CN106318910A - 可用于抗病毒药物筛选的埃博拉病毒复制子模型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可用于抗病毒药物筛选的埃博拉病毒复制子模型及其应用。在该埃博拉病毒复制子模型中能够稳定的复制产生埃博拉病毒迷你基因组，因而能够简单、方便的用于筛选抑制埃博拉病毒的药物。

Description

可用于抗病毒药物筛选的埃博拉病毒复制子模型及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种可用于抗病毒药物筛选的埃博拉病毒复制子模型及其应用。

背景技术

埃博拉病毒(Ebola virus)属纤维病毒科(Filoviridae)，是单负链RNA病毒。是可以引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热的烈性传染病，致死率可高达90％，目前尚无实用的治疗药物或疫苗。埃博拉病毒自1976年首次在非洲被发现以来已经爆发多次疫情。自2013年12月爆发的疫情是史上最严重的一次，截至2015年5月10日，世界卫生组织及多国政府共录得26,759宗感染个案，其中11,070例感染者死亡。

埃博拉的复制子系统可用于研究病毒的复制机制和抗病毒药物筛选工作(Jasenosky,Neumann et al.2010；Uebelhoer,Albarino et al.2014)。目前已经建立的迷你复制子系统基于质粒共转染，操作复杂，且不利于大规模药物筛选工作。现有的埃博拉迷你复制子系统的构建过程大概如下：

首先，构建埃博拉迷你基因组报告系统，该报告系统含有T7启动子序列，经体外转录，或者和T7聚合酶共转染细胞，能够得到迷你基因组报告系统RNA。然后，分别构建表达不同埃博拉病毒蛋白的表达载体。最后，将上述各埃博拉病毒蛋白表达质粒连同迷你报告系统RNA共转染，或者各质粒连同迷你报告系统DNA以及T7聚合酶的表达质粒共转染到细胞中(可以是Vero，293T，BHK等细胞)。在转染后1-4天内通过检测报告基因的表达来反应埃博拉病毒转录及复制。

因此，其操作繁琐，耗时长，多质粒转染重复性差，而且无法实现埃博拉病毒在细胞内的长期稳定复制。本领域技术人员致力于开发一种能够便捷使用，而且能够稳定持续性复制的埃博拉迷你复制子系统以进行药物筛选或埃博拉致病机理研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于抗病毒药物筛选的埃博拉病毒复制子模型及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种制备埃博拉病毒复制子系统的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一包装细胞

所述包装细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；

(2)提供埃博拉病毒迷你基因组的多核苷酸，并将所述多核苷酸转染入所述包装细胞中，制得所述埃博拉病毒复制子系统，

其中，所述迷你基因组的多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。

在另一优选例中，所述系统能够稳定转录、复制埃博拉病毒迷你基因组。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒的多核苷酸为DNA、或RNA，优选为RNA，更优选为反义RNA。

在另一优选例中，所述报告基因连接于所述埃博拉基因组编码区的3'端和/或5'端。

在另一优选例中，所述报告基因为荧光标记基因(优选为Gluc标记、GFP标记)。

在另一优选例中，所述迷你基因组多核苷酸还包括抗性标记(优选为抗潮霉素抗性标记)。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒VP30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒VP35蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

在另一优选例中，所述包装细胞基因组中整合有编码选自下组的蛋白的多核苷酸：所述埃博拉病毒L蛋白、所述埃博拉病毒NP蛋白、所述埃博拉病毒VP30蛋白、和所述埃博拉病毒VP35蛋白。

在另一优选例中，编码所述埃博拉病毒L蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.:1所示。

在另一优选例中，编码所述埃博拉病毒NP蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.:3所示。

在另一优选例中，编码所述埃博拉病毒VP30蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.:5所示。

在另一优选例中，编码所述埃博拉病毒VP35蛋白的多核苷酸序列如SEQ IDNO.:7所示。

在另一优选例中，所述埃博拉病毒的迷你基因组多核苷酸为RNA，优选地其序列如SEQ ID NO.:13、或14所示。

在另一优选例中，所述包装细胞为肝细胞，优选为Huh7细胞系。

在另一优选例中，所述步骤(1)包含如下步骤：

(a)构建稳定表达埃博拉病毒L蛋白的细胞系；

(b)在步骤(a)构建的细胞系中通过慢病毒载体分别转导埃博拉病毒NP、VP30和VP35蛋白，从而得到稳定表达埃博拉病毒L蛋白、NP蛋白、VP30蛋白和VP35蛋白的细胞系，即为所述包装细胞。

在另一优选例中，所述步骤(a)中，将表达埃博拉病毒L蛋白的基因克隆到pCNDA3.1载体上，转染到细胞中，从而获得所述稳定表达埃博拉病毒L蛋白的细胞系。

本发明的第二方面，提供了一种分离的细胞，所述细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；并且所述细胞中具有埃博拉病毒迷你基因组多核苷酸；

其中，所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒调控复制、转录所需的非编码区序列和报告基因。

在另一优选例中，所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。

在另一优选例中，所述细胞能够稳定复制所述埃博拉病毒迷你基因组。

在另一优选例中，所述博拉病毒迷你基因组多核苷酸为DNA、或RNA。

本发明的第三方面，提供了一种筛选抑制埃博拉病毒复制的药物的方法，所述方法包括步骤：

(a)使用权利要求1所述的方法制备埃博拉病毒复制子系统；

(b)向所述埃博拉病毒复制子系统中添加待筛选的化合物；

(c)检测所述埃博拉病毒复制子系统中报告基因的表达水平。

在另一优选例中，所述筛选为高通量筛选。

本发明的第四方面，提供了如本发明第二方面所述的细胞的用途，用于筛选抑制埃博拉病毒的药物。

本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(i)包装细胞；和

(ii)埃博拉病毒迷你基因组多核苷酸；

其中，所述包装细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；

所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了RT-PCR鉴定Huh7-4P细胞系。

图2显示了电转后不同时间收取上清检测报告基因Gluc表达和细胞内埃博拉病毒迷你基因组系统RNA表达水平。

图3显示了本发明的埃博拉迷你复制子系统能够稳定的复制。

图4显示了shNP1可以有效抑制埃博拉病毒迷你复制子系统报告基因表达。

图5显示了筛选出的具有埃博拉病毒抑制活性的化合物。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种支持埃博拉病毒稳定复制的埃博拉病毒复制子系统，实验结果表明，在该埃博拉病毒复制子系统中能够稳定的复制产生埃博拉病毒迷你基因组，因而能够简单、方便的用于筛选抑制埃博拉病毒的药物，在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

