KR20180056343A - 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스의 간단하고 고감도 분자 진단 방법 - Google Patents

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KR20180056343A
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이정훈
이도환
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광운대학교 산학협력단
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    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Abstract

본 실시예들은 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 지카 바이러스 유전자를 증폭하며, 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하고, dNTP에 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 지카 바이러스 유전자를 검출함으로써, 간단하면서도 고감도로 지카 바이러스를 진단할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스의 간단하고 고감도 분자 진단 방법 {Method for Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus Using Lateral Flow Assay Strip}
본 실시예가 속하는 기술 분야는 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스의 간단하고 고감도 분자 진단 방법에 관한 것이다.
이 부분에 기술된 내용은 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래기술을 구성하는 것은 아니다.
지카 바이러스(Zika virus)는 플라비 바이러스과 플라비 바이러스 속에 속하는 바이러스로, 숲모기에 의해 감염하는 RNA를 함유한 바이러스이다. 사람에서는 지카열로 알려진 가벼운 증상의 병을 일으키는데, 이 병은 1950년대 이후로 아프리카에서 아시아에 이르는 좁은 적도 대 안에서 발생하는 것으로 알려졌다. 증상은 가벼운 뎅기열과 같고, 휴식을 취해 치료하며, 약이나 백신으로 예방할 수 없다. 또한, 현재로서는 지카 열병이 바이러스에 감염된 산모에게서 난 신생아의 소두증과 관련된 피해가 발생하는 사례도 발생하고 있다.
한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단방법이나 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다. 최근에는 바이러스를 진단하기 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있으나, PCR을 이용한 진단방법은 특이적인 프라이머(Primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(Electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야 한다. 더불어 이러한 방법은 중합효소 연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문인력이 요구되며, 최종확인을 위한 증폭산물의 염기서열분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 또한 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 이와 같이 바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다(한국특허공개번호 제10-2010-0125766호).
등온증폭(Loop mediated isothermal amplification, LAMP) 방법은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(Exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)를 사용함으로써, 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
한국 공개 특허 제10-2010-0125766호 (2010.12.01 공개)
본 발명의 실시예들은 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 지카 바이러스 유전자를 증폭하며, 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하고, dNTP에 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 지카 바이러스 유전자를 검출함으로써, 간단하면서도 고감도로 지카 바이러스를 진단하는 데 발명의 주된 목적이 있다.
본 발명의 명시되지 않은 또 다른 목적들은 하기의 상세한 설명 및 그 효과로부터 용이하게 추론할 수 있는 범위 내에서 추가적으로 고려될 수 있다.
본 실시예의 일 측면에 의하면, 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법에 있어서, 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 상기 지카 바이러스 유전자를 증폭하는 단계, 상기 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하는 단계, 상기 dNTP에 제2 태그를 라벨링하는 단계, 및 상기 제1 태그 및 상기 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 상기 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 상기 지카 바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 지카 바이러스 진단 방법을 제공한다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 실시예들에 의하면, 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 지카 바이러스 유전자를 증폭하며, 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하고, dNTP에 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 지카 바이러스 유전자를 검출함으로써, 간단하면서도 고감도로 지카 바이러스를 진단할 수 있는 효과가 있다.
여기에서 명시적으로 언급되지 않은 효과라 하더라도, 본 발명의 기술적 특징에 의해 기대되는 이하의 명세서에서 기재된 효과 및 그 잠정적인 효과는 본 발명의 명세서에 기재된 것과 같이 취급된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법을 예시한 도면이다.
도 2는 지카 바이러스 유전자 구조를 예시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 프라이머를 예시한 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 프라이머에 관한 평가를 예시한 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 프라이머로 검출이 가능한 지카 바이러스들을 예시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 지카 바이러스 유전자에 제1 태그 및 제2 태그를 라벨링한 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법의 등온증폭 반응에서의 마그네슘 이온 농도를 예시한 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법의 등온증폭 반응에서의 dNTP 농도를 예시한 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 측방 유동 분석 스트립의 구조를 예시한 도면이다.
도 10는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 측방 유동 분석 스트립의 동작을 예시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 실시예들에 따라 수행된 실험결과를 도시한 것이다.
이하, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지기능에 대하여 이 분야의 기술자에게 자명한 사항으로서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략하고, 본 발명의 일부 실시예들을 예시적인 도면을 통해 상세하게 설명한다.
