JP6736462B2 - 生体内のアシル化機能と置き換えられる人工触媒システム - Google Patents
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Description
(a)染色体局在性および求核触媒活性を有する化合物
(b)染色体局在性およびリジンをアシル化する活性を有する化合物
(2)(a)の化合物が、染色体局在に有効な数のカチオン性求核触媒が結合した構造を有する、(1)に記載の薬剤。
(7)(b)の化合物が、アシル化剤とカチオン性化合物とが結合した構造を有する、(1)〜(6)のいずれかに記載の薬剤。
(14)(b)の化合物におけるアシル化剤がマロニル化剤である、(7)〜(10)のいずれかに記載の薬剤。
(17)染色体局在性および求核触媒活性を有する化合物。
(23)染色体局在性およびリジンをアシル化する活性を有する化合物。
(31)アシル化剤がマロニル化剤である、(24)〜(27)のいずれかに記載の化合物。
(34)(17)〜(22)のいずれかに記載の化合物と(28)〜(30)のいずれかに記載の化合物との組み合わせを含む、がん細胞においてp53、p21またはp27の発現を誘導するための薬剤。
本発明は、染色体局在性求核触媒、すなわち、染色体局在性および求核触媒活性を有する化合物を提供する。本発明の染色体局在性求核触媒は、本発明の人工触媒システムの一つの構成要素であり、後述の染色体局在性アシル化剤との組み合わせで細胞に導入した場合に、染色体タンパク質のアシル化を亢進させることができる。
カチオン性求核触媒は、例えば、上記リンカー構造のRまたはR'に、直接またはさらなるリンカー構造を介して間接的に結合させることができる。最終的に合成される化合物が染色体局在性および求核触媒活性を有する限り、RおよびR'の全てにカチオン性求核触媒を結合させる必要はない。また、ROMPポリマーリンカーにおける構造の繰返しは、最終的に合成される化合物が染色体局在性および求核触媒活性を有する範囲内で行えばよい。
本発明は、染色体局在性アシル化剤、すなわち、染色体局在性およびリジンをアシル化する活性を有する化合物を提供する。本発明の染色体局在性アシル化剤は、本発明の人工触媒システムの他の一つの構成要素であり、上記の染色体局在性求核触媒との組み合わせで細胞に導入した場合に、染色体タンパク質のアシル化を亢進させることができる。
これらの例において、リンカーの一端は、アセチル化剤であるN-メトキシジアセトアミドを結合させた構造として表現したが、他のアシル化剤を結合させてもよい。カチオン性化合物は、例えば、リンカーの両端のうち、アシル化剤が結合した端と反対の端に、直接またはさらなるリンカー構造を介して間接的に結合させることができる。ペプチドリンカーにおいては、繰り返し構造を有するアミノ酸が塩基性アミノ酸であり、かつ、当該繰り返し構造により染色体局在性が担保できる場合、アシル化剤が結合した端と反対の端に、さらなるカチオン性化合物を結合させる必要はない。
−染色体タンパク質アシル化剤−
本実施例において、染色体局在性求核触媒と染色体局在性アシル化剤との組み合わせを細胞に導入した場合に、染色体タンパク質のアシル化を亢進させることができることが見出された。従って、本発明は、上記染色体局在性求核触媒と上記染色体局在性アシル化剤との組み合わせを含む、染色体タンパク質をアシル化するための薬剤を提供する。また、本発明は、当該組み合わせを用いる、染色体タンパク質をアシル化する方法を提供する。アシル化される「染色体タンパク質」は、主としてヒストン(特にヒストンH3およびH4)である。
また、本実施例においては、上記染色体タンパク質のアセチル化により、がん細胞において、がん抑制遺伝子であるp53並びにサイクリン依存性キナーゼ阻害因子であるp21およびp27の発現が誘導されることが見出された。従って、本発明は、上記染色体局在性求核触媒と上記染色体局在性アセチル化剤との組み合わせを含む、がん細胞においてp53、p21またはp27の発現を誘導するための薬剤を提供する。また、本発明は当該組み合わせを用いる、がん細胞においてp53、p21またはp27の発現を誘導する方法を提供する。
本発明は、上記染色体局在性求核触媒と上記染色体局在性アセチル化剤との組み合わせを含む、染色体タンパク質のアセチル化の低下に起因する疾患を治療するための薬剤を提供する。また、本発明は、当該組み合わせを患者に投与することを含む、染色体タンパク質のアセチル化の低下に起因する疾患を治療する方法を提供する。
本発明の染色体タンパク質アシル化剤を医薬として用いる場合には、有効成分である染色体局在性求核触媒と染色体局在性アシル化剤を、公知の製剤学的方法で製剤化することができる。本発明の薬剤が染色体局在性求核触媒と染色体局在性アシル化剤との「組み合わせを含む」とは、染色体局在性求核触媒と染色体局在性アシル化剤の双方を有効成分として含む単剤の形態であっても、染色体局在性求核触媒を有効成分として含む製剤と染色体局在性アシル化剤を有効成分とする製剤との併用剤の形態であってもよいことを意味する。
(1)染色体局在性アセチル化剤の合成
