ES2446301T3 - Uso de microvesículas en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de enfermedades y afecciones médicas - Google Patents

Abstract

Un método para ayudar en el diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto, que comprende las etapas de: (a) aislar una fracción de microvesicula de una muestra de orina de un sujeto humano; y (b) analizar el ARNm en la fracción de microvesícula para la presencia de un gen específico para un cáncerde próstata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar así la presencia o ausencia decáncer de próstata en el sujeto.

Description

Uso de microvesiculas en el diagnostico, pronostico y tratamiento de enfermedades y afecciones medicas CAMPO DE LA INVENCION La presente invencion se refiere a los campos del diagnostico medico, el monitoreo del paciente, la evaluacion de la eficacia del tratamiento, entrega de acido nucleico y proteina, y la transfusion de sangre. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los glioblastomas son tumores cerebrales altamente malignos con un mal pronostico a pesar de una intensa investigacion y los esfuerzos clinicos (Louis y otros, 2007). La naturaleza invasiva de este tumor hace imposible la reseccion quirurgica completa y el tiempo de supervivencia medio es solo de 15 meses aproximadamente (Stupp y otros, 2005). Las celulas de glioblastoma asi como tambien muchas otras celulas tumorales tienen una notable capacidad para moldear su medio ambiente estromal en su propio beneficio. Las celulas tumorales alteran directamente las celulas circundantes normales para facilitar el crecimiento de la celula tumoral, invasion, quimioresistencia, inmune-evasion y metastasis (Mazzocca y otros, 2005; Muerkoster y otros, 2004; Singer y otros, 2007). Las celulas tumorales ademas secuestran la vasculatura normal y estimulan la rapida formacion de nuevos vasos sanguineos para suministrar nutrientes al tumor (Carmeliet y Jain, 2000). Aunque el sistema inmune puede suprimir inicialmente el crecimiento del tumor, frecuentemente se embota progresivamente por la activacion del tumor de las rutas inmunosupresivas (Gabrilovich, 2007). Las pequenas microvesiculas desprendidas por las celulas se conocen como exosomas (Thery y otros, 2002). Los exosomas se reportan como que tienen un diametro de aproximadamente 30-100 nm y se desprenden de muchos tipos de celulas diferentes tanto bajo condiciones normales y patologicas (Thery y otros, 2002). Estas microvesiculas se describieron por primera vez como un mecanismo para retirar receptores de transferrina de la superficie celular de los reticulocitos maduros (Pan y Johnstone, 1983). Los exosomas se forman a traves de la gemacion interna de las membranas endosomales que dan lugar a cuerpos multivesiculares intracelulares (MVB) que luego se fusionan con la membrana plasmatica, liberando los exosomas al exterior (Thery y otros, 2002). Sin embargo, ahora hay pruebas para una liberacion mas directa de los exosomas. Ciertas celulas, tales como las celulas T Jurkat, se dice que desprenden directamente exosomas por gemacion hacia el exterior de la membrana plasmatica (Booth y otros, 2006). Todas las vesiculas de membrana desprendidas por las celulas se refieren colectivamente en la presente invencion como microvesiculas. Las microvesiculas en Drosophila melanogaster, llamadas argosomas, se dice que contienen morfogenos tales como la proteina Wingless y que se mueven a grandes distancias a traves del epitelio del disco imaginal en embriones deDrosophila melanogaster en desarrollo (Greco y otros, 2001). Las microvesiculas encontradas en el semen, conocidas como prostasomas, se expone que tienen una amplia variedad de funciones que incluye la promocion de la movilidad de los espermatozoides, la estabilizacion de la reaccion del acrosoma, la facilitacion de la inmunosupresion y la inhibicion de la angiogenesis (Delves y otros, 2007). Por otro lado, los prostasomas liberados por las celulas de prostata malignas se dice que promueven la angiogenesis. Las microvesiculas se dice que transfieren proteinas (Mack y otros, 2000) y estudios recientes exponen que esas microvesiculas aisladas a partir de lineas celulares diferentes ademas pueden contener ARN mensajero (ARNm) y microARN (miARN) y pueden transferir ARN a otros tipos de celulas (Baj-Krzyworzeka y otros, 2006; Valadi y otros, 2007) Las microvesiculas derivadas de las celulas B y las celulas dendriticas se expone que tienen efectos inmuno estimuladores y antitumorales potentes in vivo y se usan como vacunas antitumorales (Chaput y otros, 2005). Las microvesiculas derivadas de las celulas dendriticas se exponen que contienen las proteinas coestimuladoras necesarias para la activacion de las celulas T, mientras que la mayoria de las microvesiculas derivadas de celulas tumorales no (Wieckowski y Whiteside, 2006). Las microvesiculas aisladas a partir de celulas tumorales pueden actuar para suprimir la respuesta inmune y acelerar el crecimiento tumoral (Clayton y otros, 2007; Liu y otros, 2006a). Las microvesiculas de cancer de mama pueden estimular la angiogenesis, y las microvesiculas derivadas de plaquetas pueden promover la progresion tumoral y la metastasis de celulas de cancer de pulmon (Janowska-Wieczorek y otros, 2005; Millimaggi y otros, 2007). Los canceres surgen a traves de la acumulacion de alteraciones geneticas que promueven el crecimiento celular ilimitado. Se ha expuesto que cada uno de esos tumores albergan, en promedio, alrededor de 50 a 80 mutaciones que estan ausentes en las celulas no tumorales (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Wood y otros, 2007). Las tecnicas actuales para detectar estos perfiles de mutacion incluyen el analisis de muestras de biopsia y el analisis no invasivo de fragmentos de ADN de tumores mutantes que circulan en fluidos corporales tales como la sangre (Diehl y otros, 2008). El primer metodo es invasivo, complicado y posiblemente nocivo para los sujetos. El ultimo metodo carece intrinsecamente de sensibilidad debido al numero muy bajo de copias de ADN de cancer mutante en el fluido corporal (Gormally y otros, 2007).

Por lo tanto, un desafio orientado al diagnostico del cancer es desarrollar un metodo de diagnostico que pueda detectar celulas tumorales en las diferentes etapas de forma no invasiva, sin embargo con alta sensibilidad y especificidad. Ademas se ha expuesto que esos perfiles de expresion genica (que codifican ARNm o microARN) pueden distinguir el tejido canceroso y no canceroso (Jones y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Schetter y otros, 2008). Sin embargo, las tecnicas actuales de diagnostico para la deteccion de perfiles de expresion genica requieren biopsia invasiva de tejidos. Algunos procedimientos de biopsia causan alto riesgo y son potencialmente nocivos. Por otra parte, en un procedimiento de biopsia, las muestras de tejido se toman a partir de un area limitada y pueden dar falsos positivos o falsos negativos, especialmente en tumores que son heterogeneos y/o dispersados dentro del tejido normal. Por lo tanto, un metodo de diagnostico no invasivo y sensible para la deteccion de biomarcadores seria altamente deseable.

RESUMEN DE LA INVENCION

Generalmente, esta descripcion se refiere a un nuevo metodo para detectar en un sujeto la presencia o ausencia de una diversidad de biomarcadores contenidos en las microvesiculas, ayudando de ese modo al diagnostico, seguimiento y evaluacion de enfermedades, otras afecciones medicas y la eficacia del tratamiento asociado con biomarcadores de microvesiculas.

La invencion es un metodo para ayudar en el diagnostico del cancer de prostata en un sujeto, que comprende las etapas de: a) aislar una fraccion de microvesicula a partir de una muestra de orina de un sujeto humano; y b) analizar el ARNm en la fraccion de microvesicula para la presencia de un gen especifico para un cancer de prostata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar asi la presencia o ausencia de cancer de prostata en el sujeto.

Se describe un metodo para ayudar en la evaluacion de la eficacia del tratamiento en un sujeto, que comprende las etapas de: a) aislar una fraccion de microvesicula a partir de una muestra biologica del sujeto; y b) detectar la presencia o ausencia de un biomarcador dentro de la fraccion de microvesicula, en donde el biomarcador se asocia con la eficacia del tratamiento para una enfermedad u otra afeccion medica. El metodo puede comprender ademas la etapa de proporcionar una serie de muestras biologicas durante un periodo de tiempo del sujeto. Ademas, el metodo puede comprender ademas la etapa o etapas de determinar cualquier cambio medible en los resultados de la etapa de deteccion (por ejemplo, la cantidad de uno

o mas biomarcadores detectados) en cada una de las muestras biologicas a partir de la serie para asi evaluar la eficacia del tratamiento para la enfermedad u otra afeccion medica.

Se describe ademas un metodo para ayudar en el diagnostico o monitoreo de una enfermedad u otra afeccion medica en un sujeto, que comprende las etapas de a) obtener una muestra biologica del sujeto; y b) determinar la concentracion de microvesiculas dentro de la muestra biologica.

Ademas se describe un metodo para entregar un acido nucleico o una proteina a una celula diana en un individuo que comprende las etapas de administracion de las microvesiculas que contienen el acido nucleico o la proteina, o una o mas celulas que producen tales microvesiculas, al individuo de manera que las microvesiculas entran en la celula diana del individuo. Las microvesiculas pueden ser entregadas a las celulas del cerebro.

Ademas se describe un metodo para realizar transfusion de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma), que comprende las etapas de obtener una fraccion de fluido corporal del donante libre libre de todas o sustancialmente todas las microvesiculas, o libre de todas o sustancialmente todas las microvesiculas de tipo de celula particular (por ejemplo, celulas tumorales), e introducir la fraccion libre de microvesicula en un paciente. Ademas se describe una composicion de materia que comprende una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma) libre de todas o sustancialmente todas las microvesiculas, o libre de todas o sustancialmente todas las microvesiculas de un tipo de celula particular.

Mas aun se describe un metodo para realizar transfusion de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma), que comprende las etapas de obtener una fraccion enriquecida de microvesiculas de fluido corporal del donante e introducir la fraccion enriquecida de microvesiculas a un paciente. La fraccion puede enriquecerse con microvesiculas derivadas de un tipo de celula particular. Se contempla ademas una composicion de materia que comprende una muestra de fluido corporal (por ejemplo, sangre, suero o plasma) enriquecida con microvesiculas.

Se describe ademas un metodo para ayudar en la identificacion de nuevos biomarcadores asociados con una enfermedad u otra afeccion medica, que comprende las etapas de obtener una muestra biologica de un sujeto; aislar una fraccion de microvesicula de la muestra; y detectar dentro de la fraccion de microvesicula especies de acido nucleico; sus niveles de expresion respectivos o concentraciones; variantes de acido nucleico; o combinaciones de los mismos.

Varios aspectos y modalidades de la invencion se describiran ahora con mas detalle. Se apreciara que la modificacion de los detalles puede hacerse sin apartarse del alcance de la invencion que se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ademas, a menos que de cualquier otra manera sea requerido por el contexto, los terminos singulares incluiran pluralidades y los terminos en plural incluiran el singular.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Las celulas de glioblastoma producen microvesiculas que contienen ARN. (a) Imagen de microscopia electronica de barrido de una celula glioblastoma primario (bar = 10 m). (b) Un mayor aumento que muestra las microvesiculas en la superficie celular. Las vesiculas varian de tamano con diametros entre alrededor de 50 nm y alrededor de 500 nm (bar = 1 m). (c) Grafico que muestra la cantidad de ARN total extraido a partir de microvesiculas que se trataron o no se trataron con 10 Ribonucleasa A. Las cantidades se indican como la absorbancia (Abs, eje y) de la longitud de onda de 260 nm (eje x). Los experimentos se repitieron 5 veces y se muestra un grafico representativo. (d) Datos del Bioanalizador que muestran la distribucion de tamano del ARN total extraido a partir de celulas de glioblastoma primario y (e) datos del Bioanalizador que muestran la distribucion de tamano del ARN total extraido a partir de microvesiculas aisladas a partir de celulas de glioblastoma primario. El pico 25 nt representa un estandar interno. Los dos picos prominentes en (d) (flechas) representan

15 el ARN ribosomal 18S (flecha izquierda) y 28S (flecha derecha). Los picos ribosomales estan ausentes del ARN extraido a partir de las microvesiculas (e). (f) Imagen de microscopia electronica de transmision de microvesiculas secretadas por las celulas de glioblastoma primario (bar = 100 nm).

Figura 2. Analisis del ARN de la microvesicula. Las FIGS. 2 (a) y 2 (b) son graficos de dispersion de los niveles de ARNm en

20 microvesiculas y niveles de ARN en celulas de glioblastoma de donante a partir de dos experimentos diferentes. Las regresiones lineales muestran que los niveles de ARNm en las celulas del donante contra las microvesiculas no se correlacionan bien. Las FIGS. 2 (c) y 2 (d) son los niveles de ARNm en dos celulas de donantes diferentes o dos preparaciones de microvesiculas diferentes. En contraste a las FIGS. 2 (a) y 2 (b), las regresiones lineales muestran que los niveles de ARNm entre celulas del donante FIG. 2 (c) o entre las microvesiculas FIG. 2 (d) se correlacionan estrechamente.

Figura 3. Analisis del ADN de la microvesicula.

a) Amplificacion del gen GAPDH con plantillas de ADN de exosomas tratados con DNasa antes de la extraccion de acido nucleico Los carriles se identifican como sigue:

1.

MW en escalera de 100bp

2.

Control negativo

b) amplificacion del gen GAPDH con plantillas de ADN de exosomas sin tratamiento previo con DNasa. Los carriles se 35 identifican como sigue:

1.

MW en escalera de 100bp

2.

ADN de celula de melanoma primario 0105

3.

ADN de exosoma del melanoma 0105

40 4. Control negativo

5. ADNc de GBM 20/3 primario (control positivo)

c) Amplificacion del gen Retrovirus K endogeno humano. Los carriles se identifican como sigue:

45 1. MW en escalera de 100 bp

2.

ADN de exosoma del meduloblastoma D425 a

3.

ADN de exosoma del meduloblastoma D425 b

4.

ADN de exosoma de los fibroblastos humanos normales (NHF19)

5.

ADN de exosoma de suero humano normal

50 6. ADN. genomico de GBM 20/3.

7. Control negativo

d) amplificacion del gen Tenascina C. Los carriles se enumeran identificados de la siguiente manera:

55 1. MW en escalera de 100bp

2.

Exosomas de fibroblastos humanos normales (NHF19)

3.

Exosomas de suero (individuo A libre de celula tumoral)

4.

Exosomas de suero (individuo B libre de celula tumoral)

5.

Exosomas de celula de meduloblastoma primario D425

e) Amplificacion del elemento transponible Line 1.Los carriles se identifican como sigue:

1.

MW en escalera de 100bp

2.

ADN de exosoma de suero humano normal

5 3. ADN de exosoma de fibroblastos humanos normales

4.

ADN de exosoma del meduloblastoma D425 a

5.

ADN de exosoma de meduloblastoma D425 b

f) El ADN esta presente en exosomas de celula de medulloblastoma D425. Los carriles se identifican como sigue:

1.

marcador de 100bp

2.

D425 sin DNasa

3.

D425 con DNasa

4.

marcador de 1kb

15 g) Analisis de acidos nucleico monocatenario usando un chip pico de ARN. Panel superior: El ADN purificado no se trato con DNasa, panel inferior: El ADN purificado se trato con DNasa La flecha en el panel superior se refiere a los acidos nucleicos detectados. El pico a 25 nt es un estandar interno. h) Analisis de acidos nucleicos contenidos en exosomas a partir de meduloblastoma primario D425. Panel superior:

20 acidos nucleicos monocatenarios detectados por un chip pico de ARN. Panel inferior: acidos nucleicos bicatenarios detectados por un chip de ADN 1000. La flecha en el panel superior se refiere a los acidos nucleicos detectados. Los dos picos (15 y 1500 bp) son estandar internos.

i) Analisis del ADN de exosoma a partir de distintos origenes usando un chip pico de ARN.Panel superior: el ADN se 25 extrajo de exosomas de celulas de glioblastoma. Panel inferior: el ADN se extrajo de exosomas de fibroblastos humanos normales.

Figura 4. La extraccion de ARN extracelular a partir de suero es mas eficiente cuando se incluye una etapa de aislamiento de exosomas de suero. a) ARN de exosoma de suero. b) la extraccion completa directa de suero. c) pocillo vacio. Las

30 flechas se refieren al ARN detectado en las muestras.

Figura 5. Comparacion de los niveles de expresion genica entre microvesiculas y celulas de origen. Se encontro que 3426 genes se distribuyeron diferencialmente en mas de 5 veces en las microvesiculas en comparacion con las celulas de las que se derivaron (valor de p lt; 0.01).

35 Figura 6. Analisis ontologico de los ARN microvesiculares. (a) El grafico circular visualiza la ontologia de los procesos biologicos de las 500 especies mas abundantes de ARNm en las microvesiculas. (b) Grafico que muestra la intensidad de los ARNs de microvesiculas pertenecientes a ontologias relacionadas al crecimiento del tumor. El eje x representa el numero de transcritos de ARNm presentes en la ontologia. Los niveles medios de intensidad en los arreglos fueron 182.

40 Figura 7. Diagrama de agrupacion de los niveles de ARNm. Se analizaron los datos del microarreglo sobre los perfiles de expresion de ARNm en las lineas celulares y los exosomas aislados a partir de los medios de cultivo de estas lineas celulares y se generaron grupos de perfiles de expresion. Las etiquetas de las especies de ARN son las siguientes:

45 20/3C-1: ARN celular Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 1

20/3C-2: ARN celular Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 2

11/5C: ARN celular Glioblastoma 11/5

0105C: ARN celular Melanoma 0105

0664C: ARN celular Melanoma 0664

55 0664 E-1: ARN del exosoma del Melanoma 0664, replica del arreglo 1

0664 E-2: ARN del exosoma del Melanoma 0664, replica del arreglo 2

0105E: ARN del exosoma del Melanoma 0105

20/3E: ARN del exosoma del Glioblastoma 20/3 11/5E-1: Exosomas del Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 1 5 11/5E-2: Exosomas del Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 2 GBM: glioblastoma. La escala se refiere a la distancia entre los grupos. Figura 8. Las microvesiculas de suero contienen microRNAs. Se analizaron los niveles de miARNs maduros extraidos a

10 partir de microvesiculas y de celulas de glioblastoma de dos pacientes diferentes (GBM1 y GBM2) usando la RT-PCR cuantitativa de miARN. El valor de ciclo umbral (Ct) se presenta como la media ± SEM (n = 4). Figura 9. Diagrama de agrupacion de los niveles de microARN. Se analizaron los datos del microarreglo sobre los perfiles de

expresion de microARN en las lineas celulares y los exosomas aislados a partir de los medios de cultivo de estas lineas 15 celulares y se generaron grupos de perfiles de expresion. Las etiquetas de las especies de ARN son las siguientes: 0664C-1: ARN celular de Melanoma 0664, replica del arreglo 1 0664C-2: ARN celular de Melanoma 0664, replica del arreglo 2

0105C-1: ARN celular de Melanoma 0105, replica del arreglo 1 0105C-2: ARN celular de Melanoma 0105, replica del arreglo 2

25 20/3C-1: ARN celular Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 1 20/3C-2: ARN celular Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 2 11/5C-1: ARN celular de Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 1

11/5C-2: ARN celular de Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 2 11/5E-1: Exosomas del Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 1

35 11/5E-2: Exosomas del Glioblastoma 11/5, replica del arreglo 2 20/3E-1: ARN de exosoma de Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 1 20/3E-2: ARN de exosoma de Glioblastoma 20/3, replica del arreglo 2

0664 E: ARN de exosoma de Melanoma 0664

0105E-1: ARN de exosoma de Melanoma 0105, replica del arreglo 1

45 0105E-2: ARN de exosoma de Melanoma 0105, replica del arreglo 2

GBM: Glioblastoma. La escala se refiere a la distancia entre los grupos.

Figura 10. El nivel de expresion de microARN-21 en microvesiculas de suero se asocia con glioma. Se muestra un grafico

50 de barras, suero control normal en la izquierda, suero glioma a la derecha. La RT-PCR cuantitativa se uso para medir los niveles de microARN-21 (miR-21) en exosomas a partir de suero de pacientes con glioblastoma asi como tambien los controles de pacientes normales. El suero glioblastoma mostro una reduccion de 5.4 del valor de Ct, correspondiente a un aumento aproximadamente de 40 (2Lct ) veces de miR21. Los niveles de miR21 se normalizaron a GAPDH en cada muestra (n=3).

Figura 11. La RT-PCR anidada se uso para detectar ARNm de EGFRvIII en muestras de tumores y exosomas de suero correspondientes. El producto de PCR silvestre EGFR aparece como una banda a 1153 bp y el producto de PCR EGFRvIII aparece como una banda a 352 bp. La RT-PCR de ARNm de GAPDH se incluyo como un control positivo (226 bp). Las muestras que se consideran positivas para EGFRvIII se indican con un asterisco. Los pacientes 11, 12 y 14 mostraron solo

60 una amplificacion debil de EGFRvIII en la muestra de tumor, pero fue evidente cuando se cargaron mas muestras.