도 1에서는 디자인한 프라이머를 이용하여 특정 지카 바이러스 유전자를 증폭하고 이를 스트립으로 검출하는 일련의 과정이 도시되어 있다.
먼저, 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 여부를 판단하고자 하는 시료를 채취하여 추출한다.
추출한 시료를 미리 정해진 온도 구간에서 증폭하여, 표적 유전 물질 중 일 부분을 증폭시킨다. 이 때, 여기서, 표적 유전물질은 지카 바이러스(Zika Virus)로, 지카 RNA를 증폭하기 위하여 등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)방법을 이용한다.
측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법은 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 지카 바이러스 유전자를 증폭하는 단계를 포함한다. 지카 바이러스 유전자를 증폭하는 단계는 등온증폭(Loop mediated isothermal amplification, LAMP) 반응을 이용하여 증폭할 수 있다.
측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법은 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하는 단계 및 dNTP에 제2 태그를 라벨링하는 단계를 포함한다.
측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법은 제1 태그 및 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 지카 바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함한다.
이하에서는 지카 바이러스 유전자 및 디자인된 프라이머를 설명한다. 도 2는 지카 바이러스 유전자 구조를 예시한 도면이고, 도 3은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 프라이머를 예시한 것이다.
본 실시예들에 의하면, 지카 바이러스 RNA 시퀀스 중 껍데기 단백질 (Envelope Protein) 코딩 영역이 지카 바이러스 종 간의 동종성(Homogeneity)가 제일 높음과 동시에 다른 플라비 바이러스(Flavivirus)들과의 차이점이 가장 큰 영역 중에 하나에 해당하므로, 이를 타겟 유전자로 결정한다. 이 유전자를 이용하여 지카 바이러스에 매우 특정된(Highly Specific) LAMP 프라이머 시퀀스(Primer Sequence)를 디자인할 수 있다.
본 실시예들에 의하면, 껍데기 단백질(Envelope Protein) 코딩 영역을 타겟 유전자로 하여 디자인한 LAMP 프라이머 시퀀스에 대한 정보 프라이머들 중 루프 프라이머(Loop Primer)에 디곡시게닌(Digoxigenin)과 같은 표지 물질을 라벨링(Labeling)하여 증폭된 지카 바이러스 유전자가 스트립에서 검출이 가능하게 할 수 있다. 이후 디자인된 프라이머들의 특이성(Specificity)에 대해 평가하고, 적용가능한 지카 바이러스 스트레인(Strain)들을 정리할 수 있다.
도 4a 내지 도 4f는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 디자인된 프라이머에 관한 평가를 예시한 것이고, 도 5는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 프라이머로 검출이 가능한 지카 바이러스들을 예시한 도면이다. 도 4a 내지 도 4f를 참조하면, 디자인된 프라이머가 지카 바이러스에 매칭함을 쉽게 파악할 수 있다. 도 5를 참조하면, 디자인된 프라이머로 검출이 가능한 지카 바이러스 스트레인들이 나열되어 있다.
이하에서는 유전자를 증폭하는 과정을 설명한다. 본 발명에 따른 표적 유전 물질의 등온 증폭은 하기의 과정으로 수행될 수 있다.
우선, 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 판단하고자 하는 시료를 전처리한다. 본 실시예에서, 지카 바이러스의 시료는 안전성을 위하여 실제 지카 바이러스와 동일한 RNA를 지니나 감염성이 없는 Zeptometrix 사의 NATtrol™Zika Virus (strain: MR766 (Uganda))를 사용할 수 있다. 시료의 전처리 방법은 바이오니아 사의 Viral RNA Extraction Kit를 이용하여 통상적인 RNA 추출 과정을 진행한다.
다음으로, 전처리된 시료와 표적 유전물질에 반응하는 시약을 혼합한다. 일 실시예로, 표적 유전 물질에 결합하는 6개의 프라이머와 2.2mM의 dNTP, Bst 3.0 중합효소, 그리고 Isothermal Amplification Buffer II를 시약으로 사용한다.
다음으로, Zika Virus RNA를 추출하여 purified RNA를 얻고, 이중 2uL를 등온증폭에 필요한 시약(Reagent) 23uL와 섞은 뒤에 30분 동안 오븐에서 72℃로 반응시켜 특이적인 유전자를 증폭시킨다.
LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법은 대표적인 등온 유전자 증폭법으로, 표적 유전자에서 6개의 영역을 선택하여 조합한 4 내지 6개의 프라이머를 사용하여 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 방법이다.
