WO2013168807A1 - 移植細胞懸濁液用の添加剤及び治療用組成物 - Google Patents

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志成 上杉
元也 西川
木下　茂
範子 小泉
直毅 奥村
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京都府公立大学法人
学校法人同志社
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Definitions

  • the present invention relates to an additive for transplanted cell suspension that can improve the therapeutic effect of cell therapy. Furthermore, the present invention relates to a therapeutic composition that exhibits an excellent therapeutic effect in cell therapy.
  • Cell adhesion by adhesamine is accompanied by phosphorylation of FAK and ERK, reorganization of the cytoskeleton, and formation of adhesion spots. These characteristics suggest that the cell adhesion by adhesamine is a physiological cell adhesion. Biochemical, cell biology, and organic chemistry studies have revealed that the molecular target of adhesamine is heparan sulfate on the cell surface.
  • adhesamine In addition to adhesamine, many heparan sulfate binding compounds have been reported. However, it is only a peptide-derived compound that shows cell adhesion promotion, that is, agonist-like activity as far as the present inventor knows, and adhesamine is the first non-peptide small molecule organic compound that promotes physiological adhesion.
  • Non-Patent Document 2 reports that adhesamine improves the survival rate of nerve cells and promotes differentiation.
  • Non-Patent Documents 3-5 it is reported that a dispirotripiperazine derivative having the same dispirotripiperazine structure as adhesamine has antiviral activity.
  • the cornea is a transparent tissue located in front of the eyeball, and serves as a “window” that transmits light to the retina, which is a nerve tissue behind the eyeball.
  • Corneal endothelial cells exist as a single cell group on the back of the cornea, have a pump function and a barrier function, and are essential for maintaining the transparency of the cornea.
  • corneal endothelial dysfunction occurs due to corneal endothelial dystrophy, eye surgery, trauma, etc.
  • the cornea is irreversibly clouded, resulting in severe visual impairment (vesicular keratopathy).
  • Bullous keratopathy is the leading cause of blindness by the cornea, and the only current treatment is corneal transplantation.
  • corneal transplantation has problems such as donor shortage, rejection, and corneal endothelial damage after transplantation.
  • the present inventors have already reported that transparent healing can be obtained by transplanting a cultured monkey corneal endothelial cell sheet to a bullous keratopathy model using a primate cynomolgus monkey as a model and a type I collagen sheet as a carrier. ing.
  • transplantation of a corneal endothelial cell sheet using a carrier has problems such as an effect on visual function due to a decrease in transparency due to the carrier itself and a technical difficulty in transplanting an extremely thin sheet. It has already been reported that transparent healing of the cornea cannot be obtained by injecting a suspension of cultured corneal endothelial cells into the anterior chamber.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1-5 only describe the cell adhesion promoting effect and antiviral activity of the dispirotripiperazine derivative, and do not mention its application to cell therapy.
  • an object of the present invention is to provide an additive for a transplanted cell suspension containing a dispirotripiperazine derivative or a salt thereof, which can improve the therapeutic effect of cell therapy. Furthermore, an object of the present invention is to provide a therapeutic composition containing a dispirotripiperazine derivative or a salt thereof that exhibits an excellent therapeutic effect in cell therapy.
  • the present inventors add a dispirotripiperazine derivative to a suspension of cultured corneal endothelial cells and administer it into the anterior chamber, so that the cornea is healed transparently, and the injected cultured corneal endothelial cells engraft and function.
  • the knowledge that it expresses was obtained.
  • stimulated by intradermal injection of the bone marrow origin cell which added the dispirotripiperazine derivative to the wound vicinity was also acquired.
  • the present invention has been completed on the basis of these findings and has been completed and provides the following additives, therapeutic compositions, etc. for transplanted cell suspensions.
  • Item 1 An additive for a transplanted cell suspension comprising a dispirotripiperazine derivative represented by the following formula (I) or (II) or a salt thereof.
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent hydrogen, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, cycloalkyl-substituted alkyl group, aryl group, heteroaryl group, aryl-substituted alkyl group or hetero An aryl-substituted alkyl group is shown.
  • R 1 and R 2 are not both hydrogen.
  • R 1 and R 2 may be bonded to dansyl hydrazine, a substance having integrin binding activity, RGD peptide or RGDS peptide directly or via a linker.
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group or alkyl moiety constituting R 1 and R 2 is halogen, hydroxy (the hydroxy may be acylated, carbamate or etherified), cyano, nitro, amino, It may be substituted with an atom or group selected from mono- or di-substituted amino, carbamoyl and sulfamoyl.
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, alkyl part or cycloalkyl part constituting R 1 and R 2 may be added to the group —O—, —S—, —SO—, —SO 2 —, —OSO.
  • the aryl group, aryl part, heteroaryl group, heteroaryl part, cycloalkyl group or cycloalkyl part constituting R 1 and R 2 is halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro
  • R 3 represents an alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, cycloalkylene group, cycloalkylalkylene group, arylene group, heteroarylene group, aryl-substituted alkylene group or heteroaryl-substituted alkylene group.
  • the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group or alkylene moiety constituting R 3 is halogen, hydroxy (the hydroxy may be acylated, carbamated or etherified), cyano, nitro, amino, mono or di. It may be substituted with an atom or group selected from substituted amino, carbamoyl and sulfamoyl.
  • the arylene group, aryl part, heteroarylene group, heteroaryl part, cycloalkylene group or cycloalkyl part constituting R 3 is halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro, amino, It may be substituted with an atom or group selected from mono- or di-substituted amino, carbamoyl, sulfamoyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonylamino, alkylcarbonylamino, methylenedioxy and aryl.
  • D 1 and D 2 are the same or different and represent N or CH. ] Item 2.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents hydrogen or a heteroaryl group (provided that R 1 and R 2 are not both hydrogen in the case of the compound of formula (I)),
  • the R 1 and R 2 may be bound with dansyl hydrazine, a substance having integrin binding activity, RGD peptide or RGDS peptide,
  • the heteroaryl group constituting R 1 and R 2 may be substituted with an atom or group selected from halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro and amino
  • R 3 represents an alkylene group or a heteroarylene group
  • the heteroarylene group constituting R 3 may be substituted with an atom or group selected from halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro and amino.
  • Item 2 The additive for transplanted cell suspension according to Item 1.
  • Item 3. The additive according to Item 1, wherein the dispirotripiperazine derivative is selected from the following group.
  • Item 4. The additive according to any one of Items 1 to 3, which has a cell survival promoting action.
  • Item 5 The additive according to any one of Items 1 to 4, wherein the cell is a corneal endothelial cell or a bone marrow-derived cell.
  • Item 6 A therapeutic composition comprising the dispirotripiperazine derivative or a salt thereof according to Item 1, and a cell.
  • composition according to claim 5 wherein the dispirotripiperazine derivative is the dispirotripiperazine derivative according to item 2 or 3.
  • Item 8. The composition according to Item 6 or 7, which is used for corneal treatment.
  • Item 9 The composition according to any one of Items 6 to 8, wherein the cell is a corneal endothelial cell.
  • Item 10. The composition according to Item 6 or 7, which is used for treating skin wounds.
  • Item 11 The composition according to Item 6, 7, or 10, wherein the cell is a bone marrow-derived cell.
  • Item 8. A cell transplantation method comprising administering a dispirotripiperazine derivative or a salt thereof according to Item 1, and a cell.
  • Item 13 The method according to Item 12, wherein the dispirotripiperazine derivative is the dispirotripiperazine derivative according to Item 2 or 3.
  • Item 14 The method according to Item 12 or 13, which is a corneal treatment method or a skin wound treatment method.
  • Item 15. The dispirotripiperazine derivative or a salt thereof according to any one of Items 1 to 3, for use in cell transplantation (preferably for corneal treatment or skin wound treatment).
  • Item 16 Use of a dispirotripiperazine derivative or a salt thereof according to any one of Items 1 to 3 for producing a cell engraftment promoter in cell transplantation (preferably for corneal treatment or skin wound treatment). .
  • cell transplantation can promote corneal transparent healing and wound healing, and is an excellent treatment in cell therapy. Expected to be effective.
  • BMDCs supplemented with 6 ⁇ M artificial fibronectin, BMDCs supplemented with 6 ⁇ M adhesamine, or non-added BMDCs were incubated on the culture plate for 24 hours. Results are expressed as the mean ⁇ SD value of 12 wells. * P ⁇ 0.05 indicates a statistically significant difference from the control group.
  • 2 is a graph showing adhesion of BMDCs to cultured endothelial cells. BMDCs to which 6 ⁇ M artificial fibronectin was added, BMDCs to which 6 ⁇ M adhesamine was added, or unadded BMDCs were added onto the cultured MAEC cell monolayer and incubated for 24 hours. The results were expressed as the mean ⁇ SD value of 12 wells.
  • A A graph showing changes in wound healing over time in C57BL / 6 mice.
  • BMDCs added with 6 ⁇ M artificial fibronectin ( ⁇ ) and non-added BMDCs ( ⁇ ) were prepared at 5 ⁇ 10 5 cells / shot and injected intradermally into two places near the wound. Further, HBSS ( ⁇ ) not containing BMDCs or 6 ⁇ M artificial fibronectin ( ⁇ ) was also injected in the same manner. The results were expressed as the mean ⁇ SD value of 4-6 mice.
  • B Representative photograph of dorsal skin wound of C57BL / 6 mice. Photographed 3 days after transplantation of BMDCs.
  • HBSS ( ⁇ ) containing no BMDCs was also injected in the same manner. The results were expressed as the mean ⁇ SD value of 4-6 mice.
  • B Representative photograph of dorsal skin wound of db / db mice. Photographed 3 days after transplantation of BMDCs.
  • HBSS group (b) BMDCs group, (c) BMDCs group supplemented with 6 ⁇ M artificial fibronectin. This experiment was repeated twice and the typical experimental results were shown.
  • * P ⁇ 0.05 indicates that there is a statistically significant difference from the HBSS group. It is a photograph which shows the influence on the cell adhesion in invitro of small molecule fibronectin.
  • NIH3T3 cells were treated with compounds (1% (v / v) DMSO, 0.6-60 ⁇ M adhesamine-RGDS, 60 ⁇ M Y-27632, 0.04 ⁇ M fibronectin) for 24 hours under serum-free anoikis-inducing conditions. Under serum-free anoikis-induced conditions, most cells are suspended and dispersed. The cell viability was determined by a WST assay that measures the activity of NADPH dehydrogenase, and the cell viability immediately after seeding was 1. Average values of three samples were shown for each treatment. It is a graph which shows the cell viability on serum-free anoikis induction conditions.
  • the cell viability was determined by a WST assay that measures the activity of NADPH dehydrogenase, and the cell viability immediately after seeding was 1. Average values of three samples were shown for each treatment. It is a photograph which shows the result of re-cultivating floating cells. Dispersed floating cells were separately collected from the sample of FIG. 21, re-cultured on a tissue culture treatment plate, and grown on complete medium (DMEM with 10% FBS) for 10 days. Cells were fixed and stained with 0.25% crystal violet.
  • additive for transplanted cell suspension of the present invention comprises a dispirotripiperazine derivative represented by the following formula (I) or (II) or a salt thereof:
  • R 1 and R 2 are the same or different and represent hydrogen, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, cycloalkyl-substituted alkyl group, aryl group, heteroaryl group, aryl-substituted alkyl group or hetero An aryl-substituted alkyl group is shown.
  • R 1 and R 2 are not both hydrogen.
  • R 1 and R 2 may be bonded to dansyl hydrazine, a substance having integrin binding activity, RGD peptide or RGDS peptide directly or via a linker.
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group or alkyl moiety constituting R 1 and R 2 is halogen, hydroxy (the hydroxy may be acylated, carbamate or etherified), cyano, nitro, amino, It may be substituted with an atom or group selected from mono- or di-substituted amino, carbamoyl and sulfamoyl.
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, cycloalkyl group, alkyl part or cycloalkyl part constituting R 1 and R 2 may be added to the group —O—, —S—, —SO—, —SO 2 —, —OSO.
  • the aryl group, aryl part, heteroaryl group, heteroaryl part, cycloalkyl group or cycloalkyl part constituting R 1 and R 2 is halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro
  • R 3 represents an alkylene group, alkenylene group, alkynylene group, cycloalkylene group, cycloalkylalkylene group, arylene group, heteroarylene group, aryl-substituted alkylene group or heteroaryl-substituted alkylene group.
  • the alkylene group, alkenylene group, alkynylene group and alkylene moiety constituting R 3 are halogen, hydroxy (the hydroxy may be acylated, carbamate or etherified), cyano, nitro, amino, mono or di. It may be substituted with an atom or group selected from substituted amino, carbamoyl and sulfamoyl.
  • the arylene group, aryl part, heteroarylene group, heteroaryl part, cycloalkylene group or cycloalkyl part constituting R 3 is halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro, amino, It may be substituted with an atom or group selected from mono- or di-substituted amino, carbamoyl, sulfamoyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonylamino, alkylcarbonylamino, methylenedioxy and aryl.
  • D 1 and D 2 are the same or different and represent N or CH. ]
  • the salt of the dispirotripiperazine derivative represented by the above formula (I) or (II) is a salt of two molecules of a monovalent anion or one molecule of a divalent anion per molecule of a dispirotripiperazine derivative. means.
  • salts include hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, perchlorate and other inorganic acid salts, oxalate, malonate, succinate, Organics such as maleate, fumarate, lactate, malate, tartrate, benzoate, trifluoroacetate, acetate, methanesulfonate, p-toluenesulfonate, trifluoromethanesulfonate And acidic amino acid salts such as glutamate and aspartate.
  • Examples of the dispirotripiperazine derivative to which dansylhydrazine is bound include a compound represented by the following formula (c). Dansylhydrazine may be directly bonded or may be bonded via a linker.
  • the substance having integrin-binding activity is not particularly limited as long as it is a compound capable of binding to integrin.
  • RGD (Arg-Gly-Asp-Ser) peptide RGD (Arg-Gly-Asp-Ser) peptide And R groups of compounds represented by the following formula (h), RGD peptides, and derivatives or mimics of RGDS peptides.
  • the substance having integrin binding activity may be either directly bound or bound via a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as it can bind a substance having integrin binding activity, and can be used in various lengths and structures.
  • -C NO-CH 2- CO- etc. are mentioned.
  • Examples of the dispirotripiperazine derivative to which a substance having integrin binding activity include, for example, a compound represented by the following formula (j).
  • each group shown in the above (I) and (II) is as follows.
  • alkyl group may be any of linear, branched or cyclic, such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, Examples include hexyl, heptyl, octyl, nonyl and decyl.
  • the carbon number is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20.
  • alkenyl group may be linear, branched or cyclic, and has at least one double bond.
  • the number of carbon atoms is preferably 2-30, more preferably 2-20.
  • alkynyl group may be any of linear, branched or cyclic, and means having at least one triple bond, for example, ethynyl, 1- or 2-propynyl, 1-, 2- or 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl and their equivalents.
  • the number of carbon atoms is preferably 2-30, more preferably 2-20.
  • cycloalkyl group examples include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl.
  • the carbon number is preferably 3 to 8, more preferably 5 or 6.
  • Aryl group means a monocyclic or polycyclic group consisting of a 5- or 6-membered aromatic hydrocarbon ring. Specific examples include phenyl, naphthyl, fluorenyl, anthryl, biphenylyl, tetrahydronaphthyl, chromanyl. 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyl, indanyl and phenanthryl.
  • Heteroaryl group means a monocyclic or polycyclic group consisting of a 5- or 6-membered aromatic ring containing 1 to 3 heteroatoms selected from N, O and S. In the case of the system, at least one ring may be an aromatic ring, and it is preferable that N is present next to the carbon atom bonded to another molecule.
