6302-AmNA(15)（配列番号１９１）、
hnSR100-6448-AmNA(15)（配列番号１９２）、
hnSR100-6755-AmNA(15)（配列番号１９３）、
hnSR100-6870-AmNA(15)（配列番号１９４）、
hnSR100-7057-AmNA(15)（配列番号１９５）、
hnSR100-7060-AmNA(15)（配列番号１９６）、
hnSR100-7130-AmNA(15)（配列番号１９７）、
hnSR100-7131-AmNA(15)（配列番号１９８）、
hnSR100-7133-AmNA(15)（配列番号１９９）、
hnSR100-7134-AmNA(15)（配列番号２００）、
hnSR100-7135-AmNA(15)（配列番号２０１）、
hnSR100-7136-AmNA(15)（配列番号２０２）、
hnSR100-7203-AmNA(15)（配列番号２０３）、
hnSR100-7365-AmNA(15)（配列番号２０４）、
hnSR100-7373-AmNA(15)（配列番号２０５）、
hnSR100-7688-AmNA(15)（配列番号２０６）、
hnSR100-7733-AmNA(15)（配列番号２０７）、
hnSR100-7734-AmNA(15)（配列番号２０８）、
hnSR100-7769-AmNA(15)（配列番号２０９）、
hnSR100-7792-AmNA(15)（配列番号２１０）、
hnSR100-7794-AmNA(15)（配列番号２１１）、
hnSR100-7827-AmNA(15)（配列番号２１２）、
hnSR100-7829-AmNA(15)（配列番号２１３）、
hnSR100-7859-AmNA(15)（配列番号２１４）、
hnSR100-7860-AmNA(15)（配列番号２１５）、
hnSR100-8001-AmNA(15)（配列番号２１６）、
hnSR100-8165-AmNA(15)（配列番号２１７）、
hnSR100-7174-AmNA，scpBNA(15)（配列番号２１８）または
hnSR100-7174-AmNA，GuNA(15)（配列番号２１９）
である。上記に列挙したオリゴヌクレオチドに関して、「LNA」は、以下の式（ａ）で示される核酸を含むオリゴヌクレオチドであることを示す。「AmNA」は、以下の式（ｂ）で示される核酸を含むオリゴヌクレオチドであることを示す。「AmNA，scpBNA」は、以下の式（ｂ）で示される核酸（AmNA）および以下の式（ｃ）で示される核酸（scpBNA）を含むオリゴヌクレオチドであることを示す。「AmNA，GuNA」は、以下の式（ｂ）で示される核酸（AmNA）および以下の式（ｄ）で示される核酸（GuNA）を含むオリゴヌクレオチドであることを示す。

本発明におけるオリゴヌクレオチドは、上述したような糖修飾ヌクレオシドおよび天然ヌクレオシドを用いて、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、Applied Biosystems社製、株式会社ジーンデザイン製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters，1981, vol. 22. pp.1859−1862、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２０１４／０４６２１２号、国際公開第２０１５／１２５７８３号等に開示されている。

本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有するnSR100発現抑制剤を包含する。さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩またはnSR100発現抑制剤を含有する癌治療薬を包含する。nSR100発現抑制剤とは、本発明のnSR100発現抑制剤または癌治療薬の投与方法および製剤は、当該分野で公知の投与方法および製剤であれば、いずれも利用可能である。これらは、局所的あるいは全身的な処置、または処置すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。

本発明の癌治療薬は、局所的あるいは全身的な治療、または治療すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、または、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による気道を介した肺投与等が挙げられる。

本発明の癌治療薬を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。

経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。

非経口投与用組成物としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。

本発明の癌治療薬は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩、あるいはnSR100発現抑制剤の有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。

本発明の癌治療薬は、nSR100遺伝子発現に関連した癌疾患の治療または予防に用いられ得る。nSR100遺伝子発現に関連した癌疾患として、例えば、小細胞肺癌、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌（CRPC））、乳癌が挙げられる。このような癌疾患は、神経内分泌細胞に由来し得る。

本発明は、nSR100遺伝子発現抑制方法を提供する。本発明は、癌疾患の治療または予防のための方法も提供する。１つの実施形態では、これらの方法は、nSR100遺伝子発現に関連した癌疾患（例えば、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌）の治療に用いられる。これらの方法は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む。「個体」とは、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスであり、さらに好ましくはヒトである。これらの方法においては、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量が投与される限り、投与方法および剤型は問わない。投与有効量は、投与される個体に依存するが、個体の性別、年齢、体重、症状等、ならびに投与の方法、経路、頻度などに応じて任意に定めることができる。投与方法等は上述したとおりである。

nSR100遺伝子発現に関連した癌疾患（例えば、小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌）の治療において、nSR100遺伝子に基づく診断を併用することもできる。このような診断としては、血液中において上記癌疾患（特に小細胞肺癌）患者に特異的に検出されるmiRNA（例えば、miR-4279（例えば、cucuccuccc ggcuuc（配列番号７２））、miR-4419b（例えば、gaggcugaag gaagaugg（配列番号７３））、miR-4516（例えば、gggagaaggg ucggggc（配列番号７４））、およびmiR-4635（例えば、ucuugaaguc agaacccgca a（配列番号７５））の少なくとも１種）を指標マーカーとすることができる。好ましくは、miR-4516が用いられる。この診断のため、例えば、特許文献１に記載の診断薬および診断方法を用いることができる。このような診断との併用により、早期の診断および治療が可能となり、上記癌疾患の治療がより効果的なものとなり得る。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

（実施例１：オリゴヌクレオチド合成）
本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、Tetrahedron Letters 22，1859-1862(1981)、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に記載される方法によって合成した。