Figura 12. La RT PCR anidada de EGFRvIII se realizo en microvesiculas a partir de 52 sueros controles normales. El EGFRvIII (352 bp) nunca se encontro en los sueros controles normales. La PCR de GAPDH (226 bp) se incluyo como un control.

Figura 13. El ARNm de la hepcidina puede detectarse dentro de exosomas de suero humano. A) Pseudo gel generado por un Bioanalizador Agilent. B) Grafico primario generado por un Bioanalizador Agilent para el control positivo (Muestra 1). C) Grafico primario generado por un Bioanalizador Agilent para el control negativo (Muestra 2). D) Grafico primario generado por un Bioanalizador Agilent para los exosomas (Muestra 3).

Figura 14. Aislamiento de exosomas urinarios e identificacion de acido nucleico dentro de exosomas urinarios. (a) Imagen de microscopia electronica de un cuerpo multivesicular (MVB) que contiene muchos quot;exosomasquot; pequenos en una celula del tubulo renal. (b) Imagen de microscopia electronica de exosomas urinarios aislados. (c) Analisis de transcritos de ARN contenidos dentro de exosomas urinarios por un Bioanalizador Agilent. Se identifico una extensa variedad de especies de ARN pero estaban ausentes ambos ARNs ribosomales 18S y 28S. (d) Identificacion de varios transcritos de ARN en exosomas urinarios mediante PCR. Los transcritos asi identificados fueron: Acuaporina 1 (AQP1); Acuaporina 2 (AQP2); Cubilina (CUBN); Megalina (LRP2); Receptor Arginina Vasopresina (AVPR2); Intercambiador sodio/hidrogeno 3 (SLC9A3); subunidad B1 de la ATPasa V (ATP6V1B1); Nefrina (NPHS1); Podocina (NPHS2); y Canal de cloruro 3 (CLCN3). De arriba a abajo, las cinco bandas en el carril de peso molecular (MW) corresponden a fragmentos de 1000, 850, 650, 500, 400, 300 pares de bases. (e) Diagramas del Bioanalizador de acidos nucleicos exosomales a partir de las muestras de orinas. Los numeros se refieren a la numeracion de los individuos humanos. (f) Pseudogeles que representan los productos de PCR generados con diferentes pares de iniciadores usando los extractos de acidos nucleicos descritos en (e). Casa se refiere al gen de la actina y los iniciadores de actina son de Ambion (TX, Estados Unidos). El control +ve se refiere a las PCRs que usan ADNc de rinon humano de Ambion (TX, Estados Unidos) como las plantillas y el control -ve se refiere a las PCRs sin plantillas de acido nucleico. (g) Ilustracion del pseudogel que muestra la identificacion positiva de ADNc del gen de la actina a traves de PCR con y sin el tratamiento con DNasa de los exosomas antes de la extraccion del acido nucleico. (h) Diagramas del Bioanalizador que muestran la cantidad de acidos nucleicos aislados de exosomas urinarios humanos.

Figura 15. Analisis de biomarcadores de cancer de prostata en exosoma urinarios. (a) Ilustraciones del gel que muestran los productos de la PCR del genTMPRSS2-ERG y fragmentos digeridos de los productos de la PCR. P1 y P2 se refieren a las muestras de orina del paciente 1 y paciente 2, respectivamente. Para cada muestra, el producto no digerido esta en el carril de la izquierda y el producto digerido esta en el carril de la derecha. MWM indica los carriles con marcadores de MW. Los tamanos de las bandas (tanto no digerido y digerido) se indican a la derecha del panel. (b) Ilustraciones del gel que muestran los productos de la PCR del gen PCA3 y fragmentos digeridos de los productos de la PCR. P1, P2, P3 y P4 se refieren a las muestra de orina del paciente 1, paciente 2, paciente 3 y paciente 4, respectivamente. Para cada muestra, el producto no digerido esta en el carril de la izquierda y el producto digerido esta en el carril de la derecha. MWM indica carriles con marcadores de MW. Los tamanos de las bandas (tanto no digerido y digerido) se indican a la derecha del panel.

(c) Un sumario de la informacion de los pacientes y los datos presentados en (a) y (b). TMERG se refiere al gen de fusion TMPRSS2-ERG.

Figura 16. El ARNm de BRAF esta contenido dentro de microvesiculas desprendidas por las celulas de melanoma. (a) Una ilustracion del gel de electroforesis que muestra los productos de la RT-PCR de la amplificacion del gen de BRAF. (b) Una ilustracion del gel de electroforesis que muestra los productos de la RT-PCR de la amplificacion del gen de GAPDH. Los carriles y sus correspondientes muestras son los siguientes: Carril #1 -marcador de peso molecular de 100 bp; Carril #2 -exo YUMEL-01-06; Carril #3 -celulas YUMEL-01-06; Carril # 4 exo YUMEL-06-64; Carril # 5. Celulas YUMEL-06 64; Carril # 6. Exo M34; Carril # 7 celulas-M34; Carril # 8 -celulas de fibroblastos; Carril # 9 -Control negativo El termino de referencia quot;exoquot; significa que el ARN se extrajo a partir de los exosomas en los medios de cultivo. El termino de referencia quot;celulaquot; significa que el ARN se extrajo a partir de las celulas cultivadas. Los numeros que siguen a YUMEL se refieren a la identificacion de un lote especifico de la linea celular YUMEL. (c) Resultados de la secuenciacion de los productos de la PCR de exo YUMEL-01-06. Los resultados de celulas YUMEL-01-06, exo YUMEL-06-64 y celulas YUMEL-06-64 son los mismos que los de exo YUMEL-01-06. (d) Resultados de la secuenciacion de los productos de la PCR de exo M34. Los resultados de las celulas M34 son los mismos que los de exo M34.

Figura 17. Las microvesiculas de glioblastoma pueden liberar ARN funcional a HBMVECs. (a) Las microvesiculas purificadas se marcaron con colorante de membrana PKH67 (verde) y se anadieron a HBMVECs. Las microvesiculas se internalizaron en estructuras similares a endosomas dentro de una hora. (b) Las microvesiculas se aislaron a partir de celulas de glioblastoma que expresan establemente Gluc. La extraccion del ARN y la RT-PCR de los ARNm de Gluc y GAPDH mostraron que ambos se incorporaron a las microvesiculas. (c) Las microvesiculas se anadieron despues a HBMVECs y se incubaron por 24 horas. La actividad Gluc se midio en el medio a 0, 15 y 24 horas luego de la adicion de la

microvesicula y se normalizo a la actividad Gluc en las microvesiculas. Los resultados se presentan como la media ± SEM (n = 4).

Figura 18. Las microvesiculas de glioblastoma estimulan la angiogenesis in vitro y contienen proteinas angiogenicas. (a) HBMVECs se cultivaron en Matrigel™ en medio basal (EBM) solo, o suplementado con microvesiculas de GBM (EBM+MV)

o factores angiogenicos (EGM). La formacion de tubulos se midio luego de 16 horas como la longitud promedio del tubulo ± SEM en comparacion con las celulas crecidas en EBM (n = 6). (b) Se analizaron las proteinas totales a partir de celulas de glioblastoma primario y microvesiculas (MV) de estas celulas (1 mg cada una) en un arreglo de anticuerpos de la angiogenesis humana. (c) Los arreglos se escanearon y las intensidades se analizaron con el programa informatico Image J (n = 4).

Figura 19. Las microvesiculas aisladas a partir de celulas de glioblastoma primario promueven la proliferacion de la linea celular de glioblastoma U87. Se sembraron 100.000 celulas U87 en pocillos de una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer por tres dias en (a) medio de crecimiento normal (DMEM-5% FBS) o (b) medio de crecimiento normal suplementado con 125 Ig de microvesiculas. (c) Luego de tres dias, las celulas no suplementadas se expandieron a 480,000 celulas, mientras que las celulas suplementadas con microvesiculas se expandieron a 810,000 celulas. NC se refiere a las celulas crecidas en medio control normal y MV se refiere a las celulas crecidas en el medio suplementado con microvesiculas. El resultado se presenta como la media ± SEM (n=6).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Las microvesiculas son desprendidas por las celulas eucariotas, o germinan fuera de la membrana plasmatica, al exterior de la celula. Estas vesiculas de membrana son de tamano heterogeneo con diametros en el intervalo de aproximadamente 10nm a aproximadamente 5000 nm. Las microvesiculas pequenas (aproximadamente 10 a 1000nm, y mas frecuentemente 30 a 200 nm de diametro) que se liberan por exocitosis de cuerpos intracelulares multivesiculares son referidas en la tecnica como quot;exosomasquot;. Los metodos y composiciones descritos en la presente invencion son igualmente aplicables a microvesiculas de todos los tamanos; preferentemente de 30 a 800 nm, y con mayor preferencia de 30 a 200 nm.

En algunas literaturas, el termino quot;exosomaquot; se refiere ademas a complejos de proteinas que contienen exorribonucleasas que estan involucradas en la degradacion del ARNm y el procesamiento de los ARNs pequenos nucleolares (snoARNs), ARNs pequenos nucleares (snARN) y ARN ribosomales (ARNr) (Liu y otros, 2006b; van Dijk y otros, 2007). Tales complejos de proteinas no tienen membranas y no son quot;microvesiculasquot; o quot;exosomasquot; tal como se usan aqui estos terminos.

Los exosomas como herramientas de diagnostico y/o pronostico

Sorprendentemente se encontro las microvesiculas derivadas del glioblastoma pueden aislarse a partir del suero de pacientes con glioblastoma. Este es el primer descubrimiento de microvesiculas derivadas de celulas en el cerebro, presentes en el fluido corporal de un sujeto. Antes de este descubrimiento no se sabia si las celulas de glioblastoma producian microvesiculas o si tales microvesiculas podrian cruzar la barrera de hematoencefalica al resto del cuerpo. Se encontro que estas microvesiculas contienen ARNm mutante asociado con celulas tumorales. Las microvesiculas contenian ademas microARNs (miARNs) los que se encontraron abundantes en los glioblastomas. Ademas se encontraron microvesiculas derivadas de glioblastoma para promover potentemente las caracteristicas angiogenicas en las celulas primarias endoteliales microvesiculares del cerebro humano (HBMVEC) en cultivo. Este efecto angiogenico fue mediado al menos en parte a traves de las proteinas angiogenicas presentes en las microvesiculas. Los acidos nucleicos que se encuentran dentro de estas microvesiculas, asi como tambien otros contenidos de las microvesiculas tales como proteinas angiogenicas, pueden usarse como biomarcadores valiosos para el diagnostico de tumores, la caracterizacion y el pronostico al proporcionar un perfil genetico. El contenido dentro de estas microvesiculas puede usarse ademas para monitorerar la progresion del tumor en el tiempo mediante el analisis de si otras mutaciones se adquieren durante la progresion del tumor asi como tambien si los niveles de ciertas mutaciones favorecen que aumenten o disminuyan en el tiempo o en el curso del tratamiento

Se encontro ademas que las microvesiculas son secretadas por celulas tumorales y circulan en los fluidos corporales. El numero de microvesiculas aumenta a medida que el tumor crece. La concentracion de las microvesiculas en los fluidos corporales es proporcional a la carga tumoral correspondiente. Cuanto mas grande sea la carga tumoral, mayor sera la concentracion de microvesiculas en los fluidos corporales.

Se encontro ademas que la mayoria de los ARNs extracelulares en los fluidos corporales de un sujeto estan contenidos dentro de las microvesiculas y protegidos asi de la degradacion por ribonucleasas. Como se muestra en el Ejemplo 3, mas del 90% del ARN extracelular en el suero total puede recuperarse en las microvesiculas.

Se describen los metodos para detectar, diagnosticar, monitorear, tratar o evaluar una enfermedad u otra afeccion medica en un sujeto mediante la determinacion de la concentracion de microvesiculas en una muestra biologica. La determinacion puede realizarse usando la muestra biologica sin aislar primero las microvesiculas o aislando primero las microvesiculas.

Se describen ademas metodos para detectar, diagnosticar, monitorear, tratar o evaluar una enfermedad u otra afeccion medica en un sujeto que comprende las etapas de, aislar exosomas de un fluido corporal de un sujeto, y analizar uno o mas acidos nucleicos contenidos dentro de los exosomas. Los acidos nucleicos se analizan cualitativa y/o cuantitativamente, y los resultados se comparan con los resultados esperados u obtenidos para uno o mas sujetos que tienen o no tienen la enfermedad u otra afeccion medica. La presencia de una diferencia en el contenido de acido nucleico microvesicular del sujeto, en comparacion con la de uno o mas individuos, puede indicar la presencia o ausencia de, la progresion de (por ejemplo, cambios de tamano tumoral y la malignidad del tumor), o la susceptibilidad a una enfermedad u otra afeccion medica en el sujeto.

Claramente, los metodos de aislamiento y las tecnicas descritas en la presente invencion proporcionan las siguientes ventajas sin realizarse hasta ahora: 1) la oportunidad de analizar de forma selectiva acidos nucleicos especificos de la enfermedad o el tumor, lo que puede realizarse mediante el aislamiento de microvesiculas especificas de la enfermedad o el tumor aparte de otras microvesiculas dentro de la muestra de fluido; 2) rendimiento significativamente mayor de especies de acidos nucleicos con una mayor integridad de la secuencia en comparacion con el rendimiento/integridad obtenido mediante la extraccion de acidos nucleicos directamente de la muestra del fluido; 3) la escalabilidad, por ejemplo para detectar acidos nucleicos expresados a bajos niveles, la sensibilidad puede aumentarse mediante la sedimentacion de mas microvesiculas a partir de un mayor volumen de suero; 4) los acidos nucleicos mas puros en los que las proteinas y lipidos, los residuos de celulas muertas, y otros contaminantes potenciales e inhibidores de la PCR son excluidos de los sedimentos de microvesiculas antes de la etapa de extraccion del acido nucleico; y 5) mas opciones en los metodos de extraccion de acidos nucleicos como los sedimentos de microvesiculas son de volumen mucho mas pequeno que el del suero de partida, haciendo posible extraer los acidos nucleicos a partir de estos sedimentos de microvesiculas usando filtros de columnas de pequeno volumen.

Las microvesiculas se aislan preferentemente de una muestra tomada de un fluido corporal de un sujeto. Como se usa en la presente, un quot;fluido corporalquot; se refiere a una muestra de fluido aislado a partir de cualquier parte del cuerpo del sujeto, preferentemente una ubicacion periferica, que incluye pero sin limitarse a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, fluido de la medula espinal, fluido pleural, aspirados de pezon, fluido linfatico, fluido de los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, fluido lagrimal, saliva, leche materna, el fluido del sistema linfatico, semen, fluido cerebroespinal, fluido del sistema intraorgano, fluido ascitico, fluido de quiste tumoral, fluido amniotico y combinaciones de los mismos.

El termino quot;sujetoquot; incluye todos los animales que muestran o se espera que tengan microvesiculas. El sujeto puede ser un mamifero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja, o un roedor (por ejemplo ratones, ratas, conejillo de indias. etc.). El termino quot;sujetoquot; e quot;individuoquot; se usa indistintamente en la presente invencion.

La centrifugacion diferencial se describe en un articulo de Raposo y otros (Raposo y otros, 1996), y metodos similares se detallan en la seccion de Ejemplos en la presente invencion. Los metodos de intercambio anionico y/o cromatografia de permeacion en gel se describen en la patente de Estados Unidos nums. 6,899,863 y 6,812,023. Los metodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de organelo se describen en la patente de Estados Unidos num. 7,198,923. Un metodo de clasificacion magnetica de celulas activadas (MACS) se describe en (Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Un metodo concentrador por ultrafiltracion con nanomembrana se describe en (Cheruvanky y otros, 2007). Preferentemente, las microvesiculas pueden identificarse y aislarse a partir del fluido corporal de un sujeto mediante una tecnologia de microchip de nuevo desarrollo que usa una plataforma de microfluidos unica para separar de manera eficiente y selectiva las microvesiculas derivadas del tumor. Esta tecnologia, como se describe en un articulo de Nagrath y otros (Nagrath y otros, 2007), puede adaptarse para identificar y separar microvesiculas usando principios similares de captura y separacion como se ensena en el articulo.

Las microvesiculas aisladas de un fluido corporal pueden enriquecerse para aquellas que se originan a partir de un tipo celular especifico, por ejemplo, pulmon, pancreas, estomago, intestino, vejiga, rinon, ovario, testiculo, piel, colorrectal, mama, prostata, cerebro, esofago, higado, placenta, celulas fetales. Debido a que las microvesiculas frecuentemente portan moleculas de la superficie tales como antigenos de las celulas del donante, las moleculas de la superficie pueden usarse para identificar, aislar y/o enriquecer en microvesiculas a partir de un tipo celular especifico del donante (Al-Nedawi y otros, 2008;. Taylor y Gercel-Taylor, 2008). De esta manera, las microvesiculas que se originan a partir de poblaciones distintas de celulas pueden analizarse por su contenido de acido nucleico. Por ejemplo, las microvesiculas tumorales (malignas y no malignas) portan los antigenos de superficie asociados a tumores y pueden detectarse, aislarse y/o enriquecerse a traves de estos antigenos especificos de la superficie asociados a tumores. En un ejemplo, el antigeno de superficie es la molecula de

adhesion a la celula epitelial (EpCAM), que es especifica para microvesiculas de los carcinomas de pulmon, colorrectal, mama, prostata, cabeza y cuello, y origen hepatico, pero no de origen de celulas hematologicas (Balzar y otros, 1999;. Went y otros, 2004). En otro ejemplo, el antigeno de superficie es CD24, que es una glicoproteina especifica de microvesiculas de orina (Keller y otros, 2007). En otro ejemplo, el antigeno de superficie se selecciona a partir de un grupo de moleculas CD70, antigeno carcinoembrionario (CEA), EGFR, EGFRvIII y otras variantes, el ligando Fas, TRAIL, el receptor de transferrina, p38.5, p97 y HSP72. Ademas, las microvesiculas especificas de tumores pueden caracterizarse por la carencia de marcadores de superficie, tales como CD80 y CD86.

El aislamiento de microvesiculas a partir de tipos celulares especificos puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de anticuerpos, aptameros, analogos de aptameros o polimeros impresos molecularmente especificos para un antigeno de superficie deseado. El antigeno de superficie puede ser especifico para un tipo de cancer. Alternativamente, el antigeno de superficie puede ser especifico para un tipo celular que no es necesariamente canceroso. Un ejemplo de un metodo de separacion de microvesiculas basado en un antigeno de superficie celular se proporciona en la patente de Estados Unidos num. 7,198,923. Como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos nums. 5,840,867 y5,582,981, WO/2003/050290 y una publicacion de Johnson y otros (Johnson y otros, 2008), los aptameros y sus analogos se unen especificamente a las moleculas de superficie y pueden usarse como una herramienta de separacion para recuperar microvesiculas celulares de un tipo especifico. Los polimeros impresos molecularmente reconocen especificamente ademas moleculas de superficie como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos nums. 6,525,154, 7,332,553 y 7,384,589 y una publicacion de Bossi y otros (Bossi y otros, 2007) y son una herramienta para recuperar y aislar microvesiculas celulares de un tipo especifico.

Puede ser beneficioso o de cualquier otra manera deseable extraer el acido nucleico de los exosomas antes del analisis. Las moleculas de acido nucleico pueden aislarse de una microvesicula usando cualquier numero de procedimientos, que son bien conocidos en la materia, siendo adecuado el procedimiento de aislamiento particular elegido para la muestra biologica en particular. Los ejemplos de metodos para la extraccion se proporcionan en la seccion de Ejemplos en la presente invencion. En algunos casos, con algunas tecnicas, es posible analizar ademas el acido nucleico sin extraerlo de la microvesicula.

Los acidos nucleicos extraidos, que incluyen el ADN y/o el ARN, pueden analizarse directamente sin una etapa de amplificacion. El analisis directo puede realizarse con diferentes metodos que incluyen, pero sin limitarse a, la tecnologia de nanocadena. La tecnologia de nanocadena permite la identificacion y cuantificacion de moleculas diana individuales en una muestra biologica mediante la union de un indicador fluorescente codificador de color a cada molecula diana. Este enfoque es similar al concepto de medicion de inventario mediante el escaneo de codigos de barras. Los indicadores pueden hacerse con cientos o aun miles de codigos diferentes que permiten el analisis altamente multiplexado. La tecnologia se describe en una publicacion de Geiss y otros (Geiss y otros, 2008)

Puede ser beneficioso o de cualquier otra manera deseable amplificar el acido nucleico de la microvesicula antes de analizarlo. Los metodos de amplificacion de acidos nucleicos son usados comunmente y se conocen generalmente en la materia, muchos ejemplos de los que se describen en la presente invencion. Si se desea, la amplificacion puede realizarse de manera cuantitativa. La amplificacion cuantitativa permitira la determinacion cuantitativa de las cantidades relativas de varios acidos nucleicos, para generar un perfil como se describe mas abajo.