埃博拉病毒

埃博拉病毒(Ebola)属于纤维病毒科程长丝状体。在病毒粒子中心结构的核壳蛋白由螺旋状缠绕之基因体RNA与核壳蛋白质以及蛋白质病毒蛋白VP35、VP30、L组成，病毒包含的糖蛋白从表面深入病毒粒子10纳米长，另外10纳米则向外突出在套膜表面，而这层套膜来自宿主的细胞膜，在套膜与核壳蛋白之间的区域，称为基质空间，由病毒蛋白VP40和VP24组成。

每个病原体是由链状的负链核糖核酸病毒粒子构成。埃博拉病毒的基因组中具有18595个碱基，3'端没有多聚腺苷酸化，5'端也没有加帽(capping)。基因组编码七个结构蛋白和一个非结构蛋白。基因顺序是：3'端一NP—VP35-VP40-GP-VP30一VP24一L一5'端，两端的非编码区含有重要的信号以调节病毒的转录、复制和新病毒颗粒的包装。如果缺少相应的蛋白，单基因组本身并不具备感染性，其中一种蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，是病毒基因组转录成信使RNA所必须的酶，它对病毒基因组的复制也有重要作用。其所编译的蛋白中，NP是核衣壳蛋白，VP30和VP35是病毒结构蛋白，VP35具有抗I型干扰素作用，GP是跨膜糖蛋白，与病毒的入侵过程及细胞毒性有关，VP24和VP40与病毒的成熟释放有关，前者是小型膜蛋白，后者是病毒基质蛋白。

埃博拉病毒迷你基因组

埃博拉迷你基因组包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及埃博拉病毒基因组5’末端非编码区。在补充了埃博拉病毒复制复合体所需的L，NP，VP35和VP30四种蛋白后迷你基因组可以在细胞内转录，复制。

在本发明的优选地实施方式中，所述埃博拉病毒基因组3’末端核苷酸序列如下：

atagttattcgcacacaaaagatcctaaaaattcttctttctttttgtgtgtccg(SEQ IDNO.:9)。

在本发明的优选地实施方式中，所述NP基因5’UTR区域核苷酸序列如下：

actcggaattttgtgattccgagcaatttgtcttttaactatttccaatgttttaccccaagctttagggttgttgaatcttcaatcccctaagtgttcaagttcaaaaccaaggttaattctcaatcttgcttgtttgactgtgaactaatgctgtcctttaacaataatgtttctattaaggttgttggatcaccctgcagagtctgaggtggaacttgtgatgtgataagacctaggtgttgacaagggattttcaactgagcacactgatgcccttgctcccttcggagacctaggttgttctctatctttgtgatgtggctctgaaacaaaccaggtgtgattacagtaacaatttcaatttaaattccgatataaatttcaatgagaggaaaattattaatcttcctc(SEQ ID NO.:10)。

在本发明的优选地实施方式中，所述L基因3’UTR区域核苷酸序列如下：

ttttttataatctgtatgttaataaccaacctttgcaagtatcaggatactatgcacggtaat(SEQ ID NO.:11)。

在本发明的优选地实施方式中，所述埃博拉病毒基因组5’末端非编码区核苷酸序列如下：

tggacacacaaaaaagaagaaatagatttatttttaaatttttgtgtgcgaccatttttccag gaatcctttttgcaacgtttattctggcgagccttctgatgagcgtggtcaatgtcttaattatcat taacacgaagattattatctagtctgctatattgtaaagaaggtatttctgattttacagtcctgcc ttttcttttaattttatcattctgtatgaaatagtagcttactagacaaaaatgttaaggttattac acctaatctcttattttacacaaagattaaggctatcaccgtttttaaaacgacaaattaaagtaat gataattataaaaaacttaatcttaaagatcaattttgttttaagaagttgtgttatcaaccaaaac actattccatctgacaggatattgatacaacattattatatcaataacaatatgagcccagaccttt cgttaaagcttaattataaagagtgcagagtttattatgttgcgttaaattcattgcggcagtaata tgtcacacatgctgcattgtgaattttttgattatcacgcagggagagaggctaaatatagtatata atatagggactcctttcgttatttaaatagttgtttattgagattagatcaatatgatgtatgagag caatttatgag(SEQ ID NO.:12)。

在本发明优选地实施方式中，本发明的埃博拉病毒迷你基因组序列结构如下：病毒基因组5’末端非编码区－L基因3’UTR区域－报告基因－NP基因5’UTR区域－埃博拉病毒基因组3’末端。

埃博拉病毒复制子系统

本发明中埃博拉病毒的迷你复制子系统是指能够稳定复制埃博拉迷你基因组的细胞系。可以模拟埃博拉病毒在细胞中的增殖过程，但是不具有感染毒性。因此，能够广泛用于埃博拉病毒的研究，特别是用于高通量的筛选抗埃博拉病毒的药物。

为构建支持埃博拉病毒复制的稳定细胞系，本发明人首先构建了Huh7稳定表达埃博拉病毒L蛋白的细胞系，命名为Huh7-L。接下来在Huh7-L细胞中通过慢病毒载体pLVX转导埃博拉病毒NP，VP30和VP35蛋白，得到稳定表达这四种埃博拉蛋白的细胞系，命名为Huh7-4P。

