BRPI0306973B1

BRPI0306973B1 - Anticorpos anti-igf-ir, seu método de produção e seus usos, hibridoma murino, ácido nucléico isolado, vetor, composição, kit ou conjunto, e método diagnóstico in vitro de doenças induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor igf-ir

Info

Publication number: BRPI0306973B1
Application number: BRPI0306973-7A
Authority: BR
Inventors: Liliane Goetsch; Nathalie Corvaia; Olivier Leger
Original assignee: Pierre Fabre Medicament
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2020-03-03
Also published as: CN100410275C; WO2003059951A8; CA2473039A1; WO2003059951A2; HK1078590A1; DE60312639T2; EP1806364A3; AU2003216748B2; CN1620468A; EP1798242A3; BRPI0306973B8; EP1798242A2; AU2003216748A1; ZA200405402B; CA2473039C; EP1798242B1; EP1461359A2; EP1806364A2; SI1461359T1; JP2010233575A

Abstract

"anticorpos anti-igf-ir e respectivas aplicações". a presente invenção refere-se a novos anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao receptor humano do fator de crescimento i semelhante à insulina igf-ir e/ou capazes de inibirem especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor igf-ir, notadamente monocionais de origem murina, quiméricas e humanizadas, bem como as sequencias de aminoácido e nucléicos codificando para esses anticorpos. a invenção compreende também a utilização desses anticorpos a título de medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico de cânceres, bem como em processos ou necessários de diagnóstico de doenças ligadas à superexpressão do receptor igf-ir. a invenção compreende, enfim, produtos e/ou composições que compreendem esses anticorpos em associação com anticorpos e/ou compostos anti-egfr e/ou agentes anticancerosos ou conjugados com toxinas e sua utilização para a prevenção e/ou o tratamento de certos cânceres.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS ANTI-IGF-IR, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO E SEUS USOS, HIBRIDOMA MURINO, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, VETOR, COMPOSIÇÃO, KIT OU CONJUNTO, E MÉTODO DIAGNÓSTICO IN VITRO DE DOENÇAS INDUZIDAS POR UMA SUPEREXPRESSÃO OU UMA SUBEXPRESSÃO DO RECEPTOR IGF-IR.

[0001] A presente invenção refere-se a novos anticorpos capazes de se ligarem especificamente ao receptor humano do fator de crescimento I semelhante à insulina IGF-IR e/ou capazes de inibirem especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor IGF-IR, notadamente monoclonais de origem murina, quiméricas e humanizadas, bem como as sequências de aminoácido e nucléicos codificando para esses anticorpos. A invenção compreende também a utilização desses anticorpos a título de medicamento para o tratamento profilático e/ou terapêutico de cânceres que superexpressam o IGF-IR ou de qualquer patologia ligada à superexpressão desse receptor, bem como em processos ou necessárias de diagnóstico de doenças ligadas à superexpressão do receptor IGF-IR. A invenção compreende, enfim, produtos e/ou composições que compreendem esses anticorpos em associação com anticorpos e/ou compostos anti-EGFR e/ou agentes anticancerosos ou conjugados com toxinas e sua utilização para a prevenção e/ou o tratamento de certos cânceres.

[0002] O receptor do fator de crescimento I semelhante à insulina denominado IGF-IR (IGF-IR para Insuline-like Growth Factor-I Receptor) é um receptor com atividade tirosina quinase, comportando 70 % de homologia com o receptor à insulina IR (IR para Receptor de Insulina). O IGF-IR é uma glicoproteína de peso molecular de aproximadamente 350 000. É um receptor heterotetramétrico do qual

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2/103 cada metade, ligada por pontes dissulfeto, é composta de uma subunidade α extracelular e de uma subunidade β transmembranária (ver a figura 1). O IGF-IR fixa o IGF I e o IGF II com uma afinidade muito grande (Kd # 1 nM), mas é também capaz de se ligar à insulina com uma afinidade 100 a 1000 vezes menor. Inversamente, o IR fixa a insulina com uma afinidade muito grande, enquanto que os IGFs só se fixam no receptor à insulina com uma afinidade 100 vezes inferior. O domínio tirosina quinase do IGF-IR e do IR apresentam uma homologia muito acentuada de sequência, enquanto que as zonas de mais baixa homologia referem-se, respectivamente, à região rica em cisteína situada sobre a subunidade α e a parte C-terminal da subunidade β. As diferenças de sequências observadas na subunidade α ficam situadas na zona de fixação dos ligantes e são, p, a origem das afinidades relativas do IGF-IR e do IR para os IGFs e a insulina respectivamente. As diferenças na parte C-terminal da subunidade β resultam em uma divergência nas vias de sinalização dos dois receptores; o IGF-IR mediando efeitos mitogênicos, de diferenciação e de antiapoptose, enquanto que a ativação do IR acarreta principalmente efeitos ao nível das vias metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999).

[0003] As proteínas tirosina-quinases citoplásmicas são ativadas pela fixação do ligante ao domínio extracelular do receptor. A ativação das quinases acarreta, por sua vez, o estímulo de diferentes substratos intracelulares, incluindo o IRS-1, o IRS-2, Shc e Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). Os dois substratos maiores do IGF-IR são IRS e Shc que mediam, pela ativação de numerosos efetuadores a jusante, a maior parte dos efeitos de crescimento e de diferenciação ligados à fixação dos IGFs nesse receptor (figura 2). A disponibilidade de substratos pode, por

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3/103 conseguinte, ditar o efeito biológico final ligado à ativação do IGF-IR. Quando o IRS-1 predomina, as células tendem a proliferar e a se transformar. Quando Shc domina, as células tendem a se diferenciar (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem., 274: 12423-12430, 1999). Parece que a via principalmente em causa para os efeitos de proteção contra a apoptose seja a via das fosfatidilinositol 3-quinases (PI 3-quinases) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999).

