CN105441395A - 一种表达埃博拉gp蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达埃博拉GP蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用，通过将埃博拉病毒的editedGP插入到黄热病毒疫苗株（yellowfever17D，YF17D）的E和NS1之间，构建具有传代能力的重组病毒。病毒滴度达10⁶PFΜ/ml，可检测到埃博拉GP蛋白的表达。该重组病毒能诱导小鼠产生对埃博拉病毒GP蛋白具有特异性结合作用的抗体。该重组病毒可进一步用于开发制备预防埃博拉的特异性抗血清，在埃博拉感染的应急治疗中得到应用。

Description

一种表达埃博拉GP蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种埃博拉重组病毒构建、制备方法及其在抗埃博拉血清制备中的应用。

背景技术

埃博拉病毒(Ebolavirμs，EBOV)是丝状病毒科单股负链RNA病毒，包括苏丹型埃博拉(Sμdanebola)、扎伊尔型埃博拉(Zaireebola)、科特迪瓦型埃博拉(Coted'Ivoireebola)、本迪布焦型埃博拉病毒(Bμndibμgyoebola)和雷斯顿型埃博拉(Restonebola)等5种亚型。埃博拉病毒一般通过感染者的血液、体液和分泌液等传播，能够引发脊椎动物特别是灵长类动物产生出血热症状，人感染病例的死亡率高达90％以上。但到目前还没有有效预防和治疗埃博拉病毒感染的药物和疫苗，被WHO列为对人类危害最严重的4级病毒和潜在的生物战剂。该病毒首次报道于1976年在非洲报道，此后几十年一直在非洲大地零星爆发。

今年4月以来，埃博拉病毒在几内亚、利比里亚、塞拉利昂、尼日利亚等西非四国爆发和流行，根据世界卫生组织发布的疫情最新通报，截至8月20日，西非地区累计出现埃博拉病毒确诊、疑似和可能感染病例2615例，1427人死亡，已成为国际关注的突发公共卫生事件，并对他国家的公共健康构成威胁。尽管到目前为止，埃博拉疫情主要发生在非洲四国，但是随着中国和非洲经济文化联系的日益密切，大量人员频繁来往于中非之间，埃博拉疫情将对中国的公共卫生体系建设和埃博拉疫情的防控带来严峻的挑战和威胁。为此，国家有关部门对此次疫情给以了高度关注，发布了埃博拉防控的指导性文件，启动了相应的应急科技支撑项目。虽然埃博拉病毒没有在世界范围内造成大规模流行，但是，随着经济全球化进程的深入，非洲贸易、旅游、合作、及人员往来的增多，埃博拉病毒对各国人民的威胁与日俱增，尤其像中国这样一个人口众多，人流量大的国家，更需要对此类病毒的入侵做好储备性工作。其中埃博拉病毒感染的早期核酸和抗体检测技术的建立和完善是有效进行埃博拉病毒防控的重要措施。同时在目前世界范围内缺少埃博拉病毒预防性和治疗性疫苗的情况下，获得对埃博拉病毒特异性抗血清对埃博拉病人进行应急治疗具有十分紧迫和重要的现实意义。

