JP2023542889A - 複数の標的を介して疼痛を処置するための治療用組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＮａＶチャネルｍＲＮＡ上の同定された標的に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む非オピオイド性疼痛治療用組成物を提供する。ＡＳＯは、その標的ＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈを動員してＲＮＡを分解する二重鎖を形成し、それによってＮａＶチャネル合成を下方制御し、これが疼痛の知覚に寄与するニューロンの能力を阻害する。ＡＳＯは、同定された特定の標的の１つを標的とし、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマーとして提供され得る。組成物がインビトロで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達される場合、ＤＲＧニューロンは、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８またはＮａＶ１．９の用量依存的ノックダウンを示す。

Description

技術分野
本開示は、疼痛を処置するための非オピオイド治療用組成物に関する。

背景
米国では、疾病管理センターは、１億人もの人々が慢性疼痛に罹患していると推定している。疼痛の処置に対する１つの一般的なアプローチは、オピオイドの使用を含む。オピオイド薬は疼痛に対して非常に効果的な処置法であるが、これらの依存性薬物の乱用が蔓延していることが問題であると理解されている。それにもかかわらず、経験や生活に支障をきたす多くの一般的な医学的症状がある。

重度の慢性疼痛を誘発することが多い一般的な症状の１つは変形性関節症である。変形性関節症は、関節内の軟骨が破壊または摩耗すると起こり、最終的に関節表面に露出した骨が生じ、互いに擦れ合い、断片化または裂けが生じる可能性がある。変形性関節症に罹患している多くの人々は、この症状がもたらす持続的な疼痛をよく理解している。重度の慢性疼痛を引き起こし得る別の一般的な症状は癌である。米国癌学会は、癌性疼痛を、単に癌に対する炎症反応だけでなく、癌自体に起因すると考えている。研究は、癌細胞自体が感覚ニューロンの過敏性を駆動することを示している。したがって、癌は腫瘍として現れるか、または身体全体に広がる可能性があるだけでなく、癌自体が重度の疼痛の直接的な原因となり得る。

疼痛を処置するための様々なアプローチがあるが、それぞれが特定の制限に関連する。市販の非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、特定の形態の疼痛を処置するのに必要な有効性を欠くことがある。さらに、一部の人々は、ＮＳＡＩＤに応答しなくなるか、または消化器系および腎機能に対する有害作用に耐えることができない。オピオイドは、疼痛を処置するのに有効であると理解されているが、人的および社会的コストが高く、耐性がつくため時間が経つと効果がなくなる可能性がある。オピオイドは中毒性麻薬であり、乱用、転用、さらには不正行為および犯罪行為に関与しているとよく理解されている。ＮＳＡＩＤおよびオピオイド処置のさらに深刻な欠点には、高い死亡率が含まれる。

要旨
本発明は、オピオイドを必要としないまたは伴わない疼痛を処置するのに有用な治療用組成物を提供する。組成物は、疼痛の知覚に関与するタンパク質の合成を防止する短い核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。具体的には、特定のニューロンは、「疼痛感知」神経、または侵害受容器として機能する。これらの疼痛感知ニューロンは、電位依存性ナトリウムチャネルとして機能するタンパク質を有する。神経終末の刺激が閾値電圧（Ｖ）を超えると、侵害受容器ニューロンは細胞膜を横切ってナトリウムイオン（Ｎａ＋）を伝導し、これによりニューロンを再生的に脱分極させ、痛覚の根底にある電気信号を伝播する「発火」をもたらすことができる。本発明の組成物は、痛みの感覚を可能にするナトリウムチャネルタンパク質の産生に使用されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または前駆体ｍＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）に結合するオリゴヌクレオチドを含む。本発明は、それらのＲＮＡ内の多数の特定の検証された標的の同定を含む。オリゴヌクレオチドは、それらのタンパク質が産生されるのを妨げ、それにより、それらの疼痛感知ニューロンの感受性または活性が低下する。疼痛感知ニューロンの活性が低下するため、患者の経験する疼痛は、はるかに少ない。組成物は、オピオイドまたは他の麻薬を含む必要がなく、したがって、習慣性ではない。組成物は、オピオイドの有効用量を減少させるためにオピオイドと組み合わせて使用され得る。したがって、組成物は、疼痛感知ニューロンのナトリウムチャネルを下方制御することによって長期の疼痛緩和を提供する。

ヒトには、ＮａＶ１．１～ＮａＶ１．９と呼ばれる電位依存性ナトリウムチャネルの９つのファミリーがある。これら９つのタンパク質のうち、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９は、侵害受容器後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにおいて発現され、疼痛の知覚に寄与する。

本開示のオリゴヌクレオチドは、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９タンパク質の合成に使用されるＲＮＡ中の特定の標的に結合するように設計されている。オリゴヌクレオチドの結合は、タンパク質合成を妨げ、対応するＮａＶチャネルの発現を下方制御する。具体的には、オリゴヌクレオチドは、ＮａＶチャネルのｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ上の同定された標的のうちの１つに実質的にまたは完全に相補的な配列を有する。すなわち、オリゴヌクレオチドは、同定された標的に対してアンチセンスである。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、その標的ＲＮＡにハイブリダイズすると、二本鎖二重鎖の一部を分解する酵素（ＲＮａｓｅ Ｈ）を動員する二本鎖ＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を形成する。ＡＳＯ：ＲＮＡ二重鎖を分解すると、ＮａＶチャネルｍＲＮＡのニューロンが枯渇し、細胞によって合成されるＮａＶチャネルの量が減少する。ＮａＶチャネル発現の下方制御は、疼痛の感覚に寄与するニューロンの能力を妨げる。

したがって、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、またはＮａＶ１．９のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の同定された標的に対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドを含む組成物を患者に投与すると、その患者は疼痛の経験が減少する。したがって、本開示の組成物は、オピオイドの使用を必要とせずに患者の疼痛を処置するのに有用であり、オピオイドの使用を最小限に抑えるか、または減少させることもできる。

特定の態様では、本開示は、疼痛を処置するための組成物を提供する。組成物は、配列番号１～１４１のうちの１つに少なくとも約７５％相補的なＲＮＡのセグメントに沿ってナトリウムチャネルタンパク質をコードするｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってＲＮＡのナトリウムチャネルタンパク質への翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９のうちの１つまたは複数のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現をノックダウンし得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する。例えば、オリゴヌクレオチドの塩基の配列は、配列番号１～１０１のうちの１つと少なくとも９０％または９５％同一であってもよく、オリゴヌクレオチドは、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかにハイブリダイズし、それらのＲＮａｓｅ Ｈでの切断を誘導し得る。組成物は、それぞれが配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも８０、９０、９５、または１００％同一の塩基配列を有する複数の治療用オリゴヌクレオチドを含み得る。

本開示の治療用オリゴヌクレオチドは、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し得る。そのような治療用オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ塩基の中央領域（例えば、約８～１０個のＤＮＡ塩基）に隣接する２つのウィングを含み得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端は、修飾ＲＮＡ塩基、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（「２’－ＭＯＥ」）および／または２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（「２’Ｏ－Ｍｅ」）の任意の数または任意の組み合わせを含む。さらに、本発明の組成物は、細胞質ｍＲＮＡ対核ｍＲＮＡを示差的に標的とするために、エクソン－エクソン接合部を標的とするように設計され得る。したがって、本発明のＡＳＯは、スプライシングの前または後にＲＮＡと相互作用し、組成物に特異性および汎用性を付加するように設計することができる。

治療用オリゴヌクレオチドは、髄腔内注射用に製剤化された溶液または担体中に、好ましくは約３～４回／年で提供され得る。オリゴヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、少なくとも約１３塩基、好ましくは約１５～２５塩基であってもよい。オリゴヌクレオチドは、骨格にホスホロチオエート結合を有していてもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされ、ヒトにおける任意の長い非コードＲＮＡまたは他のオフターゲット配列もしくは転写物について閾値マッチを満たさないと決定された塩基配列を有する。オリゴヌクレオチドは、非ヒト霊長類ゲノム中の相同セグメントとのミスマッチが０であり、げっ歯類ゲノム中の相同セグメント中のミスマッチが約５以下である塩基配列を有し得る。