  • heteroaryl group is particularly preferably a monocyclic group consisting of a 6-membered aromatic ring containing 2 or 3 heteroatoms (particularly N atoms).
  • Alkyl moiety means not only each alkyl group in a cycloalkyl-substituted alkyl group, aryl-substituted alkyl group and heteroaryl-substituted alkyl group, but also hydroxyalkyl, alkylthio, alkylsulfonyl, alkylsulfonylamino, alkylcarbonylamino, And alkyl groups in alkoxy (O-alkyl groups), and alkyl groups that are mono- or di-substituted amino, carbamoyl and sulfamoyl substituents.
  • Cycloalkyl moiety means a cycloalkyl group of a cycloalkyl-substituted alkyl group and a cycloalkylalkylene group.
  • Aryl moiety means an aryl group of an aryl-substituted alkyl group and an aryl-substituted alkylene group.
  • Heteroaryl moiety means a heteroaryl group of a heteroaryl-substituted alkyl group or a heteroaryl-substituted alkylene group.
  • Specific examples of the composite group containing an alkyl, cycloalkyl, aryl or heteroaryl moiety include those obtained by applying the specific examples described above for each group to the corresponding moiety.
  • cycloalkyl-substituted alkyl group examples include cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl and cycloheptylmethyl.
  • aryl-substituted alkyl group examples include benzyl, naphthylmethyl, fluorenylmethyl, anthrylmethyl, biphenylylmethyl, tetrahydronaphthylmethyl, chromanylmethyl, 2,3-dihydro-1,4-dioxana Phthalenylmethyl, indanylmethyl, phenanthrylmethyl, phenethyl, naphthylethyl, fluorenylethyl, anthrylethyl, biphenylylethyl, tetrahydronaphthylethyl, chromanylethyl, 2,3-dihydro-1,4- And dioxanaphthalenylethyl, indanylethyl, and phenanthrylethyl.
  • heteroaryl-substituted alkyl group examples include furylmethyl, thienylmethyl, pyrrolylmethyl, imidazolylmethyl, pyrazolylmethyl, oxazolylmethyl, thiazolylmethyl, isoxazolylmethyl, isothiazolylmethyl, pyridylmethyl, pyrazinylmethyl, Pyrimidinylmethyl, pyridazinylmethyl, indolylmethyl, quinolylmethyl, isoquinolylmethyl, benzo [b] thienylmethyl, benzimidazolylmethyl, furylethyl, thienylethyl, pyrrolylethyl, imidazolylethyl, pyrazolylethyl, oxazolylethyl, Thiazolylethyl, isoxazolylethyl, isothiazolylethyl, pyridylethyl, pyrazin
  • Halogen atom means fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • “Acylated hydroxy” means alkylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy or aryl-substituted alkylcarbonyloxy.
  • Carbated hydroxy means alkylaminocarbonyloxy, arylaminocarbonyloxy or aryl-substituted alkylaminocarbonyloxy.
  • “Etherified hydroxy” means alkyloxy, aryloxy or aryl-substituted alkyloxy.
  • alkylcarbonyloxy examples include methylcarbonyloxy, ethylcarbonyloxy, n-propylcarbonyloxy, isopropylcarbonyloxy, n-butylcarbonyloxy, isobutylcarbonyloxy, tert-butylcarbonyloxy, n-pentylcarbonyloxy, iso Examples include pentylcarbonyloxy and hexylcarbonyloxy.
  • arylcarbonyloxy examples include phenylcarbonyloxy, naphthylcarbonyloxy, fluorenylcarbonyloxy, anthrylcarbonyloxy, biphenylylcarbonyloxy, tetrahydronaphthylcarbonyloxy, chromanylcarbonyloxy, 2,3-dihydro-1 , 4-dioxanaphthalenylcarbonyloxy, indanylcarbonyloxy and phenanthrylcarbonyloxy.
  • aryl-substituted alkylcarbonyloxy examples include benzylcarbonyloxy, naphthylmethylcarbonyloxy, fluorenylmethylcarbonyloxy, anthrylmethylcarbonyloxy, biphenylylmethylcarbonyloxy, tetrahydronaphthylmethylcarbonyloxy, chromanylmethylcarbonyloxy 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylmethylcarbonyloxy, indanylmethylcarbonyloxy, phenanthrylmethylcarbonyloxy, phenethylcarbonyloxy, naphthylethylcarbonyloxy, fluorenylethylcarbonyloxy, an Tolylethylcarbonyloxy, biphenylylethylcarbonyloxy, tetrahydronaphthylethylcarbonyloxy, chromanylethyl Ruboniruokishi, 2,3-dihydro-1
  • alkylaminocarbonyloxy examples include methylaminocarbonyloxy, ethylaminocarbonyloxy, n-propylaminocarbonyloxy, isopropylaminocarbonyloxy, n-butylaminocarbonyloxy, isobutylaminocarbonyloxy, tert-butylaminocarbonyloxy N-pentylaminocarbonyloxy, isopentylaminocarbonyloxy and hexylaminocarbonyloxy.
  • arylaminocarbonyloxy examples include phenylaminocarbonyloxy, naphthylaminocarbonyloxy, fluorenylaminocarbonyloxy, anthrylaminocarbonyloxy, biphenylylaminocarbonyloxy, tetrahydronaphthylaminocarbonyloxy, chromanylaminocarbonyloxy. 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylaminocarbonyloxy, indanylaminocarbonyloxy and phenanthrylaminocarbonyloxy.
  • aryl-substituted alkylaminocarbonyloxy examples include benzylaminocarbonyloxy, naphthylmethylaminocarbonyloxy, fluorenylmethylaminocarbonyloxy, anthrylmethylaminocarbonyloxy, biphenylylmethylaminocarbonyloxy, tetrahydronaphthylmethylaminocarbonyl Oxy, chromanylmethylaminocarbonyloxy, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylmethylaminocarbonyloxy, indanylmethylaminocarbonyloxy, phenanthrylmethylaminocarbonyloxy, phenethylaminocarbonyloxy, naphthyl Ethylaminocarbonyloxy, fluorenylethylaminocarbonyloxy, anthrylethylaminocarbonyloxy, bife Rylethylaminocarbonyloxy,
  • alkyloxy examples include methyloxy, ethyloxy, n-propyloxy, isopropyloxy, n-butyloxy, isobutyloxy, tert-butyloxy, n-pentyloxy, isopentyloxy and hexyloxy.
  • aryloxy examples include phenyloxy, naphthyloxy, fluorenyloxy, anthryloxy, biphenylyloxy, tetrahydronaphthyloxy, chromanyloxy, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyl Examples include oxy, indanyloxy and phenanthryloxy.
  • aryl-substituted alkyloxy examples include benzyloxy, naphthylmethyloxy, fluorenylmethyloxy, anthrylmethyloxy, biphenylylmethyloxy, tetrahydronaphthylmethyloxy, chromanylmethyloxy, 2,3-dihydro-1 , 4-Dioxanaphthalenylmethyloxy, indanylmethyloxy, phenanthrylmethyloxy, phenethyloxy, naphthylethyloxy, fluorenylethyloxy, anthrylethyloxy, biphenylylethyloxy, tetrahydronaphthylethyloxy, Examples include chromanylethyloxy, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylethyloxy, indanylethyloxy and phenanthrylethyloxy.
  • “Mono-substituted” in a mono- or di-substituted amino group, mono- or di-substituted carbamoyl group or mono- or di-substituted sulfamoyl group means that one of the hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group, carbamoyl group or sulfamoyl group is alkyl.
  • the term “disubstituted” means that two hydrogen atoms bonded to the nitrogen atom of the amino group, carbamoyl group or sulfamoyl group are substituted with the same or different alkyl.
  • Examples of the amino group mono-substituted by alkyl include methylamino, ethylamino, n-propylamino, isopropylamino, n-butylamino, isobutylamino, tert-butylamino, n-pentylamino, isopentylamino and hexylamino. Can be mentioned.
  • amino group disubstituted with alkyl examples include dimethylamino, diethylamino, di-n-propylamino, diisopropylamino, di-n-butylamino, diisobutylamino, ditert-butylamino, di-n-pentylamino, diisopentylamino And dihexylamino.
  • Alkyl monosubstituted carbamoyl groups include methylcarbamoyl, ethylcarbamoyl, n-propylcarbamoyl, isopropylcarbamoyl, n-butylcarbamoyl, isobutylcarbamoyl, tert-butylcarbamoyl, n-pentylcarbamoyl, isopentylcarbamoyl and hexylcarbamoyl. Can be mentioned.
  • Examples of the carbamoyl group disubstituted with alkyl include dimethylcarbamoyl, diethylcarbamoyl, di-n-propylcarbamoyl, diisopropylcarbamoyl, din-butylcarbamoyl, diisobutylcarbamoyl, ditert-butylcarbamoyl, din-pentylcarbamoyl, diisopentyl Examples include rucarbamoyl and dihexylcarbamoyl.
  • alkyl-substituted monosulfamoyl group examples include methylsulfamoyl, ethylsulfamoyl, n-propylsulfamoyl, isopropylsulfamoyl, n-butylsulfamoyl, isobutylsulfamoyl, tert-butylsulfamo And moyl, n-pentylsulfamoyl, isopentylsulfamoyl and hexylsulfamoyl.
  • alkyl-disubstituted sulfamoyl group examples include dimethylsulfamoyl, diethylsulfamoyl, di-n-propylsulfamoyl, diisopropylsulfamoyl, di-n-butylsulfamoyl, diisobutylsulfamoyl, ditert- Examples include butyl sulfamoyl, di-n-pentyl sulfamoyl, diisopentyl sulfamoyl and dihexyl sulfamoyl.
  • hydroxyalkyl group examples include hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxy-n-propyl, hydroxyisopropyl, hydroxy-n-butyl, hydroxyisobutyl, hydroxy-tert-butyl, hydroxy-n-pentyl, hydroxyisopentyl And hydroxyhexyl.
  • alkoxy group examples include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentyloxy, isopentyloxy and hexyloxy.
  • alkylthio group examples include methylthio, ethylthio, n-propylthio, isopropylthio, n-butylthio, isobutylthio, tert-butylthio, n-pentylthio, isopentylthio and hexylthio.
  • alkylsulfonyl group examples include methylsulfonyl and ethylsulfonyl.
  • alkylsulfonylamino group examples include methylsulfonylamino and ethylsulfonylamino.
  • alkylcarbonylamino group examples include methylcarbonylamino and ethylcarbonylamino.
  • the “alkylene group” may be linear, branched or cyclic.
  • the carbon number is preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20.
  • alkenylene group may be linear, branched or cyclic, and means having at least one double bond, such as vinylene, arylene, 1-propenylene, 2-methyl-2- Propenylene, isopropenylene, 1-, 2- or 3-butenylene, 2-, 3- or 4-pentenylene, 2-methyl-2-butenylene, 3-methyl-2-butenylene, 5-hexenylene, 1-cyclopent And tenylene, 1-cyclohexenylene, 3-methyl-3-butenylene, and the like.
  • the number of carbon atoms is preferably 2-30, more preferably 2-20.
  • alkynylene group may be any of linear, branched or cyclic, and means having at least one triple bond, such as ethynylene, 1- or 2-propynylene, 1-, 2- or Examples include 3-butynylene, 1-methyl-2-propynylene, and equivalents thereof.
  • the number of carbon atoms is preferably 2-30, more preferably 2-20.
  • cycloalkylene group examples include cyclopropylene, cyclobutylene, cyclopentylene, cyclohexylene and cycloheptylene.
  • the carbon number is preferably 3 to 8, more preferably 5 or 6.
  • arylene group means a monocyclic or polycyclic group composed of a 5- or 6-membered aromatic hydrocarbon ring, and specific examples include phenylene and naphthylene.
  • Heteroarylene group means a monocyclic or polycyclic group consisting of a 5- or 6-membered aromatic ring containing 1 to 3 heteroatoms selected from N, O and S. In the case of the system, at least one ring may be an aromatic ring, and it is preferable that N is present next to the carbon atom bonded to another molecule. Specific examples include furylene, thienylene and pyrimidinylene.
  • the “heteroarylene group” is particularly preferably a monocyclic group consisting of a 6-membered aromatic ring containing two heteroatoms (particularly N atoms).
  • Alkylene moiety means each alkylene group in a cycloalkylalkylene group, an aryl-substituted alkylene group, and a heteroaryl-substituted alkylene group.
  • Specific examples of the composite group containing alkylene include those in which the above-described specific examples for each group are applied to the corresponding part.
  • cycloalkylalkylene group examples include cyclopropylmethylene, cyclobutylmethylene, cyclopentylmethylene, cyclohexylmethylene and cycloheptylmethylene.
  • aryl-substituted alkylene group examples include naphthylmethylene, fluorenylmethylene, anthrylmethylene, biphenylylmethylene, tetrahydronaphthylmethylene, chromanethylene, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenes.
  • Examples include nylmethylene, indanylmethylene, phenanthrylmethylene, naphthylethylene, fluorenylethylene, anthrylethylene, biphenylylethylene, tetrahydronaphthylethylene, chromanethylene, indanylethylene, and phenanthrylethylene.
  • heteroaryl-substituted alkylene group examples include furylmethylene, thienylmethylene, pyrrolylmethylene, imidazolylmethylene, pyrazolylmethylene, oxazolylmethylene, thiazolylmethylene, isoxazolylmethylene, isothiazolylmethylene, Pyridylmethylene, pyrazinylmethylene, pyrimidinylmethylene, pyridazinylmethylene, indolylmethylene, quinolylmethylene, isoquinolylmethylene, benzo [b] thienylmethylene, benzimidazolylmethylene, furylethylene, thienylethylene, pyrrolylethylene Imidazolylethylene, pyrazolylethylene, oxazolylethylene, thiazolylethylene, isoxazolylethylene, isothiazolylethylene, pyridylethylene, pyrazinylethylene, Mi
  • R 1 and R 2 are preferably hydrogen, aryl group, heteroaryl group, aryl-substituted alkyl group or heteroaryl-substituted alkyl group, more preferably hydrogen, heteroaryl group or heteroaryl-substituted alkyl group, particularly Preferably it is hydrogen or a heteroaryl group.
  • the heteroaryl group is preferably pyrimidinyl or 1,3,5-triazinyl.
  • the aryl group, heteroaryl group, aryl moiety and heteroaryl moiety may be substituted with 1 to 3 atoms or groups as described above.
  • a substance having integrin binding activity particularly RGD peptide or RGDS peptide is bound to R 1 and R 2 , since a high protective effect against anoikis is obtained.
  • R 3 is preferably an alkylene group, an arylene group or a heteroarylene group, more preferably an alkylene group or a heteroarylene group.
  • a heteroarylene group pyrimidinylene is preferable.
  • the arylene group and heteroarylene group may be substituted with 1 to 2 atoms or groups described above.
  • R 1 and R 2 are the same or different and each represents hydrogen or a heteroaryl group. However, in the case of the compound of formula (I), R 1 and R 2 are not both hydrogen. R 1 and R 2 may be bonded to dansyl hydrazine, an R group of a compound represented by the following formula (h), an RGD peptide or an RGDS peptide.
  • the heteroaryl group constituting R 1 and R 2 may be substituted with an atom or group selected from halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro and amino.
  • R 3 represents an alkylene group or a heteroarylene group.
  • the heteroarylene group constituting R 3 may be substituted with an atom or group selected from halogen, hydroxy, formyl, alkyl, hydroxyalkyl, alkoxy, alkylthio, cyano, nitro and amino.
