JP2007536925A - マイクロｎａｓおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本明細書には、前立腺ガンおよび肺ガンに関連する新規ポリヌクレオチドが記載されている。これらのポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ前駆体である。診断、予後診断およびこれらの病状の治療に用いることができる、関連する方法および組成物が開示されている。さらに本明細書には、前立腺ガンおよび肺ガンのモジュレーターを特定するために用いることができる方法が記載されている。

Description

本発明は、一般的にマイクロＲＮＡ分子ならびにそれに関連するまたはそれらに由来する種々の核酸分子に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は約２２ヌクレオチドの短いＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、遺伝子調節に関与する。マイクロＲＮＡは、切断または翻訳を抑制するためにｍＲＮＡを標的化することによって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡはＣ． ｅｌｅｇａｎｓ、ショウジョウバエおよびヒトを含む広範囲の種に存在するが、それらはつい最近、同定されたばかりである。より重要なことに、疾患の発症および進行におけるｍｉＲＮＡの役割が、ようやく最近になって理解されてきた。

ｍｉＲＮＡのサイズが小さいことの結果として、標準的な方法を用いてｍｉＲＮＡを同定することは困難であった。多量のＲＮＡを抽出することによって、限られた数のｍｉＲＮＡが同定された。さらに、視覚的に識別できる表現型の提示に寄与するｍｉＲＮＡも同定された。発現アレイのデータから、ｍｉＲＮＡは異なる発達段階であるいは異なる組織で発現することが示されている。ある特定の組織にまたは限られた発達段階にｍｉＲＮＡが制限されていることは、現在までに同定されたｍｉＲＮＡは、おそらくｍｉＲＮＡ全体の僅かな部分に過ぎないことを示唆する。

近年、ゲノム内のｍｉＲＮＡの残りを同定するためのコンピュータを利用したアプローチが開発された。ＭｉＲｓｃａｎおよびＭｉＲｓｅｅｋｅｒなどのツールによってｍｉＲＮＡが同定され、後に実験的にも確認されたた。これらのコンピュータを利用したツールに基づいて、ヒトゲノムに２００−２５５のｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれると推定された。しかし、これらの推定値は未だ同定されていないｍｉＲＮＡも既に同定されたｍｉＲＮＡと同一の特性を持つであろうという仮定に基づくものではある。哺乳動物の生物学および疾患におけるｍｉＲＮＡの基本的な重要性に基づけば、技術は未知のｍｉＲＮＡを同定することを必要としている。本発明によってこの必要性が満たされ、その結果相当数のｍｉＲＮＡおよび使用が提供される。

本発明は、プリｍｉＲＮＡの配列、プレｍｉＲＮＡの配列、ｍｉＲＮＡの配列、ｍｉＲＮＡ^*の配列、アンチｍｉＲＮＡの配列もしくはｍｉＲＮＡ結合部位の配列またはその変異体を含む単離された核酸に関する。この核酸は、表１に言及されるヘアピン配列；表１０の配列識別子６７５７２４８−６８９４８８２の配列；表１７の配列識別子１−６３１８もしくは１８７２８−１８９６０の配列；表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列；表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列；表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列；表４に言及される標的遺伝子結合部位の配列；表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列；その相補体；またはそれらと少なくとも６０％一致する少なくとも１２の連続するヌクレオチドを含む配列を含んでもよい。この単離された核酸は、５−２５０のヌクレオチド長であってもよい。

本発明は、核酸を含むプローブにも関する。このプローブは、前立腺ガンまたは肺ガンで差別的に発現されるものとして表２に言及されるｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも８−２２の連続するヌクレオチドを含んでもよい。

本発明は、複数のプローブにも関する。複数のプローブは、前立腺ガンで差別的に発現されるものとして表２に言及される各々のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのプローブを含んでもよい。複数のプローブはさらに、肺ガンで差別的に発現されるものとして表２に言及される各々のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのプローブを含んでもよい。

本発明は、１つのプローブまたは複数のプローブを含む組成物にも関する。

本発明は固体担体を備えるバイオチップにも関し、当該担体は複数のプローブを含む。プローブの各々は、担体の空間的に定められたアドレスに連結されてもよい。このバイオチップは、前立腺ガンで差別的に発現されるものとして表２に言及されるｍｉＲＮＡに相補的なプローブを含んでもよい。このバイオチップはさらに、肺ガンで差別的に発現されるものとして表２に言及されるｍｉＲＮＡに相補的なプローブを含んでもよい。

本発明は、疾患に関連するｍｉＲＮＡの差別的発現を検出する方法にも関する。生物学的試料を用意し、表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列；表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列；表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列；またはその変異体と少なくとも７０％の同一性を有する核酸のレベルを測定してもよい。コントロールと比較した核酸のレベルの相違は、差別的発現を示唆する。

本発明はさらに、病的な状態を調節する化合物を同定する方法に関する。表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列；表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列；表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列；またはその変異体と少なくとも７０％の同一性を有する核酸を発現できる細胞を提供してもよい。この細胞をモジュレーターの候補物と接触させ、次いで核酸発現のレベルを測定してもよい。コントロールと比較した核酸のレベルの相違によって、核酸に関連する病的な状態のモジュレーターとしての化合物を同定する。

本発明はさらに、細胞中での標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。細胞内に、標的遺伝子の発現を十分に阻害できる量の核酸を導入してもよい。その標的遺伝子は、表４に言及される結合部位と実質的に同一の結合部位；表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列；またはその変異体を含んでもよい。核酸は、配列番号：１−７６０６１６の配列；表１０の配列識別子１−１１７７５０および６７５７２４８−１００６８１７７の配列；表１７に記載の配列；またはその変異体を含んでもよい。標的遺伝子の発現はインビトロでまたはインビボで阻害されてもよい。

本発明はさらに、細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法に関する。細胞内に、標的遺伝子の発現を十分に阻害できる量の核酸を導入してもよい。その標的遺伝子は、表４に言及される結合部位と実質的に同一の結合部位；表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列；またはその変異体を含んでもよい。核酸は、配列番号：１−７６０６１６；表１０の配列識別子１−１１７７５０および６７５７２４８−１００６８１７７の配列；表１７に記載の配列；またはその変異体に実質的に相補的な配列を含んでもよい。標的遺伝子の発現はインビトロまたはインビボで阻害されてもよい。標的遺伝子の発現はインビトロまたはインビボで促進されてもよい。

本発明はさらに、配列番号：１−７６０６１６の配列、表１０に記載の配列、表１７に記載の配列またはその変異体を含む核酸を、必要とする患者に投与することを含む、表６に記載の疾患を伴う患者を治療する方法に関する。

本発明は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列、それに対する前駆体、その標的および関連する配列を提供する。このような核酸は、診断目的にとって、さらには標的遺伝子の発現を改変することにとって有用である。本発明のその他の側面は、本発明の次の記述によって、当業者に明らかになるであろう。

１．定義
今回の化合物、製品および組成物ならびに方法を開示し記載する前に、本明細書で用いられる専門用語が特定の態様を説明する目的のみのものであり、制限を意図するものではないことを理解すべきである。明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそれ以外のことを指示しない限り、複数の対象を包含することに留意すべきである。

ａ．動物
本明細書で用いられる「動物」は、魚類、両生類、爬虫類、鳥類および哺乳類を意味してもよく、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、サルおよびヒトが挙げられる。

ｂ．連結
プローブおよび固体担体に関して本明細書で用いられる「連結された」または「固定化された」とは、プローブと固体担体との間の結合が、結合、洗浄、解析および除去の条件下で十分に安定していることを意味してもよい。この結合は共有的であってもまたは非共有的であってもよい。共有結合はプローブと固体担体との間で直接形成されてもよく、または架橋によってもしくは固体担体もしくはプローブのいずれか上または両方の分子上に特定の反応基の含ませることによって形成されてもよい。非共有結合は、静電気的、親水性および疎水性の相互作用のうち１つ以上であってよい。非共有結合に含まれるものは、ストレプトアビジンなどの分子の担体への共有的な連結、およびビオチン化プローブのストレプトアビジンへの非共有結合である。固定化には、共有的および非共有的相互作用の組み合わせが関与してもよい。

ｃ．生物学的試料
本明細書で用いられる「生物学的試料」とは、核酸を含む生物学的組織または液体の試料を意味してもよい。このような試料としては、動物から単離される組織が挙げられるが、それらに制限されるわけではない。生物学的試料としては、生検材料および検死試料などの組織切片、組織学上の目的のために採取された凍結切片、血液、血漿、血清、唾液、大便、涙液、粘液、毛髪および皮膚も挙げられ得る。生物学的試料はさらに、外植体および患者の組織に由来する一次細胞および／または形質転換細胞の培養物を含む。動物から細胞試料を除去することによって生物学的試料を提供してもよいが、予め単離された（たとえば、別のヒトによって、別の時点でおよび／または別の目的で単離された）細胞を用いて実現してもよく、または本発明の方法をインビボで実施することによって実現してもよい。保管されていた組織、たとえば、治療されたものまたは過去に結果がでたもの、を用いてもよい。

ｄ．相補体
本明細書で用いられる「相補体」または「相補的」とは、ヌクレオチドまたは核酸分子のヌクレオチドアナログ間のワトソン−クリック塩基対またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対を意味してもよい。

ｅ．差別的発現
「差別的発現」とは、細胞および組織の中および間における一時的なおよび／または細胞性の遺伝子発現パターンの定性的または定量的な相違を意味してもよい。したがって、たとえば正常組織対疾患組織において、差別的に発現される遺伝子は定性的に発現が改変され得る（たとえば、活性化または非活性化など）。遺伝子は、その他の状況と比較して特定の状況において作動、または作動が停止し得るため、したがって２つ以上の状態の比較が可能となる。定性的に調節される遺伝子は、ある状況または細胞のタイプの範囲内で、標準的な技術で検出可能な発現パターンを表すことになる。いくつかの遺伝子は１つの状況または細胞のタイプで発現することになるが、両方では発現されない。あるいは、たとえば、発現が調節される場合、結果的に転写物の量が増加する上方調節、または結果的に転写物の量が減少する下方調節のいずれかとなる点で発現の違いは定量的となり得る。発現が異なる程度は、ただ単に、発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン解析およびＲＮａｓｅの保護などの標準的な特徴解析技術による定量が十分にできる程度の量であればよい。

ｆ．遺伝子
本明細書で用いられる「遺伝子」は、転写および／または翻訳調節配列および／またはコード領域および／または非翻訳配列（たとえばイントロン、５’−および３’−非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子であってよい。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能的ＲＮＡ、たとえばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列であってよい。遺伝子はさらに、必要に応じてそれに結合する５’−または３’−非翻訳配列を含むコード領域（たとえばエキソンおよびｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってよい。遺伝子はさらに、コード領域および／またはそれに結合する５’−もしくは３’−非翻訳配列のすべてまたは一部を含む、インビトロで生産され増幅された核酸分子であってよい。

ｇ．宿主細胞
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、ベクターを含みベクターの複製をサポートする天然の細胞または形質転換細胞であってよい。宿主細胞は、培養細胞、外植体、インビボの細胞などであってよい。宿主細胞は、Ｅ． ｃｏｌｉなどの原核細胞または酵母、昆虫、両生類またはＣＨＯ、ＨｅＬａなどの哺乳動物の細胞のような真核細胞であってよい。

ｈ．同一性
本明細書で用いられる２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一な」または「同一性」とは、特定の領域に亘って同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸が特定のパーセンテージを有する配列を意味してもよい。最適に整列された２つの配列を比較し、特定の領域に亘り２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を計測してマッチング位置数を得、マッチング位置数をその特定の領域内の位置の総数で割り、そしてその結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを得ることによって、そのパーセンテージを計算することができる。２つの配列の長さが異なるか、またはアラインメントによってスタガード末端が生じ、比較する特定の領域が１つの配列しか含まない場合、１つの配列の残りは計算において分子には算入されないが分母には算入される。ＤＮＡとＲＮＡとを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）を等価とみなす。同一性については、手動で行ってもよく、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いてもよい。

