CN101891814A - 抗骨桥蛋白opn单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗骨桥蛋白opn单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗骨桥蛋白OPN单克隆抗体、其在制备治疗OPN介导的疾病用的药物中的用途、在制备检测OPN用的试剂盒中的用途，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及含有使用单克隆抗体的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及抗骨桥蛋白OPN单克隆抗体。具体而言，本发明涉及制备天然骨桥蛋白的方法，使用所产生的天然骨桥蛋白制备产生抗骨桥蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，有该杂交瘤细胞株产生单克隆抗体，以及本发明单克隆抗体在制备治疗骨桥蛋白介导的疾病用的药物以及制备检测骨桥蛋白用的试剂盒中的用途。
背景技术
骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是细胞外基质(ECM)中一重要的功能性蛋白，最早由骨基质分离出，是一富含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)序列的分泌型糖基化磷蛋白，相对分子质量约为40-75KDa。起初认为OPN参与骨的吸收，与骨组织的矿化有关，现发现OPN在人体组织中分布广泛，具有多种功能，参与平滑肌细胞增生、动脉粥样硬化，特别是近年研究发现OPN与肿瘤细胞生长、增殖和侵袭、转移密切相关，近年Yeatman等应用基因表达图谱技术来筛选新的肿瘤标记物，OPN被确定为临床上首选标记物。
OPN在诊断及预后评估中的应用：由于OPN广泛存在于人体组织及血、尿、乳汁等体液中，这一特征使其有可能成为一种优质的、无损伤性的诊断标记物、肿瘤筛查指标，或用来判断患者的预后。Le等利用微阵列、Northern印迹和Western印迹等手段证明，组织缺氧时抗癌基因的表达下调，而OPN基因的表达上调；并且进一步发现血清OPN水平和头颈部鳞癌患者的肿瘤缺氧状况有关，利用线性相关分析发现较高的血清OPN水平往往导致较高的近期内复发风险和较差的预后。由此提出了把测量血清OPN作为一种无创性判断肿瘤患者预后的方法的可能性。骨桥蛋白与肿瘤的转移及患者预后的密切关系已引起不少学者高度重视。Tuck等研究认为，OPN表达强弱与乳腺癌恶性程度相关，血浆OPN正常参考值为14～64ng/ml，若大于此值则提示肿瘤可能已发生了转移。Schorge等以血清OPN和CA125水平来评估直肠癌患者预后价值，发现直肠癌患者血清OPN均值为178ng/ml，CA125均值为812U/ml，术后二者均明显下降，值得关注的是，9O例复发患者OPN再度升高，且与CA125比较平均提前3个月。Wong等对72例非分化型鼻咽癌(NPC)患者接受放疗前血清OPN水平检测证实，NPC组平均为184.66ng/ml，远高于正常组的75.89ng/ml，且OPN水平与患者临床病理分级及颈部淋巴结转移相关。Coppola等对一组包括头颈、食管、乳腺、肺、肝、胃肠、膀胱、子宫等全身实体肿瘤组织大宗病例OPN表达研究比较发现，OPN蛋白表达普遍增高，尤其在胃肠、泌尿生殖和妇科系统，并与肿瘤临床分级密切相关，Rudland等对333例乳腺癌组织切片经免疫组化进行
回顾性分析发现OPN表达阴性患者平均存活时间大于224个月，而阳性患者仅为68个月。Pan等应用RT-PCR半定量法结合原位杂交研究发现，OPN在肝癌组织中表达明显增强，OPN mRNA相对表达量在复发组为不伴复发组的3倍，而且OPN表达与肿瘤分期、血甲胎蛋白水平相关，认为OPN是临床监测肝癌早期复发的一个可靠指标。
OPN在治疗中的应用：OPN是多种肿瘤播散的关键细胞因子，过去的研究提示在几种肿瘤模型中，针对OPN及其受体从基因启动到信号传导途径的成功干预，将有效地降低肿瘤的生物学恶性程度，延长患者的生存时间，提高其生存质量。Hirama等则认为通过干扰OPN的功能来抑制血管生成是将来从分子水平治疗肿瘤的一个有效途径。Overgaard等通过随机双盲对照实验发现，头颈部肿瘤患者血清中的OPN浓度越高，则放疗的效果越差，但服用尼莫拉唑后能提高疗效。血清OPN浓度较高的患者往往临床上表现出来的缺氧症状比较明显，在放疗中若能注意对这部分患者缺氧的纠正，则能得到比较好的放疗效果。
此外，大量研究表明在自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、多发性硬化症，自身免疫性肝炎、克隆氏病等)中，组织及血浆中OPN的水平明显上调(Expression of osteopontin at sites of bone erosion in a murine experimentalarthritis model of collagen-induced arthritis：possible involvement of osteopontin inbone destruction in arthritis.Arthritis Rheum.″明胶诱导关节炎的鼠关节炎实验模型中骨质侵蚀部位的骨桥蛋白表达：骨桥蛋白可能涉及关节炎中的骨质侵蚀″2002.46：1094-1101；Role of osteopontin in amplification and perpetuation ofrheumatoid synovitis.″骨桥蛋白在类风湿性滑膜炎扩增和无限繁殖中的作用″J.Clin.Invest.2005.115：1060-1067.Osteopontin/Eta-1 upregulated in Crohn’sdisease regulates the Th1 immune response.″上调的骨桥蛋白/Eta-1在克隆氏病中调节Th1免疫反应Gut.2005.54：1254-1262.Osteopontin as a Mediator of NKTCell Function in T Cell-Mediated Liver Diseases.″作为T细胞介导的肝病中NKT细胞功能介导物的骨桥蛋白″Immunity，2004.21：539-550)。OPN通过与淋巴细胞，巨噬细胞表面的CD44及其他整合素受体结合，招募炎症细胞在靶器官集聚，同时进一步的促进各种炎症细胞的活化，分泌大量的促炎因子(TNF-α、IL-1β及IL-6)(Essential role of the cryptic epitope SLAYGLR within osteopontin in amurine model of rheumatoid arthritis.