研制埃博拉病毒的疫苗一直被认为是有效控制埃博拉病毒感染的有效方法。但由于埃博拉病被认为是一种生物安全危害四级的病毒，开展埃博拉病毒培养、病毒操作和动物感染实验需要在四级生物安全实验室进行，而且世界各国对从事埃博拉病毒的研究和埃博拉病毒的保藏有及其严格的管理规定，所以有关康埃博拉病毒疫苗的研究大部分依赖于重组病毒进行。截止目前，埃博拉重组病毒主要有利用腺病毒，VSV(水泡性口炎病毒)，VLP(类病毒)等来构建，研究结果显示这些重组病毒能有效诱导实验动物小鼠产生对埃博拉病毒结构蛋白产生特异性抗体，而且证明诱导产生的抗体与埃博拉病毒的结构蛋白能发生特异性结合反应，但抗体对埃博拉病毒的中和反应及其抗埃博拉病毒感染的动物实验还有待进一步进行，这是目前开展抗埃博拉病毒疫苗研究存在的无法克服的技术障碍。黄热病毒疫苗株作为灭活和减毒菌株已经安全地用于抗黄热病毒疫苗的制备，在中国和世界其他地方用于黄热病毒的预防性疫苗已经安全应用了几十年，在黄热病毒的防控中发挥了很好的作用，被认为是一种安全的疫苗菌株，但到目前为止尚无有人利用黄热病毒的疫苗株构建埃博拉重组病毒用于埃博阿拉病毒抗血清的制备。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP，其序列为SEQIDNO.1所示。通过将埃博拉病毒的重编辑后的GP(editedGP,swissprot:Q05320)蛋白基因插入到黄热病毒疫苗株(yellowfever17D，YF17D)的E和NS1之间，构建具有传代能力的重组病毒。

本发明的另一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒的构建方法，方法简单，易行，易于大规模生产。

本发明的还有一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用。本发明所述的埃博拉重组病毒，经鉴定，重组病毒能在BHK21中产生病毒，病毒滴度达106PFU/ml。通过噬斑，WB,IFA(间接免疫荧光)，RT-PCR等方法分别检测到埃博拉GP蛋白的表达，我们发现重组病毒的滴度小于YF17D的毒力滴度，说明了埃博拉重组病毒的安全性。

本发明最后一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP重组病毒在制备埃博拉病毒GP蛋白抗血清制备中的应用。该病毒能够在小鼠体内诱导出针对editedGP特异性的结合抗体，并特异性地介导CD8+T淋巴细胞分泌IFN-分，IL-2等细胞分子，参与特异性抗病毒细胞免疫。该重组病毒可进一步大量制备对埃博拉结构蛋白具有特异性结合反应的抗血清和抗埃博拉病毒的疫苗研制提供原创性技术支撑，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的发明思路为：本发明采取的黄热病毒疫苗株(YellowFever17D，YF17D)(astablefulllengthyellowfeverviruscDNAcloneandtheroleofconservedRNAelementsinflavivirusreplication)作为重组病毒的骨架获得表达埃博拉病毒GP蛋白的重组黄热病毒。该重组病毒载体已有七十多年的使用历史，被用作多种病原体和病毒如HIV、DENV和WNV等的重组载体，均取得良好的免疫保护效果。为使重组病毒出毒和提高稳定性，在插入片段editedGP连入N端NS1(N9aa)和C端加WNV-E24融合区。通过融合PCR构建插入片段，酶切位点(NsiI和MlI)连接的方式构建重组病毒。

一种埃博拉重组病毒的构建方法，其步骤如下：

BHK-21细胞用DMEM+10％FBS+100U/ml青链霉素双抗在37℃培养箱中培养。细胞裂解液购自碧云天,pACNRA-YF17D全长感染性克隆由中国科学院武汉病毒所张波研究员惠赠。

采用酶切连接的方法，在E和NS1上找到两个酶切位点mlI和NsiI，用primer9F和primer9R,pACNRA-YF17D为模板，扩增E的左边部分区域，用primer10F和primer10R，editedGP为模板,扩增出融合中间区的editedGP，用primer11F-1primer11F-2，primer11F-3，primer11F-4和primer11R，以pACNRA-YF17D为模板，按照依次顺序通过多轮PCR，得到NS1右边融合区。我们融合PCR将这3个PCR产物融合在一起，通过两个酶切位点mulI和NsiI连在pACNRA-YF17D。(所用到的引物参见实施例1中表1)

埃博拉重组病毒的出毒鉴定和生物学特性实验：

经鉴定，重组病毒能在BHK21中产生病毒颗粒，病毒滴度达10⁶PFΜ/ml。我们通过噬斑、WB、IFA(间接免疫荧光)和RT-PCR等方法分别检测到埃博拉GP蛋白的表达，我们发现重组病毒的滴度小于YF17D的毒力滴度，说明了重组病毒的安全性。此外，我们通过传代实验，测定重组病毒的稳定性在P5代左右。