El acido nucleico extraido puede ser ARN. Los ARNs despues son preferentemente transcritos de manera inversa a ADN complementarios antes de su amplificacion. Tal transcripcion inversa puede realizarse sola o en combinacion con una etapa de amplificacion. Un ejemplo de un metodo que combina las etapas de transcripcion inversa y de amplificacion es la reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR), que puede modificarse mas aun para ser cuantitativos, por ejemplo, la RT-PCR cuantitativa como se describe en la patente de Estados Unidos num. 5,639,606

Los metodos de amplificacion de acidos nucleicos incluyen, sin limitarse a, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (la patente de Estados Unidos num. 5,219.727 ) y sus variantes tal como la reaccion en cadena de la polimerasa in situ (la patente de Estados Unidos num. 5,538,871), la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (la patente de Estados Unidos num. 5,219,727), la reaccion en cadena de la polimerasa anidada (la patente de Estados Unidos num. 5,556,773), la replicacion de secuencia autosostenida y sus variantes (Guatelli y otros, 1990), sistema de amplificacion transcripcional y sus variantes (Kwoh y otros, 1989), replicasa Qb y sus variantes (Miele y otros, 1983), PCR en-frio (Li y otros, 2008) o cualquier otro metodo de amplificacion de acidos nucleicos, seguido por la deteccion de las moleculas amplificadas usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Son especialmente utiles aquellos esquemas de deteccion disenados para la deteccion de moleculas de acido nucleico si tales moleculas estan presentes en numeros muy bajos.

El analisis de acidos nucleicos presentes en las microvesiculas es cuantitativo y/o cualitativo. Para el analisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresion), ya sean relativas o absolutas, de los acidos nucleicos especificos de interes dentro de

las microvesiculas se miden con metodos conocidos en la tecnica (descritos mas abajo). Para el analisis cualitativo, las especies de acidos nucleicos especificos de interes dentro de las microvesiculas, ya sea silvestres o sus variantes, se identifican con los metodos conocidos en la tecnica (descritos mas abajo).

quot;Aberraciones geneticasquot; se usa en la presente invencion para referirse a las cantidades de acidos nucleicos asi como tambien las variantes de acido nucleico dentro de las microvesiculas. Especificamente, las aberraciones geneticas incluyen, sin limitarse a, la sobreexpresion de un gen (por ejemplo, oncogenes) o un panel de genes, la subexpresion de un gen (por ejemplo, genes supresores de tumores tales como p53 o RB) o un panel de genes, produccion alternativa de variantes de empalme de un gen o un panel de genes, las variantes del numero de copias del gen (CNV) (por ejemplo, ADN de minutos dobles) (Hahn, 1993), modificaciones de acido nucleico (por ejemplo, la metilacion, acetilacion y fosforilaciones), polimorfismos de nucleotido individual (SNPs), reordenamientos cromosomicos (por ejemplo, inversiones, deleciones y duplicaciones), y mutaciones (inserciones, deleciones, duplicaciones, cambio de sentido, sin sentido, sinonimos o cualquier otro cambio de nucleotidos) de un gen o un panel de genes, cuyas mutaciones, en muchos casos, en ultima instancia afectan a la actividad y funcion de los productos genicos, conducen a variantes de empalme transcripcional alternativo y/o cambios del nivel de la expresion genica.

La determinacion de tales aberraciones geneticas puede realizarse por una diversidad de tecnicas conocidas por el profesional experto. Por ejemplo, los niveles de expresion de acidos nucleicos, variantes de corte y empalme alternativo, reordenamiento cromosomico y los numeros de copias de genes pueden determinarse mediante el analisis de microarreglo (la patente de Estados Unidos num. 6,913,879, 7,364,848 , 7,378,245, 6,893,837 y 6,004,755) y la PCR cuantitativa. Particularmente, los cambios del numero de copias pueden detectarse con el ensayo de genotipaje del genoma completo de llumina Infinium II o Microarreglo CGH del Genoma Humano de Agilent (Steemers y otros, 2006). Las modificaciones a los acido nucleico pueden ensayarse mediante los metodos descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos num. 7,186,512 y la publicacion de la patente WO/2003/023065. Particularmente, los perfiles de metilacion pueden determinarse mediante el Panel de Cancer OMA003 de metilacion de ADN de Illumina. Los SNPs y las mutaciones pueden detectarse mediante la hibridacion con sondas especificas de alelo, la deteccion de mutaciones enzimaticas, el clivaje quimico de heteroduplos mal apareados (Cotton y otros, 1988), clivaje con ribonucleasa de bases mal apareadas (Myers y otros, 1985), espectrometria de masas (la Patente de Estados Unidos num. 6,994,960, 7,074,563, y 7,198,893), secuenciacion de acidos nucleicos, polimorfismo de conformacion monocatenaria (SSCP) (Orita y otros, 1989), electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), electroforesis de gel en gradiente de temperatura (TGGE) (Fischer y Lerman, 1979a; Fischer y Lerman, 1979b), polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP) (Kan y Dozy, 1978a; Kan y Dozy, 1978b), ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA), la PCR especifica de alelo (ASPCR) (la patente de Estados Unidos num. 5,639,611), reaccion en cadena de ligacion (LCR) y sus variantes (Abravaya y otros, 1995;. Landegren y otros, 1988; Nakazawa y otros, 1994), analisis de heteroduplos por citometria de flujo (WO/2006/113590) y combinaciones/modificaciones de los mismos. Notablemente, los niveles de expresion genica pueden determinarse mediante la tecnica de analisis en serie de la expresion genica (SAGE) (Velculescu y otros, 1995). Generalmente, los metodos para el analisis de aberraciones geneticas se presentan en numerosas publicaciones, sin limitarse a las citadas en la presente invencion, y estan disponibles para los profesionales expertos. El metodo de analisis adecuado dependera de las metas especificas del analisis, la afeccion/historia del paciente y el(los) tipo(s) de cancer especifico(s), enfermedades u otras afecciones medicas a detectar, monitorear o tratar.

Se ha identificado una diversidad de aberraciones geneticas para producir y/o contribuir a la generacion inicial o progresion del cancer. Los ejemplos de genes que son comunmente regulados positivamente (es decir, sobreexpresados) en cancer se proporcionan en la Tabla 4 (canceres de diferentes tipos) y la Tabla 6 (cancer pancreatico). Los ejemplos de microARNs que estan regulados positivamente en el tumor cerebral se proporcionan en la Tabla 8. En algunos casos hay un aumento en el nivel de expresion de acido nucleico de un gen enumerado en la Tabla 4 y/o en la Tabla 6 y/o de un microARN enumerados en la Tabla 8. Los ejemplos de genes que son comunmente regulados negativamente (por ejemplo sub expresado) en cancer se proporcionan en la Tabla 5 (canceres de diferentes tipos) y la Tabla 7 (cancer de pancreas). Los ejemplos de microARN que son regulados negativamente en el tumor cerebral se proporcionan en la Tabla 9. En algunos casos hay una disminucion en el nivel de expresion de acido nucleico de un gen enumerado en la Tabla 5 y/o en la Tabla 7 y/o un microARN enumerado en la Tabla 9. Los ejemplos de genes que son comunmente subexpresados, o sobreexpresados en tumores cerebrales se revisan en (Furnari y otros, 2007). Con respecto al desarrollo de tumores cerebrales, RB y p53 estan frecuentemente regulados negativamente para disminuir de cualquier otra manera su actividad supresora del tumor. Por lo tanto, la presencia o ausencia de un aumento o disminucion en el nivel de expresion del acido nucleico de un(os) gen(es) y/o un(os) microARN(s) cuyo nivel de expresion desregulado es especifico de un tipo de cancer puede usarse para indicar la presencia o ausencia del tipo de cancer en el sujeto.

De lmanera similar, las variantes de acido nucleico, por ejemplo, modificaciones del ADN o el ARN, los polimorfismos de nucleotidos individuales (SNPs) y mutaciones (por ejemplo, cambio de sentido, sin sentido, inserciones, deleciones, duplicaciones) ademas pueden analizarse dentro de las microvesiculas del fluido corporal de un sujeto, que incluyen las

mujeres embarazadas donde las microvesiculas derivadas del feto pueden estar en el suero asi como tambien en el fluido amniotico. Los ejemplos no limitantes se proporcionan en la Tabla 3. La variante de nucleotido puede estar en el gen EGFR. La variante de nucleotido puede ser la mutacion/variante de EGFRvIII. Los terminos quot;EGFRquot;, quot;receptor del factor de crecimiento epidermicoquot; y quot;ErbB 1quot; se usan indistintamente en la materia, por ejemplo como se describe en un articulo de Carpenter (Carpenter, 1987). Con respecto al desarrollo de tumores cerebrales, RB, PTEN, p16, p21 y p53 se mutan frecuentemente para disminuir de cualquier otra manera su actividad supresora del tumor. Los ejemplos de mutaciones especificas en formas especificas de tumores cerebrales se discuten en un articulo de Furnari y otros (Furnari y otros, 2007)

Adicionalmente, mas aberraciones geneticas asociadas con los canceres se identificaron recientemente en algunos proyectos de investigacion en curso. Por ejemplo, el programa Atlas del Genoma del Cancer (TCGA) explora un espectro de cambios genomicos involucrados en los canceres humanos. Los resultados de este proyecto y otros esfuerzos de investigacion similares estan publicados (Jones y otros, 2008; McLendon y otros, 2008; Parsons y otros, 2008; Wood y otros, 2007). Especificamente, estos proyectos de investigacion han identificado las aberraciones geneticas, tales como mutaciones (por ejemplo, perdida de sentido, sin sentido, inserciones, deleciones y duplicaciones), las variaciones del nivel de expresion genica (ARNm o microARN), variaciones del numero de copia y modificacion de los acidos nucleicos (por ejemplo, metilacion), en glioblastoma humano, cancer de pancreas, cancer de mama y/o cancer colorrectal. Los genes mutados mas frecuentemente en estos canceres se enumeran en la Tabla 11 y la Tabla 12 (glioblastoma), Tabla 13 (cancer de pancreas), Tabla 14 (cancer de mama) y Tabla 15 (cancer colorrectal). Las aberraciones geneticas en estos genes, y de hecho cualquier gen que contiene cualquiera de las aberraciones geneticas en un cancer, son dianas que pueden seleccionarse para su uso en el diagnostico y/o monitoreo del cancer mediante los metodos descritos en la presente invencion.

La deteccion de una o mas variantes de nucleotidos puede lograrse mediante la realizacion de un tamiz de variante de nucleotidos en los acidos nucleicos dentro de las microvesiculas. Tal tamiz puede ser tan amplio o estrecho como se determine necesario o deseable por el profesional experto. Puede ser un tamiz amplio (configurado para detectar todas las posibles variantes de nucleotidos en los genes conocidos por estar asociados con uno o mas canceres o estados de la enfermedad). Cuando se sospecha o se sabe que existe un cancer o una enfermedad especifica, el tamiz puede ser especifico para ese cancer o enfermedad. Un ejemplo es un tamiz para cancer cerebral/tumor cerebral (por ejemplo, configurado para detectar todas las posibles variantes de nucleotidos en los genes asociados con varios subtipos clinicamente distintos de cancer cerebral o conocidas mutaciones resistentes o sensibles a farmacos de ese cancer).

El analisis puede ser de un perfil de las cantidades (niveles) de acidos nucleicos especificos presentes en la microvesicula, en la presente invencion referido como un quot;perfil de acidos nucleicos cuantitativoquot; de las microvesiculas. El analisis puede ser de un perfil de las especies de acidos nucleicos especificos presentes en las microvesiculas (silvestre asi como tambien las variantes), en la presente invencion se refiere como un quot;perfil de las especies de acidos nucleicosquot;. Un termino usado en la presente invencion para referirse a una combinacion de estos tipos de perfiles es quot;perfil geneticoquot; que se refiere a la determinacion de la presencia o ausencia de especies de nucleotidos, las variantes y ademas aumentos o disminuciones en los niveles de acido nucleico.

Una vez generados, estos perfiles geneticos de las microvesiculas se comparan con aquellos esperados en, o derivados de cualquier otra manera de un individuo normal sano. Un perfil puede ser un perfil amplio del genoma (configurado para detectar todos los posibles genes expresados o secuencias de ADN). Puede ser asi mas estrecho, tal como un perfil amplio de cancer (configurado para detectar todos los posibles genes o acidos nucleicos derivados de ellos, o que se sabe estan asociados con uno o mas canceres). Cuando se sospecha o se sabe que existe un tipo especifico de cancer, el perfil puede ser especifico para ese cancer (por ejemplo, configurado para detectar todos los posibles genes o acidos nucleicos derivados de ellos, asociados con varios subtipos clinicamente distintos de ese cancer o mutaciones conocidas de ese cancer resistentes o sensibles a los farmacos).

El profesional experto puede seleccionar cuales acidos nucleicos han de amplificarse y/o analizarse. La totalidad del contenido de acido nucleico de los exosomas o solo un subconjunto de acidos nucleicos especificos que son probables o se sospeche que estan influenciados por la presencia de una enfermedad u otra afeccion medica tal como el cancer, puede amplificarse y/o analizarse. La identificacion de una(s) aberracion(es) del acido nucleico en el acido nucleico de la microvesicula analizada puede usarse para diagnosticar el sujeto para la presencia de una enfermedad tal como cancer, enfermedades hereditarias o infeccion viral con la que esa(s) aberracion(es) se asocia(n). Por ejemplo, el analisis de la presencia o ausencia de una o mas variantes del acido nucleico de un gen especifico de un cancer (por ejemplo, la mutacion EGFRvIII) puede indicar la presencia del cancer en el individuo. Alternativamente, o adicionalmente, el analisis de acidos nucleicos para un aumento o disminucion en los niveles del acido nucleico especifico de un cancer puede indicar la presencia del cancer en el individuo (por ejemplo, un aumento relativo en el acido nucleico del EGFR, o una disminucion relativa en un gen supresor tumoral como p53).

Las mutaciones de un gen que esta asociado con una enfermedad tal como el cancer (por ejemplo a traves de variantes de nucleotidos, sobreexpresion o subexpresion) pueden detectarse mediante el analisis de acidos nucleicos en microvesiculas, cuales acidos nucleicos se derivan del propio genoma en la celula de origen o de genes exogenos introducidos a traves de los virus. Las secuencias de acidos nucleicos pueden ser completas o parciales, como se espera que ambos rindan informacion util en el diagnostico y el pronostico de una enfermedad. Las secuencias pueden ser sentido o antisentido para el presente gen o secuencias transcritas. El profesional experto sera capaz de concebir metodos de deteccion para una discrepancia en un nucleotido ya sea de los acidos nucleicos sentido o antisentido que pueden estar presentes en una microvesicula. Muchos de estos metodos involucran el uso de sondas que son especificas para las secuencias de nucleotidos que flanquean directamente, o contienen las discrepancias de nucleotidos. El profesional experto puede disenar tales sondas dado el conocimiento de las secuencias de genes y la ubicacion de las variantes de acido nucleico dentro del gen. Tales sondas pueden usarse para aislar, amplificar, y/o en realidad hibridar para detectar las variantes del acido nucleico, tal como se describe en la tecnica y en la presente invencion.

La determinacion de la presencia o ausencia de una variante particular de nucleotido o una pluralidad de variantes en el acido nucleico dentro de las microvesiculas de un sujeto puede realizarse en una diversidad de maneras. Una diversidad de metodos esta disponible para tal analisis, que incluyen, pero sin limitarse a, la PCR, hibridacion con sondas especificas de alelo, la deteccion de mutaciones enzimaticas, el clivaje quimico de desapareamientos, la espectrometria de masas o secuenciacion de ADN, que incluye la minisecuenciacion. La hibridacion con sondas especificas de alelo puede efectuarse en dos formatos: 1) oligonucleotidos especificos de alelo unidos a una fase solida (vidrio, silicio, membranas de nailon) y la muestra marcada en solucion, como en muchas aplicaciones de chip de ADN, o 2) muestra unida (frecuentemente ADN clonado o ADN amplificado por PCR) y oligonucleotidos marcados en solucion (ya sea alelo especifico o corto de manera que permite la secuenciacion mediante hibridacion). Las pruebas de diagnostico pueden involucrar un panel de discrepancias, frecuentemente en un soporte solido, que permite la determinacion simultanea de mas de una discrepancia. La determinacion de la presencia de al menos una discrepancia del acido nucleico en el acido nucleico de la microvesicula puede implicar una prueba de determinacion del haplotipo. Los metodos de determinacion de haplotipos son conocidos por los expertos en la materia, como por ejemplo, en WO 00/04194.

La determinacion de la presencia o ausencia de una(s) variante(s) de acido(s) nucleico(s) puede involucrar la determinacion de la secuencia del sitio o sitios de variacion (la ubicacion exacta dentro de la secuencia donde se produce la variacion del acido nucleico respecto a la norma) mediante metodos tales como reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciacion de terminacion de cadena de ADN (la patente de Estados Unidos num. 5,547,859), minisecuenciacion (Fiorentino y otros, 2003), hibridacion de oligonucleotidos, pirosecuenciacion, analizador de genoma de Illumina, secuenciacion profunda, espectrometria de masas u otros metodos de deteccion de secuencia de acido nucleico. Los metodos para la deteccion de variantes de acido nucleico son bien conocidos en la tecnica y se describen en WO 00/04194. En un metodo ilustrativo, la prueba de diagnostico comprende la amplificacion de un segmento de ADN o ARN (generalmente luego de la conversion del ARN a ADN complementario) que abarca una o mas variantes conocidas en la secuencia genica deseada. Este segmento amplificado se secuencio despues, y/o se sometio a electroforesis con el fin de identificar las variantes del nucleotido en el segmento amplificado.

Se describe un metodo de tamizaje para las variantes del nucleotido en el acido nucleico de las microvesiculas aisladas. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante PCR o, alternativamente, en una reaccion en cadena de ligacion (LCR) (Abravaya y otros, 1995; Landegren y otros, 1988; Nakazawa y otros, 1994). La LCR puede ser particularmente util para detectar mutaciones puntuales en un gen de interes (Abravaya y otros, 1995). El metodo de la LCR comprende las etapas de diseno de iniciadores redundantes para la amplificacion de la secuencia diana, los iniciadores que corresponden a una o mas regiones conservadas del acido nucleico que corresponde al gen de interes, la amplificacion de productos de PCR con los iniciadores usando, como una plantilla, un acido nucleico obtenido a partir de una microvesicula, y el analisis de los productos de PCR. La comparacion de los productos de PCR del acido nucleico de la microvesicula con una muestra control (ya sea que tenga la variante de nucleotidos o no) indica variantes en el acido nucleico de la microvesicula. El cambio puede ser ya sea una ausencia o presencia de una variante del nucleotido en el acido nucleico de la microvesicula, dependiendo del control.

El analisis de los productos de amplificacion puede realizarse usando cualquier metodo capaz de separar los productos de amplificacion de acuerdo con su tamano, que incluye la electroforesis en gel automatizada y manual, la espectrometria de masas, y similares.

Alternativamente, los productos de amplificacion pueden analizarse basado en las diferencias en la secuencia, usando SSCP, DGGE, TGGE, clivaje quimico, OLA, polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion, asi como tambien la hibridacion, por ejemplo, los microarreglos de acidos nucleicos.

Los metodos de aislamiento de acidos nucleicos, la amplificacion y el analisis son rutinarios para un experto en la tecnica y los ejemplos de los protocolos pueden encontrarse, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (conjunto de 3 volumenes) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, y Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a edicion (15 de enero de 2001), ISBN: 0879695773. Una fuente util en particular de protocolos para los metodos usados en la amplificacion por PCR es PCR Basics: From Background to Bench by Springer Verlag; 1a edicion (15 de octubre de 2000), ISBN: 0387916008.