ｉ．標識
本明細書で用いられる「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、化学的に、あるいはその他の物理的手段によって検出可能な組成物を意味してもよい。たとえば、有用な標識としては、³²Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえばＥＬＩＳＡに広く使われるもの等）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよびその他の検出可能となり得る構成要素が挙げられる。標識を、核酸およびタンパク質内の任意の位置に組み込んでもよい。

ｊ．核酸
本明細書で用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、相互に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味してもよい。当業者であれば理解できるように、一本鎖を記述することは、その相補鎖の配列も規定する。したがって、核酸は、記述された一本鎖の相補鎖も包含する。さらに当業者であれば理解できるように、１つの核酸の多数の変異体を、所定の核酸と同じ目的に用いてもよい。したがって、核酸は実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。さらに当業者であれば理解できるように、一本鎖によって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブのためのプローブが与えられる。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

核酸は一本鎖もしくは二本鎖であってよく、または二本鎖および一本鎖の配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸はＤＮＡ（ゲノミックとｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡまたはハイブリッドであってよく、ここで、核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせを含んでもよく、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン・ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含んでもよい。化学合成法によって、または組み換え法によって、核酸を得ることができる。

一般的に核酸はホスホジエステル結合を含むものであるが、たとえばホスホロアミダート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホロジチオアート結合またはＯ−メチルホスホロアミダイト結合や、ペプチド核酸のバックボーンおよび結合など少なくとも１つの異なる結合を有しうる核酸アナログが含まれていてもよい。その他の核酸アナログとしては、陽性のバックボーン；非イオン性のバックボーン、非リボースバックボーンを伴うものが挙げられ、米国特許番号第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号（これらは引用として組み込まれる）に記載のものが挙げられる。１つ以上の非天然または改変されたヌクレオチドを含む核酸も、核酸の定義の１つに包含される。改変されたヌクレオチドアナログは、たとえば核酸分子の５’−末端および／または３’−末端に位置させればよい。ヌクレオチドアナログの代表的な例としては、糖またはバックボーンが改変されたリボヌクレオチドから選択することができる。しかしながら、核酸塩基が改変されたリボヌクレオチド、すなわち天然の核酸塩基の代わりに人工の核酸塩基を含むリボヌクレオチド、たとえば５位が改変されたウリジンまたはシチジン（例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン）；８位が改変されたアデノシンおよびグアノシン（例えば８−ブロモグアノシン）；デアザヌクレオチド（例えば７−デアザ−アデノシン）；Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド（例えばＮ６−メチルアデノシン）も適切であることに留意すべきである。２’−ＯＨ基を、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ₂、ＮＨＲ、ＮＲ₂またはＣＮから選択される基で置き換えてもよく、ここで、ＲはＣ₁−Ｃ₆のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。種々の理由、たとえばそのような分子の生理的環境における安定性および半減期あるいはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を高めることを目的として、リボース−リン酸のバックボーンを改変してもよい。天然の核酸およびアナログの混合物を作製してもよく；あるいは異なる核酸アナログの混合物、および天然の核酸とアナログとの混合物を作製してもよい。

ｋ．作動可能な結合
本明細書で用いられる「作動可能な結合」とは、遺伝子発現が、空間的に連結したプロモーターの制御下にあることを意味してもよい。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置してもよい。プロモーターと遺伝子との間の間隔は、プロモーターが由来する遺伝子において、プロモーターとそれが制御する遺伝子の間の間隔とほぼ同じであってよい。本技術分野において知られているように、プロモーターの機能を喪失すること無く、この間隔を変動させることができる。

ｌ．プローブ
本明細書で用いられる「プローブ」は、１つ以上のタイプの化学結合を介して、通常は相補的塩基対の形成（通常は水素結合の形成を介する）を介して、相補的配列の標的核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを意味してもよい。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠いた状態でプローブが標的配列と結合してもよい。標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨げることになる塩基対のミスマッチは、任意の数存在してもよい。しかしながら、突然変異の数が極めて多く、そのために最もストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件下であってさえ、ハイブリダイゼーションが生じ得ない場合、その配列は相補的な標的配列ではない。プローブは一本鎖でもよく、または部分的に一本鎖であって部分的に二本鎖のものでもよい。標的配列の構造、組成および特性によって、プローブのストランデッドネス（鎖の数）が決定される。それとストレプトアビジン複合体が後にそれと結合し得るビオチンなどで、プローブを直接標識してもよく、または間接的に標識してもよい。

ｍ．プロモーター
本明細書で用いられる「プロモーター」は、細胞内での核酸発現能を付与したり、活性化させたりまたは促進させる能力を有する合成分子または天然由来の分子を意味してもよい。プロモーターは、発現をさらに促進させるおよび／または発現の空間的位置および／または時期を改変させるための１つ以上の特異的な調節要素を含んでもよい。プロモーターはさらに、遠位のエンハンサー要素またはリプレッサー要素を含んでもよく、これらは転写開始部位から数千塩基対も離れた位置に置くことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、菌類、植物、昆虫および動物を含む起源に由来するものでよい。プロモーターは、そこで発現が生じる細胞、組織もしくは器官に関して、発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオンもしくは誘発剤などの外部刺激に対する応答として、遺伝子成分の構成的な発現または差別的な発現を調節してもよい。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

ｎ．選択マーカー
本明細書で用いられる「選択マーカー」は、細胞に表現型を与える任意の遺伝子を意味し、その細胞の中でその遺伝子が発現して、遺伝的構築物によって形質移入または形質転換された細胞の同定および／または選択を促進する。選択マーカーの代表的な例としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^r）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ^r）、細菌のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎ^r）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生物質のオーレオバシジンＡに対する抵抗性を付与するＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。

ｏ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で第１の核酸配列（たとえばプローブ）が、たとえば核酸の複雑な混合物内で第２の核酸配列（たとえば標的）とハイブリダイズすることになり、その他の配列とはしない条件を意味してもよい。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況においては異なるものとなるであろう。一般的に、ストリンジェントな条件としては、規定されたイオン強度・ｐＨにおいて、特定の配列についての融点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低い温度が選択される。Ｔｍは、平衡において（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸の濃度の下）標的に相補的なプローブの５０％が標的配列とハイブリダイズする温度であってもよい（標的配列は過剰に存在するため、Ｔｍでは平衡においてプローブの５０％が結合する）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には、約０．０１−１．０Ｍのナトリウムイオン（またはその他の塩）の濃度で、ｐＨが７．０〜８．３であって、温度が短いプローブ（たとえば約１０−５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、長いプローブ（たとえば約５０を超えるヌクレオチド）については少なくとも約６０℃というものでもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの非安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性のシグナルはハイブリダイゼーションのバックグラウンドの少なくとも２〜１０倍であってよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの典型的な条件としては、次のものが挙げられる：５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣおよび１％のＳＤＳで４２℃にてインキュベートするか、または５ｘＳＳＣ、１％のＳＤＳで６５℃でインキュベートし、６５℃の０．２ｘＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳでの洗浄を伴う。

ｐ．実質的に相補的
本明細書で用いられる「実質的に相補的」とは、第１の配列が、第２の配列の相補体と、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるヌクレオチドの領域に亘って少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味してもよい。

ｑ．実質的に同一
本明細書で用いられる「実質的に同一」とは、第１の配列および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域に亘って少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、または核酸に関しては、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味してもよい。

ｒ．標的
本明細書で用いられる「標的」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下で、１つ以上のプローブと結合し得るポリヌクレオチドを意味してもよい。

ｓ．ターミネーター
本明細書で用いられる「ターミネーター」とは、転写終了のシグナルを出す転写単位の末端の配列を意味してもよい。ターミネーターは、ポリアデニル化シグナルを含む３’−非翻訳ＤＮＡ配列でよく、これは一次転写物の３’末端へのポリアデニル化配列の付加を促進してもよい。ターミネーターは、ウイルス、細菌、菌類、植物、昆虫および動物を含む起源に由来するものでもよい。ターミネーターの代表的な例としては、たとえば、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化シグナル、ＣＹＣ１ターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＳＰＡターミネーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ遺伝子のターミネーター、Ｚｅａ ｍａｙｓ由来のゼイン遺伝子のターミネーター、Ｒｕｂｉｓｃｏの小サブユニット遺伝子（ＳＳＵ）の遺伝子ターミネーター配列、サブクローバースタントウイルス（ＳＣＳＶ）の遺伝子配列ターミネーター、ｒｈｏ非依存性Ｅ． ｃｏｌｉターミネーター、およびｌａｃＺアルファターミネーターが挙げられる。

ｔ．ベクター
本明細書で用いられる「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味してもよい。ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、細菌の人工染色体または酵母の人工染色体でもよい。ベクターはＤＮＡベクターでもよく、またはＲＮＡベクターでもよい。ベクターは、自己複製能を有する染色体外のベクターまたは宿主ゲノム内に組み込まれるベクターのいずれかでもよい。

２．マイクロＲＮＡ
理論に拘束されないが、哺乳動物のｍｉＲＮＡの成熟についての現在のモデルは図１に示されるとおりである。ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子が転写され、プリｍｉＲＮＡとして知られているｍｉＲＮＡ前駆体の生成を導く。このプリｍｉＲＮＡは、多数のプリｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの一部分でもよい。このプリｍｉＲＮＡは、ステムとループとを伴うヘアピンを形成してもよい。図１に示されるように、ステムはミスマッチ塩基を含んでもよい。

プリｍｉＲＮＡのヘアピン構造はＲＮａｓｅＩＩＩ・エンドヌクレアーゼであるドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）で認識されてもよい。ドローシャはプリｍｉＲＮＡにおける末端ループを認識し、およそ２つのヘリカルターンをステムに切断し、プレｍｉＲＮＡとして知られる６０−７０ｎｔの前駆体を生成することになる。ドローシャはＲＮａｓｅＩＩＩ・エンドヌクレアーゼに典型的なスタガードカットでプリｍｉＲＮＡを切断し得、５’リン酸と約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを伴うプレｍｉＲＮＡのステムループを生じさせる。ドローシャの切断部位を超えて広がる、ステムのおよそ１つのヘリカルターン（約１０ヌクレオチド）は、効果的なプロセシングにとって不可欠でありえる。次いで、Ｒａｎ−ＧＴＰと核外輸送レセプターのエクスポーチン−５によって、プレｍｉＲＮＡは核から細胞質に能動輸送されうる。

プレｍｉＲＮＡはやはりＲＮａｓｅＩＩＩ・エンドヌクレアーゼであるダイサーで認識されてもよい。ダイサーはプレｍｉＲＮＡの二本鎖のステムを認識しうる。ダイサーはさらに、ステムのループの根元における５’リン酸と３’オーバーハングとを認識しうる。ダイサーは、ステムのループの根元から末端ループの２つのヘリカルターンを切り落とし、新たな５’リン酸と約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを遊離させることになる。得られるｓｉＲＮＡ様二重鎖（これにはミスマッチがあってもよい）は、成熟ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ^*として知られる同様のサイズの断片を含む。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*は、プリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡの向かい合うアームに由来するものでもよい。ｍｉＲＮＡ^*の配列はクローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリーに見出される場合があるが、通常はｍｉＲＮＡよりも低い頻度である。

最初はｍｉＲＮＡ^*と共に二本鎖の種として現れるが、最終的には、ｍｉＲＮＡは一本鎖ＲＮＡとして、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体内に組み込まれてもよい。種々のタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、その結果ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^*二重鎖についての特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制または活性化）、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^*二重鎖のどちらの鎖がＲＩＳＣ内に取り込まれるか、という点での多様性がもたらされる。

ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^*二重鎖のｍｉＲＮＡの鎖がＲＩＳＣ内に取りこまれる時、ｍｉＲＮＡ^*は取り除かれ、分解されることになる。ＲＩＳＣ内に取りこまれるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^*二本鎖の鎖は、その５’末端の対形成がより緩い鎖であってもよい。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^*の両末端における５’対形成がほぼ等しい場合、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*の両者は遺伝子サイレンシング活性を有する場合がある。

ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相補性が高いレベルであることに基づいて、特にｍｉＲＮＡの２−８のヌクレオチドによって、ＲＩＳＣは標的核酸を同定する場合がある。ｍｉＲＮＡとその標的との間の相互作用がｍｉＲＮＡの全長にわたっているケースは、動物については一つのケースが報告されたのみである。このことは、ｍｉｒ−１９６およびＨｏｘ Ｂ８について示されており、さらにｍｉｒ−１９６がＨｏｘ Ｂ８ ｍＲＮＡの切断を媒介することが示された（Ｙｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４）。それ以外では、このような相互作用は植物においてのみ知られている（Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ ２００３， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３２−７０９）。

翻訳の効果的な阻害を実現するために、多数の研究によってｍｉＲＮＡおよびそのｍＲＮＡ標的の間の塩基対形成に必要な条件が考察されてきた（ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｂａｒｔｅｌ ２００４， Ｃｅｌｌ １１６−２８１）。哺乳動物の細胞においては、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要となりうる（Ｄｏｅｎｃｈ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ ２００４ ＧｅｎｅｓＤｅｖ ２００４−５０４）。しかしながら、マイクロＲＮＡのその他の部分もまた、ｍＲＮＡの結合に参加しうる。さらに、３’における十分な塩基対形成によって、５’における不十分な対形成を補うことができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ ａｔ ａｌ， ２００５ ＰＬｏＳ ３−ｅ８５）。ゲノム全体に関するｍｉＲＮＡの結合を解析するコンピュータを用いた研究から、ｍｉＲＮＡの５’における塩基２−７についての、標的との結合における特異的な役割が示唆されたが、最初のヌクレオチド（通常は「Ａ」）の役割も認識された（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｔ ２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、Ｋｒｅｋら（２００５， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）は、ヌクレオチド１−７または２−８を用いて標的の同定および検証を行った。

ｍＲＮＡにおける標的部位は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはコード領域に存在しうる。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが同一の部位または複数の部位を認識することによって、同一の標的ｍＲＮＡを調節しうる。多数のｍｉＲＮＡ相補性部位が、遺伝学的に同定されたほとんどの標的内に存在することは、複数のＲＩＳＣの協同的な作用が最も効率的に翻訳を阻害することを示唆しうる。

ｍｉＲＮＡは、２つのメカニズム：ｍＲＮＡの切断または翻訳の抑制のいずれかによって、ＲＩＳＣが遺伝子発現を下方調節するように導くと考えられる。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する相補性をある程度有する場合、ｍｉＲＮＡはｍＲＮＡの切断を指定しうる。ｍｉＲＮＡが切断を導く場合、その切断はｍｉＲＮＡの残基１０と１１と対を形成するヌクレオチド間で生じうる。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する相補性を必要な程度有していない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制しうる。翻訳の抑制は、動物においてより一般的である。というのは、動物の有する相補性はより低いものでありえるからである。

ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ^*との任意の対において、５’−末端および３’−末端で可変性が存在しうることに留意すべきである。この可変性は、切断部位に関しての、ドローシャおよびダイサーの酵素的なプロセシングにおける可変性によるものでありうる。ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*の５’−末端および３’−末端における可変性も、プリｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡのステムの構造におけるミスマッチによるものでもありうる。ステムの鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団を導きうる。ステムの構造における可変性も、ドローシャおよびダイサーによる切断の生成物における可変性を導きうる。

３．核酸
本発明は、配列番号：１−７６０６１６において言及されるヌクレオチド配列、表１０に記載された配列および表１７に記載された配列またはその変異体を含む単離された核酸に関する。この変異体は、引用されたヌクレオチド配列の相補体でもよい。この変異体はさらに、引用されたヌクレオチド配列またはその相補体と実質的に同一なヌクレオチド配列でもよい。この変異体はさらに、引用されたヌクレオチド配列、その相補体またはそれと実質的に同一なヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列でもよい。

核酸は、１０〜１００ヌクレオチドの長さを有してもよい。核酸は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０または９０ヌクレオチドの長さを有してもよい。核酸は、合成品でもよく、または下記の合成遺伝子を用いて、細胞（インビトロまたはインビボ）で発現させたものでもよい。核酸は一本鎖分子として合成し、そして実質的に相補的な核酸とハイブリダイズさせて二重鎖を形成させてもよい。このものも本発明の核酸とみなされる。核酸は一本鎖の形状または二本鎖の形状で、細胞、組織または器官に導入してもよく、米国特許第６，５０６，５５９号（これは引用として組み込まれる）に記載されたもの等を含む当業者に周知の方法を用いて合成遺伝子により発現可能であっても良い。

ａ．プリｍｉＲＮＡ
本発明の核酸は、プリｍｉＲＮＡまたはその変異体の配列を含んでもよい。プリｍｉＲＮＡの配列は、４５−２５０、５５−２００、７０−１５０または８０−１００のヌクレオチドを含んでもよい。プリｍｉＲＮＡの配列は、下記のプレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*を含んでもよい。プリｍｉＲＮＡはさらに、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ^*およびその相補体ならびにその変異体を含んでもよい。プリｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチドおよび少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含んでもよい。

プリｍｉＲＮＡはヘアピン構造を形成してもよい。ヘアピンは、実質的に相補的な第１の核酸配列および第２の核酸配列を含んでもよい。第１の核酸配列および第２の核酸配列は３７−５０のヌクレオチドであってもよい。第１の核酸配列および第２の核酸配列は、８−１２のヌクレオチドの第３の配列によって分けられていてもよい。ヘアピン構造は、Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ． Ｃｈｅｍｉｅ １２５： １６７−１８８ （１９９４）（その内容は本明細書に組み込まれる）に記載されるようにＶｉｅｎｎａアルゴリズムを初期設定のパラメータで計算したとき−２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ未満の自由エネルギーを有していてもよい。ヘアピンは、４−２０、８−１２または１０ヌクレオチドの末端ループを含んでもよい。

プリｍｉＲＮＡの配列は、表１において言及されるヘアピン配列、表１０の配列識別子６７５７２４８−６８９４８８２の配列、表１７の配列識別子１−６３１８もしくは１８７２８−１８９６０の配列またはその変異体を含んでもよい。

ｂ．プレｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はさらに、プレｍｉＲＮＡまたはその変異体の配列を含んでもよい。プレｍｉＲＮＡの配列は、４５−９０、６０−８０または６０−７０のヌクレオチドを含んでもよい。プレｍｉＲＮＡの配列は、下記のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*を含んでもよい。プレｍｉＲＮＡはさらに、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ^*およびその相補体ならびにその変異体を含んでもよい。プレｍｉＲＮＡの配列はさらに、プリｍｉＲＮＡの５’−末端および３’−末端から０−１６０のヌクレオチドを除いたプリｍｉＲＮＡの配列であってもよい。

プレｍｉＲＮＡの配列は、表１において言及されるヘアピン配列、表１０の配列識別子６７５７２４８−６８９４８８２の配列、表１７の配列識別子１−６３１８もしくは１８７２８−１８９６０の配列またはその変異体を含んでもよい。

ｃ．ｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はさらに、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ^*またはその変異体の配列を含んでもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、１３−３３、１８−２４または２１−２３のヌクレオチドを含んでもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの最初の１３−３３ヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの最後の１３−３３ヌクレオチドであってもよい。

ｍｉＲＮＡの配列は、表１において言及されるｍｉＲＮＡの配列、表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列、表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列またはその変異体を含んでもよい。

ｄ．アンチｍｉＲＮＡ
本発明の核酸はさらに、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ^*の活性を阻害可能なアンチｍｉＲＮＡの配列を含んでもよい。アンチｍｉＲＮＡは、全体で５−１００または１０−６０ヌクレオチドを含んでもよい。また、アンチｍｉＲＮＡは全体で少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含んでもよい。アンチｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡの５’と実質的に同一である少なくとも５ヌクレオチド、および当該ｍｉＲＮＡの５’−末端からの標的部位のフランキング領域と実質的に相補的である少なくとも５−１２ヌクレオチド、あるいは（ｂ）ｍｉＲＮＡの３’と実質的に同一な少なくとも５−１２ヌクレオチド、および当該ｍｉＲＮＡの３’−末端からの標的部位のフランキング領域と実質的に相補的な少なくとも５ヌクレオチドを含んでもよい。

アンチｍｉＲＮＡの配列は、表１において言及されるｍｉＲＮＡの配列、表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列、表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列またはその変異体の相補体を含んでもよい。

ｅ．標的の結合部位
本発明の核酸は、標的ｍｉＲＮＡ結合部位の配列またはその変異体を含んでもよい。標的部位の配列は、全体で５−１００または１０−６０のヌクレオチドを含んでもよい。標的部位の配列は、表４において言及される標的遺伝子結合部位の配列、表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列、またはその変異体、の少なくとも５ヌクレオチドを含んでもよい。

４．合成遺伝子
本発明はさらに、転写および／または翻訳の調節配列に作動可能に結合した本発明の核酸を含む合成遺伝子に関する。この合成遺伝子は、本発明の核酸への結合部位を伴う標的遺伝子の発現を改変可能であってもよい。標的遺伝子の発現は、細胞、組織または器官の中で変更されても良い。合成遺伝子は合成されたものでもよく、または標準的な組み換え技術によって、天然の遺伝子から誘導されたものでもよい。合成遺伝子はさらに、合成遺伝子の配列の転写単位の３’−末端において、ターミネーターを含んでもよい。合成遺伝子はさらに、選択マーカーを含んでもよい。

５．ベクター
本発明はさらに、本発明の合成遺伝子を含むベクターに関する。ベクターとしては発現ベクターでよい。発現ベクターは追加的要素を含んでもよい。たとえば、発現ベクターは、２つの生物体内で、たとえば発現のための哺乳動物の細胞または昆虫細胞において、そしてクローニングおよび増幅のための原核生物の宿主において、ベクターを維持させることができる２つの複製系を有してもよい。発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムと相同な少なくとも１つの配列、好ましくは発現構築物に隣接する２つの相同な配列を含んでもよい。ベクターの組み込みは、ベクター内に含ませる適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞内の特定の座に向けてもよい。ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能とする選択マーカー遺伝子を含んでもよい。

６．宿主細胞
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。この細胞は、細菌、菌類、植物、昆虫または動物細胞であってよい。

７．プローブ
本発明はさらに、本発明の核酸を含むプローブに関する。下記に概要を示すように、スクリーニング方法および診断方法のためにプローブを用いてもよい。プローブは固体担体、たとえばバイオチップに連結してもよく、または固定化してもよい。

プローブは、８〜５００、１０〜１００または２０〜６０のヌクレオチド長を持つものでよい。プローブはさらに、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０または３００のヌクレオチド長を持つものでよい。プローブは、１０−６０ヌクレオチドのリンカー配列をさらに含んでもよい。

８．バイオチップ
本発明はさらにバイオチップに関する。バイオチップは、単数または複数の本発明のプローブが連結された固体担体を含んでもよい。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズ可能でもよい。このプローブは、担体上の空間的に定められたアドレスに連結されてもよい。標的配列あたり１を超えるプローブを用いてもよく、重複するプローブまたは特定の標的配列の異なる区域に対するプローブのいずれかでもよい。プローブは、単独の疾患に関連する標的配列とハイブリダイズ可能でもよい。

当業者が理解できるように、多種多様の方法によって、バイオチップにプローブを連結してもよい。プローブは、最初に合成して次いでバイオチップに連結してもよく、またはバイオチップ上で直接合成してもよい。

固体担体は、プローブの連結または結合に適する個別の独立した部位を含むように改変された材料であって、そして少なくとも１つの検出方法によく反応する材料であってよい。担体の代表的な例としては、たとえば、ガラスおよび修飾されたかまたは機能が付与されたガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンとその他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴｅｆｌｏｎＪなどを含む）、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、シリカまたはケイ素および改変されたケイ素、炭素、金属、無機ガラスおよびプラスチックを含むシリカベースの材料が挙げられる。担体としては、感知できる程度の蛍光を伴わずに光学的な検出が可能なものでもよい。