  • D 1 and D 2 are the same or different and represent N or CH. ]
  • dispirotripiperazine derivatives of the present invention specific examples include the following compounds and salts thereof.
  • the compounds represented by the formulas (h) and (j) are compounds to which a substance having integrin binding activity is bound.
  • the cell adhesion promoting activity of the compounds (a) to (g) was evaluated in International Publication No. 2009/154201, and it was shown that the compound has cell adhesion promoting activity.
  • the compounds represented by the formula (I) and salts thereof include, for example, compounds of the following formula (III), R 1 -X 1 and R 2 -X 2 (X 1 and X 2 are the same or different leaving groups, such as halogen such as Cl and Br, p-toluenesulfonyloxy, methanesulfonyloxy, etc.) It can be produced by converting to a compound of formula (I).
  • the reaction of the compound of formula (III) with the reactive derivatives of R 1 and R 2 is carried out in a solvent or without solvent.
  • the solvent to be used should be selected according to the type of raw material compound, etc., for example, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, ethylene glycol diethyl ether, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, 1,3-dimethyl Examples include -2-imidazolidinone and 1-methyl-2-pyrrolidinone. These solvents are used alone or in combination of two or more.
  • This reaction is performed in the presence of a base as necessary.
  • a base include organic bases such as triethylamine, ethyldiisopropylamine, N-methylmorpholine, pyridine, and 4-dimethylaminopyridine.
  • reaction temperature and reaction time vary depending on the type of raw material compound used, but the reaction temperature is usually about 0 ° C. to about 150 ° C., and the reaction time is about 0.5 hour to about 72 hours.
  • the molar ratio in the reaction between the compound of formula (III) and the reactive derivative of R 1 and R 2 varies depending on the kind of the raw material compound, but is usually 1: 1.2 to 1:20, more preferably 1: 2 to 1:10.
  • a compound represented by the formula (II) and a salt thereof are prepared by reacting the compound of the above formula (III) with R 3 -X 1 X 2 (X 1 and X 2 are as defined above), Accordingly, the product can be produced by converting the product into a compound of the formula (II) to which two other dispirotripiperazine derivatives are bonded.
  • the molar ratio in the reaction between the compound of formula (III) and the reactive derivative of R 3 varies depending on the type of the raw material compound, but is usually 600: 1 to 2: 1, more preferably 200: It is 1-2: 1.
  • Compound (III) as a raw material compound in the above production method, and reactive derivatives of R 1 , R 2 and R 3 can be produced by a method known per se or can be easily obtained because they are commercially available. it can.
  • dansyl hydrazine derivatization After reacting the compound of the above formula (III) with the reactive derivatives of R 1 , R 2 and R 3 , dansyl hydrazine derivatization can be performed. This reaction can be carried out under the reaction conditions usually used for dansylhydrazine derivatization reaction.
  • the compound of formula (I) or (II) produced by the above production method or a production method according to these can be isolated and purified according to conventional methods such as chromatography, recrystallization, reprecipitation and the like. It can be converted into a salt by treating with various acids according to a conventional method.
  • the compound of formula (I) or (II) can be obtained in the form of a salt depending on the reaction / treatment conditions, etc., but can be converted into the compound of formula (I) or (II) according to a conventional method.
  • the transplanted cell suspension in the present invention means a solution in which cells for use in transplantation treatment are suspended.
  • the effective concentration of the dispirotripiperazine derivative or a salt thereof in the transplanted cell suspension is preferably about 0.1 to 1,000 ⁇ M, more preferably about 1 to 100 ⁇ M.
  • the transplanted cells in the present invention are preferably animal cells, more preferably mammalian animal cells.
  • mammalian animal cells include cells derived from humans, mice, rats, rabbits and the like.
  • the type of transplanted cell is not particularly limited as long as it is a cell used for cell transplantation (cell therapy), and preferably a corneal endothelial cell, a bone marrow-derived cell, a fibroblast, and the like.
  • a buffer solution or a medium can be used.
  • the buffer solution include phosphate buffered saline (PBS) and Hanks solution (HBSS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • HBSS Hanks solution
  • a medium suitable for the type of cell may be appropriately selected and used.
  • Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Williams E medium
  • Ham F-10 medium F-12 medium
  • RPMI -1640 medium MCDB153 medium
  • 199 medium etc.
  • the medium may be either a medium supplemented with serum or a serum-free medium, but a serum-free medium is preferred.
  • the additive of the present invention in a transplanted cell suspension, it is possible to promote transparent healing of the cornea and wound healing by transplanting cells (cell therapy), and an excellent therapeutic effect is obtained in cell therapy. It is expected. Since the additive of the present invention has a cell engraftment promoting action, such an effect is considered to be obtained.
  • the cell therapy in this specification means the therapy which treats a disease by transplanting a cell.
  • the therapeutic composition of the present invention is characterized by comprising the above-mentioned dispirotripiperazine derivative or a salt thereof, and cells.
  • the cells here are the same as those described above.
  • the therapeutic composition of the present invention is administered to mammals including humans and can be used parenterally in the form of an injection of a transplanted cell suspension.
  • a buffer solution, a culture medium, etc. can be used for this suspension, What was mentioned above as a suspension and a culture medium is mentioned.
  • the effective concentration of the dispirotripiperazine derivative or a salt thereof in the therapeutic composition is preferably about 0.1 to 1,000 ⁇ M, more preferably about 1 to 100 ⁇ M.
  • the dosage of the therapeutic composition of the present invention can be appropriately determined finally based on the judgment of a doctor in consideration of the type of dosage form, administration method, patient age and weight, patient symptom, and the like.
  • the therapeutic composition of the present invention can promote transparent healing of the cornea and wound healing by cell transplantation (cell therapy), and is expected to have an excellent therapeutic effect in cell therapy.
  • Example 1 HPLC used Shimadzu LC-2010C. Integer mass spectrometry was measured by Shimadzu LCMS-2010 (ESI mode), and accurate mass spectrometry was measured by JEOL MS Station JMS-700 (FAB mode). For 1 H NMR spectra, JEOL JNM-ECP 300 MHz or JEOL JNM-ECA 600 MHz spectrometers were used.
  • 1,3-di-4-piperidylpropane (27.7 mg, 0.13 mmol) was added to a mixture of compound SI-2 (99.3 mg, 0.26 mmol) and K 2 CO 3 (45.6 mg, 0.33 mmol) in acetonitrile (1.5 mL). The mixture was added and stirred at 50 ° C. overnight. The precipitate was removed by filtration, and the residue obtained by concentrating the filtrate was purified by chromatography on NH-coated silica gel (Fuji Silysia Chemical Ltd.), white powder SI-3 (70.8 mg, 67% yield) Got.
  • NIH3T3 / Luc cells in which luciferase was stably expressed in the mouse fibroblast cell line NIH / 3T3 cells were subcultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • mice were sacrificed over time to recover the damaged area, solubilized with lysis buffer (0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris HCl, pH 7.8), and centrifuged at 4 ° C, 12,000 g for 15 minutes Thereafter, the supernatant was collected. 50 ⁇ l of luciferase assay buffer (Picagene, Tokyo Ink, Tokyo Japan) was mixed with 10 ⁇ l of the supernatant, and luminescence was immediately measured with a luminometer (Lumat LB 9507, EG & G Berthold, Bad Wildbad, Germany).
  • mice were administered into the tail vein of C57BL6 mice. Two hours after administration, mice were sacrificed and the lungs were collected, solubilized with lysis buffer (0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris HCl, pH 7.8), and 10 minutes at 4 ° C, 11,000 g After centrifugation, the supernatant was collected. 10 ⁇ l of the supernatant was mixed with 100 ⁇ l of luciferase assay buffer (Picagene, Tokyo Ink, Tokyo Japan), and luminescence was immediately measured with a luminometer (Lumat LB 9507, EG & G Berthold, Bad Wildbad, Germany).
  • lysis buffer 0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris HCl, pH 7.8
  • 10 minutes at 4 ° C, 11,000 g After centrifugation, the supernatant was collected. 10 ⁇ l of the supernatant was mixed with 100 ⁇ l
  • N, N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), piperidine, N, N-dimethylformamide (DMF) and N-methylmorpholine are available from Wako Pure Chemical (Osaka, Japan) and (Boc -Aminooxy) acetic acid and (7-azabenzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyAOP) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Reagent K was adjusted before use.
  • RGDS resin was obtained by the usual Fmoc solid phase synthesis method using Rink amide MBHA resin. That is, the condensation was carried out in DMF using 5 equivalents of the Fmoc-protected amino acid, DIC, and HOBt with respect to the loading capacity (0.6 mmol / g) of the carrier resin. At each step, the reaction was confirmed by a Kaiser test.
  • the compound 2 is referred to as artificial fibronectin or small molecule fibronectin.
  • RPMI-1640 medium Hanks buffered saline solution (HBSS), and phosphate buffer solution (PBS) were purchased from Nippon Suisan Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • Adhesamine was synthesized as previously reported (Chem. Biol., 2009, 16, 773-782), and artificial fibronectin was synthesized by the method described above.
  • commercially available special grade products were used.
  • mice Purchase 5 or 10-13 weeks old male C57BL / 6 strain mice and enhanced green fluorescent protein (eGFP) transgenic mice prepared from the same strain mice from Japan SLC (Shizuoka, Japan) The animals were reared with standard food and water in a conventional environment. Diabetes db / db mice (C57BLKS / JInvent + Lepr db / + Lepr db, 10-13 weeks old) and its normal littermates db / m - mice (C57BLKS / J7.3 -m + / + Lepr db, 5 weeks Age) was purchased from the Institute for Animal Breeding (Ibaraki, Japan). All animal experiments were conducted with the approval of the Animal Experiment Committee of Kyoto University graduate School of Pharmaceutical Sciences.
  • eGFP enhanced green fluorescent protein
  • Bone marrow cells are filtered through a cell strainer with a pore size of 40 ⁇ m (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA), and lysed red blood cells are lysed by incubating in hypotonic 0.1% ammonium chloride solution for 5 minutes at room temperature. did. Residual cells were collected by centrifugation at 450 ⁇ g for 10 minutes, and used as bone marrow-derived cells (BMDCs) for subsequent studies.
  • BMDCs bone marrow-derived cells
  • BMDCs to which 6 ⁇ M artificial fibronectin or 6 ⁇ M adhesamine is added, or BMDCs to which nothing is added are seeded in a 96-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells / well in RPMI medium, 37 ° C., 5% CO 2 The cells were cultured under humidified conditions. The number of BMDCs adhering to the culture plate was measured by the MTT method (Br. J. Cancer, 1989, 60, 206-210), except for floating BMDCs.
  • BMDCs Adhesion experiment of BMDCs to vascular endothelial cells
  • MAEC suspended in M199 medium was seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured for 24 hours at 37 ° C., 5% CO 2 and humidified conditions.
  • BMDCs were suspended in RPMI at 1 ⁇ 10 5 cells / well, 6 ⁇ M adhesamine or 6 ⁇ M artificial fibronectin was added, and incubated at room temperature for 5-10 minutes.
  • BMDCs were then added onto the MAEC monolayer and incubated for 24 hours. The number of BMDCs adhered to MAEC was measured by the MTT method, except for floating BMDCs.
  • BMDCs with or without 6 ⁇ M artificial fibronectin were prepared in HBSS at 5 ⁇ 10 5 / shot and injected intradermally at two locations above and below the wound. Similarly, HBSS or 6 ⁇ M artificial fibronectin was injected intradermally at two locations above and below the wound. 24 hours after the intradermal injection, the wound was covered with a protective film (Tegaderm, 3M, London, ON, Canada). The length of the wound in two directions was measured using a caliper over time, and the wound area was calculated by multiplying them.
  • 5'-ctacggcgtgcagtgcttcag-3 'and 5'-tagccttcgggcatgg-3' were used as forward and reverse oligonucleotide primers, respectively.
  • Amplification products were detected using intercalation of fluorescent dye SYBR green (LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA).
  • FIG. 5 shows the number of BMDCs adhering to monolayer-cultured MAEC when adhesamine derivative was added or not added. Compared to the control group, the number of adherent BMDCs significantly increased to about 131% in the 6 ⁇ M artificial fibronectin added group and about 110% in the 6 ⁇ M adhesamine added group. Thus, artificial fibronectin showed higher cell adhesion activity than adhesamine at the same concentration.
  • FIG. 6 shows the change over time of the number of BMDCs / eGFP remaining in the skin tissue after intradermal injection.
  • the number of BMDCs / eGFP cells was significantly higher in the 6 ⁇ M artificial fibronectin added group than in the non-added group. Similar results were obtained in studies using NIH3T3 / Luc cells (data not shown).
  • FIG. 7 shows the change in wound size over time after BMDCs transplantation. Wound healing was significantly promoted by intradermal injection of BMDCs, which have high potential for wound healing, near the wound. In the BMDCs group added with 6 ⁇ M artificial fibronectin, the wound contracted significantly earlier than in the BMDCs group not added (FIG. 7A). FIG. 7B shows representative wound photographs of each group on the third day after treatment.
  • FIG. 8A shows a photograph of a representative wound 3 days after treatment.
  • the corneal endothelium was removed from the eyeballs removed from cynomolgus monkeys euthanized for another purpose, and the corneal endothelium together with the Descemet's membrane, the basement membrane. Peeled from the corneal tissue. Subsequently, corneal endothelial cells were enzymatically recovered using collagenase and subjected to primary culture and subculture.
  • the cell density was maintained at 2000 cells / mm 2 or more, which is the standard for normal corneal endothelial cells, and the cells were maintained in good shape. And examined.
  • Cell culture was performed using DMEM to which 10% FBS and 2 ng / ml FGF2 were added as a basic medium.
  • Rabbit corneal endothelial cells were mechanically detached under general anesthesia to create a bullous keratopathy model.
  • Rabbit cultured corneal endothelial cells subcultured in the same manner as described above were collected from the culture dish by trypsin treatment, and 200 ⁇ l of a suspension containing 5.0 ⁇ 10 5 cells was added using serum-free DMEM. It was administered into the anterior chamber with a 25G needle (FIG. 11). The cells were previously labeled with DiI. Subsequently, the rabbit was placed in a 3-hour depression posture with the corneal epithelium side facing downward (FIG. 12).
  • RCEC group in which only cell suspension was injected into the anterior chamber as the group composition
  • RCEC + SM-FN group in which small molecule fibronectin was added to the suspension at a final concentration of 10 ⁇ M
  • corneal endothelium was detached as a control
  • the transparency of the cornea tended to be slightly higher than that in the control group, but bullous keratopathy occurred with edema and opacity of the corneal stroma.
  • the cornea was transparently healed and the cultured corneal endothelial cells that were injected were engrafted to express the function (FIG. 13).
  • graded corneal opacity according to Sotozono C et al. (Sotozono C, et al. Opthalmology; 114: 1294-302, 2007.)
  • the RCEC group showed a significant improvement in transparency, with 2.6 compared to the RCEC + SM-FN group, 0.6 (FIG. 16).
  • the presence or absence of intraocular pressure increase due to deposition in the corners of cells injected into the anterior chamber was examined by measuring intraocular pressure over time, and no increase in intraocular pressure during observation was observed (FIG. 17).
  • the rabbit was euthanized, and the cornea was removed and the morphology of the transplanted corneal endothelium was observed in vivo by immunohistological staining.
  • ZO-1 related to the barrier function of the corneal endothelium and Na + K + ATPase related to the pump function were used as markers, the RCEC group showed expression in some of the engrafted cells, while RCEC + SM- In the FN group, expression was observed in all cells. All these cells were DiI positive, pre-labeled before injection (FIG. 18).
  • ⁇ Test Example 4> There are various obstacles in clinical application of cell transplantation.