組成物がインビトロで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達される場合、ＤＲＧニューロンは、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８またはＮａＶ１．９の用量依存的ノックダウンを示す。オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合された塩基を有する、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも９０％の一致を有する塩基配列を有するギャップマーであってもよい。結合は、すべてホスホロチオエートであっても、ホスホロチオエートとホスホジエステル結合との混合物であってもよい。オリゴヌクレオチドは、５’ウィングおよび３’ウィングに隣接する中央の１０個のＤＮＡ塩基をさらに有し得、５’ウィングおよび３’ウィングはそれぞれ、５個の連続する２’修飾ＲＮＡ塩基を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって連結された塩基を有する配列番号１～１４１のうちの１つと一致する塩基配列と、５’ウィングおよび３’ウィングに隣接する中央ＤＮＡ塩基を有する構造とを有する。ウィング中のＲＮＡ塩基および中央セグメント中のＤＮＡ塩基の数は、５－１０－５または４－１２－４、または同様の適切なパターンであってもよい。５’ウィングおよび３’ウィングはそれぞれ、いくつかの２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、中央の１０個のＤＮＡ塩基を有する各ウィング中に５個の連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基（「５－１０－５」構造）を有し得、中央ＤＮＡセグメント全体にホスホロチオエート結合があり、ウィング中にホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合の混合物がある。

組み合わせ実施形態では、本発明は、各々が上記の記載による複数の異なる治療用ギャップマーの複数のコピーを適切な製剤または担体中に含む組成物を提供する。

好ましくは、本開示のオリゴヌクレオチドは、対照ギャップマー（例えば、インビトロでＤＲＧニューロンを使用するアッセイでは、対照ギャップマーは、ホスホロチオエート結合のみによって連結されたＧＣＣＡＵＡＡＴＣＣＧＧＧＴＴＵＣＵＧＣ（配列番号１６５）からなり、５つの連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基の５’ウィングおよび５つの連続する２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基の３’ウィングに隣接する中央の１０個のＤＮＡ塩基をさらに含む）よりも少なくとも２５％良好なＮａＶノックダウンを示す。

本開示の態様は、患者の疼痛を処置するための医薬品を製造するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を提供する。使用において、ＡＳＯは、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、例えば９５％または１００％の同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５～２５塩基長、好ましくは約１８～２２塩基長または約１９～２１塩基長（両端を含む）のＡＳＯを使用する。一般に、「ＡＳＯ」への言及は、実質的に同一の分子の多数のコピーを含む。したがって、「ＡＳＯ」は、示されたＡＳＯの任意の数、例えば数十万または数百万のコピーであってもよい。好ましい実施形態では、ＡＳＯは、２０塩基長であり、配列番号１～１４１のうちの１つの配列を有し、疼痛を処置するための医薬品の製造に使用される。ＡＳＯは、例えば、微量遠心管または試験管などの管内で凍結乾燥されたもの、または管内で溶液になったものなど、任意の適切な形式で提供されてもよい。使用の好ましい実施形態は、ＮａＶ１．７および／またはＮａＶ１．８を標的とする。１またはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、または５またはそれを超える）ＡＳＯを医薬品の製造に使用することができる。１またはそれを超えるＡＳＯは、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ中の標的にハイブリダイズし得る。使用の特定の実施形態では、ＡＳＯ中の塩基の配列は、配列番号１～１０１のうちの１つと少なくとも９０％同一である。実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメント、例えば中央領域の両側に５個の修飾ＲＮＡ塩基を有する１０個のＤＮＡ塩基の中央領域を有するギャップマー構造を有し得る。各修飾ＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥであってもよい。好ましくは、ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合を有し、例えば、使用実施形態では、糖結合の大部分またはすべてがホスホロチオエートであってもよい。対応する医薬品は、髄腔内送達のために製剤化され得る。したがって、ＡＳＯは、最初は注射またはポンプによる導入に適した製剤への混合に適した形態であってもよい。例えば、ＡＳＯ（１つのＡＳＯの数千または数百万またはそれを超えるコピー）は、管内で凍結乾燥されてもよく、または既知のモル濃度もしくは濃度の溶液であってもよい。ＡＳＯは、溶媒および／または賦形剤などの担体がＡＳＯを含む薬学的に許容され得る組成物に溶解または希釈されてもよく、ＩＶバッグ、シリンジ、またはポンプに装填されてもよい。医薬品は、２つ以上のＡＳＯ、例えば２、３、４、または５、またはそれを超える任意の組み合わせを使用して作成され得る。本発明の組成物中の塩基は、本発明の組成物の幅および有効性を増加させるために修飾されてもよく、またはゆらぎ塩基が使用されてもよい。一例では、本発明で使用するためのＡＳＯは、メチル化塩基（例えば、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル（チミン）など）を含有し得る。

本発明の組成物は、連続投与に対応するように製剤化され得る。例えば、製剤は、最適な治療ウィンドウを利用し、ＡＳＯ間の潜在的な競合を回避するために、２またはそれを超える別々の時間に、および必要に応じて２またはそれを超える異なるＡＳＯと共に投与される投与量を提供し得る。さらに、本発明の組成物は、連続的に投与されるか否かにかかわらず、関与するＡＳＯの組成に応じて、２つ以上の標的と相互作用し得る。例えば、ＡＳＯは、複数の標的（ｍＲＮＡおよびｐｒｅ－ｍＲＮＡ種の内部および全体の両方）との相互作用を可能にし、したがって関連する処置が２つ以上のチャネルに影響を及ぼすことを可能にする標的化ミスマッチを含み得る。

図１は、疼痛を処置するための組成物を示す。 図２は、ギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチドを示す。 図３は、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾リボース糖を示す。 図４は、ＤＮＡのセグメント中のホスホロチオエート結合を示す。 図５は、１７の異なるＡＳＯによるＮａＶ１．７のノックダウンのためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す。 図６は、対照と比較したＮａＶ１．７標的化ＡＳＯの効果を示す。 図７は、本開示のＡＳＯの標的選択性を示す。 図８は、ＡＳＯに対するリボース糖修飾の効果を比較する。 図９は、抗ＮａＶ１．７ ＡＳＯの効果を示す。 図１０は、抗ＮａＶ１．８ ＡＳＯの効果を示す。 図１１は、組み合わせ組成物による処置下での神経活性レベルを示す。 図１２は、本開示のＡＳＯが複数のＮａｖ標的の強力かつ選択的なノックダウンを提供することを示す。 図１３は、どのＮａｖチャネルが神経活動の閾値、閾値未満および閾値を超える興奮性に実質的または主に関与しているかを示す。

詳細な説明
図１は、疼痛を処置するための組成物１０１を示す。組成物１０１は、ｍＲＮＡ１１７またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ中の標的セグメント１１５にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド１０７を含む。ｍＲＮＡ１１７はナトリウムチャネルタンパク質をコードする。標的を含むｍＲＮＡ１１７のセグメント１１５は、配列番号１～１４１のうちの１つに少なくとも約７５％相補的である。ｍＲＮＡ１１７のセグメント１１５へのオリゴヌクレオチド１０７のハイブリダイゼーションは、ナトリウムチャネルタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を妨げる。オリゴヌクレオチド１０７は、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９のうちの１つまたは複数のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現をノックダウンし得る。好ましくは、オリゴヌクレオチド中の塩基の配列は、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。

特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの塩基の配列は、配列番号１～１０１のうちの１つと少なくとも９０％同一であり、オリゴヌクレオチドは、ＮａＶ１．７のｍＲＮＡまたはＮａＶ１．８のｍＲＮＡのいずれかにハイブリダイズし、そのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導することができる。

オリゴヌクレオチド１０７がｍＲＮＡ１１７の標的セグメント１１５に対して実質的にまたは完全にアンチセンスであるので、オリゴヌクレオチド１０７はｍＲＮＡ１１７のセグメント１１５にハイブリダイズする。その意味で、組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む。組成物１０１は、ＡＳＯの化学構造および設計に基づいて、塩基対相補性で標的ＲＮＡに結合し、様々な効果を発揮するＡＳＯを含む。神経疾患の前臨床モデルおよびヒト臨床試験開発で一般的に使用される様々な機構を使用することができる。これらの機構には以下のＲＮａｓｅ Ｈ酵素の動員によるＲＮＡ標的分解、エクソンを含むかまたは排除するための選択的スプライシング修飾、およびその標的へのｍｉＲＮＡ結合を阻害するためのｍｉＲＮＡ阻害が含まれる。