担体は平面でよいが、その他の構造の担体も同様に用いてもよい。たとえば、試料の体積を最小限に抑える目的で、貫流する試料用に、チューブの内壁面にプローブを設置してもよい。同様に、担体は柔軟なものでもよく、たとえば柔軟な発泡体、特定のプラスチックから作られるクローズドセル発泡体が含まれる。

バイオチップおよびプローブを、それらを後で連結するための官能基で誘導体化してもよい。たとえば、これらに制限されるわけではないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基を含む官能基で、バイオチップを誘導体化してもよい。これらの官能基を用いることで、直接的にまたは間接的にリンカーを利用して、プローブ上の官能基を用いてプローブを連結してもよい。５’−末端、３’−末端または内部ヌクレオチドを介することのいずれかによって、プローブを固体担体に連結してもよい。

さらに、固体担体に非共有的にプローブを連結してもよい。たとえば、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作製することができ、これはストレプトアビジンで共有的にコートされた表面に結合してもよく、結果的に連結が達成される。あるいは、光重合およびフォトリソグラフィーなどの技術を用いて、表面上でプローブを合成してもよい。

９．ｍｉＲＮＡの発現の分析
本発明はさらに、生物学的試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させること、およびハイブリダイゼーションの量を検出することを含む、疾患すなわち病的な状態に関連するｍｉＲＮＡを同定する方法に関する。ＰＣＲを用いて試料中の核酸を増幅してもよく、これにより高い感度が得られる。

病的な細胞内でコントロールと比べて過剰に発現されるかまたは過少に発現されるｍｉＲＮＡを同定する能力により、診断、治療、薬剤の開発、薬理遺伝学、バイオセンサーの開発分野およびその他の関連の分野において用いられ得る高解像度で高感度なデータセットを提供することができる。現在の方法によって作られる発現プロフィールは、多数のｍｉＲＮＡに関する試料の状態の「フィンガープリント」であってよい。２つの状態は同様に発現される任意の特定ｍｉＲＮＡを有し得るが、多数のｍｉＲＮＡを同時に評価することによって、その細胞の状態に特徴的な遺伝子発現プロフィールの作製が可能となる。すなわち、正常な組織を疾患組織と区別することができる。既知の種々の病状における組織の発現プロフィールを比較することによって、いずれのｍｉＲＮＡがこれらの状態の各々と関連しているかについての情報を得ることができる。次いで、組織試料が正常組織の発現プロフィールを示すかあるいは疾患組織の発現プロフィールを示すか決定するために、診断を実施または確認してもよい。これにより、関連する状態の分子診断が提供され得る。

１０．発現レベルの測定
本発明はさらに、生物学的試料を本発明のプローブまたはバイオチップと接触させること、およびハイブリダイゼーションの量を測定することを含む、疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現レベルを決定する方法に関する。疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現レベルは、多数の方法における情報である。たとえば、コントロールと比較したときの疾患に関連するｍｉＲＮＡの差別的発現を、患者がその疾患を患っていることの診断として利用してもよい。疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現レベルを利用して、患者の治療と病状を監視してもよい。さらに、疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現レベルによって、特定の発現プロフィールを変化させるか、または疾患に関連する発現プロフィールを抑制するための薬剤の候補物をスクリーニングすることが可能になりうる。

標的核酸を含む試料を、標的核酸に十分に相補的な、連結されたプローブを含むバイオチップと接触させること、およびコントロールのレベルを超えたプローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより、標的核酸を検出してもよい。

調査する核酸をナイロンメンブレンなどの固体担体上に固定化すること、および標識化プローブを試料とハイブリダイズさせることにより、標的核酸を検出してもよい。同様に、標識化プローブを固体担体に固定化すること、および標識化された標的核酸を含む試料をハイブリダイズさせることによって、標的の核酸を検出してもよい。非特異的なハイブリダイゼーションを排除するために洗浄した後、標識を検出してもよい。

透過化処理を行った細胞または組織の試料を標識化プローブと接触させることにより、標的核酸とハイブリダイゼーションさせ、ｉｎ ｓｉｔｕで標的核酸を検出してもよい。非特異的に結合したプローブを排除するために洗浄した後、標識を検出してもよい。

これらのアッセイは直接的なハイブリダイゼーションアッセイとなり得、または米国特許番号第５，６８１，７０２号；第５，５９７，９０９号；第５，５４５，７３０号；第５，５９４，１１７号；第５，５９１，５８４号；第５，５７１，６７０号；第５，５８０，７３１号；第５，５７１，６７０号；第５，５９１，５８４号；第５，６２４，８０２号；第５，６３５，３５２号；第５，５９４，１１８号；第５，３５９，１００号；第５，１２４，２４６号；および第５，６８１，６９７号（これらは各々引用として組み込まれる）に概説されるように、多数のプローブの使用を伴うサンドイッチアッセイを含んでも良い。

上記で概要するように、高度、中程度のおよび低度のストリンジェンシー条件を含めた種々のハイブリダイゼーション条件を用いてもよい。プローブが標的のみとハイブリダイゼーションできるようなストリンジェンシーの条件下で、これらのアッセイを実施してもよい。これらに制限されるわけではないが、温度、ホルムアミドの濃度、塩濃度、カオトロピック性の塩の濃度、ｐＨまたは有機溶媒の濃度を含めた熱力学変数である工程のパラメータを変化させることによって、ストリンジェンシーをコントロールすることができる。

種々の方法によって、ハイブリダイゼーション反応を達成してもよい。反応の構成要素を同時に添加してもよく、または異なる順序で連続的に添加してもよい。さらに、この反応にはその他の種々の試薬が含まれ得る。これらには、塩、緩衝剤、アルブミンなどの中性タンパク質、界面活性剤などが挙げられ、これらを用いて最適なハイブリダイゼーションおよび検出を促進したりおよび／または非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を減少させてもよい。試料の調製方法および標的の純度に合わせて、別の方法でアッセイの効率を改善する試薬、たとえばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビターおよび抗菌剤などを適宜用いてもよい。

ａ．診断
本発明はさらに、生物学的試料中での疾患に関連するｍｉＲＮＡの差別的発現のレベルを検出することを含む診断の方法に関する。その試料は患者に由来するものでもよい。患者の病状の診断によって、予後診断および治療計画の選択が可能になる。さらに、細胞の発達段階を、一時的に発現したｍｉＲＮＡ分子を測定することによって分類してもよい。

標識化プローブの組織アレイへのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施してもよい。個体と標準との間のフィンガープリントを比較することで、当業者であればその知見に基づいて診断、予後診断または予測を行うことができる。診断を示唆する遺伝子は、予後診断を示唆する遺伝子とは相違していてもよいこと、および細胞の状態についての分子プロファイルによって反応性状態もしくは難治性の状態との間で区別がなされ、またそれにより結果を予想できることがさらに理解される。

ｂ．薬剤のスクリーニング
本発明はさらに、疾患に関連するｍｉＲＮＡを発現し得る病的な細胞と、治療薬の候補とを接触させること、および薬剤の候補物が疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現プロフィールに与える影響を評価することを含む、治療薬のスクリーニング方法に関する。差別的に発現されたｍｉＲＮＡが同定されることで、種々のアッセイを実行することができる。疾患に関連するｍｉＲＮＡの遺伝子発現を調節する能力について、試験化合物をスクリーニングしてもよい。調節には、遺伝子発現を増加させることおよび減少させることの両方が含まれる。

試験化合物あるいは薬剤候補物は、疾患の表現型または疾患に関連するｍｉＲＮＡの発現を直接的にまたは間接的に変化させる能力についてテストを行う任意の分子、たとえばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖、ポリヌクレオチドなどであってよい。薬剤の候補物には、無数の化学薬品の部類、たとえば１００ダルトンを超え、約５００、１，０００、１，５００、２，０００または２，５００ダルトン未満の分子量を持つ小有機分子が包含される。候補化合物はタンパク質との構造上の相互作用、特に水素結合の形成、に必須の官能基を含んでもよく、典型的には少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの前記官能化学基を含む。候補薬剤は、上記の官能基の１つ以上で置換された、炭素の環状構造または複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含んでもよい。候補薬剤はさらに、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログまたはその組み合わせを含む生体分子の間に見出される。

疾患に関連するｍｉＲＮＡに対する結合能力またはその活性の調節能力について、潜在的なモジュレーターのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングしてもよい。コンビナトリアルライブラリーは、試薬などの多数の化学的構成物を組み合わせることによる化学合成または生合成のいずれかによって作られた様々な化合物の集合体であってもよい。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製法およびスクリーニング法は、当業者にとって周知である。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーとしては、ペプチドをコードするペプチドライブラリー、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー、ビニル性のポリペプチド、小化合物ライブラリーのアナログ有機合成、オリゴカルバミン酸塩および／またはペプチジルホスホン酸塩、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー、抗体ライブラリー、炭水化物ライブラリー、および小有機分子ライブラリーが挙げられるが、これらに制限されるものではない。

１１．遺伝子サイレンシング
本発明はさらに、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を減少させる方法に関する。標的ｍＲＮＡの１つ以上の結合部位と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにり、標的遺伝子の発現を減少させてもよい。核酸はｍｉＲＮＡでもよく、またはその変異体でもよい。核酸はさらに、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡまたはその変異体でもよく、これらはプロセシングを受けてｍｉＲＮＡを生じさせうる。発現したｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ上にある実質的に相補的な結合部位とハイブリダイズしてもよい。これにより、ＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングの活性化が導かれうる。ｍｉＲＮＡの過剰発現を利用した研究についての一例はＹｅｋｔａ ｅｔ ａｌ ２００４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４−５９４であり、これは引用として本明細書に組み込まれる。当業者であれば、本発明の核酸を用い、本技術分野において周知のアンチセンス法、ならびに米国特許第６，５０６，５５９号および第６，５７３，０９９号（これらは引用によって取り込まれる）に記載のＲＮＡｉ法を利用して標的遺伝子の発現を阻害してもよいことを認識するだろう。

遺伝子サイレンシングの標的は、第２のタンパク質のサイレンシングを引き起こすタンパク質であってもよい。標的遺伝子の発現を抑制することにより、第２のタンパク質の発現が促進されるだろう。ｍｉＲＮＡ発現を効果的に抑制する例は、Ｅｓａｕ ｅｔ ａｌ ２００４ ＪＢＣ ２７５−５２３６１； ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３−１２９０による研究であり、これらは引用として本明細書に組み込まれる。

１２．遺伝子の増強
本発明はさらに、本発明の核酸を用いて細胞、組織または器官内の標的遺伝子の発現を増加させる方法に関する。プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその変異体と実質的に相補的な配列を含む本発明の核酸を発現させることにより、標的遺伝子の発現を増加させてもよい。核酸はアンチｍｉＲＮＡでもよい。アンチｍｉＲＮＡはプリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとハイブリダイズしてもよく、それによりその遺伝子の抑制活性を減少させる。標的遺伝子の発現も、標的遺伝子内の結合部位の一部分に実質的に相補的な本発明の核酸を発現させることにより増加させてもよく、それによる核酸の結合部位への結合がｍｉＲＮＡの結合を妨害することになるだろう。

１３．治療
本発明はさらに、本発明の核酸を、ガンなどの疾患または機能障害の進行に関連する障害のモジュレーターまたは標的として用いる方法に関する。一般的に、請求の範囲の核酸分子を、当該核酸に少なくとも部分的に相補的な遺伝子の発現モジュレーターとして用いてもよい。さらに、ｍｉＲＮＡ分子は、治療のためのスクリーニング手段の標的として機能してもよい。たとえばｍｉＲＮＡ分子の阻害または活性化は、細胞の分化プロセス、たとえばアポトーシスを調節しうる。