Muchos metodos de diagnostico realizados en una muestra de biopsia del tumor pueden realizarse con microvesiculas desde celulas tumorales, asi como tambien se conocen algunas celulas normales que desprenden microvesiculas en el fluido corporal y las aberraciones geneticas dentro de estas microvesiculas reflejan aquellas dentro de las celulas tumorales como se demuestra en la presente invencion. Ademas, los metodos de diagnostico usando microvesiculas tienen caracteristicas que estan ausentes en los metodos de diagnostico realizados directamente en una muestra de biopsia del tumor. Por ejemplo, una ventaja particular del analisis de acidos nucleicos microvesiculares, a diferencia de otras formas de toma de muestras de acido nucleico de tumor/cancer, es la disponibilidad para el analisis de acidos nucleicos de tumor/cancer derivados de todos los focos de un tumor o tumores geneticamente heterogeneos presentes en un individuo. Las muestras de biopsia se limitan en que ellas proporcionan informacion unicamente sobre el enfoque especifico del tumor a partir del cual se obtiene la biopsia. Diferentes focos tumorales/cancerosos que se encuentran dentro del cuerpo, o aun dentro de un tumor individual frecuentemente tienen diferentes perfiles geneticos y no se analizan en una biopsia estandar. Sin embargo, el analisis de los acidos nucleicos microvesiculares de un individuo supuestamente proporciona un muestreo de todos los focos dentro de un individuo. Esto proporciona informacion valiosa con respecto a los tratamientos recomendados;. la efectividad del tratamiento, el pronostico de la enfermedad, y el analisis de recurrencia de la enfermedad, que no pueden proporcionarse mediante una biopsia simple

La identificacion de aberraciones geneticas asociadas con enfermedades especificas y/o afecciones medicas mediante los metodos descritos en la presente invencion puede usarse ademas para las decisiones de pronostico y tratamiento de un individuo diagnosticado con una enfermedad u otra afeccion medica tal como el cancer. La identificacion de la base genetica de una enfermedad y/o afeccion medica proporciona informacion util que orienta el tratamiento de la enfermedad y/o afeccion medica. Por ejemplo, muchas formas de quimioterapia han mostrado ser mas efectivas en canceres con anomalias/aberraciones geneticas especificas. Un ejemplo es la efectividad de los tratamientos dirigidos al EGFR con medicamentos, como los inhibidores de cinasa gefitinib y erlotinib. Tal tratamiento ha demostrado ser mas efectivo en las celulas cancerosas cuyo gen de EGFR alberga mutaciones especificas de nucleotido en el dominio cinasa de la proteina EGFR (la publicacion de la patente de Estados Unidos 20060147959). En otras palabras, la presencia de al menos una de las variantes de nucleotidos identificadas en el dominio cinasa del mensaje del acido nucleico de EGFR indica que un paciente probablemente se beneficiara del tratamiento con el compuesto gefitinib o erlotinib dirigido al EGFR . Tales variantes de nucleotidos pueden identificarse en los acidos nucleicos presentes en las microvesiculas mediante los metodos descritos en la presente invencion, y se ha demostrado que los transcritos de EGFR de origen tumoral se aislan de las microvesiculas en el fluido corporal.

Se ha encontrado ademas que las aberraciones geneticas en otros genes influyen en la efectividad de los tratamientos. Como se describe en la publicacion de Furnari y otros (Furnari y otros, 2007), las mutaciones en una diversidad de genes afecta la efectividad de los medicamentos especificos usados en la quimioterapia para el tratamiento de tumores cerebrales. La identificacion de estas aberraciones geneticas en los acidos nucleicos dentro de las microvesiculas orientara la seleccion de planes de tratamiento apropiados.

Se describe ademas un metodo para el monitoreo de la progresion de la enfermedad (por ejemplo cancer) en un sujeto, y un metodo para el monitoreo de la recurrencia de la enfermedad en un individuo. Estos metodos comprenden las etapas de aislamiento de las microvesiculas de los fluidos corporales de un individuo, como se discute en la presente invencion, y el analisis del acido nucleico dentro de las microvesiculas como se discute en la presente invencion (por ejemplo para crear un perfil genetico de las microvesiculas). La presencia/ausencia de un cierto perfil/aberracion genetica se usa para indicar la presencia/ausencia de la enfermedad (por ejemplo, cancer) en el sujeto como se discute en la presente invencion. El proceso se realiza periodicamente en el tiempo, y los resultados se revisaron, para monitorear la progresion o regresion de la enfermedad, o para determinar la recurrencia de la enfermedad. Dicho de otra manera, un cambio en el perfil genetico indica un cambio en el estado de la enfermedad en el sujeto. El periodo de tiempo que transcurre entre el muestreo de las microvesiculas del sujeto, para la realizacion del aislamiento y el analisis de la microvesicula, dependera de las circunstancias del sujeto, y se determinara por el profesional experto. Tal metodo resultaria sumamente beneficioso cuando se analice un acido nucleico de un gen que esta asociado con la terapia sometida al sujeto. Por ejemplo, un gen que esta dirigido por la terapia puede monitorerase para el desarrollo de mutaciones que lo hacen resistente a la terapia, tiempo tras el que la terapia puede modificarse en consecuencia. El gen monitoreado puede ser ademas uno que indica la receptividad especifica a una terapia especifica.

Una diversidad de enfermedades no cancerosas y/o afecciones medicas ademas tienen vinculos y/o causas geneticas, y tales enfermedades y/o afecciones medicas pueden diagnosticarse y/o monitorearse de manera similar mediante los metodos descritos en la presente invencion. Muchas de estas enfermedades son de naturaleza metabolicas, infecciosas o degenerativas. Una de esas enfermedades es la diabetes (por ejemplo diabetes insipida) en la que se modifica el receptor de la vasopresina tipo 2 (V2R). Otra de esas enfermedades es la fibrosis renal en la que se cambian los perfiles geneticos para los genes de colagenos, fibronectina y TGF-�. Los cambios en el perfil genetico debido al abuso de sustancias (por ejemplo uso de esteroides o farmacos), la infeccion viral y/o bacteriana, y los estados de enfermedad hereditaria pueden detectarse de manera similar mediante los metodos descritos en la presente invencion.

Las enfermedades u otras afecciones medicas incluyen, pero sin limitarse a, nefropatia, diabetes insipida, diabetes tipo I, diabetes tipo II, enfermedad renal glomerulonefritis, glomerulonefritides bacterianas o virales, nefropatia por IgA, Purpura de Henoch-Schonlein, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatia membranosa, sindrome de Sjogren, sindrome nefrotico de enfermedad de cambios minimos, glomeruloesclerosis focal y trastornos relacionados, insuficiencia renal aguda, nefritis tubulointersticial aguda, pielonefritis, enfermedad inflamatoria del tracto GU, preclampsia, rechazo al injerto renal, lepra, nefropatia por reflujo, nefrolitiasis, enfermedad renal genetica, quistica medular, esponja medular, enfermedad renal poliquistica, enfermedad renal poliquistica autosomica dominante, enfermedad renal poliquistica autosomica recesiva, esclerosis tuberosa, enfermedad de von Hippet-Lindau, enfermedad de la membrana delgada basal glomerular familiar, glomerulopatia por colageno III, glomerulopatia por fibronectina, sindrome de Alport, enfermedad de Fabry, sindrome de Nail-Patella, anomalias urologicas congenitas, gammapatias monoclonales, mieloma multiple, amiloidosis y trastornos relacionados, malestar febril, fiebre mediterranea familiar, infeccion por VIH-SIDA, enfermedad inflamatoria, vasculitis sistemicas, poliarteritis nodosa, granulomatosis de Wegener, poliarteritis, glomerulonefritis crecentic y necrotizante, polimiositis-dermatomiositis, pancreatitis, artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistemico, gota, trastornos de la sangre, anemia de celulas falciformes, la trombocitopenica trombotica purpura, el sindrome de Fanconi, trasplante, lesion renal aguda, sindrome de intestino irritable, sindrome hemolitico-uremico, necrosis corticol aguda, tromboembolismo renal, trauma y cirugia, lesion extensa, quemaduras, cirugia abdominal y vascular, induccion de la anestesia, efecto secundario del uso de farmacos o abuso de farmacos, enfermedad circulatoria infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad vascular periferica, hipertension, enfermedad coronaria, enfermedad cardiovascular no aterosclerotica, enfermedad cardiovascular aterosclerotica, enfermedad de la piel, soriasis, esclerosis sistemica, enfermedad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, la apnea obstructiva del sueno, hipoxia a gran altura o enfermedad erdocrina, acromegalia, diabetes mellitus o diabetes insipida.

La seleccion de un individuo del que se aislan las microvesiculas se realiza por el profesional experto sobre la base del analisis de una o mas de una diversidad de factores. Tales factores a considerar son si el sujeto tiene antecedentes familiares de una enfermedad especifica (por ejemplo un cancer), tiene una predisposicion genetica para tal enfermedad, tiene un riesgo aumentado de una enfermedad debido a antecedentes familiares, la predisposicion genetica, otra enfermedad o sintomas fisicos que indican una predisposicion, o motivos medioambientales. Los motivos medioambientales incluyen el estilo de vida, la exposicion a agentes que causan o contribuyen a la enfermedad, tales como en el aire, la tierra, el agua o la dieta. Adicionalmente, tras tener previamente la enfermedad, ser diagnosticado actualmente con la enfermedad antes de la terapia o luego de la terapia, ser tratado actualmente para la enfermedad (sometiendose a la terapia), estar en remision o en recuperacion de la enfermedad, son otros motivos para seleccionar un individuo para realizar los metodos.

Los metodos descritos en la presente invencion se realizan opcionalmente con la etapa adicional de seleccion de un gen o acido nucleico para el analisis, antes de la etapa de analisis. Esta seleccion puede basarse en cualquiera de las predisposiciones del sujeto, o cualquier exposicion o diagnosticos previos, o tratamientos terapeuticos experimentados o al los que se somete al mismo tiempo el sujeto.

El cancer diagnosticado, monitoreado o de cualquier otra manera perfilado, puede ser cualquier tipo de cancer. Esto incluye, sin limitarse a, los canceres de celulas epiteliales tales como cancer de pulmon, ovario, cuello uterino, endometrio, mama, cerebro, colon y prostata. Ademas se incluyen el cancer gastrointestinal, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer del sistema nervioso, cancer de rinon, cancer de retina, cancer de piel, cancer de higado, cancer de pancreas, cancer genital urinario y cancer de vejiga, melanoma, y leucemia. Adicionalmente, los metodos y composiciones pueden ser igualmente aplicables a la deteccion, diagnostico y pronostico de tumores no malignos en un individuo (por ejemplo neurofibromas, meningiomas y schwannomas). De acuerdo con la invencion el cancer es cancer de prostata.

Adicionalmente para identificar las aberraciones de acidos nucleicos previamente conocidas (como asociada con enfermedades), los metodos descritos en la presente invencion pueden usarse para identificar previamente secuencias/modificaciones de acido nucleico no identificadas previamente (por ejemplo modificaciones post transcripcionales) cuyas aberraciones son asociadas con una cierta enfermedad y/o afeccion medica. Esto se logra, por ejemplo, mediante el analisis del acido nucleico dentro de las microvesiculas de un fluido corporal de uno o mas sujetos con

una enfermedad/afeccion medica dada (por ejemplo un tipo clinico o subtipo de cancer) y la comparacion con e l acido nucleico dentro de las microvesiculas de uno o mas sujetos sin la enfermedad/afeccion medica dada, para identificar las diferencias en su contenido de acido nucleico. Las diferencias pueden ser cualquiera de las aberraciones geneticas que incluyen, sin limitarse a, nivel de expresion del acido nucleico, variantes alternativas de empalme, variantes del numero de copias del gen (CNV), modificaciones del acido nucleico, polimorfismos de nucleotido individual (SNP), y mutaciones (inserciones, deleciones o cambios de nucleotido individual) del acido nucleico. Una vez que se identifica una diferencia en un parametro genetico de un acido nucleico en particular para una cierta enfermedad, estudios adicionales que involucran un numero de sujetos significativo clinica y estadisticamente pueden llevarse a cabo para establecer la correlacion entre la aberracion genetica del acido nucleico en particular y la enfermedad. El analisis de las aberraciones geneticas puede hacerse mediante uno o mas metodos descritos en la presente invencion, tal como se determina de manera adecuada por el profesional experto.

Exosomas como vehiculos de entrega

Se describe una microvesicula aislada, aislada a partir de un individuo. La microvesicula puede producirse por una celula dentro del cerebro del individuo (por ejemplo una celula tumoral o no tumoral). La microvesicula puede aislarse de un fluido corporal de un individuo, tal como se describe en la presente invencion. Los metodos de aislamiento se describen en la presente invencion.

Se han encontrado microvesiculas aisladas a partir de las celulas de glioblastoma humano que contienen ARNs mensajeros, miARNs y proteinas angiogenicas. Tales microvesiculas de glioblastoma se abosorbieron por las celulas endoteliales cerebrales humanas primarias, probablemente a traves de un mecanismo de endocitosis, y se tradujo en esas celulas un ARNm de proteina indicadora incorporada a las microvesiculas. Esto indica que los mensajes entregados por las microvesiculas pueden cambiar el perfil genetico y/o traduccional de una celula diana (una celula que absorbe una microvesicula). Las microvesiculas contenian ademas miARNs que son conocidos por ser abundantes en los glioblastomas (Krichevski y otros, manuscrito en preparacion). Asi las microvesiculas derivadas de tumores de glioblastoma funcionan como vehiculos de entrega para ARNm, miARN y proteinas que pueden cambiar el estado traduccional de otras celulas a traves de la entrega de especies de ARNm especificos, al promover la angiogenesis de las celulas endoteliales, y estimular el crecimiento tumoral.

Las microvesiculas pueden reducirse de un fluido corporal de un sujeto donante antes de que dicho fluido corporal se entregue a un sujeto receptor. El sujeto donante puede ser un sujeto con un tumor indetectable y las microvesiculas en el fluido corporal se derivan del tumor. Las microvesiculas tumorales en el fluido corporal del donante, si no se eliminan, serian nocivas puesto que los materiales geneticos y proteinas en la microvesicula pueden promover el crecimiento incontrolado de las celulas en el sujeto receptor.

Como tal, se describe ademas el uso de las microvesiculas identificadas en la presente invencion para entregar un acido nucleico a una celula. La celula puede estar dentro del cuerpo de un individuo. El metodo comprende la administracion de una(s) microvesicula(s) que contiene(n) el acido nucleico, o una celula que produce dichas microvesiculas, al individuo de manera que las microvesiculas contacten y/o penetren a la celula del individuo. La celula a la que el acido nucleico se entrega se refiere como la celula diana.

La microvesicula puede ser disenada para contener un acido nucleico que no lo contiene de forma natural (es decir, que es exogeno para el contenido normal de la microvesicula). Esto puede lograrse mediante la insercion fisica del acido nucleico en las microvesiculas. Alternativamente, una celula (por ejemplo, crecida en cultivo) puede ser disenada para dirigir uno o mas acidos nucleicos especificos al exosoma, y el exosoma puede aislarse de la celula. Alternativamente, la propia celula disenada puede administrarse al individuo.

La celula que produce el exosoma para la administracion puede ser del mismo o similar origen o ubicacion en el cuerpo que la celula diana. Es decir, para la entrega de una microvesicula a una celula del cerebro, la celula que produce la microvesicula seria una celula del cerebro (por ejemplo una celula primaria crecida en cultivo). Alternativamente, la celula que produce el exosoma puede ser de un tipo celular diferente de la celula diana. La celula que produce el exosoma puede ser un tipo que se ubica de manera proxima en el cuerpo a la celula diana.

Una secuencia de acido nucleico que puede entregarse a una celula a traves de un exosoma puede ser ARN o ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario, y puede ser seleccionado de un grupo que comprende: acido nucleico que codifica una proteina de interes, oligonucleotidos, analogos de acidos nucleicos, por ejemplo acido peptido nucleico (PNA), PNA pseudocomplementario (PC-PNA), acido nucleico bloqueado (LNA) etcetera. Tales secuencias de acidos nucleicos incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a, secuencias de acido nucleico que codifican proteinas, por ejemplo que actuan como

represores transcripcionales, moleculas antisentido, ribozimas, pequenas secuencias de acidos nucleicos inhibitorios, por ejemplo pero sin limitarse a ARNi, ARNhc, ARNip, miARN, oligonucleotidos antisentido, y combinaciones de los mismos.

Las microvesiculas aisladas a partir de un tipo de celula se entregan a un sujeto receptor. Dichas microvesiculas pueden beneficiar medicamente al sujeto receptor. Por ejemplo, los efectos de la angiogenesis y la proproliferacion de los exosomas tumorales pueden ayudar a la regeneracion de los tejidos lesionados en el sujeto receptor. Los medios de entrega pueden ser por transfusion de fluidos corporales en donde las microvesiculas se anaden en un fluido corporal de un sujeto donante antes que dicho fluido corporal se entregue a un sujeto receptor.

La microvesicula puede ser un ingrediente (por ejemplo el ingrediente activo en una formulacion farmaceuticamente aceptable apropiada para la administracion al sujeto (por ejemplo en los metodos descritos en la presente invencion). Generalmente, esto comprende un portador farmaceuticamente aceptable para el ingrediente activo. El portador especifico dependera de un numero de factores (por ejemplo, la via de administracion).

El quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; significa cualquier medio farmaceuticamente aceptable para mezclar y/o entregar la composicion de entrega dirigida a un sujeto. Esto incluye un material, composicion o vehiculo farmaceuticamente aceptables, tal como una carga liquida o solida, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulacion, involucrados en portar o transportar los agentes del sujeto desde un organo, o porcion del cuerpo, a otro organo, o porcion del cuerpo. Cada portador debe ser quot;aceptablequot; en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y ser compatible con la administracion a un sujeto, por ejemplo un humano

La administracion al sujeto puede ser sistemica o ubicada. Esto incluye, sin limitarse a, dispensar, entregar o aplicar un compuesto activo (por ejemplo en una formulacion farmaceutica) al sujeto por cualquier via apropiada para la entrega del compuesto activo a la ubicacion deseada en el sujeto, que incluye la entrega por cualquiera via parenteral u oral, inyeccion intramuscular, inyeccion subcutanea/intradermica, inyeccion intravenosa, administracion bucal, entrega transdermica y administracion por via rectal, colonica, vaginal, intranasal o el tracto respiratorio.

Debe entenderse que esa invencion no se limita a las metodologias particulares, protocolos y reactivos descritos en la presente invencion, y como tal puede variar. La terminologia usada en la presente invencion es con el proposito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invencion, que se define unicamente por las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente invencion se relaciona a los metodos descritos en la presente invencion, y los componentes respectivos de ellos, como esencial para la invencion, pero abierto a la inclusion de elementos no especificados, esenciales

o no (quot;que comprendequot;). En algunas modalidades, otros elementos que deben incluirse en la descripcion del metodo o componente respectivo de ellos se limitan a los que no afectan materialmente a la(s) caracteristica(s) basica(s) y novedosa(s) de la invencion (quot;que consiste practicamente enquot;). Esto se aplica igualmente a las etapas dentro de un metodo descrito asi como tambien a componentes del mismo. En otras modalidades, los metodos, y los respectivos componentes de ellos, descritos en la presente invencion estan destinados a ser exclusivos de cualquier elemento que no se considere un elemento esencial para el componente, composicion o metodo (quot;que consiste dequot;).

EJEMPLOS

Ejemplos 1-7.Celulas tumorales desprenden microvesiculas que contienenARNs, que incluyen ARNs mensajerosy microARNs,yesas microvesiculas contienenmas de 90%del ARN extracelularenlos fluidos corporales.

Ejemplo 1: Las microvesiculas se desprenden de celulas de glioblastoma humano primario.

El tejido del glioblastoma se obtuvo a partir de resecciones quirurgicas y las celulas tumorales se disociaron y se cultivaron en forma de monocapas. Especificamente, los especimenes de tumor cerebral de los pacientes diagnosticados por un neuropatologo como glioblastoma multiforme se tomaron directamente de la cirugia y se colocaron en medio Neurobasal esteril frio (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los especimenes se disociaron en celulas individuales dentro de 1 hora a partir del momento de la cirugia usando un Kit de Disociacion de Tejido Neural (Miltenyi Biotech, Berisch Gladbach, Alemania) y se sembraron en DMEM 5% dFBS suplementado con penicilina-estreptomicina (10 UI ml-1 y 10 Ig ml-1, respectivamente, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos). Debido a que las microvesiculas pueden encontrarse en el suero bovino fetal (FBS) usado tradicionalmente para cultivar celulas, y estas microvesiculas contienen cantidades sustanciales de ARNm y miARN, fue importante crecer las celulas tumorales en medios que contenian FBS reducido en microvesiculas (dFBS). Se encontro que las celulas primarias cultivadas obtenidas de tres tumores de glioblastoma producian microvesiculas tanto en pases tempranos como posteriores (un pase es una generacion celular definida por la division de las celulas, que es una tecnica comun de cultivo celular y es necesaria para mantener vivas las celulas). Las

microvesiculas fueron capaces de detectarse mediante microscopia electronica de barrido (FIGS. la y 1b) y microscopia electronica de transmision (FIG. 1f). Brevemente, las celulas de glioblastoma humano se colocaron sobre cubreobjetos recubiertos con ornitina, se fijaron en fijador de Karnovskys 0.5x y despues se lavaron con PBS 2x5min (2 veces con 5 minutos cada uno). Las celulas se deshidrataron en 35% EtOH 10 min, 50% EtOH 2x 10 min, 70% EtOH 2x 10 min, 95% EtOH 2x 10 min, y 100% EtOH 4x 10 min. Las celulas se transfirieron despues a secado de punto critico en una secadora de punto critico Tousimis SAMDR1-795 semiautomatica seguido por el recubrimiento con cromo en un recubridor de haz de iones de alta resolucion GATAN Modelo 681. Como se muestra en las FIGS. 1a y 1b, las celulas tumorales se cubrieron con microvesiculas que varian en tamano de aproximadamente 50 -500 nm.