本開示の好ましい実施形態は、電位依存性ナトリウムチャネル（ＮａＶチャネル）のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ酵素を動員するＡＳＯを含む。ＲＮａｓｅ Ｈ酵素は、ＮａＶチャネルＲＮＡを切断し、ＮａＶチャネルタンパク質の発現を下方制御する。したがって、本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、疼痛治療の標的としてＮａＶチャネルに対処する。本開示は、臨床データおよび前臨床データが疼痛治療のための小分子ＮａＶ遮断薬の使用を支持するという洞察に基づいている。例えば、ＩＶリドカインおよびリドカインパッチは疼痛緩和効果を示しており、リドカイン標的の合成の遮断が同様の効果をもたらし得ることを示唆している。実際、神経因性疼痛に使用される三環系および選択的セロトニン再取り込み阻害剤などの多くの薬剤は、複数の作用機序を有するが、ＮａＶチャネルを遮断する能力を共有する。ナトリウムチャネルＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９は疼痛に関与している。これらのタンパク質は、疼痛表現型との遺伝的リンクを提供する。例えば、ＮａＶ１．７機能喪失は、疼痛に対する先天性不感受性に関連している（マウスモデルで再現される）。さらに、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８の機能獲得は両方とも過剰な疼痛障害に関連している。さらに、ＮａＶ１．９機能獲得は、疼痛に対する無関心を伴う神経障害に関連している。遺伝的洞察により、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９を選択的に標的とするための理論的根拠が提供される。抗ＮａＶ ＡＳＯを含む組成物を対象に投与して、疼痛を処置または軽減することができる。抗ＮａＶ ＡＳＯは状態に依存せず、サブタイプ選択性であってもよいので、抗ＮａＶ ＡＳＯはリドカインなどの他のアプローチよりも利点を提供することが見出され得る。

したがって、本開示の態様は、患者の疼痛を処置するための医薬品を製造するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用を提供する。使用において、ＡＳＯは、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも約７５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、例えば９５％またはそれを超える同一性を有する。好ましい実施形態は、約１５～２５塩基長、好ましくは約１８～２２塩基長（両端を含む）のＡＳＯを使用する。一般に、「ＡＳＯ」への言及は、実質的に同一の分子の多数のコピーを含む。したがって、「ＡＳＯ」は、定義されたＡＳＯの数十万または数百万を超えるコピーであってもよい。好ましい実施形態では、ＡＳＯは、２０塩基長であり、配列番号１～１４１のうちの１つの配列を有し、疼痛を処置するための医薬品の製造に使用される。ＡＳＯは、例えば、微量遠心管または試験管などの管内で凍結乾燥されたもの、または管内で溶液になったものなど、任意の適切な形式で提供されてもよい。使用の好ましい実施形態は、ＮａＶ１．７および／またはＮａＶ１．８を標的とする。１またはそれを超える（例えば、２つ、３つ、４つ、または５またはそれを超える）ＡＳＯを医薬品の製造に使用することができる。１またはそれを超えるＡＳＯは、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８のｍＲＮＡ中の標的にハイブリダイズし得る。使用の特定の実施形態では、ＡＳＯ中の塩基の配列は、配列番号１～１０１のうちの１つと少なくとも９０％同一である。使用の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメント、例えば中央領域の両側に５個の修飾ＲＮＡ塩基を有する１０個のＤＮＡ塩基の中央領域を有するギャップマー構造を有し得る。各修飾ＲＮＡ塩基は、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、または他の適切な糖であってもよい。好ましくは、ＡＳＯの骨格は、複数のホスホロチオエート結合を排他的に有するか、またはホスホジエステル結合も含み、例えば、使用実施形態では、糖結合の大部分またはすべてがホスホロチオエートであってもよい。医薬品は、髄腔内（ＩＴ）送達のために製剤化され得る。したがって、ＡＳＯは、最初は髄腔内ポンプへの導入に適した製剤への混合に適した形態であってもよい。例えば、ＡＳＯ（１つのＡＳＯの数千または数百万またはそれを超えるコピー）は、管内で凍結乾燥されてもよく、または既知のモル濃度の溶液であってもよい。ＡＳＯは、溶媒または賦形剤などの担体がＡＳＯを含む薬学的に許容され得る組成物に溶解または希釈されてもよく、ＩＶバッグ、シリンジ、または髄腔内ポンプに装填されてもよい。医薬品は、２つ以上のＡＳＯ、例えば２、３、４、または５、またはそれを超える任意の組み合わせを使用して作成され得る。

使用実施形態に記載された任意のＡＳＯは、本開示の組成物に含まれてもよい。本開示の組成物の好ましい実施形態は、それぞれが配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも８０％同一の塩基配列を有する１または複数の治療用オリゴヌクレオチドを含み、治療用オリゴヌクレオチドの各々は、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し、複数の治療用オリゴヌクレオチドは、髄腔内注射用に製剤化された溶液または担体中に提供される。

図２は、ギャップマー構造を有するオリゴヌクレオチド２０７を示す。オリゴヌクレオチド２０７は、約１０個のＤＮＡ塩基の中央領域２２１に隣接する２つのウィング（第１のウィング２１５および第２のウィング２１６）を含む。好ましい実施形態では、ウィング２１５、２１６は、すべてまたは主にＲＮＡ塩基であり、中央領域２２１は、すべてまたは主にＤＮＡ塩基である。好ましくは、ウィングはすべてＲＮＡ塩基（修飾または非修飾）であり、中央領域はすべてＤＮＡ塩基である。いくつかの実施形態では、各ウィングは、５個のＲＮＡ塩基からなり、その全部または大部分は修飾ＲＮＡ塩基であり、例えば、各修飾ＲＮＡ塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群から選択される。修飾ＲＮＡ塩基は、リボース糖の２’ヒドロキシル基上の置換を含み得る。

図３は、ＲＮＡ塩基に含まれ得る２’－Ｏ－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）修飾された糖を示す。

オリゴヌクレオチド２０７は、好ましくは少なくとも約１５塩基を含み、約１５～約２５塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド２０７は、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する。

図４は、オリゴヌクレオチド２０７の中央領域２２１などのＤＮＡのセグメントの骨格内のホスホロチオエート結合５０５を示す。オリゴヌクレオチド２０７は、１または任意の数のホスホロチオエート結合５０５を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチド２０７内のすべての骨格結合は、ホスホロチオエートであってもよく、または大部分、または約半分がホスホロチオエートであってもよい。

組成物１０１は、送達のために製剤化され得る。したがって、オリゴヌクレオチド１０７は、最初は、シリンジ、バッグ、または注射ポンプへの導入に適した製剤への混合に適した形態であってもよい。例えば、オリゴヌクレオチド１０７（１つのオリゴヌクレオチド１０７の数千または数百万またはそれを超えるコピー）は、管内で凍結乾燥されてもよく、または既知のモル濃度の溶液であってもよい。オリゴヌクレオチド１０７は、溶媒または賦形剤などの担体がオリゴヌクレオチド１０７を含む薬学的に許容され得る組成物に溶解または希釈されてもよく、ＩＶバッグ、シリンジ、または髄腔内ポンプに装填されてもよい。記載されるように、組成物１０１は、配列番号１～１４１のうちの１つとの比較によって定義される配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド１０７を含む。したがって、本開示の組成物は、同定された標的によって定義および例示される。

具体的には、オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～１４１のうちの１つに少なくとも約７５％相補的なｍＲＮＡのセグメントに沿ってナトリウムチャネルタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズし、それによってｍＲＮＡのナトリウムチャネルタンパク質への翻訳を防止する。これは、オリゴヌクレオチドが配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも約７５％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％または９５％の同一性を有する場合に達成される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～１４１のうちの１つの配列を有するが、当業者は、相補的な標的に対して９０％または好ましくは９５％の同一性を有するオリゴヌクレオチドが依然として標的に配列特異的にハイブリダイズする傾向があることを理解するであろう。二本鎖構造を形成することは、ワトソン－クリック型塩基対形成および塩基スタッキングによって十分にエネルギー的に有利であり、二本鎖構造は、およそ１０個ごとに約１個のミスマッチ塩基対を許容することができる。したがって、ＤＲＧニューロンにおける中程度にストリンジェントな生理学的条件下では、特に、オリゴヌクレオチドを酵素分解から保護するためにオリゴヌクレオチドが少なくとも数個の修飾ＲＮＡ塩基またはホスホロチオエート骨格結合を有するギャップマー構造を有する場合、９５％の同一性が有効であるはずである。