具体的には、式（ａ）で示される2’,4’-BNA/LNAを含むオリゴヌクレオチドに関しては、株式会社ジーンデザインに合成委託した。

（式中、Ｂａｓｅは５−メチルシトシニル基、チミニル基、アデニニル基またはグアニニル基である。）

式（ｂ）で示されるアミドBNA（AmNA）を含むオリゴヌクレオチドに関しては、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法を参照して合成した。

（式中、Ｂａｓｅは５−メチルシトシニル基、チミニル基、アデニニル基またはグアニニル基であり、Ｍｅはメチルである。）

式（ａ）で示される2’,4’-BNA/LNAまたは式（ｂ）で示されるアミドBNA（AmNA）を含有する１５〜１９マー（mer）のオリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（nS-8型、株式会社ジーンデザイン製）を用いて、０．２μｍｏｌスケールで合成した。鎖長の伸長は標準的なホスホロアミダイトプロトコール（固相担体：CPGレジン、ホスホロチオエート化（PS）骨格形成のための硫化はDDT（3H-1,2-Benzodithiole-3-one,1,1-dioxide）等を使用）にて実施し、末端の５’位の水酸基がDMTr（ジメトキシトリチル）基で保護され、かつ３’位が固相に担持されたオリゴヌクレオチドを得た。続いて、酸処理により、DMTr基を除去した後、塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した。希酸にて中和後、溶媒を留去し、得られた粗生成物をゲルろ過カラムクロマト、逆相HPLCにて精製することにより目的物を得た。

本実施例で使用したLNAまたはAmNAの架橋構造、ならびに得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をHPLCおよびMALDI-TOF-MS（BRUKER DALTONICS社製）により確認した。

（実施例２：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計）
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトnSR100（hnSR100）（GenBank：NM_194286.3（配列番号１））のmRNAを標的とするよう設計した。

標的領域の選定のため、アンチセンスで毒性発現するＣＧ、ＴＣＣ、ＴＧＣの逆配列（ＣＧ、ＧＧＡ、ＧＣＡ）を除外した。次いで、mfold（mfold：http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）を用いた二次構造予測に基づき、ループ構造などのアンチセンスオリゴヌクレオチドがアクセスしやすい領域を選定した。次いで、Blast（BLAST：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch）を用いて、マウスで評価した結果に基づいてヒトへの適用を可能にするように、nSR100遺伝子についてヒトmRNAおよびマウスmRNAの相同性の高い領域を中心に選択した。このようにして、２２種の候補配列を選定した。

上記のように選定した候補配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さを１５マーとし、５’末端および３’末端に糖修飾ヌクレオシドを含む人工核酸領域を、そして中央部に天然ヌクレオシド（DNA）を含む天然核酸領域を設けた。より詳細には、５’末端側の３塩基（５’ウイング領域）を糖修飾ヌクレオシドとし、次いで９塩基（ギャップ領域）を天然ヌクレオシド（DNA）、次いで３’末端側の３塩基（３’ウイング領域）のうち中央側の２塩基を糖修飾ヌクレオシド、そして３’末端の１塩基を天然ヌクレオシドとする、３−９−２−１型ギャップマーを設計した。

表１は、設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（５’→３’方向）およびその標的領域の配列の５’末端および３’末端を配列番号１の塩基位置にて示す。表１では、糖修飾ヌクレオシドとして2’,4’-BNA/LNA（単に「LNA」とも示す）を用いた。

表１中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、上から順に、配列番号７６〜９７に対応する。表１中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの表記であるhnSR100-ｐ-ｎ(Ｌ)において、「ｐ」は、配列番号１におけるその標的領域の５’末端にあたる塩基位置の番号に該当し、「ｎ」は、糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）であり（表１では「LNA」）、そして「Ｌ」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さである。例えば、hnSR100-7174-LNA(15)であれば、配列番号１の塩基配列の７１７４位が標的領域の５’末端となり、LNAを含み、そして１５マーの長さである。表１では、配列名「hnSR100L#21」のアンチセンスオリゴヌクレオチドが「hnSR100-7174-LNA(15)」でもあるため、本明細書中においては、いずれか一方で示すか、あるいは「hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)」とも示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を５’から３’の方向（５’→３’）で表す場合、例えば、hnSR100-7174でアンチセンスオリゴヌクレオチドが１５マーの長さの場合、配列番号１の塩基配列の７１７４位から１５塩基分３’末端側に伸ばした、すなわち配列番号１の７１７４位から７１８８位までのDNA塩基配列である５’−gcttcagtcacacaa−３’（配列番号９８）に基づく標的mRNA配列である５’−gcuucagucacacaa−３’ （配列番号９９）に相補する塩基配列（５’−ttgtgtgactgaagc−３’）（配列番号８）として設計した。このように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドhnSR100-7174-LNA(15)の塩基配列（５’−ttgtgtgactgaagc−３’）（配列番号８）は、配列番号１の７１７４位から７１８８位までの領域の塩基配列（５’−gcttcagtcacacaa−３’）（配列番号９８）に対して相補的な配列となる。

なお、「ホスホロチオエート化」とは、リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換された構造（リン酸基に対応する基をホスホロチオエート基という）としたことをいう。また、本明細書において、オリゴヌクレオチドのリン酸基がすべてホスホロチオエート基に置き換わったオリゴヌクレオチドを特にＳ−オリゴヌクレオチドという。表１に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドである。

（実施例３：ヒトSCLC細胞におけるインビトロでのnSR100のmRNA発現抑制）
（３−１：種々のアンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNA発現抑制解析）
実施例２で調製したアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ヒトSCLC細胞におけるインビトロでのnSR100のmRNA発現抑制について調べた。ヒトSCLC細胞として、NCI-H82細胞（American Type Culture Collection：ATCC）、STC-1細胞（ATCC）、およびNCI-N417細胞（ATCC）を用いた。オリゴヌクレオチドを添加しなかったものをコントロールとした。また、比較のために、Ｎ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：本実施例では大文字の塩基は2’,4’-BNA/LNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１００）を用いた。

