NL1031584C2

NL1031584C2 - Brassica Oleracea planten met een resistentie tegen Mycosphaerella Brassicicola.

Info

Publication number: NL1031584C2
Application number: NL1031584A
Authority: NL
Inventors: Piet Barten
Original assignee: Bejo Zaden Bv
Priority date: 2006-04-12
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2007-10-15
Also published as: AR060803A1; WO2007116096A1; RU2438298C2; NZ571894A; EP1998608A1; US8492615B2; AU2007235880B2; AU2007235880A1; RU2008144575A; JP2009533037A; US20090126036A1

Description

BRASSICA OLERACEA PLANTEN MET EEN RESISTENTIE TEGEN MYCOSPHAERELLA BRASSICICOLA

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op 5 Brassica oleracea planten, welke resistent zijn tegen Mvcosphaerella brassicicola, de veroorzaker van de ringvlekkenziekte. De uitvinding betreft tevens de zaden, vruchten en/of andere plantdelen afkomstig van deze resistente planten. De onderhavige uitvinding heeft verder 10 betrekking op een werkwijze voor het verschaffen van een B. oleracea plant welke resistent is tegen M. brassicicola. De uitvinding heeft tevens betrekking op het gebruik van specifieke DNA-merkers welke nauw zijn gekoppeld aan het resistentiegen tegen M. brassicicola voor het identificeren 15 van resistente B. oleracea planten.

Mvcosphaerella brassicicola (soms ook voorkomend onder de namen Sohaeria brassicicola. Sphaerella brassicicola, Dothidea brassicae, Asteroma brassicae en Phvllosticta brassicicola (Punithalingham and Holliday,

20 Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria, CMI

(Commonwealth Mycological Institute) England, No. 468, 1975) is de veroorzaker van de zogeheten ringvlekkenziekte in Brassica planten. De schimmel, die sinds begin jaren tachtig op vele plaatsen voorkomt en in sommige gevallen zelfs 25 epidemische vormen heeft aangenomen, behoort tot de

Ascomyceten en vormt grijs-bruine lesies op de bladeren van de planten, waarin uiteindelijk de ascosporen worden gevormd. Deze sporen zijn de verspreidingsvorm van de schimmel en worden hoofdzakelijk door wind en regendruppels verspreid.

30 Onder vochtige en gematigde omstandigheden gedijt de schimmel optimaal. Door een combinatie van factoren kan M. brassicicola zich snel verspreiden over een groot gebied. Een zware aantasting door M. brassicicola kan leiden tot versnelde bladveroudering, ontbladering en daaruit 1031584 2 voortvloeiende opbrengstschade. Daarnaast kan dit leiden tot cosmetische schade aan het product (de plant en/of delen van de plant), mede doordat tijdens bewaring van het product de M. brassicicola aantasting nog kan toenemen en de lesies een 5 invalsplek vormen voor secundaire infecties (bijvoorbeeld Botrvtis spp.).

De waardplanten van M. brassicicola omvatten vrijwel alle Brassica species, waaronder B. campestris. B. carinata.

B. napus. B. nigra. B. oleracea, en verder Raphanus sativus, 10 en tevens enkele kruisbloemige onkruiden, waaronder

Hirschfeldia incana, Matthiola incana. Sisymbrium officinale, en Thlaspi arvense.

Brassica is een plantengeslacht in de familie Brassicaceae (vroeger Cruciferae). De leden van dit geslacht 15 worden gezamenlijk als kool of mosterd betiteld. Het geslacht Brassica omvat een aantal belangrijke land- en tuinbouwgewassen, waaronder koolzaad, bloemkool, rode kool, savooienkool, witte kool, spitskool, boerenkool, broccoli, spruitkool, Chinese kool, koolrabi en Portugese kool 20 (tronchuda). Vrijwel alle delen van de planten worden als voedsel gebruikt, zoals de wortels (koolraap), stengels (koolrabi), bladeren (witte kool), okselknoppen (spruitjes), bloemen (bloemkool, broccoli) en de zaden (koolzaad). Verder worden sommige soorten met witte of paarse bloemen of aparte 25 bladkleur of -vorm voor de sier geteeld.