重组病毒的鉴定和生物学特性实验：

我们将YF17D的RNA和重组病毒的全长感染性RNA通过DMRIE-CReagent转染到BHK21中(六孔板)，分别取第3天和第4天的上清液，经过离心1000g，5min，保留上清，用Trizol法提取其总RNA，以其RNA为模板用M-MLV反转录酶逆转录出cDNA，用扩增GP和NS1的部分序列一对引物进行PCR，产物大小1.1kb。我们在YF17D-editedGP的3d和4d上清中，检测到了目的大小的片段，经测序比对，证实是GP和NS1的部分序列。同时，我们用碧云天细胞裂解液收获了转染后4天后的细胞，加上上清液，YF17D感染的细胞，用GPMcAb单抗进行了WesternBlot检测。此外，我们将获得病毒上清液用24孔板来做噬斑，4d后可见噬斑形态，6天后染色，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFΜ/ml，PFΜ：plaqueformationunit噬斑形成单位)PFΜ＝病毒稀释倍数×P/V(P:空时斑数目，V：接种量)在两次不同的时间内进行。此外，我们用感染复数MOI为0.1的重组病毒连续传代BHK21，分别在感染后第4天取10μl上清液，感染新的BHK21，如此直至10代，收集每代的感染细胞和上清液，分别进行WB和RT-PCR检测外源基因的遗传稳定性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：

1.这是首次利用黄热病毒17D作为病毒骨架构建表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，为表达埃博拉病毒蛋白的重组病毒的构建和抗血清的制备及疫苗研究提供了一个新的方向。

2.这个疫苗载体是黄热病毒的疫苗株，具有很好的安全性，在临床上已有70多年的使用历史，重组病毒的毒力弱于母本病毒，具有更高的安全性。

3.本发明首公开的黄热病毒包容外源片段大小为2kb(目前最大)，大于文献报道的最大外源片段(拉萨热GP1.5kb)，拓展了黄热病毒疫苗株接受外源基因的容量。

4.重组病毒能够连续传代至5代保持稳定，比较稳定。

重组病毒是一种很有前景的疫苗之一，它能在体外大量制备，进入人体后接近于自然感染，能够诱导强烈的系统免疫应答和粘膜免疫反应，几乎可以提供完全的保护作用。本发明不仅对于埃博拉的疫苗的研发提供了重要的思路和基础，同时也为其他烈性病毒和病原体的疫苗和药物研发提供了重要的思路。

5.本发明系YF17D-editedGP重组病毒首次进行的动物免疫试验，并在B/c系小鼠模型上本发明通过对重组病毒的构建出毒及小鼠免疫试验，诱导出针对editedGP特异性的结合抗体，并特异性地介导CD8⁺T淋巴细胞分泌IFN-γ，IL-2等细胞分子，参与特异性抗病毒细胞免疫。该重组病毒可进一步实验开发作为预防埃博拉的疫苗，具有广泛的应用前景。

6.YF17D-editedGP重组病毒相比DNA疫苗，能够更加显著地刺激T细胞反应，分泌更多的细胞因子和刺激记忆细胞，参与T细胞抗病毒免疫。

7.YF17D-editedGP重组病毒相比其他的重组病毒更加安全，因为YF17D是有70多年临床使用经验的病毒疫苗株，而YF17D-editedGP毒性弱于YF17D。免疫实验中，没有发生小鼠死亡或不适现象，辅证了YF17D-editedGP重组病毒的安全性。