各アンチセンスオリゴヌクレオチドをCEM法（「Ca^２＋ enrichment for medium」カルシウムイオン富化培地を用いた方法：Nucleic Acids Research, 2015, Vol.43, e128）を用いてヒトSCLC細胞に取り込ませ、qRT-PCR法にてmRNAの発現量を測定し、ノックダウン活性（mRNAの発現抑制）を調べた。以下に手順を示す。

対数増殖期のヒトSCLC細胞を２．０×１０^５個／ウェルにて、２４ウェルプレートのウェル（１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含む）中に播いた。２４時間後、各オリゴヌクレオチドを最終濃度が２００ｎＭとなるように、９ｍＭの塩化カルシウムと共にウェル内に添加し、７２時間インキュベートした。

インキュベーション後、細胞を回収し、RNA抽出キット（Qiagen社, Total RNeasy mini Kit）を用いて、total RNAを抽出した。該total RNAを鋳型として、逆転写反応キット（Qiagen社, Quantitect reverse transcriptase又はタカラバイオ株式会社、Primescript RT）を用いて逆転写反応を行った。さらに、逆転写反応後の試料を鋳型として、リアルタイムPCR反応キット（Qiagen社, SYBR Green PCR kit又はタカラバイオ株式会社、SYBR Premix EX TaqII）を用いて、PCRを行った。核酸増幅反応は、９５℃ ５分→［（９５℃ ５秒→６０℃ ５秒）×４０サイクル］の温度サイクルで行った。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のヒトGAPDHまたはアクチンのmRNA量も同時に定量し、GAPDH（図１）またはアクチン（図２）のmRNA量に対するhnSR100のmRNA量を評価した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドによるmRNA量は、オリゴヌクレオチド無添加細胞であるコントロールのmRNA量を１または１００％とした場合の相対値または相対％にて示す。

用いたプライマーセットは、下記のとおりである：
（hnSR100検出用プライマーセット）
Set1-Fw：tgacaaagacttgacaccacc（配列番号１０１）
Set1-Rv：acctgcgtcgcttgtgttt（配列番号１０２）
Set2-Fw：ctcctcaccccagaacaagg（配列番号１０３）
Set2-Rv：ggatgggaccaaactggact（配列番号１０４）
（ヒトGapdh検出用プライマーセット）
Set1-Fw：gagtcaacggatttggtcgt（配列番号１０５）
Set1-Rv：gacaagcttcccgttctcag（配列番号１０６）
（ヒトアクチン検出用プライマーセット）
Set1-Fw：ggccgtcttcccctccatcg（配列番号１０７）
Set1-Rv：ccagttggtgacgatgccgtgc（配列番号１０８）

結果を図１（Ａ：ヒトNCI-H82細胞；およびＢ：ヒトSTC-1細胞）および図２（NCI-N417細胞）に示す。オリゴヌクレオチド無添加細胞（「コントロール」）およびＮ２６添加細胞よりもmRNA量が低くなる、すなわちmRNA発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが見出された。

（３−２：アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現抑制に関する濃度依存性）
上記３−１において比較的高い発現抑制活性（ノックダウン活性）がみられたhnSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)、hnSR100L#2／hnSR100-717-LNA(15)、hnSR100L#3／hnSR100-721-LNA(15)、hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)、hnSR100L#5／hnSR100-783-LNA(15)、hnSR100L#6／hnSR100-786-LNA(15)、hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)およびhnSR100L#22／hnSR100-7177-LNA(15)のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、それらのnSR100のmRNA発現抑制に関する濃度依存性を調べた。ヒトSCLC細胞としてヒトNCI-H82細胞を用い、上記３−１のヒトSCLC細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加量を５０ｎＭ、２５ｎＭまたは１２．５ｎＭのいずれかとした。

図３において、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドについて左側から順に、５０ｎＭ、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭの結果を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを低濃度で添加した場合でも発現抑制活性（ノックダウン活性）を確認することができた。特に、hnSR100L#6、hnSR100L#21およびhnSR100L#22において、低濃度条件でも比較的高い発現抑制活性が見られた。

（実施例４：ヒトSCLC細胞におけるインビトロでのnSR100のmRNA発現抑制）
（４−１：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計）
実施例３において、低濃度条件下において比較的高い発現抑制活性が見られたhnSR100L#6／hnSR100-786-LNA(15)およびhnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)のそれぞれの標的配列の周辺の塩基を含む配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、さらに設計した（表２および３）。

本実施例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さを１５、１７または１９マーとし、５’末端および３’末端に糖修飾ヌクレオシドを含む人工核酸領域を、そして中央部に天然ヌクレオシド（DNA）を含む天然核酸領域を設けた。より詳細には、５’末端側の３塩基（５’ウイング領域）を糖修飾ヌクレオシドとし、次いで９〜１３塩基（ギャップ領域）を天然ヌクレオシド（DNA）、次いで３’末端側の３塩基（３’ウイング領域）のうち中央側の２塩基を糖修飾ヌクレオシド、そして３’末端の１塩基を天然ヌクレオシドとする、３−９−２−１型、３−１１−２−１型または３−１３−２−１型ギャップマーを設計した。

表２および３は、設計したアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（５’→３’方向）およびその標的領域の配列の５’末端および３’末端を配列番号１の塩基位置にて示す。表２では、糖修飾ヌクレオシドとして2’,4’-BNA/LNAを用いた。表３では、糖修飾ヌクレオシドとしてAmNAを用いた。表２および３に記載のオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドである。

表２中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上から順に、配列番号１０９〜１３６にそれぞれ対応する。

表３中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上から順に、配列番号１３７〜１６６にそれぞれ対応する。