さらに、既存のｍｉＲＮＡ分子を、その標的特異性を改変するために、配列が改変されたｍｉＲＮＡ分子を製造するための出発物質として用いてもよい。たとえば、腫瘍遺伝子、多剤耐性遺伝子またはその他の治療目的の標的遺伝子がある。さらに、プロセシングを受け、次いで二本鎖のｓｉＲＮＡとして生じさせ、治療上関連する標的に対して指向付けられるようにするために、ｍｉＲＮＡ分子を改変することができる。さらに、組織を再度作り変える手段のためにｍｉＲＮＡ分子を用いてもよく、たとえば、分化した細胞系は、ｍｉＲＮＡ分子の発現によって異なる細胞タイプまたは幹細胞に形質転換する場合がある。

１４．組成物
本発明はさらに、本発明の核酸を含み、薬理学的に許容され得る担体を必要に応じて含む薬理学組成物に関する。この組成物を診断または治療の用途に用いてもよい。既知の方法によって薬理学組成物を投与すればよく、たとえば核酸を所望の標的細胞にインビトロまたはインビボで導入する。一般的に用いられる遺伝子導入技術としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス法およびカチオン性リポソームが挙げられる。
１５．キット
本発明はさらに、次のもののいずれかまたはすべてのものと一緒に、本発明の核酸を含むキットに関する：アッセイ用試薬、緩衝剤、プローブおよび／またはプライマー、および滅菌食塩水またはその他の薬理学的に許容され得るエマルション基剤およびサスペンション基剤。さらに、このキットは、本発明の方法を実施するための指示書を含む指導用資料（たとえばプロトコール）を含んでもよい。

ｍｉＲＮＡの予測
ｍｉＲＮＡを予測するために、米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号（これらの内容は引用として本明細書に組み込まれる）に記載のものと類似のコンピュータを利用した２つのアプローチを用いて、潜在的なｍｉＲＮＡコード遺伝子についてヒトの全ゲノムを調査した。簡潔に述べると、ヘアピン構造について、ヒトの全ゲノムの非タンパク質コード領域を走査した。予測したヘアピンおよび可能性があるｍｉＲＮＡを、熱力学的安定性、ならびに構造上の特徴および文脈上の特徴によってスコア付けした。既に確認されているＳａｎｇｅｒデータベース内のｍｉＲＮＡを用いることによって、このアルゴリズムを較正した。

１．第１のスクリーニング
表１１Ａ〜表１１Ｃでは、予測したｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）と共に、コンピュータを利用した第１のスクリーニングから予測したヘアピンの各々についての配列（「ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）、配列識別子（「ＰＲＥＣＵＲ ＳＥＱ−ＩＤ」）および起源の生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）を示す。表１２では、起源の生物（「ＧＡＭ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）およびＤｉｃｅｒ切断位置部位（「ＧＡＭ ＰＯＳ」）と共に、各々のｍｉＲＮＡ（「ＧＡＭ ＮＡＭＥ」）についての配列（「ＧＡＭ ＲＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）および配列識別子（「ＧＡＭ ＳＥＱ−ＩＤ」）を示す。予測したヘアピンの配列およびｍｉＲＮＡの配列も、表１０に記載する。

２．第２のスクリーニング
表１では、コンピュータを利用した第２のスクリーニングの予測した各々のヘアピン（「ＨＩＤ」）についての配列番号が列挙されている。表１では、各々のヘアピンについてのゲノムの位置（「Ｈａｉｒｐｉｎ Ｌｏｃａｔｉｏｎ」）も列挙されている。ゲノムの位置についてのフォーマットは、＜ｃｈｒ＿ｉｄ＞（染色体番号）＜ｓｔｒａｎｄ＞（鎖）＜ｓｔａｒｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ＞（開始位置）の連結である。たとえば、１９＋１３５４６００００は、第１９番染色体、＋ｓｔｒａｎｄ、開始位置１３５４６００００を意味する。第２３番〜第２５番染色体は、染色体Ｘ、染色体ＹおよびミトコンドリアＤＮＡを意味する。染色体上の位置は、ＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）によるヒトゲノムのｈｇ１７アセンブリに基づくものであり、これはＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３５ ｖｅｒｓｉｏｎ １を基礎とし、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（国際ヒトゲノムシークエンシングコンソーシアム）によって作成された。

表１では、進化の過程でヘアピンが保存されているか否か（「Ｃ」）についても列挙されている。ゲノム版の研究論文が存在するという選択肢がある。ｐｈａｓｔＣｏｎｓデータを用いることによって、これらのヘアピンを保存されたもの（「Ｙ」）または保存されていないもの（「Ｎ」）として特定した。ｐｈａｓｔＣｏｎｓデータは、チンパンジー、マウス、ラット、イヌ、ニワトリ、カエルおよびゼブラフィッシュのゲノムに対しての、ヒトゲノムにおける各々のヌクレオチドについての進化における保存の指標であり、各々の種についてのＢｌａｓｔＺに基づくベスト・イン・ゲノム・ペアー・ワイズ・（ｂｅｓｔ−ｉｎ−ｇｅｎｏｍｅ ｐａｉｒ ｗｉｓｅ）アラインメントと、それに続く、８ゲノムのｍｕｌｔｉＺアラインメントとを用いるｐｈｙｌｏ−ＨＭＭに基づくものである（Ｓｉｅｐｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ １１， ４１３−４２８， ２００４ ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １３， １０３−１０７， ２００３）。ヘアピンのステム内の任意の１５ヌクレオチド配列において、７種に亘るｐｈａｓｔＣｏｎｓ保存スコアの平均が少なくとも０．９である場合、保存されたものとしてヘアピンが列挙されている（Ｂｅｒｅｚｉｋｏｖ，Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｈａｄｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｇｅｎｅｓ． Ｃｅｌｌ １２０， ２１−２４， ２００５）。

表１では、遺伝子間（「Ｇ」）、イントロン（「Ｉ」）またはエキソン（「Ｅ」）のいずれかとして、各々のヘアピンについてのゲノムのタイプ（「Ｔ」）も列挙されている。表１では、予測したｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ^*の各々についての配列番号（「ＭＩＤ」）も列挙されている。表１では、Ｈｏｆａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ ｆ． Ｃｈｅｍｉｅ １２５： １６７−１８８， １９９４に記載されたように、０−１のスケール（１は、そのヘアピンが最も確実である）で、各々のヘアピン（「Ｐ」）についての予測スコアの評価も列挙されている。評価がゼロあるいは無の場合、そのｐ値が０．０５未満であるようなより低い値のＰａｌＧｒａｄｅに変換される。表１では、各々のＰスコアの値について、バックグラウンドのヘアピンから計算したｐ値（「Ｐｖａｌ」）も列挙されている。表中に示されるように、Ｐｖａｌが０．０５を超える例はほとんどない。これらのケースの各々において、ヘアピンは高度に保存され、あるいはこれらのヘアピンは有効であると検証された（Ｆ＝Ｙ）。

表１では、表２に詳述されるように、発現の解析（「Ｅ」）によってｍｉＲＮＡが有効とされたか否かも列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝無効）。表１では、シークエンシング（「Ｓ」）によってｍｉＲＮＡが有効とされたか否かについても列挙されている（Ｙ＝有効、Ｎ＝無効）。予測したｍｉＲＮＡとシークエンシングされたものとの間の配列に違いがあった場合、シークエンシングされた配列を予測する。ｍｉＲＮＡのシークエンシングまたはその発現の検出ができないことは、ｍｉＲＮＡが存在しないことを必ずしも意味するものではないことに留意すべきである。このような検出されないｍｉＲＮＡは、このようなテストを受けた組織以外で発現する場合がある。さらに、このような検出されないｍｉＲＮＡは、試験用の細胞の段階または条件とは異なる段階または条件にて、テスト組織で発現する場合がある。

表１では、表２に詳述されるように、少なくとも１つの疾患において、ｍｉＲＮＡが差別的に発現することが示された（「Ｄ」）か否か示されたことも列挙されている（Ｙ＝発現、Ｎ＝未発現））。表１はまた、Ｓａｎｇｅｒデータベース・リリース６．０（２００５年４月）（ｈｔｔｐ：／／ｎａｒ．ｏｕｐｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）において、ｍｉＲＮＡがヒトもしくはマウスにおいて検出されたものとして、またはヒトにおいて予測したものとして、存在したか否か（「Ｆ」）（Ｙ＝存在、Ｎ＝非存在）も列挙されている。上記で説明したように、Ｓａｎｇｅｒデータベースに列挙されたｍｉＲＮＡは予測アルゴリズムの構成要素であり、かつ出力についてのコントロールである。

表１では、互いの５，０００ヌクレオチドの距離内にあるヘアピンについての遺伝子のロケーション・クラスター（「ＬＣ」）も列挙されている。同一のＬＣを有する各々のｍｉＲＮＡは、同一の遺伝子のクラスターを共有している。表１では、正確なマッチングによる２−７のシードによりｍｉＲＮＡをグループ化するシード・クラスター（「ＳＣ」）も列挙されている。同一のＳＣを有する各々のｍｉＲＮＡは同一のシードを有する。５ヌクレオチド長のシードについては、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １２０； １５−２０ （２００５）が参照できる。

標的遺伝子の予測
次いで、コンピュータを利用した実施例１の２つのスクリーニングから予測したｍｉＲＮＡを用い、そしてｍｉＲＮＡを予測するための米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号（これらの内容は引用として本明細書に組み込まれる）に記載のものと類似のコンピュータを利用した２つのアプローチを用いて、標的遺伝子およびそれらの結合部位を予測した。
１．第１のスクリーニング
表１３Ａ〜表１３Ｃでは、コンピュータを利用した第１のスクリーニングから予測した標的遺伝子（「ＴＡＲＧＥＴ」）および結合部位配列（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」）ならびに結合部位の配列識別子（「ＴＡＲＧＥＴ ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ ＳＥＱ−ＩＤ」）、ならびに標的の起源の生物（「ＴＡＲＧＥＴ ＯＲＧＡＮＩＳＭ」）が列挙されている。表１４では、標的遺伝子に関連する疾患（「ＤＩＳＥＡＳＥ ＮＡＭＥ」）が列挙されている（「ＴＡＲＧＥＴ−ＧＥＮＥＳ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＩＳＥＡＳＥ」）。表１５では、ｍｉＲＮＡ（「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ ＯＦ ＧＡＭＳ ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＷＩＴＨ ＤＩＳＥＡＳＥ」）についての配列識別子および標的遺伝子に基づくｍｉＲＮＡに関連する疾患（「ＤＩＳＥＡＳＥ ＮＡＭＥ」）も列挙されている。結合部位配列の配列も表１０に記述されている。

２．第２のスクリーニング
表４では、コンピュータを利用した第２のスクリーニングから予測した各々のｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）およびそのヘアピン（ＨＩＤ）についての標的遺伝子が列挙されている。標的遺伝子の名称は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ・リリース９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ； Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ３３（１）： Ｄ５０１−Ｄ５０４， ２００５； Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １６（１）： ４４−４７， ２０００； ａｎｄ Ｔａｔｕｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， １５（７−８）： ５３６−４３， １９９９）から得た。７ヌクレオチドのｍｉＲＮＡシード（位置２−８）とＵＴＲ上のＡ（総数＝８ヌクレオチド）と完全に相補的マッチングすることによって、標的遺伝子を同定した。標的遺伝子を同定することについては、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １２０： １５−２０， （２００５）が参照できる。ｍｉＲＮＡがＵＴＲに結合するのに十分であるシードについては、Ｌｉｍ Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．， （Ｎａｔｕｒｅ ２００５） ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｃｋ ｅｔ ａｌ， （ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ２００５）が参照できる。