8.本发明不仅对于埃博拉的疫苗的研发提供了重要的思路和基础，同时也为其他烈性病毒和病原体的疫苗和药物研发提供了重要的思路。

附图说明

图1重组黄热病毒17D构建示意图

为使重组病毒出毒和提高稳定性，在插入片段editedGP连入N端NS1(N9aa)和C端加WNV-E24融合区。通过融合PCR构建插入片段，酶切位点(NsiI和MluI)连接的方式构建重组病毒，并双酶切鉴定。

图2重组病毒颗粒鉴定和生物学特性

其中，图2A显示YF17D和YF17D-editedGP形成的噬斑都是不规则的噬斑，而且YF17D-editedGP噬斑比YF17D更小，这从一个侧面验证了YF17D-edited的毒力比YF17D更小，没有因为插入外源基因而使毒性安全的疫苗株变得不安全。

图2B显示重组病毒的毒力弱于母本病毒，为106PFΜ/ml；

图2C显示重组病毒能够连续传代至5代保持稳定。

图3免疫小鼠血清中埃博拉GP抗体效价测定结果

在YF17D和DMEM中均未检测出针对GP1(190-313)的阳性效价，在DNA疫苗组(pcDNA3.1(+)-editedGP)中检测出较低效价100-200之间，且小鼠个体间差异较大。在YF17D-editedGP组，免疫小鼠血清中GP效价与阴性样本DMEM和YF17D相比存在显著性的差异,效价均值达1200左右，同样存在个体间差异较大的问题。联合免疫组没有取得预期的增强的效果，效价均值在500左右。

图4为EbolaGP表位肽特异性CD8⁺T细胞反应IFN-γELISpot

经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和CD8/L9V；LYDRLASTV)刺激，如图3-6(B)所示,DNA组pcDNA3.1(+)-editedGP无论在G9F还是L9V的刺激下，所形成的SFC数量与阴性组YF17D均没有显著性差异，这与我们的预期也是大致一样，因为DNA疫苗能够较好地介导特异性体液免疫，而在激发T细胞免疫方面效果一般。而YF17D-editedGP和complexs组无论在G9F还是L9V的刺激下，所形成的SFC数量与阴性组YF17D均均有显著差异，引起较强的GP特异性CD8⁺T-cell反应，由此可见YF17D是一个十分良好的激发T细胞的活病毒疫苗平台。而且我们可以发现G9F表位肽比L9V表位肽可以更好地激发T淋巴细胞分泌细胞因子。

图5为内细胞因子染色分析-IFN-γ结果

我们用APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，然后固定透化，将IFN-γ染色，最后上机检测。实验结果如图3，我们可以看出经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和(CD8/L9V；LYDRLASTV)双刺后，YF17D组与未经刺激的DMEM组IFN-γ标记阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比并没有显著的提高和降低(未展示)，这与我们的预期是一致的，因为YF17D组免疫的小鼠没有经过GP的免疫。而pcDNA3.1(+)-editedGP组相对YF17D存在P值为0.05水平的显著性差异，而YF17D-editedGP组与complex组均存在P值为0.001水平的显著性差异，其中以YF17D-editedGP组激发的阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比最高，由此可见editedGP在YF17D这个疫苗平台上能够很好地激发T淋巴细胞分泌IFN-γ，参与抗病毒感染。图的右侧是每组流式图的代表，其中P2方框的是APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，蓝色代表的是阳性的分泌IFN-γ的细胞。

图6胞内细胞因子染色分析-IL-2结果

我们用APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，然后固定透化，将IL-2染色，最后上机检测。结果见图3-7(B)，我们可以看出经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和(CD8/L9V；LYDRLASTV)双刺后，pcDNA3.1(+)-editedGP组相对YF17D组略高，但IL-2标记阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比并没有显著的提高，而YF17D-editedGP组与complex组均存在P值为0.001水平的显著性差异，其中以YF17D-editedGP组激发的阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比最高，由此可见editedGP在YF17D这个疫苗平台上能够很好地激发T淋巴细胞分泌IL-2，参与抗病毒感染。图的右侧是每组流式图的代表，其中P2方框的是APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，蓝色代表的是阳性的分泌IL-2的细胞。