프라이머의 설계에서 처음의 증폭산물의 프라이머 결합부위에 루프 구조를 생기게 한다. 루프부분은 한 가닥이므로, 다음의 프라이머가 결합(Annealing)가능하다. 사슬치환활성이 높은 특수한 DNA 합성효소(Bst Polymerase)는 진행방향에 있는 두 가닥 DNA를 해리시키면서, 스스로의 신장반응을 진행해간다. 최종적으로 원래의 표적서열의 정수 배의 길이의 증폭산물이 기 설정된 온도 및 기 설정된 시간의 반응에서 축적된다.
LAMP 방법은 아래와 같은 순서로 진행된다.
먼저, 표적 유전물질(DNA 또는 RNA)에 정방향 내/외부 프라이머가 붙는다. 프라이머는 표적에 상보적인 서열을 가지도록 디자인되어 있으므로 결합(Annealing)이 가능하다.
다음으로, 내부 프라이머에 의해 DNA 또는 RNA가 신장(Extension)되고 이와 동시에 외부 프라이머에 의해 신장되어 내부 프라이머에 의해 합성된 DNA 가락은 분리된다.
이렇게 분리된 DNA 가닥은 한쪽에 루프를 형성하게 된다. 루프가 형성되도록 프라이머가 디자인된다.
역방향 내/외부 프라이머가 이 가닥에 붙으며 상기 결합하고 신장하고 분리하는 과정을 거치게 됩니다.
다음으로, 좌우에 모두 루프를 가진 DNA 가닥이 형성된다.
상기 과정들을 반복적으로 수행하면서 DNA 또는 RNA가 끊임없이 증폭된다.
본 발명의 일 실시예에서 사용되는 외부 프라이머 세트는 올리고 DNA, 올리고 DNA 및 혼성 올리고 RNA/DNA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있고, 표적핵산 서열에 상보적(Complementary)이다.
등온증폭법은 기존의 PCR(Polymerase Chain Reaction)방법과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며, 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 이 때, 본 발명에서 이용하는 등온증폭은 프라이머 및 효소를 이용하여, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 온도는 바람직하게는 55℃ 내지 75℃가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 65℃ 내지 75℃가 바람직하며, 72℃인 것이 가장 바람직하다.
이하에서는 증폭된 유전자를 검출하기 위한 앰플리콘 수정(Modification) 과정을 설명한다. 도 6은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 지카 바이러스 유전자에 제1 태그 및 제2 태그를 라벨링한 것이다.
디자인된 프라이머는 정방향 내부 프라이머, 역방향 내부 프라이머, 정방향 루프 프라이머, 역방향 루프 프라이머, 정방향 외부 프라이머, 및 역방향 외부 프라이머에 해당하고, 정방향 루프 프라이머 및 역방향 루프 프라이머에 제1 태그를 각각 라벨링한다. 제1 태그는 디곡시게닌(Digoxigenin)일 수 있다. 루프 프라이머(Loop Primer)에 디곡시게닌(Digoxigenin)과 같은 제1 표지 물질을 달아주어 증폭된 유전자에 디곡시게닌이 라벨링되게 한다.
유전자 증폭시 필요한 dTNP(ATGC Sources)에 제2 태그를 라벨링한다. 제2 태그는 바이오틴(Biotin)일 수 있다. dNTP에 특정 비율의 Biotin-18-dUTP를 추가하여, 증폭된 유전자 사이사이에 바이오틴(Biotin)과 같은 제2 표지 물질이 라벨링(Labeling)한다. 즉, 증폭된 유전자는 제1 표지물질 및 제2 표지물질이 라벨링되어 있다.
이하에서는 등온증폭 반응에서 비 표적 증폭(Non-Target Amplification) 문제를 해결하기 위한 Mg2+의 농도 및 Biotin-dUTP가 결합된 dNTP의 농도를 설명한다. 도 7은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법의 등온증폭 반응에서의 마그네슘 이온 농도를 예시한 것이고, 도 8은 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법의 등온증폭 반응에서의 dNTP 농도를 예시한 것이다.
본 실시예들에 의하면, LAMP 방법으로 유전자의 등온 증폭 시 가장 큰 문제가 되는 non-target amplification을 해결하기 위한 Mg2+와 Biotin-dUTP mixed dNTPs (dNTP mix)의 농도를 조절하고 이를 최적화할 수 있다.
