CN103864904A - 基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用。本发明公开的一种蛋白或该蛋白的截短体，该蛋白为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.3所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的抗原及其截短体能够诱导较强的体液免疫反应，具有良好的免疫原性，可应用于埃博拉病毒疫苗的开发及中和抗体的制备。

Description

基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用
技术领域
本发明涉及一种基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用。
背景技术
埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是烈性传染病埃博拉出血热（EHF）的病原体，为丝状病毒属，非节段单股负链RNA病毒，有5个亚型，即Zaire Ebola（ZEBOV），SudanEbola(SEBOV)，Cote d’Ivoire Ebola(CIEBOV)，Bundibugyo Ebola（BEBOV）与Reston Ebola（REBOV）（Kuhn,JH,Becker et al.Arch.Virol,2010,155,2083–2103）。自1976年首次发现Ebola病毒以来，EHF的爆发造成了大量人员死亡，死亡率接近90%。Ebola病毒感染后，相关疾病症状很快出现，包括头痛、肌痛、发热、多器官功能衰竭及休克等（Ksiazek TG et al.J Dis1999;179(Suppl1):S177–S187）。目前，没有有效的疫苗及药物用于埃博拉病毒感染的预防及治疗。
埃博拉病毒基因组全长19kb，编码7种蛋白质，包括4种结构蛋白（包膜蛋白GP、核糖核蛋白NP、基质蛋白VP24和VP40）、2种非结构蛋白（VP30和VP35）以及病毒RNA聚合酶L。包膜蛋白GP覆盖于病毒颗粒表面，是EBOV唯一的宿主粘附功能蛋白，在介导病毒侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。此外，GP可选择性地降低细胞表面与细胞粘附和免疫功能相关的大分子的表达，导致细胞的脱落死亡（Gene,O.G et al.Infect.Disord.Drug Targets,2009,9:191–200；Sullivan NJ,et al.Virol,2005,79:547-553）。成熟的GP蛋白是三聚体形式，由三个GP1-GP2异源二聚体组成，其中亚基GP1的功能是将病毒锚定于宿主细胞，亚基GP2则负责病毒与细胞的融合（KathrynSchornberg,et al.JOURNAL OF VIROLOGY,2006,p.4174–4178）。
近十年来，随着Ebola病毒致病机制的阐明，Ebola病毒疫苗的研究工作取得了巨大的进展，已研究了灭活疫苗、DNA疫苗、VEEV复制子疫苗、病毒颗粒疫苗(eVLP)、HPIV3载体疫苗、rAD5载体疫苗、rVSV载体疫苗等。上述已研究的疫苗主要是基于包膜蛋白GP抗原，其中重组腺病毒5（rAD5）载体疫苗与重组疱疹口炎病毒（rVSV）载体疫苗，均在NHP模型中获得了很好的保护活性（Sullivan NJ,et al.PLoS Med,2006,3:177；Thomas W Geisbert et al.Vaccine,2008,26:6894-6900；Thomas W Geisbertet al.J Viro,2009,80(14):7296-7304）。由于嵌入完整GP蛋白的病毒载体疫苗具有一定的复制能力及恢复毒性的风险，安全问题是这类疫苗不可忽视和亟待克服的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短体及应用。
本发明提供的一种蛋白或该蛋白的截短体，该蛋白为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.3所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
该蛋白的截短体为如下（3）-（8）任一所示：
（3）SEQ ID No.4所示的蛋白；
（4）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
（5）SEQ ID No.5所示的蛋白；
（6）将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
（7）SEQ ID No.6所示的蛋白；
（8）将SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
上述蛋白或该蛋白的截短体的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述蛋白的编码基因为如下1）-3）任一所示：