次いで、最少３０ヌクレオチドのＵＴＲを含む標的遺伝子のみを含むことに従ってフィルターをかけられた標的遺伝子のデータセットを用いて、結合部位を予測した。結合部位のスクリーニングでは、ＵＴＲ毎最初の４０００ヌクレオチドのみを考慮し、遺伝子あたりいくつかの転写物が存在する場合、最も長い転写物を考慮した。フィルターをかけることによって、転写物の総数が２３６２６から１４２３９に減少した。表４では、各々の標的遺伝子に関して、予測した結合部位についての配列番号が列挙されている。結合部位の配列はスプライスされたｍＲＮＡ上にあるため、この配列は結合部位の５’および３’の２０ヌクレオチドを含む。予測した結合部位を１つしか有さないｍｉＲＮＡまたは有効であるとされたｍｉＲＮＡを除き、表４のデータは、少なくとも２結合部位を含む標的遺伝子のみを示すようにフィルターがかけられた。

表５は、それらの標的遺伝子によりｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）／ヘアピン（「ＨＩＤ」）と疾患との間の関係を示す。疾患の名称は、ＯＭＩＭから得る。ヘアピンがその上に位置するホスト遺伝子を疾患に位置結びつける根拠については、Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ， ＲＮＡ， １１： ２４１−２４７ （２００５） ａｎｄ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １４： １９０２−１９１０ （２００４）を参照できる。表５は、疾患に関連する標的遺伝子のｍｉＲＮＡの数（「Ｎ」）を示す。表５はさらに、疾患に関連する遺伝子の総数（「Ｔ」）を示し、これはｍｉＲＮＡへの結合部位を有すると予測された遺伝子から得られた。表５はさらに、Ｔ中におけるＮのパーセンテージと、超幾何学的解析（「Ｐｖａｌ」）のｐ値とを示す。表８は、表５および表６についての疾患の符号を示す。超幾何学的解析の参考文献としては、Ｓｃｈａｕｍ’ｓ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＩＩ： Ｉｎｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓが参照できる。

表６は、ホスト遺伝子によりｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）／ヘアピン（「ＨＩＤ」）と疾患との間の関係を示す。ホスト遺伝子の相補鎖上のヘアピン遺伝子を、その遺伝子上に位置するものとして規定した：イントロンとしてＩｎｔｒｏｎ＿ｃおよびエキソンとしてＥｘｏｎ＿ｃ。相補鎖が疾患を引き起こし得るため相補鎖を選択する。たとえば、相補鎖上に位置するｍｉＲＮＡにおける突然変異である。ｍｉＲＮＡが両鎖上にあるというケースにおいて、イントロンとＥｘｏｎ＿ｃの場合のような２つの状況では、イントロンが第１に選択される。選択の理論は、Ｉｎｔｒｏｎ＞Ｅｘｏｎ＞Ｉｎｔｒｏｎ＿ｃ＞Ｅｘｏｎ＿ｃ＞遺伝子間、である。表９は、標的配列（「Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ」）と疾患（「Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｄｅ」）との間の関係を示す。

ｍｉＲＮＡの検証
１．発現の解析−セット１
０において予測したヘアピンおよびｍｉＲＮＡを確認するために、米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号（これらの内容は引用として本明細書に組み込まれる）に記載のものと類似の高スループットマイクロアレイを用いて、種々の組織における発現を検出した。予測した各々の前駆体ｍｉＲＮＡについて、ヘアピンの両方のステムに由来する成熟ｍｉＲＮＡをテストした。

表２は、関連するｍｉＲＮＡ（「ＭＩＤ」）の発現を検出することによって検証された第２の予測セットのヘアピン（「ＨＩＤ」）、ならびに発現が検出された組織についての符号（「Ｔｉｓｓｕｅ」）を示す。表２についての組織および疾患の符号を表７に列挙する。テストされた組織のいくらかは細胞系であった。Ｐ５３を有する／有しない肺ガンの細胞系（Ｈ１２９９）：Ｈ１２９９は突然変異を伴うＰ５３を有する。この細胞系は、温度感受性（３２℃で活性化）のＰ５３を伴う構築物で形質移入された。この試験は３２℃で実施した。

表２はさらに、チップ発現スコアの評価（５００−６５０００の範囲）を示す。５００のしきい値を用いて、有意でないシグナルを除外し、異なる試験からのＭｉｒＣｈｉｐプローブのシグナルによってスコアを標準化した。試験間の蛍光物質の強度のばらつきは、ＲＮＡ調製または標識化効率における変動による場合がある。各々の試料におけるｍｉＲＮＡの総量は比較的一定であるという仮説に基づいて標準化した。最初に各々のプローブの生のシグナルからバックグラウンドシグナルを引いた。ここでバックグラウンドシグナルは４００と規定している。次いで各々のｍｉＲＮＡプローブのシグナルをすべてのｍｉＲＮＡのシグナルの平均で割り、その結果を１００００倍してバックグラウンドシグナルの４００を加えた。このように規定することにより、各々の試験におけるすべてのｍｉＲＮＡプローブのシグナルの総和は１０４００である。

表２はさらに、標準化されたスコアに基づいて計算された、標準化されたシグナル（「Ｓｐｖａｌ」）の統計的解析を示す。各々のｍｉＲＮＡについて、予測したｍｉＲＮＡの完全なリストから該当するコントロール群を用いた。各々のｍｉＲＮＡは、ミスマッチを伴うプローブの内部コントロールを有する。類似のＴｍを有するために、関連するコントロール群は、類似のＣおよびＧパーセンテージを伴うプローブ（絶対的相違＜５％）を含んでいた。プローブシグナルのｐ値は、同一のまたはより高いシグナルを有する関連するコントロール群のプローブと比較した比率である。その結果は、ｐ値が０．０５以下で、スコアが５００を超えるというものである。ＳＰＶａＩが０．０として記入されるケースでは、その値は０．０００１未満である。

２．発現の解析−セット２
０において予測したヘアピンおよびｍｉＲＮＡをさらに確認するために、別の組織における発現を検出した。表１６では、次のものによるｍｉＲＮＡの発現のデータが列挙されている：ＨＩＤ：表１７に記載された配列についてのヘアピンの配列識別子；ＭＩＤ：表１７に記載された配列についてのｍｉＲＮＡの配列識別子；Ｔｉｓｓｕｅ：テストされた組織；Ｓ：チップ発現スコアの評価（範囲＝１００−６５０００）；Ｄｉｓ． Ｄｉｆｆ． Ｅｘｐ．：疾患に関連する差別的発現およびテストが行われた組織；Ｒ：疾患に関連する発現の比率（範囲＝０．０１−９９．９９）；ならびに略号：Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ａ−アルツハイマー病に罹患した脳組織の混合物；Ｂｒａｉｎ Ｍｉｘ Ｂ−すべての脳組織の混合物；ならびにＢｒａｉｎ ＳＮ−黒質。

３．シークエンシング
第２の予測のヘアピン（「ＨＩＤ」）をさらに検証するために、米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号（これらの内容は引用として本明細書に組み込まれる）に記載のものと類似のシークエンシング法によって多数のｍｉＲＮＡを検証した。表３は、示された組織（「Ｔｉｓｓｕｅ」）におけるｍｉＲＮＡ（ＭＩＤ）をシークエンシングすることによって検証されたヘアピン（「ＨＩＤ」）を示す。

第１９番染色体のｍｉＲＮＡ
実施例３から検証されたｍｉＲＮＡの群は、胎盤で高度に発現し、顕著な配列類似性を有し、そして第１９番染色体上の同一の座に位置する（図２）。これらの予測したｍｉＲＮＡは、１９ｑ１３．４２座内の約１００，０００ヌクレオチドの範囲に亘って広がる。このゲノム領域はタンパク質をコードする遺伝子を欠き、遺伝子間にあるように思われる。我々の予測アルゴリズムの出力の詳細な検査を含むゲノム配列のさらなる解析によって、より多くの関連する推定ｍｉＲＮＡがより多いこと、ならびにｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２およびｍｉｒ−３７３がこの領域の約２５，０００ｂｐ下流に位置することが分かった。全体として、５４の推定ｍｉＲＮＡ前駆体がこの領域内で同定された。これらのｍｉＲＮＡ前駆体を、４つの別個のタイプの関連配列に分けることができる（図２）。クラスター内のｍｉＲＮＡの約７５％は高度に関連しており、Ａタイプと命名した。その他の３つのｍｉＲＮＡのタイプ、つまりＢタイプ、ＣタイプおよびＤタイプは、各々４前駆体、２前駆体および２前駆体から成る。さらなる３種の推定ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｓ１からＳ３）は関連性が無い配列を有する。興味深いことに、すべてのｍｉＲＮＡ前駆体は、隣接するｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２およびｍｉｒ−３７３のｍｉＲＮＡ前駆体と同一の向きである。

さらなる配列解析から、ＡタイプのｍｉＲＮＡの大部分が、クラスター内で３５回繰り返されている約６００ｂｐの領域内に埋め込まれていることが分かった。反復配列は、ゲノムのその他の領域には見られず、霊長類にのみ保存されている。ほとんどの場合、この反復単位はその上流と下流にＡｌｕリピートが結合している。このことは、Ａｌｕリピートがほとんど無いＭＣ１４−１クラスターとは際立って対照的である。

図３−Ａは、ヒトにおけるＡタイプのｍｉＲＮＡ前駆体を含む３５の反復単位の配列の比較を示す。この比較によって、最も高い配列類似性を示す２つの領域が特定された。１つの領域には、リピートの３’領域内に位置するＡタイプのｍｉＲＮＡが含まれる。第２の領域は、ＡタイプのｍｉＲＮＡ前駆体の約１００ヌクレオチド上流に位置する。しかしながら、ＡタイプのｍｉＲＮＡ前駆体を含む領域はチンパンジーの反復単位の間で高い類似性を示すのに対して、第２の領域はそれを示さない（図３−Ｂ）。

Ａタイプのリピートを含む領域の調査から、前駆体（５ｐ ｍｉＲＮＡ）の５’のステムにコードされたｍｉＲＮＡの５’領域が、成熟ｍｉＲＮＡのその他の領域よりも可変的であると考えられることが示唆された。このことは、３’のステム（３ｐ ｍｉＲＮＡ）に由来する成熟ｍｉＲＮＡの３’領域における可変性と一致する。予想されるように、ループ領域は可変性が高い。同一の事象は、４３のすべてのＡタイプのｍｉＲＮＡの多重配列アラインメントでも見ることができる（図４）。

図４にて示された多重配列アラインメントから、予測した成熟ｍｉＲＮＡに関する次の発見が明らかになった。５ｐ ｍｉＲＮＡを３のブロックに分割することができる。ヌクレオチド１〜６はＣ／Ｔリッチであり、比較的可変性が高く、そしてほとんどのｍｉＲＮＡにおけるヌクレオチド３〜５のＣＴＣモチーフに特徴がある。ヌクレオチド７〜１５はＡ／Ｇリッチであり、ヌクレオチド７および８以外は多くのｍｉＲＮＡ間で共有されている。ヌクレオチド１６〜２３はＣ／Ｔリッチであり、メンバーの間で再度保存されている。予測した３ｐ ｍｉＲＮＡは一般的に、そのファミリーのメンバー間でより高い保存性を示す。ほとんどのものはＡＡＡモチーフで始まるが、少数は、異なる５’配列を有し、これは標的の認識に重要でありうる。ヌクレオチド８〜１５はＣ／Ｔリッチであり、高い保存性を示す。最後の７ヌクレオチドはやや保存性が低いが、ほとんどのメンバーに共通するヌクレオチド１７〜１９内にＧＡＧモチーフを含む。

反復単位の５’領域の解析によって、ヘアピンの可能性があるものを特定した。しかしながら、ほとんどの反復単位において、これらのヘアピンは保存されておらず、そしてスコアが最も高いヘアピンからｍｉＲＮＡをクローニングする努力は失敗に終わった。長い反復単位内では見つけられない８種のＡタイプの前駆体が存在する。これらの前駆体の周囲の配列は、Ａタイプの反復単位またはその他のどのゲノム配列に対する類似性も示さない。これらのＡタイプの前駆体のうちの５種について、Ａタイプの配列の下流で極めて近接する位置にＡｌｕリピートが存在する。