″骨桥蛋白中隐藏抗原表位SLAYGLR在鼠类风湿性关节炎模型中的重要作用″J.Clin.Invest.2003.112：181-188)。此外，在类风湿性关节炎中，OPN还可通过与破骨细胞表面的αγβ3和αγβ5受体介导骨的破坏吸收，加重RA的发病(Osteopontin.″骨桥蛋白″Crit Rev OralBiol Med.2000；11(3)：279-303)。研究表明，在OPN基因缺失的小鼠中，关节炎的发病率及严重程度明显降低(Osteopontin deficiency protects joints againstdestruction in anti-type II collagen antibodyinduced arthritis in mice.″小鼠中骨桥蛋白缺陷保护关节免受抗II型胶原抗体诱导的关节炎的破坏″PNAS.2002.99(7)：4556-4561)，ConA诱导的自身免疫性肝炎的发病率及肝脏破坏程度也明显减轻(″作为T细胞介导的肝病中NKT细胞功能介导物的骨桥蛋白″，同上Immunity，2004.21：539-550)，而且对DSS诱导的小鼠克隆氏病也有保护作用(Osteopontin deficiency protects mice from Dextran sodium sulfate-induced colitis.″骨桥蛋白缺陷使小鼠免受葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎″Inflamm Bowel Dis.2006.12(8)：790-6)。在上述的模型中，抗OPN的多克隆抗体也可以明显的降低类风湿性关节炎模型小鼠的发病，减轻关节肿胀、畸形的程度(″骨桥蛋白中隐藏抗原表位SLAYGLR在鼠类风湿性关节炎模型中的重要作用″，同上2003.112：181-188)；对肝脏的炎症也能明显减轻(″作为T细胞介导的肝病中NKT细胞功能介导物的骨桥蛋白″，同上，2004.21：539-550)。由此可见，OPN是自身免疫性疾病的重要发病因素，OPN将是一个治疗自身免疫性疾病的有效药物靶点。
鉴于OPN浓度的变化在提示肿瘤转移及指示患者预后的有益作用，研发出一种能检测OPN在体液中含量的ELISA试剂盒具有重大的应用价值。市面上现有的检测OPN的ELISA试剂盒主要有R&D、Assay Designs，IBL等，但是，这几种试剂盒中的抗体都是由重组OPN免疫动物制备，而OPN是一个具有多个糖基化和磷酸化位点的蛋白，所以重组OPN和天然OPN在结构和表位在一定程度上有所差别，因此用重组OPN免疫得到的抗体在检测天然OPN时可能会存在漏检，文献研究表明这些试剂盒在用于临床研究检测血清OPN水平时，对同样的样本检出值出现了不同程度的差异(BMC Cancer 2008，8：38doi：10.1186/1471-2407-8-38)，这就造成了对OPN的检测没有一个很好的标准，影响OPN应用于临床检测。
本发明人为了解决上述问题，采用天然纯化的方式，从体液中提取了高纯度的OPN作为免疫原。
发明内容
本发明提供一种抗骨桥蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为IgG，κ亚型抗体。
在一个优选实施方式中，所述单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一优选实施方式中，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC-C200932的杂交瘤细胞株产生。
本发明提供选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
本发明提供一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)本发明的单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在一个优选实施方式中，本发明的单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一优选实施方式中，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC-C200932的杂交瘤细胞株产生。
本发明提供一种检测试剂盒，其含有本发明的单克隆抗体或免疫偶联物，或所述抗体或免疫偶联物的组合。
在一个优选实施方式中，所述单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一个优选实施方式中，所述免疫偶联物免疫偶联物含有由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一个优选实施方式中，所述试剂盒含有如下组合的抗体或其免疫偶联物：
(1)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200933产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(2)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(3)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；和/或
(4)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200931产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物。
在一优选实施方式中，所述试剂盒还含有指导使用所含单克隆抗体或其免疫偶联物检测骨桥蛋白的使用说明书。
本发明提供一种药物组合物，它含有：
(i)有效量的本发明的单克隆抗体或免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在一个优选实施方式中，所述单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一个优选实施方式中，所述免疫偶联物免疫偶联物含有由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一优选实施方式中，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC-C200932的杂交瘤细胞株产生。
本发明提供本发明的单克隆抗体或其免疫偶联物在制备检测骨桥蛋白用的试剂盒中的用途。