表２および３中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの表記であるhnSR100-ｐ-ｎ(Ｌ)は、表１について説明したとおりである。「ｎ」は、表２では糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）のLNAであり、表３では糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）のAmNAである。例えば、hnSR100-7174-AmNA(15)であれば、配列番号１の塩基配列の７１７４位が標的領域の５’末端となり、AmNAを含み、そして１５マーの長さである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、実施例２と同様に、配列番号１の塩基配列に基づいて標的領域の５’末端から３’末端に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さとなる塩基数分延長した塩基配列に相補的な塩基配列として設計した。

（４−２：インビトロでのnSR100 mRNA発現抑制アッセイ）
上記３−１と同様にして、ヒトSCLC細胞としてヒトSTC-1細胞を１×１０^５個／ウェルにて用い、ヒトSCLC細胞に各種アンチセンスオリゴヌクレオチドを添加して、nSR100のmRNA量を求めた。また、比較のために、上記３−１と同様に、Ｎ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：本実施例では大文字の塩基は2’,4’-BNA/LNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１００）を用いた。

結果を図４に示す。LNAを含む場合およびAmNAを含む場合のいずれとも、オリゴヌクレオチド無添加細胞（「コントロール」）およびＮ２６添加細胞（「Ｎ２６」）よりもnSR100のmRNA量が低くなる、すなわちmRNA発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが見出された。hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)をベースに設計した塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、比較的高いmRNA発現抑制活性が確認された。

（４−３：hnSR100L#21ベースに設計した塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロでのnSR100 mRNA発現抑制アッセイ）
さらに、hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)をベースに設計した塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、トランスフェクト試薬を用いてヒトSCLC細胞にトランスフェクトし、そのmRNA発現抑制活性を調べた。

対数増殖期のヒトSTC-1細胞を１．０×１０^５個／ウェルにて、２４ウェルプレートのウェル（１０％FBSを含むDMEM培地（低グルコース）を含む）中に播いた。２４時間後、各オリゴヌクレオチドを最終濃度が１００ｎＭまたは３０ｎＭとなるように９ｍＭの塩化カルシウムと共にウェル内に添加し、そして市販のトランスフェクション試薬（リポフェクタミン３０００：サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より入手）を用いてトランスフェクトした。さらに培養を続け、４８時間後に細胞を回収した。上記３−１と同様にして、hnSR100のmRNA量を評価した。

結果を図５に示す。LNAを含む場合およびAmNAを含む場合のいずれとも、オリゴヌクレオチド無添加細胞（コントロール）およびＮ２６添加細胞（「Ｎ２６」）よりもmRNA量が低くなる、すなわちｍＲＮＡ発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが見出された。

（４−５：アンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNA発現抑制に関する濃度依存性）
mRNA発現抑制に関して、hnSR100-7172-LNA(15)、hnSR100-7170-LNA(17)、hnSR100-7168-LNA(19)、hnSR100-7172-AmNA(17)、hnSR100-7170-AmNA(15)およびhnSR100-7168-AmNA(17)のアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、それらのnSR100 mRNA発現抑制に関する濃度依存性を調べた。ヒトSTC-1細胞へのトランスフェクションの際のアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加量を２００ｎＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭまたは１５ｎＭのいずれかとした以外は、上記４−３に記載のようにしてmRNA量を評価した。

結果を図６に示す。用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは発現抑制（ノックダウン）について濃度依存性が確認され、低濃度（例えば１５ｎＭまたは３０ｎＭ）で添加した場合でも発現抑制（ノックダウン）が見られた。

（４−６：インビトロでのnSR100 mRNA発現抑制アッセイ）
上記４−５で用いた各種アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ヒトNCI-H82細胞を用いて、上記３−１に記載のようにして、nSR100のmRNA量を評価した。

結果を図７に示す。hnSR100-7172-LNA(15)、hnSR100-7170-LNA(17)、hnSR100-7168-LNA(19)、hnSR100-7172-AmNA(17)、hnSR100-7170-AmNA(15)およびhnSR100-7168-AmNA(17)のいずれとも、ヒトNCI-H82細胞においても、nSR100のmRNA発現抑制が確認された。

（実施例５：インビトロでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞増殖抑制効果検証）
アンチセンスオリゴヌクレオチドhnSR100L#21について、ヒトSCLC細胞としてヒトNCI-H82細胞を用いて、上記３−１と同様にしてmRNA量を求めた。また、ヒトSCLC細胞としてヒトSTC-1細胞を用いて、上記４−３に記載のようにしてmRNA量を評価した（比較のためにＮ２６を用いた）。

さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドhnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)またはＮ２６を添加した細胞および無添加の細胞のそれぞれについて、WST-1試薬キット（株式会社同仁化学研究所より入手）を用いて同キットに添付の指示書に従って細胞増殖能力を調べた。細胞増殖能力の結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチド無添加細胞（コントロール）の生存細胞数を１とする相対数で示した。

結果を図８に示す（Ａ．ヒトNCI-H82細胞およびＢ．ヒトSTC-1細胞のそれぞれの（ａ）nSR100のmRNA量および（ｂ）細胞生存度を示す）。ヒトNCI-H82細胞については、アンチセンスオリゴヌクレオチドhnSR100L#21を添加した細胞では、無添加細胞（コントロール）と比べてhnR100のmRNA量の低下および細胞生存度の低下が観察された。ヒトSTC-1細胞については、無添加細胞（コントロール）および比較のＮ２６添加細胞と比べてhnR100のmRNA量の低下および細胞生存度の低下が観察された。これにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドhnSR100L#21の添加により、ヒトSCLC細胞におけるhnR100のmRNAの発現抑制に加え、SCLC細胞の細胞生存の低下または細胞増殖の抑制を示すことが確認された。