具体实施方式

实施例1：

一种重组黄热病毒的构建方法如下(图1)：

1)以pACNRA-YF17D为模板，用primer9F和primer9R,，扩增E的左边部分区域；

2)以editedGP为模板，用primer10F和primer10R，扩增出融合中间区的editedGP；

3)以pACNRA-YF17D为模板，用primer11F-1primer11F-2，primer11F-3，primer11F-4和primer11R，，按照依次顺序通过多轮PCR，得到NS1右边融合区WNV-E24；

4)利用融合PCR，将步骤1)-3)中得到的3个PCR产物融合在一起，通过两个酶切位点mulI和NsiI连在pACNRA-YF17D。

最终获得一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP，其序列为SEQIDNO.1所示。

pACNRA-YF17D全长感染性克隆(astablefμlllengthyellowfevervirμscDNAcloneandtheroleofconservedRNAelementsinflavivirμsreplication)由中国科学院武汉病毒所张波研究员惠赠。表1本实验所用到的引物表

实施例2：

埃博拉重组病毒的出毒鉴定和生物学特性实验：

BHK-21细胞用DMEM+10％FBS+100U/ml青链霉素双抗在37℃培养箱中培养。细胞裂解液购自碧云天。

将YF17D的RNA和重组病毒的全长感染性RNA通过DMRIE-CReagent转染到BHK21中(六孔板)，分别取第3天和第4天的上清液，经过离心1000g5min，保留上清，用Trizol法提取其总RNA，以其RNA为模板用M-MLVReverseTranscriptase逆转录出cDNA，用扩增GP和NS1的部分序列一对引物(Primer11R和Primer12F)进行PCR，产物大小1.1kb。我们在YF17D-editedGP的3d和4d上清中，检测到了目的大小的片段，经测序比对，证实是GP和NS1的部分序列。同时，我们用碧云天细胞裂解液收获了转染后4天后的细胞，加上上清液，YF17D感染的细胞，用GPMcAb单抗进行了WesternBlot检测。此外，我们将获得病毒上清液用24孔板来做噬斑，4d后可见噬斑形态，6天后染色，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml，PFU：plaqueformationunit噬斑形成单位)PFU＝病毒稀释倍数×P/V(P:空时斑数目，V：接种量)在两次不同的时间内进行。此外，我们用感染复数MOI为0.1的重组病毒连续传代BHK21，分别在感染后第4天取10μl上清液，感染新的BHK21，如此直至10代，收集每代的感染细胞和上清液，分别进行WB和RT-PCR检测外源基因的遗传稳定性。

WesternBlot及噬菌斑检测结果(图2A)：图2A显示，通过WB和RT-PCR检测出重组病毒在BHK21细胞表达的edidtedGP，证明重组病毒的表达外源蛋白的可行性。此外，YF17D和YF17D-editedGP形成的噬斑都是不规则的噬斑，而且YF17D-editedGP噬斑比YF17D更小，这从一个侧面验证了YF17D-edited的毒力比YF17D更小，没有因为插入外源基因而使毒性安全的疫苗株变得不安全。

病毒滴度(图2B)：图2B显示重组病毒的毒力弱于母本病毒，为10⁶PFU/ml；

传代稳定性结果(图2C)：图2C显示重组病毒能够连续传代至5代保持稳定。

实施例3：

重组病毒YF17D-editedGP在埃博拉病毒抗血清制备中的应用，其应用过程如下：

实验设置5组，DMEM作为阴性对照，YF17D，YF17D-editedGP和混合组(DNA和YF17D-editedGP联合免疫)。所有小鼠均为4-6周大的B/c系雌鼠，病毒液均采用腹腔注射的方式，DNA疫苗采用肌肉注射加电击的方式。

表2小鼠免疫试验的设计

按照表2所设计，当第二次免疫完2周后，我们在BSL-2实验室里对小鼠进行眼球取血获取血清，之后拉颈处死，解剖小鼠尸体，获取脾脏，使用达优淋巴细胞分离液获取单细胞的悬液。