在一优选实施方式中，所述试剂盒含有由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体或其免疫偶联物：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
本发明提供本发明所述的单克隆抗体或其免疫偶联物在制备治疗骨桥蛋白介导的疾病用的药物中的用途。
在一个优选实施方式中，所述单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一个优选实施方式中，所述免疫偶联物免疫偶联物含有由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
在一优选实施方式中，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC-C200932的杂交瘤细胞株产生。
在一优选实施方式中，所述骨桥蛋白介导的疾病选自自身免疫性疾病。
在一个优选实施方式中，所述自身免疫性疾病选自：类风湿性关节炎、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、克隆氏病、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、自身免疫糖尿病、自身免疫眼色素层炎、肾病综合症、溃疡性结肠炎、牛皮癣关节炎、未分化的脊柱关节病、慢性的肝功能衰竭和与类风湿性关节炎相关的其他症状包括体重增加、关节变形、关节肿胀、关节畸形、关节弯曲僵硬、严重的运动障碍及其组合。
在一优选实施方式中，所述骨桥蛋白介导的疾病为癌症。
在优选实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、直肠癌、鼻咽癌、肝癌、头颈部肿瘤等。
本发明提供一种制备天然骨桥蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供并离心含骨桥蛋白的体液，获得上清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得上清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白。
在一优选实施方式中，所述含骨桥蛋白的体液选自血液、尿液、乳汁。
在一优选实施方式中，所述体液来自哺乳动物，比如人。
在一优选实施例中，所述体液选自哺乳期妇女的乳汁。
在一优选实施方式中，本发明纯化OPN蛋白的方法包括以下步骤：
(1)提供并离心乳汁，去除上层乳脂，获得乳清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得乳清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白；
其中，所述步骤(3)中使用到含有约0.8-1.2M的(NH4)2SO4和约0.05-0.2M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2的起始缓冲液，和含有约0.05-0.15M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2的洗脱缓冲液。
在一优选实施方式中，起始缓冲液含有1.0-1.1M的(NH4)2SO4和0.1-0.12M的Na2HPO4，pH约为7.0。
在一优选实施方式中，洗脱缓冲液含有约0.1-0.12M的Na2HPO4，pH约7.0。
附图说明
图1显示离子交换纯化SDS-PAGE图。各泳道样品依次为：1.低分子量蛋白标记；2.上样后穿透液；3.0.2M NaCl洗涤；和4-8.0.4M NaCl洗脱接的不同管(含OPN)。
图2显示疏水层析SDS-PAGE图。各泳道样品依次为：1.低分子量蛋白标记；2.离子交换纯化后样品；3.穿透液；4-6.洗脱液洗脱后接的第一个峰(含纯化好的OPN)；7.洗脱液洗脱后第二个峰；8.浓缩后OPN。
图3显示纯化后样品的免疫印迹图，所用抗体为mAb14331(R&D公司)。各泳道样品依次为：1.预染蛋白标记；3.离子交换纯化后样品；4.穿透液；5-7.洗脱液洗脱后接的第一个峰(含纯化好的OPN)；8.洗脱液洗脱后第二个峰；9.浓缩后OPN。
图4显示s-77-1单抗稀释度测定。图中横坐标是表示抗体的倍比稀释度，初始稀释度为1∶1000，倍比为3，即1∶1000，1∶3000，1∶9000等。
图5显示s-113-6单抗稀释度测定。图中横坐标是表示抗体的倍比稀释度，初始稀释度为1∶1000，倍比为3，即1∶1000，1∶3000，1∶9000等。
图6显示OPN-ELISA结果，其中，OPN稀释在1％BSA中。
图7显示OPN-ELISA结果，其中，OPN稀释在正常人血清中。
图8显示在划痕0小时和48小时两个时间点进行拍照，比较细胞迁移的能力。
图9所示细胞划痕修复实验结果见图。实验结果显示，48hrs内S-113-6抗体处理的细胞比Mork组(PBS)和无关抗体对照组细胞迁移的能力显著降低。
具体实施方式
分离纯化OPN的方法
由于OPN广泛存在于人体组织及血、尿、乳汁等体液中，所以，从体液中提取OPN具可行性。与其他体液比，从乳汁中提取OPN具优势，因其中OPN含量高，大约为3-10ug/ml。文献已报道的从乳汁中纯化OPN的方法一般至少有四步：离子交换、去除酪蛋白、疏水层析、分子筛。四步法过程较为复杂，且OPN在体外比较容易降解，过多的纯化步骤会影响OPN蛋白结构的完整性。例如，见Steen
et al.Purification and characterization of osteopontinfrom human milk.Protein Expression and Purification 30(2003)238-245。因此从乳汁中提取免疫用量的OPN(至少5mg)具有可行性，但尚有改进空间。
本发明人经过摸索和实验，只用离子交换和疏水层析两步就从乳汁中提取得到纯度大于95％的全长OPN，为制备单克隆抗体打下基础。
因此，本发明涉及一种纯化骨桥蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(1)提供并离心含OPN的体液，获得上清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得上清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白。
本发明中，含OPN的体液可以是血液、尿液或乳汁，它们可得自哺乳动物。
在一优选实施例中，使用哺乳期妇女的乳汁来提取、纯化OPN。因此，在此实施例中，所述纯化OPN蛋白的方法包括以下步骤：