  • One of the obstacles is the high probability of cell death (apoptosis) during cell isolation and transplantation.
  • Cell death due to loss or abnormality of cell-extracellular matrix interaction is called “anoikis”.
  • Another obstacle is that cell therapy has recently been desired to grow and transplant cells under chemically unambiguous conditions that do not contain animal-derived substances.
  • integrins a heparan sulfate-binding transmembrane protein
  • syndecan a heparan sulfate-binding transmembrane protein
  • fibronectin the main extracellular matrix protein
  • This compound has an integrin binding site and a heparan sulfate binding site.
  • Such synthetic compounds can be a safe option in the development of chemically distinct cell therapies that do not contain animal-derived substances.
  • This compound is the aforementioned compound 2 (artificial fibronectin) (hereinafter referred to as adhesamine-RGDS).
  • adhesamine-RGDS inhibited anoikis in a test tube under conditions similar to cell transplantation was examined. Round bottom uncoated plates were used to eliminate or reduce cell-substrate interactions. Prior to the assay, the cells were scraped twice with a strainer to suspend the cells. This process also reduces cell-cell interactions. These two conditions induce cells to anoikis. Serum-free medium was used throughout the assay. NIH3T3 cells (mouse fetal fibroblasts) are adhesion-dependent and are often used for anoikis studies.
  • the cells were cultured for 72 hours under anoikis-inducing conditions in the presence or absence of various concentrations of compounds, and the viability of the cells was determined by a WST assay that measures the activity of NADPH dehydrogenase in living cells.
  • cell viability decreased to about 30% due to anoikis.
  • Adhesamine-RGDS protected cells from anoikis in a concentration-dependent manner.
  • ROCK inhibitor Y-27632 and fibronectin were used as positive controls. 6 ⁇ M or 60 ⁇ M adhesamine-RGDS increased cell viability more strongly than 60 ⁇ M Y-27632 and 10 ⁇ g / mL fibronectin (FIG. 20).
  • adhesamine-RGDS maintained the survival of floating cells under the condition of ininox induction after 7 days (FIG. 21).
  • NASH3T3 cell culture Cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 in DMEM (invitrogen) containing 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS) (biowest). At passage, cells were harvested with 0.25% trypsin (invitrogen) and resuspended in complete medium.
  • DMEM invitrogen
  • FBS fetal bovine serum
  • NIH3T3 cells were collected with 0.25% trypsin, washed with serum-free DMEM medium, and suspended in serum-free DMEM medium. Single cell samples were obtained by passing twice through a 40- ⁇ m nylon cell strainer (Falcon). 20,000 cells (100 ⁇ l volume) per well were seeded in a 96-well uncoated round bottom plate (Corning) and cultured in serum-free DMEM medium in the presence or absence of adhesamine-RGDS.
  • Falcon 40- ⁇ m nylon cell strainer
  • Cell viability test Cell viability was determined by measuring NADPH dehydrogenase activity of cells using Cell Counting Kit-8 (Dojindo). Dojindo's highly water-soluble tetrazolium salt (WST-8) is reduced by intracellular NADPH dehydrogenase activity to give a yellow formazan dye. The amount of formazan dye produced by NADPH dehydrogenase activity in the cell is proportional to the number of living cells. The test was performed according to the manufacturer's method. Ten microliters of reagent was added directly to each well, incubated for 2 hours, and absorbance at 450 nm was measured.
  • WST-8 highly water-soluble tetrazolium salt
  • Cell colony formation test Suspension cells were collected, replated on 12-well tissue culture treated plates, and cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum for 10 days. Ten days later, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes, stained with 0.25% crystal violet for 30 minutes, and washed with distilled water.

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Abstract

開示されているのは、下記式(I)若しくは(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩からなる移植細胞懸濁液用の添加剤、該ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を含む治療用組成物、並びに該ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を投与することを特徴とする細胞の移植方法である。

Description

移植細胞懸濁液用の添加剤及び治療用組成物
　本発明は、細胞治療の治療効果を改善することができる移植細胞懸濁液用の添加剤に関する。さらに、本発明は、細胞治療において優れた治療効果を発揮する治療用組成物に関する。
　以下に示すアドヘサミン(adhesamine)(分子a)は、ヒト培養細胞の接着と増殖を促進する小分子化合物として化合物ライブラリーのスクリーニングにより見出された(非特許文献１、特許文献１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　アドヘサミンによる細胞接着は、FAKやERKのリン酸化、細胞骨格の再構築、及び接着斑の形成を伴う。これらの特徴は、アドヘサミンによる細胞接着が、生理的な細胞接着であることを示唆している。生化学、細胞生物学、有機化学的な研究により、アドヘサミンの分子標的は細胞表面にあるヘパラン硫酸であることが判明している。
　アドヘサミン以外にも、多くのヘパラン硫酸結合化合物が報告されている。しかしながら、細胞接着促進、即ちアゴニスト様活性を示すのは、本発明者の知る限りペプチド由来の化合物のみであり、アドヘサミンは生理的接着を促進する初めての非ペプチド性小分子有機化合物である。
　非特許文献２では、アドヘサミンが神経細胞の生存率を向上させ且つ分化を促進させることが報告されている。
　また、非特許文献３－５では、アドヘサミンと同じジスピロトリピペラジン構造を有するジスピロトリピペラジン誘導体が抗ウィルス活性を有することについて報告されている。
　角膜は眼球の前方に位置する透明組織であり、光を眼球後方の神経組織である網膜に透過する「窓」の役割を果たす組織である。角膜内皮細胞は角膜の裏側に一層の細胞群として存在し、ポンプ機能とバリア機能を有し、角膜の透明性の維持に不可欠な細胞である。
　角膜内皮ジストロフィ、眼手術、外傷などにより角膜内皮障害が生じると、角膜が不可逆的に混濁し重症の視覚障害をきたす(水疱性角膜症)。水疱性角膜症は角膜による失明の主たる原因であり、現在唯一の治療法は角膜移植である。一方、角膜移植はドナー不足、拒絶反応、移植後の角膜内皮障害などの問題を有し、これらを克服するために生体外で培養した角膜内皮細胞を移植する再生医学的手法による治療法の開発が望まれている。
　既に本発明者らは、霊長類であるカニクイザルをモデルとしてI型コラーゲンシートをキャリアとして、培養したサル角膜内皮細胞シートを水疱性角膜症モデルに移植することで透明治癒が得られることを報告している。
国際公開第2009/154201号
Yamazoe, S., Shimogawa, H., Sato, S., Esko, J.D., Uesugi, M., Chemistry & Biology (2009), 16, 773-782 Hoshino, M., Tsujimoto, T., Yamazoe, S., Uesugi, M., Terada, S., Biochemical Journal (2010), 427, 297-304 Schmidtke, M., Riabova, O., Dahse, H.M., Stelzner, A., Makarov, V., Antiviral Research (2002), 55, 117-127 Artemenko, A.G., Muratov, E.N., Kuz’min, V.E., Kovdienko, N.A., Hromov, A.I., Makarov, V.A., Riabova, O.B., Wutzler, P., Schmidtke, M., Journal of antimicrobial Chemotherapy (2007), 60 (1), 68-77 Schmidtke, M., Karger, A., Meerbach, A., Egerer, R., Stelzner, A., Makarov, V., Virology (2003), 311, 134-143
　しかしながら、キャリアを用いた角膜内皮細胞シートの移植は、キャリア自体による透明性の低下による視機能への影響、極めて薄いシートを移植する手技的困難さなどの問題を有する。培養した角膜内皮細胞の懸濁液の前房内への注入では、角膜の透明治癒が得られないことは既に報告されている。
　また、特許文献１及び非特許文献１－５では、ジスピロトリピペラジン誘導体について細胞接着促進効果や抗ウィルス活性などついて述べられているのみであり、細胞治療への応用については言及されていない。
　そこで、本発明は、細胞治療の治療効果を改善することができる、ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩を含む移植細胞懸濁液用の添加剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、細胞治療において優れた治療効果を発揮する、ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩を含む治療用組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、培養角膜内皮細胞の懸濁液にジスピロトリピペラジン誘導体を添加し、前房内に投与することで角膜が透明治癒し、注入した培養角膜内皮細胞が生着して機能を発現するという知見を得た。また、ジスピロトリピペラジン誘導体を添加した骨髄由来細胞を創傷付近に皮内注射することで、創傷治癒が有意に促進するという知見も得た。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の移植細胞懸濁液用の添加剤、治療用組成物等を提供するものである。
　項１．下記式(I)若しくは(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩からなる移植細胞懸濁液用の添加剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
〔式中、R1及びR2は、同一又は異なって、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルキル置換アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリール置換アルキル基又はヘテロアリール置換アルキル基を示す。但し、式(I)の化合物の場合はR1及びR2は、共に水素であることはない。
該R1及びR2は、ダンシルヒドラジン、インテグリン結合活性を有する物質、RGDペプチド又はRGDSペプチドが直接又はリンカーを介して結合していてもよい。
該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルキル部分又はシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
該R1及びR2を構成するアリール基、アリール部分、ヘテロアリール基、ヘテロアリール部分、シクロアルキル基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
R3は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルキルアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アリール置換アルキレン基又はヘテロアリール置換アルキレン基を示す。
該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基又はアルキレン部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、アルキレン部分又はシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
該R3を構成するアリーレン基、アリール部分、ヘテロアリーレン基、ヘテロアリール部分、シクロアルキレン基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
D1及びD2は、同一又は異なって、N又はCHを示す。〕
　項２．R1及びR2が、同一又は異なって、水素又はヘテロアリール基を示し(但し、式(I)の化合物の場合はR1及びR2は、共に水素であることはない)、
該R1及びR2は、ダンシルヒドラジン、インテグリン結合活性を有する物質、RGDペプチド又はRGDSペプチドが結合していてもよく、
該R1及びR2を構成するヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ及びアミノから選択される原子又は基で置換されていてもよく、
R3が、アルキレン基又はヘテロアリーレン基を示し、
該R3を構成するヘテロアリーレン基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ及びアミノから選択される原子又は基で置換されていてもよい、
項１に記載の移植細胞懸濁液用の添加剤。
　項３．前記ジスピロトリピペラジン誘導体が以下の群から選択される、項１に記載の添加剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 　　　
及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　項４．細胞生着促進作用を有する、項１～３のいずれか一項に記載の添加剤。
　項５．前記細胞が角膜内皮細胞又は骨髄由来細胞である、項１～４のいずれか一項に記載の添加剤。
　項６．項１に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を含む治療用組成物。
　項７．前記ジスピロトリピペラジン誘導体が項２又は３に記載のジスピロトリピペラジン誘導体である、請求項５に記載の組成物。
　項８．角膜治療用である、項６又は７に記載の組成物。
　項９．前記細胞が角膜内皮細胞である、項６～８のいずれか一項に記載の組成物。
　項１０．皮膚創傷治療用である、項６又は７に記載の組成物。
　項１１．前記細胞が骨髄由来細胞である、項６、７又は１０に記載の組成物。
　項１２．項１に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を投与することを特徴とする細胞の移植方法。
　項１３．前記ジスピロトリピペラジン誘導体が項２又は３に記載のジスピロトリピペラジン誘導体である、項１２に記載の方法。
　項１４．角膜治療方法又は皮膚創傷治療方法である、項１２又は１３に記載の方法。
　項１５．(好ましくは角膜治療又は皮膚創傷治療のための)細胞移植に使用するための項１～３のいずれか一項に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩。
　項１６．(好ましくは角膜治療又は皮膚創傷治療のための)細胞移植における細胞生着促進剤を製造するための、項１～３のいずれか一項に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩の使用。
　本発明の移植細胞懸濁液用の添加剤及び治療用組成物によれば、細胞の移植(細胞治療)による、角膜の透明治癒や創傷治癒の促進が可能であり、細胞治療において優れた治療効果が得られることが期待される。