（実施例６：アンチセンスオリゴヌクレオチド投与マウスにおける腫瘍抑制効果の検証）
（６−１．移植用細胞および投与アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製）
腫瘍形成を蛍光画像観察できるように、ヒトNCI-N417細胞にレトロウイルスを用いてホタルルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（GFP）を導入し、組み込まれた細胞（「hSCLC-LUC細胞」）を単離し、この細胞を、細胞外マトリックス成分（Millipore, ECL cell attachment matrix）でコーティングされた培養皿上で、湿潤環境下、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で４８時間、接着培養した。

（６−２．胸腔内移植による腫瘍形成およびアンチセンスオリゴヌクレオチド静脈投与）
６週齢のBALB/c Slc-nu/nu胸腺欠損ヌードマウス（雄）にhSCLC-LUC細胞（１×１０^６細胞）を胸腔内移植し、腫瘍を形成させた。移植の７日後に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を開始した。投与開始日を０日として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを０日目、２日目、４日目および６日目に２ｍｇ／ｋｇにてマウスに静脈注射した。ここでのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、hnSR100-7168-AmNA(17)、hnSR100-7172-AmNA(17)およびhnSR100-7174-AmNA(15)を用いた。コントロールのオリゴヌクレオチドとして、同様にAmNAを用いたＬ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：大文字の塩基はAmNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１６７：修飾核酸がAmNAであること以外、Ｎ２６オリゴヌクレオチドの塩基配列に対応する）を用いた。各投与日に、マウスの腫瘍について観察した。

（６−３．胸腔内移植による腫瘍形成およびアンチセンスオリゴヌクレオチド気道投与）
６週齢のBALB/c Slc-nu/nu胸腺欠損ヌードマウス（雄）にhSCLC-LUC細胞（１×１０^６細胞）を胸腔内移植し、腫瘍を形成させた。移植の３日後に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を開始した。投与開始日を０日として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを０日目、２日目、４日目および６日目に５０ｍｇ／ｋｇにてマウスの気道に投与した。ここでのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)を用いた。コントロールのオリゴヌクレオチドとして、同様にLNAを用いたＬ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：大文字の塩基は2’,4’-BNA/LNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１００：Ｎ２６オリゴヌクレオチドに対応する）を用いた。投与開始日の０日目、７日目および１０日目に、マウスの腫瘍について観察した。

（６−４．背中皮下移植による腫瘍形成およびアンチセンスオリゴヌクレオチド腹腔内投与）
６週齢のBALB/c Slc-nu/nu胸腺欠損ヌードマウス（雌）にhSCLC-LUC細胞（５×１０^５細胞）を皮下移植し、腫瘍を形成させた。移植の７日後に、マウスにアンチセンスオリゴヌクレオチドを腹腔内投与した。ここでのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、hnSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)、hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)およびhnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)を用いた。コントロールのオリゴヌクレオチドとして、同様にLNAを用いたＬ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：大文字の塩基は2’,4’-BNA/LNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１００：Ｎ２６オリゴヌクレオチドに対応する）を用いた。アンチセンスオリゴヌクレオチの投与から１０日後に、マウスの腫瘍について観察した。

（６−５．結果）
上記６−２の結果を図９（hnSR100-7168-AmNA(17)）、図１０（hnSR100-7172-AmNA(17)）および図１１（hnSR100-7174-AmNA(15)）に、上記６−３の結果を図１２（hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)）に、上記６−４の結果を図１３（hnSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)、hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)およびhnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)）に示す。いずれも、各種アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与前後のマウスにおける腫瘍の状態を示す写真である。図９〜１３のいずれの場合とも、コントロールのオリゴヌクレオチド（Ｌ２６）では、投与前に比べて投与後に、蛍光画像により表される腫瘍の部分が拡大していたのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチドでは、投与前に比べて投与後に、蛍光画像により表される腫瘍の部分が縮小していた。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与したマウスにおいて、腫瘍抑制効果が確認された。

（実施例７：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および合成ならびにmRNA発現抑制解析）
実施例２に追加し、更なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを取得するため、ヒトnSR100（hnSR100）（GenBank：NM_194286.3（配列番号１））のmRNAを標的とするよう設計した。糖修飾ヌクレオシドとして、上記式（ａ）の2’,4’-BNA/LNA（「LNA」）を用いた。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および合成を実施例１〜２と同様にして行った。アンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも、５’末端側の３塩基（５’ウイング領域）を糖修飾ヌクレオシド（LNA）とし、次いで９塩基（ギャップ領域）を天然ヌクレオシド（DNA）、次いで３’末端側の３塩基（３’ウイング領域）のうち中央側の２塩基を糖修飾ヌクレオシド、そして３’末端側の１塩基を天然ヌクレオシドとする、３−９−２−１型ギャップマーを設計した。用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、すべてＳ−オリゴヌクレオチドであった。

アンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNA発現抑制解析は、ヒトSCLC細胞としてSTC-1細胞を用いて、上記３−１と同様にして行った。オリゴヌクレオチドを添加しなかったものをコントロールとした。また、比較のために、Ｎ２６オリゴヌクレオチド（塩基配列：５’−TGAacaaaataaTAc−３’：大文字の塩基は2’,4’-BNA/LNAであり、小文字の塩基はDNAであり、Ｓ−オリゴヌクレオチドである：配列番号１００）を用いた。

調製しかつ発現抑制を調べたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表４に示す通りである。以下の表４には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの名称（「オリゴヌクレオチド名」）を、その標的領域の配列の５’末端および３’末端（各々、配列番号１の塩基位置にて示す）と共に示す。

表４中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの表記であるhnSR100-ｐ-ｎ(Ｌ)は、表１について説明したとおりである。表４中では「ｎ」は、LNAである。例えば、hnSR100-680-LNA(15)であれば、配列番号１の塩基配列の６８０位が標的領域の５’末端となり、LNAを含み、そして１５マーの長さである。

mRNA発現抑制解析の結果を図１４に示す。特に高いmRNA発現抑制率を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドを以下の表５に、配列（５’→３’方向）およびその標的領域の配列の５’末端および３’末端（配列番号１の塩基位置にて示す）と共に示す。表５中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上から順に、配列番号１６８〜１７１にそれぞれ対応する。