측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법은 등온증폭 반응에 마그네슘 이온을 기 설정된 농도로 첨가한다. 마그네슘 이온은 4 mM 농도로 첨가될 수 있다. 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법은 등온증폭 반응에 제2 태그가 라벨링된 dNTP를 기 설정된 농도로 첨가한다. 제2 태그가 라벨링된 dNTP는 2.2 mM 농도로 첨가될 수 있다.
본 실시예들에 의하면, Mg2+ 의 농도를 2mM에서 8mM까지 조절하여 최적화된 Mg2+ 농도를 확인할 수 있다. Mg2+ 농도가 4mM일 때, 가장 뚜렷하게 positive와 negative를 구별할 수 있었을 뿐만 아니라, negative 샘플에서 non-target amplification현상이 일어나지 않음을 확인할 수 있다.
본 실시예들에 의하면, dNTP mix의 농도를 0.6mM 에서 2.2mM까지 조절하여 최적화된 dNTP mix농도를 확인할 수 있다. dNTP mix의 농도가 2.2mM일 때, 가장 뚜렷하게 positive와 negative를 구별할 수 있었을 뿐만 아니라, negative 샘플에서 non-target amplification현상이 일어나지 않음을 확인할 수 있다.
도 9는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 측방 유동 분석 스트립의 구조를 예시한 도면이다. 도 10는 본 발명의 실시예들에 따른 지카 바이러스 진단 방법이 사용하는 측방 유동 분석 스트립의 동작을 예시한 도면이다.
측방 유동 분석 스트립은 샘플 내의 분석물을 측정하며, 크로마토그래피 방식을 이용한다. 측방 유동 분석 스트립은 샘플 패드(Sample), 복합 패드(Conjugate Pad), 및 테스트 패드(Test Pad)를 포함한다. 샘플 패드는 버퍼 로딩 패드(Buffer Loading Pad)라고도 불리며, 검출하려는 샘플을 주입하는 패드이다. 복합 패드는 발색 물질에 결합된 탐지자를 포함하는 패드이다. 탐지자는 샘플 내의 분석물과 결합한다. 테스트 패드는 검출 영역인 테스트 라인(Test Line) 및 대조 영역인 제어 라인(Control Line)을 포함하며, 샘플 내에 분석물이 존재하는지 여부를 표시하고, 샘플이 이동하는지 여부를 표시한다. 흡수 패드(Absorbent Pad)는 모세관 현상을 이용하여 샘플을 흡수하는 패드이다.
복합 패드는 제1 태그와 결합하여 복합체를 형성하는 탐지자 및 표시자를 결합시킨 결합체를 포함하고, 테스트 패드는 제2 태그와 결합하여 복합체를 포획하는 검출 영역을 포함할 수 있다.
한편, 복합 패드는 제2 태그와 결합하여 복합체를 형성하는 탐지자 및 표시자를 결합시킨 결합체를 포함하고, 테스트 패드는 제1 태그와 결합하여 복합체를 포획하는 검출 영역을 포함할 수 있다.
예컨대, 복합 패드에는 바이오틴(Biotin)과 특이적으로 결합 가능한 스트렙타아비딘(Streptavidin)이 코팅된 AuNPs(Gold Nano Particles)이 모여있다. Streptavidin이 코팅된 AuNPs는 바이오틴(Biotin)이 라벨링된 증폭 유전자와 결합하여 복합체(Complex)를 형성할 수 있다. Diluent buffer에 의한 모세관력(Capillary Force)에 의해 복합체가 이동하다가, 복합체의 디곡시게닌(Digoxigenin)이 라벨링된 증폭 유전자가 검출 영역의 anti-digonxigenin과 결합하여 AuNPs들이 모이게 되어 테스트 라인에서 붉은색 색깔을 띄게 된다. 복합체를 형성하지 못한 AuNPs은 대조 영역과 결합하여 제어 라인에서 붉은색을 띄게 된다. 이렇게 띈 색깔을 분석하여 지카 바이러스 유무를 파악할 수 있을 뿐만 아니라 이미지 분석을 통해 정량분석도 가능하다.
도 11은 본 발명의 실시예들에 따라 수행된 실험결과를 도시한 것이다. 도 11을 참조하면, 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법에 의하여, 지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 지카 바이러스 유전자를 증폭하며, 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하고, dNTP에 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 지카 바이러스 유전자를 검출함으로써, 간단하면서도 고감도로 지카 바이러스를 진단할 수 있음을 쉽게 파악할 수 있다.