Hoewel de bestrijding van M. brassicicola met behulp van fungiciden mogelijk is, wordt het aantal toegestane middelen en het gebruik van deze middelen om milieutechnische en gezondheid-gerelateerde redenen steeds meer beperkt. Het 30 met fungiciden bestrijden van M. brassicicola is bovendien niet eenvoudig omdat het juiste tijdstip van bestrijding moeilijk is vast te stellen. Het is dus gewenst dat Brassica planten, in het bijzonder Brassica oleracea planten, 3 ontwikkeld worden welke resistent zijn tegen de hiervoor beschreven schimmel. Er zijn geen Brassica rassen beschikbaar met een resistentie tegen M. brassicicola.

Het doel van onderhavige uitvinding is het 5. verschaffen van een Brassica oleracea plant met een resistentie tegen M. brassicicola, de veroorzaker van de ringvlekkenziekte.

Hiertoe verschaft de uitvinding een Brassica oleracea plant, welke een resistentiegen tegen M. brassicicola omvat. 10 In een voorkeursuitvoeringsvorm verschaft het resistentiegen een monogene en dominante resistentie tegen M. brassicicola.

Het resistentiegen tegen M. brassicicola is volgens de uitvinding bij voorkeur afkomstig uit de B. oleracea 15 plant, waarvan de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC, Patent Depository, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, Verenigde Staten van Amerika) op 1 maart 2006 onder nummer PTA-7413. Verrassenderwijs is gevonden dat met het resistentiegen 20 volgens de uitvinding een dominante resistentie wordt verschaft tegen twee fysio's van M. brassicicola. Het gaat hierbij om een veel in Nederland voorkomend fysio en een meer virulent fysio dat veel wordt aangetroffen in de bloemkoolgebieden in West Frankrijk (met name Normandië en 25 Bretagne) en in koolgebieden in Midden-Amerika (met name Guatemala).

In een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen in de B. oleracea plant aantoonbaar met behulp 30 van één of meer specifieke DNA-merkers die zijn gekoppeld aan het resistentiegen.

In een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is de aanwezigheid van de introgressie met het resistentiegen 4 tegen M. brassicicola aantoonbaar met behulp van ten minste twee, bij voorkeur ten minste drie, meer bij voorkeur ten minste vier, meer bij voorkeur ten minste vijf, meest bij voorkeur zes aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, 5 . waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten. Met omsluiten wordt in de onderhavige aanvrage bedoeld dat de DNA-merkers op het genoom aan beide zijden van het resistentiegen gelegen zijn, dat wil zeggen, zowel "upstream" als "downstream" van het resistentiegen. Door het aantonen 10 van de aanwezigheid van meerdere DNA-merkers, die zijn gekoppeld aan het resistentiegen en het resistentiegen omsluiten wordt verzekerd dat de introgressie met het resistentiegen daadwerkelijk aanwezig is.

De DNA-merkers volgens de uitvinding worden bij 15 voorkeur gekozen uit tabel 1, waarbij de aanwezigheid van de DNA-merkers in het genoom van de plant wordt aangetoond met behulp van de primersequenties gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID NO: 1 tot en met SEQ ID NO: 6.

In het onderzoek dat heeft geleid tot de onderhavige 20 uitvinding is aangetoond dat de betreffende DNA-merkers karakteristiek zijn voor de introgressie van de resistentie tegen M. brassicicola. De DNA-merkers volgens de uitvinding zijn DNA-fragmenten, die zijn gekoppeld aan het betreffende resistentiegen, die een bepaalde grootte hebben (bp), zoals 25 aangegeven in tabel 1, en kunnen worden aangetoond met behulp van specifieke primercombinaties.

De plant volgens de uitvinding wordt bij voorkeur gekozen uit de groep die bestaat uit B. oleracea convar. botrvtis var. botrvtis (bloemkool, romanesco), B. oleracea 30 convar. botrvtis var. cvmosa (broccoli), B. oleracea convar. botrvtis var. asparaqoides (spruitbroccoli) , B. oleracea convar. oleracea var. qemnifera (spruitkool), B. oleracea convar. capitata var. alba (witte kool, spitskool), B_^ 5 oleracea convar. capitata var. rubra (rode kool), B. oleracea convar. capitata var. sabauda (savooienkool) B. oleracea convar. acephela var. sabellica (boerenkool), B. oleracea convar. acephela var, gonavloides (koolrabi) en B^_ 5 oleracea var. tronchuda svn. costata (Portugese kool).