（実施例８：アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計および合成ならびにmRNA発現抑制解析）
実施例２および７に追加し、更なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを取得するため、ヒトnSR100（hnSR100）（GenBank：NM_194286.3（配列番号１））のmRNAを標的とするよう設計した。

標的領域の選定のため、アンチセンスで毒性を発現するCGの逆配列（GC）を除外した。ついで、実施例２と同様の手法により、２９９種の候補配列を選定した。但し、実施例２とは異なり、配列選定にマウスmRNAの配列を考慮に入れなかった。

上記のように選定した候補配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さを１５マーとし、５’末端および３’末端に糖修飾ヌクレオシドを含む人工核酸領域を、そして中央部に天然ヌクレオシド（DNA）を含む天然核酸領域を設けた。より詳細には、５’末端側の３塩基（５’ウイング領域）を糖修飾ヌクレオシドとし、次いで９塩基（ギャップ領域）を天然ヌクレオシド（DNA）、次いで３’末端側の３塩基（３’ウイング領域）のうち中央側の２塩基を糖修飾ヌクレオシド、そして３’末端側の１塩基を天然ヌクレオシドとする、３−９−２−１型ギャップマー、または、３’末端側の全３塩基を糖修飾ヌクレオシドとする、３−９−３型ギャップマーを設計した。

糖修飾ヌクレオシドとして、以下の核酸を用いた：式（ｂ）で示されるアミドBNA（AmNA）、式（ｃ）で示されるスピロシクロBNA（scpBNA）または式（ｄ）で示されるグアニジノBNA（GuNA）：

アミドBNA（AmNA）に関しては、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法を参照して合成した。スピロシクロBNA（scpBNA）に関しては、国際公開第２０１５／１２５７８３号に記載の方法を参照して合成した。グアニジノBNA（GuNA）に関しては、国際公開第２０１４／０４６２１２号に記載の方法を参照して合成した。

アミドBNA（AmNA）、スピロシクロBNA（scpBNA）またはグアニジノBNA（GuNA）を含む15マー（mer）オリゴヌクレオチドは、実施例１と同様の方法を用いて合成した。アミドBNA（AmNA）を含有するオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がDMTr（ジメトキシトリチル）基で保護され、かつ３’位が固相に担持されたものを得た。続いて塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した後に溶媒を留去し、得られた粗生成物をカートリッジ精製することにより目的物を得た。一方、スピロシクロBNA（scpBNA）またはグアニジノBNA（GuNA）のいずれか１つを含有し、アミドBNA（AmNA）を含有するオリゴヌクレオチドは、末端の５’位の水酸基がDMTr（ジメトキシトリチル）基で保護されておらず、かつ３’位が固相に担持されたものを得た。続いて塩基処理することにより、目的物を固相担体から切り出した後に溶媒を留去し、得られた粗生成物を逆相HPLCにて精製することにより目的物を得た。

得られた各オリゴヌクレオチドの純度および構造をLC-MS（Waters社製）により確認した。

以上のように調製したアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ヒトSCLC細胞におけるインビトロでのnSR100のmRNA発現抑制について調べた。調製しかつ発現抑制を調べたアンチセンスオリゴヌクレオチドには、それぞれ適宜、参照番号を付した（AmNAを含有するオリゴヌクレオチドについて参照番号３５３〜６４９；AmNAとscpBNAとを含有するオリゴヌクレオチドについて参照番号６６１；ならびにAmNAとGuNAとを含有するオリゴヌクレオチドについて参照番号７６４）。オリゴヌクレオチドを添加しなかったものをコントロールとした。また、比較のために、AmNAを含むＮ２６オリゴヌクレオチド（配列番号１６７）（「AmNA26オリゴヌクレオチド」とも称した）を用いた。さらに、hnSR100-7174-AmNA(15)（配列番号１５２）（表３に示す：hnSR100L#21ベースの塩基配列中にAmNAを含むオリゴヌクレオチドでもあるので、「AmNA21オリゴヌクレオチド」とも称した）もまた比較のために用いた。

ヒトSCLC細胞として、STC-1細胞（JCRB細胞バンク）を用いた。各アンチセンスオリゴヌクレオチドを市販のトランスフェクション試薬（ThermoFisher Scientific社，リポフェクトアミン3000）を用いてSTC-1細胞に取り込ませ、qRT-PCR法にてmRNAの発現量を測定し、ノックダウン活性（mRNAの発現抑制）を調べた。以下に手順を示す。

対数増殖期のSTC-1細胞を１．０×１０^５個／ウェルにて、２４ウェルプレートのウェル（１０％ウシ胎児血清（FBS）を含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）-1640培地（高グルコース）を含む）中に播いた。２４時間後、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを最終濃度が２００ｎＭとなるようにウェル内に添加し、２４時間インキュベートした。

インキュベート後、細胞を回収し、RNA抽出試薬（MACHEREY-NAGEL社, Nucleo ZOL）を用いて、total RNAを抽出した。該当total RNAを鋳型として、核酸増幅反応用試薬（QIAGEN社, QuantiFast Probe RT-PCR kit）を用いて逆転写反応とPCR増幅反応を行った。核酸増幅反応は、５０℃ １０分→９５℃ ５分→[（９５℃ １０秒→６０℃ ３０秒）×４０サイクル]の温度サイクリングで行った。リアルタイムPCRでは、ハウスキーピング遺伝子のヒトアクチンのmRNA量も同時に定量し、アクチンのmRNA量に対するhnSR100のmRNA量を評価した。各アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドによるmRNA量は、AmNA２６オリゴヌクレオチド添加細胞のmRNA量を１とした場合の相対値にて示す。