본 실시예들은 본 실시예의 기술 사상을 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 실시예의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 실시예의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 실시예의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
표적 유전물질 수집
지카 바이러스(Zika virus)를 검출하기 위하여, 실제 지카 바이러스와 동일한 RNA를 지니고 있으나, 감염성이 없는 Zeptometrix 사의 NATtrol™Zika Virus (strain: MR766 (Uganda))를 인간 혈액에 주입시켜 이를 시료로 하여, 추출한 지카 바이러스 RNA를 106copy 부터 1copy까지 희석하여 등온증폭 반응의 주형으로 사용하였다.
프라이머 작성
표적 유전물질을 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 통하여 검출하기 위하여, 프라이머(primer)를 지카 바이러스 RNA의 전체 염기서열(Genbank: AY632535, strain: MR766 (Uganda))를 이용하여 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(FIP, BIP, F3 및 B3)가 하나의 세트가 되어 표적 유전물질의 증폭을 야기하며, 증폭의 속도를 가속화 하기 위해 2개의 루프 프라이머(LF, LB)를 추가로 설계하여 프라이머 세트를 제작하였다.
등온증폭법의 시행
표적 유전물질 지카 바이러스 RNA 추출은 바이오니아 사의 Viral RNA Extraction Kit방법을 따른다. 먼저 1.5ml 튜브에 200의 지카 바이러스가 주입된 인간혈액을 넣는다. 400의 바인딩 버퍼(Binding buffer)를 넣고 5초간 볼택싱(vortexing)을 하여 10분간 상온에서 반응시킨 뒤, 100의 이소프로페놀을 넣고 5초간 볼택싱(vortexing) 한다. 바인딩 컬럼(Binding column)에 희석시킨 모든 용액(700)을 옮긴 뒤에 뚜껑을 닫고 약 8000rpm에서 1분간 원심 분리한다. 바인딩 컬럼을 튜브에서 빼내어 새로운 컬렉션 튜브(Collection tube)에 끼운 뒤 500의 W1 버퍼를 넣고 약 8000rpm에서 1분간 원심 분리한다. 바인딩 컬럼을 빼내어 컬렉션 튜브에 담긴 폐액을 버리고 다시 끼운 뒤 약 8000rpm 에서 1분간, 13000rpm에서 1분간 원심 분리한다. 바인딩 컬럼을 1.5ml 튜브에 옮기고 50의 일루션 버퍼(Elution buffer)를 넣고 1분간 반응시킨 뒤 1분간 약 8000rpm에서 원심 분리하여 5.5ng/(4.7108copy)의 정제된 지카 바이러스 RNA시료를 얻는다. 이 것을 10배씩 희석(106copy 부터 1copy 까지)하여 등온증폭 반응의 주형으로 사용하였다.
6개의 프라이머(FIP, BIP, LF, LB, F3, B3)는 지카 바이러스 RNA의 전체 염기서열(Genbank: AY632535, strain: MR766 (Uganda))에 상보적인 서열을 포함되도록 설계하였으며, 각각의 서열 정보는 다음과 같다.
FIP: 5'- GGCGTGGGCATCCTTGAATTCTGCAGACACCGGAACTCCA -3'
BIP: 5'- GGCAAACCGTCGTCGTTCTGGCTCAGCCTCTAGAGCTCCA -3'
LF: 5'- TGCCTCTTTGTTGTTCCAGTG -3'
LB: 5'- AGCCGTTCACACGGCTC -3'
F3: 5'- TGACATCCCATTGCCTTGG -3'
B3: 5'- CTTCCCTTTGCACCATCCAT -3'

Claims (14)

  1. 측방 유동 분석 스트립을 이용한 지카 바이러스 진단 방법에 있어서,
    지카 바이러스 유전자의 표적 유전자에 결합하도록 디자인된 프라이머 및 dNTP를 이용하여 상기 지카 바이러스 유전자를 증폭하는 단계;
    상기 디자인된 프라이머 중 일부에 제1 태그를 라벨링하는 단계;
    상기 dNTP에 제2 태그를 라벨링하는 단계; 및
    상기 제1 태그 및 상기 제2 태그를 라벨링하여 증폭된 지카 바이러스 유전자를 상기 측방 유동 분석 스트립에 주입하여 상기 지카 바이러스 유전자를 검출하는 단계
    를 포함하는 지카 바이러스 진단 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 디자인된 프라이머는 정방향 내부 프라이머, 역방향 내부 프라이머, 정방향 루프 프라이머, 역방향 루프 프라이머, 정방향 외부 프라이머, 및 역방향 외부 프라이머에 해당하고,
    상기 정방향 루프 프라이머 및 상기 역방향 루프 프라이머에 상기 제1 태그를 각각 라벨링하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 태그는 디곡시게닌(Digoxigenin)인 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2 태그는 바이오틴(Biotin)인 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 지카 바이러스 유전자를 증폭하는 단계는 등온증폭(Loop mediated isothermal amplification, LAMP) 반응을 이용하여 증폭하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 등온증폭 반응은 72℃의 온도에서 증폭하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 등온증폭 반응에 마그네슘 이온을 기 설정된 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 마그네슘 이온을 4 mM 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 등온증폭 반응에 상기 제2 태그가 라벨링된 dNTP를 기 설정된 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 태그가 라벨링된 dNTP를 2.2 mM 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 측방 유동 분석 스트립은 샘플 패드, 복합 패드, 및 테스트 패드를 포함하며,