Ejemplo 2: Las microvesiculas de glioblastoma contienen ARN.

Para aislar las microvesiculas, se cultivaron celulas de glioblastoma en el pase 1-15 en medio libre de microvesiculas (DMEM que contenia 5% dFBS preparado mediante ultracentrifugacion a 110,000 x g por 16 horas para eliminar las microvesiculas bovinas). El medio condicionado a partir de 40 millones de celulas se recogio despues de 48 horas. Las microvesiculas se purificaron mediante centrifugacion diferencial. Especificamente, el medio condicionado de glioblastoma se centrifugo por 10 min a 300 x g para eliminar cualquier contaminacion celular. Los sobrenadantes se centrifugaron mas aun por 20 min a 16,500 x g y se filtraron a traves de un filtro de 0.22 Im. Despues las microvesiculas se sedimentaron mediante ultracentrifugacion a 110,000 x g por 70 min. Los sedimentos de microvesiculas se lavaron en 13 ml de PBS, se sedimentaron de nuevo y se resuspendieron en PBS.

Las microvesiculas aisladas se midieron para su contenido total de proteina usando el ensayo DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, Estados Unidos).

Para la extraccion del ARN de las microvesiculas, se anadio Ribonucleasa A (Fermentas, Glen Burnie, MD, Estados Unidos) a una concentracion final de 100 Ig/ml a las suspensiones de microvesiculas y se incubo por 15 min a 37'C para deshacerse del ARN fuera de las microvesiculas y asi asegurarse de que el ARN extraido vendria del interior de las microvesiculas. Despues el ARN total se extrajo de las microvesiculas usando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion, Austin TX, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Despues del tratamiento con DNasa de acuerdo con el protocolo del fabricante, el ARN total se cuantifico usando un instrumento de nanogotas ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, Estados Unidos).

Se encontro que las microvesiculas de glioblastoma contienen ARN y proteina en una relacion de aproximadamente 1:80 (Ig ARN:Ig proteina). El rendimiento promedio de las proteinas y los ARNs aislados de las microvesiculas en un periodo de 48 horas en cultivo fue de alrededor de 4 Ig de proteina y 50 ng de ARN/millon de celulas.

Para confirmar que el ARN estaba contenido dentro de las microvesiculas, las microvesiculas se expusieron a Ribonucleasa A o a tratamiento simulado antes de la extraccion del ARN (FIG.1c). Nunca hubo mas de una disminucion del 7% en el contenido de ARN despues del tratamiento con Ribonucleasa. Asi, parece que casi todo el ARN extracelular del medio esta contenido dentro de las microvesiculas y de ese modo esta protegido de las Ribonucleasas externas por la membrana vesicular circundante.

El ARN total de las microvesiculas y de sus celulas del donante se analizo con un Bioanalizador, mostrando que las microvesiculas contienen una extensa variedad de tamanos de ARN consistente con una diversidad de ARNs mensajeros y miARNs, pero carecen de los picos de ARN ribosomal 18S y 28S caracteristicos del ARN celular (FIGS. 1d y 1e).

Ejemplo 3: Las microvesiculas contienen ADN.

Para probar si las microvesiculas ademas contienen ADN, se aislaron los exosomas como se menciona en el Ejemplo 2 y despues se trataron con DNasa antes de ser lisados para liberar los contenidos. La etapa de tratamiento con DNasa fue para eliminar el ADN fuera de los exosomas para que solo se extrajera el ADN que reside dentro de los exosomas. Especificamente, se realizo el tratamiento con DNasa usando el kit libre de ADN de Ambion de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Catalogo # AM 1906). Para la etapa de purificacion del ADN, se liso una alicuota de los exosomas aislados en 300Il de amortiguador de lisis que era parte del kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion) y los ADNs se purificaron a partir de la mezcla lisada usando un kit de purificacion de ADN (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Para examinar si el ADN extraido contiene genes comunes, se realizaron PCRs usando pares de iniciadores especificos para GAPDH, retrovirus K endogeno humano, Tenascina c y LINE-1.Para el gen GAPDH, se usaron los siguientes iniciadores: Forw3GAPDHnew (sec. con num. de ident.: 1) y Rev3GAPDHnew (sec. con num. de ident.: 2). El par de iniciadores amplifica un amplicon de 112bp si la plantilla es un ADNc de GAPDH empalmado y una amplicon de 216bp si la

plantilla es un ADN genomico de GAPDH sin empalmar. En un experimento, los exosomas aislados se trataron con DNasa antes de ser lisados para la extraccion del ADN (FIG. 3a). Los fragmentos de 112bp se amplificaron como se esperaba a partir de los exosomas del suero tumoral Ver Carril 4 en la FIG. 3a) y las celulas tumorales primarias (Ver Carril 6 en la FIG. 3a) pero no de los exosomas de fibroblastos humanos normales (Ver Carril 5 en la FIG. 3a). El fragmento de 216bp no pudo amplificarse a partir de los exosomas de los tres origenes. Sin embargo, se amplificaron ambos fragmentos de 112bp y 216bp cuando se uso como plantilla el ADN genomico aislado de celulas de glioblastoma (Ver Carril 3 en la FIG. 3a). Asi, el ADN de GAPDH empalmado existe dentro de los exosomas aislados de las celulas tumorales pero no dentro de los exosomas aislados de las celulas de fibroblastos normales.

En cambio, en otro experimento, los exosomas aislados no se trataron con DNasa antes de ser lisados para la extraccion del ADN (FIG.3b). No solo los fragmentos de 112bp sino ademas los fragmentos de 216bp se amplificaron a partir de los exosomas aislados de celulas de melanoma primario (Ver Carril 3 en la FIG. 3b), lo que sugiere que fuera de los exosomas existe ADN de GAPDH no empalmado o ADNc parcialmente empalmado que se ha transcrito de manera inversa.

Para el gen de retrovirus K endogeno humano (HERV-K), se usaron los siguientes iniciadores: HERVKL6Forw (sec. con num. de ident.: 3) y HERVKL6Rev (sec. con num. de ident.: 4). El par iniciador amplifica un amplicon de 172bp . Se extrajo el ADN de los exosomas que se aislaron y se trataron con DNasa, y se uso como plantilla para la amplificacion por PCR. Como se muestra en la FIG. 3c, se amplificaron fragmentos de 172bp en todos los exosomas tumorales y del suero humano normal pero no en los exosomas de los fibroblastos humanos normales. Estos datos sugieren que a diferencia de los exosomas de los fibroblastos humanos normales, los exosomas tumorales y del suero humano normal contienen secuencias de ADN de retrovirus endogenos. Para examinar si los exosomas tumorales contienen ademas elementos de transposicion, se usaron los siguientes iniciadores especificos de LINE-1 para las amplificaciones por PCR: Line1LForw (sec. con num. de ident.: 5) y LinelLRev (sec. con num. de ident.: 6). Estos dos iniciadores estan disenados para detectar LINE-1 en todas las especies puesto que cada iniciador contiene cantidades iguales de dos oligos diferentes. Para el iniciador LinelLForw, un oligo contiene una C y el otro oligo contiene una G en la posicion designada con quot;squot;. Para el iniciador Line1LRev, un oligo contiene una A y el otro oligo contiene una G en la posicion designada con quot;rquot;. El par iniciador amplifica un amplicon de 290bp. La plantilla fue el ADN extraido de los exosomas que se trataron con DNasa (como se describio anteriormente). Como se muestra en la FIG. 3e, pudieron amplificarse fragmentos LINE-1 de 290bp a partir de los exosomas de celulas tumorales y suero humano normal pero no de los exosomas de los fibroblastos humanos normales.

Para probar si los exosomas ademas contienen ADN de Tenascina-C, se uso el siguiente par de iniciadores para realizar la PCR: Tenascin C Forw (sec. con num. de ident.: 7) y Tenascin C Rev (sec. con num. de ident.: 8). El par de iniciadores amplifica un amplicon de 197bp. La plantilla fue el ADN extraido de los exosomas que se aislaron y que despues se trataron con DNasa antes de la lisis. Como se muestra en la FIG. 3d, se amplificaron fragmentos de tenascina C de 197bp en exosomas de celulas tumorales o suero humano normal pero no en exosomas de fibroblastos humanos normales. Asi, el ADN de Tenascina C existe en los exosomas tumorales y del suero humano normal pero no en los exosomas de fibroblastos humanos normales.

Para confirmar mas aun la presencia de ADN en los exosomas, se extrajo el ADN exosomal de celulas de meduloblastoma D425 usando el metodo descrito anteriormente. Especificamente, los exosomas se aislaron y se trataron con DNasa antes de la lisis. Volumenes iguales del extracto final de ADN se trataron ya sea con DNasa o no se trataron con DNasa antes de ser visualizados mediante tincion con bromuro de etidio en gel de agarosa al 1%. El bromuro de etidio es un colorante que tine especificamente los acidos nucleicos y puede visualizarse bajo la luz ultravioleta. Como se muestra en la FIG. 3f, la tincion con bromuro de etidio desaparecio despues del tratamiento con DNasa Ver Carril 3 en la FIG. 3f) mientras que pudo visualizarse la tincion fuerte en la alicuota sin tratar Ver Carril 2 en la FIG. 3f). Los extractos tratados y no tratados con DNasa se analizaron ademas en un chip pico de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la FIG. 3g, el ADN monocatenario pudo detectarse facilmente en el extracto no tratado con DNasa (Ver panel superior en la FIG. 3g) pero apenas pudo detectarse en el extracto tratado con DNasa (Ver panel inferior en la FIG. 3g).

Para probar si el ADN extraido era monocatenario, los acidos nucleicos se extrajeron de los exosomas tratados como se describe en el parrafo anterior y se trataron mas aun con RNAsa para eliminar cualquier contaminacion con ARN. Los acidos nucleicos tratados se analizaron despues en un chip pico de Bioanalizador de ARN y en un chip de ADN 1000. El chip pico de ARN detecta solamente acidos nucleicos monocatenarios. El chip de ADN 1000 detecta acidos nucleicos bicatenarios. Como se muestra en la FIG. 3h, los acidos nucleicos monocatenarios se detectaron Ver panel superior) pero los acidos nucleicos bicatenarios no se detectaron Ver panel inferior). Asi, los ADN contenidos dentro de los exosomas del tumor son principalmente monocatenarios.

Para demostrar que existe ADN monocatenario en las celulas tumorales pero no en los fibroblastos humanos normales, los acidos nucleicos se extrajeron de los exosomas ya sean del suero de un paciente con glioblastoma o de fibroblastos humanos normales. Los exosomas se trataron con DNasa antes de la lisis y los acidos nucleicos purificados se trataron con

RNasa antes del analisis. Como se muestra en la FIG. 3i, los acidos nucleicos exosomales extraidos del suero del paciente con glioblastoma puede detectarse mediante un chip pico de ARN. En contraste, solamente muy poca cantidad de ADN monocatenario se extrajo de los fibroblastos humanos normales.

En consecuencia, se encontro que los exosomas de celulas tumorales y de suero humano normal contienen ADN monocatenario. El ADN monocatenario es un producto de la transcripcion inversa puesto que los productos de amplificacion no contienen intrones (FIG. 3a y FIG. 3b). Se sabe que las celulas tumorales asi como tambien las celulas progenitoras normales/celulas madre tienen actividad de la transcriptasa inversa (RT) activa aunque la actividad en las celulas progenitoras normales/celulas madre es relativamente mucho menor. Esta actividad de la RT hace que sea posible que los transcritos de ARN en la celula puedan transcribirse de manera inversa y empaquetarse en los exosomas como ADNc. Curiosamente, los exosomas de celulas tumorales contienen mas ADNs complementarios correspondientes a transcritos de genes especificos de tumor puesto que las celulas tumorales tienen por lo general la actividad de la transcriptasa inversa regulada positivamente. Por lo tanto, los ADNc especificos de tumor en los exosomas pueden usarse como biomarcadores para el diagnostico o el pronostico de diferentes tipos de tumores. El uso de ADNs complementarios como biomarcadores podria omitir la etapa de transcripcion inversa en comparacion con el uso de ARNm como biomarcadores para tumores. Adicionalmente, el uso de ADNc exosomal es ventajoso sobre el uso del ADN completo en suero/plasma porque el suero/plasma contiene ADN genomico liberado a partir de las celulas que mueren. Cuando se pruebe el ADN completo en suero/plasma amplificado, habra mas fondo.

Ejemplo 4: La mayoria del ARN extracelular en suero humano esta contenido dentro de los exosomas.

Para determinar la cantidad de ARN que circula en el suero como quot;ARN librequot;/complejo ARN-proteina contra la cantidad de ARN contenido dentro de los exosomas, aislamos el suero de un sujeto humano sano, y dividimos igualmente el suero en dos muestras con igual volumen. Para la muestra 1, el suero se ultracentrifugo para eliminar la mayoria de las microvesiculas. Despues el sobrenadante del suero se recogio y el ARN que quedo en el sobrenadante se extrajo usando Trizol LS. Para la muestra 2, el suero no se ultracentrifugo y el ARN total se extrajo del suero usando Trizol LS. Se midio la cantidad de ARN en el sobrenadante de la muestra 1 y el suero de la muestra 2. Como resultado, se encontro que la cantidad de ARN libre en el sobrenadante de la muestra 1 fue de menos del 10% de la cantidad de ARN total aislado del suero de la muestra 2. Por lo tanto, la mayoria del ARN en el suero esta asociado con los exosomas.

Ejemplo 5: La alta eficiencia de la extraccion del acido nucleico extracelular en suero se logra mediante la incorporacion de una etapa de aislamiento de exosomas en suero.

El suero y el plasma completos contienen grandes cantidades de ADN circulante y posiblemente ademas de ARN protegido en complejos de proteinas, mientras que el ARN libre tiene una vida media de unos pocos minutos en el suero. Los perfiles de acido nucleico extracelular en el suero varian entre los mamiferos normales y enfermos y asi pueden ser biomarcadores para ciertas enfermedades. Para examinar los perfiles, se necesita extraer los acidos nucleicos. Sin embargo, la extraccion directa de los acidos nucleicos de suero y plasma no es practica, especialmente a partir de grandes volumenes de suero/plasma. En este caso, se usan grandes volumenes de Trizol LS (un reactivo de extraccion de ARN) para inactivar instantaneamente todas las nucleasas del suero antes de la extraccion de los acidos nucleicos exosomales. Subsecuentemente, los contaminantes precipitan en la muestra y afectan a los analisis subsecuentes. Como se muestra en el Ejemplo 4, la mayoria de los ARNs extracelulares en suero estan contenidos en los exosomas del suero. Por lo tanto, hemos probado si es mas eficiente aislar los acidos nucleicos extracelulares mediante el aislamiento de los exosomas del suero antes de la extraccion del acido nucleico.

Se dividieron cuatro mililitros (ml) de suero de la sangre de un paciente en 2 alicuotas de 2 ml cada una. Los exosomas del suero de una alicuota se aislaron antes de la extraccion del ARN. Los metodos de aislamiento de exosomas y extraccion del ARN son los mismos mencionados en el Ejemplo 2. Para la otra alicuota, se extrajo el ARN directamente usando Trizol LS de acuerdo con la recomendacion del fabricante. Los acidos nucleicos de estas dos extracciones se analizaron en un chip de Bioanalizador de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la Figura 4, la cantidad de ARN extraido con el primer metodo es significativamente mayor que la obtenida a partir del ultimo metodo. Ademas, la calidad del ARN extraido con el ultimo metodo es relativamente pobre en comparacion con la del primer metodo. Asi, la etapa de aislamiento de los exosomas contribuye a la eficiencia de la extraccion del ARN extracelular del suero.

Ejemplo 6: Analisis de microarreglo de ARNm.

El analisis de microarreglo de la poblacion de ARNm en las celulas de glioblastoma y las microvesiculas derivadas de ellas se realizo por Miltenyi Biotech (Auburn, CA, Estados Unidos) usando el arreglo de dos colores, Microarreglo del Genoma Humano Completo de Agilent, 4x44K. El analisis de microarreglo se realizo en dos preparaciones diferentes de ARN de celulas de glioblastoma primario y sus preparaciones correspondientes de ARN de microvesiculas preparadas como se

describe en los Ejemplos 1 y 2. Los datos se analizaron usando el programa informatico GeneSifter (Vizxlabs, Seattle, WA, Estados Unidos). El programa informatico Intersector (Vizxlabs) se uso para extraer los genes detectados facilmente en ambos arreglos. Los datos de microarreglo se han depositado en el Gene Expression Omnibus del NCBI y son accesibles a traves del numero de acceso GSE13470 de las series GEO.

Encontramos aproximadamente 22,000 transcritos de genes en las celulas y 27,000 transcritos de genes en las microvesiculas que se detectaron muy por encima de los niveles de fondo (intervalo de confianza 99%) en ambos arreglos. Aproximadamente 4,700 ARNs mensajeros diferentes se detectaron exclusivamente en microvesiculas en ambos arreglos, lo que indica un proceso de enriquecimiento selectivo dentro de las microvesiculas. Consistente con esto, hubo una correlacion general pobre en los niveles de ARNs mensajeros en las microvesiculas en comparacion con sus celulas de origen de dos preparaciones de celulas tumorales (FIGS. 2a y 2b). En contraste, hubo una buena correlacion de los niveles de ARNm de un cultivo de celulas (A) contra el segundo cultivo de celulas (B) (FIG. 2c) y una correlacion similar de los niveles de ARNm de las microvesiculas correspondientes (A) y (B) (FIG. 2d). En consecuencia, existe una consistencia de la distribucion del ARNm dentro de las celulas tumorales y las microvesiculas. En la comparacion de la relacion de los transcritos en las microvesiculas contra sus celulas de origen, encontramos 3,426 transcritos distribuidos diferencialmente mas de 5 veces (valor de p lt;0.01). De estos, 2,238 transcritos estaban enriquecidos (hasta 380 veces) y 1,188 transcritos fueron menos abundantes (hasta 90 veces) que en las celulas (FIG. 5). Se documentaron las intensidades y las relaciones de todos los transcritos de genes. Las ontologias de los transcritos de ARNm enriquecidos o reducidos mas de 10 veces se registraron y se revisaron.

Los transcritos de ARNm que estaban altamente enriquecidos en las microvesiculas no siempre eran los que estaban mas abundantes en las microvesiculas. Los transcritos mas abundantes serian mas propensos a generar un efecto en la celula receptora tras la entrega, y por lo tanto los 500 transcritos de ARNm mas abundantes presentes en las microvesiculas se dividieron en diferentes procesos biologicos basados en sus descripciones de la ontologia (FIG. 6a). De las varias ontologias, la angiogenesis, la proliferacion celular, la respuesta inmune, la migracion celular y la modificacion de histonas se seleccionaron para el estudio adicional ya que representan funciones especificas que podrian estar involucradas en la remodelacion del estroma tumoral y el incremento del crecimiento del tumor. Los ARNs mensajeros de las microvesiculas de glioblastoma pertenecientes a estas cinco ontologias se graficaron para comparar sus niveles y su contribucion al espectro de ARNm (FIG. 6b). Todas los cinco ontologias contenian ARNs mensajeros con niveles de expresion muy altos en comparacion con el nivel de intensidad media de la senal del arreglo.

Un analisis exhaustivo de los ARNs mensajeros que estan enriquecidos en las microvesiculas contra las celulas del donante, sugiere que puede haber un mecanismo celular para la ubicacion de estos mensajes en las microvesiculas, posiblemente a traves de un quot;codigo postalquot; en la 3'UTR como se describe para los ARNs mensajeros traducidos en ubicaciones celulares especificas, tal como aquel para la beta actina (Kislauskis y otros, 1994). Las configuraciones moleculares de los ARNs mensajeros en las microvesiculas no se conoce, pero pueden estar presentes como particulas ribonucleares (RNPs) (Mallardo y otros, 2003) lo que despues prevendra la degradacion y la traduccion prematuras en la celula del donante.