トリエチレングリコール(10.0g, 66.6mmol)をテトラヒドロフラン(THF: 47.6ml)に溶解し、トリエチルアミン(NEt3: 7.12ml, 51.3mmol)を室温で加えたのち、反応液を氷冷した。そこにメタンスルホニルクロリド(MsCl: 1.84ml, 23.8mmol)をゆっくりと滴下したのち、室温で9時間撹拌した。反応液を濃縮後、残渣をエタノール(47.6ml)に溶解した。そこにアジ化ナトリウム(3.09g, 47.6mmol)を加え、11時間加熱還流した。室温まで冷却後、反応液を濃縮し残渣を酢酸エチルに溶解した。有機層を24mlの飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=1/2から1/4)で精製し、無色油状物質(化合物3, 2.80g, 16.0mmol, 67%収率)を得た。各種スペクトルは文献値(Amaral, S. P. et al., Org. Lett. 2011, 13, 4522-4525)と一致した。
化合物3(2.80g, 16.0mmol)を塩化メチレン(32.0ml)に溶解し、p-トルエンスルフォニルクロリド(TsCl: 3.66g, 19.2mmol)とトリエチルアミン(4.43ml, 32.0mmol)を加え室温で14時間撹拌した。1Mの塩酸水溶液を加え、水層を塩化メチレンで抽出し、集めた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3/1から2/1)で精製し、無色油状物質(化合物4, 4.92g, 14.9mmol, 93%収率)を得た。各種スペクトルは文献値(Deng, L. et al., Org. Biomol. Chem. 2011, 9, 3188-3198)と一致した。
Methyl gallate(688mg, 3.73mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF: 94.0ml)に溶解し、炭酸カリウム(5.16g, 37.3mmol)を加えた。そこにDMF(19.0ml)に溶解した化合物4(4.92g, 14.9mmol)を加えたのち、80℃で24時間撹拌した。室温まで冷却したのち、固体をろ過して除き、ろ液を濃縮した。残渣をt-ブタノールに溶解したのち再度濃縮した。残渣を塩化メチレンに溶解し、有機層を水、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物(4.00g)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=1/1から1/4)で精製し、薄い黄色油状物質(化合物5, 2.30g, 3.51mmol, 94%収率)を得た。各種スペクトルは文献値(Amaral, S. P. et al., Org. Lett. 2011, 13, 4522-4525)と一致した。
化合物5(1.82g, 2.78mmol)をエタノール(77.3ml)に溶解し、1M水酸化カリウム水溶液(5.17ml, 5.17mmol)を加えて、2時間加熱還流した。室温まで冷却したのち、反応液を留去した。残渣を塩化メチレンに溶解し、そこに1M塩酸水溶液を水層が酸性(pH=1)を示すまで注意深く加えた。水層を塩化メチレンで抽出し、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物(化合物6, 1.67g)を得た。得られた粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。
粗生成物6(1.36g)を塩化メチレン(10.6ml)に溶解し、グリシンメチルエステル塩酸塩(293mg, 2.33mmol)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩(WSC: 447mg, 2.33mmol)、トリエチルアミン(0.646ml, 4.66mmol)、4-(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP: 25.9mg, 0.212mmol)を加えて室温で22時間撹拌した。1M塩酸水溶液を加えたのち、水層を塩化メチレンで抽出した。集めた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物(1.72g)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=100/0から13/1)で精製し、薄い黄色油状物質(化合物7, 1.15g, 1.61mmol, 2工程71%収率)を得た。
(vi)(3,4,5-Tris(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)benzoyl)glycine(化合物8)
化合物7(319mg, 0.448mmol)をメタノール(4.48ml)に溶解し、1M水酸化ナトリウム水溶液(0.895ml, 0.895mmol)を加えて、室温で90分撹拌した。Amberlyst 15-DRYを反応液が酸性(pH=4)になるまで加えた。ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物(化合物8, 297mg)を得た。得られた粗生成物は精製せずに次の反応に用いた。