在本发明优选的埃博拉病毒L蛋白的氨基酸序列如下：

matqhtqypdarlsspivldqcdlvtracglyssyslnpqlrncklpkhiyrlkydvtvtkflsdvpvatlpidfivpvllkalsgngfcpveprcqqfldeiikytmqdalflkyylknvgaqedcvdehfqekilssiqgneflhqmffwydlailtrrgrlnrgnsrstwfvhddlidilgygdyvfwkipismlplntqgiphaamdwyqasvfkeavqghthivsvstadvlimckdlitcrfnttliskiaeiedpvcsdypnfkivsmlyqsgdyllsilgsdgykiikfleplclakiqlcskyterkgrfltqmhlavnhtleeitemralkpsqaqkirefhrtlirlemtpqqlcelfsiqkhwghpvlhsetaiqkvkkhatvlkalrpivifetycvfkysiakhyfdsqgswysvtsdrnltpglnsyikrnqfpplpmikellwefyhldhpplfstkiisdlsifikdratavertcwdavfepnvlgynpphkfstkrvpeqfleqenfsienvlsyaqkleyllpqyrnfsfslkekelnvgrtfgklpyptrnvqtlcealladglakafpsnmmvvtereqkesllhqaswhhtsddfgehatvrgssfvtdlekynlafryeftapfieycnrcygvknvfnwmhytipqcymhvsdyynpphnltlenrdnppegpssyrghmggieglqqklwtsiscaqislveiktgfklrsavmgdnqcitvlsvfpletdadeqeqsaednaarvaaslakvtsacgiflkpdetfvhsgfiyfgkkqylngvqlpqslktatrmaplsdaifddlqgtlasigtafersisetrhifpcritaafhtffsvrilqyhhlgfnkgfdlgqltlgkpldfgtislalavpqvlgglsflnpekcfyrnlgdpvtsglfqlktylrmiemddlflpliaknpgnctaidfvlnpsglnvpgsqdltsflrqivrrtitlsaknklintlfhasadfedemvckwllsstpvmsrfaadifsrtpsgkrlqilgylegtrtllaskiinnntetpvldrlrkitlqrwslwfsyldhcdnilaealtqitctvdlaqilreyswahilegrpligatlpcmieqfkvfwlkpyeqcpqcsnakqpggkpfvsvavkkhivsawpnasriswtigdgipyigsrtedkigqpaikpkcpsaalreaielasrltwvtqgssnsdllikpflearvnlsvqeilqmtpshysgnivhryndqysphsfmanrmsnsatrlivstntlgefsgggqsardsniifqnvinyavalfdikfrnteatdiqynrahlhltkcctrevpaqyltytstldldltryreneliydsnplkgglncnisfdnpffqgkrlniieddlirlphlsgwelaktimqsiisdsnnsstdpissgetrsftthfltypkigllysfgafvsyylgntilrtkkltldnflyylttqihnlphrslrilkptfkhasvmsrlmsidphfsiyiggaagdrglsdaarlflrtsissfltfvkewiinrgtivplwivyplegqnptpvnnflyqivellvhdssrqqafkttisdhvhphdnlvytckstasnffhaslaywrsrhrnsnrkylardsstgsstnnsdghiersqeqttrdphdgternlvlqmsheikrttipqenthqgpsfqsflsdsacgtanpklnfdrsrhnvkfqdhnsaskreghqiishrlvlpfftlsqgtrqltssnesqtqdeiskylrqlrsvidttvycrftgivssmhykldevlweiesfksavtlaegegagallliqkyqvktlffntlatessieseivsgmttprmllpvmskfhndqieiilnnsasqitditnptwfkdqrarlpkqvevitmdaetteninrsklyeavyklilhhidpsvlkavvlkvflsdtegmlwlndnlapffatgylikpitssarssewylcltnflsttrkmphqnhlsckqviltalqlqiqrspywlshltqyadcelhlsyirlgfpslekvlyhrynlvdskrgplvsitqhlahlraeireltndynqqrqsrtqtyhfirtakgritklvndylkfflivqalkhngtwqaefkklpelisvcnrfyhirdcnceerflvqtlylhrmqdsevklierltgllslfpdglyrfd*(SEQ ID NO.:2)；