1.免疫小鼠血清中埃博拉GP抗体效价测定实验：

ELISA实验方法如下：使用原核表达纯化的GP1(190-313)4℃包被过夜，用奶粉37℃封闭2小时，用2倍连续稀释(至2048倍)的小鼠血清37℃孵育1小时，清洗后，加1:1000的酶标抗体，加显色液45min，加2M硫酸终止。计算公式：(待测样OD－空白OD)/(阴性对照OD－空白OD)。若两者比值大于2.1可判读为阳性。结果见图3。

在YF17D和DMEM中均未检测出针对GP1(190-313)的阳性效价，在DNA疫苗组(pcDNA3.1(+)-editedGP)中检测出较低效价100-200之间，且小鼠个体间差异较大。在YF17D-editedGP组，免疫小鼠血清中GP效价与阴性样本DMEM和YF17D相比存在显著性的差异,效价均值达1200左右，同样存在个体间差异较大的问题。联合免疫组没有取得预期的增强的效果，效价均值在500左右。

2ELISpot实验：

1).预包被板的活化：每孔加入200μl的达优无血清培养基，室温静置5-10min后将其扣出。

2).加入细胞悬液：接种不同浓度的细胞100μl/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀，一般1×10⁵cells/well。

3).加刺激物：每孔加入zaireebolaGPspecificCD8+Tcellpeptide的G9F(GPCAGDFAF)和L9V(LYDRLASTV)表位肽各10μl(2mg/ml)。

4).静置孵育：放入二氧化碳培养箱，37℃，5％CO2培养16-20h。

ELISPOT程序第二天，斑点显色------非无菌操作

本程序包括裂解细胞、加检测抗体、加酶联亲和素、斑点显色。这些操作ELISA类似，不再需要无菌操作。具体参照达科为ELISPOT操作流程。

5).结果见图4

经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和CD8/L9V；LYDRLASTV)刺激，如图3-6(B)所示,DNA组pcDNA3.1(+)-editedGP无论在G9F还是L9V的刺激下，所形成的SFC数量与阴性组YF17D均没有显著性差异，这与我们的预期也是大致一样，因为DNA疫苗能够较好地介导特异性体液免疫，而在激发T细胞免疫方面效果一般。而YF17D-editedGP和complexs组无论在G9F还是L9V的刺激下，所形成的SFC数量与阴性组YF17D均均有显著差异，引起较强的GP特异性CD8⁺T-cell反应，由此可见YF17D是一个十分良好的激发T细胞的活病毒疫苗平台。而且我们可以发现G9F表位肽比L9V表位肽可以更好地激发T淋巴细胞分泌细胞因子。

3胞内细胞因子染色实验：

参照上述脾细胞的分离，获取实验的组织脾脏，然后制备单细胞溶液，用灭菌后的PBS重悬。

1)杀小鼠取脾，制成单细胞悬液，10⁷个/ml，100μl

2)加BFA(0.1μl)和阳性双刺(PMA和IonominA),T细胞刺激短肽各10μl(终浓度10ng/ml),37℃细胞培养箱，4-6h

3)离心500g5min，弃上清

4)加500μlPBS重悬，离心，重复3

5)加100μlPBS重悬，加CD16/CD32，冰上或者4℃孵育10-15min，清洗一次。

6)重悬至100μl，加FITC--CD3和APC-CD8一抗各1μl，冰上暗处孵育15-20min7500g离心5min，清洗2次。

7)加500μl固定液(4％对聚甲醛)，室温避光固定20min

8)离心5min，弃上清(如需中止，客家500μl1％的多聚甲醛，4℃短期保存)