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de zaden, vruchten en/of andere plantendelen afkomstig van de hiervoor beschreven planten. Met plantendelen worden hierbij onder andere de eetbare delen van de plant bedoeld, zoals 10 bijvoorbeeld okselknoppen (spruitjes).

De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van een B. oleracea plant met een resistentie tegen M, brassicicola, welke werkwijze ten minste de volgende stappen omvat: 15 (a) het verschaffen van een eerste B. oleracea plant, welke plant een resistentiegen tegen M. brassicicola omvat; (b) het kruisen van de resistente plant met een vatbare tweede B. oleracea plant; (c) het uit de nakomelingen isoleren van genomisch 20 DNA voor het detecteren van de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen met behulp van één of meer specifieke aan het resistentiegen gekoppelde DNA merkers; en (d) het uit de nakomelingen selecteren van een B^ 25 oleracea plant, waarin de aanwezigheid van de introgressie met het resistentiegen in stap (c) is aangetoond.

Met de werkwijze volgens de uitvinding kunnen op een snelle en eenvoudige wijze resistente B. oleracea planten worden verschaft, door gebruik te maken van DNA-merkers die 30 specifiek zijn voor de introgressie met het resistentiegen volgens de uitvinding.

De ziektedruk van M. brassicicola kan door verschillende natuurlijke factoren als wind, temperatuur, 6 luchtvochtigheid en omgeving (o.a. andere waardplanten) zeer wisselend zijn. Grote verschillen in de mate van aantasting kunnen hierdoor ontstaan. Bovendien kan het ziektebeeld gemakkelijk verward worden met de door Alternaria brassicae 5 en A. brassicicola veroorzaakte ziekten. Met behulp van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding en het gebruik van de specifieke, aan een resistentiegen gekoppelde DNA-merkers kan op eenvoudige wijze worden vastgesteld of een plant het resistentiegen bevat. Bovendien kunnen op deze 10 wijze sneller resistente B. oleracea planten worden verkregen dan met de conventionele veredelingsprogramma's. Veel Brassica soorten hebben een tweejarige cyclus waarin de plant het eerste jaar vegetatief is en in het tweede jaar bloeit en zaad produceert. Door de inzet van de specifieke DNA-merkers 15 die gekoppeld zijn aan een resistentiegen kan het proces versneld worden tot een éénjarige cyclus omdat er geen ziektetoets hoeft te worden uitgevoerd en de planten ook niet tot een volwassen stadium hoeven te worden opgekweekt om selectie mogelijk te maken. Op het totale 20 veredelingsprogramma kan zo al snel vele jaren worden bespaard.

De in stap (d) van de werkwijze volgens de uitvinding geselecteerde planten kunnen optioneel worden onderworpen aan aanvullende stappen, zoals het één of meerdere malen 25 terugkruisen of zelfbevruchten van de plant verkregen in stap (d) met een vatbare B. oleracea plant en het vervolgens opnieuw selecteren uit de nakomelingen van een resistentie B. oleracea plant met behulp van de specifieke DNA-merkers. De in stap (d) verkregen planten kunnen bijvoorbeeld ook 30 homozygoot worden gemaakt door middel van voor de vakman bekende technieken als antheren- en/of microsporencultuur.

7

De eerste B. oleracea plant omvat bij voorkeur een resistentiegen dat een monogene en dominante resistentie tegen M. brassicicola geeft.

In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de eerste Bj_ 5 oleracea plant een resistentiegen dat afkomstig is uit de B. oleracea plant waarvan de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) onder nummer PTA-7413.

In een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de 10 werkwijze volgens de uitvinding omvat het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) het selecteren van een B, oleracea plant welke ten minste twee, bij voorkeur ten minste drie, meer bij voorkeur ten minste vier, meer bij voorkeur ten minste vijf en meest bij voorkeur zes aan het 15 resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten. Hierdoor kan met zekerheid worden vastgesteld dat de plant daadwerkelijk de introgressie met het resistentiegen bezit.