1）SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（1）或（2）所述蛋白质的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（1）或（2）所述蛋白质的DNA分子；
所述截短体的编码基因为如下4）-12）任一所示：
4）SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子；
5）在严格条件下与4）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（3）或（4）所述蛋白质的DNA分子；
6）与4）或5）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（3）或（4）所述蛋白质的DNA分子；
7）SEQ ID No.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子；
8）在严格条件下与7）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（5）或（6）所述蛋白质的DNA分子；
9）与7）或8）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（5）或（6）所述蛋白质的DNA分子；
10）SEQ ID No.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
11）在严格条件下与10）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（7）或（8）所述蛋白质的DNA分子；
12）与10）或11）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（7）或（8）所述蛋白质的DNA分子。
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体是将SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID No.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子、SEQID No.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子分别插入pVAX1的EcoRI与XhoI位点间得到的。
上述蛋白或该蛋白的截短体、上述基因或上述重组载体在制备免疫原和/或抗原中的应用也属于本发明的保护范围；
所述免疫原或抗原是针对埃博拉病毒或埃博拉病毒包膜蛋白GP的。
上述蛋白或该蛋白的截短体、上述基因或上述重组载体作为抗原在制备针对埃博拉病毒的抗体中的应用也属于本发明的保护范围。
上述蛋白或该蛋白的截短体、上述基因或上述重组载体在制备预防和/或治疗埃博拉病毒引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述埃博拉病毒具体为Zaire亚型埃博拉病毒。
GP蛋白的生物学功能主要是通过GP1亚基吸附细胞膜、GP2亚基发挥融合功能，从而使得埃博拉病毒进入宿主细胞。
暴露于GP蛋白表面的中部区域（aa393-556）在GP蛋白功能的发挥中具有关键作用，且该区域含有丰富的GP蛋白抗原表位。本发明提供的抗原片段是来自埃博拉病毒（Zaire）包膜蛋白GP的一段序列（aa393-556）以及该序列的截短体。本发明提供的抗原片段L具有作为GP蛋白相似的抗原潜力，免疫产生的中和抗体能够有效抑制病毒的感染。与完整的GP蛋白抗原相比，该抗原片段不具有GP蛋白的生物学功能（不具有GP1亚基与GP2亚基的功能，在病毒进入过程中只发挥辅助功能），因此不能使病毒进入宿主细胞，该片段用于病毒载体疫苗的构建时具有更好的安全性，也更方便用于多价疫苗制备。抗原片段L进一步截短后也能够诱导较强的体液免疫反应，具有良好的免疫原性，可应用于埃博拉病毒疫苗的开发及中和抗体的制备。
附图说明
图1为1%琼脂糖凝胶分析pVAX1-GP，pVAX1-L，pVAX1-LA，pVAX1-LM，pVAX1-LB的电泳图。
图2为重组蛋白GP的表达及纯化后SDS-PAGE电泳分析图。
图3为重组蛋白L的表达及纯化后SDS-PAGE电泳分析图。
图4为重组质粒免疫小鼠血清的ELISA分析图。
图5为GP蛋白和L蛋白免疫小鼠血清的ELISA分析图。
图6为Concanavalin A（ConA）或GP蛋白刺激后GP免疫组与L免疫组的淋巴细胞刺激指数分析。
图7为GP蛋白和L蛋白及片段免疫血清对假病毒感染靶细胞的中和活性分析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的酶，除特殊说明外，均购自TAKARA公司。
下述实施例中所用的细胞培养基及血清，除特殊说明外，均购自Gibco公司。
pVAX1购自Invitrogen公司。
pCAGGS-GP购自上海捷瑞生物工程有限公司，GP基因GenBank号为U28077.1。
6周龄Balb/C雌性小鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK-（军）2012-0004。
HRP标记的Goat anti-mouse IgG抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司。