9)加1X的破膜缓冲液500μl，室温避光处理10-15min

10)800g离心5min，两次，重悬至300μl

11)分管并分别加入IFN-γ，IL-2荧光标记抗体各1μl，室温避光20min

12)用PBS洗3遍，加入500μl的PBS上机检测

13)分析结果见图5和图6。

APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，然后固定透化，将IFN-γ染色，最后上机检测。实验结果如图5，我们可以看出经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和(CD8/L9V；LYDRLASTV)双刺后，YF17D组与未经刺激的DMEM组IFN-γ标记阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比并没有显著的提高和降低，这与我们的预期是一致的，因为YF17D组免疫的小鼠没有经过GP的免疫。而pcDNA3.1(+)-editedGP组相对YF17D存在P值为0.05水平的显著性差异，而YF17D-editedGP组与混合组均存在P值为0.001水平的显著性差异，其中以YF17D-editedGP组激发的阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比最高，由此可见editedGP在YF17D这个疫苗平台上能够很好地激发T淋巴细胞分泌IFN-γ，参与抗病毒感染。图的右侧是每组流式图的代表，其中P2方框的是APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，蓝色代表的是阳性的分泌IFN-γ的细胞。

用APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，然后固定透化，将IL-2染色，最后上机检测。结果见图6，我们可以看出经过GP-specific-CD8⁺T-cellpeptide(CD8/G9F；GPCAGDFAF)和(CD8/L9V；LYDRLASTV)双刺后，pcDNA3.1(+)-editedGP组相对YF17D组略高，但IL-2标记阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比并没有显著的提高，而YF17D-editedGP组与混合组均存在P值为0.001水平的显著性差异，其中以YF17D-editedGP组激发的阳性的CD8⁺T淋巴细胞的百分比最高，由此可见editedGP在YF17D这个疫苗平台上能够很好地激发T淋巴细胞分泌IL-2，参与抗病毒感染。图的右侧是每组流式图的代表，其中P2方框的是APC-CD8和FITC-CD3圈定CD8⁺T淋巴细胞，蓝色代表的是阳性的分泌IL-2的细胞。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院武汉病毒研究所

<120>一种表达埃博拉GP蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用

<130>一种表达埃博拉GP蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用

<160>1

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>12890

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agtaaatcctgtgtgctaattgaggtgcattggtctgcaaatcgagttgctaggcaataa60

acacatttggattaattttaatcgttcgttgagcgattagcagagaactgaccagaacat120

gtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcg180

ctccttgtcaaacaaaataaaacaaaaaacaaaacaaattggaaacagacctggaccttc240

aagaggtgttcaaggatttatctttttctttttgttcaacattttgactggaaaaaagat300

cacagcccacctaaagaggttgtggaaaatgctggacccaagacaaggcttggctgttct360

aaggaaagtcaagagagtggtggccagtttgatgagaggattgtcctcaaggaaacgccg420

ttcccatgatgttctgactgtgcaattcctaattttgggaatgctgttgatgacgggtgg480

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gtgcccagactcaatggaatacaactgtcccaatctcagtccaagagaggagccagatga660

cattgattgctggtgctatggggtggaaaacgttagagtcgcatatggtaagtgtgactc720

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Claims (4)

1.一种埃博拉重组病毒的构建方法，其序列为SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述重组病毒的制备方法，其步骤如下：

1）以pACNRA-YF17D为模板，用primer9F和primer9R,，PCR扩增；

2）以editedGP为模板，用primer10F和primer10R，PCR扩增；

3）以pACNRA-YF17D为模板，用primer11F-1primer11F-2，primer11F-3，primer11F-4和primer11R，，按照依次顺序进行多轮PCR；

4）利用融合PCR，将步骤1）-3）中得到的3个PCR产物融合在一起，通过两个酶切位点mulI和NsiI连在pACNRA-YF17D；

最终获得一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP，其序列为SEQIDNO.1所示。

3.权利要求1所述重组病毒在在埃博拉病毒抗血清制备中的应用。

4.权利要求1所述的重组病毒在制备抗埃博拉GP蛋白血清中的应用。