De DNA-merkers volgens de uitvinding worden bij 20 voorkeur gekozen uit tabel 1, waarbij de aanwezigheid van de DNA-merkers in het genoom van de plant wordt aangetoond met behulp van de primer sequenties gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID NO: 1 tot en met SEQ ID NO: 6 (tabel 2).

In een bijzondere uitvoeringsvorm volgens de 25 uitvinding omvat de eerste B. oleracea plant een resistentiegen tegen M. brassicicola afkomstig uit de B. oleracea plant waarvan de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) onder nummer PTA-7413.

30 De vatbare B. oleracea plant waarin het resistentiegen wordt ingebracht wordt bij voorkeur gekozen uit de groep die bestaat uit B. oleracea convar. botrvtis var. botrvtis (bloemkool, romanesco), B. oleracea convar.

8 botrvtis var. cvmosa (broccoli), B, oleracea convar. botrvtis var. asparaqoides (spruitbroccoli), B. oleracea convar. oleracea var. qemnifera (spruitkool), B, oleracea convar. capitata var. alba (witte kool, spitskool), B. oleracea 5 convar. capitata var. rubra (rode kool), B. oleracea convar. capitata var. sabauda (savooienkool) B. oleracea convar. acephela var. sabellica (boerenkool), B. oleracea convar. acephela var, qonqyloides (koolrabi) en B. oleracea var. tronchuda svn. costata (Portugese kool).

10 De uitvinding heeft verder betrekking op de B.

oleracea planten, verkrijgbaar met de hiervoor beschreven werkwijze, alsmede de zaden en/of plantendelen daarvan.

De uitvinding betreft tevens het gebruik van ten minste één aan een resistentiegen tegen M. brassicicola

15 gekoppelde DNA-merker voor het identificeren van een B. oleracea plant welke resistent is tegen M. brassicicola. waarbij de DNA-merker wordt gekozen uit de DNA-merkers van tabel 1 en waarbij de DNA-merker wordt aangetoond met de primersequenties gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID

20 No.: 1-6 (tabel 2).

Het resistentiegen is bij voorkeur afkomstig uit de B, oleracea plant waarvan de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) onder nummer PTA-7413.

25 De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van het volgende voorbeeld.

VOORBEELD

30 De M. brassicicola resistente onderlijn B.oleracea (9009899, bloemkool-type; gedeponeerd bij ATCC onder nummer PTA-7413) is gekruist met verschillende B. oleracea soorten (koolrabi, broccoli, spitskool, witte kool, rode kool, 9 boerenkool, savooienkool, tronchuda, spruitkool en bloemkool). Na terugkruising met de vatbare ouderlijnen zijn TK1 populaties verkregen.

Verschillende jaren zijn veldproeven uitgevoerd. In 5 een jaar waarin de aantastingsgraad van M. brassicicola hoog en gelijkmatig voorkwam in de verschillende Brassica soorten is plantmateriaal verzameld. Met deze populaties is de ontwikkeling van DNA merkers voor de resistentie tegen M. brassicicola gestart. De populaties hadden vrijwel allemaal 10 een 1:1 uitsplitsing voor wat betreft de M. brassicicola resistentie, wat duidt op de verwachte monogene dominante resistentie.

Er werden drie populaties (spitskool, broccoli en koolrabi) van elk ongeveer 150 individuen gebruikt. Van alle 15 individuen is DNA geïsoleerd uit bladponsjes (~0.3 cm2/ bladpons). Een BSA (bulked segregant analysis) methode werd vervolgens gebruikt om nauw gekoppelde DNA-merkers te genereren, waarbij gebruik werd gemaakt van de RAMP techniek (Matsumoto et al., Mammalian Genome, 9: 531-535, 1998; 20 Reiter, PCR-based marker systems, in: DNA-based markers in plants, Kluwer Academie Publishers, vol. 6: 9-29, 2001; Weising et al·., Detecting DNA variation by molecular markers, in: DNA fingerprinting in plants, principles, methods and applications, CRC Press, 2nd ed.: 21-73, 2005).