(1)提供并离心乳汁，去除上层乳脂，获得乳清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得乳清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白。
可采用常规的方法离心含OPN蛋白的体液。例如，在该体液是乳汁的情况下，可以1000-3000rpm/5-15分钟离心乳汁。离心的体液的量依具体实验情况而定。在一具体实施例中，以1000rpm/10min离心200ml乳汁(来自哺乳期妇女)，去除上层乳脂，留乳清用于下步纯化。
离子交换法是本领域常用的离子交换法，采用离子交换法可富集乳汁中的OPN和去除大部分杂蛋白。
所使用的磷酸钠缓冲液可为0.005-0.03M的磷酸钠缓冲液，例如为0.01-0.02M的磷酸钠缓冲液，其pH约为6.8-7.2，通常为7.0左右。该磷酸钠缓冲液可使用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠来配制。
在一实施例中，上述磷酸钠缓冲液为0.01M的磷酸钠缓冲液，pH为7.0左右，用0.2M磷酸二氢钠和0.2M磷酸氢二钠配制，调pH到约7.0。使用时，稀释20倍。
在一具体实施例中，用磷酸钠缓冲液平衡柱子后，取出DEAE sepharose(GE)和乳清4℃混合过夜。混合物自然沉降后，取混合物装柱。然后约0.1-0.3MNaCl清洗柱子，流速5-15ml/min，洗去乳汁中的大部分杂蛋白，洗到曲线完全变平为止；再用约0.3-0.5M NaCl洗脱，流速2-10ml/min，接洗脱峰用于下步纯化。
在一实施例中，第一次清洗柱子所用的NaCl为0.2-0.3M的NaCl，其用0.2-0.3M的NaCl溶于例如约1L的0.005-0.02M磷酸钠缓冲液(pH为6.8-7.2，如约为7)配制得到。在一优选实施例中，使用0.2M NaCl来清洗柱子。
在一实施例中，第二次清洗柱子所用NaCl为0.4-0.5M NaCl，其用0.4-0.5MNaCl溶于例如约1L的0.005-0.02M磷酸钠缓冲液(pH为6.8-7.2，如约为7)配制得到。在一优选实施例中，使用0.4M NaCl来清洗柱子。
离子交换后所接洗脱峰，可在洗脱峰中加硫酸铵到0.8-1.5M/L，例如1-1.2M/L，然后用滤膜(例如0.45um)过滤除杂质。
本领域技术人员根据实际情况可选择适当的流速。
疏水层析的步骤为本领域常规步骤，可采用市售获得的例如phenylsepharose HP(GE)柱实施。
在一具体实施方式中，phenyl sepharose HP用起始缓冲液平衡；样品过柱，流速约2-5ml/min；起始缓冲液洗平，流速3-8ml/min；洗脱缓冲液梯度洗脱(起始缓冲液为A，洗脱缓冲液为B，约2-5ml/min，100％B，30min，即15倍柱体积梯度洗脱)，接第一个洗脱峰，其中含有目的蛋白OPN。由此获得纯化的OPN。
在一具体实施例中，起始缓冲液可使用蒸馏水来配制，其含有约0.8-1.2M的(NH4)2SO4和约0.05-0.2M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2，例如约7.0。可将这些成分溶于约1L蒸馏水而配制得到起始缓冲液。
在另一实施例中，所述(NH4)2SO4的浓度为1.0-1.1M，所述Na2HPO4的浓度为0.1-0.15M，缓冲液的pH约为7.0。
在一具体实施例中，洗脱缓冲液可用蒸馏水来配制，其含有约0.05-0.15M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2，例如约为7.0。
在另一实施例中，洗脱缓冲液含有约0.1-0.12M的Na2HPO4，pH约7.0。
在另一实施方式中，起始缓冲液含有1.0-1.1M的(NH4)2SO4和0.1-0.12M的Na2HPO4，pH约为7.0；洗脱缓冲液含有约0.1-0.12M的Na2HPO4，pH约7.0。
在一优选实施例中，洗脱液置于冰上接，接完后，立即加PMSF(苯甲基磺酰氟)蛋白酶抑制剂，然后用约50ml超滤管超(例如，BD，Amicon-ultra-15，30KDa)滤浓缩。
因此，在一优选实施例中，本发明纯化OPN蛋白的方法包括以下步骤：
(1)提供并离心乳汁，去除上层乳脂，获得乳清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得乳清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白；
其中，所述步骤(3)中使用到含有约0.8-1.2M的(NH4)2SO4和约0.05-0.2M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2的起始缓冲液，和含有约0.05-0.15M的Na2HPO4，pH约6.8-7.2的洗脱缓冲液。
在一个优选实施例中，将洗脱峰的容器置于冰上接洗脱峰。在另一个优选实施例中，接完洗脱峰后，立即加PMSF蛋白酶抑制剂。
采用本发明方法提取得到纯度大于95％的全长OPN。与现有方法相比，本发明方法缩减了纯化步骤，从而可保证制备得到的OPN蛋白的结构完整。同时，与现有方法制得的重组OPN蛋白相比，本发明方法制备得到的OPN蛋白为天然的OPN，其在结构和表位上在一定程度上与重组OPN蛋白有所差别，由此也导致其免疫原性不同，这可从本发明单克隆抗体的更高的效价以及更宽的检测范围得到证实。
因此，本发明也包括采用本发明方法制得的OPN。
OPN的用途
本发明涉及使用本发明骨桥蛋白的用途，即用其来免疫动物以制备单克隆抗体的方法，该方法包括用本发明的骨桥蛋白免疫动物；用被免疫的动物的脾细胞制备特异性表达骨桥蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞；和从杂交瘤细胞中制得本发明的单克隆抗体。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American TypeCulture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal AntibodiesProduction Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)，单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
分离纯化所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
杂交瘤细胞株