优选地其编码多核苷酸序列如下：

atggcaactcagcatacccagtacccagatgcaagactctcctcaccaatcgtcctcgaccagtgcgacctcgtcacaagggcctgcggcctgtacagctcctatagcctgaatccacagctcaggaactgcaagctgcccaaacacatctacagactgaagtatgacgtgactgtcaccaaatttctgtccgatgtgccagtcgcaacactgcccatcgacttcattgtgcctgtcctgctcaaagccctgtctggaaacgggttttgcccagtggagcccaggtgtcagcagttcctggatgaaatcattaagtacaccatgcaggacgccctcttcctgaagtactatctgaaaaacgtcggtgctcaggaggactgcgtggatgagcactttcaggaaaagattctgtctagtatccagggcaatgagttcctgcatcagatgttcttttggtatgatctcgccatcctgaccaggagaggaaggctgaatagagggaactcaagaagcacatggtttgtgcacgacgatctgatcgacattctcggttacggcgattatgtcttctggaagatccctatttctatgctcccactgaacacacagggaatcccacatgccgctatggactggtaccaggccagcgtcttcaaggaggctgtgcaggggcacacacatatcgtgtccgtctctactgccgacgtgctgatcatgtgcaaggatctcattacctgtaggtttaacaccacactgatctccaaaattgctgagatcgaagaccccgtgtgctctgattatccaaatttcaagatcgtctcaatgctgtaccagagcggagattatctgctctcaattctggggagcgacggttacaagatcatcaagttcctggagcccctctgcctggctaagatccagctgtgctccaagtatacagaacggaaagggcgcttcctgactcagatgcatctcgcagtgaaccacactctggaggaaatcaccgagatgagagcactgaagccttctcaggcccagaaaatcagggaatttcacagaaccctcattcggctggagatgacacctcagcagctctgcgaactgttctccatccagaagcattggggccacccagtgctgcactctgagaccgccattcagaaggtcaagaaacatgccacagtgctcaaagctctgcggccaatcgtcatttttgaaacctactgcgtgttcaagtattctatcgctaaacactactttgattcacagggtagctggtattccgtgacatctgacaggaatctgactccaggcctcaacagctacattaagagaaatcagttccctcccctgcccatgatcaaagagctgctctgggagttctaccatctggatcacccacccctctcagcacaaagatcattagtgacctgtcaatcttcatcaaggatcgcgctacagcagtggagcgaacttgctgggacgccgtctttgaacccaatgtgctgggatacaaccctccacacaagttctccaccaaaagggtgcctgagcagtttctggagcaggaaaatttctcaatcgagaacgtcctgagctatgctcagaagctcgaatacctgctcccacagtatagaaacttcagtttttcactgaaggagaaagaactcaatgtggggaggaccttcggcaagctgccttacccaacccgaaacgtccagaccctgtgcgaggccctgctcgctgatggactggcaaaggctttcccctccaatatgatggtggtcaccgagcgggaacagaaagagtctctgctccaccaggcttcctggcaccatacatctgacgattttggcgagcatgcaaccgtccgcggctcaagcttcgtgacagacctggaaaaatacaacctcgctttccgatatgagtttaccgcaccattcattgaatactgcaataggtgttatggcgtcaagaacgtgttcaactggatgcattacaccatcccccagtgctatatgcacgtgagcgattactataatccccctcataacctcacactggagaatcgcgacaacccacccgaaggaccctcctcttaccgagggcacatgggcggaatcgagggactgcagcagaagctctggactagcatttcctgcgctcagatcagtctggtggaaattaagaccggcttcaagctgcggtcagcagtcatgggggacaaccagtgtatcactgtcctgagcgtgttcccactcgagaccgacgccgatgagcaggaacagagtgctgaagataacgcagcccgcgtcgctgcatccctggcaaaagtgacttctgcctgcggaatctttctgaaacccgacgagaccttcgtgcactccggcttcatctactttggcaagaaacagtatctgaacggggtgcagctgcctcagagtctcaagacagctactcggatggcaccactgtcagacgccatctttgacgatctgcagggtaccctcgcttccatcggcacagcattcgagaggtctattagtgaaaccagacacatctttccttgtcggattactgccgctttccataccttcttttctgtgcgcatcctgcagtaccaccatctcggctttaacaagggattcgatctggggcagctcacactgggaaaacctctggacttcgggactatcagtctcgcactggcagtcccacaggtcctcggaggtctgtcatttctcaaccctgagaagtgcttctacaggaatctgggtgacccagtgacttctggcctgtttcagctcaaaacctatctgagaatgatcgagatggacgatctcttcctgcccctcattgctaagaatcctggaaactgtactgcaatcgattttgtcctgaatccaagcggactcaacgtgcccgggagtcaggacctgacctcattcctcaggcagatcgtgcggcgcaccattacactgagcgccaagaacaagctgatcaacaccctctttcacgcttccgcagacttcgaggatgaaatggtgtgcaagtggctgctcagttcaacacctgtcatgtctaggtttgcagccgacatcttctcccgcactccatctggcaagcgactgcagattctcggttacctggagggcactagaaccctgctcgccagcaagatcattaacaataacacagaaactcctgtgctcgatcgactgaggaaaatcaccctgcagagatggagtctctggttctcatacctggaccactgcgataacatcctggccgaggctctcacacagattacctgtacagtggacctggcacagatcctcagggagtatagctgggcccatatcctcgaaggtagacccctgattggcgccaccctcccttgcatgatcgagcagttcaaggtgttttggctgaaaccctacgaacagtgccctcagtgttccaacgcaaagcagcccggcggaaaacctttcgtgtctgtcgccgtgaagaaacacatcgtgagtgcctggccaaacgctagcagaatttcctggacaatcggagatgggattccatatatcggaagccggactgaggacaagatcgggcagcccgccattaagcctaaatgtccaagcgccgccctgcgagaggcaattgaactggcctccaggctcacctgggtgacacaggggagctccaacagcgatctgctcatcaagccctttctggaggctcgggtcaatctctccgtgcaggaaatcctgcagatgactccatctcattacagtggcaacattgtgcaccgctacaatgaccagtattcaccccacagcttcatggcaaataggatgtcaaacagcgccaccagactgatcgtgagtactaacaccctgggcgagttttcagggggtggccagagcgccagagactccaatatcattttccagaatgtcatcaactacgcagtggccctgtttgatatcaagttcaggaacactgaggccaccgacatccagtataatcgcgctcacctgcatctcaccaagtgctgtacacgagaagtgcctgctcagtacctgacatatacttccaccctggacctcgatctgaccagataccgggagaacgaactgatctatgatagcaatcccctgaagggagggctcaattgcaacatttccttcgacaaccctttctttcagggtaaacgactgaatatcattgaggacgatctcatcaggctgccacacctctctggctgggaactggccaagacaattatgcagagtatcatttccgactctaataactctagtacagatcctatctcaagcggcgagactcggagctttactacccatttcctgacctacccaaagattggactgctctatagtttcggggccttcgtgagctactatctgggaaacactatcctccgcaccaagaaactcacactggataacttcctgtactatctcacaactcagattcataatctgccccaccgatccctgaggatcctcaagcctacctttaaacacgcctccgtgatgtctcggctgatgagcatcgacccccatttctccatctacattggtggagcagctggcgaccgaggactgtcagatgcagcacgactcttcctgcgaactagcatctcctctttcctgacctttgtgaaggagtggatcattaacaggggtactatcgtccctctctggatcgtgtacccactggagggccagaatcccacccctgtgaataactttctgtatcagattgtcgaactgctcgtgcacgacagttcaagacagcaggccttcaaaaccacaatcagcgaccacgtccatccccacgataacctggtgtacacttgtaagagtaccgcttcaaatttctttcacgcatccctggcctactggcgcagccgacataggaacagcaaccggaagtatctggcccgcgatagctccacaggttctagtactaataactctgacggccacatcgagcggagtcaggaacagactacccgcgaccctcatgatggcaccgagcggaacctcgtgctgcagatgtcccacgagatcaagcgcacaactattcctcaggaaaatactcatcagggaccaagctttcagtcctttctgagtgactcagcttgcgggaccgcaaatcccaagctgaactttgatagatctcggcataacgtgaagttccaggaccacaatagcgcctccaaacgcgagggacatcagatcatttcacaccgactcgtgctgcctttctttacactgagccaggggaccaggcagctgacatcaagcaacgagtcacagactcaggatgaaattagcaagtacctgagacagctccggagcgtcatcgacaccacagtgtactgtaggttcaccgggatcgtgagctctatgcactataagctggatgaggtcctctgggagattgaatctttcaaaagtgccgtgacactggctgagggtgaaggcgctggagcactgctcctgatccagaagtaccaggtgaaaactctgttctttaacacactcgccactgagagttcaattgagtctgaaatcgtgagtggcatgactaccccacggatgctcctgcccgtcatgtctaagtttcacaacgaccagatcgagatcattctgaataattctgctagtcagattaccgatatcacaaatcccacttggttcaaggaccagcgcgcccgactgcctaaacaggtcgaagtgatcaccatggatgctgagacaactgaaaatatcaacaggtccaagctgtacgaagccgtgtataaactcattctgcaccatatcgacccctctgtcctgaaggctgtggtcctgaaagtgttcctcagtgatacagagggaatgctctggctgaatgacaacctggcaccattctttgccaccgggtacctgattaagcccatcacaagctccgcccgctctagtgagtggtatctctgcctgaccaacttcctgtcaaccacacgaaagatgcctcatcagaatcacctgagctgtaaacaggtcatcctgacagcactccagctgcagattcagaggtctccatactggctgagtcacctcactcagtatgccgactgcgagctccatctgagctacatcagactgggcttcccctccctggaaaaggtcctctaccacagatataacctggtggattccaaacggggacctctggtctctatcacccagcatctggctcacctcagggcagagattagagaactgacaaatgactacaaccagcagcgccagtcccgaacacagacttatcactttatccgaactgccaaggggaggattaccaaactggtgaacgactacctgaagttctttctcatcgtccaggctctgaaacataatggcacatggcaggcagagttcaagaaactgcctgaactcatcagcgtgtgcaacaggttctaccacattcgggattgcaattgtgaggaaagattcctggtgcagaccctctatctgcatcggatgcaggactccgaggtcaagctgattgaacgactcactgggctcctctcactcttccccgacggactctacagatttgactga(SEQ ID NO.:1)。