プロパルギルブロミド(4.01g, 33.7mmol)をDMF(76.6ml)に溶解し、N-hydroxyphthalimide(5.00g, 30.7mmol)、1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene(DBU: 4.58ml, 30.7mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応液を氷冷した1M塩酸水溶液(768ml)に注意深く注ぎ、生じた沈殿をろ取し、水、エタノール、ジエチルエーテルの順で洗浄して目的物を白色粉末(化合物9, 5.27g, 26.2mmol, 85%収率)として得た。各種スペクトルは文献値(Kim, J. N. et al., Synth. Commun. 1992, 22, 1427-1432)と一致した。
ヒドラジン水和物(1.44g, 28.8mmol)と化合物9(5.27g, 26.2mmol)を混合し室温で5分撹拌したのち、ジエチルエーテル(26.2ml)を加えてさらに45分激しく撹拌した。生じた沈殿をろ過して除き、ジエチルエーテルで洗浄したのち、合わせたろ液に撹拌しながら2M塩酸(ジエチルエーテル溶液、19.0ml, 38.0mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。生じた沈殿をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄して目的物を白色固体(化合物10, 2.76g, 25.6mmol, 98%収率)として得た。各種スペクトルは文献値(Banerjee, D. et al., ChemBioChem 2010, 11, 1273-1279)と一致した。
化合物10(300mg, 2.79mmol)を塩化メチレン(2.79ml)に溶解して氷冷したのち、トリエチルアミン(1.55ml, 11.2mmol)、無水酢酸(Ac2O: 0.659ml, 6.97mmol)をゆっくりと加えたあと、反応液を室温で3時間撹拌した。ジエチルエーテルを加えて生じた沈殿をろ過して除き、ろ液を濃縮することで粗生成物(1.32g)を得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=5/1から3/2)で精製し、無色油状物質(化合物11, 298mg, 1.92mmol, 69%収率)を得た。
PD-10カラム(GEヘルスケア)にRink-Amide-AM resin(0.79mmol/g, 100mg, 0.079mmol)を計り取り、塩化メチレン(3ml)を加えて10時間震盪して樹脂を膨潤させた。吸引ろ過により塩化メチレンを除きDMF(3ml)で5回洗浄したのち、20%ピペリジン(DMF溶液, 2ml)を加えて30秒間震盪した。吸引ろ過し、さらに20%ピペリジン(DMF溶液, 2ml)を加えて10分間震盪した。吸引ろ過したのちDMF(3ml)で10回洗浄し、そこにFmoc-Arg(Pbf)-OH(314mg, 0.484mmol, Fmoc: 9-fluorenylmethyloxycarbonyl, Pbf: 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl chloride)、O-(6-Chlorobenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HCTU: 189mg, 0.457mmol)、DMF(2ml)、iPr2NEt(0.0790ml, 0.453mmol)を加えて1時間震盪した。吸引ろ過したのち、DMF(3ml)で5回洗浄した。ピペリジンによるFmoc基の除去とFmoc-Arg(Pbf)-OHの縮合を8回繰り返し、最後に再びピペリジンによるFmoc基の除去を行うことで化合物12を得た。そこにHCTU(189mg, 0.457mmol)、DMF(2ml)に溶解した化合物8(331mg, 0.474mmol)、iPr2NEt(0.0790ml, 0.453mmol)を加えて2時間震盪した。吸引ろ過したのち、DMF(3ml)で5回洗浄し、さらにメタノール(3ml)で5回洗浄した。得られた樹脂をバイアルにとり、そこに水(0.125ml)、トリイソプロピルシラン(TIPS: 0.125ml)、トリフルオロ酢酸(TFA: 4.75ml)を加えて室温で90分間撹拌した。樹脂をろ過して除き、ろ液を濃縮したのち、残渣にジエチルエーテル(30ml)を加えて生じた沈殿をろ取して粗生成物を得た。HPLC(ODS, linear gradient; 10-90%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 60分, 254nm, 10ml/分)で精製し、目的物を白色固体(化合物13, 36.8mg)として得た。HPLC保持時間27.6分。MALDI-TOF MS m/z Calcd: 1947.13 [M+H]+, Found: 1947.47.