采用本发明的OPN蛋白，经常规的杂交瘤技术，产生获得了以下杂交瘤细胞株，并已于2009年4月30日将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学)，其培养物名称与对应的保藏号如下所示：
| 培养物名称 | 保藏编号 |
| 杂交瘤细胞株S-294-4 | CCTCC-C200931 |
| 杂交瘤细胞株S-113-6 | CCTCC-C200932 |
| 杂交瘤细胞株S-10-4 | CCTCC-C200933 |
| 杂交瘤细胞株S-195-5 | CCTCC-C200934 |
| 杂交瘤细胞株S-77-1 | CCTCC-C200935 |
抗OPN单克隆抗体、其制备及其用途
因此，本发明也包括抗OPN的单克隆抗体，所述抗体为IgG，κ亚型抗体。
术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
制备本发明单克隆抗体的方法是本领域周知的。在一个实施例中，本发明的单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株产生。产生的方法可包括：培养杂交瘤细胞系CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934、CCTCC-C200935，使之分泌单克隆抗体；和分离所产生的单克隆抗体。
培养杂交瘤细胞株的方法和分离单克隆抗体的方法是本领域周知的。分离得到的单克隆抗体可如前文所述用常规手段来鉴定。
本发明的抗OPN单克隆抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
可采用本领域已知的方法检测本发明单克隆抗体与OPN的亲合力的方法是本领域周知的。
在优选的实施方式中，本发明的单克隆抗体都是IgG，κ亚型抗体。在其它优选实施例中，本发明单克隆抗体是IgG1，κ亚型抗体。在其它实施方式中，本发明单克隆抗体是IgG2b，κ亚型抗体。
与现有的OPN的抗体的检测范围(通常为几十ng/ml)相比(见AliciaPlumer等，Development of fragment-specific osteopontin antibodies and ELISAfor quantification in human metastatic breast cancer，BMC Cancer 2008，8：38)，本发明的单克隆抗体对天然OPN具有更宽检测的范围(0-1000ng/ml)。
本发明的单克隆抗体可以骨桥蛋白为治疗靶点，治疗以骨桥蛋白介导的多种自身免疫性疾病，所述的自身免疫性疾病包括但不限于：类风湿性关节炎、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、强直性脊柱炎、克隆氏病、类风湿性脊椎炎、骨关节炎、痛风性关节炎、自身免疫糖尿病、自身免疫眼色素层炎、肾病综合症、溃疡性结肠炎、牛皮癣关节炎、未分化的脊柱关节病、慢性的肝功能衰竭和与类风湿性关节炎相关的其他症状包括体重增加、关节变形、关节肿胀、关节畸形、关节弯曲僵硬、严重的运动障碍及其组合。
本发明的单克隆抗体还可以用于治疗OPN介导的各种癌症，包括乳腺癌、直肠癌、鼻咽癌、肝癌、头颈部肿瘤等。在其它实施方式中，本发明的单克隆抗体或其免疫偶联物还可以干扰OPN的功能以抑制血管生成，从而从分子水平来治疗肿瘤。
因此，本发明也涉及本发明单克隆抗体在制备用于治疗OPN介导的疾病用的药物中的用途。所述OPN介导的疾病如上文所述。
此外，本发明还涉及本发明单克隆抗体在制备检测OPN用的试剂盒中的用途。
本发明的单克隆抗体还可以用来制备免疫偶联物，该免疫偶联物包括药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明抗OPN单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与本发明的抗OPN单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明的免疫偶联物也可用于制备治疗OPN介导的疾病用的药物，以及用于制备检测OPN用的试剂盒。
药物组合物
本发明还提供了一种治疗自身免疫病的药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明单抗或其免疫偶联物以及药学上可接受的载体。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的活性物质相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991年)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。
这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的组合物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药；优选的是口服或静脉内注射给药。
通常，在本发明的药物组合物中，本发明单克隆抗体或免疫偶联物有效成分占组合物总重量的0.00001-99.9wt％，例如，0.0001-90wt％、0.001-75wt％、0.01-50wt％、0.01-20wt％、0.1-10wt％、1-5wt％等。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用灌注和其它治疗方式。
使用药物组合物时，是将安全有效量的抗OPN单克隆抗体或免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常约0.1微克-5毫克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1-10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围内的。
本发明的药物组合物还可包含对自身免疫性疾病有治疗或改善活性的物质，或可与其它活性物质联合使用，以获得更佳的治疗效果。所述其它对自身免疫性疾病有治疗或改善活性的物质包括但不限于：与抗炎症的细胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10和/或IL-4拮抗剂、
磷酸二酯酶IV型抑制剂，抗炎症的抑制剂和细胞因子抑制剂例如来氟米特，非类固醇的炕炎药物例如萘普生、皮质醇、环孢菌素等。
当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。优选地，联合施用的药物或其它制剂不干扰本发明单克隆抗体的治疗活性。