在本发明优选的埃博拉病毒NP蛋白的氨基酸序列如下：

mdsrpqkiwmapsltesdmdyhkiltaglsvqqgivrqrvipvyqvnnleeicqliiqafeagvdfqesadsfllmlclhhayqgdyklflesgavkyleghgfrfevkkrdgvkrleellpavssgknikrtlaampeeetteanagqflsfaslflpklvvgekaclekvqrqiqvhaeqgliqyptawqsvghmmvifrlmrtnflikfllihqgmhmvaghdandavisnsvaqarfsgllivktvldhilqktergvrlhplartakvknevnsfkaalsslakhgeyapfarllnlsgvnnlehglfpqlsaialgvatahgstlagvnvgeqyqqlreaateaekqlqqyaesreldhlglddqekkilmnfhqkkneisfqqtnamvtlrkerlaklteaitaaslpktsghydddddipfpgpindddnpghqdddptdsqdttipdvvvdpddgsygeyqsysengmnapddlvlfdldeddedtkpvpnrstkggqqknsqkgqhiegrqtqsrpiqnvpgphrtihhasapltdndrrnepsgstsprmltpineeadplddaddetsslpplesddeeqdrdgtsnrtptvappapvyrdhsekkelpqdeqqdqdhtqearnqdsdntqsehsfeemyrhilrsqgpfdavlyyhmmkdepvvfstsdgkeytypdsleeeyppwltekeamneenrfvtldgqqfywpvmnhknkfmailqhhq*(SEQ ID NO.:4)；

优选地其编码多核苷酸序列如下：

atggactcaagacctcagaagatttggatggcaccctccctcacagaatcagacatggactatcataagatcctcaccgctgggctgtctgtgcagcagggaatcgtccggcagcgcgtcattcccgtgtatcaggtcaacaacctggaggaaatttgccagctgatcattcaggccttcgaggctggcgtggattttcaggaaagcgccgactccttcctgctcatgctgtgcctccaccatgcttatcagggcgattacaagctgttcctggagagcggagccgtgaaatacctggaggggcacggtttccgatttgaagtgaagaaacgggacggggtcaagcgcctggaggaactgctcccagctgtgagctccggcaagaacatcaaaagaaccctggccgctatgcccgaggaagagaccacagaggcaaatgccggccagttcctgtcttttgcaagtctgttcctccccaagctcgtggtcggagagaaggcttgcctggaaaaagtgcagagacagatccaggtccacgctgagcagggcctgattcagtatcctactgcatggcagagcgtgggacacatgatggtcattttccgactcatgaggaccaacttcctgatcaagtttctgctcattcaccaggggatgcacatggtggccggtcacgatgcaaacgacgccgtgatctccaattctgtcgctcaggcacggttttccgggctgctcatcgtgaagaccgtcctggaccacattctccagaaaacagagagaggtgtgcggctgcatcctctcgctcgcactgcaaaggtgaaaaacgaggtcaatagtttcaaggcagccctgtctagtctcgccaaacacggcgagtacgccccttttgctaggctgctcaacctgagcggggtgaacaatctggagcacggtctcttcccacagctgtctgccatcgctctcggagtggcaactgcccacggcagcaccctggctggagtcaatgtgggcgagcagtatcagcagctgcgcgaagctgcaacagaggcagaaaagcagctccagcagtacgccgagtcccgagaactggaccacctgggactcgacgatcaggagaagaaaattctgatgaacttccatcagaagaaaaatgaaatctcttttcagcagacaaacgctatggtgaccctgcgcaaggagcgactggctaaactcaccgaagcaattacagccgcttccctgcctaagacctctgggcactatgacgatgacgatgacatccccttccctgggccaattaacgatgacgataatccaggtcatcaggacgatgaccccacagattcacaggacactaccatccccgatgtggtcgtggaccctgatgacggcagctacggagagtatcagagttactcagaaaacggcatgaatgccccagatgacctggtgctctttgatctggacgaggatgacgaagacacaaagcccgtccctaacagaagtactaaaggcggacagcagaagaacagccagaaaggccagcacatcgagggacgacagacccagtccaggccaattcagaacgtgccaggcccccatcggactatccaccatgcttctgcacccctgaccgataacgacaggagaaatgagcctagcggcagcaccagccctcgcatgctgacaccaatcaacgaagaggccgaccccctggatgacgctgatgacgagacatcaagcctgccccctctcgaaagcgatgacgaagagcaggatagagacggaacttccaatcggacacctactgtggcaccacccgccccagtctatagggatcactccgagaagaaagaactgccacaggacgagcagcaggatcaggaccatacacaggaagccagaaaccaggatagtgacaatactcagtcagagcacagcttcgaagagatgtacaggcatatcctgagatcacaggggccatttgatgctgtgctgtactatcacatgatgaaggacgagcccgtcgtgttcagtacttcagatggtaaagaatacacctatcctgactctctcgaagaggaataccctccctggctgaccgagaaggaagccatgaacgaggaaaatcggtttgtgacactggacggacagcagttctattggcccgtgatgaaccacaaaaacaagtttatggctattctccagcaccaccagtga(SEQ ID NO.:3)。

