CN105622750B - 一种单克隆抗体q314及应用 - Google Patents

一种单克隆抗体q314及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单克隆抗体Q314及应用。本发明保护的单克隆抗体Q314，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45‑52位氨基酸残基、第70‑77位氨基酸残基和第116‑135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45‑52位氨基酸残基、第70‑72位氨基酸残基和第109‑121位氨基酸残基。本发明对于埃博拉病毒扎伊尔亚型的防控具有重大的应用价值。

Description

一种单克隆抗体Q314及应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体Q314及应用。
背景技术
埃博拉病毒是迄今为止人类所知的最致命传染性病毒之一，平均病死率高达50％左右。由于埃博拉出血热的高致死率，以及目前尚未有任何预防或治疗方法可在临床上广泛使用。埃博拉病毒被列为生物安全第四级(Biosafety Level 4)病毒，同时被视为是生物恐怖主义的工具之一。
2014春季年开始在西非各国暴发的埃博拉疫情引起了全世界的广泛关注。截止至2015年2月27日，埃博拉病毒确诊和疑似病例已经达到23825人，死亡人数达到9660人，美国和一些欧洲国家已经有输入性的传播，并有死亡病例。因此，防控埃博拉病毒是全球所有国家的头等大事。然而令所有人焦虑的是：到目前为止还没有一个被批准的埃博拉病毒疫苗和药物上市。由美国和加拿大联合开发的应急性治疗药物ZMapp是目前唯一在模式动物和小规模病人临床验证有效的药物。我国目前尚没有类似的应急药物，一旦有中国公民感染埃博拉病毒，后果不堪设想。紧急研制埃博拉病毒抗体对于我国乃至全球埃博拉病毒疫情的防控具有重要的意义，同时对社会的稳定和谐有着深远的影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体Q314及应用。
本发明保护的单克隆抗体Q314，为一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。
所述重链可为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列3所示的蛋白质。
所述轻链可为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列5自N末端第20-234位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列5所示的蛋白质。
本发明还保护编码所述IgG抗体的基因，其特征在于：
编码所述重链的基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)序列表的序列4自5’末端第889-2313位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列4自5’末端第946-2313位核苷酸所示的DNA分子；
(3)序列表的序列4所示的DNA分子；
编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)或(6)：
(4)序列表的序列6自5’末端第889-1593位核苷酸所示的DNA分子；
(5)序列表的序列6自5’末端第946-1593位核苷酸所示的DNA分子；
(6)序列表的序列6所示的DNA分子。
本发明还保护所述IgG抗体在制备用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应用。
本发明还保护一种用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述IgG抗体。
本发明还保护所述IgG抗体在制备用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应用。
本发明还保护一种用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为所述IgG抗体。
本发明还保护所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血热的药物中的应用。
本发明还保护一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血热的药物，其活性成分为所述IgG抗体。
埃博拉病毒扎伊尔亚型又称扎伊尔埃博拉病毒，英文缩写为EBOV。
本发明利用EBOV的GP△m蛋白作为钓饵，从免疫猴的外周血单个核细胞中筛选抗体生成的记忆B细胞，得到可同GP△m蛋白特异结合的单克隆抗体。通过EBOV假型病毒侵染模型，筛选得到了具有中和活性同时具有良好的特异性的的单克隆抗体。
本发明对于扎伊尔埃博拉病毒的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。
附图说明
图1为抗体对EBOV的中和活性的结果。
图2为抗体对VSV的中和活性的结果。
图3为抗体对HIV的中和活性的结果。
图4为抗体对SUDV的中和活性的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒pcDNA3.1(+)：Invitrogen公司，产品目录号V790-20。293T细胞：盖德，CRL-11268。恒河猴：蓝岛生物。PMD18T载体：Takara，产品目录号D101A。VeroE6细胞：vircell公司，产品目录号VCV6。
质粒pNL4-3R-E-luciferase(骨架质粒)：参考文献:He J,Choe S,Walker R,DiMarzio P,Morgan DO,Landau NR.J Virol 69:6705–6711,1995.。
实施例1、抗体的发现
一、GP△m蛋白的制备
1、构建重组质粒
(1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质，其中开放阅读框为序列2自5’末端第18-1451位核苷酸。序列表的序列1中，自N末端第1至19位氨基酸残基组成信号肽，第472至477位氨基酸残基组成His6标签。序列表的序列1所示的蛋白质的预期分子量为200kDa。
(2)用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切质粒pcDNA3.1(+)，回收约5400bp的载体骨架。
(4)将步骤2回收的酶切产物和步骤3回收的载体骨架连接，得到重组质粒pcDNA3.1-GP△m。根据测序结果，对重组质粒pcDNA3.1-GP△m进行结构描述如下：在质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第11至1453位核苷酸所示的双链DNA分子。
2、构建重组细胞
将步骤1得到的重组质粒转染293T细胞，得到重组细胞。
3、制备GP△m蛋白
(1)取步骤2得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4000rpm离心30min，收集上清液。
(2)亲和层析
亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；
亲和层析的柱填料：镍柱beads(购自Qiagen公司，产品目录号为30230)；
操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育3小时；②用100mL含20mM咪唑的上样缓冲液洗涤柱子；③用30mL含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。上样缓冲液即HEPEs buffer。
(3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，用30kD浓缩管(购自Merck公司，产品目录号为UFC800396)进行浓缩，得到体积为1ml的浓缩液。
(4)凝胶过滤层析
凝胶过滤层析的层析柱规格：长度24cm，内径2cm；
凝胶过滤层析的柱填料：superdex200increase 10/300GL(购自GEHealthcare公司，产品目录号为28-9909-44)；
操作步骤：上样0.5ml步骤(3)得到的浓缩液，用流速为0.5ml/min的PBS缓冲液(pH7.2、10mM)洗脱，收集保留体积为11ml的峰对应的过柱后溶液，即为GP△m蛋白溶液。
二、从与GP△m蛋白特异结合的menory B细胞中分离抗体可变区基因
1、将GP△m蛋白作为免疫原免疫恒河猴，然后取外周血并分离单个核细胞(PBMC)。
2、采用流式细胞仪分选能够特异性识别GP△m蛋白的B细胞(CD3-CD16-CD235a-CD19+CD27+CD38-IgG+GP△m BCR+)。
3、取步骤2得到的B细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
4、以步骤3得到的cDNA为模板，进行巢式PCR，将PCR扩增产物进行测序。
获得重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列。
三、获得抗体基因
将重链可变区上游与CMV片段、重链可变区下游与人IgG1的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整重链的DNA片段。
将抗体轻链可变区上游与CMV片段、抗体轻链可变区下游与轻链κ/λ的恒定区以及ployA片段，进行overlapping PCR，得到可以表达完整轻链的DNA片段。