用いたプライマーセットは、下記のとおりである：
（hnSR100検出用プライマーセット）
Set1-Fw：tgacaaagacttgacaccacc（配列番号１０１）
Set1-Rv：acctgcgtcgcttgtgttt（配列番号１０２）
（ヒトアクチン検出用プライマーセット）
TaqMan Gene Expression Assay Hs99999903_m1_4331182（ThermoFisher Scientific社）

結果を図１５〜２４に示す。特に高いmRNA発現抑制率を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドを以下の表６および７に列挙し、配列（５’→３’方向）、標的領域の配列の５’末端および３’末端（各々、配列番号１の塩基位置にて示す）ならびに参照番号と共に示す。これらの表６および７中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの表記であるhnSR100-ｐ-ｎ(Ｌ)は、表１〜３について説明したとおりである。「ｎ」は、「AmNA」の表記の場合は、糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）がAmNAであるオリゴヌクレオチドであり、「AmNA，scpBNA」の場合は、糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）にAmNAおよびscpBNAを用いたオリゴヌクレオチドであり、「AmNA，GuNA」の場合は、糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）にAmNAおよびGuNAを用いたオリゴヌクレオチドである。「ｎ」が「AmNA」または「AmNA，GuNA」の場合はオリゴヌクレオドの３’末端がDNAであるのに対し、「ｎ」が「AmNA，scpBNA」である場合はオリゴヌクレオドの３’末端もまた糖修飾ヌクレオシド（人工核酸）を用いた。表６および７中、「ｎ」が「AmNA」であるオリゴヌクレオチドにおいては、本実施例で検討した２９７配列のうち上位４６個のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。表６および７中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は、上から順に、配列番号１７２〜２１９にそれぞれ対応する。

「５」は５−メチルシトシン（５mC）を表す。
A(Y)，G(Y)，5(Y)，T(Y)は、AmNAの塩基を表す。
A(D)，G(D)，5(D)，T(D)は、GuNAの塩基を表す。
A(S)，G(S)，5(S)，T(S)は、scpBNAの塩基を表す。
a，g，c，tは、DNAの塩基を表す。
「^」は、ホスホロチオエート化を表す。

これまでの実施例の結果および本実施例の結果を併せて、AmNAを含む場合、GuNAを含む場合およびscpBNAを含む場合のいずれとも、オリゴヌクレオチド無添加細胞（「コントロール」）およびAmNA26添加細胞よりもmRNA量が低くなる、すなわちmRNA発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドが見出された。

本発明は、癌治療のための医薬品の製造に有用である。

Claims

オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であって、該オリゴヌクレオチドが、以下の式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造：

を少なくとも１つ含み、
ここで、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基、またはα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ａは、以下：

で表される二価の基であり、
Ｒ^１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表し；
Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^２およびＲ^３は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ^４およびＲ^５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ^１１）Ｒ^１２［式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］であり；
Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ^８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；
Ｒ^９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ^１０は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

であるか、あるいは−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９［式中、Ｒ^１７、Ｒ^１８およびＲ^１９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である］であり；
Ｒ^１３およびＲ^１４は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であり；
ｍは、０から２の整数であり；
ｎは、０から１の整数であり；
Ｒ^１０が水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

である場合、ｐは１であり、かつＲ^１５およびＲ^１６は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、アミノ基の保護基、または

であり、あるいは
Ｒ^１０が−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９である場合、ｐは０であり；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｙは酸素原子または硫黄原子であり、
該オリゴヌクレオチドが、ヒトnSR100遺伝子と結合し得、該ヒトnSR100遺伝子の発現を抑制する活性を有し、
該オリゴヌクレオチドの長さが、１２〜２０塩基であり、そして
該オリゴヌクレオチドが、配列番号１の６００位から６２０位、６４０位から７００位、７１０位から８００位、１０６０位から１０８０位、１５６０位から１６００位、１６３０位から１６６０位、１６８５位から１７２０位、１８５０位から１９００位、２９００位から２９２５位、３８３５位から３８７５位、４８００位から４８３０位、５９００位から５９７０位、６０１０位から６０３５位、６２３０位から６２７０位、６３００位から６３２０位、６４４０位から６４７０位、６７５０位から６７７２位、６８６５位から６８９０位、７０４５位から７０８０位、７１３０位から７１５５位、７１６０位から７２２０位、７３６０位から７３９０位、７６８０位から７８５０位、７９５０位から７９８０位、７９９５位から８０２０位または８１６０位から８１８０位の塩基配列の中の１２〜２０塩基の連続した配列からなる標的領域と相補的である配列を含む、
オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
前記標的領域の５’末端が、配列番号１の７１６８位、７１７０位、７１７２位または７１７４位であり、そして前記オリゴヌクレオチドの長さが１５〜１９塩基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
前記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２〜７１のいずれかの塩基配列を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
前記オリゴヌクレオチドが、６〜１５塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイングおよび３〜５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、
該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして
該５’ウイングおよび該３’ウイングが、少なくとも１つの前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造を含む、請求項１から３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
前記式（Ｉ）で表されるヌクレオシド構造が、

（ここで、Ｒ^１３およびＲ^１４がともに水素原子である）；

（ここで、ｍは０であり、そしてＲ^１は、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基である）；

（ここで、Ｒ^２およびＲ^３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ^２およびＲ^３は一緒になって、−（ＣＨ_２）_ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表す）；または