在本发明优选的埃博拉病毒VP30蛋白的氨基酸序列如下：

measyergrpraarqhsrdghdhhvrarsssrenyrgeyrqsrsasqvrvptvfhkkrvepltvppapkdicptlkkgflcdssfckkdhqlesltdrelllliarktcgsveqqlnitapkdsrlanptaddfqqeegpkitlltliktaehwarqdirtiedsklralltlcavmtrkfsksqlsllcethlrreglgqdqaepvlevyqrlhsdkggsfeaalwqqwdrqslimfitaflnialqlpcessavvvsglrtlvpqsdneeastnpgtcswsdegtp*(SEQ ID NO.:6)；

优选地其编码多核苷酸序列如下：

atggaagcatcctacgagagaggcagaccaagagccgcaaggcagcacagcagagacgggcacgatcatcatgtccgagccagaagtagctcccgagagaactacaggggggaatatcggcagtcccgctctgccagtcaggtcagggtgcccacagtcttccacaagaaaagagtcgagcctctgactgtgccccctgctccaaaggacatctgccccaccctgaagaaaggtttcctctgcgactctagtttttgtaagaaagatcatcagctggagagcctcactgaccgcgaactgctcctgctcatcgctcgaaagacatgtggcagcgtggagcagcagctgaacattactgcacctaaagattccagactggcaaatccaaccgccgacgattttcagcaggaggaaggacctaagatcaccctgctgaccctgatcaagacagctgagcactgggcaagacaggacatccggactattgaagattctaagctgcgggcactgctcactctctgcgccgtgatgacccgcaagttctcaaaaagccagctgagtctgctctgtgagacacacctgaggagagaagggctcggtcaggatcaggcagagccagtcctggaagtgtaccagcgactgcattccgacaagggcggatcttttgaggccgctctgtggcagcagtgggatcgccagagcctgatcatgttcattaccgcctttctgaatattgctctgcagctcccatgcgaatcaagcgccgtggtcgtgagtggactgcggacactcgtgccccagtcagacaatgaggaagccagcacaaacccaggaacatgcagttggagcgacgagggaaccccctaa(SEQ ID NO.:5)。

在本发明优选的埃博拉病毒VP35蛋白的氨基酸序列如下：

mttrtkgrghtaattqndrmpgpelsgwiseqlmtgripvsdifcdiennpglcyasqmqqtkpnpktrnsqtqtdpicnhsfeevvqtlaslatvvqqqtiasesleqritslenglkpvydmaktisslnrvcaemvakydllvmttgratataaateaywaehgqpppgpslyeesairgkiesrdetvpqsvreafnnlnsttslteenfgkpdisakdlrnimydhlpgfgtafhqlvqvicklgkdsnsldiihaefqaslaegdspqcaliqitkrvpifqdaappvihirsrgdipracqkslrpvppspkidrgwvcvfqlqdgktlglki*(SEQ ID NO.:8)；

优选地其编码多核苷酸序列如下：

atgaccacccgaaccaagggccgaggccacaccgccgctaccacccagaacgacaggatgcccggcccagaactgtccgggtggatttccgaacagctgatgaccggcaggattcccgtgtccgatatcttctgcgacatcgagaacaatcccgggctgtgctacgcctcccagatgcagcagactaagcccaaccctaagactaggaactcccagacacagaccgatcccatctgcaaccattccttcgaggaagtcgtgcagaccctggcctctctggccaccgtggtccagcagcagactatcgcctctgagtcactggagcagaggatcacctccctggaaaacggcctgaagcccgtgtacgacatggccaagaccatctccagcctgaatcgcgtgtgcgcagaaatggtggccaaatacgacctgctggtcatgaccactggcagggccaccgctactgccgccgcaactgaggcttactgggccgagcatggtcagccccctcccggaccctccctgtacgaagagtccgccatcaggggcaaaatcgaatccagggacgagaccgtgccccagtccgtgagggaggccttcaacaacctgaatagtacaacctcactgaccgaggaaaattttggaaagcccgacattagtgctaaggacctgcgcaacatcatgtacgatcacctgccaggctttggcaccgcctttcaccagctggtgcaggtcatctgcaagctgggcaaagactccaattctctggacatcatccacgccgagttccaggcttccctggccgagggcgattcaccccagtgcgctctgatccagatcaccaagagggtgcccattttccaggatgcagctccccctgtgatccacattcgctccaggggcgacatccccagggcttgccagaagtccctgcgaccagtccctccctccccaaagatcgacaggggctgggtctgcgtgtttcagctgcaggacggcaagaccctgggtctgaagatttga(SEQ ID NO.:7)。

为构建埃博拉病毒迷你基因组报告系统，本发明人将报告基因(GaussiaLuciferase(Gluc)或者GFP)替换在埃博拉病毒基因组两端非编码区之间，构建迷你基因组报告系统，经体外转录后得到含有报告基因的埃博拉病毒迷你基因组RNA。采用电转的方法将这一RNA转染到Huh7-4P细胞中即得到模拟埃博拉病毒复制的迷你复制子系统。