Q314全长重链的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。序列表的序列3中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至144位氨基酸残基组成重链可变区，第145至474位氨基酸残基组成重链恒定区。序列表的序列4中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至2313位核苷酸编码序列表的序列3所示的全长重链，第2314至2511位核苷酸为ployA片段。
Q314全长轻链的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示。序列表的序列5中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至128位氨基酸残基组成轻链可变区，第129位至234位氨基酸残基组成轻链恒定区。序列表的序列6中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889至1593位核苷酸编码序列表的序列5所示的全长轻链，第1594至1741位核苷酸为ployA片段。
实施例2、抗体的制备
一、重组质粒的构建
将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到重链表达载体。
将序列表的序列6所示的双链DNA分子插入PMD18T载体，得到轻链表达载体。
二、重组细胞的构建
将重链表达载体和轻链表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞。
三、抗体的制备
1、取步骤二得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。
2、亲和层析
亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；
亲和层析的柱填料：protein A beads(Thermo，产品目录号10006D)；
操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16小时；②用60ml结合缓冲液洗涤柱子；③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。
结合缓冲液：取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1L，用氢氧化钠调pH至8.0。
洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调pH至3.0。
3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液(pH7.2、10mM)，得到1ml蛋白浓度为2mg/ml的抗体溶液。
实施例3、抗体的效果
一、EBOV假病毒的制备
1、将人工合成的序列表的序列8所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA3.1-GP△muc。序列表的序列8所示的双链DNA分子编码序列表的序列7所示的蛋白质(EBOV的GP△muc蛋白)。
2、将重组质粒pcDNA3.1-GP△muc和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到重组细胞。
质粒pNL4-3R-E-luciferase中含有HIV-1病毒基因组的全部基因(与野生HIV-1病毒基因组的差异仅在于envelope基因发生了移码)。重组质粒pcDNA3.1-GP△muc和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染宿主细胞，可以表达EBOV假病毒。EBOV假病毒只有病毒颗粒表面的膜蛋白是GP△muc蛋白，其他均为HIV-1病毒的成分，只能在被感染的细胞中复制基因组并表达荧光素酶报告基因，不能再产生有感染性的病毒颗粒。GP△muc蛋白与EBOV的GP蛋白相比，差异仅在于缺失了一段mucin-like domain区域，缺失此区域能明显提高假病毒进入易感细胞的能力。
3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
4、完成步骤3后，取培养上清，即为EBOV假病毒的病毒液(简称EBOV病毒液)。
5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测EBOV病毒液中的病毒滴度。
二、单克隆抗体的中和活性检测
1、取实施例2制备的抗体溶液，用PBS缓冲液(pH7.2、10mM)进行倍比稀释，得到抗体稀释液。
2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升EBOV病毒液，使得混合体系中的抗体浓度为50μg/ml、16.67μg/ml、5.56μg/ml、1.85μg/ml、0.62μg/ml、0.21μg/ml、0.07μg/ml或0.02μg/ml(以蛋白浓度计)，37℃静置孵育1小时。用等体积PBS缓冲液(pH7.2、10mM)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的DMEM培养基代替EBOV病毒液，作为细胞对照。
3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升VeroE6细胞悬液(用于制备细胞悬液的溶剂为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞悬液中的VeroE6细胞浓度为2×105个细胞/ml)，37℃静置孵育64小时。
4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微格拉斯生物技术，货号T003，按说明书操作)，37℃静置孵育5分钟。
5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。
荧光强度结果见表1(每个处理设置三个复孔，表1的第二列、第三列和第四列分别列出了三个复孔各自的值)。
表1荧光强度的结果
病毒对照 453716 416989 515392
细胞对照 955 1081 1105
抗体浓度为0.02μg/ml 364894 394164 435084
抗体浓度为0.07μg/ml 285880 452374 372691
抗体浓度为0.21μg/ml 276280 344517 349392
抗体浓度为0.62μg/ml 165486 226710 239484
抗体浓度为1.85μg/ml 88493 114894 106588
抗体浓度为5.56μg/ml 53684 46488 62804
抗体浓度为16.67μg/ml 37203 31339 37770
抗体浓度为50μg/ml 27627 18904 28058
中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]×100％。
中和活性的结果见图1。
利用Prism 5软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的IC50值，抗体的IC50值为0.78μg/ml。
实施例4、抗体的特异性
一、VSV假病毒的制备(VSV即疱疹性口炎病毒)
1、将人工合成的序列表的序列9所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列9所示的双链DNA分子编码VSV的壳G糖蛋白。
2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到重组细胞。
3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
4、完成步骤3后，取培养上清，即为VSV假病毒的病毒液(简称VSV病毒液)。
5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测VSV病毒液中的病毒滴度。
二、HIV假病毒的制备
1、将人工合成的序列表的序列10所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列10所示的双链DNA分子编码HIV-1CNE30的GP蛋白。
2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到重组细胞。
3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
4、完成步骤3后，取培养上清，即为HIV假病毒的病毒液(简称HIV病毒液)。
5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测HIV病毒液中的病毒滴度。
三、SUDV假病毒的制备(SUDV即埃博拉病毒苏丹亚型)
1、将人工合成的序列表的序列11所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒。序列表的序列11所示的双链DNA分子编码SUDV的GP△muc蛋白。
2、将步骤1得到的重组质粒和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到重组细胞。
3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。
4、完成步骤3后，取培养上清，即为SUDV假病毒的病毒液(简称SUDV病毒液)。
5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测SUDV病毒液中的病毒滴度。
四、单克隆抗体的中和活性检测
用VSV病毒液、HIV病毒液或SUDV病毒液代替EBOV病毒液，其它同实施例3的步骤二。
抗体对VSV病毒的中和活性的结果见图2。
抗体对HIV病毒的中和活性的结果见图3。
抗体对SUDV病毒的中和活性的结果见图4。
结果表明，实施例二制备的抗体溶液对VSV病毒、HIV病毒和SUDV病毒的中和活性均为20％以下，为阴性结果。