OPN检测试剂盒
本发明还提供了一种检测OPN的试剂盒，它含有本发明的抗OPN单克隆抗体或其活性片段、免疫偶联物。可采用本发明的试剂盒来检测生物样品中是否存在OPN或其含量，该检测方法包括步骤：(a)将样品与本发明试剂盒中的抗OPN单克隆抗体或其免疫偶联物接触；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在骨桥蛋白或定量检测所形成的抗原-抗体复合物的量以反映样品中OPN的含量。所述样品可为经过预处理或未经过预处理，例如可经过提取、纯化或浓缩等。
所述试剂盒含有容器以及位于容器内的本发明的单克隆抗体或其免疫偶联物、或者带有所述单克隆抗体或其免疫偶联物的检测板，以及使用说明书。该试剂盒中还可含有检测所需的其它试剂，例如缓冲液、指示剂等。本领域技术人员可根据具体需要对试剂盒的内容物进行调整。
在一优选实施例中，本发明的检测试剂盒含有：
(1)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200933产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(2)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(3)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；和/或
(4)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200931产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物。
应理解，虽然以各个具体部分的方式描述了各部分中的具体技术特征，但在各部分中描述的各具体技术特征的任意组合也是显而易见的，也包括在本发明的保护范围之内。在本说明书中，所使用“含有”、“包括”等类似的术语，其也包括“由……组成”、“由……构成”之意。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：从人乳汁中纯化天然OPN
本发明人采用优化的两步法从乳汁中提取天然OPN。本发明的分离纯化方法，为获得天然OPN提供了新的方法。本发明人经过长期摸索和实验，优化出两步层析法，从乳汁中获得纯度高达95％的OPN，不仅缩短了分离步骤和纯化时间，而且减少了OPN的损失和活性丢失。具体步骤为：
1.乳汁处理：以1000rpm/10min离心200ml乳汁(来自哺乳期妇女)，去除上层乳脂，留乳清用于下步纯化。
2.离子交换法富集乳汁中的OPN和去除大部分杂蛋白。
材料：乳清(200ml)；DEAE sepharose(GE，20ml)；GE公司Akta Purify纯化仪。
流程：用磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡柱子后，取出DEAE sepharose和乳清4℃混合过夜；混合物自然沉降后，取混合物装柱；0.2M NaCl清洗柱子，流速10ml/min，洗去乳汁中的大部分杂蛋白，洗到曲线完全变平为止；0.4M NaCl洗脱，流速5ml/min，接洗脱峰(大概在50ml-100ml左右)用于下步纯化。
离子交换纯化后取样进行SDS-PAGE，结果如图1所示。
3.离子交换后所接洗脱峰处理：洗脱峰中加硫酸铵到1M/L；0.45um滤膜过滤除杂质。
4.疏水层析：
材料：phenyl sepharose HP(GE，5ml)
流程：phenyl sepharose HP用起始缓冲液平衡；样品过柱，流速2.5ml/min，起始缓冲液洗平，流速5ml/min，洗脱缓冲液梯度洗脱(起始缓冲液为A，洗脱缓冲液为B，2.5ml/min，100％B，30min，即15倍柱体积梯度洗脱)，接第一个洗脱峰，其中含有目的蛋白OPN。洗脱液置于冰上接，接完后，马上加PMSF蛋白酶抑制剂，然后用50ml超滤管超(BD，Amicon-ultra-15，30KDa)滤浓缩。
疏水层析后取样进行SDS-PAGE，结果如图2所示。
疏水层析样品的Western Blot结果如图3所示，纯化得到分子量大小为75KD左右，纯度为95％的OPN，经特异性抗OPN单抗(购自R&D，货号mAb14331)验证，纯化所得蛋白为OPN。
上述步骤中所用溶液配方如下：
1：离子交换：
0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.0)为磷酸(钠)缓冲液(20X)，含有0.2M磷酸二氢钠39.0ml和0.2M磷酸氢二钠61.0ml，调pH到7.0，使用时，稀释20倍。
0.2M NaCl：0.2M NaCl溶于1L 0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.0)。
0.4M NaCl：0.4M NaCl溶于1L 0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.0)。
2：疏水层析：
起始缓冲液：1M(NH4)2SO4，0.1M Na2HPO4，pH7.0，溶于1L蒸馏水；
洗脱缓冲液：0.1M Na2HPO4，pH7.0，溶于1L蒸馏水。
实施例2：动物免疫
选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8-12周，雌雄不限。抗原为实施例1制得的天然纯化的OPN蛋白。抗原原液浓度：1mg/ml；Balb/c小鼠免疫剂量：每只每次100μg OPN。注射方式为肌肉多点注射。使用时用PBS或生理盐水稀释。免疫程序：在第0、3和6周三次免疫。融合前三天取100μg加PBS稀释到0.5ml腹腔注射，做回忆刺激。末次免疫三天后，分离脾细胞融合。免疫结果显示在下表1中。
表1：第三次用OPN免疫之后小鼠血清中的抗体滴度
实施例3：杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备
1.骨髓瘤细胞株的培养
选择瘤细胞的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，我们采用的是SP2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均价，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9*105/ml，倍增时间通常为10-15h。融合细胞选择在对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞(活性大于95％)。骨髓瘤细胞株再融合前先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基为2*105/ml，次日一般为对数生长期细胞。