进一步在报告系统中添加筛选抗性标记潮霉素(Hygromycin)，筛选后得到可以稳定复制的埃博拉病毒迷你复制子系统。优选地，在潮霉素抗性基因和报告基因之间具有连接肽2A的编码基因。在本发明优选的实施方式中，构建的可以稳定复制的埃博拉病毒迷你复制子系统的多核苷段序列如下：

tggacacacaaaaaagaagaaatagatttatttttaaatttttgtgtgcgaccatttttccaggaat cctttttgcaacgtttattctggcgagccttctgatgagcgtggtcaatgtcttaattatcattaac acgaagattattatctagtctgctatattgtaaagaaggtatttctgattttacagtcctgcctttt cttttaattttatcattctgtatgaaatagtagcttactagacaaaaatgttaaggttattacacct aatctcttattttacacaaagattaaggctatcaccgtttttaaaacgacaaattaaagtaatgata attataaaaaacttaatcttaaagatcaattttgttttaagaagttgtgttatcaaccaaaacacta ttccatctgacaggatattgatacaacattattatatcaataacaatatgagcccagacctttcgtt aaagcttaattataaagagtgcagagtttattatgttgcgttaaattcattgcggcagtaatatgtc acacatgctgcattgtgaattttttgattatcacgcagggagagaggctaaatatagtatataatat agggactcctttcgttatttaaatagttgtttattgagattagatcaatatgatgtatgagagcaat ttatgagttttttataatctgtatgttaataaccaacctttgcaagtatcaggatactatgcacggt aat tggacacacaaaaaagaagaaatagatttatttttaaatttttgtgtgcgaccatttttccaggaat cctttttgcaacgtttattctggcgagccttctgatgagcgtggtcaatgtcttaattatcattaac acgaagattattatctagtctgctatattgtaaagaaggtatttctgattttacagtcctgcctttt cttttaattttatcattctgtatgaaatagtagcttactagacaaaaatgttaaggttattacacct aatctcttattttacacaaagattaaggctatcaccgtttttaaaacgacaaattaaagtaatgata attataaaaaacttaatcttaaagatcaattttgttttaagaagttgtgttatcaaccaaaacacta ttccatctgacaggatattgatacaacattattatatcaataacaatatgagcccagacctttcgtt aaagcttaattataaagagtgcagagtttattatgttgcgttaaattcattgcggcagtaatatgtc acacatgctgcattgtgaattttttgattatcacgcagggagagaggctaaatatagtatataatat agggactcctttcgttatttaaatagttgtttattgagattagatcaatatgatgtatgagagcaat ttatgagttttttataatctgtatgttaataaccaacctttgcaagtatcaggatactatgcacggtaat actcggaattttgtgattccgagcaatttgtcttttaactatttccaatgttttaccccaagctttagggttgttgaatcttcaatcccctaagtgttcaagttcaaaaccaaggttaattctcaatcttgcttgtttgactgtgaactaatgctgtcctttaacaataatgtttctattaaggttgttggatcaccctgcagagtctgaggtggaacttgtgatgtgataagacctaggtgttgacaagggattttcaactgagcacactgatgcccttgctcccttcggagacctaggttgttctctatctttgtgatgtggctctgaaacaaaccaggtgtgattacagtaacaatttcaatttaaattccgatataaatttcaatgagaggaaaattattaatcttcctcatagttattcgcacacaaaagatcctaaaaattcttctttctttttgtgtgtccg 1809

(SEQ ID NO.:14，GFP标记，潮霉素抗性；潮霉素抗性基因序列以标示、2a连接多肽序列以GFP报告基因序列以标示。

基于本发明的埃博拉病毒的迷你复制子系统可筛选具有潜在抗病毒活性的化合物。

本发明的主要优点在于：

1.本发明首次构可稳定复制的埃博拉迷你复制子系统，可用于抗病毒研究和研究埃博拉病毒复制周期等，现有的复制子系统基于瞬时转染，操作繁琐，实验结果往往不够稳定。

2.本发明首次构建了支持埃博拉病毒复制的肝细胞系，肝脏也是埃博拉病毒感染的器官，目前尚没有基于肝脏细胞系来源的埃博拉病毒复制子系统。本发明将有利于研究埃博拉病毒在肝细胞中的复制和致病机制。

3.采用本发明的埃博拉迷你复制子系统进行药物筛选，具有很高的信噪比和稳定性，适用于高通量药物筛选工作。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1 埃博拉病毒支持细胞系的建立

本发明人根据扎伊尔型埃博拉病毒1976年株Mayinga序列(NCBI序列号NC_002549)，通过全基因合成经过密码子优化的埃博拉病毒NP，VP30，VP35和L蛋白表达序列，基因合成工作由金斯瑞公司完成。

将表达埃博拉病毒L蛋白的基因克隆到pCNDA3.1载体(购自Invitrogen公司)上，用lipofectemine-LTX(购自invitrogen)，转染到Huh7细胞(购自ATCC公司)中，转染后48小时加500μg/ml G418筛选3周后，得到Huh7-L细胞系，该细胞系培养在含有250μg/ml G418的培养基中维持选择压力。NP，VP30和VP35分别克隆到慢病毒载体pLVX上(购自Clone Tech公司)，包装成假病毒后转导Huh7-L细胞，得到Huh7-4P细胞系。该细胞系同样培养在含有250μg/ml G418的维持培养基中。

为验证Huh7-4P细胞中是否表达4种蛋白，本发明人通过RT-PCR的方法验证这4种蛋白的表达。本发明人分别设计了针对这4种基因的特异性PCR引物，抽取Huh7-4P细胞的RNA后，经反转录成cDNA后分别用特异性引物扩增，以普通的Huh7细胞为对照。如图1所示，这4种基因都能够检测到在Huh7-4P细胞中表达，表明细胞系构建成功。

为确定Huh7-4P细胞是否能够支持Ebola迷你复制子系统的复制，本发明人将体外转录的迷你复制子报告系统Ebola-Gluc RNA通过电转的方法转染到Huh7-4P细胞中，以Huh7-L细胞为对照。通过测定释放到细胞上清中的报告基因Gluc活性，反应埃博拉病毒的复制情况。如图2所示，在电转后能够检测很强的Gluc活性，最高信噪比大于10000倍。本发明人还进一步用荧光定量PCR的方法来验证，通过设计特异针对埃博拉病毒迷你复制子系统信使RNA(mRNA)，病毒RNA(vRNA),本发明人用定量PCR的方法检测上述RNA在电转后的变化情况。结果如图2所示，在电转后能够检测到活跃的mRNA转录。这些结果说明Huh7-4P细胞能够很好地支持埃博拉病毒的复制和转录。

图2显示了电转后不同时间收取上清检测报告基因Gluc表达和细胞内埃博拉病毒迷你基因组系统RNA表达水平。(图中mRNA为迷你基因组转录得到的信使RNA，vRNA为迷你基因组RNA)