达优小鼠淋巴细胞分离液购自达科为生物技术公司,产品目录号为DKW33-R0100。
Cell Counting Kit-8(CCK-8Kit)购自日本同仁化学研究所，产品目录号为CK04。
293FT细胞购自ATCC。
pNL4-3.luc.RE质粒在文献“L.Du et al.,Development of a safe and convenientneutralization assay for rapid screening of influenza HA-specific neutralizingmonoclonal antibodies,Biochemical and Biophysical Research Communications,2010,397:580–585”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
Bright-GloTM Luciferase Assay System购自Promega公司，产品目录号为E2610。
实施例1、抗原及其片段的免疫原性分析
一、重组质粒的构建
同时构建pVAX1-GP，pVAX1-L重组质粒以及L截短体LA、LB、LM的重组质粒pVAX1-LA，pVAX1-LM和pVAX1-LB。
具体步骤如下：
（一）设计并合成如下引物：
GPF：5’-GAATTCGCCACCATGGGTGTTACAGGAATATTG-3’
GPR：5’-CCGCTCGAGTTAAAAGACAAATTTGCATAT-3’
LF/LAF:5’-GAATTCGCCACCATGGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3’
LR/LBR:5’-CCGCTCGAGTTAACAGATTAAACCATCTTG-3’
LAR:5’-CCGCTCGAGTTATAGCTTCCCGCTGCTGGC-3’
LMF：5’-GGAATTCGCCACCATGAACACGAGCAAGGGTAC-3’
LMR：5’-CCGCTCGAGTTAAGTCCAGTAATGTAAATT-3’
LBF：5’-GGAATTCGCCACCATGGGCTTAATTACCAATACT-3’
（二）GP基因扩增
以pCAGGS-GP为模板，以GPF和GPR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1。
PCR反应体系：pCAGGS-GP为模板1μl，2×Prime STAR GC buffer（Mg2+，plus）25μl，dNTP mix（2.5mM each）4μl，上游引物GPF1μl，下游引物GPR1μl，PrimeSTAR DNA polymerase0.5μl，补加灭菌水至50μl。
PCR程序：94℃预变性4分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，30个循环，最后72℃延伸10min,4℃保温。
GP基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
（三）L、LA、LM与LB基因扩增
1、以pCAGGS-GP为模板，以LF/LAF和LR/LBR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2（L基因）。PCR扩增的退火温度为54℃，72℃延伸30秒。
L基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2、以pCAGGS-GP为模板，以LF/LAF和LAR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物3（LA基因）。PCR扩增的退火温度为57℃，72℃延伸20秒。
LA基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3、以pCAGGS-GP为模板，以LMF和LMR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物4（LM基因）。PCR扩增的退火温度为53℃，72℃延伸20秒。
LM基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
4、以pCAGGS-GP为模板，以LBF和LR/LBR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物5（LB基因）。PCR扩增的扩增退火温度为54℃，72℃延伸20秒。
LB基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
（四）EcoRI与XhoI分别双酶切PCR扩增产物1、PCR扩增产物2、PCR扩增产物3、PCR扩增产物4和PCR扩增产物5，得到GP、L、LA、LM和LB基因；EcoRI与XhoI双酶切载体pVAX1，得到载体大片段；将GP、L、LA、LM和LB基因分别与载体大片段连接，得到重组质粒pVAX1-GP，pVAX1-L，pVAX1-LA，pVAX1-LM和pVAX1-LB。