実際、本開示の組成物の特徴および利点は、ナトリウムチャネル転写物以外の補完物が分子中に存在する配列を除外するために標的（配列番号１～１４１）がスクリーニングされていることである。例えば、長い非コードＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）を含むＲＮＡ転写物のデータベースに対して配列をスクリーニングし、非標的配列と一致する初期配列を除外した。したがって、患者に投与した場合の配列番号１～１４１の配列を有するＡＳＯは、非標的配列にハイブリダイズする可能性を最小限に抑えるべきである。したがって、好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド１０７は、スクリーニングされ、ヒトにおける任意のオフターゲットコードまたは長い非コードＲＮＡについての閾値マッチを満たさないと決定された塩基配列を有する。上記の基準を満たす組成物または使用は、含まれる配列がＩｎｃＲＮＡのデータベースに対してスクリーニングされているので、インビボでＩｎｃＲＮＡなどのオフターゲット物質に結合しないはずである。本開示の配列は、標的特異性についてスクリーニングされている。好ましくは、オリゴヌクレオチド１０７は、ヒトまたは非ヒト霊長類ゲノム中の相同セグメントとのミスマッチが０であり、げっ歯類ゲノム中の相同セグメント中のミスマッチが約５以下である塩基配列を有する。

組成物がインビトロで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達される場合、ＤＲＧは、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８またはＮａＶ１．９の用量依存的ノックダウンを示す。

図５は、本開示の実施形態に従って設計された１７個の異なるＡＳＯ（各３つの濃度）によるラットにおけるＮａＶ１．７のノックダウンのためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す（２０塩基、ＡＳＯを介した２’－Ｏ修飾ＲＮＡおよびホスホロチオエート結合を有するＲＮＡウィングに隣接する１０塩基のＤＮＡ中央領域）。図の下部に沿って、「開始位置」、すなわちラットＳＣＮ９Ａ ｍＲＮＡ内の位置が示されている。最も右側の３つのバーは、対照のみを投与した場合の発現レベルを示す。１７個すべてのＡＳＯは、少なくとも最高濃度で、対照と比較してＮａＶ１．７発現を減少させた。位置１２９４から始まる２０塩基標的に特異的なＡＳＯについて、最も強いノックダウンが示された。グラフは、ＧＡＰＤＨに対して正規化された発現レベルで、ジムノシス送達を使用してＤＩＶ８で適用された１７個のＡＳＯ、３つの濃度の結果を示す。グラフは、本開示の組成物１０１がＮａＶ１．７の用量依存的ノックダウンを示すことを示している。

核酸ハイブリダイゼーションはミスマッチに対するいくらかの許容性を有するので、ホスホロチオエート結合によってのみ連結された塩基を有する、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも９０％の一致である塩基配列を有し、オリゴヌクレオチド１０７が５’ウィングおよび３’ウィングに隣接したＤＮＡ塩基の中央セグメント（例えば、５’ウィングおよび３’ウィングがそれぞれ、１０個のＤＮＡ塩基に隣接する５個の連続する２’修飾ＲＮＡ塩基を含む５－１０－５構造、または４－１２－４構造、または同様のもの）を有するオリゴヌクレオチド１０７は、チャートに示されるパターンに従って用量依存的ノックダウンを示すことが見出され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド１０７は、具体的には、配列番号１～１４１（より好ましくは、配列番号１～１０１のうちの１つ）のうちの１つと一致する塩基配列を有し、塩基は、ホスホロチオエート結合（必要に応じて、ウィング中にいくつかのホスホジエステル結合を有する）によって結合されており、オリゴヌクレオチド１０７は、５’ウィングおよび３’ウィングに隣接する中央の１０個のＤＮＡ塩基を有し、５’ウィングおよび３’ウィングはそれぞれ、５個の連続する２’ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む。

図６は、対照と比較したラットＤＲＧニューロンにおけるＤＩＶ１４でのｍＲＮＡ発現に対するＮａＶ１．７標的化ＡＳＯの効果を示す。本開示の組成物１０１は、髄腔内投与のために製剤化された担体中に、前述の主張のいずれか一項に記載の複数の異なる治療用ギャップマーの複数のコピーを含み得ることに留意されたい。好ましくは、任意の１またはそれを超えるオリゴヌクレオチド１０７は、インビトロでＤＲＧを使用するアッセイにおいて対照ギャップマーよりも少なくとも２５％良好なＮａＶノックダウンを示し、候補オリゴヌクレオチドおよび対照は、ホスホロチオエート結合によって大部分が連結されるか、またはホスホロチオエート結合によってのみ連結され、２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基の５’ウィングおよび２’－ＭＯＥ ＲＮＡ塩基の３’ウィングに隣接するＤＮＡ塩基の中央セグメントを含む。

これらの組成物はナトリウムチャネルの発現をノックダウンするのに有効であるので、本開示の組成物は、重度の難治性疼痛を経験する患者集団を処置するために使用され得る。本開示の方法は、投与を必要とする患者に本開示の任意の組成物を投与し、それにより癌性疼痛（例えば、転移性骨癌に由来する）もしくは神経因性疼痛（例えば、機能獲得型ＮａＶ変異に関連する小線維性神経障害）または他の集団を処置または緩和することを含む。本開示の方法は、任意のＮａＶチャネルを一次標的として標的にするために使用することができ、二次標的のためのオリゴをさらに含み得る。例えば、一次標的はＮａＶ１．７（オリゴが、配列番号１～５３のうちの１またはそれを超えるものと実質的な同一性を有する）であってもよく、二次標的はＮａＶ１．８および／またはＮａＶ１．９（オリゴが、それぞれ配列番号５４～１０１および／または配列番号１０２～１４１のうちの１またはそれを超えるものと実質的な同一性を有する）であってもよい。

図７は、ラットＤＲＧにおいてｑＰＣＲによって試験したラットＮａＶ標的ＡＳＯの選択性を示す。上部パネルは、ＮａＶ１．７に特異的なＡＳＯを送達した場合のｍＲＮＡレベルに対する効果を示す。中央のパネルは、ＮａＶ１．８に特異的なＡＳＯを送達する効果を示し、下部パネルはＮａＶ１．９に特異的なＡＳＯを送達する効果である。すべてのパネルにおいて、バーの４番目の三つ組は、４５０ｎＭカクテルＡＳＯ（１５０ｎＭ ＮａＶ１．７ ＡＳＯ＋１５０ｎＭ ＮａＶ１．８ ＡＳＯ＋１５０ｎＭ ＮａＶ１．９ ＡＳＯ）を送達した場合の結果を提供する。各パネルにおいて、非標的ＮａＶチャネルはＡＳＯによってノックダウンされなかった（Ｎａｖ１．７ ＡＳＯは、ＮａＶ１．８またはＮａＶ１．９などの発現をノックダウンせず、標的選択性を示した）。３つのオリゴヌクレオチド１０７のカクテルは、３つの標的すべてをノックダウンすることが示されている。

図８は、本開示のオリゴヌクレオチド１０７内のリボース糖修飾の効果を比較する。ヒトＳＣＮ９Ａ遺伝子の位置１２９４から始まる２０塩基と一致する２０塩基配列を有するオリゴヌクレオチド１０７（配列番号６）を、２’－Ｏ－メチル－（ＯＭｅ）リボース糖修飾を有する形態および２’－Ｏ－メトキシエチル－（ＭＯＥ）リボース糖修飾を有する形態で試験した。配列番号１６５の対照オリゴに対して同様の試験を行った。本開示のオリゴヌクレオチドは対照よりも優れており、また示されるように、ＭＯＥ修飾はＯＭｅ修飾よりも優れている（標的相対発現のより大きな阻害を示す）ことが見出された。したがって、本開示のオリゴヌクレオチドがＲＮＡリボース糖に１またはそれを超える２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾を含むことが好ましい場合がある。例えば、ＡＳＯは、それぞれ約５個のＲＮＡ塩基の５’および３’ウィングを有してもよく、それらのウィングでは、ほとんどまたはすべてのリボース糖が２’ＭＯＥであってもよい。

Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．８ ＡＳＯの併用効果をインビトロでラットＤＲＧニューロンにおいて試験した。インビトロでのニューロンには、光刺激下で神経活性化を提供する光遺伝学的構築物（例えば、光に応答してニューロンを発火させる改変藻類チャネルロドプシン）および神経活性の光学的レポーター（ニューロン膜電位に比例して光を放出し、ニューロン活性のシグナルを生じる修飾アーキロドプシン）が含まれた。インビトロでのニューロンを蛍光顕微鏡装置でアッセイし、インビボでの疼痛の経験と同様の方法でＤＲＧニューロンを発火させる刺激物質として働く疼痛メディエータ組成物（例えば、シミュレートされた「癌性疼痛スープ」）で処理した。任意の適切な光遺伝学的構築物、光遺伝学的顕微鏡、または疼痛メディエータ組成物が使用され得る。例えば、適切な光遺伝学的構築物としては、参照により組み込まれる、米国特許第９，５９４，０７５号に記載されているものが挙げられる。適切な光遺伝学的顕微鏡としては、参照により組み込まれる、米国特許第１０，２８８，８６３号に記載されているものが挙げられる。適切な疼痛メディエータ組成物としては、参照により組み込まれる、国際公開第２０１８／１６５５７７号に記載されているものが挙げられる。

インビトロでのＤＲＧアッセイは、増加する光刺激下で、光遺伝学的神経試料単独からの光を測定することを含む。これにより、神経興奮性の基準値が得られる。次いで、神経試料を刺激物質、ここではサイトカイン、プロテアーゼ、ｐＨ、壊死因子、または有痛性腫瘍の部位でインビボで見られ得る他の因子の混合物を含む疼痛メディエータ組成物で刺激する。その刺激物質で処理している神経試料から光を測定する。最後に、神経試料を本開示の組成物で処理する。刺激物質が測定された興奮性を測定されたベースラインから遠ざける場合、オリゴヌクレオチド１０７は、測定された興奮性をベースラインに向かって回復させる傾向があると仮定される。さらに、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８は、異なる（重複するが）神経活性条件下でそれらの効果を示すことが予想される。結果は、抗ＮａＶ１．７および抗ＮａＶ１．８ ＡＳＯを組み合わせると、個々のＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８ ＡＳＯと比較して、より多くの量およびより広い範囲の入力刺激レベルにわたって、有痛性刺激物質に対する神経応答を緩和することを示している。

図９は、ベースライン、刺激物質での処理下、ならびに刺激物質および抗ＮａＶ１．７ ＡＳＯでの処理下での青色光刺激の増加勾配に応答した神経活性の測定レベルを示している。予想されるように、ＮａＶ１．７ ＡＳＯは、刺激物質に応答して示される神経興奮性を減少させる。

図１０は、ベースライン、刺激物質での処理下、ならびに刺激物質および抗ＮａＶ１．８ ＡＳＯでの処理下での青色光刺激の増加勾配に応答した神経活性の測定レベルを示している。予想されるように、ＮａＶ１．８ ＡＳＯは、入力刺激力の異なる領域ではあるが、刺激物質に応答して示される神経興奮性を減少させる。

図１１は、ベースライン、刺激物質での処理下、ならびに刺激物質と抗ＮａＶ１．７ ＡＳＯおよび抗ＮａＶ１．８ ＡＳＯを含む組成物での処理下での青色光刺激の増加勾配に応答した神経活性の測定レベルを示している。オリゴの組み合わせの正味の疼痛軽減効果は、いずれかのオリゴ単独よりも良好である。ＤＲＧニューロンの活性レベルは、入力刺激の全範囲にわたって有意に低い。様々な有痛性症状を経験して生きている対象は、異なるＮａＶチャネルを標的とする異なるオリゴを含む組成物を投与することによって、鎮痛効果のより大きな範囲および効力によって利益を得ることが見出され得る。

本開示の方法および組成物は、疼痛に罹患している患者においてインビボで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに本明細書に記載の治療用オリゴヌクレオチド１０７を送達するために有益に使用され得る。例えば、全身送達（例えば、注射によって）または局所送達（例えば、皮下注射または徐放装置の埋め込みによって）を含む任意の適切な送達アプローチが使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物１０１は、髄腔内注射によって送達される。本開示の方法は、約数ヶ月ごと、例えば約３回または４回／年の髄腔内注射によって本開示の組成物を送達することを含み得る。

髄腔内注射とは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達し、脊髄麻酔、化学療法、または疼痛管理用途に有用であるように、脊柱管内またはくも膜下腔内への注射を介した薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、組成物が血液脳関門によって停止されるのを回避する。好ましくは、組成物１０１は、標準的な注射用薬物調製物に時折見られる防腐剤または他の潜在的に有害な不活性成分を含有しないように、そのような製剤に配合される。組成物１０１は、髄腔内ポンプで提供されてもよく、または髄腔内ポンプを介した送達のための診療所での再構成に適した製剤で提供されてもよい。例えば、組成物１０１は、規定の濃度で溶液（例えば、生理食塩水中）中にあってもよい。技術者は、濃縮物を診療所で適切な希釈剤と混合して送達することができる。他の実施形態では、ＡＳＯは、凍結乾燥されるか、そうでなければ乾燥固体形態で保存され、診療所で再懸濁され、適切に希釈される。髄腔内送達は、ＰＫ、代謝、末梢オン／オフターゲット効果に関する懸念を軽減する。髄腔内投与アプローチは、ジコヌクレオチドなどの他の薬物およびヌシネルセンなどのＡＳＯとの臨床使用について検証されている。そのような方法は、本開示の組成物１０１を神経系に直接送達するために使用され得る。

組成物１０１中のギャップマー、ＡＳＯ、または治療用オリゴヌクレオチド１０７などの本開示のオリゴヌクレオチドは、表１に示される配列の１つを参照して定義される配列を有し得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、表１に示す配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、または完全に同一の配列を有し得る。ＳＣＮ９Ａに対する最も好ましい実施形態には、以下のようにラベル付けされた表１の実施形態が含まれる。「４／６」（配列番号６）、「４／１０」（配列番号１０）、および「４／１１」（配列番号１１）。これらの３つの候補は、用量依存的様式でＮａＶ１．７の強力で有意なノックダウン活性（７５％超）を示す。ＳＣＮ１０Ａに対する最も好ましい実施形態には、以下のようにラベル付けされた表１の実施形態が含まれる。「５／８」（配列番号６１）、「５／１８」（配列番号７１）、「５／２０」（配列番号７３）。これらの３つの候補は、用量依存的様式でＮａＶ１．８の強力で有意なノックダウン活性（６５％超）を示す。ＳＣＮ１１Ａに対する最も好ましい実施形態には、以下のようにラベル付けされた表１の実施形態が含まれる。「６／１」（配列番号１０２）、「６／３」（配列番号１０４）、および「６／６」（配列番号１０７）。これらの３つの候補は、用量依存的様式でＮａＶ１．９の強力で有意なノックダウン活性（７０％超）を示す。

上で論じられたように、ベースライン、刺激物での処理下、ならびに刺激物質と抗ＮａＶ１．７ ＡＳＯおよび抗ＮａＶ１．８ ＡＳＯを含む組成物での処理下での神経活性の測定レベルは、オリゴの組み合わせがオリゴ単独よりも良好に機能することを示している。本明細書に開示されるように、ＳＣＮ９Ａ（別名ＮａＶ１．７）に対する最も好ましい実施形態は、配列番号６、配列番号１０、または配列番号１１のうちの１つを有するものを含む。ＳＣＮ１０Ａ（別名ＮａＶ１．９）に対する最も好ましい実施形態は、配列番号６１、配列番号７１、または配列番号７３のうちの１つを有するものを含む。したがって、本開示の最も好ましい組み合わせの実施形態は、疼痛を処置するための組成物を含む。組成物は、配列番号６、配列番号１０、および配列番号１１のうちの１つに少なくとも約９０％相補的なｍＲＮＡのセグメントに沿ってナトリウムチャネルタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズする第１のオリゴヌクレオチド、ならびに配列番号６１、配列番号７１、および配列番号７３のうちの１つ少なくとも約９０％相補的なｍＲＮＡのセグメントに沿ってナトリウムチャネルタンパク質をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズする第２のオリゴヌクレオチドを含む。好ましい組み合わせの実施形態では、治療用オリゴヌクレオチドの各々は、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し得る。

ウィングのいずれかまたは両方は、修飾ＲＮＡ塩基を含んでもよく、例えば、両方のウィングは、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース修飾を有する５個の連続したＲＮＡ塩基を含み得る。各オリゴヌクレオチドの全体は、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合または当業者には明らかである他の結合を介して連結されていてもよい。好ましくは、複数の治療用オリゴヌクレオチドは、髄腔内注射のために診療所で希釈または再構成するために、凍結乾燥または溶液で提供される。すなわち、１またはそれを超える管に包装された凍結乾燥または溶液中のものは、少なくとも数千～数百万コピーの第１のオリゴヌクレオチドおよび少なくとも数千～数百万コピーの第２のオリゴヌクレオチドである。図１１によって実証されるような効果を示すように、組成物のこの好ましい組み合わせの実施形態は、疼痛の処置のための非オピオイド治療薬として予想外の利益を有することを証明することができる。