(xi)アセチル化剤(化合物1)
化合物13(38.4mg)を水(5.41ml)、t-ブタノール(5.42ml)に溶解し、化合物11のt-ブタノール溶液(60mM, 1.97ml, 0.118mmol)を加えた。そこに別途調製した2mM銅触媒溶液(tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine(TBTA): 10.5mg, 0.0198mmolにt-ブタノール(2.46ml)、4mM CuSO4水溶液(2.46ml)を加えて調製、4.92ml)と25mMアスコルビン酸ナトリウム水溶液(25mM, 1.97ml, 0.0493mmol)を加え室温で撹拌した。4時間後さらに化合物11(18.0mg, 0.116mmol)、4mM銅触媒溶液(TBTA:10.5mg, 0.0198mmolにt-ブタノール(1.23ml)、8mM CuSO4水溶液(1.23ml)を加えて調製、2.46ml)、アスコルビン酸ナトリウム(9.8mg, 0.0495mmol)を加えて室温で2時間撹拌した。反応液を濃縮し、水(7ml)を加えて不溶物をろ過して除いたのち、ろ液をHPLC(ODS, linear gradient; 10-90%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 60分, 254nm, 10ml/分)で精製して目的物を白色固体(化合物1, 36.7mg)として得た。HPLC保持時間26.3分。MALDI-TOF MS (CHCA) m/z Calcd: 2412.31 [M+H]+, Found: 2412.01.
(2)染色体局在性マロニル化剤の合成
4-hydroxybenzoic acid(S1, 1.0g, 7.2mmol)をDMF(5ml)に溶解し、そこにN-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCI, 1.7g, 8.9mmol)、HOBT(0.5g, 4.7mmol)およびプロパルギルアミン(0.5ml, 7.2mmol)を加えて終夜撹拌した。溶媒を留去して粗生成物を得たのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/アセトン=8/1から4/1)で精製し、目的物を淡黄色固体(S2, 753.6mg, 60%収率)として得た。
(ii)benzyl(4-(prop-2-yn-1-ylcarbamoyl)phenyl)malonate(化合物S3)
化合物S2(175.2mg, 1.0mmol)を2,2-dimethyl-1,3-dioxane-4,6-dione(144.1mg, 1.0mmol)と混合し、100度で2時間撹拌した。室温まで冷却したのち、アセトニトリル(5ml)、ベンジルアルコール(360μl, 3.0mmol)およびEDCI(372.0mg, 2.0mmol)を加えて、室温で8時間撹拌した。溶媒を留去したのち、残渣を酢酸エチルに溶解し、有期層を飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過したのち、ろ液を濃縮して粗生成物を得た。HPLC(YMC-Pack ODS-AM(20mmI.D.x250) column, linear gradient; 1-90% アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 60分, 230nm, 10mL/分)で精製し、目的物を黄色固体(S3, 82.0mg, 0.23mmol, 23%収率)として得た。HPLC保持時間 30.0分。
(iii)Bn-3Mal-8R(化合物S5)
化合物S4(16.0mg, 0.0056mmol)を水-tBuOH(1:1, 5.6ml)に溶解し、アルキンS3のアセトニトリル溶液(160mM, 0.29ml, 0.0448mmol)、別途調製したCu-TBTAの水-tBuOH溶液(CuSO4: TBTA=1:1, 1mM, 0.626ml, 0.0056mmol)、およびアスコルビン酸水溶液(50mM, 0.56ml, 0.0280mmol)を加えて4度で1時間撹拌したのち、HPLC(YMC-Pack ODS-AM(20mmI.D.x250) column, linear gradient; 30-50% アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 60分, 230nm, 10mL/分)で精製し、凍結乾燥後に目的物を白色固体(S5, 13.13mg, 60%収率)として得た。HPLC保持時間: 28.0分。
Bn-3Mal-8R(S5, 1.9mg, 0.00049mmol)を水-メタノール(3:1, 0.8ml)に溶解し、10% Pd/C(0.6mg)を加えて、水素雰囲気下室温で1時間撹拌したのち、反応液をセライトろ過し、ろ液を濃縮することで粗生成物を得た。HPLC(YMC-Pack ODS-AM(10mmI.D.x250) column, linear gradient; 10-30% アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 60分, 230nm, 3mL/分)で精製し、凍結乾燥後に目的物を白色固体(S6, 0.51mg, 29%収率)として得た。
フラスコにアクリル酸メチル(9.00ml, 99.9mmol)、4-(methylamino)pyridine(化合物14, 541mg, 5.00mmol)を加え、85℃で19時間還流した。溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=15/1から10/1)で精製することで目的物を淡黄色の油状化合物(化合物15, 800mg, 4.12mmol, 82%収率)として得た。各種スペクトルは文献値(Bhattacharya, S. & Snehalatha, K. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1996, 2021-2025)と一致した。