Claims (9)

1.一种IgG抗体，由轻链和重链组成；所述重链中的重链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列3自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-77位氨基酸残基和第116-135位氨基酸残基；所述轻链中的轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3依次为序列表的序列5自N末端第45-52位氨基酸残基、第70-72位氨基酸残基和第109-121位氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的IgG抗体，其特征在于：
所述重链为如下(a)或(b)：(a)序列表的序列3自N末端第20-474位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)序列表的序列3所示的蛋白质；
所述轻链为如下(c)或(d)：(c)序列表的序列5自N末端第20-234位氨基酸残基组成的蛋白质；(d)序列表的序列5所示的蛋白质。
3.编码权利要求2所述IgG抗体的基因，其特征在于：
编码所述重链的基因为如下(1)或(2)：
(1)序列表的序列4自5’末端第889-2313位核苷酸所示的DNA分子；
(2)序列表的序列4自5’末端第946-2313位核苷酸所示的DNA分子；
编码所述轻链的基因为如下(4)或(5)：
(4)序列表的序列6自5’末端第889-1593位核苷酸所示的DNA分子；
(5)序列表的序列6自5’末端第946-1593位核苷酸所示的DNA分子。
4.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应用。
5.一种用于抑制埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG抗体。
6.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物中的应用。
7.一种用于中和埃博拉病毒扎伊尔亚型的药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG抗体。
8.权利要求1或2所述IgG抗体在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血热的药物中的应用。
9.一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒扎伊尔亚型引起的埃博拉出血热的药物，其活性成分为权利要求1或2所述IgG抗体。
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