他の特徴および実施形態は、本開示の範囲内である。本開示の実施形態は、ＮａＶ１．７および／またはＮａＶ１．８を発現している細胞においてＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８の発現を阻害することができる、ＳＣＮ９ＡまたはＳＣＮ１０Ａを標的とするロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、疼痛の予防または処置に使用され得る。本発明はさらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのヒトＮａＶ１．７のオリゴヌクレオチド阻害剤、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ剤によって標的化され得るヒトＮａＶ１．７ｐｒｅ－ｍＲＮＡ上の有利な標的部位配列を提供する。

本発明は、ヒトＮａＶ１．７標的核酸およびヒトＮａＶ１．８標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有し、細胞内のＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８の両方の発現を阻害することができる、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチド１０７は、配列番号１～１４１のいずれかと１００％同一であってもよいか、または少なくとも９０％同一である。

実施形態は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または本発明によるコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を含む。

本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。

本発明は、薬剤に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬塩もしくは組成物を提供する。

本発明は、疼痛の処置または予防または緩和に使用するための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬塩もしくは組成物を提供する。本発明は、疼痛を処置、予防または緩和するための医薬品を調製するための、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは本発明のコンジュゲート、または本発明の医薬塩もしくは組成物の使用を提供する。

いくつかの実施形態では、疼痛は、慢性疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、または侵害受容性疼痛である。

オリゴヌクレオチドは、一般に、固相化学合成とそれに続く精製および単離によって実験室で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分またはその修飾の配列または順序が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工のもの、すなわち化学的に合成されたものであってもよく、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１またはそれを超える修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドを含み得る。

修飾ヌクレオチドは、独立して、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、立体配座制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、非天然塩基含有ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣物を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２’－０－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

ＡＳＯの窒素塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基、ならびに置換プリンまたは置換ピリミジンなどの非天然変異体、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ（ｔｈｉｏｚｏｌｏ）－シトシン、５－プロピニル－シトシン、５－プロピニル－ウラシル、５－ブロモウラシル、５－チアゾロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、２’チオ－チミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される核酸塩基であってもよい。

核酸塩基部分は、各対応する核酸塩基、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵの文字コードによって示されてもよく、各文字は、必要に応じて同等の機能の修飾核酸塩基を含み得る。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。必要に応じて、ＬＮＡギャップマーの場合、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用してもよい。

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、ナトリウムチャネル（ＮａＶ１．７、１．８または１．９）の発現を下方制御する（阻害する）ことができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、阻害または下方制御することによって、標的の発現を調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常発現レベルと比較して少なくとも２０％の発現の阻害、より好ましくは標的の正常発現レベルと比較して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の阻害をもたらす。

本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、例えばｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングの調節を介して、標的核酸のレベルを（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を介して）低下させ得るか、または標的核酸の機能性を低下させ得る（または機能性を変化させ得る）。

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合、糖部分の修飾を有する１またはそれを超えるヌクレオシドを含み得る。主に、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善する目的で、リボース糖部分を修飾した多数のヌクレオシドが作製されている。そのような修飾には、リボース環構造が、例えば、典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間に架橋を有するヘキソース環（ＨＮＡ）、もしくは二環式環、または典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非連結リボース環（例えば、ＵＮＡ）での置換によって修飾されるものが含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシドも含まれる。

糖修飾にはまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドに天然に見られる２’－ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位に導入され得る。

オリゴヌクレオチドは、１またはそれを超えるロックド核酸（ＬＮＡ）塩基を含み得る。ＬＮＡは、リボース環の立体配座を制限またはロックする、当該ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するビラジカル（２’－４’ブリッジとも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドを含み得る。これらのヌクレオシドはまた、文献では架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対してＬＮＡがオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、リボースの立体配座のロックは、ハイブリダイゼーションの増強された親和性（二重鎖安定化）に関連する。これは、オリゴヌクレオチド／補完物二重鎖の融解温度を測定することによって日常的に決定することができる。非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号および国際公開第２００８／１５０７２９号に開示されており、これらはすべて参照により組み込まれる。

本開示のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容され得る塩には、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない塩が含まれる。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、スルホン酸、またはサリチル酸などの有機酸で形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製され得る。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂の塩が挙げられるが、これらに限定されない。

オリゴヌクレオチド１０７は、ナトリウムチャネルｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物のヌクレアーゼ媒介分解を媒介または促進し得る。ヌクレアーゼ媒介分解は、そのような配列と二重鎖を形成する際に相補的なヌクレオチド配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介分解を介して機能することができ、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅ Ｈなどのエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を動員することができる。ヌクレアーゼ媒介機構を介して作用するオリゴヌクレオチド設計の例は、典型的には少なくとも５個または６個の連続するＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシドによって片側または両側に隣接するオリゴヌクレオチド、例えばギャップマーである。アンチセンスオリゴヌクレオチド１０７のＲＮａｓｅ Ｈ活性とは、相補的ＲＮＡ分子との二重鎖にあるときにＲＮａｓｅ Ｈを動員する能力を指す。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド１０７またはその連続するヌクレオチド配列は、ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも呼ばれるギャップマーであってもよい。アンチセンスギャップマーは、一般に、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの異なる構造領域の５’－フランク、ギャップおよび３’－フランクであるＦ－Ｇ－Ｆ’を、「５→３」配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ Ｈを動員することを可能にする一続きの連続するＤＮＡヌクレオチドを含む。ギャップ領域は、１またはそれを超える糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’隣接領域（Ｆ）と、１またはそれを超える糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’隣接領域（Ｆ’）とに隣接している。領域ＦおよびＦ’における１またはそれを超える糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める（すなわち、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’における１またはそれを超える糖修飾ヌクレオシドは、２’糖修飾ヌクレオシドであり、ＬＮＡおよび２’－ＭＯＥから独立して選択されるものなどの高親和性２’糖修飾などである。

混合ウィングギャップマーは、ＬＮＡギャップマーであり、領域ＦおよびＦ’の一方または両方が２’置換ヌクレオシド、例えば２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’－フルオロ－ＡＮＡ単位、またはそれらの組み合わせからなる群から独立して選択される２’置換ヌクレオシドを含む。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。領域ＦおよびＦ’の少なくとも一方、または領域ＦおよびＦ’の両方が少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の残りのヌクレオシドは、２’－ＭＯＥおよびＬＮＡからなる群から独立して選択される。いくつかの混合ウィングの実施形態では、領域ＦおよびＦ’の一方または両方は、１またはそれを超えるＤＮＡヌクレオシドをさらに含み得る。ギャップマー設計は、いずれも参照により組み込まれる国際公開第２００８／０４９０８５号および国際公開第２０１２／１０９３９５号に論じられている。

１またはそれを超える非ヌクレオチド部分へのオリゴヌクレオチド１０７のコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込みまたは安定性に影響を及ぼすことによって、オリゴヌクレオチドの薬理学を改善し得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性および／または細胞取り込みを改善することによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改変または増強することができる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それによってその器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を高めることができる。コンジュゲートはまた、非標的細胞型、組織または器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば非標的細胞型、組織または器官におけるオフターゲット活性または活性を低下させるのに役立ち得る。

一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばキャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

本開示のオリゴヌクレオチド１０７は、上述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートもしくはその塩、ならびに薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントのいずれかを含む医薬組成物で提供され得る。薬学的に許容され得る希釈剤には、ＡＣＳＦ人工脳脊髄液が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水または滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの好ましい実施形態では、臨床用途のための希釈剤は、エリオットＢ溶液および／またはＡＣＳＦ人工脳脊髄液を含む。

いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中の溶液、例えばＰＢＳまたは炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した溶液の形態である。オリゴヌクレオチドは、溶液中に予め製剤化されてもよく、またはいくつかの実施形態では、投与前に薬学的に許容され得る希釈剤に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。適切には、例えば、オリゴヌクレオチドは、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、例えば１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解され得る。

本開示の組成物は、慢性疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、または侵害受容性疼痛などの疼痛の予防または処置のために患者に投与され得る。本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明のコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物は、局所鎮痛薬として使用するためのものであってもよい。