实施例2 埃博拉病毒稳定迷你复制子系统的建立

在上述埃博拉病毒迷你复制子基础上，本发明人通过将抗性筛选标记和报告基因通过可以自我剪切的肽段2a相连，构建了埃博拉病毒带有Hygromycin抗性筛选标记和报告基因Gluc的迷你复制子系统。将体外转录得到的该复制子RNA通过电转转染到Huh7-4P细胞中，转染后48小时加100μg/mlHygromycin，持续筛选2周，得到具有Hygromycin抗性的细胞，即为可稳定复制的埃博拉病毒迷你复制子系统。

经检测该细胞上清中Gluc表达水平比检测本底值高2000倍以上，证明本发明人已经成功构建了能够稳定复制的埃博拉病毒迷你复制子系统。

图3显示了本发明的埃博拉迷你复制子系统能够稳定的复制。

为进一步验证本发明建立的能够稳定复制的埃博拉病毒迷你复制子系统的有效性，本发明人参考文献报道设计了针对埃博拉病毒NP基因5’UTR区域的shNP1序列(Groseth,Hoenen et al.2007)，构建到shRNA表达载体shLenti-vector(购自Clone Tech公司)，针对的目标序列为GGCATCAGTGTGCTCAGTTGA，位于埃博拉病毒基因组193-213位置处。针对不相关序列的shRNA作为对照。在24孔版中铺3X105埃博拉病毒复制子细胞，每个孔用lipofectemine 2000(购自Invitrogen公司)转染0.1，0.3和0.9μg针对NP的shNP1或对照shCTR质粒，Mock组是没有转染质粒的对照组。转染后三天取上清测定荧光素酶活性。与空白转染组和针对不相关位点的shCTR质粒相比，转染shNP1能够有效抑制荧光素酶活性，最高剂量转染组shNP1比对照组下降约60％，表明针对NP 5’UTR区域的shRNA可以有效抑制埃博拉病毒复制或转录，与文献报道结果一致。

图4A显示了shNP1针对迷你基因组的作用位点，图4BshNP1可以有效抑制埃博拉病毒迷你复制子系统报告基因表达，进一步证明本发明建立的复制子系统的有效性。

实施例3 具有潜在抗病毒活性的中药小分子化合物的高通量筛选

本发明人基于建立的埃博拉病毒迷你复制子系统从中药小分子化合物库中筛选具有潜在抗病毒作用的药物。将转染埃博拉病毒迷你复制子的细胞以每孔1X10⁴个细胞的密度铺到96孔板中，同时加入不同浓度稀释的小分子化合物，每个浓度3个复孔，以DMSO处理组为对照，3天后检测上清中的Gluc活性，确定药物的抗病毒活性。同时用cell titer(采购自Promega公司)测定细胞活性，确定药物毒性情况。

实验结果

基于本发明构建的埃博拉迷你复制子系统，在96孔板模式下可以得到信噪比大于3000倍，Z值大于0.7，表明这一系统具有很高的信噪比和稳定性，适用于高通量药物筛选工作。

本发明人使用基于迷你复制子系统筛选了包含301种中药成分的小分子化合物库，得到具有抗埃博拉病毒活性的小分子药物188#和190#，结果如图4所示。实验表明，在实验浓度下，这两种化合物没有表现出细胞毒性。

图5显示了筛选出的具有埃博拉病毒抑制活性的化合物。

本发明建立了稳定的埃博拉病毒复制支持细胞，以及可稳定持续性复制的埃博拉迷你复制子系统，并且基于该系统本发明人从中药小分子化合物库筛选出了2种具有潜在抗病毒活性的药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

Groseth,A.,T.Hoenen,et al.(2007)."In vitro evaluation of antisense RNA efficacy againstfilovirus infection,by use of reverse genetics."J Infect Dis 196Suppl 2:S382-389.

Jasenosky,L.D.,G.Neumann,et al.(2010)."Minigenome-based reporter system suitable forhigh-throughput screening of compounds able to inhibit Ebolavirus replication and/ortranscription."Antimicrob Agents Chemother 54(7):3007-3010.

Uebelhoer,L.S.,C.G.Albarino,et al.(2014)."High-throughput,luciferase-based reverse geneticssystems for identifying inhibitors of Marburg and Ebola viruses."Antiviral Res 106:86-94.

Claims (10)

1.一种制备埃博拉病毒复制子系统的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)提供一包装细胞

所述包装细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；

(2)提供埃博拉病毒迷你基因组的多核苷酸，并将所述多核苷酸转染入所述包装细胞中，制得所述埃博拉病毒复制子系统，

其中，所述迷你基因组的多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃博拉病毒的多核苷酸为DNA、或RNA；优选为RNA；更优选为反义RNA。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包装细胞基因组中整合有编码选自下组的蛋白的多核苷酸：所述埃博拉病毒L蛋白、所述埃博拉病毒NP蛋白、所述埃博拉病毒VP30蛋白、和所述埃博拉病毒VP35蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述埃博拉病毒的迷你基因组多核苷酸为RNA，优选地其序列如SEQ ID NO.:13、或14所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包含如下步骤：

(a)构建稳定表达埃博拉病毒L蛋白的细胞系；

(b)在步骤(a)构建的细胞系中通过慢病毒载体分别转导埃博拉病毒NP、VP30和VP35蛋白，从而得到稳定表达埃博拉病毒L蛋白、NP蛋白、VP30蛋白和VP35蛋白的细胞系，即为所述包装细胞。

6.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；并且所述细胞中具有埃博拉病毒迷你基因组多核苷酸；

其中，所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒调控复制、转录所需的非编码区序列和报告基因。

7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。

8.一种筛选抑制埃博拉病毒复制的药物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)使用权利要求1所述的方法制备埃博拉病毒复制子系统；

(b)向所述埃博拉病毒复制子系统中添加待筛选的化合物；

(c)检测所述埃博拉病毒复制子系统中报告基因的表达水平。

9.如权利要求6所述的细胞的用途，其特征在于，用于筛选抑制埃博拉病毒的药物。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：

(i)包装细胞；和

(ii)埃博拉病毒迷你基因组多核苷酸；

其中，所述包装细胞表达埃博拉病毒L蛋白，埃博拉病毒NP蛋白，埃博拉病毒VP30蛋白，和埃博拉病毒VP35蛋白；

所述迷你基因组多核苷酸包含埃博拉病毒基因组3’末端，NP基因5’UTR区域，报告基因，L基因3’UTR区域以及病毒基因组5’末端非编码区。