（ここで、Ｒ^１０は、−（Ｃ＝（ＮＨＲ^１７）^＋）−ＮＲ^１８Ｒ^１９であり、Ｒ^１７およびＲ^１８は、それぞれ独立して、水素原子、または、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基であり、そしてＲ^１９は水素原子である）
である、請求項１から４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
前記オリゴヌクレオチドが、
nSR100L#1／hnSR100-712-LNA(15)（配列番号７６）、
hnSR100L#2／hnSR100-717-LNA(15)（配列番号７７）、
hnSR100L#3／hnSR100-721-LNA(15)（配列番号７８）、
hnSR100L#4／hnSR100-780-LNA(15)（配列番号７９）、
hnSR100L#5／hnSR100-783-LNA(15)（配列番号８０）、
hnSR100L#6／hnSR100-786-LNA(15)（配列番号８１）、
hnSR100L#21／hnSR100-7174-LNA(15)（配列番号９６）、
hnSR100L#22／hnSR100-7177-LNA(15)（配列番号９７）、
hnSR100-7170-LNA(19)（配列番号１２４）、
hnSR100-7172-LNA(15)（配列番号１２５）、
hnSR100-7170-LNA(17)（配列番号１２６）、
hnSR100-7168-LNA(19)（配列番号１２７）、
hnSR100-7170-LNA(15)（配列番号１２８）、
hnSR100-7168-LNA(17)（配列番号１２９）、
hnSR100-7166-LNA(19)（配列番号１３０）、
hnSR100-7176-LNA(15)（配列番号１３１）、
hnSR100-7174-LNA(17)（配列番号１３２）、
hnSR100-7172-LNA(19)（配列番号１３３）、
hnSR100-7178-LNA(15)（配列番号１３４）、
hnSR100-7174-AmNA(15)（配列番号１５２）、
hnSR100-7172-AmNA(17)（配列番号１５３）、
hnSR100-7170-AmNA(19)（配列番号１５４）、
hnSR100-7172-AmNA(15)（配列番号１５５）、
hnSR100-7170-AmNA(17)（配列番号１５６）、
hnSR100-7168-AmNA(19)（配列番号１５７）、
hnSR100-7170-AmNA(15)（配列番号１５８）、
hnSR100-7168-AmNA(17)（配列番号１５９）、
hnSR100-7174-AmNA(17)（配列番号１６２）、
hnSR100-7172-AmNA(19)（配列番号１６３）、
hnSR100-680-LNA(15)（配列番号１６８）、
hnSR100-1064-LNA(15)（配列番号１６９）、
hnSR100-3841-LNA(15)（配列番号１７０）、
hnSR100-3854-LNA(15)（配列番号１７１）、
hnSR100-604-AmNA(15)（配列番号１７２）、
hnSR100-1566-AmNA(15)（配列番号１７３）、
hnSR100-1582-AmNA(15)（配列番号１７４）、
hnSR100-1584-AmNA(15)（配列番号１７５）、
hnSR100-1633-AmNA(15)（配列番号１７６）、
hnSR100-1645-AmNA(15)（配列番号１７７）、
hnSR100-1689-AmNA(15)（配列番号１７８）、
hnSR100-1690-AmNA(15)（配列番号１７９）、
hnSR100-1697-AmNA(15)（配列番号１８０）、
hnSR100-1858-AmNA(15)（配列番号１８１）、
hnSR100-1863-AmNA(15)（配列番号１８２）、
hnSR100-2906-AmNA(15)（配列番号１８３）、
hnSR100-4810-AmNA(15)（配列番号１８４）、
hnSR100-5907-AmNA(15)（配列番号１８５）、
hnSR100-5908-AmNA(15)（配列番号１８６）、
hnSR100-5950-AmNA(15)（配列番号１８７）、
hnSR100-6015-AmNA(15)（配列番号１８８）、
hnSR100-6239-AmNA(15)（配列番号１８９）、
hnSR100-6240-AmNA(15)（配列番号１９０）、
hnSR100-6302-AmNA(15)（配列番号１９１）、
hnSR100-6448-AmNA(15)（配列番号１９２）、
hnSR100-6755-AmNA(15)（配列番号１９３）、
hnSR100-6870-AmNA(15)（配列番号１９４）、
hnSR100-7057-AmNA(15)（配列番号１９５）、
hnSR100-7060-AmNA(15)（配列番号１９６）、
hnSR100-7130-AmNA(15)（配列番号１９７）、
hnSR100-7131-AmNA(15)（配列番号１９８）、
hnSR100-7133-AmNA(15)（配列番号１９９）、
hnSR100-7134-AmNA(15)（配列番号２００）、
hnSR100-7135-AmNA(15)（配列番号２０１）、
hnSR100-7136-AmNA(15)（配列番号２０２）、
hnSR100-7203-AmNA(15)（配列番号２０３）、
hnSR100-7365-AmNA(15)（配列番号２０４）、
hnSR100-7373-AmNA(15)（配列番号２０５）、
hnSR100-7688-AmNA(15)（配列番号２０６）、
hnSR100-7733-AmNA(15)（配列番号２０７）、
hnSR100-7734-AmNA(15)（配列番号２０８）、
hnSR100-7769-AmNA(15)（配列番号２０９）、
hnSR100-7792-AmNA(15)（配列番号２１０）、
hnSR100-7794-AmNA(15)（配列番号２１１）、
hnSR100-7827-AmNA(15)（配列番号２１２）、
hnSR100-7829-AmNA(15)（配列番号２１３）、
hnSR100-7859-AmNA(15)（配列番号２１４）、
hnSR100-7860-AmNA(15)（配列番号２１５）、
hnSR100-8001-AmNA(15)（配列番号２１６）、
hnSR100-8165-AmNA(15)（配列番号２１７）、
hnSR100-7174-AmNA，scpBNA(15)（配列番号２１８）または
hnSR100-7174-AmNA，GuNA(15)（配列番号２１９）である、
請求項１から５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を含有する、nSR100遺伝子発現抑制剤。
請求項１から６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩あるいは請求項７に記載のnSR100発現抑制剤を含有する、癌治療薬。
小細胞肺癌、前立腺癌および乳癌よりなる群から選択される少なくとも１つの癌の治療に用いられる、請求項８に記載の癌治療薬。