(1)アドヘサミンと(6)アドヘサミン誘導体(i)の各60μMを培地に添加した時のJurkat細胞の接着率を示すグラフである。* P<0.05 compared with the DMSO group. 移植細胞の生存に対するアドヘサミン(50 ng mL-1)の効果を示すグラフである。NIH3T3/Luc細胞(5×105 cells 50μL-1)がマウスの8 mmを切除した全層皮膚損傷モデルに皮下的に注射された。ルシフェラーゼアッセイが各時間で実施された。●：アドへサミン添加、▲：アドヘサミン無添加 * P<0.05 compared with the NIH3T3/Luc group ルシフェラーゼでラベルされたB16-BL6メラノーマ細胞の肺転移に対するアドヘサミンの効果を示すグラフである。マウス肺でのB16-BL6/Luc細胞の接着は、尾静脈へのB16-BL6/Luc細胞の投与2時間後の肺組織のホモジネートのルシフェラーゼ活性を測定することによって評価された。** P<0.01 compared with the control group 培養プレートへのBMDCsの接着を示すグラフである。6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs、6μMアドヘサミンを添加したBMDCs、又は未添加のBMDCsを、培養プレート上で24時間インキュベートした。結果は、12ウェルの平均±SD値で表す。* P<0.05はcontrol群に対して統計学的有意差があることを示す。 培養内皮細胞へのBMDCsの接着を示すグラフである。6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs、6μMアドヘサミンを添加したBMDCs、又は未添加のBMDCsを、培養したMAEC細胞単層上に添加し、24時間インキュベートした。結果は、12ウェルの平均±SD値で表した。* P<0.05はcontrol群に対して統計学的有意差があることを示す。 BMDCs/eGFPの皮内移植後の細胞残存率の経時変化を示すグラフである。6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs/eGFP(●)と添加していないBMDCs/eGFP (control; ○)をマウスの背部皮内に注射した。注射してから1時間、24時間、7日そして14日後に、創傷付近の皮膚中総DNAをDNeasy kitを用いて抽出し、リアルタイムPCR法を用いてeGFP cDNAを定量した。本実験は2回繰り返して行い、代表的な実験結果を示した。結果は、マウス3匹の平均±SD値で表した。* P<0.05はcontrol群に対して統計学的有意差があることを示す。 (A) C57BL/6マウスにおける創傷治癒の経時変化を示すグラフである。6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs(▲)と添加していないBMDCs(●)を5×105cells/shotで調製し、創傷付近の上下2か所に皮内注射した。また、BMDCsを含まないHBSS(○)又は6μM人工フィブロネクチン(△)も同様に注射した。結果は、マウス4-6匹の平均±SD値で表した。(B) C57BL/6マウスの背部皮膚創傷の代表的写真である。BMDCs移植後3日目に撮影した。(a) HBSS群、(b) 6μM 人工フィブロネクチン群、(c) BMDCs群、(d) 6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs群。本実験は3回繰り返して行い、代表的な実験結果を示した。* P<0.05はHBSS群に対する統計学的有意差があることを示す。 (A) 糖尿病モデルdb/dbマウスにおける創傷治癒の経時変化を示すグラフである。6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs(▲)と添加していないBMDCs(●)を5×105cells/shotとなるように調製し、創傷付近の上下2か所に皮内注射した。また、BMDCsを含まないHBSS(○)も同様に注射した。結果は、マウス4-6匹の平均±SD値で表した。(B) db/dbマウスの背部皮膚創傷の代表的写真である。BMDCs移植後3日目に撮影した。(a) HBSS群、(b) BMDCs群、(c) 6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCs群。本実験は2回繰り返して行い、代表的な実験結果を示した。* P<0.05はHBSS群に対する統計学的有意差があることを示す。 小分子フィブロネクチンのin vitroにおける細胞接着への影響を示す写真である。 小分子フィブロネクチンの角膜内皮細胞接着に対する影響を示すグラフである。 培養角膜内皮細胞の前房内への注入移植(ウサギモデル)を示す写真である。 培養角膜内皮細胞の前房内への注入移植のコンセプトを示す写真である。 培養角膜内皮細胞の注入移植後の前眼部写真(7日目)である。 培養角膜内皮注入移植後の免疫染色像(3時間後)である。 角膜混濁の程度のgradingを示す図である。 培養角膜内皮注入移植後の角膜透明性を示すグラフである。 培養角膜内皮注入移植後の眼圧に対する影響を示すグラフである。 培養角膜内皮注入移植後の免疫染色像(1週間後)を示す写真である。 培養角膜内皮注入移植後の細胞形態(2週間)を示す写真である。 無血清アノイキス誘発条件での細胞生存度を示すグラフである。NIH3T3細胞を化合物(1% (v/v) DMSO, 0.6-60μM adhesamine-RGDS, 60μM Y-27632, 及び0.04μMフィブロネクチン)で24時間、無血清アノイキス誘発条件で処理した。無血清アノイキス誘発条件ではほとんどの細胞が浮遊し分散している。細胞の生存度はNADPH脱水素酵素の活性を測定するWSTアッセイにより決定し、播種した直後の細胞の生存度を1とした。それぞれの処理について3つのサンプルの平均値を示した。 無血清アノイキス誘発条件での細胞生存度を示すグラフである。細胞の生存度はNADPH脱水素酵素の活性を測定するWSTアッセイにより決定し、播種した直後の細胞の生存度を１とした。それぞれの処理について3つのサンプルの平均値を示した。 浮遊細胞を再培養した結果を示す写真である。分散した浮遊細胞を図２１のサンプルから別々に回収し、組織培養処理プレートで再培養し、10日間完全培地(DMEM with 10% FBS)で増殖した。細胞を固定し、0.25%のクリスタルバイオレットで染色した。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　移植細胞懸濁液用の添加剤
　本発明の移植細胞懸濁液用の添加剤は、下記式(I)若しくは(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩からなることを特徴とする。
　・ジスピロトリピペラジン誘導体及びそれらの塩
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 〔式中、R1及びR2は、同一又は異なって、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルキル置換アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリール置換アルキル基又はヘテロアリール置換アルキル基を示す。但し、式(I)の化合物の場合はR1及びR2は、共に水素であることはない。
該R1及びR2は、ダンシルヒドラジン、インテグリン結合活性を有する物質、RGDペプチド又はRGDSペプチドが直接又はリンカーを介して結合していてもよい。
該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルキル部分又はシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
該R1及びR2を構成するアリール基、アリール部分、ヘテロアリール基、ヘテロアリール部分、シクロアルキル基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
R3は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルキルアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アリール置換アルキレン基又はヘテロアリール置換アルキレン基を示す。
該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基及びアルキレン部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、アルキレン部分及びシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
該R3を構成するアリーレン基、アリール部分、ヘテロアリーレン基、ヘテロアリール部分、シクロアルキレン基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
D1及びD2は、同一又は異なって、N又はCHを示す。〕
　上記式(I)又は(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体の塩とは、ジスピロトリピペラジン誘導体1分子に対し、一価のアニオン2分子又は二価のアニオン1分子との塩を意味する。このような塩の具体例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。
　ダンシルヒドラジンが結合しているジスピロトリピペラジン誘導体としては、例えば、下記式(c)で表される化合物が挙げられる。ダンシルヒドラジンは、直接結合させたものであってもよいし、又はリンカーを介して結合させたものであってもよい。
　上記インテグリン結合活性を有する物質としては、インテグリンに結合することが可能な化合物であれば特に限定されないが、例えば、RGD(Arg-Gly-Asp)ペプチド、RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)ペプチド、下記式(h)で表される化合物のR基、RGDペプチド及びRGDSペプチドの誘導体又は模倣体などが挙げられる。インテグリン結合活性を有する物質は、直接結合させたものであってもよいし、又はリンカーを介して結合させたもののいずれであってもよい。リンカーとしては、インテグリン結合活性を有する物質を結合させることが可能なものであれば特に限定されず種々の長さ及び構造のものを使用することができるが、例えば-C=N-O-CH2-CO-などが挙げられる。インテグリン結合活性を有する物質(例えば、RGDSペプチド)が結合しているジスピロトリピペラジン誘導体としては、例えば、下記式(j)で表される化合物が挙げられる。
　上記(I)及び(II)において示される各基は、より具体的にはそれぞれ次の通りである。
　「アルキル基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシルが挙げられる。炭素数は好ましくは1～30であり、より好ましくは1～20である。
　「アルケニル基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、二重結合を少なくとも1個有するものを意味し、例えばビニル、アリル、１－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、イソプロペニル、１－、２－若しくは３－ブテニル、２－、３－若しくは４－ペンテニル、２－メチル－２－ブテニル、３－メチル－２－ブテニル、５－ヘキセニル、１－シクロペンテニル、１－シクロヘキセニル、３－メチル－３－ブテニル及びこれらの均等物が挙げられる。炭素数は好ましくは2～30であり、より好ましくは2～20である。
　「アルキニル基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、三重結合を少なくとも1個有するものを意味し、例えばエチニル、１－若しくは２－プロピニル、１－、２－若しくは３－ブチニル、１－メチル－２－プロピニル及びこれらの均等物が挙げられる。炭素数は好ましくは2～30であり、より好ましくは2～20である。
　「シクロアルキル基」の具体例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが挙げられる。炭素数は好ましくは3～8であり、より好ましくは5又は6である。
　「アリール基」とは、5又は6員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
　「ヘテロアリール基」とは、N、O及びSから選択される1～3個のヘテロ原子を含む、5又は6員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよく、他の分子に結合している炭素原子の隣にNが存在することが好ましい。具体例としては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンズイミダゾリル及びトリアジニル(特に、１，３，５－トリアジニル)が挙げられる。「ヘテロアリール基」としては、2又は3個のヘテロ原子(特に、N原子)を含む6員の芳香環からなる単環の基が特に好ましい。
　「アルキル部分」とは、シクロアルキル置換アルキル基、アリール置換アルキル基及びヘテロアリール置換アルキル基における各アルキル基を意味するだけでなく、ヒドロキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、及びアルコキシ(Ｏ－アルキル基)中のアルキル基、並びにモノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルの置換基であるアルキル基を包含する。
　「シクロアルキル部分」とは、シクロアルキル置換アルキル基及びシクロアルキルアルキレン基のシクロアルキル基を意味する。
　「アリール部分」とは、アリール置換アルキル基及びアリール置換アルキレン基のアリール基を意味する。
　「ヘテロアリール部分」とは、ヘテロアリール置換アルキル基及びヘテロアリール置換アルキレン基のヘテロアリール基を意味する。
　アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリール部分を含む複合基の具体例としては、該当部分に各基についての前述の具体例を当てはめたものを挙げることができる。
　「シクロアルキル置換アルキル基」の具体例としては、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル及びシクロヘプチルメチルが挙げられる。
　「アリール置換アルキル基」の具体例としては、ベンジル、ナフチルメチル、フルオレニルメチル、アントリルメチル、ビフェニリルメチル、テトラヒドロナフチルメチル、クロマニルメチル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチル、インダニルメチル、フェナントリルメチル、フェネチル、ナフチルエチル、フルオレニルエチル、アントリルエチル、ビフェニリルエチル、テトラヒドロナフチルエチル、クロマニルエチル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチル、インダニルエチル及びフェナントリルエチルが挙げられる。
　「ヘテロアリール置換アルキル基」の具体例としては、フリルメチル、チエニルメチル、ピロリルメチル、イミダゾリルメチル、ピラゾリルメチル、オキサゾリルメチル、チアゾリルメチル、イソオキサゾリルメチル、イソチアゾリルメチル、ピリジルメチル、ピラジニルメチル、ピリミジニルメチル、ピリダジニルメチル、インドリルメチル、キノリルメチル、イソキノリルメチル、ベンゾ［ｂ］チエニルメチル、ベンズイミダゾリルメチル、フリルエチル、チエニルエチル、ピロリルエチル、イミダゾリルエチル、ピラゾリルエチル、オキサゾリルエチル、チアゾリルエチル、イソオキサゾリルエチル、イソチアゾリルエチル、ピリジルエチル、ピラジニルエチル、ピリミジニルエチル、ピリダジニルエチル、インドリルエチル、キノリルエチル、イソキノリルエチル、ベンゾ［ｂ］チエニルエチル及びベンズイミダゾリルエチルが挙げられる。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
　「アシル化されたヒドロキシ」とは、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ又はアリール置換アルキルカルボニルオキシを意味する。
　「カルバメート化されたヒドロキシ」とは、アルキルアミノカルボニルオキシ、アリールアミノカルボニルオキシ又はアリール置換アルキルアミノカルボニルオキシを意味する。
　「エーテル化されたヒドロキシ」とは、アルキルオキシ、アリールオキシ又はアリール置換アルキルオキシを意味する。
　アルキルカルボニルオキシの具体例としては、メチルカルボニルオキシ、エチルカルボニルオキシ、ｎ－プロピルカルボニルオキシ、イソプロピルカルボニルオキシ、ｎ－ブチルカルボニルオキシ、イソブチルカルボニルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルカルボニルオキシ、ｎ－ペンチルカルボニルオキシ、イソペンチルカルボニルオキシ及びヘキシルカルボニルオキシが挙げられる。
　アリールカルボニルオキシの具体例としては、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、フルオレニルカルボニルオキシ、アントリルカルボニルオキシ、ビフェニリルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルカルボニルオキシ、クロマニルカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルカルボニルオキシ、インダニルカルボニルオキシ及びフェナントリルカルボニルオキシが挙げられる。
　アリール置換アルキルカルボニルオキシの具体例としては、ベンジルカルボニルオキシ、ナフチルメチルカルボニルオキシ、フルオレニルメチルカルボニルオキシ、アントリルメチルカルボニルオキシ、ビフェニリルメチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルカルボニルオキシ、クロマニルメチルカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルカルボニルオキシ、インダニルメチルカルボニルオキシ、フェナントリルメチルカルボニルオキシ、フェネチルカルボニルオキシ、ナフチルエチルカルボニルオキシ、フルオレニルエチルカルボニルオキシ、アントリルエチルカルボニルオキシ、ビフェニリルエチルカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルカルボニルオキシ、クロマニルエチルカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチルカルボニルオキシ、インダニルエチルカルボニルオキシ及びフェナントリルエチルカルボニルオキシが挙げられる。
　アルキルアミノカルボニルオキシの具体例としては、メチルアミノカルボニルオキシ、エチルアミノカルボニルオキシ、ｎ－プロピルアミノカルボニルオキシ、イソプロピルアミノカルボニルオキシ、ｎ－ブチルアミノカルボニルオキシ、イソブチルアミノカルボニルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルアミノカルボニルオキシ、ｎ－ペンチルアミノカルボニルオキシ、イソペンチルアミノカルボニルオキシ及びヘキシルアミノカルボニルオキシが挙げられる。
　アリールアミノカルボニルオキシの具体例としては、フェニルアミノカルボニルオキシ、ナフチルアミノカルボニルオキシ、フルオレニルアミノカルボニルオキシ、アントリルアミノカルボニルオキシ、ビフェニリルアミノカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルアミノカルボニルオキシ、クロマニルアミノカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルアミノカルボニルオキシ、インダニルアミノカルボニルオキシ及びフェナントリルアミノカルボニルオキシが挙げられる。
　アリール置換アルキルアミノカルボニルオキシの具体例としては、ベンジルアミノカルボニルオキシ、ナフチルメチルアミノカルボニルオキシ、フルオレニルメチルアミノカルボニルオキシ、アントリルメチルアミノカルボニルオキシ、ビフェニリルメチルアミノカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルアミノカルボニルオキシ、クロマニルメチルアミノカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルアミノカルボニルオキシ、インダニルメチルアミノカルボニルオキシ、フェナントリルメチルアミノカルボニルオキシ、フェネチルアミノカルボニルオキシ、ナフチルエチルアミノカルボニルオキシ、フルオレニルエチルアミノカルボニルオキシ、アントリルエチルアミノカルボニルオキシ、ビフェニリルエチルアミノカルボニルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルアミノカルボニルオキシ、クロマニルエチルアミノカルボニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチルアミノカルボニルオキシ、インダニルエチルアミノカルボニルオキシ及びフェナントリルエチルアミノカルボニルオキシが挙げられる。
　アルキルオキシの具体例としては、メチルオキシ、エチルオキシ、ｎ－プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ－ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシ、ｎ－ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ及びヘキシルオキシが挙げられる。
　アリールオキシの具体例としては、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、フルオレニルオキシ、アントリルオキシ、ビフェニリルオキシ、テトラヒドロナフチルオキシ、クロマニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシ、インダニルオキシ及びフェナントリルオキシが挙げられる。
　アリール置換アルキルオキシの具体例としては、ベンジルオキシ、ナフチルメチルオキシ、フルオレニルメチルオキシ、アントリルメチルオキシ、ビフェニリルメチルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルオキシ、クロマニルメチルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシ、インダニルメチルオキシ、フェナントリルメチルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルエチルオキシ、フルオレニルエチルオキシ、アントリルエチルオキシ、ビフェニリルエチルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルオキシ、クロマニルエチルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチルオキシ、インダニルエチルオキシ及びフェナントリルエチルオキシが挙げられる。
　モノ若しくはジ置換アミノ基、モノ若しくはジ置換カルバモイル基又はモノ若しくはジ置換スルファモイル基における「モノ置換」とは、アミノ基、カルバモイル基又はスルファモイル基の窒素原子に結合する水素原子の1個がアルキルで置換されていることを意味し、「ジ置換」とは、アミノ基、カルバモイル基又はスルファモイル基の窒素原子に結合する水素原子の2個が同一又は異なるアルキルで置換されていることを意味する。
　アルキルでモノ置換されたアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｔｅｒｔ－ブチルアミノ、ｎ－ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ及びヘキシルアミノが挙げられる。
　アルキルでジ置換されたアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ－プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ－ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｔｅｒｔ－ブチルアミノ、ジｎ－ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ及びジヘキシルアミノが挙げられる。
　アルキルでモノ置換されたカルバモイル基としては、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ｎ－プロピルカルバモイル、イソプロピルカルバモイル、ｎ－ブチルカルバモイル、イソブチルカルバモイル、ｔｅｒｔ－ブチルカルバモイル、ｎ－ペンチルカルバモイル、イソペンチルカルバモイル及びヘキシルカルバモイルが挙げられる。
　アルキルでジ置換されたカルバモイル基としては、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、ジｎ－プロピルカルバモイル、ジイソプロピルカルバモイル、ジｎ－ブチルカルバモイル、ジイソブチルカルバモイル、ジｔｅｒｔ－ブチルカルバモイル、ジｎ－ペンチルカルバモイル、ジイソペンチルカルバモイル及びジヘキシルカルバモイルが挙げられる。
　アルキルでモノ置換されたスルファモイル基としては、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ｎ－プロピルスルファモイル、イソプロピルスルファモイル、ｎ－ブチルスルファモイル、イソブチルスルファモイル、ｔｅｒｔ－ブチルスルファモイル、ｎ－ペンチルスルファモイル、イソペンチルスルファモイル及びヘキシルスルファモイルが挙げられる。