    상기 복합 패드는 상기 제1 태그와 결합하여 복합체를 형성하는 탐지자 및 표시자를 결합시킨 결합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 테스트 패드는 상기 제2 태그와 결합하여 상기 복합체를 포획하는 검출 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 측방 유동 분석 스트립은 샘플 패드, 복합 패드, 및 테스트 패드를 포함하며,
    상기 복합 패드는 상기 제2 태그와 결합하여 복합체를 형성하는 탐지자 및 표시자를 결합시킨 결합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 테스트 패드는 상기 제1 태그와 결합하여 상기 복합체를 포획하는 검출 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 지카 바이러스 진단 방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200091658A (ko) 2019-01-23 2020-07-31 충북대학교 산학협력단 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법
WO2021025455A1 (ko) * 2019-08-06 2021-02-11 주식회사 지엠디바이오텍 일체형 분자 진단 장치
WO2021187791A1 (ko) * 2020-03-17 2021-09-23 주식회사 필메디 측방유동 분석 스트립 및 그를 이용한 분자진단방법
KR20210116149A (ko) * 2020-03-17 2021-09-27 주식회사 필메디 측방유동 분석 스트립 및 그를 이용한 분자진단방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032196A1 (en) * 2001-07-18 2003-02-13 Siliang Zhou Test strip for a lateral flow assay for a sample containing whole cells
US20060019406A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-26 Ning Wei Lateral flow device for the detection of large pathogens
KR20160075964A (ko) * 2014-12-19 2016-06-30 주식회사 메디안디노스틱 돼지 콜레라 바이러스의 e2 단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 돼지 콜레라 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트
KR20160075963A (ko) * 2014-12-19 2016-06-30 주식회사 메디안디노스틱 구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032196A1 (en) * 2001-07-18 2003-02-13 Siliang Zhou Test strip for a lateral flow assay for a sample containing whole cells
US20060019406A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-26 Ning Wei Lateral flow device for the detection of large pathogens
KR20160075964A (ko) * 2014-12-19 2016-06-30 주식회사 메디안디노스틱 돼지 콜레라 바이러스의 e2 단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 돼지 콜레라 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트
KR20160075963A (ko) * 2014-12-19 2016-06-30 주식회사 메디안디노스틱 구제역 바이러스의 3ａｂ 비구조단백질 및 이에 특이적인 단일클론항체를 이용한 구제역 바이러스 감염여부를 진단하는 방법 및 이를 구현하기 위한 진단키트

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문1: ANAL. CHEM. *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200091658A (ko) 2019-01-23 2020-07-31 충북대학교 산학협력단 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법
WO2021025455A1 (ko) * 2019-08-06 2021-02-11 주식회사 지엠디바이오텍 일체형 분자 진단 장치
KR20210018150A (ko) * 2019-08-06 2021-02-17 주식회사 지엠디바이오텍 일체형 분자 진단 장치
WO2021187791A1 (ko) * 2020-03-17 2021-09-23 주식회사 필메디 측방유동 분석 스트립 및 그를 이용한 분자진단방법
KR20210116149A (ko) * 2020-03-17 2021-09-27 주식회사 필메디 측방유동 분석 스트립 및 그를 이용한 분자진단방법
CN113841050A (zh) * 2020-03-17 2021-12-24 菲尔梅迪株式会社 侧流分析条带和使用该条带的分子诊断方法

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