クラスターにおけるその他のタイプのｍｉＲＮＡから、次の特徴が示された。４つのＢ群のｍｉＲＮＡが約５００ｂｐの反復領域内に見出され、そのうちの１つがそのクラスターの末端に位置する。２つのＤタイプのｍｉＲＮＡ、これは相互に約２０００ヌクレオチド離れている、はそのクラスターの先頭に位置し、１２２０ヌクレオチドの重複領域内に含まれる。興味深いことに、この２つのＤタイプの前駆体は同一である。関連が無い配列の３つのｍｉＲＮＡのうちの２つ、Ｓ１およびＳ２は、２つのＤタイプのｍｉＲＮＡの直後に位置し、第３のものはＡ３４とＡ３５との間に位置する。一般的に、クラスターを含む約１００，０００ヌクレオチドの全領域は反復要素で覆われている。これは、この領域に特異的なｍｉＲＮＡを含有する反復単位と、クラスター内に多数存在する、ゲノムに広がる反復要素とを含む。

予測したｍｉＲＮＡのクローニング
予測したｍｉＲＮＡをさらに検証するために、実施例４に記載された多数のｍｉＲＮＡを、米国特許出願第６０／５２２，４５９号、第１０／７０９，５７７号および第１０／７０９，５７２号（これらの内容は引用として本明細書に組み込まれる）に記載のものと類似の方法を用いてクローニングした。簡潔に述べると、予測したｍｉＲＮＡの各々について、特異的な捕獲用オリゴヌクレオチドを設計した。このオリゴヌクレオチドを用いて、小ＲＮＡに富む、胎盤由来のライブラリーから特異的なｍｉＲＮＡを捕獲し、クローニングし、そしてシークエンシングした。

４３種のＡタイプのｍｉＲＮＡのうちの４１種をクローニングした。その１３種のｍｉＲＮＡは、オリジナルのマイクロアレイ上には存在していなかったが、ＤタイプのｍｉＲＮＡと同じくコンピュータを利用して予測されただけであった。予測したｍｉＲＮＡ前駆体のうちの１１種について、５ｐおよび３ｐの予測した成熟ｍｉＲＮＡの両方がマイクロアレイ上に存在し、そしてすべてのケースにおいて、両者は明確なシグナルを与えた。したがって、すべてのクローニングの計画において、５’および３’の両方の成熟ｍｉＲＮＡをクローニングすることを試みた。４３のクローニングされたｍｉＲＮＡのうちの２７について、５’のステムおよび３’のステムの両方に由来するｍｉＲＮＡをクローニングすることができた。クローニングの努力は徹底的なものではなかったので、より多くのｍｉＲＮＡ前駆体が５’および３’の成熟ｍｉＲＮＡをコードする可能性がある。

多数のｍｉＲＮＡクローニングの研究（Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ２００１， ２００２， ２００３） （Ｐｏｙ ２００４）で観察されるように、クローニングされたｍｉＲＮＡの多くが、３’末端における不均一性を示した。興味深いことに、かなりの数のクローニングされたｍｉＲＮＡについて、５’末端での不均一性も観察された。この不均一性は、３’のステムに由来するｍｉＲＮＡ（６）に比べて５’のステムに由来するｍｉＲＮＡ（９）においてより多く見られるようであった。対照的に、３’末端における不均一性は、３’のステムおよび５’のステムに由来するｍｉＲＮＡの両者において同程度であった（各々１９および１３）。５’の不均一性には、主に１つのヌクレオチド、大半はＣまたはＡの付加が伴うが、あるケースにおいては、３ヌクレオチドの付加が存在した。この事象は第１９番染色体クラスターにおけるｍｉＲＮＡに特異的なものではない。既知のｍｉＲＮＡならびにその他の染色体からの新規ｍｉＲＮＡの両方を含むさらに多くのクローニングされたｍｉＲＮＡについて、それを観察した（データは示さず）。

ｍｉＲＮＡの発現の解析
実施例４のｍｉＲＮＡの発現をさらに調査するために、ノーザン・ブロット解析を用いていくつかの組織内のｍｉＲＮＡ発現のプロファイルを得た。１３％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した合計で４０μｇのＲＮＡを用い、そして³²Ｐで末端を標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ノーザン・ブロット解析を実施した。このオリゴヌクレオチドプローブの配列は、５’−ＡＣＴＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＴＧＴ−３’（Ａ１９−３ｐ， ＮＣＢＩ： ＨＳＡ−ＭＩＲ−ＲＧ−２１）および５’−ＡＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴ−３’（Ａ２４−３ｐ， ＮＣＢＩ： ＨＳＡ−ＭＩＲ−ＲＧ−２７）であった。マイクロアレイ解析（図５−Ａ）で観察されたものと同一の組織特異的プロフィールを伴う約２２ヌクレオチドの長いＲＮＡ分子として、このｍｉＲＮＡが発現された。

ＭＣ１９−１クラスターがどのようにして転写されるのかを明らかにするため。領域内のＥＳＴを調査することによって、ポリアデニル化シグナルとポリＡの尾部とを伴うＥＳＴを含む僅かに１つの場所を特定した。この領域は、Ａ４３前駆体のすぐ下流側に位置する。これ以外でポリアデニル化シグナルを伴うＥＳＴを有する領域は一つのみで、ｍｉｒ−３７３の直後に位置する。このことは、ｍｉｒ−３７１、２、３が別個の転写物上にあることを示唆する。最初に、ｍｉｒ−Ａ４３周辺の領域に焦点を当てた研究を行い、この領域が実際にポリアデニル化ｍＲＮＡ内に転写されることを確認した。３．５ｋｂの領域をカバーするプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ試験の結果、予想された断片が得られた（図５−Ｂ）。５μｇの胎盤の全ＲＮＡを用い、オリゴ−ｄＴをプライマーとして用いるＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。次のプライマーを用いて転写物を増幅した：ｆ１： ５’−ＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＡＧ−３’； ｆ２： ５’−ＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＧＡＡＣＧＣＡ−３’； ｒ１： ５’−ＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＧ−３’； ｒ２： ５’−ＴＴＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＴＴＴＣ−３’； ｒ３： ５’−ＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣ−３’；およびｒ４： ５’−ＴＧＡＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＣ−３’。シークエンシングによって、この断片の信憑性を検証した。この領域にはｍｉｒ−Ａ４２およびｍｉｒ−Ａ４３が含まれ、このことは、ｍｉＲＮＡの両方が同一の一次転写物上に存在することを示す。

クラスターの転写に関するさらなる情報は、その内部に位置する７７のＥＳＴの解析からもたらされた。ＥＳＴのうち４２個が胎盤に由来することを見出した。これらのＥＳＴはクラスター全体に沿って広がっているため、クラスター全体が胎盤で発現することが示唆される。この観察結果は、マイクロアレイ解析で観察される発現プロフィールと一致する。したがって、ＨｅＬａ細胞で発現する唯一のｍｉＲＮＡであるＤタイプのｍｉＲＮＡだけを例外として、クラスターにおけるすべてのｍｉＲＮＡは同時発現されているようである。興味深いことに、７７のＥＳＴのどれ１つとして、クラスターにおけるｍｉＲＮＡ前駆体と重複する領域内に位置しない。このことは、ドローシャによって加工される転写物由来のＥＳＴの発現が枯渇していることと一致する。

マイクロアレイ発現プロフィールの調査から、ｍｉＲＮＡのＤ１／２、Ａ１２、Ａ２１、Ａ２２およびＡ３４が、テストを行ったその他のいくつかの組織において軽度から中程度の発現ｌｅｖｅｌとして示された多少異なる発現プロフィールを有することが明らかになった。このことは、ｍｉＲＮＡをコードする単数もしくは複数の転写物のオルターナティブスプライシングによって、または異なる組織特異性を有する別の単数もしくは複数のプロモーターがクラスターに沿って存在することによって説明できるかもしれない。

３ｐ成熟ｍｉＲＮＡの発現と５ｐ成熟ｍｉＲＮＡの発現とを比較することによって、多数のｍｉＲＮＡ前駆体のために両者が発現するが、多くの場合異なるレベルであることが明らかになった。ほとんどのプレｍｉＲＮＡについて、３ｐ ｍｉＲＮＡは、５ｐ ｍｉＲＮＡよりも高いレベルで発現する。しかしながら、６種の場合（ｍｉｒ−Ｄ１、２、ｍｉｒ−Ａ１、ｍｉｒ−Ａ８、ｍｉｒ−Ａ１２、ｍｉｒ−Ａ１７およびｍｉｒ−Ａ３３）において、３ｐ ｍｉＲＮＡおよび５ｐ ｍｉＲＮＡの両方が同様のレベルで発現し、１つの場合（ｍｉｒ−Ａ３２）においては、５ｐ ｍｉＲＮＡが３ｐ ｍｉＲＮＡよりも高いレベルで発現した。

保存
実施例４の予測ｍｉＲＮＡの全４つのタイプに由来する配列を、その他の種（チンパンジー、マカク、イヌ、ニワトリ、マウス、ラット、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、菌類、ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）のそれと比較することで、クラスターにおけるすべてのｍｉＲＮＡ、そして実際のところ領域全体が、霊長類を超えては保存されていないことが明らかになった。興味深いことに、この領域のホモログは、マウスおよびラットを含むその他のいずれの調査されたゲノム内にも存在しない。したがって、これは、霊長類に特異的であって、動物一般には共有されていない最初のｍｉＲＮＡクラスターである。チンパンジーとヒトとの間のホモロジー解析から、ＡタイプのｍｉＲＮＡを保持する３５のすべてのリピートが２つの種の間で近接していることが示される。さらに、クラスター全体は、ヒトとチンパンジーとの間で同一と考えられる。したがって、ＭＣ１９−１クラスターの発生を導く多重の重複は、チンパンジーとヒトとが分かれる前に生じ、そして各々の種の進化の過程においても安定であり続けたに違いない。ヒトの第１９番染色体が、タンデムにクラスターを形成した多数の遺伝子ファミリーと、大きなセグメントでの重複とを含むことが既知であることに留意すべきである（Ｇｒｉｍｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ， ２００４）。したがって、この点に関して、ＭＣ１９−１クラスターは第１９番染色体の天然の部分である。

対照的に、ＭＣ１４−１クラスターはマウスにおいて広く保存されており、霊長類を超えて保存されていないものはクラスター内のＡ７ ｍｉＲＮＡおよびＡ８ ｍｉＲＮＡのみである（Ｓｅｉｔｚ ２００４）。対照的に、ＭＣ１９−１クラスターにおけるすべてのｍｉＲＮＡは霊長類に固有である。Ｓａｎｇｅｒで見出されたすべてのｍｉＲＮＡの調査から、三種のｍｉＲＮＡ、ｍｉｒ−１９８、ｍｉｒ−３７３およびｍｉｒ−４２２ａ、だけが、マウスゲノムまたはラットゲノムに保存されていないが、これらはイヌゲノムに保存されていることが明らかになった。したがって、これらは霊長類に特異的ではない。興味深いことに、ｍｉｒ−３７１およびｍｉｒ−３７２は、ｍｉｒ−３７３とクラスターを形成し、ＭＣ１９−１クラスターの２５ｋｂ下流側に位置し、ＡタイプのｍｉＲＮＡとある程度相同的である（図４）が、げっ歯類でも保存されている。