　アルキルでジ置換されたスルファモイル基としては、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、ジｎ－プロピルスルファモイル、ジイソプロピルスルファモイル、ジｎ－ブチルスルファモイル、ジイソブチルスルファモイル、ジｔｅｒｔ－ブチルスルファモイル、ジｎ－ペンチルスルファモイル、ジイソペンチルスルファモイル及びジヘキシルスルファモイルが挙げられる。
　「基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されているアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルキル部分又はシクロアルキル部分」とは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルキル部分又はシクロアルキル部分中の炭素間の単結合において、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在している炭素数が2以上のアルキル基、炭素数が3以上のアルケニル基、炭素数が3以上のアルキニル基、シクロアルキル基、炭素数が2以上のアルキル部分及びシクロアルキル部分を言い、ジスピロトリピペラジンの窒素原子から2炭素以上離れている炭素原子にこれらが結合していることが好ましい。
　「ヒドロキシアルキル基」の具体例としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシ－ｎ－プロピル、ヒドロキシイソプロピル、ヒドロキシ－ｎ－ブチル、ヒドロキシイソブチル、ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチル、ヒドロキシ－ｎ－ペンチル、ヒドロキシイソペンチル及びヒドロキシヘキシルが挙げられる。
　「アルコキシ基」の具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ及びヘキシルオキシが挙げられる。
　「アルキルチオ基」の具体例としては、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔｅｒｔ－ブチルチオ、ｎ－ペンチルチオ、イソペンチルチオ及びヘキシルチオが挙げられる。
　「アルキルスルホニル基」の具体例としては、メチルスルホニル及びエチルスルホニルが挙げられる。
　「アルキルスルホニルアミノ基」の具体例としては、メチルスルホニルアミノ及びエチルスルホニルアミノが挙げられる。
　「アルキルカルボニルアミノ基」の具体例としては、メチルカルボニルアミノ及びエチルカルボニルアミノが挙げられる。
　「アルキレン基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、例えば、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、イソプロピレン、ｎ－ブチレン、イソブチレン、ｔｅｒｔ－ブチレン、ｎ－ペンチレン、イソペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン及びデシレンが挙げられる。炭素数は好ましくは1～30であり、より好ましくは1～20である。
　「アルケニレン基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、二重結合を少なくとも1個有するものを意味し、例えばビニレン、アリレン、１－プロペニレン、２－メチル－２－プロペニレン、イソプロペニレン、１－、２－若しくは３－ブテニレン、２－、３－若しくは４－ペンテニレン、２－メチル－２－ブテニレン、３－メチル－２－ブテニレン、５－ヘキセニレン、１－シクロペンテニレン、１－シクロヘキセニレン、３－メチル－３－ブテニレン及びこれらの均等物が挙げられる。炭素数は好ましくは2～30であり、より好ましくは2～20である。
　「アルキニレン基」とは、直鎖状、分枝鎖状又は環状のいずれでもよく、三重結合を少なくとも1個有するものを意味し、例えばエチニレン、１－若しくは２－プロピニレン、１－、２－若しくは３－ブチニレン、１－メチル－２－プロピニレン及びこれらの均等物が挙げられる。炭素数は好ましくは2～30であり、より好ましくは2～20である。
　「シクロアルキレン基」の具体例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン及びシクロヘプチレンが挙げられる。炭素数は好ましくは3～8であり、より好ましくは5又は6である。
　「アリーレン基」とは、5又は6員の芳香族炭化水素環からなる単環又は多環系の基を意味し、具体例としては、フェニレン及びナフチレンが挙げられる。
　「ヘテロアリーレン基」とは、N、O及びSから選択される1～3個のヘテロ原子を含む、5又は6員の芳香環からなる単環又は多環系の基を意味し、多環系の場合には少なくとも１つの環が芳香環であればよく、他の分子に結合している炭素原子の隣にNが存在することが好ましい。具体例としては、フリレン、チエニレン及びピリミジニレンが挙げられる。「ヘテロアリーレン基」としては、2個のヘテロ原子(特に、N原子)を含む6員の芳香環からなる単環の基が特に好ましい。
　「アルキレン部分」とは、シクロアルキルアルキレン基、アリール置換アルキレン基及びヘテロアリール置換アルキレン基における各アルキレン基を意味する。
　アルキレンを含む複合基の具体例としては、該当部分に各基についての前述の具体例を当てはめたものを挙げることができる。
　「シクロアルキルアルキレン基」の具体例としては、シクロプロピルメチレン、シクロブチルメチレン、シクロペンチルメチレン、シクロヘキシルメチレン及びシクロヘプチルメチレンが挙げられる。
　「アリール置換アルキレン基」の具体例としては、ナフチルメチレン、フルオレニルメチレン、アントリルメチレン、ビフェニリルメチレン、テトラヒドロナフチルメチレン、クロマニルメチレン、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチレン、インダニルメチレン、フェナントリルメチレン、ナフチルエチレン、フルオレニルエチレン、アントリルエチレン、ビフェニリルエチレン、テトラヒドロナフチルエチレン、クロマニルエチレン、インダニルエチレン及びフェナントリルエチレンが挙げられる。
　「ヘテロアリール置換アルキレン基」の具体例としては、フリルメチレン、チエニルメチレン、ピロリルメチレン、イミダゾリルメチレン、ピラゾリルメチレン、オキサゾリルメチレン、チアゾリルメチレン、イソオキサゾリルメチレン、イソチアゾリルメチレン、ピリジルメチレン、ピラジニルメチレン、ピリミジニルメチレン、ピリダジニルメチレン、インドリルメチレン、キノリルメチレン、イソキノリルメチレン、ベンゾ［ｂ］チエニルメチレン、ベンズイミダゾリルメチレン、フリルエチレン、チエニルエチレン、ピロリルエチレン、イミダゾリルエチレン、ピラゾリルエチレン、オキサゾリルエチレン、チアゾリルエチレン、イソオキサゾリルエチレン、イソチアゾリルエチレン、ピリジルエチレン、ピラジニルエチレン、ピリミジニルエチレン、ピリダジニルエチレン、インドリルエチレン、キノリルエチレン、イソキノリルエチレン、ベンゾ［ｂ］チエニルエチレン及びベンズイミダゾリルエチレンが挙げられる。
　「基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－で割り込まれているアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、アルキレン部分及びシクロアルキル部分」とは、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、アルキレン部分及びシクロアルキル部分中の炭素間の単結合において、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－で割り込まれている炭素数が2以上のアルキレン基、炭素数が3以上のアルケニレン基、炭素数が3以上のアルキニレン基、シクロアルキレン基、炭素数が2以上のアルキレン部分及びシクロアルキル部分を言い、ジスピロトリピペラジンの窒素原子から2炭素以上離れている炭素原子にこれらが結合していることが好ましい。
　R1及びR2としては、好ましくは水素、アリール基、ヘテロアリール基、アリール置換アルキル基又はヘテロアリール置換アルキル基であり、より好ましくは水素、ヘテロアリール基又はヘテロアリール置換アルキル基であり、特に好ましくは水素又はヘテロアリール基である。ヘテロアリール基としては、ピリミジニル又は１，３，５－トリアジニルが好ましい。当該アリール基、ヘテロアリール基、アリール部分及びヘテロアリール部分は、前述する1～3個の原子又は基で置換されていてもよい。また、R1及びR2には、インテグリン結合活性を有する物質、特にRGDペプチド又はRGDSペプチドが結合していることはアノイキスからの高い保護効果が得られるため好ましい。
　R3としては、好ましくはアルキレン基、アリーレン基又はヘテロアリーレン基であり、より好ましくはアルキレン基又はヘテロアリーレン基である。ヘテロアリーレン基としては、ピリミジニレンが好ましい。当該アリーレン基及びヘテロアリーレン基は、前述する1～2個の原子又は基で置換されていてもよい。
　本発明の式(I)又は(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体のうちで特に好ましいもののR1～R3、D1及びD2の組み合わせを以下に示す：
〔R1及びR2は、同一又は異なって、水素又はヘテロアリール基を示す。但し、式(I)の化合物の場合はR1及びR2は、共に水素であることはない。
該R1及びR2は、ダンシルヒドラジン、下記式(h)で表される化合物のR基、RGDペプチド又はRGDSペプチドが結合していてもよい。
該R1及びR2を構成するヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ及びアミノから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
R3は、アルキレン基又はヘテロアリーレン基を示す。
該R3を構成するヘテロアリーレン基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ及びアミノから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
D1及びD2は、同一又は異なって、N又はCHを示す。〕
　本発明のジスピロトリピペラジン誘導体のうちで、特に好適な化合物の具体例として以下の化合物及びそれらの塩が挙げられる。式(h)及び(j)で表される化合物は、インテグリン結合活性を有する物質が結合した化合物である。なお、化合物(a)～(g)の細胞接着促進活性は、国際公開第2009/154201号で評価され、当該化合物が細胞接着促進活性を有することが示されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
・ジスピロトリピペラジン誘導体及びそれらの塩の製造方法
　式(I)で表される化合物及びその塩は、例えば、下記式(III)の化合物とR1-X1及びR2-X2(X1及びX2は同一又は異なる脱離基であり、例えばCl, Br等のハロゲン、ｐ－トルエンスルホニルオキシ、メタンスルホニルオキシ等が挙げられる)とを反応させ、必要に応じて生成物を他の式(I)の化合物に変換させることにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　式(III)の化合物とR1及びR2の反応性誘導体との反応は、溶媒中又は無溶媒下に行われる。使用する溶媒は、原料化合物の種類等に従って選択されるべきであるが、例えばトルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン及び１－メチル－２－ピロリジノンが挙げられる。これらの溶媒はそれぞれ単独で、或いは2種以上混合して用いられる。
　本反応は、必要に応じて塩基の存在下で行われる。塩基の具体例としては、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジンのような有機塩基が挙げられる。
　反応温度及び反応時間は、用いる原料化合物の種類等により異なるが、通常、反応温度は約0℃～約150℃であり、反応時間は約0.5時間～約72時間である。
　式(III)の化合物とR1及びR2の反応性誘導体との反応の際のモル比は、原料化合物の種類等により異なるが、通常、1:1.2～1:20、より好ましくは1:2～1:10である。
　式(II)で表される化合物及びその塩は、上記式(III)の化合物とR3-X1X2(X1及びX2は上記と同じ定義である)とを反応させ、必要に応じて生成物を他のジスピロトリピペラジン誘導体が2個結合した式(II)の化合物に変換させることにより製造することができる。
　この場合の式(III)の化合物とR3の反応性誘導体との反応の際のモル比は、原料化合物の種類等により異なるが、通常、600:1～2:1、より好ましくは200:1～2:1である。
　R1、R2及びR3の構造中に反応に関与する官能基が存在する場合には、それらを常法に従って保護しておき、反応終了後に保護基を脱離させることが望ましい。
　上記製法における原料化合物で化合物(III)、並びにR1、R2及びR3の反応性誘導体は、自体公知の方法により製造することができるか、或いは市販されているので容易に入手することができる。
　上記式(III)の化合物とR1、R2及びR3の反応性誘導体とを反応させた後に、ダンシルヒドラジン誘導体化させることができる。この反応は、ダンシルヒドラジン誘導体化反応に通常用いられる反応条件下にて行うことができる。
　上記式(III)の化合物と4,6-ジクロロ‐2‐(メチルチオ)ピリミジン‐5-カルボン酸を反応させた後に、カルボン酸部分を活性エステル化し、RGD(アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸)ペプチド誘導体、RGDペプチド模倣体等を反応させることにより、アドヘサミンにインテグリン結合活性を有する物質を結合させることができる。この反応は活性エステルとアミンの結合反応に通常用いられる反応条件下にて行うことができる。
　上記製造方法或いはこれらに準じた製造方法により生成する式(I)又は(II)の化合物は、クロマトグラフィー、再結晶、再沈殿等の常法に従って単離・精製することができる。常法に従って各種の酸と処理することにより塩に導くことができる。また、式(I)又は(II)の化合物は、反応・処理条件等により、塩の形で得られるが、常法に従って式(I)又は(II)の化合物に変換することができる。
　・移植細胞懸濁液
　本発明における移植細胞懸濁液とは、移植治療に用いるための細胞が懸濁された溶液のことを意味する。
　移植細胞懸濁液中の上記ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩の有効濃度としては、好ましくは0.1～1,000μM程度、より好ましくは1～100μM程度である。
　本発明における移植細胞としては、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類の動物細胞である。哺乳類の動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等由来の細胞が挙げられる。移植細胞の種類としては、細胞の移植(細胞治療)に使用される細胞であれば特に限定されないが、好ましくは角膜内皮細胞、骨髄由来細胞、繊維芽細胞などである。
　本発明における懸濁液には、緩衝液や培地などを使用することができる。緩衝液としては、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、ハンクス液(HBSS)などが挙げられる。また、培地としては、細胞の種類により適した培地を適宜選択して使用すればよく、例えばダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)、ウィリアムズE培地、HamのF-10培地、F-12培地、RPMI-1640培地、MCDB153培地、199培地などの従来公知の細胞培養用基礎培地に、必要に応じて各細胞の培養に適合した従来公知の成長因子や抗酸化剤などを加えたものを使用することができる。培地は、血清を添加した培地又は無血清培地のどちらでもよいが、無血清培地の方が好ましい。
　本発明の添加剤を移植細胞懸濁液に使用することで、細胞の移植(細胞治療)による、角膜の透明治癒や創傷治癒の促進が可能であり、細胞治療において優れた治療効果が得られることが期待される。本発明の添加剤は、細胞生着促進作用を有することから、このような効果が得られると考えられる。ここで、本明細書における細胞治療とは、細胞を移植することにより疾患を治療する療法のことを意味している。
　治療用組成物
　本発明の治療用組成物は、上記ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を含むことを特徴とする。
　ここでの細胞は、前述するものと同様である。
　本発明の治療用組成物は、人を含む哺乳動物に投与されるものであって、移植細胞懸濁液の注射剤の形で非経口的に使用できる。該懸濁液には、緩衝液や培地などを使用することができ、懸濁液や培地としては前述するものが挙げられる。治療用組成物中の上記ジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩の有効濃度としては、好ましくは0.1～1,000μM程度、より好ましくは1～100μM程度である。
　本発明の治療用組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定できる。
　本発明の治療用組成物により、細胞の移植(細胞治療)による、角膜の透明治癒や創傷治癒の促進が可能であり、細胞治療において優れた治療効果が得られることが期待される。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
　＜試験例１＞
　HPLCはShimadzu LC-2010Cを使用した。整数質量分析はShimadzu LCMS-2010 (ESI mode)により、精密質量分析はJEOL MS Station JMS-700 (FAB mode)で測定した。1H NMR スペクトルはJEOL JNM-ECP 300 MHz又はJEOL JNM-ECA 600MHz spectrometersを使用した。
　製造例１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　1,2-ジブロモエタン(2 mL, 23 mmol)とN-エチルジイソプロピルアミン(397μL, 2.33 mmol)の混合物に1-(4-ブロモベンゾイル)ピペラジン SI-1[1] (626 mg, 2.33 mmol)を添加し室温にて終夜撹拌を行った。反応終了後、反応液を減圧除去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、白色固体SI-2 (349 mg, 40% yield)を得た。1H NMR (300 MHz, CDCL3) δ 7.56 (dd, J=6.6Hz, 1.8Hz, 2H), 7.29 (dd, J=6.6Hz, 1.8Hz, 2H), 3.78 (brs, 2H), 3.60-3.40 (m, 2H), 3.43 (t, J=7.1Hz, 2H), 2.83 (t, J=7.1Hz, 2H), 2.57 (m, 4H); ESIMS [M+Na] + m/z = 397; HRMS (FAB) calcd. for C13H17Br2N2O [M+H] + m/z = 374.9708, found 374.9707.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　化合物SI-2 (99.3 mg, 0.26 mmol)とK2CO3(45.6 mg, 0.33 mmol)のアセトニトリル(1.5 mL)混合液に1,3-ジ-4-ピペリジルプロパン(27.7 mg, 0.13 mmol)を添加し、50℃にて終夜撹拌を行った。沈殿物をろ過除去し、ろ液を濃縮して得られた残渣を、NH-コートシリカゲル(Fuji Silysia Chemical Ltd.)のクロマトグラフィーで精製し、白色粉末SI-3 (70.8 mg, 67% yield)を得た。1H NMR (300 MHz, CDCL3) δ 7.54 (m, 4H), 7.28 (m, 4H), 3.76 (brs, 4H), 3.41 (brs, 4H), 2.89 (m 4H), 2.70-2.31 (m, 16H), 1.93 (m, 4H), 1.62 (m, 4H), 1.20 (m, 12H);  ESIMS [M+H]+ m/z = 801.; HRMS (FAB) calcd. for C39H57Br2N6O2[M+H] + m/z = 799.2910, found 799.2893.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　化合物SI-3 (49 mg, 61 μmol)と1,2-ジブロモエタン(1.5 mL)の混合物を115℃で終夜撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、得られた残渣を逆相HPLC (GL science, Inertsil ODS-3, 20 mm × 50 mm, flow rate 3.0 mL min-1, 0.1% TFA MeOH/H2O, 20→49%)で精製を行い、白色固体SI-4(37.5 mg, 47% yield)を得た。1H NMR (600 MHz, CD3CO2D) δ 7.63 (d, J=7.8Hz, 4H), 7.42 (d, J=7.8Hz, 4H), 4.42-3.87 (m, 36H), 3.52 (brs, 4H), 1.94 (m, 4H), 1.70 (brs, 6H), 1.35 (brs, 6H); ESIMS [M4++CF3CO2 -]3+at m/z 323 and [M4++2CF3CO2 -]2+at m/z 541; HRMS (FAB) calcd. for C49H64Br2F9N6O8[M4++3CF3CO2 -]+ m/z = 1193.3009, found 1193.3012.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　化合物SI-4 (26.8 mg, 21μmol)を25%HBr aq. (2 mL)で3時間還流し、反応溶媒を減圧除去した。得られた残渣に水(200μL)を添加し、その水溶液に、4,6-ジクロロ-2-(メチルチオ)-5-ホルミルピリミジン(10.2 mg, 45.6μmol)とトリエチルアミン(13.0μL)の1,4-ジオキサン混合液(500μL)を添加し、室温にて2.5時間撹拌した。反応終了後、逆相HPLC (YMC, YMC-PACK ODS-A, 10 mm × 150 mm, flow rate 3.0 mL min-1, 0.1% TFA MeOH/H2O, 20→55%)で精製を行い、白色固体i (3.6 mg, 13% yield)を得た。1H NMR (600 MHz, CD3CO2D) δ 10.19 (s, 2H), 4.45-3.90 (m, 36H), 3.53 (brs, 4H), 2.53 (s, 6H), 1.97 (m, 4H), 1.71 (brs, 6H), 1.36 (brs, 6H); ESIMS [M4++CF3CO2 -]3+at m/z 325 and [M4++2CF3CO2 -]2+at m/z 544; HRMS (FAB) calcd. for C47H64Cl2F9N10O8S2[M4++3CF3CO2 -]+ m/z = 1201.3583, found 1201.3531.