1%琼脂糖凝胶分析重组质粒pVAX1-GP，pVAX1-L，pVAX1-LA，pVAX1-LM，pVAX1-LB结果如图1所示。
将重组质粒pVAX1-GP，pVAX1-L，pVAX1-LA，pVAX1-LM和pVAX1-LB测序，结果正确。
二、重组蛋白GP和L的表达及纯化
（一）以pCAGGS-GP为模板，以24aGPF和24aGPR为引物进行PCR扩增,得到GPΔTM基因（SEQ ID No.7）,EcoRI与XhoI双酶切GPΔTM基因，得到GPΔTM片段；EcoRI与XhoI双酶切pET24a（+）载体（购自Novagen公司），得到载体大片段；将GPΔTM基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET24a（+）-GP。
24aGPF：5’-GGAATTCATCCCACTTGGAGTCATCCAC-3’
24aGPR：5’-CCGCTCGAGGTCCGGAAGGGTTTTATCAAC-3’
GPΔTM蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
以pCAGGS-GP为模板，以24aLF和24aLR为引物进行PCR扩增,得到L基因,EcoRI与XhoI双酶切L基因，得到L基因片段；EcoRI与XhoI双酶切L基因，得到L基因；EcoRI与XhoI双酶切pET24a（+）载体，得到载体大片段；将L基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET24a（+）-L。
24aLF：5’-GGAATTCGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3’
24aLR：5’-CCGCTCGAGCCCACAGATTAAACCATC-3’
将pET24a(+)-GP和pET24a(+)-L送测序结果正确。
（二）pET24a(+)-GP与pET24a(+)-L转化感受态细胞
pET24a(+)-GP转化Rosetta（DE3）感受态细胞（购自北京康为世纪生物科技有限公司），pET24a(+)-L转化BL21(DE3)感受态细胞（购自北京康为世纪生物科技有限公司）。各取1μl质粒加入相应的感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴150秒，向感受态中加入900μl无抗性LB培养基，37℃，150rpm复苏45分钟，将复苏菌液均匀涂布在卡那霉素抗性的LB平板，37℃倒置培养16小时。
（三）重组蛋白的诱导表达
挑取各重组菌的单克隆菌落，加入10ml50μg/ml卡那霉素抗性的LB培养基，37℃，220rpm培养12h；按照体积比1:100接种菌液至1L50μg/ml卡那霉素抗性的LB培养基，37℃，220rpm培养至OD600=0.6，大约2小时，加入IPTG至终浓度1mM，30℃诱导表达6小时后离心收集GP重组菌菌体和L重组菌菌体。
（四）重组蛋白的纯化
重组蛋白GP为包涵体形式，其纯化过程如下：
NTA-0buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，500mM NaCl，体积百分含量为10%的甘油）重悬GP重组菌菌体，超声破菌（功率400W，工作5秒，间歇5秒，总时间40分钟），4℃，10000rpm离心30分钟，收集破菌上清以及包涵体；UNTA-0buffer（20mM Tris-HClpH7.9，500mM NaCl，体积百分含量为10%的甘油，8M尿素）重悬包涵体沉淀，37℃，搅拌变性30分钟，4℃，10000rpm离心30分钟，收集包涵体溶解液上清，将其0.45μm滤膜过滤后上NTA-Ni亲和柱进行纯化，收集穿透液、杂蛋白洗脱液和目的蛋白洗脱液。将破菌上清、包涵体溶解液上清、穿透液、杂蛋白洗脱液和目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果如图2所示。
Macrosep超滤离心管（50K）（购自Millipore公司）超滤浓缩目的蛋白洗脱液，得到蛋白GP（SEQ ID No.8所示），大小约为70kD。
重组蛋白L为可溶形式，其纯化过程如下：
NTA-0buffer（20mM Tris-HCl pH7.9，500mM NaCl，体积百分含量为10%的甘油）重悬L重组菌菌体，超声破菌（功率400W，工作5秒，间歇5秒，总时间40分钟），4℃，10000rpm离心30分钟，收集破菌上清，0.45μm滤膜过滤后上NTA-Ni亲和柱进行纯化，收集穿透液、杂蛋白洗脱液和目的蛋白洗脱液。将破菌上清、穿透液、NTA-50洗脱液、NTA-100洗脱液和目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示。
Macrosep超滤离心管（10K）（购自Millipore公司）超滤浓缩目的蛋白洗脱液，得到蛋白L（SEQ ID No.3所示），大小约为20kD。
三、抗原免疫活性测定
（一）免疫方法
分组：
动物选取6周龄Balb/C雌性小鼠，分为生理盐水1组，pVAX1载体组，pVAX1-GP组，pVAX1-L组，pVAX1-LA组，pVAX1-LM组和pVAX1-LB5组；生理盐水2组，GP蛋白组及L蛋白组，每组10只小鼠。
免疫方式：