ＡタイプのｍｉＲＮＡ配列を、ＳａｎｇｅｒデータベースにおけるｍｉＲＮＡと比較することで、ヒトのｍｉｒ−３０２ファミリーとのホモロジーが最も高いことが明らかになった（図４−Ｃ）。このホモロジーは、ｍｉｒ−３７１、２、３で見られるホモロジーよりも高い。ｍｉｒ−３０２ファミリー（ｍｉｒ−３０２ａ、ｂ、ｃおよびｄ）は、ＨＤＣＭＡ１８Ｐ遺伝子（アクセス番号０１６６４８）のタンパク質をコードするエキソン内にある第１のイントロン内にアンチセンスの配向で位置する、６９０ヌクレオチドをカバーする（ｍｉｒ−３６７を含む）５つのｍｉＲＮＡの強固に固められたクラスター内に見出される。ｍｉＲＮＡホモロジー以外のさらなるホモロジーは、ｍｉｒ−３０２クラスターとＭＣ１９−１クラスターとの間には存在しない。ｍｉｒ−３７１、２、３およびｍｉｒ−３０２ａ、ｂ、ｃ、ｄの両方が胚性幹細胞に特異的であるという事実は、注目に値する。

ｍｉＲＮＡの差別的発現
０において記載された方法と類似のチップ発現法を利用して、マイクロアレイの画像をＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｖｅｒｓｉｏｎ ７．１．１， Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて解析した。表２は、正常の組織と比較した疾患に関連する発現（「Ｒ」）の比率を示す。表２はさらに、標準化されたシグナル（「ＲＰｖａｌ」）の統計的解析を示す。各々のプローブのシグナルを、強度の中央値として設定した。シグナル強度は、バックグラウンドのレベルの４００から飽和レベルの６６０００まで分布する。２チャンネル・ハイブリダイゼーションを実施し、Ｃｙ３シグナルをＣｙ５シグナルと比較した。ここで、フルオロ・リバーストチップを用い（正常対疾患）、プローブシグナルをその平均シグナルに設定した。既知のｍｉＲＮＡシグナルの総和が各々の試験またはチャンネルで同一となるようにシグナルを既知のｍｉＲＮＡ平均シグナルで割って、シグナルを標準化した。疾患の組織と正常組織との間のシグナル比を計算した。１．５よりも大きなシグナル比は、ｐ値が０．００７の有意な上方調節を示し、２を超えるシグナル比は０．００３のｐ値を有する。２回の試験を通して、このようなまたはそれを超えるシグナル比の発生に基づいて、ｐ値を計算した。

表２における差別的発現解析は、ｍｉＲＮＡのうち多くの発現が疾患組織内で有意に変化したことを示す。特に、実施例４のＭＣ１９−１のｍｉＲＮＡは、前立腺ガンおよび肺ガン内で差別的に発現されている。ガンに対するＭＣ１９−１ ｍｉＲＮＡの関連性は、前立腺ガン由来細胞内のＭＣ１９−１領域内における異型接合性の喪失の特定によって支持される（Ｄｕｍｕｒ ｅｔ ａｌ． ２００３）。

図１は、ｍｉＲＮＡの成熟のモデルを示す。 図２は、１９ｑ１３．４２上のＭＣ１９クラスターの概略図を示す。パネルＡは、その中にクラスターが位置する第１９番染色体の５８，５８０，００１〜５９，０８０，０００の約５００，０００ｂｐの領域（２００４年５月のＵＳＣＳアセンブリによる）を示し、この領域は隣接するタンパク質をコードする遺伝子も含む。ＭＣ１９−１クラスターは長方形で示される。ｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２およびｍｉｒ−３７３は線で示される。クラスターに隣接する、タンパク質をコードする遺伝子は、太い矢印で示される。パネルＢは、ＭＣ１９−１ ｍｉＲＮＡクラスターの詳細な構造を示す。５８，８６０，００１〜５８，９６２，０００の約１０２，０００ｂｐの領域（２００４年５月のＵＳＣＳアセンブリによる）が示される。ｍｉＲＮＡ前駆体は黒い棒で示される。すべてのｍｉＲＮＡが左から右まで同一の配向であることに留意すべきである。ｍｉＲＮＡ前駆体の周囲の斜線部分は、その中に前駆体が埋め込まれている反復単位を示す。ｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２およびｍｉｒ−３７３の位置も示されている。 図３は、約６９０ｎｔの明確なサイズのヒトの３５の反復単位（Ａ）およびチンパンジーの２６の反復単位（Ｂ）の多重配列アラインメントのグラフ表示である。平均化スライドウインドウを１０ｎｔとして（最大スコア−１、最小スコア−０）、アラインメント内の各々の位置についての類似性のスコアを計算することによってこのグラフを作成した。反復単位の配列をＣｌｕｓｔａｌＷプログラムで整列した。結果として生じたアラインメントの各々の位置に、その位置での類似性の程度を示すスコアを割り当てた。ｍｉＲＮＡ前駆体を含む領域は、縦棒で境界を示されている。前駆体の５’のステム（５ｐ）および３’のステム（３ｐ）に由来する成熟ｍｉＲＮＡの正確な位置を、縦棒で示す。 図４は、ＭＣ１９−１クラスターの４３のＡタイプのプレｍｉＲＮＡの配列アラインメントを示す。パネルＡは、多重配列アラインメントを、枠で印を付けた成熟ｍｉＲＮＡの位置と共に示す。下部にコンセンサス配列を示す。保存されているヌクレオチドを、次のように着色する：黒−１００％、濃灰色−８０％〜９９％および淡灰色−６０％〜７９％。パネルＢは、成熟ＡタイプのコンセンサスｍｉＲＮＡのアラインメントを、上流のヒトクラスターのｍｉｒ−３７１、ｍｉｒ−３７２、ｍｉＲ−３７３と共に示す。パネルＣは、成熟ＡタイプのコンセンサスｍｉＲＮＡのアラインメントを、マウスのオーソロガスクラスターｈｓａ−ｍｉｒ−３７１−３７３と共に示す。 図５は、ＭＣ１９−１ ｍｉＲＮＡの発現の解析を示す。パネルＡは、選択された２つのＡタイプのｍｉＲＮＡのノーザン・ブロット解析を示す。ヒトの脳（Ｂ）、肝臓（Ｌ）、胸腺（Ｔ）、胎盤（Ｐ）およびＨｅＬａ細胞（Ｈ）からのすべてのＲＮＡを用いて、発現を解析した。ｍｉｒ−９８の発現とｔＲＮＡバンドのエチジウムブロミド染色がコントロールとなった。パネルＢは、ＡタイプのｍｉＲＮＡ前駆体を含むｍＲＮＡ転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。胎盤からの５ｙ（ウムラウト付きｙ）ｇの全ＲＮＡの逆転写を、オリゴ−ｄＴを用いて実施した。その後、表示されたプライマー（水平の矢印で示される）を用いてのＰＣＲを行った。調査された領域を、上端に図示する。縦方向の黒棒はプレｍｉＲＮＡを示す；プレｍｉＲＮＡの周囲の斜線部分は反復単位を示す；４つのＥＳＴの位置を右側に示す；ポリ−Ａ部位（ＥＳＴ内に見出され、ＡＡＴＡＡＡコンセンサスの下流に位置する）を、縦方向の矢印で示す。三種のプライマーの組み合わせを用いたＲＴ−ＰＣＲから予測される断片を、クラスター領域の説明図の下に示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を、予測した断片の下に示す。パネルＣは、ＦＲ２断片のシークエンシング戦略を示す。この断片をベクターｐＴＺ５７Ｒ＼Ｔ内にクローニングし、外部プライマーおよび内部プライマーを用いてシークエンシングした。

Claims (17)

1. （ａ）表１に言及されるヘアピン配列；
   （ｂ）表１０の配列識別子６７５７２４８−６８９４８８２の配列；
   （ｃ）表１７の配列識別子１−６３１８または１８７２８−１８９６０の配列；
   （ｄ）表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列；
   （ｅ）表１０の配列識別子１−１１７７５０または６８９４８８３−１００６８１７７の配列；
   （ｆ）表１７の配列識別子６３１９−１８７２７または１８９６１−１９４０１の配列；
   （ｇ）表４に言及される標的遺伝子結合部位の配列；
   （ｈ）表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列；
   （ｉ）（ａ）−（ｈ）の相補体；
   （ｊ）（ａ）−（ｈ）と少なくとも６０％一致する少なくとも１２の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
   からなる群より選択される配列を含み、５−２５０のヌクレオチド長である、単離された核酸。
2. 請求項１の核酸を含むプローブ。
3. 核酸が、表２に前立腺ガンまたは肺ガンで差別的に発現されるものとして言及されるｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも８−２２の連続するヌクレオチドを含む、請求項２のプローブ。
4. 請求項３の複数のプローブ。
5. 表２に前立腺ガンで差別的に発現されるものとして言及される各々のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのプローブを含む、請求項４の複数のプローブ。
6. 表２に言及される各々のｍｉＲＮＡに相補的な少なくとも１つのプローブであって、肺ガンで差別的に発現されるもの等を含む、請求項４の複数のプローブ。
7. 請求項４乃至６のいずれか１項の複数のプローブを含む組成物。
8. 固体担体を備えるバイオチップであって、該担体は請求項４乃至６のいずれか１項の複数のプローブを含み、各々のプローブが担体の空間的に定められたアドレスに連結されているバイオチップ。
9. プローブが表２に前立腺ガンで差別的に発現されるものとして言及されるｍｉＲＮＡに相補的である、請求項８のバイオチップ。
10. プローブが表２に肺ガンで差別的に発現されるものとして言及されるｍｉＲＮＡに相補的である、請求項８のバイオチップ。
11. 疾患に関連するｍｉＲＮＡの差別的発現を検出するための方法であって：
    （ａ）生物学的試料を提供すること；および
    （ｂ）（ｉ）表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列、（ｉｉ）表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列、（ｉｉｉ）表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列または（ｉｖ）（ｉ）−（ｉｉｉ）の変異体と少なくとも７０％の同一性を有する核酸のレベルを測定することを含み、
    コントロールと比較した核酸レベルの相違が差別的発現を示す方法。
12. 病的な状態を調節する化合物を同定するための方法であって：
    （ａ）（ｉ）表１に言及されるｍｉＲＮＡの配列、（ｉｉ）表１０の配列識別子１−１１７７５０もしくは６８９４８８３−１００６８１７７の配列、（ｉｉｉ）表１７の配列識別子６３１９−１８７２７もしくは１８９６１−１９４０１の配列または（ｉｖ）（ｉ）−（ｉｉｉ）の変異体と少なくとも７０％の同一性を有する核酸を発現できる細胞を提供すること；
    （ｂ）細胞をモジュレーターの候補物と接触させること；
    （ｃ）核酸発現のレベルを測定することを含み、
    コントロールと比較した核酸のレベルの相違によって、核酸に関連する病的な状態のモジュレーターとしての化合物を同定する方法。
13. 標的遺伝子の発現を十分に阻害できる量の核酸を細胞内に導入することを含む細胞における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、標的遺伝子が（ｉ）表４に言及される結合部位と実質的に同一の結合部位、（ｉｉ）表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の変異体を含み；核酸が（ａ）配列番号：１−７６０６１６の配列、（ｂ）表１０の配列識別子１−１１７７５０および６７５７２４８−１００６８１７７の配列、（ｃ）表１７に記載の配列または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の変異体を含む、細胞における標的遺伝子の発現を阻害する方法。
14. 発現がインビトロまたはインビボで阻害される、請求項１２の方法。
15. 標的遺伝子の発現を十分に増加できる量の核酸を細胞内に導入することを含む細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、標的遺伝子が（ｉ）表４に言及される結合部位と実質的に同一の結合部位、（ｉｉ）表１０の配列識別子１１７７５１−６７５７２４７の配列または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の変異体を含み；核酸が（ａ）配列番号：１−７６０６１６の配列、（ｂ）表１０に記載の配列、（ｃ）表１７に記載の配列または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の変異体と実質的に相補的な配列を含む、細胞における標的遺伝子の発現を増加させる方法。
16. 発現がインビトロまたはインビボで阻害される、請求項１５の方法。
17. （ａ）配列番号：１−７６０６１６の配列、（ｂ）表１０に記載の配列、（ｃ）表１７に記載の配列または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の変異体を含む核酸を、必要とする患者に投与することを含む、表６に記載の疾患を伴う患者を治療する方法。

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