　細胞接着試験
　細胞接着促進活性は、以前報告した方法に準じて行った[2]。化合物(i)は、細胞接着試験においてアドヘサミンと同程度の活性を示した(図１)。
　マウス皮膚への繊維芽細胞の移植
　ICRマウス(15週齢)の背部2箇所の皮膚を、直径8 mmの円形に切り取ることで皮膚損傷モデルを作製した。マウス線維芽細胞株NIH/3T3細胞にルシフェラーゼを安定に発現させた3T3/Luc細胞を37℃条件下5% CO2インキュベーター内で継代培養した。アドヘサミン50 ng/mlで処理したNIH3T3/Luc細胞及び無処理のNIH3T3/Luc細胞(各5×105NIH3T3/Luc cells / 50μL HBSS)を損傷部位表周囲に皮下注入した。経時的にマウスを屠殺して損傷部位を回収し、lysis buffer (0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris HCl, pH 7.8)で可溶化し、4℃、12,000 gで15分間遠心後、上清を回収した。上清10μlにluciferase assay buffer (Picagene, Tokyo Ink, Tokyo Japan) 50μlを混合し、直ちにルミノメータ(Lumat LB 9507, EG & G Berthold, Bad Wildbad, Germany)で発光を測定した。
　結果を図２に示す。アドヘサミンが無い状況では、細胞は2日後に検出不可能になったが、アドヘサミン(50 ng mL-1)を共に投与した場合、5日後でも約8%の細胞が検出された。
　Effects of Adhesamine on Lung Metastasis
　B16BL6/Luc細胞[3]は、10% fetal bovine serum（FBS, GIBCO-Invitrogen）、0.15% NaHCO3、100 units ペニシリン/ストレプトマイシン/mlを加えたDMEM (Nissui Pharmaceutical)培地を用いて、37℃条件下5% CO2インキュベーター内で継代培養した。セルスクレイパーを用いて細胞を剥離し、細胞懸濁液(1×105 個/200μl HBSS)を調製した。この細胞にアドヘサミンを50μg ml-1で添加し、アドヘサミン結合細胞とした。調製したB16BL6/Luc細胞を、C57BL6マウスの尾静脈内に投与した。投与2時間後、マウスを屠殺して肺を回収し、lysis buffer (0.05% Triton X-100, 2 mM EDTA, 0.1 M Tris HCl, pH 7.8)で可溶化し、4℃、11,000 gで10分間遠心後、上清を回収した。上清10μlにluciferase assay buffer (Picagene, Tokyo Ink, Tokyo Japan) 100μlを混合し、直ちにルミノメータ（Lumat LB 9507, EG & G Berthold, Bad Wildbad, Germany)で発光を測定した。
　結果を図３に示す。マウス尾静脈内投与後の肺中細胞数は、アドヘサミン添加により有意に約1.8倍増加した。
[1] US2007/167435 A1.
[2] S. Yamazoe, H. Shimogawa, S. Sato, J. D. Esko, M. Uesugi, Chem. & Biol., 2009, 16, 773
[3] K. Hyoudou, M. Nishikawa, Y. Umeyama, Y. Kobayashi, F. Yamashita, M. Hashida, Clin. Cancer Res., 2004, 10, 7685
　＜試験例２＞
　製造例２
　(材料)
　9-フルオロメトキシカルボニル(Fmoc)保護アミノ酸及びRink amide MBHA樹脂はNovabiochem (San Diego, CA)より購入した。各Fmoc保護アミノ酸の側鎖は、AspとSerではO-tert-ブチル(tBu)基、Argは2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル(Pbf)基で保護されたものを使用した。N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、ピペリジン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)及びN-メチルモルホリンはWako Pure Chemical (Osaka, Japan)より、また(Boc-アミノオキシ)酢酸及び(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyAOP)はSigma-Aldrich (St. Louis, MO)より購入した。Reagent Kは使用前に調整した。
　(樹脂上でのRGDSペプチドの合成)
　RGDS樹脂は、Rink amide MBHA樹脂を用い、通常のFmoc固相合成法で得た。即ち、縮合はFmoc保護アミノ酸、DIC及びHOBtのいずれも担体樹脂の充填容量(0.6 mmol/g)に対し5当量を用い、DMF中で撹拌した。各ステップにおいて、カイザーテストで反応を確認した。
　(アミノオキシ-ペプチド前駆体の合成(化合物１))
　上記合成のRGDS樹脂に対して、Boc-アミノオキシ酢酸(5当量)、(7-アザベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyAOP)(5当量)及びN-メチルモルホリン(10当量)のDMF溶液を添加した。12時間撹拌の後、反応液の除去、DMF洗浄3回を行った。次に、reagent Kを用いて4時間撹拌することで樹脂からの切断を行った。切断されたペプチドをジエチルエーテルで沈殿させた後、HPLC精製により目的ペプチドを得た。ESI-MS (positive mode) :[M+H]+ at m/z 506. HR-FAB-MS (glycerol): calc. for C17H32O9N9[M+H]+ 506.2326, found 506.2323.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　(アミノオキシ-ペプチド前駆体の合成(化合物２))
　ペプチド(分子１)の100 mMアニリン/0.1 M酢酸アンモニウムバッファー(pH 4.5)の混合液に、アドヘサミンを添加した。12時間撹拌の後、HPLC精製を行い目的とする化合物２を得た。
ESI-MS (positive mode) :[M]2+ at m/z 786. HR-FAB (glycerol): calc. for C58H90Cl2N26O18S2[M]2+ 786.2872, found 786.2863. 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　(別法)
　アドヘサミン(2.0 mg)の水溶液(0.1% TFA) 1 mLに、ペプチド(化合物１：3当量)のメタノール溶液(0.5 mL)を添加し、50℃にて6時間撹拌した。反応溶媒を減圧除去し、HPLC精製により目的とする化合物２(3.8 mg)を得た。
　以下において該化合物２を人工フィブロネクチン又は小分子フィブロネクチンと称している。
　材料と方法
　(試薬)
　RPMI-1640培地、ハンクス緩衝塩類溶液(HBSS)、リン酸緩衝液(PBS)は、日本水産株式会社(Tokyo, Japan)より購入した。Medium199 (M199)とウシ胎児血清(FBS)は、GIBCO-Invitrogen社(Carlsbad, CA, USA)より購入した。アドヘサミンは、以前報告されている内容で合成し(Chem. Biol., 2009, 16, 773-782)、人工フィブロネクチンは上記の方法で合成した。他の試薬は、市販の特級品を用いた。
　(実験動物)
　5週齢又は10-13週齢のC57BL/6系雄性マウスと、その同系マウスをもとに作製されたenhanced green fluorescent protein (eGFP)トランスジェニックマウスを日本SLC株式会社(Shizuoka, Japan)より購入し、コンベンショナル環境下で標準餌と水を与えて飼育した。糖尿病db/dbマウス(C57BLKS/J Iar +Leprdb/+Leprdb, 10-13週齢)とその正常同腹子であるdb/m-マウス(C57BLKS/J Iar -m+/+Leprdb, 5週齢)は、財団法人動物繁殖研究所(Ibaraki, Japan)より購入した。すべての動物実験は、京都大学大学院薬学研究科の動物実験委員会の承認を得て行った。
　(細胞培養)
　マウスの大動脈血管内皮細胞株であるMAECは、斉藤一郎先生(鶴見大学歯学部口腔病理学部)より供与を受けた。5%の非動化したFBS、0.15%の炭酸水素ナトリウム、100 units/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを加えたM199培地中で、37℃、5% CO2、加湿条件下で培養した。
　(骨髄由来細胞の単離)
　5週齢のC57BL/6系マウス、eGFPトランスジェニックマウス、db/m-マウスはペントバルビタール麻酔下で安楽死させ、大腿骨と脛骨を摘出し、骨に付着する結合組織をすべて除去した。大腿骨と脛骨中の骨髄細胞は、26ゲージ針を用いて10%非動化FBS含有RPMIを骨髄腔内を注入することで回収した。骨髄細胞は、ポアサイズが40μmの細胞ストレイナー(BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)で濾過し、低張な0.1%塩化アンモニウム溶液中で5分間、室温でインキュベートすることにより混在する赤血球を溶解した。残存細胞を450×gで10分間遠心することにより回収し、これを骨髄由来細胞(BMDCs)として以降の検討に用いた。
　(BMDCsの培養プレートへの接着実験)
　6μM人工フィブロネクチン又は6μMアドヘサミンを添加したBMDCs、あるいは何も添加していないBMDCsを、RPMI培地中で2×105cells/wellとなるように96 wellプレートに播種し、37℃、5% CO2、加湿条件下で培養した。浮遊しているBMDCsは除き、MTT法 (Br. J. Cancer, 1989, 60, 206-210)により、培養プレートに接着したBMDCs数を測定した。
　(BMDCsの血管内皮細胞への接着実験)
　M199培地に懸濁したMAECは、1×105 cells/wellとなるように96 wellプレートに播種し、37℃、5% CO2、加湿条件下で24時間培養した。BMDCsはRPMI中で1×105 cells/wellとなるように懸濁し、6μMアドヘサミン又は6μM人工フィブロネクチンを添加して5-10分間、室温でインキュベートした。その後、BMDCsをMAEC単層上に添加し、24時間インキュベートした。浮遊しているBMDCsは除き、MTT法によりMAECに接着したBMDCs数を測定した。
　(創傷治癒モデルへの細胞移植)
　10-13週齢のC57BL/6系マウス及びdb/dbマウスは、ペントバルビタール麻酔下で電気バリカンを用いて背部を丁寧に除毛した後、生検パンチ(Kai Industries, Gifu, Japan)を用いて背部両側に直径8 mmの全層欠損皮膚創傷を作製した。6μM人工フィブロネクチンを添加又は未添加BMDCsは、HBSS中で5×105/shotとなるように調製し、創傷付近の上下2か所に皮内注射した。また、HBSS又は6μM人工フィブロネクチンも同様に創傷付近の上下2か所に皮内注射した。皮内注射後24時間は、防護フィルム(Tegaderm, 3M, London, ON, Canada) で創傷を覆った。経時的にcaliperを用いて創傷の2方向の長さを計測し、それらを乗算することにより創傷の面積を算出した。
　(マウス皮膚に移植したBMDCs/eGFPの生存率の評価)
　BMDCs/eGFPを皮内に投与後、経時的にマウスを安楽死させ、創傷付近の皮膚を摘出して皮膚組織重量を測定した。DNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて切除した皮膚組織から総DNAを抽出し、既報に準じて(Werner et al., Gene Therapy, 2004, 11, 992-1000)、Light Cycler instrument (Roche Diagnostics, Basle, Switzerland)を用いて定量的リアルタイムPCRを行った。eGFP cDNAの一部を増幅するために、5’-ctacggcgtgcagtgcttcag-3’及び5’-tagccttcgggcatgg-3’をそれぞれ前向き、逆向きオリゴヌクレオチドプライマーとして用いた。増幅産物は、fluorescent dye SYBR greenのインターカレーションを利用して検出した(LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)。
　(統計学的解析)
　有意差検定には、二群間の比較にスチューデントのt検定を用いた。全p値は両側であり、p<0.05を統計学的に有意とした。
　結果
　(アドヘサミン誘導体の培養プレートへの細胞接着促進効果)
　過去の研究において、アドヘサミンが培養プレートに対する細胞接着を促進することが示されている。そこで、アドヘサミンと人工フィブロネクチンの細胞接着能を比較するために、培養プレート中で6μMアドヘサミン又は6μM人工フィブロネクチンを添加したBMDCsを24時間インキュベートした(図４)。その結果、人工フィブロネクチン添加群では、BMDCsの接着は対照(control)群の224%と有意に増大した。また、この結果はアドヘサミン添加群よりも有意に高い値であった。
　(アドヘサミン誘導体の単層培養MAECへの細胞接着促進効果)
　次に、アドヘサミン誘導体の細胞間相互作用に及ぼす効果について評価した。図５は、アドヘサミン誘導体の添加又は非添加時の、単層培養されたMAECに接着したBMDCsの細胞数を示す。Control群と比較した場合、接着BMDCs数は、6μM人工フィブロネクチン添加群で約131%、6μMアドヘサミン添加群で約110%と有意に増大した。このように人工フィブロネクチンは、同濃度でアドヘサミンよりも高い細胞接着活性を示した。また、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するマウス線維芽細胞株NIH3T3 (NIH3T3/Luc)細胞を用いた場合にも、同様な実験結果が得られた(data not shown)。以上の結果をもとに、以下のin vivo実験にはアドヘサミン誘導体として人工フィブロネクチンを用いた。
　(細胞の皮膚中残存に及ぼす人工フィブロネクチンの影響)
　図６は、皮内注射後の皮膚組織中に残存するBMDCs/eGFP数の経時的変化を示す。BMDCs/eGFP細胞数は、6μM人工フィブロネクチン添加群で、非添加群よりも有意に高く推移した。また、NIH3T3/Luc細胞を用いた検討においても同様な結果が得られた(data not shown)。
　(BMDCs投与による皮膚創傷治療)
　図７は、BMDCs移植後の創傷サイズの経時的変化を示す。創傷治癒に対して高いポテンシャルを持つとされるBMDCsを創傷付近に皮内注射することで創傷治癒は有意に促進した。6μM人工フィブロネクチン添加BMDCs群では、非添加BMDCs群よりも有意に早く創傷が縮小した(図７A)。図７Bには、処置後3日目における各群の代表的な創傷写真を示す。
　(BMDCs投与による糖尿病マウスの皮膚創傷治療)
　最後に、創傷治癒が遅いことが知られる2型糖尿病モデルdb/dbマウスを用いて治療実験を行った。既報の通り、糖尿病モデルマウスでの創傷治癒は遅く、HBSSを注射した群においては完治までに28日以上が必要であった。このマウスでの創傷治癒は、BMDCsの皮内注射により促進し、更に6μM人工フィブロネクチン処理の効果も認められた(図８A)。図８Bには、処置後3日目における代表的な創傷の写真を示す。
　＜試験例３＞
　In vitroにおける小分子フィブロネクチンの培養角膜内皮細胞の細胞接着への影響の検討