フラスコにmethyl 3-(methyl-4-pyridylamino)propionate(化合物15, 777mg, 4.00mmol)、メタノール(5.00ml)、2M水酸化ナトリウム水溶液(5.00ml, 10.0mmol)を加え、室温で9時間撹拌した。1N塩酸(7ml)を加え、pH7に調整した後、溶媒を減圧留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=1/1から2/3)で精製することで目的物を白色固体(化合物16, 680mg, 3.78mmol, 94%収率)として得た。各種スペクトルは文献値(Bhattacharya, S. & Snehalatha, K. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 1996, 2021-2025)と一致した。
Rink Amide AM resin(0.79mmol/g, 100mg, 0.079mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで8回洗浄後、それぞれ5当量のFmoc-L-Lys(Mtt)-OH(247mg, 0.395mmol, Mtt: 4-methyltrityl)、1-hydroxybenzotriazole(HOBt: 60.5mg, 0.395mmol)、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC: 0.0610ml, 0.395mmol)、DMF(3ml)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計7回行い、樹脂上にhepta-L-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことで、Mtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16(284mg, 1.58mmol)、HOBt(242mg, 1.58mmol)、DIC(0.247ml, 1.58mmol)、DMF(3ml)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS, 2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、氷浴中、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、組成生物を得た。HPLC(ODS, linear gradient; 10-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 10ml/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(2, 42.0mg)として得た。HPLC保持時間15.3分。MALDI-TOF MS (CHCA) : m/z Calcd: 2211.33 [M+H]+, Found: 2211.59。
NovaPEG Rink Amide resin(0.45mmol/g, 222mg, 0.10mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで10回洗浄後、それぞれ4当量のFmoc-D-Lys(Mtt)-OH(250mg, 0.40mmol)、HOBt(61.3mg, 0.40mmol)、DIC(61.9μL, 0.40mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計7回行い、樹脂上にhepta-D-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことでMtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16 (360mg, 2.0mmol)、HOBt(306mg, 2.0mmol)、DIC(310μL, 2.0mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS, 2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、粗生成物を得た。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S7, 45.4mg)として得た。逆相HPLCによる保持時間=15.1分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 553.59[M+4H]4+, found: 553.59。