2.饲养细胞的培养
在体外培养条件下，细胞的生长以来适当的细胞密度。因而，在培养融合细胞活细胞克隆化培养时，还需加其他饲养细胞(feeder cell)。我们所有的饲养细胞为小鼠(BALB/c健康小鼠，中科院动物房)的腹腔细胞，制备方法为用冰冻培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其他细胞。
饲养细胞调至1*105/ml，提前一天置板孔中培养。
3.细胞融合
回忆刺激后三天融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可以从1∶2到1∶10不等，我们用1∶4的比例，保证了两种细胞在融合前都具有较高的活性。
4.有限稀释法
筛选阳性株选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能持续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后(一般稀释至0.8个细胞/孔)，按Poission法计算，应用的36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％-20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体分泌量，所用筛选用免疫所用抗原。首先把抗体的分泌量按照OD450＞1划分为阳性和阴性孔，对阳性克隆进行克隆化；连续三次克隆化均为100％阳性的克隆，再选做扩大培养或冻存。经过三次有限稀释法克隆化筛选得到五株抗体，分别命名为：S-10-4，S-195-5，S-113-6，S-77-1，S-294-4，经亚型测定(亚型检测采用BIO-RAD公司的小鼠亚型检测试剂盒)。
已于2009年4月30日将这些细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉大学)，其培养物名称与对应的保藏号如下所示：
| 培养物名称 | 保藏编号 |
| 杂交瘤细胞株S-294-4 | CCTCC-C200931 |
| 杂交瘤细胞株S-113-6 | CCTCC-C200932 |
| 杂交瘤细胞株S-10-4 | CCTCC-C200933 |
| 杂交瘤细胞株S-195-5 | CCTCC-C200934 |
| 杂交瘤细胞株S-77-1 | CCTCC-C200935 |
5.单克隆抗体的大量制备
取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。五株抗体分别按该体内诱生法制备腹水。腹水效价通过间接ELISA法检测。下表2显示五株单克隆抗体的特性测定。
表2抗OPN单克隆抗体的特性测定
| 克隆号 | 抗体滴度 | 抗体亚型 |
| s-10-4 | 0.933±0.082 | IgG1，κ |
| s-77-1 | 1.479±0.386 | IgG2b，κ |
| s-195-5 | 1.006±0.100 | IgG1，κ |
| s-113-6 | 1.972±0.065 | IgG1，κ |
| s-294-4 | 1.248±0.141 | IgG1，κ |
*细胞上清为1*106杂交瘤细胞在9ml培养基中培养三天。
表3 ELISA检测抗OPN单抗的腹水效价
| 克隆号 | 效价 |
| s-10-4 | 1,024,000 |
| s-77-1 | ＞＞1,024,000 |
| s-195-5 | 512,000 |
| s-113-6 | ＞1,024,000 |
| s-294-4 | ＞1,024,000 |
*ELISA抗原包被浓度为10ug/ml的OPN。
**腹水稀释倍数的倒数，第一次稀释为1∶1000。
实施例3：单克隆抗体的应用
1.抗体检测最敏感时稀释倍数
采用间接ELISA检测。用抗原过量包被(5ug/ml)，一抗为五株单抗梯度稀释，稀释度从1000-729000变化，二抗用羊抗鼠-HRP(Sigma)。
结果显示在图4和5中。通过曲线变化可以看出单抗在某一浓度时，曲线斜率最高，且OD450值接近1.0，说明抗体在此稀释度检测最为敏感，故选择1∶80000为最佳抗体检测稀释度。
2.抗体竞争性ELISA实验决定六株细胞株是否由一个抗原决定簇决定
抗体包被浓度为5ug/ml，一抗浓度为上述测定的抗体最敏感稀释度，二抗用羊抗鼠-HRP检测。通过实验结果可以得知，S-10-4、S-195-5、S-294-4为识别同一抗原决定簇，S-113-6、S-77-1分别识别另两个不同的抗原决定簇。
表3：抗体竞争性ELISA结果
注：编号分别代表：1＝S-10-4、2＝S-77-1，3＝S-195-5，4＝S-113-6，5＝S-294-4。下表同。
表4：竞争系数A.I.值计算
| 抗体编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 | 0.96 | 0.32 | 0.69 | 0.25 | |
| 2 | 0.83 | 0.63 | 0.65 | ||
| 3 | 0.82 | 0.44 | |||
| 4 | 0.83 |
注：A.I.代表了两个抗体的叠加效果，计算公式为：A.I.＝2*A1+2/(A1+A2)-1，如果两个抗体分别独立由不同的抗原决定簇决定，那么，该A.I.将接近1，如果两个抗体自由的被同一个抗原决定簇结合，那么该A.I.将接近0；如果A.I.数值在0.5左右，说明两个抗体的抗原决定簇有相应的重叠(Bertrand Friguet，Journal of Immunological Methods，30(1983)351-358)。
结论：从A.I.来看，2和1、3、4和3、5基本是有两个独立的抗原决定簇决定，而4和1、2，2和5的A.I.数值虽不高，但是仍可以看出，大部分抗原决定簇是不同的。
而其他A.I.均在0.25-0.45间，说明不同A.I.对应的不同抗体之间的抗原决定簇有很大部分是重叠的。
总结以上结果，在利用抗体夹心ELISA检测OPN时，可有四组配对，分别是2和1或3，4和3或5，也就是S-77-1与S-10-4或S-195-5，S-113-6与S-195-5或S-294-4，分别组成ELISA检测试剂盒。
实施例5：双抗体夹心ELISA法检测OPN