　別の目的で安楽死させたカニクイザルから摘出した眼球から角膜組織を摘出して、角膜内皮を基底膜であるデスメ膜とともに角膜組織から剥離した。続いてコラゲナーゼを用いて酵素的に角膜内皮細胞を回収して初代培養及び継代培養を行った。継代培養を3回行った時点で、細胞密度が正常角膜内皮細胞の基準である内皮細胞密度が2000個/mm2以上に保たれており、細胞形態が良好に維持されていた細胞を用いて検討を行った。細胞培養はDMEMに10%FBS及び2 ng/ml FGF2を添加した培地を基本培地として行った。
　8ウェルチャンバーに1ウェルあたり60000個の培養角膜内皮細胞を基本培地及び基本培地に小分子フィブロネクチンを各種濃度で添加して継代培養した。継代培養24時間後に位相差顕微鏡にて細胞の形態を観察したところ、小分子フィブロネクチンの添加群においては細胞の凝集及び接着細胞数の増加が認められた(図９)。また、96ウェルプレートに1ウェルあたり1000個の培養角膜内皮細胞を基本培地及び基本培地に小分子フィブロネクチンを各種濃度で添加して継代培養し、継代培養24時間後にCelltiter-Glo (Promega社)を用いて培養皿への接着細胞数を測定した。接着細胞数は検討した小分子フィブロネクチンの最終濃度が2, 5, 10μMにおいて有意に促進された(図１０）。
　ウサギ水疱性角膜症モデルを用いた小分子フィブロネクチン併用培養角膜内皮細胞移植の検討
　全身麻酔下でウサギの角膜内皮を機械的に剥離し、水疱性角膜症モデルを作成した。上述と同様の方法にて継代培養したウサギの培養角膜内皮細胞をトリプシン処理にて培養皿より回収して血清を含まないDMEMを用いて5.0×105個の細胞を含む懸濁液200μlを25Gの注射針にて前房内に投与した(図１１)。なお、細胞は事前にDiIによりラベリングを行った。続いて、角膜上皮側が下向きになるようウサギを3時間のうつむき姿勢とした(図１２)。
　これらの処置は適宜全身麻酔薬を追加投与して動物愛護的に行った。群構成としては細胞懸濁液のみを前房内に注入した「RCEC群」、懸濁液に最終濃度10μMとして小分子フィブロネクチンを添加した「RCEC+SM-FN群」、コントロールとして角膜内皮の剥離のみを行って細胞注入を行わない「control群」とした。各群n=6としてウサギに処置を行った。control群では水疱性角膜症を生じ、角膜実質の著明な浮腫、混濁を生じた。RCEC群ではcontrol群と比べると角膜の透明性はやや高い傾向を認めるものの、角膜実質の浮腫、混濁を伴い水疱性角膜症を生じた。一方、RCEC+SM-FN群においては、角膜は透明治癒し注入した培養角膜内皮細胞が生着して機能を発現していることが示唆された(図１３)。
　小分子フィブロネクチンにより生体において注入した培養細胞の接着が促進されたかどうかを検討するために、各群1匹において細胞注入移植後3時間後に安楽死させ角膜を摘出して免疫組織学的染色により生体内での移植した角膜内皮の形態観察を行った。ファロイジン染色により細胞接着が促進され、3時間の時点で多角形の細胞形態を示すことが明らかとなった(図１４)。
　残りのウサギにおいては、各群n=5で1週間の経過観察を行い、細隙灯顕微鏡による観察、眼圧測定を行った。細隙灯顕微鏡による前眼部観察において、Sotozono Cら(Sotozono C, et al. Opthalmology;114:1294-302,2007.)(図１５)による角膜混濁の程度のgradingを行ったところ、平均スコアはRCEC群では2.6に対し、RCEC+SM-FN群では0.6と有意に透明性の改善を認めた(図１６)。前房内に注入した細胞の隅角へ沈着による眼圧上昇の有無について、経時的な眼圧測定により検討したところ、観察中の眼圧上昇を認めなかった（図１７）。
　処置後7日目にウサギを安楽死させ、角膜を摘出して免疫組織学的染色により生体内での移植した角膜内皮の形態観察を行った。角膜内皮のバリア機能に関連するZO-1及びポンプ機能に関連するNa+K+ATPaseをマーカーとして検討したところ、RCEC群では生着した細胞の一部にその発現を認める一方、RCEC+SM-FN群ではすべての細胞に発現が認められた。また、これらの細胞はすべて注入前に事前にラベリングしたDiI陽性であった(図１８)。
　これらのことから、RCEC+SM-FN群においては注入した細胞により正常な機能を有する角膜内皮組織が生体内において再生されたことを示す。一部の個体は、処置後14日目に安楽死させ、角膜内皮の形態観察をファロイジン染色により行った。control群では限られた箇所にのみ、残存したレシピエント由来と推測される細胞を認めた。RCEC群では角膜内皮細胞の生着を認めるものの、重層化し線維芽細胞様に形質転換しており、角膜内皮としての形質を喪失していた。一方、RCEC+SM-FN群では、正常角膜内皮と同様の一層の多角形細胞を認めた(図１９)。
　培養した角膜内皮細胞の懸濁液の前房内への注入では、角膜の透明治癒が得られないことは既に報告されており、現在複数の研究グループが培養角膜内皮シートを作成して移植する、新規の治療法の開発に取り組んでいる。しかしながら、キャリアを用いない本手法は、キャリアの不透明性による視機能の低下、キャリアの生物学的適合性を満たすことは臨床応用上大きな問題点であること、非常に薄いシートを眼内に移植する手技的困難さなど、キャリアを用いたシート移植の問題を解決しうる画期的な手法であるといえる。また、キャリアを用いない細胞注入移植により、生理的な解剖学的特徴を有する角膜組織を再生できることは、特筆に値する。
　＜試験例４＞
　細胞移植の臨床応用には様々な障害がある。障害の一つは、細胞の単離や移植の際に高い確率で細胞死(アポトーシス)が起こることである。細胞－細胞外マトリクス相互作用の損失や異常による細胞死は「アノイキス(anoikis)」と呼ばれる。もう一つの障害は、動物由来物質を含まず、化学的に明確な条件で細胞を増殖し移植することが細胞治療で近年望まれていることである。
　細胞移植の際には、細胞は多かれ少なかれ細胞外マトリクスから切り離される。細胞と細胞外マトリクスの相互作用は、主にインテグリンにより維持されている。多くの研究によると、ヘパラン硫酸結合膜貫通タンパク質であるシンデカンが、インテグリンによる細胞－細胞外マトリクス相互作用の促進に必要であることが明らかにされた。だからこそ、主な細胞外マトリクスタンパク質であるフィブロネクチンには、インテグリン結合部位とヘパラン硫酸結合部位の両方がある。この両方の部位が協同することで、フィブロネクチンは細胞の生存を促す強いシグナルを引き起こす。
　細胞移植の際の細胞死(アノイキス)という問題を回避するために、ハイブリッド型化合物を設計した。この化合物は、インテグリン結合部位とヘパラン硫酸結合部位を有している。このような合成化合物は、動物由来物質を含まない化学的に明確な細胞治療の開発において安全な選択肢となりえる。当該化合物は、前述する化合物２(人工フィブロネクチン)(以下、adhesamine-RGDSと称する)である。
　細胞移植に似た条件で、試験管内でadhesamine-RGDSがアノイキスを阻害するかどうかを調べた。細胞－基質相互作用を除くもしくは減少させるために、丸底のコーティングなしプレートを用いた。アッセイの前に、細胞を浮遊させるために細胞を二度ストレイナーで掻きとった。この工程は、細胞－細胞相互作用も減少させる。これらの二つの条件は、細胞をアノイキスへと誘導する。アッセイの間を通して、無血清培地を用いた。NIH3T3細胞(マウス胎仔繊維芽細胞)は接着依存性があり、アノイキスの研究によく用いられるため、この細胞を選択し利用した。
　各種濃度の化合物存在下もしくは非存在下でアノイキス誘導条件で72時間培養し、細胞の生存度を生細胞のNADPH脱水素酵素の活性を測定するWSTアッセイにより決定した。Adhesamine-RGDS非存在下で72時間培養すると、アノイキスのために細胞の生存度は約30%に減少した。Adhesamine-RGDSは、濃度依存的に細胞をアノイキスから保護した。ROCK阻害剤 Y-27632とフィブロネクチンをポジティブコントロールとして用いた。6μMもしくは60μMの adhesamine-RGDSは、60μMのY-27632や10μg/mLのフィブロネクチンよりも強く細胞生存度を上昇させた(図２０)。より長い時間の効果を調べたところ、adhesamine-RGDSは7日間後でもアイノキス誘導条件で浮遊細胞の生存を維持した(図２１)。
　浮遊細胞の生存を確認するために、アノイキス条件で1日から7日間培養した後に、浮遊細胞を組織培養処理プレートで再培養した(図２２)。再培養した細胞は、完全培地(DMEM with 10% serum)で培養した後、10日目に固定し、クリスタルバイオレットで染色した。1日から7日いずれにおいても、adhesamine-RGDSで処理されたサンプルから採取した浮遊細胞は、コントロールに比べて高い細胞増殖能を示した。これらの結果によって、adhesamine-RGDSの存在下で浮遊し分散させた細胞がアノイキスから保護され、生存していることが再確認された。
　方法
　(NIH3T3細胞の培養)
　10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)(biowest)を含有したDMEM (invitrogen)中、5%CO2存在下37℃で細胞を培養した。継代においては、0.25%のトリプシン(invitrogen)で細胞を回収し、完全培地で再度懸濁した。
　(NIH3T3細胞の無血清、アノイキス誘発培養)
　0.25%のトリプシンでNIH3T3細胞を回収し、無血清DMEM培地で洗い、無血清DMEM培地に懸濁した。40-μm ナイロン製細胞ストレイナー(Falcon)に2度通すことで、単一細胞のサンプルを得た。1ウェル当たり20,000個の細胞(100μl容量)を96穴コーティング無し丸底プレート(Corning)に播種し、無血清DMEM培地中でadhesamine-RGDS存在下又は非存在下で培養した。
　(細胞生存度試験)
　細胞生存度はCell Counting Kit-8 (Dojindo)を用いて細胞のNADPH脱水素酵素活性を測定することで決定した。Dojindoの高水溶性テトラゾリウム塩(WST-8)は、細胞内のNADPH脱水素酵素活性により還元されて黄色フォルマザン色素を与える。細胞中のNADPH脱水素酵素活性により生成したフォルマザン色素の量は生細胞の数に比例する。試験は製造会社の方法に従って行った。10マイクロリットルの試薬を各ウェルに直接加え、2時間培養し、450 nmの吸光度を測定した。
　(細胞コロニー生成試験)
　浮遊細胞を収集し、12穴の組織培養処理プレートに再度播種し、10%ウシ胎児血清を含んだDMEM中で10日間培養した。10日後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.25%クリスタルバイオレットで30分間染色し、蒸留水で洗浄した。

Claims (13)

  1. 　下記式(I)若しくは(II)で表されるジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩からなる移植細胞懸濁液用の添加剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
      〔式中、R1及びR2は、同一又は異なって、水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルキル置換アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アリール置換アルキル基又はヘテロアリール置換アルキル基を示す。但し、式(I)の化合物の場合はR1及びR2は、共に水素であることはない。
    該R1及びR2は、ダンシルヒドラジン、インテグリン結合活性を有する物質、RGDペプチド又はRGDSペプチドが直接又はリンカーを介して結合していてもよい。
    該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
    該R1及びR2を構成するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルキル部分又はシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
    該R1及びR2を構成するアリール基、アリール部分、ヘテロアリール基、ヘテロアリール部分、シクロアルキル基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
    R3は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルキル置換アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アリール置換アルキレン基又はヘテロアリール置換アルキレン基を示す。
    該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基又はアルキレン部分は、ハロゲン、ヒドロキシ(当該ヒドロキシはアシル化、カルバメート化又はエーテル化されていてもよい)、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル及びスルファモイルから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
    該R3を構成するアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、アルキレン部分又はシクロアルキル部分に、基－Ｏ－、－Ｓ－、－ＳＯ－、－ＳＯ２－、－ＯＳＯ２－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＨＣＯＯ－、－ＯＣＨ２ＣＯＮＨ－又は－ＯＣＨ２ＣＯ－が介在されていてもよい。
    該R3を構成するアリーレン基、アリール部分、ヘテロアリーレン基、ヘテロアリール部分、シクロアルキレン基又はシクロアルキル部分は、ハロゲン、ヒドロキシ、ホルミル、アルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、シアノ、ニトロ、アミノ、モノ若しくはジ置換アミノ、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、メチレンジオキシ及びアリールから選択される原子又は基で置換されていてもよい。
    D1及びD2は、同一又は異なって、N又はCHを示す。〕
  2. 　前記ジスピロトリピペラジン誘導体が以下の群から選択される、請求項１に記載の添加剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     及び
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  3. 　細胞生着促進作用を有する、請求項１又は２に記載の添加剤。
  4. 　前記細胞が角膜内皮細胞又は骨髄由来細胞である、請求項１又は２に記載の添加剤。
  5. 　請求項１に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を含む治療用組成物。
  6. 　前記ジスピロトリピペラジン誘導体が請求項２に記載のジスピロトリピペラジン誘導体である、請求項５に記載の組成物。
  7. 　角膜治療用である、請求項５又は６に記載の組成物。
  8. 　前記細胞が角膜内皮細胞である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　皮膚創傷治療用である、請求項５又は６に記載の組成物。
  10. 　前記細胞が骨髄由来細胞である、請求項９に記載の組成物。
  11. 　請求項１に記載のジスピロトリピペラジン誘導体又はそれらの塩、及び細胞を投与することを特徴とする細胞の移植方法。
  12. 　前記ジスピロトリピペラジン誘導体が請求項２に記載のジスピロトリピペラジン誘導体である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　角膜治療方法又は皮膚創傷治療方法である、請求項１１又は１２に記載の方法。
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