NovaPEG Rink Amide resin(0.45mmol/g, 222mg, 0.10mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで10回洗浄後、それぞれ4当量のFmoc-L-Lys(Mtt)-OH(250mg, 0.40mmol)、HOBt(61.3mg, 0.40mmol)、DIC(61.9μL, 0.40mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計4回行い、樹脂上にtetra-L-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことでMtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16(225mg, 1.25mmol)、HOBt(191mg, 1.25mmol)、DIC(193μL, 1.25mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS、2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、粗生成物を得た。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S8, 35.2mg)として得た。逆相HPLCによる保持時間=14.3分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 447.61[M+3H]3+, found: 447.53。
NovaPEG Rink Amide resin(0.45mmol/g, 222mg, 0.10mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで10回洗浄後、それぞれ4当量のFmoc-L-Lys(Mtt)-OH(250mg, 0.40mmol)、HOBt(61.3mg, 0.40mmol)、DIC(61.9μL, 0.40mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計5回行い、樹脂上にpenta-L-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことでMtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16(270mg, 1.50mmol)、HOBt(229mg, 1.50mmol)、DIC(232μL, 1.50mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS, 2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、粗生成物を得た。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S9, 57.8mg)として得た。逆相HPLCによる保持時間=14.5分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 408.50[M+4H]4+, found: 408.43。
NovaPEG Rink Amide resin(0.45mmol/g, 222mg, 0.10mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで10回洗浄後、それぞれ4当量のFmoc-L-Lys(Mtt)-OH(250mg, 0.40mmol)、HOBt(61.3mg, 0.40mmol)、DIC(61.9μL, 0.40mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計6回行い、樹脂上にhexa-L-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことでMtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16(315mg, 1.75mmol)、HOBt(256mg, 1.75mmol)、DIC(271μL, 1.75mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS, 2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、粗生成物を得た。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S10, 57.6mg)として得た。逆相HPLCによる保持時間=14.6分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 481.05[M+4H]4+, found: 480.96。
Fmoc-L-Lys(Mtt)-Alko-PEG resin(0.22mmol/g, 455mg, 0.10mmol)をPD-10カラム(GEヘルスケア)に計りとり、DMFで膨潤させた。20%ピペリジンのDMF溶液を加え10分撹拌することで、Fmoc基の除去を行った。DMFで10回洗浄後、それぞれ4当量のFmoc-L-Lys(Mtt)-OH(250mg, 0.40mmol)、HOBt(61.3mg, 0.40mmol)、DIC(61.9μL, 0.40mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で1時間撹拌し、アミノ酸のカップリング反応を行った。同様に、Fmoc基の除去・カップリング反応の操作を計6回行い、樹脂上にH-octa-L-Lys(Mtt)を調製した。DMFで洗浄後、さらにジクロロメタンで5回洗浄し溶媒置換した。3% TFA, 5% TIPSのジクロロメタン溶液を加え、30秒撹拌を12回繰り返すことでMtt基を除去した。ジクロロメタンで洗浄後、DMFに溶媒置換し、リジン残基アミノ基に対してそれぞれ2.5当量の化合物16(360mg, 2.0mmol)、HOBt(306mg, 2.0mmol)、DIC(310μL, 2.0mmol)、DMF(3mL)を加え、室温で15時間撹拌した。DMFで洗浄後、メタノールで溶媒置換し、樹脂を真空乾燥した。得られた樹脂をバイアルに取り、2.5% TIPS, 2.5% 水のTFA溶液を加え、1時間撹拌し、ペプチドを樹脂から切り出した。溶媒を減圧留去し、ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿をろ取し、粗生成物を得た。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S11, 192mg)として得た。逆相HPLCによる保持時間=14.6分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 585.86[M+4H]4+, found: 585.64。