25 De RAMP techniek, waarbij een iSSR en een RAPD-primer worden gecombineerd, levert bandenpatronen op met daarin DNA-fragmenten die specifiek co-segregeren met de resistentie, waarmee onderscheid kan worden gemaakt tussen individuen die de resistentiegen-introgressie wel en individuen die de 30 introgressie niet bevatten.

Door kartering van de RAMP-fragmenten werden nauw gekoppelde RAMP-merkers geïdentificeerd die binnen de introgressie vallen en het resistentiegen omsluiten, zie 10 tabel 1. De genetische afstand tussen de DNA-merker en het resistentiegen wordt weergegeven in centimorgans (cM).

Merker analyse en PCR condities 5 De algemene PCR condities waaronder de DNA merkers werden gegenereerd zijn in onderstaand overzicht weergegeven.

PCR mix voor RAMP reactie:

Per reactie 10 ongeveer 1 ng genomisch plant DNA 75 mM Tris-HCL (pH 8.8) 20 mM NH4S04 0.01% (v/v) Tween20 2.8 mM MgCl2 15 0.15 |0M forward primer

0.20 μΜ reverse primer 0.25 mM dNTP

0.04 units/μΙ Red Hot® DNA polymerase (Abgene, Epsom, UK) 20 PCR programma: RAPD35 Aantal cycli 1 2 min. 93'C 1

2 30 sec. 93'C

25 3 30 sec. 35'C

4 opwarmen met 0.3'/sec tot 72'C

5 1 min. 30 sec 72'C

2-5 40 6 5 min 72'C 1 30 PAGE/Licor

Voor het analyseren van de RAMP patronen werd gebruik gemaakt van een "Gene ReadIR 4200 DNA analyzer" (Licor Ine.).

11

Op basis van een optimale concentratie van 6.5% acrylamide kunnen fragmenten tot op één enkele base worden gescheiden.

Om de fragmenten zichtbaar te maken op dit systeem is het noodzakelijk om gelabelde (IRDye labels) primers te 5 gebruiken. Hiertoe werd een derde van de hoeveelheid forward-primer vervangen door een gelabelde primer met dezelfde sequentie.

Merkeroverzicht 10 In het onderzoek dat heeft geleid tot de onderhavige uitvinding zijn de in tabel 2 vermelde primers gebruikt om de in tabel 1 vermelde DNA-merkers te genereren.

Tabel 1: Overzicht van RAMP merkers 15 RAMP SEQ ID Fragment grootte (bp) Positie in cM t.o.v.

Combinatie resistentiegen 1+6 198 2,4 2+6 360 0,7 20 3+6 370 0,3 4+6 230 1,2 5+6 173 2,1 5+6_473_ 3,2 25 12

Tabel 2: Overzicht van SEQ ID nrs SEQ ID nr. Sequentie

1 iSSR CAGGAAACAGCTATGACAATGTCTCTCTCTCTC

2 iSSR CAGGAAACAGCTATGACTTGCTCTCTCTCTCTC

5 3 iSSR CAGGAAACAGCTATGACCACTTCTCTCTCTCTC

4 iSSR CAGGAAACAGCTATGACCTTTTCTCTCTCTCTC

5 iSSR CCAGGTGTGTGTGTGT

6 Operon RAPD® 10-mer kits A-01 t/m Z-20 (Operon Biotechnologies, Inc. Huntsville, USA) _ 10 De primercombinaties vormen op de resistentiegen- introgressie fragmenten met een specifieke grootte (Tabel 1). Deze DNA-merkers zijn dus karakteristiek voor de resistentiegen-introgressie. De combinatie van deze DNA-merkers die het resistentiegen omsluiten, geeft een 15 onomstotelijk bewijs dat de M. brassicicola resistentiegen-introgressie aanwezig is.

Definities 20 BSA -Bulked Seqreqant Analysis - selectiestrategie waarbij van grote splitsende populaties, individuen met eenzelfde eigenschap (fenotype) of DNA van deze individuen worden samengevoegd tot "pools". Na screening van deze pools met DNA-technieken worden merkers geïdentificeerd die gekoppeld 25 zijn aan het betreffende fenotype.

cM - centimorqan - eenheid voor de genetische afstand tussen merkers, gebaseerd op het aantal overkruisingen per honderd, individuen.