El analisis de microarreglo de las poblaciones de ARNm en celulas de glioblastoma y microvesiculas derivadas de celulas de glioblastoma, celulas de melanoma, y microvesiculas derivadas de celulas de melanoma se realizo por Illumina Inc (San Diego, CA, Estados Unidos) usando el ensayo Apareamiento, Seleccion, Extension, y Ligacion mediados por ADNc de Genoma Completo (DASL). El ensayo DASL del Genoma Completo combina las etapas de PCR y marcaje del ensayo DASL de Illumina con la hibridacion basada en los genes y el conjunto de sondas del genoma completo del HumanRef-8 BeadChip de Illumina. Este BeadChip cubre mas de 24,000 genes anotados derivados de RefSeq (Construccion 36.2, Liberacion 22). El analisis de microarreglo se realizo en dos preparaciones diferentes de ARN de celulas de glioblastoma primario, microvesiculas de celulas de glioblastomas (derivadas con el metodo descrito en los Ejemplos 1 y 2), celulas de melanoma, y microvesiculas de celulas de melanoma (derivadas con el metodo descrito en los Ejemplos I y 2).

Los datos de expresion para cada preparacion de ARN se agruparon juntos y se usaron para generar un diagrama de grupos. Como se muestra en la FIG. 7, los perfiles de expresion del ARNm de celulas de glioblastoma, microvesiculas de celulas glioblastomas, celulas de melanoma, y microvesiculas de celulas de melanoma se agruparon juntas, respectivamente. Los perfiles de expresion de las dos lineas celulares de glioblastoma primario 20/3C y 11/5c se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.06. Los perfiles de expresion de las dos lineas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.09. Los perfiles de expresion de exosomas de las dos lineas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.15. Los perfiles de expresion de exosomas de las dos lineas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.098. Asi, los exosomas de glioblastoma y melanoma tienen firmas distintivas de expresion del ARNm y la firma de la expresion genica de los exosomas se diferencia de la de sus celulas originales. Estos

datos demuestran que los perfiles de expresion del ARNm de las microvesiculas pueden usarse en los metodos descritos en la presente invencion para el diagnostico y el pronostico de los canceres.

Ejemplo 7: Las microvesiculas de glioblastoma contienen miARN.

El miARN maduro de las microvesiculas y de las celulas del donante se detecto usando una PCR cuantitativa de transcripcion inversa de miARN. Especificamente, el ARN total se aislo de las microvesiculas y de las celulas del donante usando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). Usando los kits TaqMan® MicroRNA Assay (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos), 30 ng de ARN total se convirtieron en ADNc usando iniciadores especificos para miR y se amplificaron despues de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Un subconjunto de 11 miARNs entre aquellos conocidos por estar regulados positivamente y abundantes en los gliomas se analizo en las microvesiculas purificadas de dos glioblastomas primarios diferentes (GBM1 y GBM 2).Estos subconjuntos contenian let-7a, miR-15b, miR-16, miR-19b, miR-21, miR-26a, miR-27a, miR-92, miR-93, miR-320 y miR-20. Todos estos miARN se detectaron facilmente en las celulas del donante y en las microvesiculas (FIG. 8). Los niveles fueron generalmente mas bajos en las microvesiculas por Ig de ARN total que en las celulas parentales (10%, que corresponde a aproximadamente 3 valores de Ct), pero los niveles se correlacionaron bien, lo que indica que estas 11 especies de miARN no estan enriquecidas en las microvesiculas.

El analisis de microarreglo de las poblaciones de microARN en celulas de glioblastoma y microvesiculas derivadas de celulas de glioblastoma, celulas de melanoma, y microvesiculas derivadas de celulas de melanoma se realizo por Illumina Inc (San Diego, CA, Estados Unidos) usando el Panel de Perfiles de Expresion de MicroARN, potenciado por el ensayo DASL. Los paneles de microARN humanos incluyen 1146 especies de microARN. El analisis de microarreglo se realizo en dos preparaciones diferentes de ARN de celulas de glioblastoma primario, microvesiculas de celulas de glioblastomas (derivadas usando el metodo descrito en los Ejemplos 1 y 2), celulas de melanoma, y microvesiculas de celulas de melanoma (derivadas usando el metodo descrito en los Ejemplos 1 y 2).

Los datos de expresion para cada preparacion de ARN se agruparon juntos y se usaron para generar un diagrama de grupos. Como se muestra en la FIG. 9, los perfiles de expresion de microARN de celulas de glioblastoma, microvesiculas de celulas de glioblastomas, celulas de melanoma, y microvesiculas de celulas de melanoma se agruparon juntos, respectivamente. Los perfiles de expresion de las dos lineas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.13. Los perfiles de expresion de las dos lineas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon con una distancia de aproximadamente 0.12. Los perfiles de expresion de los exosomas de las dos lineas celulares de glioblastomas primarios 20/3C y 11/5c se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.12. Los perfiles de expresion de los exosomas de las dos lineas celulares de melanoma primario 0105C y 0664C se agruparon juntos con una distancia de alrededor de 0.17. Asi, los exosomas de glioblastoma y melanoma tienen firmas distintivas de expresion de microARN y la firma de la expresion genica de los exosomas se diferencia de la de sus celulas originales. Ademas, como se demuestra en la presente invencion, los perfiles de expresion de microARN de microvesiculas pueden usarse en los metodos descritos en la presente invencion para el diagnostico y el pronostico de los canceres.

El hallazgo de miARNs en las microvesiculas sugiere que las microvesiculas derivadas del tumor pueden modificar las celulas normales circundantes al cambiar sus perfiles transcripcionales/traduccionales. Ademas, como se demuestra en la presente invencion, el perfil de expresion de los miARN de las microvesiculas pueden usarse en los metodos descritos en la presente invencion para el diagnostico y el pronostico de los canceres, que incluyen pero sin limitarse al glioblastoma.

Ejemplos 8-15. Estos ejemplos muestran que los acidos nucleicos dentro de los exosomas de los fluidos corporales pueden usarse como biomarcadores para enfermedades u otras afecciones medicas.

Ejemplo 8: Los perfiles de expresion de miARNs en las microvesiculas pueden usarse como biomarcadores sensibles para el glioblastoma.

Para determinar si los microARNs dentro de los exosomas pueden usarse como biomarcadores de una enfermedad y/o afeccion medica, examinamos la existencia de una correlacion entre el nivel de expresion de microARN y el estado de la enfermedad. Puesto que el microARN-21 se expresa en altos niveles en celulas de glioblastoma y es facilmente detectable en los exosomas aislados del suero de pacientes con glioblastoma, medimos cuantitativamente los numeros de copias del microARN-21 dentro de los exosomas de los sueros de pacientes con glioblastoma mediante RT-PCR cuantitativa. Especificamente, los exosomas se aislaron de muestras de suero de 4 ml de 9 sujetos humanos normales y 9 pacientes con glioblastoma. El procedimiento de extraccion del ARN fue similar al procedimiento de extraccion del ARN descrito en el

Ejemplo 2. El nivel de miR-21 se analizo usando qPCR uniplex (Applied Biosystems) y se normalizo al nivel de expresion de GAPDH.

Como se muestra en la FIG. 10, el valor promedio del Ct fue 5.98 mas bajo en la muestra de suero de glioblastoma, lo que sugiere que los niveles de expresion de miARN-21 exosomal en pacientes con glioblastoma es aproximadamente 63 veces mas alto que en un sujeto humano normal. La diferencia es estadisticamente significativa con un valor p de 0.01. Por lo tanto, existe una correlacion entre el nivel de expresion del microARN-21 y el estado de la enfermedad de glioblastoma, que demuestra la validez y la aplicabilidad de los metodos de diagnostico no invasivos descritos en la presente invencion. Por ejemplo, en un aspecto, el metodo comprende las etapas de aislamiento de los exosomas del fluido corporal de un sujeto y el analisis de los niveles de expresion del microARN-21 dentro de los exosomas mediante la medicion del numero de copias de microARN-21 y comparando el numero con aquel dentro de los exosomas de un sujeto normal o con un numero estandar generado mediante el analisis de los contenidos del micro-ARN-21 dentro de los exosomas de un grupo de sujetos normales. Un numero de copias aumentado indica la existencia de glioblastoma en el sujeto; mientras que la ausencia de un numero de copias aumentado indica la ausencia de glioblastoma en el sujeto. Este metodo basico puede extrapolarse para diagnosticar/monitorear otras enfermedades y/o afecciones medicas asociadas con otras especies de microARNs.

Ejemplo 9: Los ARNs mensajeros en las microvesiculas pueden usarse como biomarcadores sensibles para el diagnostico

Los acidos nucleicos son de alto valor como biomarcadores debido a su capacidad de ser detectados con alta sensibilidad mediante metodos de PCR. En consecuencia, se disenaron y llevaron a cabo las siguientes pruebas para determinar si los ARNs mensajeros en las microvesiculas podrian usarse como biomarcadores para una enfermedad o afeccion medica, en este caso los tumores de glioblastoma. El ARNm del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) se selecciono debido a que la expresion de la mutacion EGFRvIII es especifica de algunos tumores y define un subtipo clinicamente distinto de glioma (Pelloski y otros, 2007). Adicionalmente, las mutaciones EGFRvIII no pueden detectarse tradicionalmente usando tejidos que no sean los tejidos de la lesion puesto que estas mutaciones son mutaciones somaticas pero no mutaciones de la linea germinal. Por lo tanto, una biopsia de los tejidos de la lesion tal como un tumor de glioma se requiere convencionalmente para la deteccion de mutaciones EGFRvIII. Como se detalla mas abajo, se uso la RT-PCR anidada para identificar el ARNm de EGFRvIII en muestras de biopsia de tumor de glioma y los resultados se compararon con las especies de ARNm que se encuentran en microvesiculas purificadas de una muestra de suero del mismo paciente.

Las microvesiculas se purificaron a partir de celulas de glioblastoma humano primario seguido de la extraccion del ARN de las microvesiculas y las celulas del donante (biopsia). Las muestras se codificaron y las PCRs se realizaron de una manera a ciegas. Se incluyo como un control positivo Gli-36EGFRvIII (celulas de glioma humano que expresan EGFRvIII de forma estable). Las microvesiculas de muestras de 0.5 a 2 ml de suero congelado se sedimentaron como se describe en el Ejemplo 2 y el ARN se extrajo usando el kit MirVana de aislamiento del ARN de microvesiculas. Despues se uso la RT-PCR anidada para amplificar tanto el EGFR silvestre (1153 bp) como los transcritos EGFRvIII (352 bp) de las microvesiculas y las celulas del donante usando el mismo conjunto de iniciadores. Especificamente, el ARN se convirtio en ADNc usando el kit Omniscript RT (Qiagen Inc, Valencia, CA, Estados Unidos) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. Los iniciadores GAPDH fueron GAPDH Directo (sec. con num. de ident.: 9) y GAPDH Reverso (sec. con num. de ident.: 10). Los iniciadores EGFR/EGFRvIII PCR1 fueron sec. con num. de ident.: 11 y sec. con num. de ident.: 12. Los iniciadores EGFR/EGFRvIII PCR2 fueron sec. con num. de ident.: 13 y sec. con num. de ident.: 14. El protocolo de ciclos de PCR fue 94 'C por 3 minutos; 94 'C por 45 segundos, 60 'C p or 45 seconds, 72 'C por 2 minutos por 35 ciclos; y una etapa final a 72 'C por 7 minutos.

Analizamos la muestra de biopsia para determinar si el ARNm de EGFRvIII estaba presente y el resultado se comparo con el ARN extraido de exosomas purificados a partir de una muestra de suero congelado del mismo paciente. Catorce de las 30 muestras de tumores (47%) contenian el transcrito EGFRvIII, lo que es consistente con el porcentaje de glioblastomas que se han encontrado que contienen esta mutacion en otros estudios (Nishikawa y otros, 2004). El EGFRvIII pudo amplificarse a partir de exosomas en siete de los 25 pacientes (28%) de los que se extrajo el suero alrededor del momento de la cirugia (FIG. 11 y Tabla 1). Cuando un nuevo par de iniciadores de EGFR/EGFRvIII PCR3: sec. con num. de ident.: 15 y sec. con num. de ident.: 16, se usaron como el segundo par de iniciadores para la amplificacion por PCR anidada anterior, se encontraron mas individuos que albergan mutaciones EGFRvIII (Tabla 1). El EGFRvIII pudo amplificarse a partir de exosomas en los seis pacientes que se identificaron como negativos con el viejo par de iniciadores EGFRvIII PCR2: sec. con num. de ident.: 13 y sec. con num. de ident.: 14. Notablemente, los exosomas del individuo 13, cuya biopsia no mostro mutacion EGFRvIII, mostraron que contiene la mutacion EGFRvIII, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad de deteccion de la mutacion EGFRvIII usando la tecnologia de exosomas. El EGFRvIII no pudo ser amplificado a partir de los exosomas aislados de 52 muestras de suero control normales (FIG. 12). Curiosamente, dos pacientes con una muestra de tumor negativa a EGFRvIII resultaron ser positivos a EGFRvIII en los exosomas del suero, apoyando focos heterogeneos de expresion de EGFRvIII en el tumor de glioma. Ademas, nuestros datos mostraron ademas que los ARN intactos en las microvesiculas fueron, de manera inesperada, capaces de aislarse del suero corporal congelado de los pacientes con

glioblastoma. Estas muestras de suero a ciegas de pacientes confirmados con glioblastoma se obtuvieron del Centro de Investigacion del Cancer (centro medico VU, Amsterdam, Paises Bajos) y se mantuvieron a -80DC hasta su uso. La identificacion de los ARNs especificos de tumores en microvesiculas del suero permite la deteccion de mutaciones somaticas que estan presentes en las celulas tumorales. Tal tecnologia debera resultar en mejores diagnosticos y decisiones terapeuticas.

El ARN que se encuentra en las microvesiculas contiene una quot;instantaneaquot; de un arreglo sustancial del perfil de expresion genica celular en un momento dado. Entre el ARNm que se encuentra en microvesiculas derivadas de glioblastoma, el ARNm de EGFR es de especial interes puesto que la variante de empalme de EGFRvIII se asocia especificamente con glioblastomas (Nishikawa y otros, 2004). Aqui se demuestra que los tumores cerebrales liberan microvesiculas al torrente sanguineo a traves de la barrera hematoencefalica (BBB), lo que no se ha mostrado antes. Se demuestra ademas que las variantes de ARNm, tales como EGFRvIII en los tumores cerebrales, son capaces de detectarse mediante un metodo que comprende las etapas de aislamiento de los exosomas a partir de una pequena cantidad de suero del paciente y analisis del ARN en dicha microvesiculas.

El conocimiento de la mutacion EGFRvIII en los tumores es importante en la eleccion de un regimen de tratamiento optimo. Los gliomas positivos a EGFRvIII son mas de 50 veces mas propensos a responder al tratamiento con inhibidores de EGFR como erlotinib o gefitinib (Mellinghoff y otros, 2005).

Ejemplo 10: Diagnostico de los trastornos del metabolismo del hierro

El metodo de diagnostico de exosoma puede adaptarse para otros fines como se muestra en el siguiente ejemplo.

La hepcidina, un peptido antimicrobiano, es el regulador hormonal principal del metabolismo del hierro. Este peptido se produce principalmente en el higado de los mamiferos y se controla por la actividad eritropoyetica de la medula osea, la cantidad de hierro corporal circulante y almacenado, y la inflamacion. Tras la estimulacion, la hepcidina se secreta a la circulacion o a la orina donde puede actuar sobre las celulas diana que expresan ferroportina. La ferroportina es el unico exportador de hierro identificado hasta la fecha y cuando se une a la hepcidina, se internaliza y se degrada. La destruccion resultante de la ferroportina conduce a la retencion de hierro en las celulas que expresan ferroportina tales como macrofagos y enterocitos. Este mecanismo fisiopatologico subyace en la anemia de las enfermedades cronicas. Mas especificamente, los niveles inadecuadamente altos de hepcidina y el contenido de hierro elevado dentro del sistema reticuloendotelial caracterizan a la anemia. Claramente, la anemia puede estar asociada con muchas enfermedades y/o afecciones medicas tales como las infecciones (agudas y cronicas), el cancer, la autoinmunidad, el rechazo cronico tras el trasplante de organos solidos, y la enfermedad renal cronica y la inflamacion (Weiss y Goodnough, 2005). Por otro lado, en una enfermedad genetica de sobrecarga de hierro tal como la hemocromatosis hereditaria, los niveles de expresion de hepcidina inadecuadamente bajos fomentan un eflujo excesivo de hierro potencialmente fatal desde dentro del sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, la hepcidina esta regulada positivamente en la anemia asociada con la enfermedad cronica, pero esta regulada negativamente en la hemocromatosis.

Actualmente, no hay ningun ensayo apropiado para medir cuantitativamente los niveles de hepcidina en la circulacion o en la orina (Kemna y otros, 2008) excepto la espectrometria de masas de tiempo de vuelo (TOF MS), que necesita un equipo altamente especializado, y por lo tanto no es facilmente accesible. Recientemente, se ha propuesto el metodo de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para medir cuantitativamente niveles de la hormona hepcidina pero este metodo no es consistente debido a la carencia de correlaciones claras con la hepcidina (Kemna y otros, 2005, Kemna y otros, 2007) y otros parametros relacionados con el hierro (Brookes y otros, 2005, Roe y otros, 2007).

El ARN de hepcidina se detecto en exosomas de suero humano, de la siguiente manera. Los exosomas se aislaron primero del suero humano y sus contenidos de ARNm se extrajeron antes de la conversion a ADNc y la amplificacion por PCR. Los iniciadores de PCR se disenaron para amplificar un fragmento de 129 nucleotidos de hepcidina humana. Las secuencias de los iniciadores son sec. con num. de ident.: 57 y sec. con num. de ident.: 58. Se detecto facilmente mediante Bioanalizador un transcrito de hepcidina de 129 nucleotidos (el pico medio en la FIG. 13D). Como un control positivo (FIG. 13B), se extrajo el ARN de una linea celular de hepatoma humano Huh-7 y se convirtio en ADNc. El control negativo (FIG. 13C) es sin ARNm. Estos datos del Bioanalizador se muestran ademas en el pseudogel en la FIG. 13A.

El ARNm de hepcidina en las microvesiculas en la circulacion se correlaciona con el ARNm de hepcidina en las celulas hepaticas. Por lo tanto, la medicion del ARNm de hepcidina dentro de las microvesiculas en una muestra de fluido corporal permitiria diagnosticar o monitorear la anemia o la hemocromatosis en el sujeto.

Asi, es posible diagnosticar y/o monitorear la anemia y la hemocromatosis en un sujeto mediante el aislamiento de microvesiculas de un fluido corporal y la comparacion del ARNm de hepcidina en dichas microvesiculas con el ARNm de un

sujeto normal. Con un sujeto anemico, el numero de copias del ARNm aumenta por encima del nivel normal, sin anemia. En un sujeto que sufre de hemocromatosis, el numero de copias disminuye con relacion al ARNm en un sujeto normal.

Ejemplo 11: Perfil transcripcional no invasivo de los exosomas para el diagnostico de la nefropatia diabetica

La nefropatia diabetica (DN) es una complicacion que amenaza la vida que actualmente carece de tratamientos especificos. Asi, existe una necesidad de desarrollar herramientas de diagnostico sensibles para identificar a los pacientes que desarrollan o en riesgo de desarrollar DN, lo que permite la intervencion temprana y el monitoreo.

El analisis de orina proporciona una manera de examinar la funcion renal sin tener que tomar una biopsia. Hasta la fecha, este analisis se ha limitado al estudio de proteinas en la orina. Este Ejemplo expone un metodo para obtener de la orina perfiles transcripcionales derivados de las celulas que normalmente solo se podrian obtener mediante biopsia renal. Especificamente, el metodo comprende las etapas de aislamiento de los exosomas de la orina y el analisis de los ARNs dentro de dichos exosomas para obtener perfiles transcripcionales, que pueden usarse para examinar los cambios moleculares hechos por las celulas renales en individuos diabeticos y proporcionar una 'instantanea' de cualquier nueva proteina hecha por el rinon. Las tecnologias del estado del arte para la obtencion de perfiles de transcripcion exosomal incluyen, pero sin limitarse a, los arreglos de hibridacion contemporaneos, las tecnologias basadas en la PCR, y los metodos de secuenciacion de nueva generacion. Puesto que la secuenciacion directa no requiere de iniciadores predisenados u oligos situados de ADN, proporcionara una descripcion no sesgada de los perfiles de ARN exosomal. El analizador del genoma de Illumina proporciona un ejemplo de tecnologia de secuenciacion de nueva generacion, que usa la tecnologia de secuenciacion paralela de manera masiva que le permite secuenciar el equivalente de 1/3 de un genoma humano por corrida. Los datos que pueden obtenerse de este analisis permitiran examinar con rapidez y de manera exhaustiva el perfil transcripcional exosomal urinario y permitiran la comparacion del rinon completo. Con el uso de tal metodo, se podria obtener informacion muy necesaria con respecto al perfil de transcripcion de los exosomas urinarios. Una comparacion de los transcritos en el control contra los exosomas urinarios derivados de diabetes podria proporcionar ademas una lista exhaustiva de biomarcadores nuevos y predichos para la nefropatia diabetica.