生理盐水1组，pVAX1载体组，pVAX1-GP组，pVAX1-L组,pVAX1-LA组，pVAX1-LM组和pVAX1-LB组采取肌肉注射，不加佐剂，2周免疫一次（分别在第0天、第14天和第28天免疫），100μg质粒/只（质粒浓度1mg/ml），生理盐水免疫体积为100μl/只，共3次。
生理盐水2组，GP蛋白组，L蛋白组采取皮下注射，2周免疫一次（分别在第0天和第14天免疫），35μg蛋白/只（蛋白浓度350μg/ml），生理盐水免疫体积为100μl/只，共免疫2次，首次免疫采用弗氏完全佐剂（购自Sigma公司），第二次免疫采用弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司），以1:1混合。
采血方式及时间：
尾静脉采血，采血时间为免疫前采血1次，每次免疫后第10天采血1次。
（二）血清中抗体滴度测定
1、所采各组小鼠的血液置于室温凝固收缩2小时后，6000rpm离心8分钟，收集上清，即为血清。
2、重组蛋白GP（步骤二的（四）制备）铺板（Nunc酶标板），0.5μg/孔，4℃过夜，用PBST(含体积百分含量0.5%吐温-20)溶液洗板4次，每次5分钟；将板用5g/100ml的脱脂牛奶的PBST(含体积百分含量0.5%吐温-20)溶液37℃封闭2小时，PBST(含体积百分含量0.5%吐温-20)溶液洗板4次，每次5分钟；加入步骤1得到的免疫血清，37℃孵育1小时，PBST(含体积百分含量0.5%吐温-20)溶液洗板4次，每次5分钟；加入HRP标记的Goat anti-mouse IgG抗体，37℃孵育1小时，PBST(含体积百分含量0.5%吐温-20)溶液洗板4次，每次5分钟；100μl/孔加入TMB显色液，室温避光反应15分钟，加入2M硫酸终止反应，OD450读数（仪器为Thermo MULTISCAN FC酶标仪）。
生理盐水1组，pVAX1载体组，pVAX1-GP组，pVAX1-L组，pVAX1-LA组，pVAX1-LM组和pVAX1-LB5组血清中抗体滴度结果如图4所示。
生理盐水2组，GP蛋白组，L蛋白组血清中抗体滴度结果如图5所示。
图4和图5表明，无论采取质粒免疫还是重组蛋白免疫，抗原L诱导的抗体反应水平均与抗原GP诱导的抗体反应水平相当，二者之间无显著性差异。
（三）脾淋巴细胞增殖实验
通过分析淋巴细胞增殖水平，可以判断细胞免疫反应水平。
1、于最后一次免疫后，无菌条件下取GP蛋白组和L蛋白组小鼠的脾脏，按照Mouse1×Lymphocyte Separation Medium的说明，从达优小鼠淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞并制备淋巴细胞悬液（重悬于RPMI1640培养基），按照2.5×105Cell/孔铺96孔板，按100μl/孔加入重组蛋白GP(步骤二的（四）制备)溶液（25μg/ml，溶于RPMI1640培养基）或Concanavalin A(ConA，购自Sigma公司)，每组细胞设置3个复孔，将96孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养72小时。
2、按照CCK-8Kit说明，将WST-8按10μl/孔加入各细胞孔中，继续培养4小时后，测定OD450，计算刺激指数（SI），结果如图6所示。
图6表明，蛋白GP(步骤二的（四）制备)刺激时，L蛋白组SI低于GP蛋白组，表明L蛋白组特异性细胞免疫水平弱于GP蛋白组；Concanavalin A刺激时，L蛋白组SI显著高于GP蛋白组，表明L蛋白组非特异性细胞免疫状态更为活跃，即抗原L能在一定程度上提高机体的细胞免疫反应水平。
蛋白GP作为特异性刺激源，可刺激淋巴细胞产生特异性增殖反应，抗原GP含较多的T细胞表位，能够诱导更强烈的特异性细胞免疫反应，而抗原L含有较少的T细胞表位（无已报道的T细胞表位），故诱导的特异性细胞免疫反应弱于抗原GP；ConA是非特异性刺激源，抗原L可能具有某种上调机体淋巴细胞丝裂原受体表达水平的功能，因此在ConA刺激时，抗原L免疫的小鼠脾淋巴细胞增殖反应较抗原GP更为强烈。
（四）假病毒感染中和实验
采用经典的假型病毒的感染中和实验方法(Arnab Basu,et al.JOURNAL OFVIROLOGY,Apr.2011,p.3106–3119;L.Du,et al.Res.Commun.(2010),doi:10.1016/j.bbrc.2010.05.161)验证抗原片段L诱导产生有效中和抗体的能力，为抗原片段L应用于疫苗或中和抗体的开发提供依据。
具体步骤如下：
1、假病毒包装：293FT细胞以5×105Cell/孔铺6孔板，37℃，5%CO2培养箱培养过夜，至90%融合度。2μg pNL4-3.luc.RE质粒与2μg pVAX1-GP质粒共转染293FT细胞，转染试剂lipofectamine2000（购自Invitrogen公司）。转染48小时后，收集培养上清，0.22μm滤膜过滤分装，即为假病毒溶液。