30 DNA-merker - Een DNA-fragment dat gekoppeld is aan een gen of een ander stuk DNA met een bekende locatie op het genoom, welke gebruikt wordt om overerving van dit gen of deze 13 locatie te volgen.

Gel-elek.troforese - methode om moleculen (o.a. DNA, RNA, eiwit) te scheiden in een matrix (agarose of polyacrylamide) 5 onder invloed van een electrisch veld op basis van hun grootte, vorm of lading.

Introqressie - een chromosoomfragment van een lijn dat bijvoorbeeld door kruising in een andere lijn kan worden 10 ingebracht.

IRDve labels - infrarood-labels die gebruikt worden voor Licor imaging systems, waarvan de detectie plaatsvindt bij 700 nm of 800 nm.

15

Monogeen - bepaald door één gen PCR - Polymerase Chain Reaction - een in vitro amplificatiemethode om een specifiek DNA fragment te 20 vermeerderen. Deze synthesereactie maakt gebruik van minimaal één oligonucleotide primer die aanhecht op een stuk DNA waarna tijdens opeenvolgende temperatuurcycli een polymerase de flankerende regio amplificeert.

25 Primer - een korte oligonucleotide (~20-50bp) complementair aan de sequentie van een enkelstrengs DNA-molecuul, welke dient als startpunt van een polymerase.

RAMPs - Random Amplified Microsatellite Polymorphisms - DNA-30 fingerprinting techniek gebaseerd op RAPD- en iSSR primers waarmee polymorfismen tussen verschillende DNA monsters worden opgespoord.

14 RAPP - Random Amplified Polymorphic DNA - Random Amplified Polymorphic DNA primer: Een 10-mer met een "random" sequentie, waarbij het GC-gehalte tussen 60% en 70% ligt en waarbij de primer-uiteinden niet zelfcoitiplementair zijn.

5 iSSR - inter Simple Sequence Repeat - Inter Simple Sequence Repeat primer: Een primer ontworpen op het 5' uiteinde van een SSR (Single Sequence Repeat); een stukje DNA bestaande uit een herhaling van 2 of 3 nucleotiden 10 TK - Terugkruisinq - kruising van een individu met één van de oorspronkelijke ouders.

1031584

Claims

1. Brassica oleracea plant, omvattende een resistentiegen tegen Mvcosphaerella brassicicola.

2. Plant volgens conclusie 1, waarbij het resistentiegen een monogene en dominante resistentie tegen M. brassicicola geeft.

3. Plant volgens conclusie 1 of 2, waarbij het resistentiegen afkomstig is uit de B. oleracea plant, waarvan 10 de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) onder nummer PTA-7413.

4. Plant volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen aantoonbaar is met behulp van ten minste één aan het 15 resistentiegen gekoppelde specifieke DNA-merker.

5. Plant volgens conclusie 4, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen tegen M. brassicicola aantoonbaar is met behulp van ten minste twee aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, waarbij de

6. Plant volgens conclusie 5, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen tegen M. brassicicola aantoonbaar is met behulp van ten minste drie aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, waarbij de

25 DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

7. Plant volgens conclusie 6, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen tegen M. brassicicola aantoonbaar is met behulp van ten minste vier aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, waarbij de

30 DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

8. Plant volgens conclusie 7, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen tegen M. brassicicola aantoonbaar is met behulp van ten minste vijf 1031584 aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

9. Plant volgens conclusie 8, waarbij de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen tegen It 5 brassicicola aantoonbaar is met behulp van zes aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

10. Plant volgens één van de conclusies 1-9, waarbij de DNA-merkers worden gekozen uit tabel 1, waarbij de 10 aanwezigheid van de DNA-merkers in het genoom van de plant wordt aangetoond met behulp van de primersequenties gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID NO: 1 tot en met SEQ ID NO: 6 (tabel 2) .