Con el fin de probar la viabilidad del metodo de diagnostico descrito anteriormente, se diseno un experimento y se llevo a cabo para aislar los exosomas urinarios y para confirmar la presencia de biomarcadores renales especificos dentro de estos exosomas. En este experimento, se recogio una muestra de 220 ml de orina fresca de la manana de un sujeto macho sano de 28 anos de edad y se proceso a traves de centrifugacion diferencial para aislar los exosomas urinarios. Especificamente, la orina se centrifugo primero a 300 x g por 10 minutos para eliminar cualquier celula de la muestra. El sobrenadante se recogio y despues se sometio a una centrifugacion a 16,500 x g 20 minutos para bajar cualquier resto de celulas o agregados de proteinas. Despues el sobrenadante se paso a traves de un filtro de membrana de 0.22 uM para eliminar los restos con diametros mas grandes que 0.22 uM. Finalmente, la muestra se sometio a ultracentrifugacion a 100,000 x g por 1 hora para sedimentar los exosomas (Thery y otros, 2006). El sedimento se lavo suavemente en solucion salina regulada con fosfato (PBS) y se extrajo el ARN usando un kit RNeasy de Qiagen conforme a las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se convirtio a ADNc usando el kit Omniscript RT (Qiagen) seguido de la amplificacion por PCR de genes renales especificos.

Los genes renales especificos examinados y su area renal correspondiente en donde se expresa el gen son las siguientes: AQP1-tubulos proximales; AQP2 -tubulo distal (celulas principales); CUBN -tubulos proximales; LRP2 -tubulos proximales; AVPR2 -tubulos proximales y distales; SLC9A3 (NHE-3) -tubulo proximal; ATP6V1B1 -tubulo distal (celulas intercaladas); NPHS1 -glomerulo (celulas podocitos); NPHS2 -glomerulo (celulas podocitos) y CLCN3-celulas intercaladas Tipo B de los conductos colectores.Las secuencias de los iniciadores designados para amplificar cada gen son AQP1-F (sec. con num. de ident.: 17) y AQP1-R (sec. con num. de ident.: 18); AQP2-F (sec. con num. de ident.: 19) y AQP2-R (sec. con num. de ident.: 20); CUBN-F (sec. con num. de ident.: 21) y CUBN-R (sec. con num. de ident.: 22); LRP2-F (SEQ y ID NO: 23) y LRP2-R (sec. con num. de ident.: 24); AVPR2-F (sec. con num. de ident.: 25) y AVPR2-R (sec. con num. de ident.: 26); SLC9A3-F (sec. con num. de ident.: 27) y SLC9A3-R (sec. con num. de ident.: 28); ATP6V1B1-F (sec. con num. de ident.: 29) y ATP6V1B1-R (sec. con num. de ident.: 30); NPHS1-F (sec. con num. de ident.: 31) y NPHS1-R (sec. con num. de ident.: 32); NPHS2-F (sec. con num. de ident.: 33) y NPHS2-R (sec. con num. de ident.: 34); CLCN5-F (sec. con num. de ident.: 35) y CLCN5-R (sec. con num. de ident.: 36).

Los tamanos esperados de los productos de PCR para cada gen son AQP1-226bp, AQP2-208bp, CUBN-285bp, LRP2220bp, AVPR2-290bp, SLC9A3-200bp, ATP6V1B1-226bp, NPHS1-201bp, NPHS2-266bp y CLCN5-204bp. El protocolo de ciclos de PCR fue 95 'C por 8 minutos; 95 'C por 30 segundos, 60 'C por 30 segundos, 72 'C por 45 segu ndos por 30 ciclos; 30 ciclos; y una etapa final a 72 'C por 10 minutos.

Como se muestra en la FIG. 14a, las celulas tubulares renales contienen cuerpos multivesiculares, que son una etapa intermedia durante la generacion de los exosomas. Los exosomas aislados de estas celulas pueden identificarse mediante

microscopia electronica (FIG. 14b). El analisis del ARN total extraido de los exosomas urinarios indica la presencia de especies de ARN con una extensa variedad de tamanos (FIG. 14c). No se encontraron ARNs ribosomales 18S y 28S. El analisis por PCR confirmo la presencia de transcritos renales especificos dentro de los exosomas urinarios (FIG. 14d). Estos datos muestran que las celulas renales desprenden exosomas en la orina y estos exosomas urinarios contienen transcritos de origen renal, y que el metodo de exosoma puede detectar biomarcadores renales asociados con ciertas enfermedades renales y/u otras afecciones medicas.

Para confirmar mas aun la presencia de transcritos de ARN renales especificos en exosomas urinarios, se realizo un conjunto independiente de experimentos usando muestras de orina de seis individuos. Los acidos nucleicos exosomales se extrajeron de muestras de 200ml de orina de la manana de cada individuo siguiendo un procedimiento como se menciono anteriormente. Especificamente, las muestras de orina se sometieron a centrifugacion diferencial partiendo de una centrifugacion a 1000 x g para centrifugar las celulas completas y los restos celulares. El sobrenadante se elimino cuidadosamente y se centrifugo a 16,500 x g por 20 minutos. Despues se elimino el siguiente sobrenadante y se filtro a traves de un filtro de 0.8Im para eliminar los restos residuales del sobrenadante que contenia a los exosomas. Despues el sobrenadante final se sometio a ultracentrifugacion a 100,000 x g por 1 hora y 10 minutos. El sedimento se lavo en PBS libre de nucleasa y se volvio a centrifugar a 100,000 x g por 1 hora y 10 minutos para obtener el sedimento de exosomas que esta listo para la extraccion del acido nucleico. Los acidos nucleicos se extrajeron de los exosomas sedimentados usando el kit de aislamiento de ARN PicoPure de Arcturus y la concentracion y la integridad del acido nucleico se analizaron usando un chip pico de Bioanalizador (Agilent). Como se muestra en la FIG. 14e, los acidos nucleicos aislados de los exosomas urinarios varian de individuo a individuo. Para probar si la presencia de biomarcadores renales ademas varia de individuo a individuo, se llevaron a cabo amplificaciones de PCR para los genes de Acuaporina1, Acuaporina2 y cubilina usando un nuevo conjunto de pares de iniciadores: nuevo par de iniciadores para AQP1: sec. con num. de ident.: 37 y sec. con num. de ident.: 38; nuevo par de iniciadores para AQP2: sec. con num. de ident.: 39 y sec. con num. de ident.: 40; nuevo par de iniciadores para CUBN: sec. con num. de ident.: 41 y sec. con num. de ident.: 42 Estos pares de iniciadores se disenaron especificamente para amplificar los fragmentos de ADNc empalmados y transcritos de manera inversa. La transcripcion inversa se realizo usando el kit Sensiscript de Qiagen. Como se muestra en la FIG. 14f, no se observo amplificacion en el individuo 1, probablemente debido a la extraccion fallida de acido nucleico. AQP1 se amplifico solamente en el individuo 2. CUBN se amplifico en el individuo 2 y 3. Y AQP2 se amplifico en el individuo 2, 3, 4 y 5. En comparacion el gen de actina (indicado por quot;Casaquot; en la FIG. 14f) se amplifico en los individuos 2, 3, 4, 5 y 6. Estos datos proporcionan mas evidencia de que los exosomas urinarios contienen transcritos de ARNm renales especificos aunque los niveles de expresion son diferentes entre individuos diferentes.

Para probar la presencia de ADNs complementarios en los exosomas urinarios, una muestra de 200 ml de orina humana se dividio en dos muestras de orina de 100 ml. Los exosomas urinarios se aislaron de cada muestra. Los exosomas de una muestra se trataron con DNasa y los de la otra muestra se trataron de forma simulada. Despues los exosomas de cada muestra se lisaron para la extraccion del acido nucleico usando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Acturus). Los acidos nucleicos se usaron como plantillas para la amplificacion por PCR anidada (protocolos de PCR descritos en el Ejemplo 9) sin transcripcion inversa previa. Los pares de iniciadores para amplificar el gen de actina fueron Actin-FOR (sec. con num. de ident.: 43) y Actin-REV (sec. con num. de ident.: 44); Actin-nest-FOR (sec. con num. de ident.: 45) y Actin-nest-REV (sec. con num. de ident.: 46) con un amplicon final esperado de 100bp basado en la secuencia del ADNc del gen de actina. Como se muestra en la FIG. 14g, los fragmentos de 100bp estaban presentes en el control positivo (ADNc de rinon humano como plantillas), los exosomas tratados con DNasa y los no tratados, pero ausentes en el carril del control negativo (sin plantillas). En consecuencia, el ADNc de actina esta presente tanto en los exosomas urinarios tratados con DNasa como en los no tratados.

Para probar si la mayoria de los acidos nucleicos extraidos usando el metodo estaban presentes dentro de los exosomas, los acidos nucleicos extraidos de los exosomas tratados con DNasa y los no tratados se disolvieron en volumenes iguales y se analizaron usando un chip pico de ARN (Agilent Technologies). Como se muestra en la FIG. 14h, la concentracion de los acidos nucleicos aislados de la muestra tratada con DNasa fue de 1,131 pg/ul y la de la muestra no tratada fue 1,378 pg/ul. Asi, mas del 80% de los acidos nucleicos extraidos de los exosomas urinarios usando el metodo anterior eran del interior de los exosomas.

Para identificar sistematicamente el contenido de los exosomas urinarios, los acidos nucleicos se extrajeron de los exosomas urinarios y se entregaron al Broad Institute para la secuenciacion. Se generaron aproximadamente 14 millones de lecturas de secuencia, cada 76 nucleotidos de longitud. Estas lecturas de secuencia corresponden a fragmentos de transcritos de ADN/ARN presentes dentro de los exosomas urinarios. Con el uso de un parametro de alineacion extremadamente estricto (100% de identidad sobre la longitud total de la secuencia), aproximadamente 15% de las lecturas se alinearon al genoma humano. Este porcentaje podria aumentar si se usaran criterios de alineacion menos estrictos. La mayoria de este 15% de lecturas no se alineo con genes que codifican proteinas sino mas bien con elementos genomicos no codificantes tales como transposones y varios elementos de repeticion LINE & SINE. Notablemente, para aquellas

lecturas que no estan alineadas al genoma humano, muchas estan alineadas a secuencias virales. En la medida en que las composiciones y los niveles de acidos nucleicos contenidos en los exosomas urinarios cambian con respecto a un estado de la enfermedad, los perfiles de los acidos nucleicos podrian usarse de acuerdo con los metodos presentes como biomarcadores para el diagnostico de la enfermedad.

Este ejemplo demuestra que el metodo de exosoma de analizar exosomas de la orina puede usarse para determinar los cambios celulares en el rinon en la enfermedad renal relacionada con la diabetes sin tener que tomar una biopsia renal invasiva, de alto riesgo. El metodo proporciona una herramienta de diagnostico nueva y sensible usando exosomas para la deteccion temprana de las enfermedades renales tal como la nefropatia diabetica. Esto permitira la intervencion y el tratamiento inmediatos. En resumen, el metodo de diagnostico de exosoma y la tecnologia descrita en la presente proporciona un medio de diagnostico muy necesario para la nefropatia diabetica y otras enfermedades que se asocian con determinados perfiles de acidos nucleicos contenidos en los exosomas urinarios.

Ejemplo 12: Diagnostico de cancer de prostata y exosomas urinarios

El cancer de prostata es el cancer mas comun en los hombres actualmente. El riesgo del cancer de prostata es aproximadamente 16%. Mas de 218,000 hombres en los Estados Unidos fueron diagnosticados en el 2008. Mientras mas temprano se detecte el cancer de prostata, mayores son las posibilidades de un tratamiento exitoso. De acuerdo con la Sociedad Americana del Cancer, si se encuentran los canceres de prostata mientras que todavia estan en la prostata en si o en zonas cercanas, la tasa de supervivencia relativa a cinco anos estara sobre el 98%.

Un metodo de diagnostico establecido se lleva a cabo mediante la medicion del nivel de antigeno prostatico especifico (PSA) en la sangre, en combinacion con un examen rectal digital. Sin embargo, tanto la sensibilidad como la especificidad de la prueba de PSA requieren de una mejora significativa. Esta baja especificidad resulta en un alto numero de falsos positivos, que generan numerosas biopsias innecesarias y costosas. Otros metodos de diagnostico se llevan a cabo mediante la deteccion de los perfiles geneticos de biomarcadores identificados recientemente que incluyen, pero sin limitarse a, gen del cancer de prostata 3 (PCA3) (Groskopf y otros, 2006; Nakanishi y otros, 2008), un gen de fusion entre la proteasa transmembranal de serina 2 y el gen relacionado con ETS (TMPRSS2-ERG) (Tomlins y otros, 2005), glutation Stransferasa pi (Goessl y otros, 2000; Gonzalgo y otros, 2004), y alfa-metilacil CoA racemasa (AMACR) (Zehentner y otros, 2006; Zielie y otros, 2004) en celulas de cancer de prostata encontradas en fluidos corporales tales como suero y orina (Groskopf y otros, 2006; Wright y Lange, 2007) Aunque estos biomarcadores pueden dar una especificidad aumentada debido a la sobreexpresion en celulas de cancer de prostata (por ejemplo, la expresion de PCA3 se aumenta 60 a 100 veces en las celulas de cancer de prostata), se requiere un examen rectal digital para ordenar celulas de la prostata en la orina justo antes de la recogida del especimen (Nakanishi y otros, 2008). Tales examenes rectales tienen desventajas inherentes tales como el sesgo en la recogida de las celulas cancerosas que son facilmente ordenadas en la orina y la participacion de los medicos que es costosa y consume mucho tiempo.

Aqui, se propone un nuevo metodo de deteccion de los perfiles geneticos de estos biomarcadores para superar la limitacion mencionada anteriormente. El metodo comprende las etapas de aislamiento de los exosomas de un fluido corporal y el analisis del acido nucleico de dichos exosomas. Los procedimientos del metodo son similares a los detallados en el Ejemplo

9. En este ejemplo, las muestras de orina fueron de cuatro pacientes diagnosticados con cancer de prostata. Como se muestra en la FIG. 15c, las etapas del cancer se caracterizaron en terminos de grado, etapa Gleason y niveles de PSA. Adicionalmente, los acidos nucleicos analizados por RT-PCR anidada como se detalla en el Ejemplo 7 fueron TMPRSS2-ERG y de PCA3, dos de los biomarcadores de cancer de prostata identificados recientemente. Para la amplificacion de TMPRSS2-ERG, el par de iniciadores para la primera etapa de amplificacion fue TMPRSS2-ERG F1 (sec. con num. de ident.: 47) y TMPRSS2-ERG R1 (sec. con num. de ident.: 48); y el par de iniciadores para la segunda etapa de amplificacion fue TMPRSS2-ERG F2 (sec. con num. de ident.: 49) y TMPRSS2-ERG R2 (sec. con num. de ident.: 50). El amplicon esperado es de 122 pares de bases (bp) y da dos fragmentos (uno es de 68 bp, el otro es de 54 bp) despues de la digestion con la enzima de restriccion HaeII. Para la amplificacion de PCA3, el par de iniciadores para la primera etapa de amplificacion fue PCA3 F1 (sec. con num. de ident.: 51) y PCA3 R1 (sec. con num. de ident.: 52); y el par de iniciadores para la segunda etapa de amplificacion fue PCA3 F2 (sec. con num. de ident.: 53) y PCA3 R2 (sec. con num. de ident.: 54) El amplicon esperado es de 152 bp de longitud y da dos fragmentos (uno es de 90 bp, el otro es de 62 bp) despues de la digestion con la enzima de restriccion Sca1.

Como se muestra en la FIG. 15a, tanto en el paciente 1 como el 2, pero no en los pacientes 3 y 4, el amplicon esperado de TMPRSS2-ERG pudo detectarse y digerirse en dos fragmentos de tamanos esperados. Como se muestra en la FIG. 15b, en los cuatro pacientes, el amplicon esperado de PCA3 pudo detectarse y digerirse en dos fragmentos de tamanos esperados. Por lo tanto, la expresion de PCA3 pudo detectarse en las muestras de orina de los cuatro pacientes, mientras que la expresion de TMPRSS2-ERG solo pudo detectarse en las muestras de orina de los pacientes 1 y 2 (FIG. 15c). Estos datos, aunque no son concluyentes debido al pequeno tamano de la muestra, demuestran la aplicabilidad del nuevo metodo en la

deteccion de biomarcadores de cancer de prostata. Mas aun, el metodo de exosoma no se limita al diagnostico sino que puede emplearse para el pronostico y/o el monitoreo de otras afecciones medicas relacionadas con el cancer de prostata.

Ejemplo 13: Las microvesiculas en el diagnostico prenatal no invasivo

El diagnostico prenatal es ahora parte de la practica obstetrica establecida en todo el mundo. Los metodos convencionales de obtencion de tejidos fetales para el analisis genetico incluyen la amniocentesis y el muestreo de vellosidades corionicas, los que son invasivos y confieren riesgo para el feto no nato. Existe una necesidad largamente sentida en genetica clinica de desarrollar metodos de diagnostico no invasivo. Un enfoque que se ha investigado extensivamente se basa en el descubrimiento de celulas fetales circulantes en el plasma materno. Sin embargo, hay una serie de barreras que impide su aplicacion en el ambito clinico. Tales barreras incluyen la escasez de celulas fetales (solo 1.2 celulas/ml de sangre materna), que requiere muestras de sangre de volumenes relativamente grandes, y la larga vida media de las celulas fetales residuales del embarazo anterior, lo que puede causar falsos positivos. Otro enfoque se basa en el descubrimiento de ADN fetal en el plasma materno. Las cantidades suficientes de ADN fetal y el tiempo de eliminacion corto superaran las barreras asociadas con el metodo de celulas fetales. Sin embargo, el ADN solo confiere informacion genetica hereditaria y algo de epigenetica, las cuales no pueden representar a los perfiles dinamicos de expresion genica que estan vinculados a las afecciones medicas fetales. El descubrimiento del ARN fetal circulante en el plasma materno (Ng y otros, 2003b; Wong y otros, 2005) puede ser el metodo de eleccion para el diagnostico prenatal no invasivo.

Varios estudios sugieren que los ARNs fetales son de alto valor diagnostico. Por ejemplo, la expresion elevada del transcrito de la hormona liberadora de corticotropina (CRH) fetal esta asociada con preeclampsia (una afeccion clinica que se manifiesta por hipertension, edema y proteinuria) durante el embarazo (Ng y otros, 2003a). Adicionalmente, el ARNm de placenta especifico-4 (PLAC4) en el plasma materno se uso con exito en una prueba no invasiva para el embarazo aneuploide (tal como la trisomia 21, sindrome de Down) (Lo y otros, 2007). Ademas, el transcrito de la gonadotropina corionica humana (hCG) fetal en el plasma materno puede ser un marcador de enfermedades trofoblasticas de la gestacion (GTDs), que son un crecimiento tumoral de los tejidos fetales en un huesped materno. Los ARNs fetales circulantes son principalmente de origen placentario (Ng y otros, 2003b). Estos ARNs fetales pueden detectarse tan temprano como en la cuarta semana de gestacion y tal ARN se elimina rapidamente despues del parto.

El diagnostico prenatal usando ARNs fetales circulantes en el plasma materno, sin embargo, tiene varias limitaciones. La primera limitacion es que el ARN fetal circulante se mezcla con el ARN materno circulante y no se separa de manera efectiva. Actualmente, los transcritos fetales se identifican, basado en una suposicion, como aquellos que se detectan en las mujeres embarazadas antes del parto asi como tambien en la sangre del cordon de su bebe, sin embargo estan reducidos significativamente o ausentes en la sangre materna dentro de 24 o 36 horas despues del parto (Maron y otros, 2007). La segunda limitacion es que no se establece un metodo para enriquecer el ARN fetal circulante para incrementar la sensibilidad del diagnostico, puesto que aun se desconoce como se empaqueta y se libera el ARN fetal. La manera de superar estas limitaciones puede estar en el aislamiento de las microvesiculas y el analisis de los ARNs fetales en ellas.