化合物S11(163mg, 50μmol)、HATU(38mg, 100μmol)をDMF(100mL)に溶解したのち、DIEA(35μL, 200μmol)を加え、反応液を室温で3時間撹拌した。0.1% TFA水溶液(2mL)を加えた後、溶媒を減圧留去し、0.1% TFA水溶液(5mL)に再度溶解した。HPLC(Triart column, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 100分, 230nm, 3mL/分)により精製し、凍結乾燥することで目的物を白色固体(S12, 100mg)として得た。収率62%。逆相HPLCによる保持時間=15.3分(ODS column, 4.6x150mm, linear gradient; 0-100%アセトニトリル/0.1% TFA水溶液, 40分, 230nm, 0.9ml/分)。MS(ESI): m/z calcd: 581.36[M+4H]4+, found: 581.12。
(1)材料と方法
(i)細胞培養と細胞分画
Hela細胞とMCF-7細胞の培養は10% fetal bovine serum, 100U/ml penicillin, 100U/ml streptomycinを含むDulbecco’s modified Eagle’s Medium(DMEM)培地を用いた。細胞は37℃、5% CO2存在下で培養した。
タンパク質を4-20% SDS-PAGEゲルで分離し、PVDF膜に転写した後、TBSTに懸濁した5%スキムミルクによりブロッキングを行い、PVDF膜を1次抗体と反応を行った。用いた1次抗体は以下の通りである。Anti-Histone H3(acetyl K122) antibody(ab33309, Abcam), Acetylated-Lysine antibody(#9441, Cell Signaling), Anti-Histone H3(acetyl K56) antibody(ab76307, Abcam), Anti-acetyl Histone H3(Lys115)(#07-934, Millipore), Anti-P53(DO-1)(sc-126, Santa cruz), Anti-Histone H3(acetyl K9) antibody(ab4441, Abcam), Anti-Histone H3(acetyl K14) antibody(ab52946, Abcam), Anti-Acetyl-Histone H4(Ac-Lys16)(H9164, Sigma), Anti-Acetyl-Histone H4(Ac-Lys5)(SAB4500307, Sigma), anti-acetyl tubulin(T6793, Sigma), Anti-p21/WAF1/Cip1 Antibody(05-655, Millipore), Anti-p27(Kip1)(04-240, Millipore)。TBSTで洗浄後、化学発光検出試薬Luminata Forte Western HRP Substrate(Millipore)によりPVDF膜を処理し、ImageQuant LAS 4000(GE healthcare life sciences)で検出を行った。
カバーグラス上に接着させた細胞にFITC付き化合物を加えて培養した後、PBSで洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドで10分間固定し、PBSで2回洗浄後、蛍光顕微鏡(Axioplan2; Carl Zeiss)で観察および写真データの取得を行った。
Lipofectamine(R) RNAiMAX Transfection Reagent(Invitrogen)を用い、25%コンフルエンスのMCF-7またはHela細胞にCBP、p300、p53、およびコントロールとしてGL2のsiRNAを終濃度5nMで加え、37度で72時間培養した。siRNAの配列は以下に示す。
CBP-f:5'-CGGCACAGCCUCUCAGUCATT-3'(配列番号:1)
CBP-r:5'-UGACUGAGAGGCUGUGCCGTT-3'(配列番号:2)
p300-f:5'-UGACACAGGCAGGCUUGACUUTT-3'(配列番号:3)
p300-r:5'-AAGUCAAGCCUGCCUGUGUCATT-3'(配列番号:4)
hp53#1-f:5'-GACUCCAGUGGUAAUCUACTT-3'(配列番号:5)
hp53#1-r:5'-GUAGAUUACCACUGGAGUCTT-3'(配列番号:6)
hp53#2-f:5'-CUACUUCCUGAAAACAACGTT-3'(配列番号:7)
hp53#2-r:5'-CGUUGUUUUCAGGAAGUAGTT-3'(配列番号:8)
GL2-f:5'-CGUACGCGGAAUACUUCGATT-3'(配列番号:9)
GL2-r:5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGTT-3'(配列番号:10)
(v)RNA抽出およびリアルタイムPCR法によるRNAの定量
RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen)を用い、各細胞からRNAを抽出した。2μgのRNAと(Oligo(dT)20)をcDNA合成に用いた。リアルタイムPCR反応はLightCycler 480 SYBR Green I Master System(Roche)およびLightCycler480 System II(Roche)を用いて行った。ハウスキーピング遺伝子Actinを内部コントロールとして用いた。発現データはActinで正規化し、2-ΔΔCT法(Livak KJ & Schmittgen TD (2001) Methods 25: 402-408)を用いて解析を行った。3回の独立した実験を行い、各実験において、3ウェルにおける平均値を算出した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
p53-f:5’-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3’(配列番号:11)
p53-r:5’-GGCATTCTGGGAGCTTCATCT-3’(配列番号:12)
p21-f:5’-GCGATGGAACTTCGACTTTGT-3’(配列番号:13)
p21-r:5’-GGGCTTCCTCTTGGAGAAGAT-3’(配列番号:14)
p27-f:5’-AGACGGGGTTAGCGGAGCAA-3’(配列番号:15)
p27-r:5’-TCTTGGGCGTCTGCTCCACA-3’(配列番号:16)
GAPDH-f:5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’(配列番号:17)
GAPDH-r:5’-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3’(配列番号:18)
Actin-f:5’-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3’(配列番号:19)
Actin-r:5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3’(配列番号:20)
(vi)細胞周期解析
DMEM培地で培養した60-70%コンフルエンスの細胞に化合物を添加し、15-22時間培養した。サンプルの調整はBD cycle test plus DNA Reagent kit(BD Biosciences)を用いて行い、フローサイトメーターで解析を行った。
まずはじめに触媒として求核性触媒として広く使用されている4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)、アセチル化剤として水中で1級アミンを温和な条件でアセチル化することが知られているN-メトキシジアセトアミド(NMD)を用いて検討を行った(Yasuo Kikugawa, et al., Tetrahedron Letters 1990, 31, 243-246)。ヒト乳がんMCF-7細胞の細胞抽出液(核画分)をこれらの化合物と混合し、室温において12時間反応を行ったところ、ヒストンH3およびH4のリジン残基アセチル化が促進された(図1A、B)。次に、MCF-7細胞をL-DMAPおよびNMDで3時間処理した後に、細胞抽出液を回収し、染色体画分(Chromatin)と細胞質画分(Cytoplasm)に分画した後、タンパク質のアセチル化レベルをウエスタンブロッティングにより評価した。その結果、細胞質画分に含まれるタンパク質群は高度にアセチル化されたのに対し、ヒストンを含む染色体画分中のタンパク質アセチル化は変化がなかった(図1C)。この結果から、L-DMAPおよびNMDはヒト培養細胞中でタンパク質のリジン残基のアセチル化を亢進できることが明らかになった。一方で、ヒストンを含む染色体タンパク質のアセチル化を亢進することはできなかったことから、L-DMAPまたはNMDが細胞内において、染色体近傍にアクセスしにくい可能性が示唆された。
再構成ヌクレオソーム(0.346μM: DNA換算)をHeLa細胞から抽出した細胞質抽出液と20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液中で混合し、触媒L-8DMAPおよびマロニル化ドナー3Mal-BA-8Rを加えて室温で3時間反応し、SDS-PAGEゲルで分離後、ウエスタンブロッティング法により、マロニル化タンパク質を検出した。比較のため、同様にして、触媒L-8DMAPおよびアセチル化ドナー3NMD-8Rによるアセチル化タンパク質の検出も行った。ウエスタンブロッティング法においては、1次抗体として、マロニル化タンパク質検出用にPan Anti-Malonyllysine Antibody(PTM-901, PTM Biolabs)を、アセチル化タンパク質検出用にAcetylated-Lysine antibody(#9441, Cell Signaling)をそれぞれ用いた。
<223> siRNAの配列:DNA/RNA結合分子
配列番号11〜20
<223> 人工的に合成されたプライマーの配列
Claims (6)
- 下記のいずれかの構造を有する化合物。
- 下記のいずれかの構造を有する化合物。
- 請求項1に記載の化合物と請求項2に記載の化合物の組み合わせを含む、染色体タンパク質をアシル化するための薬剤。
- 請求項1に記載の化合物と請求項2に記載の化合物の組み合わせを含む、がん細胞においてp53、p21またはp27の発現を誘導するための薬剤。
- 請求項1に記載の化合物と請求項2に記載の化合物の組み合わせを含む、染色体タンパク質のアセチル化の低下に起因する疾患を治療するための薬剤。
- 染色体タンパク質のアセチル化の減少に起因する疾患ががんである、請求項5に記載の薬剤。
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