11. Plant volgens één van de conclusies 1-10, waarbij 15 de plant wordt gekozen uit de groep die bestaat uit Brassica oleracea convar. botrvtis var. botrvtis (bloemkool, romanesco), Brassica oleracea convar. botrvtis var. cvmosa (broccoli), Brassica oleracea convar. botrvtis var. asparagoides (spruitbroccoli), Brassica oleracea convar. 20 oleracea var. cremnifera (spruitkool) , Brassica oleracea convar. capitata var. alba (witte kool, spitskool), Brassica oleracea convar. capitata var. rubra (rode kool), Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda (savooienkool), Brassica oleracea convar. acephela var. sabellica 25 (boerenkool), Brassica oleracea convar. acephela var. pongvloides (koolrabi) en Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata (Portugese kool).

12. Zaden, vruchten en/of andere plantendelen afkomstig van een plant volgens één van de conclusies 1-11.

13. Werkwijze voor het verschaffen van een Brassica oleracea plant met een resistentie tegen Mvcosphaerella brassicicola, omvattende (a) het verschaffen van een eerste B. oleracea plant, welke een resistentiegen tegen M. brassicicola omvat; (b) het kruisen van de resistente plant met een vatbare tweede B. oleracea plant; 5 (c) het uit de nakomelingen isoleren van genomisch DNA voor het detecteren van de aanwezigheid van een introgressie met het resistentiegen met behulp van één of meer specifieke aan het resistentiegen gekoppelde DNA merkers; en 10 (d) het uit de nakomelingen selecteren van een B. oleracea plant, waarin de aanwezigheid van de introgressie met het resistentiegen in stap (c) is aangetoond.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij het resistentiegen een monogene en dominante resistentie tegen M^. 15 brassicicola geeft.

15. Werkwijze volgens conclusie 13 of 14, waarbij het resistentiegen afkomstig is uit de B. oleracea plant, waarvan de zaden zijn gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (ATCC) onder nummer PTA-7413.

16. Werkwijze volgens conclusie 13, 14 of 15, waarbij het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) het selecteren van een B. oleracea plant omvat, welke ten minste twee aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, waarbij het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) het selecteren van een B. oleracea plant omvat, welke ten minste drie aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, waarbij het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) het selecteren van een B. oleracea plant omvat, welke ten minste vier aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, waarbij het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) 5 het selecteren van een B. oleracea plant omvat, welke ten minste vijf aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, waarbij het selecteren van de resistente B. oleracea plant in stap (d) 10 het selecteren van een B. oleracea plant omvat, welke zes aan het resistentiegen gekoppelde DNA-merkers omvat, waarbij de DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

20 DNA-merkers het resistentiegen omsluiten.

21. Werkwijze volgens één van de conclusie 13-20, waarbij de DNA-merker wordt gekozen uit de DNA-merkers van 15 tabel 1, waarbij de DNA-merker wordt aangetoond met een primer sequentie gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID No.: 1-6 (tabel 2).

22. Werkwijze volgens één van de conclusies 13-21, waarbij de vatbare B. oleracea plant wordt gekozen uit de 20 groep die bestaat uit B. oleracea convar. botrvtis var. botrvtis (bloemkool, romanesco), B. oleracea convar. botrvtis var. cvmosa (broccoli), B. oleracea convar. botrvtis var. asparaqoides (spruitbroccoli), B. oleracea convar. oleracea var. qemnifera (spruitkool), B. oleracea convar. caoitata 25 var. alba (witte kool, spitskool), B. oleracea convar. caoitata var. rubra (rode kool), B. oleracea convar. caoitata var. sabauda (savooienkool), B. oleracea convar. aceohela var. sabellica (boerenkool), B. oleracea convar. aceohela var, qonqyloides (koolrabi) en B. oleracea var. tronchuda 30 syn. costata (Portugese kool).

23. B. oleracea plant welke resistent is tegen M. brassicicola verkrijgbaar met een werkwijze volgens één van de conclusies 13-22.

24. Gebruik van ten minste één aan een resistentiegen tegen M. brassicicola gekoppelde DNA-merker voor het identificeren van een B. oleracea plant welke resistent is tegen M. brassicicola, waarbij de DNA-merker wordt gekozen 5 uit de DNA-merkers van tabel 1 en waarbij de DNA-merker wordt aangetoond met de primer sequenties gekozen uit de groep die bestaat uit SEQ ID No.: 1-6 (tabel 2). * -k k 10 1 031 584