Varios hechos sugieren que las microvesiculas, que se desprenden de las celulas eucariotas, son los vehiculos de los ARNs fetales circulantes en el plasma materno. Primero, los ARNs circulantes dentro de las microvesiculas estan protegidos de la degradacion por Ribonucleasa. Segundo, se ha demostrado que los ARNs fetales circulantes permanecen en la fraccion no celular del plasma materno, lo que es consistente con la nocion de que las microvesiculas que abarcan estos ARNs fetales son capaces de filtrarse a traves de una membrana de 0.22 um. Tercero, de forma similar a los tejidos tumorales que se conoce que desprenden microvesiculas, las celulas de la placenta, que son un tejido fetal pseudomaligno, son capaces con mas probabilidad de desprender microvesiculas. Asi, un nuevo metodo de diagnostico prenatal no invasivo se compone de aislar microvesiculas fetales de plasma de sangre materna y despues analizar los acidos nucleicos dentro de las microvesiculas para cualquiera de las variantes geneticas asociadas con ciertas enfermedades y/u otras afecciones medicas.

Un caso hipotetico de diagnostico prenatal no invasivo es el siguiente: se recogen muestras de sangre periferica de las mujeres embarazadas y se someten a la separacion magnetica de celulas activadas (MACS) u otra purificacion por afinidad para aislar y enriquecer las microvesiculas especificas del feto. El sedimento microvesicular se resuspende en PBS y se usa inmediatamente o se almacena a -20'C para su procesamiento adicional. El ARN se extrae de las microvesiculas aisladas usando el kit de extraccion de ARN de Qiagen segun las instrucciones del fabricante. El contenido de ARN se analiza para el nivel de expresion del transcrito de gonadotropina corionica humana (hCG) fetal. Un nivel de expresion de hCG aumentado en comparacion con el intervalo estandar apunta al desarrollo de las enfermedades trofoblasticas gestacionales (GTDs) e implica ademas la necesidad del tratamiento clinico para este crecimiento anormal en el feto. La sensibilidad de la tecnologia de microvesiculas hace que sea posible detectar las GTDs en una etapa muy temprana antes de que cualquier manifestacion sintomatica o cambios estructurales se hagan detectables bajo examen ultrasonico. El intervalo estandar de

los niveles del transcrito de hCG puede determinarse mediante el examen de un numero estadisticamente significativo de muestras de ARN fetal circulante de embarazos normales.

Este metodo de diagnostico prenatal puede extrapolarse al diagnostico prenatal y/o monitoreo de otras enfermedades o afecciones medicas mediante el examen de esos transcritos asociados con estas enfermedades o afecciones medicas. Por ejemplo, la extraccion y el analisis del acido nucleico de la cinasa del linfoma anaplasico (ALK) de microvesiculas de origen fetal a partir de la sangre materna es un diagnostico prenatal no invasivo de neuroblastoma, que esta estrechamente asociado con mutaciones en el dominio cinasa o la expresion elevada de ALK (Mosse y otros, 2008). En consecuencia, los metodos de microvesiculas y la tecnologia descritos en la presente invencion pueden conducir a una nueva era del tan necesario, diagnostico genetico prenatal no invasivo.

Ejemplo 14: Diagnostico del melanoma

El melanoma en un tumor maligno de los melanocitos (celulas de pigmento) y se encuentra predominantemente en la piel. Es una forma grave de cancer de piel y es responsable del 75 por ciento de todas las muertes asociadas al cancer de piel. Las mutaciones de la activacion somatica (por ejemplo V600E) de BRAF son las anomalias geneticas mas comunes y tempranas detectadas en la genesis del melanoma humano. El BRAF activado promueve la progresion del ciclo celular y/o la supervivencia del melanoma.

Actualmente, el diagnostico de melanoma se hace sobre la base de un examen fisico y la biopsia por escision. Sin embargo, una biopsia puede muestrear solo un numero limitado de focos dentro de la lesion y puede dar falsos positivos o falsos negativos. El metodo de exosoma proporciona un medio mas preciso para el diagnostico de melanoma. Como se discutio anteriormente, el metodo se comprende de las etapas de aislamiento de los exosomas de un fluido corporal de un sujeto y el analisis del acido nucleico de dichos exosomas.

Para determinar si los exosomas desprendidos por las celulas de melanoma contienen ARNm de BRAF, cultivamos celulas de melanoma primario en medio DMEM suplementado con FBS reducido en exosomas y se recogieron los exosomas en el medio usando un procedimiento similar al detallado en el Ejemplo 2. Las lineas de celulas primarias fueron Yumel y M34. Las celulas Yumel no tienen la mutacion V600E en BRAF, mientras que las celulas M34 tienen la mutacion V600E en BRAF. Los ARNs se extrajeron de los exosomas y despues se analizaron para la presencia de ARNm de BRAF mediante RT-PCR. Los iniciadores usados para la amplificacion por PCR fueron: BRAF directo (sec. con num. de ident.: 55) y BRAF reverso (sec. con num. de ident.: 56). El amplicon es de 118 pares de bases (bp) de longitud y cubre la parte de la secuencia del ADNc de BRAF donde se ubica la mutacion V600E. Como se muestra en la FIG. 16a, se detecto una banda de 118 bp en los exosomas de las celulas de melanoma primario (celulas Yumel y M34), pero no en los exosomas de celulas de fibroblastos humanos o controles negativos. La deteccion negativa de una banda de producto de PCR de 118 bp no se debe a una extraccion de ARN erronea puesto que los transcritos GAPDH pudieron detectarse en los exosomas tanto de celulas de melanoma como de celulas de fibroblastos humanos (FIG. 16b). Los productos de PCR de 118 bp se secuenciaron ademas para detectar la mutacion V600E. Como se muestra en las FIGS. 16c y 16d, los productos de PCR a partir de celulas YUMEL, como se esperaba, contienen el ARNm de BRAF silvestre. En contraste, los productos de PCR a partir de las celulas M34, como se esperaba, contienen ARNm de BRAF mutante con una mutacion puntual T-A, que hace que el aminoacido valina (V) se sustituya por acido glutamico (E) en la posicion del aminoacido 600 de la proteina BRAF. Ademas, el ARNm de BRAF no puede detectarse en los exosomas de las celulas de fibroblastos humanos normales, lo que sugiere que el ARNm de BRAF no esta contenido en los exosomas de todos los tejidos de origen.

Estos datos sugieren que las celulas del melanoma desprenden exosomas a la circulacion de la sangre y asi el melanoma puede diagnosticarse mediante el aislamiento de estos exosomas del suero de la sangre y el analisis del acido nucleico de los mismos para la presencia o ausencia de mutaciones (por ejemplo, V600E) en BRAF. El metodo descrito anteriormente puede emplearse ademas para diagnosticar los melanomas que se asocian con otras mutaciones de BRAF y las mutaciones en otros genes. El metodo puede emplearse ademas para diagnosticar los melanomas que se asocian con los perfiles de expresion de BRAF y otros acidos nucleicos.

Ejemplo 15: Deteccion de los niveles de MMP de exosomas para monitorear las afecciones posteriores al trasplante.

Los trasplantes de organos por lo general son tratamientos efectivos para insuficiencias de organos. La insuficiencia renal, las enfermedades del corazon, la enfermedad pulmonar en etapa terminal y la cirrosis del higado son todas afecciones que pueden tratarse de manera efectiva mediante un trasplante. Sin embargo, los rechazos de organos causados por complicaciones posteriores al trasplante son los principales obstaculos para la supervivencia a largo plazo de los receptores de aloinjertos. Por ejemplo, en los trasplantes de pulmon, el sindrome de bronquiolitis obliterante es una complicacion grave que afecta a las tasas de supervivencia. En los trasplantes renales, la nefropatia cronica del aloinjerto sigue siendo una de las principales causas de fallo del aloinjerto renal. Las lesiones por isquemia-reperfusion danan el corazon del donante

despues del trasplante de corazon, asi como tambien el higado del donante despues del trasplante hepatico ortotopico. Estas complicaciones posteriores al trasplante pueden mejorarse una vez que se detecta en etapas tempranas. Por lo tanto, es esencial monitorear las afecciones posteriores al trasplante con el fin de aliviar las complicaciones adversas.

Las alteraciones en la matriz extracelular contribuyen a la remodelacion intersticial en las complicaciones posteriores al trasplante. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) estan involucradas tanto en el recambio como en la degradacion de las proteinas de la matriz extracelular (ECM). Las MMPs son una familia de enzimas proteoliticas, dependientes de zinc, con 27 miembros descritos hasta la fecha, que muestran estructuras multidominio y especificidades de sustrato, y funcionan en el procesamiento, la activacion, o desactivacion de una diversidad de factores solubles. Los niveles de MMP en suero pueden indicar el estado de las afecciones posteriores al trasplante. Claramente, la MMP-2 circulante esta asociada con la cistatina C, la duracion posterior al trasplante, y la diabetes mellitus en receptores de trasplante renal (Chang y otros, 2008). La expresion desproporcionada de MMP-9 esta vinculada al desarrollo del sindrome de bronquiolitis obliterante despues del trasplante de pulmon (Hubner y otros, 2005).

Los ARNs mensajeros de MMP (MMP1, 8, 12, 15, 20, 21, 24, 26 y 27) pueden detectarse en los exosomas desprendidos por celulas de glioblastoma como se muestra en el Ejemplo 4 y la Tabla 10.El presente metodo de exosoma, el aislamiento de exosomas de un fluido corporal y el analisis de los acidos nucleicos de dichos exosomas, puede usarse para monitorear las afecciones de trasplante. El procedimiento de aislamiento de exosomas es similar al que se detalla en el Ejemplo 2. Los presentes procedimientos para analizar el acido nucleico contenido dentro de los exosomas se detallan en el Ejemplo 9. Un aumento significativo en el nivel de expresion de MMP-2 despues del trasplante renal indicara la aparicion y/o el deterioro de complicaciones posteriores al trasplante. De manera similar, un nivel significativamente elevado de MMP-9 despues del trasplante de pulmon, sugiere la aparicion y/o el deterioro del sindrome de bronquiolitis obliterante.

Por lo tanto, el metodo de exosoma puede usarse para monitorear las afecciones posteriores al trasplante mediante la determinacion de los niveles de expresion de las proteinas MMP asociadas con complicaciones posteriores al trasplante. Ademas se espera que el metodo pueda extrapolarse para monitorear las afecciones posteriores al trasplante mediante la determinacion de la expresion de otros genes marcadores asi como tambien monitorear otras afecciones medicas mediante la determinacion del perfil genetico de los acidos nucleicos asociados con estas afecciones medicas.

Ejemplos 16-18. Las microvesiculas pueden ser agentes terapeuticos o vehiculos de entrega de agentes terapeuticos.

Ejemplo 16: Las proteinas de la microvesicula inducen angiogenesis in vitro.

Se diseno y se llevo a cabo un estudio para demostrar que las microvesiculas de glioblastoma contribuyen a la angiogenesis. HBMVECs (30,000 celulas), una linea de celulas endoteliales del cerebro, (Cell Systems, Catalogo # ACBRI376, Kirkland, WA, Estados Unidos) se cultivaron en pocillos recubiertos con Matrigel en una placa de 24 pocillos en medio basal solo (EBM) (Lonza Biologics Inc., Portsmouth, NH, Estados Unidos), medio basal suplementado con microvesiculas de glioblastoma (EBM+ MV) (7 Ig/pocillo), o medio basal suplementado con un coctel de factores angiogenicos (EGM; hidrocortisona, EGF, FGF, VEGF, IGF, acido ascorbico, FBS, y heparina; Singlequots (control positivo EBM) La formacion de tubulos se midio despues de 16 horas y se analizo con el programa informatico Image J. Las HBMVECs cultivadas en la presencia de microvesiculas de glioblastoma demostraron una duplicacion de la longitud del tubulo dentro de 16 horas. El resultado fue comparable con el resultado obtenido con HBMCECs cultivadas en presencia de factores angiogenicos (FIG. 18a). Estos resultados muestran que las microvesiculas derivadas de glioblastoma juegan un papel en la iniciacion de la angiogenesis en las celulas endoteliales cerebrales.

Ademas, se analizaron los niveles de proteinas angiogenicas en las microvesiculas y se compararon con los niveles en las celulas de glioblastoma del donante. Usando un arreglo de anticuerpos de la angiogenesis humana, fuimos capaces de detectar 19 proteinas involucradas en la angiogenesis. Especificamente, las proteinas totales tanto de celulas de glioblastoma primario como de microvesiculas purificadas aisladas de dichas celulas se lisaron en amortiguador de lisis (Promega, Madison, WI, Estados Unidos) y se anadieron al arreglo de anticuerpos de la angiogenesis humana (Panomics, Fremont CA, Estados Unidos) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los arreglos se escanearon y se analizaron con el programa informatico Image J. Como se muestra en la FIG. 18b, de las siete de las 19 proteinas angiogenicas que se detectaron facilmente en las microvesiculas, 6 (angiogenina, IL-6, 1L-8, TIMP-I, VEGF y TIMP-2) estaban presentes en niveles mas altos sobre una base de proteina total en comparacion con las celulas de glioblastoma (FIG. 18c). Las tres proteinas angiogenicas mas enriquecidas en microvesiculas en comparacion con las celulas tumorales fueron angiogenina, IL-6 y 1L-8, las que han sido implicadas en la angiogenesis de glioma con niveles mas altos asociados con el aumento de la malignidad (25-27).

Ademas se encontro que las microvesiculas aisladas de celulas de glioblastoma primario promueven la proliferacion de una linea celular U87 de glioma humano. En estos estudios, se sembraron 100 000 celulas U87 en pocillos de una placa de 24 pocillos y se dejaron crecer por tres dias (DMEM-5%FBS) o DMEM-5%FBS suplementado con 125 Ig de microvesiculas aisladas de celulas de glioblastoma primario. Despues de tres dias, las celulas U87 no tratadas (FIG. 19a) se encontraron

5 en menor numero como se determino usando una camara de Burker, que las suplementadas con microvesiculas (FIG. 19b). Ambas celulas U87 no suplementadas y suplementadas se habian aumentado 5 y 8 veces en numero durante este periodo, respectivamente (FIG. 19c). Asi, las microvesiculas de glioblastoma parecen estimular la proliferacion de otras celulas de glioma.

10 Ejemplo 17: Las microvesiculas de glioblastoma son absorbidas por HBMVECs.

Para demostrar que las microvesiculas de glioblastoma son capaces de ser absorbidas por las celulas endoteliales microvesiculares del cerebro humano (HBMVEC), las microvesiculas de glioblastoma purificadas se marcaron con el kit de marcaje PKH67 fluorescente verde (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos). Las microvesiculas marcadas se

15 incubaron con HBMVEC en cultivo (5 Ig/50,000 celulas) por 20 min a 4'C. Las celulad se lavaron e incubaron a 37'C por 1 hora. En 30 minutos las microvesiculas marcadas con PKH67 se internalizaron en estructuras similares a endosomas dentro de las HBMVECs (FIG. 17a). Estos resultados muestran que las celulas endoteliales del cerebro pueden internalizar las microvesiculas de glioblastoma.

20 Se obtuvieron resultados similares cuando se anadieron microvesiculas marcadas con fluorescencia a las celulas de glioblastoma primario.

Ejemplo 18: Los ARNm entregados por las microvesiculas de glioblastoma pueden traducirse en las celulas receptoras.

25 Para determinar si el ARNm de las microvesiculas derivadas de glioblastoma podria entregarse a y expresarse en las celulas receptoras, se infectaron celulas de glioblastoma humano primario con un vector lentiviral de autoinactivacion que expresa la luciferasa Gaussia (Gluc) secretada usando un promotor de CMV a una eficiencia de infeccion de �95%. Las celulas se transdujeron de forma estable y generaron microvesiculas durante los pases subsecuentes (se analizaron 2-10 pases). Las microvesiculas se aislaron de las celulas y se purificaron como se describio anteriormente. El analisis de RT

30 PCR mostro que el ARNm para Gluc (555 bp) asi como tambien el de GAPDH (226 bp) estaban presentes en las microvesiculas (FIG. 17b). El nivel de ARNm de Gl�� fue aun mas alto que el de GAPDH como se evaluo con RT-PCR cuantitativa.

Se anadieron cincuenta microgramos de microvesiculas purificadas a 50,000 celulas HBMVE y se incubaron por 24 horas.

35 La actividad Gluc en el sobrenadante se midio directamente despues de la adicion de las microvesiculas (0 horas), y despues de 15 horas y 24 horas. La actividad Gluc en el sobrenadante se normalizo a la actividad de la proteina Gluc asociada con las microvesiculas. Los resultados se presentan como la media ± SEM (n=4). Especificamente, la actividad en las celulas receptoras HBMVE demostro una traduccion continua del ARNm de Gl�� microvesicular. Asi, el ARNm incorporado en las microvesiculas tumorales puede entregarse en las celulas receptoras y generar una proteina funcional.

Los analisis estadisticos en todos los ejemplos se realizaron usando la prueba t de Student.

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20

25

30

35

Sin numero de estudios (tipos de cancer) que tienen los datos de expresion disponibles en un gen de ensayo. Arriba # o abajo # numero de tipos de cancer cuya expresion del gen probado es regulado positivamente o negativamente. Todos estos genes son significativamente consistentemente regulados hacia arriba (Plt;10) en una gran mayoria de tipos de cancer. doi: 10.137/journal pone 0001149.001

Todos estos genes son significativamente consistentes regulados negativamente (P lt; 10-5) en una gran mayoria de tipos de cancer. doi:10.1371/journal.pone.0001149.t002

LISTADO DE SECUENCIA

lt;110� Massachussett General Hospital Skog, Johan

lt;120� USO DE MICROVES�CULAS EN EL DIAGNOSTICO, PRONOSTICO Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y AFECCIONES M�DICAS

lt;130� 3635

lt;160� 58

lt;170� PatentIn version 3.5

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lt;400� 41 cagctctcca tcctctggac 20

lt;210� 42 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 42 ccgtgcataa tcagcatgaa 20

lt;210� 43 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 43 aaactggaac ggtgaaggtg 20

lt;210� 44 lt;211� 18 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 44 ggcacgaagg ctcatcat 18

lt;210� 45 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 45 gaagtccctt gccatcctaa 20

lt;210� 46 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 46 gctatcacct cccctgtgtg 20

lt;210� 47 lt;211� 21 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 47 taggcgcgag ctaagcagga g 21

lt;210� 48 lt;211� 19 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores lt;400� 48 gggggttgag acagccatc 19

lt;210� 49 lt;211� 19 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 49 cgcgagctaa gcaggaggc 19

lt;210� 50 lt;211� 25 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 50 gtaggcacac tcaaacaacg actgg 25

lt;210� 51 lt;211� 16 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 51 agtccgctgt gagtct 16

lt;210� 52 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 52 ccacacatct gctgaaatgg 20

lt;210� 53 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 53 atcgacggca ctttctgagt 20

lt;210� 54 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 54 tgtgtggcct cagatggtaa 20

lt;210� 55 lt;211� 24 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 55 ttcatgaaga cctcacagta aaaa 24

lt;210� 56 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 56 tctggtgcca tccacaaaat 20

lt;210� 57 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 57 cgcagcagaa aatgcagatg 20

lt;210� 58 lt;211� 20 lt;212� ADN lt;213� Secuencia artificial

lt;220� lt;223� secuencia de ADN sintetica usada como iniciadores

lt;400� 58 cacaacagac gggacaactt 20

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para ayudar en el diagnostico del cancer de prostata en un sujeto, que comprende las etapas de:

   (a)

   aislar una fraccion de microvesicula de una muestra de orina de un sujeto humano; y

   (b)

   analizar el ARNm en la fraccion de microvesicula para la presencia de un gen especifico para un cancer de prostata, en donde el gen es PCA-3 y/o TMPRSS2-ERG, para indicar asi la presencia o ausencia de cancer de prostata en el sujeto.

   �.

   El metodo de la reivindicacion 1, en donde la etapa (a) se realiza por cromatografia de exclusion por tamano, centrifugacion con gradiente de densidad, centrifugacion diferencial, ultrafiltracion en nanomembrana, captura inmunoabsorbente, purificacion por afinidad, separacion microfluidica, o combinaciones de los mismos.

   �.

   El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la etapa (b) se realiza por analisis de microarreglo, PCR, hibridacion con sondas especificas de alelo, deteccion de mutaciones enzimaticas, reaccion en cadena de ligacion (LCR), ensayo de ligacion de oligonucleotidos (OLA), analisis de heteroduplos por citometria de flujo, clivaje quimico mal apareado, espectrometria de masa, secuenciacion de acido nucleico, polimorfismo de conformacion monocatenaria (SSCP), electroforesis de gel en gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis de gel en gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismos de fragmentos de restriccion, analisis en serie de la expresion genica (SAGE), o combinaciones de los mismos.

   �.

   El metodo de cualquier reivindicacion anterior, en donde la etapa de aislamiento incluye el filtrado.

2. 5.

   El metodo de la reivindicacion 4, en donde el filtrado es a traves de un filtro de a 0.8 micras.

3. 6.

   El metodo de la reivindicacion 4 o reivindicacion 5, en donde el filtrado es seguido por concentracion por ultrafiltracion.

4. 7.

   El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el filtrado es seguido por ultracentrifugacion.