本発明のオリゴヌクレオチド、または本発明のコンジュゲート、塩もしくは医薬組成物によって処置され得る疼痛は、疼痛シグナルが末梢神経系にある疼痛であってもよい。末梢性の要素が大きい疼痛に関連する適応症としては、例えば、糖尿病性神経障害、癌、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛および術後神経痛が挙げられる。

本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、組成物または塩を使用して予防、処置または改善され得る疼痛は、例えば、遺伝性先端紅痛症（ＩＥＭ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、三叉神経痛、神経因性疼痛、慢性疼痛に関連する疼痛からなる群から選択され得るが、侵害受容性（例えば、神経の圧迫）、神経因性疼痛（例えば、糖尿病性神経障害）、内臓痛、癌性疼痛または混合疼痛の一般的な処置からも選択され得る。本発明は、慢性疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、癌性疼痛、または侵害受容性疼痛などの疼痛の予防または処置に使用するための本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、組成物または塩を提供する。

本開示は、疼痛に罹患しているか、または疼痛に罹患している可能性があるヒトなどの対象における疼痛を処置または予防する方法であって、治療上または予防上有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは医薬組成物を、癌性疼痛、変形性関節症性疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、または侵害受容性疼痛などの疼痛に罹患しているか、または疼痛に罹患している可能性がある対象に投与することを含み、オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１４１のうちの１つに相補的な配列を標的とする、方法を提供する。

二重ノックダウンの実施形態
本開示の実施形態は、複数の標的を介して疼痛を処置するための治療用組成物に関する。組成物は、配列番号１４２～１６４のうちの１つに少なくとも約７５％相補的なＲＮＡのセグメントに沿ったナトリウムチャネルタンパク質（例えば、ヒトＮａｖ１．７／Ｎａｖ１．８）の２つ以上の遺伝子からのＲＮＡにハイブリダイズし、それによってＲＮＡのナトリウムチャネルタンパク質への翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む。ただし、ＳＣＮ９ＡはＮａＶ１．７であり、ＳＣＮ１０ＡはＮａＶ１．８であり、ＳＣＮ１１ＡはＮａＶ１．９である。

オリゴヌクレオチドは、配列番号１４２～１６４（「ギャップマー」構造ではあるが、ＤＮＡコアおよびＲＮＡウィングを有する）のうちの１つと少なくとも８０％類似する配列を有し得る。オリゴヌクレオチドの外側ウィングは、例えば、大部分または全体が２－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）ＲＮＡ塩基で作成されている修飾ＲＮＡ化学を含み得る。好ましい実施形態は、ウィング内にいくつかの（例えば、２～４）ホスホジエステル結合を含み、他のすべての塩基間結合はホスホロチオエートである。例えば、第２、第３、第４、第１５および第１７の結合（配列に記載された方向）は、ホスホジエステルであってもよく、他はすべてホスホロチオエートである。特に、そのような実施形態では、最も外側の結合およびＤＮＡ塩基を含むすべての結合は、好ましくはホスホロチオエートであり、ＲＮＡ間結合のうちの３つが、２つまたは３ついずれかのホスホジエステル結合を含むように残る（残りはホスホロチオエートである）。好ましい実施形態では、組成物は、それぞれが配列番号１４２～１６４のうちの１つによって与えられる配列を有し、５－９－５（ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡ）ギャップマー設計を有する１またはそれを超えるオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｃｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）のコピーを含み、最も外側の塩基間結合およびＤＮＡ塩基を含むすべての結合はホスホロチオエートであり、各ウィングの他の３つのＲＮＡ間結合は２つまたは３ついずれかのホスホジエステル結合を含む（残りはホスホロチオエートである）。

配列番号１４２～１６４によって例示されるヒトＮａｖ１．７／Ｎａｖ１．８二重ノックダウン配列はそれぞれ、好ましくは、５×９×５の立体配置に従う１９ｍｅｒのＡＳＯギャップマー設計として提供され、９塩基のＤＮＡコアに５’および３’のＲＮＡ様ウィングを有する。好ましくは、５’および３’ウィングは、少なくとも実質的に２－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）化学の後に続き、骨格結合は、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）（例えば、最も外側の塩基間結合およびＤＮＡ塩基を含むすべての結合はＰＳであり、各ウィングの他の３つのＲＮＡ間結合は２つまたは３ついずれかのＰＳ結合を含み、残りはＰＯである）の混合物を含む。特定の実施形態では、ヒトＮａｖ１．７／Ｎａｖ１．８二重ノックダウンは、配列番号１４２～１６４のうちの１つによって与えられる配列を有するオリゴヌクレオチドおよび上記のギャップマー組成物を含む。

二重ノックダウン配列のうち、グループ１と呼ばれる第１の好ましい実施形態は、参照番号（標的コード／番号）４／６１～４／７１とも記載される配列番号１４２～１５２によって示される。グループ１の二重ノックダウンＡＳＯはすべて、ヒトＳＣＮ９Ａ転写物と１００％一致し、ヒトＳＣＮ１０Ａとのミスマッチは１ヌクレオチドのみである。グループ１の示された二重ノックダウンＡＳＯオリゴヌクレオチドは、９塩基のＤＮＡコアならびに５’および３’のＲＮＡ様ウィングを有する５－９－５ギャップマー設計を有する。５’および３’ウィングは、２－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）化学を含む。骨格は、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）の混合物を含み、例えば、第２、第３、第４、第１５および第１７の結合（配列に記載された方向）はＰＯであってもよく、他はすべてＰＳである。好ましくは、配列番号１４２～１５２のいずれかは、その骨格化学を有する。このグループ１の各配列は、ヒトＳＣＮ９ＡプレＲＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列に対するミスマッチが０個であり、ヒトＳＣＮ１０ＡプレＲＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列に対するミスマッチが１個である。

二重ノックダウン配列のうち、第２の好ましい実施形態は、グループ２と呼ばれ、参照番号（標的コード／番号）５／４９～５／６０とも記載される配列番号１５３～１６４によって示される。グループ２の二重ノックダウンＡＳＯはすべて、ヒトＳＣＮ１０Ａ転写物と１００％一致し、ヒトＳＣＮ９Ａとのミスマッチは１ヌクレオチドのみである。グループ２の示された二重ノックダウンＡＳＯオリゴヌクレオチドは、９塩基のＤＮＡコアに５’および３’のＲＮＡ様ウィングを有する５－９－５ギャップマー設計を有する。５’および３’ウィングは、２－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）化学を含む。骨格は、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）の混合物を含み、例えば、第２、第３、第４、第１５および第１７の結合（配列に記載された方向）はＰＯであってもよく、他はすべてＰＳである。好ましくは、配列番号１５３～１６４のいずれかは、その骨格化学を有する。このグループ２の各配列は、ヒトＳＣＮ９ＡプレＲＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列に対するミスマッチが１個であり、ヒトＳＣＮ１０ＡプレＲＮＡまたはｍＲＮＡの標的配列に対するミスマッチが０個である。

特定の二重ノックダウン実施形態では、本発明は、ヒトＮａＶ１．７標的核酸およびヒトＮａＶ１．８標的核酸に対して少なくとも９０％の相補性、例えば１００％の相補性を有し、細胞内のＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８の両方の発現を阻害することができる、１０～３０ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含む、１０～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを提供する。

図１２は、本開示のＡＳＯが複数のＮａｖ標的の強力かつ選択的なノックダウンを提供することを示している。図において、上のグラフは、２つの濃度で４つの異なるＡＳＯ（標識ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、およびＡＳＯ４）で処理した場合の、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．２と比較したＮａＶ１．７の比較発現レベルを示す。下のグラフは、２つの濃度で同じ４つの異なるＡＳＯ（標識ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、およびＡＳＯ４）で処理した場合の、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．２と比較したＮａＶ１．８の比較発現レベルを示す。

上部パネルにおける６つのバーからなる第１のグループは、５ｎＭまたは１５ｎＭのどちらの濃度のＡＳＯ１でも、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．２の発現と比較してＮａＶ１．７の発現が有意にノックダウンされたことを示している。予想外にも、下部パネルにおける６つのバーからなる第１のグループは、５ｎＭまたは１５ｎＭのどちらの濃度のＡＳＯ１でも、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．２の発現と比較してＮａＶ１．８の発現が有意にノックダウンされたことを示している。すなわち、上部パネルおよび下部パネルの６つのバーの左端の群は、ＡＳＯ１が、ＮａＶ１．５およびＮａＶ１．２と比較して、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８の両方の発現を特異的にノックダウンすることを示している。上部パネルおよび下部パネルを一緒に見ると、部品の第２のグループは、ＡＳＯ２について同様のことを示し、バーの第３のグループは、ＡＳＯ３について同様の結果を示し、６つのバーの第４のグループは、ＡＳＯ４について同様の結果を示している。これらのデータは、本開示のＡＳＯがＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８の両方の発現を阻害することができることを強く示している。