以上述的两两配对的单克隆抗体之一包被检测基质，比如包被S-195-5抗体，浓度为4ug/ml，4摄氏度过夜；洗涤后用稀释液封闭，37摄氏度温育2小时；充分洗涤后，待测样品(包括0-1000ng/ml一系列浓度梯度的OPN抗原)孵育；以所述的两两配对的另一单克隆抗体(HRP标记的S-77-1号抗体)作为检测抗体，加入反应体系；37摄氏度温育1个小时；洗涤后，加入酶反应底物显色10分钟，以450nm读取OD，再以抗原浓度为横坐标，OD450为纵坐标，绘制曲线。
样品稀释液为1％BSA，或者为正常人血清。检测结果显示在图6和图7中，从图中可见该双抗体夹心法(包被S-195-5抗体，HRP标记的S-77-1号抗体作为检测抗体)ELISA在0-1000ng/ml范围内，OD450读数与被检测的OPN浓度具有良好的线性关系。该方法可以有效的利用三对抗原决定簇的单克隆抗体检测OPN的含量。
结论：无论是在实验的环境下(1％BSA)还是在模拟的自然环境下(稀释到正常血清中)，OD450与OPN浓度之间都有着很好的线性关系，R2值均大于0.98。因此，0-1000ng是抗体的有效检测范围。
实施例6：细胞划痕修复实验
转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性之一。肿瘤的侵袭及转移是一个极其复杂的多因素、多步骤的序贯过程，OPN与恶性肿瘤转移的多个环节密切相关。对肿瘤细胞侵袭性的研究，需要建立相应的实验模型和方法学。大部分人乳腺癌细胞株在裸鼠体内可形成肿瘤，部分可形成转移灶，人乳腺癌转移细胞系MDA-MB-435是高转移潜能细胞株，不仅能局部浸润，还可转移到肺、骨等其他器官，而且其OPN高表达，因此选用MDA-MB-435作为验证抗OPN抗体功能试验的模型。初步功能实验结果表明，本发明制备的一株单克隆抗体S-113-6能显著抑制MDA-MB-435的迁移，提示这株抗体具有潜在的抑制肿瘤细胞转移的功能，为下一步开发靶向OPN的抗肿瘤药物打下基础。
为了研究本发明的单克隆抗体是否具有抗肿瘤转移功能，本发明人选择了一个简单的体外功能实验对抗体进行初步筛选。划痕损伤修复实验是一种简便的、直观的观察细胞迁移的实验，特别适用于研究细胞-基质和细胞-细胞之间相互作用。
具体实验步骤如下：将适当密度的MDA-MB-435细胞接种于24孔板中，每组平行3个样本，用10％FBS/DMEM培养基进行常规培养，至接近融合(90％)形成细胞单层。PBS洗涤，血清过夜饥饿；用10μl移液器头在MDA-MB-435s单层培养细胞上，沿培养板底部呈“一”字形进行单层培养细胞划痕。镜下记录划痕区相对距离。PBS洗去脱离的细胞，更换培养液，处理组中加入抗OPN单抗。37℃细胞培养箱内敷育48hrs；倒置显微镜下拍照。
结果显示在图8和9中。图8显示在划痕0小时和48小时两个时间点进行拍照，比较细胞迁移的能力。从图8可以看出，在S-113-6抗体处理组，中间划痕的距离明显比其他对照要宽，说明细胞往中间迁移能力下降。右图划痕距离的图是对前一个图的量化。
图9所示细胞划痕修复实验结果见图。实验结果显示，48hrs内S-113-6抗体处理的细胞比Mork组(PBS)和无关抗体对照组细胞迁移的能力显著降低。
通过细胞划痕实验证实S-113-6这株抗体能显著抑制人乳腺癌转移细胞株MDA-MB-435的迁移，具有潜在的抗肿瘤转移作用，为下步开发抗肿瘤转移抗体药物打下基础。
上文以具体实施方式的形式阐述了本发明，但本发明并不仅限于这些具体实施方式。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对本发明作出适当的修改和变动，这都在本发明的范围之内。
Claims (10)
1.一种抗骨桥蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为IgG，κ亚型抗体。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株产生：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
3.选自以下保藏编号的杂交瘤细胞株：CCTCC-C200931、CCTCC-C200932、CCTCC-C200933、CCTCC-C200934和CCTCC-C200935。
4.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)权利要求1或2所述的单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
5.一种检测试剂盒，其含有权利要求1或2所述的任一种抗体或权利要求4所述的免疫偶联物，或所述抗体或免疫偶联物的组合。
6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如下组合的抗体或其免疫偶联物：
(1)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200933产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(2)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200935产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；
(3)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200934产生的单克隆抗体或其免疫偶联物；和/或
(4)由杂交瘤细胞株CCTCC-C200931产生的单克隆抗体或其免疫偶联物与由杂交瘤细胞株CCTCC-C200932产生的单克隆抗体或其免疫偶联物。
7.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)有效量的权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求4所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
8.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求4所述的免疫偶联物在制备检测骨桥蛋白用的试剂盒中的用途。
9.权利要求1或2所述的单克隆抗体或权利要求4所述的免疫偶联物在制备治疗骨桥蛋白介导的疾病用的药物中的用途。
10.一种制备天然骨桥蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提供并离心含骨桥蛋白的体液，获得上清；
(2)采用离子交换法处理步骤(1)所得上清；和
(3)采用疏水层析法处理步骤(2)所得洗脱物，从而得到纯化的骨桥蛋白。
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