2、假病毒感染中和实验：于实验前一天，按1×104Cell/孔将293FT细胞铺于96孔板，待到次日生长至80%融合度。将10μl步骤（二）制备的生理盐水1组（图7中的saline），pVAX1载体组，pVAX1-GP组，pVAX1-L组，pVAX1-LA组，pVAX1-LM组和pVAX1-LB组免疫血清与10μl步骤1制备的假病毒溶液混合于1ml DMEM培养基中，37℃孵育2小时得到混合液。将200μl/孔混合液替换96孔板细胞培养基，每组血清设置4个复孔，将96孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24小时后，更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48小时后，按照Bright-Glo Luciferase Assay System说明，使用PerkinElmerEnSpireTM2300MUltiable Reader仪器测定各组发光值，计算假病毒感染抑制率，结果如图7所示。
图7表明，pVAX1载体组的实验结果与生理盐水1组的实验结果无显著性差异。抗原L能够有效诱导中和抗体的产生，对假病毒感染细胞的中和能力与抗原GP相当。抗原L的三个截短体LA、LB及LM也能不同程度地抑制假病毒的感染，即三个截短体也能够产生不同水平的中和抗体。
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Claims (7)

1.一种蛋白或该蛋白的截短体，该蛋白为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQ ID No.3所示的蛋白；
（2）将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
该蛋白的截短体为如下（3）-（8）任一所示：
（3）SEQ ID No.4所示的蛋白；
（4）将SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
（5）SEQ ID No.5所示的蛋白；
（6）将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
（7）SEQ ID No.6所示的蛋白；
（8）将SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白或该蛋白的截短体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下中1）-3）任一所示：
1）SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（1）或（2）所述蛋白质的DNA分子；
3）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（1）或（2）所述蛋白质的DNA分子；
所述截短体的编码基因为如下中4）-12）任一所示：
4）SEQ ID No.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子；
5）在严格条件下与4）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（3）或（4）所述蛋白质的DNA分子；
6）与4）或5）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（3）或（4）所述蛋白质的DNA分子；
7）SEQ ID No.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子；
8）在严格条件下与7）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（5）或（6）所述蛋白质的DNA分子；
9）与7）或8）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（5）或（6）所述蛋白质的DNA分子；
10）SEQ ID No.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
11）在严格条件下与10）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中（7）或（8）所述蛋白质的DNA分子；
12）与10）或11）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1中（7）或（8）所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白或该蛋白的截短体、权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组载体在制备免疫原和/或抗原中的应用；
所述免疫原或抗原是针对埃博拉病毒或埃博拉病毒包膜蛋白GP的。
6.权利要求1所述的蛋白或该蛋白的截短体、权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组载体作为抗原在制备针对埃博拉病毒的抗体中的应用。
7.权利要求1所述的蛋白或该蛋白的截短体、权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组载体在制备预防和/或治疗埃博拉病毒引起的疾病的产品中的应用。
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