異なるＮａｖチャネルは、異なる生物物理学的特性および興奮性における役割を有する。

図１３は、どのＮａｖチャネルが神経活動の閾値、閾値未満および閾値を超える興奮性に実質的または主に関与しているかを示している。データは、青色光およびＯｐｔｏｐａｔｃｈ構築物を使用してニューロンを刺激し、ナトリウム（Ｎａ）伝導率を測定することによって得られる。青色光刺激プロトコルを使用して、侵害受容器発火における各Ｎａｖの役割を特性決定した。データは、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８が閾値以上での活性の主な駆動因子であり、したがってそれらの標的が疼痛を処置するための治療用組成物の貴重な標的であることを示している。ここで、本開示は、検証された標的Ｎａｖ１．７およびＮａｖ１．８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療薬を提供する。

Claims (36)

1. 疼痛を処置するための組成物であって、
   配列番号１～１６４のうちの１つに少なくとも約７５％相補的なＲＮＡのセグメントに沿ってナトリウムチャネルタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズし、それによって前記ＲＮＡのナトリウムチャネルタンパク質への翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
2. 前記オリゴヌクレオチドが、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８およびＮａＶ１．９のうちの１つまたは複数のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現をノックダウンする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記オリゴヌクレオチド中の塩基の配列が、配列番号１～１６４のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記オリゴヌクレオチドの塩基の配列が、配列番号１～１０１のうちの１つと少なくとも９０％同一であり、前記オリゴヌクレオチドが、ＮａＶ１．７のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡまたはＮａＶ１．８のｐｒｅ－ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡのいずれかにハイブリダイズし、そのＲＮａｓｅ切断を誘導することができる、請求項１に記載の組成物。
5. 前記組成物が、それぞれが配列番号１～１６４のうちの１つと少なくとも８０％同一の塩基配列を有する複数の治療用オリゴヌクレオチドを含み、前記治療用オリゴヌクレオチドの各々が、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有し、前記複数の治療用オリゴヌクレオチドが、髄腔内注射用に製剤化された溶液または担体中に提供される、請求項１に記載の組成物。
6. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０個のＤＮＡ塩基の中央領域に隣接する２つのウィングを含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端が、修飾ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
8. 各修飾ＲＮＡ塩基が、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡおよび２’－Ｏ－メチルＲＮＡからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
9. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも約１５塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記オリゴヌクレオチドが、約１５～約２５塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
11. 前記オリゴヌクレオチドが、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する、請求項１に記載の組成物。
12. 前記オリゴヌクレオチドが、スクリーニングされ、ヒトにおける任意の非標的転写物について閾値マッチを満たさないと決定された塩基配列を有する、請求項１に記載の組成物。
13. 前記オリゴヌクレオチドが、非ヒト霊長類ゲノム中の相同セグメントとのミスマッチが０であり、げっ歯類ゲノム中の相同セグメント中のミスマッチが約５以下である塩基配列を有する、請求項１に記載の組成物。
14. 前記組成物がインビトロで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達される場合、前記ＤＲＧニューロンが、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８またはＮａＶ１．９の用量依存的ノックダウンを示す、請求項１に記載の組成物。
15. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合のみによって連結された塩基を有する、配列番号１～１４１のうちの１つと少なくとも９０％の一致である塩基配列を有し、前記オリゴヌクレオチドが、５’ウィングおよび３’ウィングに隣接する中央の１０個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウィングおよび前記３’ウィングがそれぞれ、５個の連続する２’修飾ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
16. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１～１４１のうちの１つと一致する塩基配列を有し、塩基間結合の大部分がホスホロチオエート結合を有し、前記オリゴヌクレオチドが、５’ウィングおよび３’ウィングに隣接する中央の１０個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウィングおよび前記３’ウィングがそれぞれ、５個の連続する２’ＭＯＥ ＲＮＡ塩基を含む、請求項１に記載の組成物。
17. 髄腔内投与のために製剤化された担体中に、先行する請求項のいずれか一項に記載の複数の異なる治療用ギャップマーの複数のコピーを含む組成物。
18. 前記オリゴヌクレオチドが、インビトロでＤＲＧニューロンを使用するアッセイにおいて、対照ギャップマーよりも少なくとも２５％良好なＮａｖノックダウンを示す、請求項１に記載の組成物。
19. 前記ＲＮＡ中の１またはそれを超える塩基がメチル化されている、請求項１に記載の組成物。
20. 前記メチル化塩基が、５－メチルシトシンおよび５－メチルウラシル（チミン）から選択される、請求項１９に記載の組成物。
21. 疼痛を処置するための組成物であって、
    配列番号１４２～１６４のうちの１つに少なくとも約７５％相補的な各ＲＮＡのセグメントに沿って２つの異なるナトリウムチャネルタンパク質をコードする２つのＲＮＡ上の位置にハイブリダイズし、それによって前記ＲＮＡのその各々のナトリウムチャネルタンパク質への翻訳を防止するオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
22. 前記オリゴヌクレオチドが、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現をノックダウンする、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記オリゴヌクレオチド中の塩基の配列が、配列番号１４２～１６４のうちの１つと少なくとも８９％の同一性を有する、請求項２１に記載の組成物。
24. 前記オリゴヌクレオチドの塩基の配列が、配列番号１４２～１６４のうちの１つと少なくとも９４％同一であり、前記オリゴヌクレオチドが、ＮａＶ１．７またはＮａＶ１．８のｐｒｅ－ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズし、そのＲＮａｓｅ切断を誘導することができる、請求項２１に記載の組成物。
25. 前記組成物が、それぞれが配列番号１４０～１６４のうちの１つと少なくとも９４％同一の塩基配列を有する複数の治療用オリゴヌクレオチドを含み、前記治療用オリゴヌクレオチドの各々が、修飾ＲＮＡウィングに隣接する中央ＤＮＡセグメントを含むギャップマー構造を有する、請求項２１に記載の組成物。
26. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも９個のＤＮＡ塩基の中央領域に隣接する２つのウィングを含む、請求項２１に記載の組成物。
27. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの末端が、修飾ＲＮＡ塩基を含む、請求項２１に記載の組成物。
28. 各修飾ＲＮＡ塩基が２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡである、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記オリゴヌクレオチドが、約１９塩基を含む、請求項２１に記載の組成物。
30. 前記オリゴヌクレオチドが、複数のホスホロチオエート結合を含む骨格を有する、請求項２１に記載の組成物。
31. 前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびホスホジエステル（ＰＯ）の混合物を含む骨格を有し、最も外側の塩基間結合およびＤＮＡ塩基を含むすべての結合がＰＳであり、各ウィングの他の３つのＲＮＡ間結合が２つまたは３ついずれかのＰＳ結合のいずれかを含み、残りがＰＯである、請求項２１に記載の組成物。
32. 前記オリゴヌクレオチドが、スクリーニングされ、ヒトにおける任意の非標的転写物について閾値マッチを満たさないと決定された塩基配列を有する、請求項２１に記載の組成物。
33. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４２～１５２または１５３～１６４のうちの１つの塩基配列を有する、請求項２１に記載の組成物。
34. 前記組成物がインビトロで後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに送達される場合、前記ＤＲＧニューロンが、ＮａＶ１．７およびＮａＶ１．８の用量依存的ノックダウンを示す、請求項２１に記載の組成物。
35. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４２～１６４のうちの１つと少なくとも９４％の一致を有する塩基配列を有し、少なくとも、最も外側の塩基間結合およびＤＮＡ塩基を含むすべての結合がホスホロチオエートであり、前記オリゴヌクレオチドが、５’ＲＮＡウィングおよび３’ＲＮＡウィングに隣接する中央の９個のＤＮＡ塩基をさらに含み、前記５’ウィングおよび前記３’ウィングがそれぞれ、５個の連続する２’修飾ＲＮＡ塩基を含む、請求項２１に記載の組成物。
36. 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１４２～１６４のうちの１つの配列を有し、両方のＲＮＡウィングが５個の２－メトキシエチル修飾ＲＮＡ塩基からなる、請求項３５に記載の組成物。

Images