[0004] O papel do sistema IGF na cancerogênese é tornado o sujeito de pesquisas intensas nos dez últimos anos. Esse interesse seguiu a descoberta pelo fato de, além de suas propriedades mitogênicas e antioaptóticas, o IGF-IR parecer ser requerido para o estabelecimento e a manutenção de um fenótipo transformado. Na realidade, foi be-estabelecido que uma superexpressão ou uma ativação constitutiva do IGF-IR leva, em uma grande variedade de células, a um aumento das células independentemente do suporte nos meios desprovidos do soro de bezerro fetal, e à formação de tumores no rato nú. Isto não é em si uma propriedade única, já que uma grande variedade de produtos de genes superexpressos podem transformar células, incluindo um bom número de receptores de fatores de crescimento. Mas a descoberta crucial que claramente colocou em evidência o papel maior exercido pelo IGF-IR na transformação foi a demonstração que as células R-, nas quais o gene codificando para o IGF-IR foi inativado, são totalmente refratárias à transformação por diferentes agentes que são habitualmente capazes de transformar as células como a proteína E5 do papiloma vírus bovino, uma superexpressão do EGFR ou do PDGFR, o antígeno T de SV40, nível ativado ou a combinação desses dois últimos fatores (Sell C. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303,

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1995; Coppola D. et. al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994;

DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164:214-221, 1995).

[0005] O IGF-IR é expresso em uma grande variedade de tumores e de linhagens tumorais e os IGFs amplificam o aumento tumoral via fixação no IGF-IR. Outros argumentos em favor do papel de IGF-IR na cancerogênese provém de estudos que utilizam anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra o receptor ou dominantes negativos do IGF-IR. Com efeito, anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra o IGF-IR inibem a proliferação de numerosas linhagens celulares em cultura e o aumento de células tumorais in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:92-98, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58:4127-4131, 1998). Foi também mostrado nos trabalhos de Jiang et al. (Oncogene, 18:6071-6077, 1999) que um dominante negativo do IGF-IR é capaz de inibir a proliferação tumoral.

[0006] A presente invenção tem por objetivo poder dispor de um anticorpo monoclonal murino, de preferência um anticorpo quimerizado ou humanizado, que reconhecerá especificamente e com uma forte afinidade o IGF-IR. Esse anticorpo não interagirá ou interagirá pouco com o receptor IR da insulina. Sua fixação deverá inibir in vitro o aumento dos tumores que expressam o IGF-IR, interagindo principalmente com as vias de transdução do sinal ativadas, quando das interações IGF1/IGF-IR e IGF2/IGF-IR. Esse anticorpo deverá ser ativo in vivo sobre todos os tipos de tumores que expressam o IGF-IR aí incluídos os tumores do seio estrogênio dependentes e os tumores da próstata, o que não é o caso para os anticorpos monoclonais (anotados AcM ou ACM) anti-IGF-IR atualmente disponíveis. Com efeito, o aIR3, que faz referência no domínio do IGF-IR, inibe totalmente o aumento de tumores do seio estrogênio dependentes

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5/103 (MCF-7) in vitro, mas não tem efeito sobre o modelo correspondente in vivo (Artega C. et al., J. Clin. Invest. 84:1418-1423, 1989). Da mesma forma, o fragmento scFv-Fc derivado do monoclonal murino 1H7, é apenas ligeiramente ativo sobre o tumor do seio MCF-7 e totalmente inativo sobre um tumor da próstata andrógeno independente (Li S.L. et al., Cancer Immunol. Immunother., 49:243-252, 2000).

[0007] De maneira surpreendente, os inventores colocaram em evidência um anticorpo quimérico (denominado C7C10) e dois anticorpos humanizados denominados respectivamente h7C10 forma humanizada 1 e h7C10 forma humanizada 2, derivados do anticorpo monoclonal murino 7C10, reconhecendo o IGF-IR e respondendo a todos os critérios enunciados acima, isto é, a um não reconhecimento do receptor à insulina, a um bloqueio in vitro da proliferação IGF1 e/ou IGF2 induzida, mas também à inibição in vivo do aumento de diferentes tumores expressando o IGF-IR dentre as quais um osteossarcoma e um tumor de pulmão não com pequenas células, mas também e mais particularmente o tumor do seio estrogênio dependente MCF-7 e um tumor da próstata andrógeno independente DU-145. Da mesma forma, e de forma surpreendente, a intensidade de inibição do aumento tumoral das células MCF-7 in vivo pelo anticorpo 7C10 é comparável, até mesmo significativamente superior, àquele observado com o tamoxifen um dos compostos de referência no tratamento dos tumores do seio estrogênios dependentes. Por outro lado, foi mostrado que esses anticorpos inibem a fosforilação da tirosina da cadeia beta do IGF-IR e do IRS1, primeiro substrato do receptor. Além disso, foi também estabelecido que esses anticorpos provocam a internalização desse receptor e sua degradação contrariamente ao que é habitualmente observado com os ligantes naturais que permitem a reciclagem rápida do receptor na superfície das células. Esses anticorpos puderam ser caracterizados por sua

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6/103 sequência peptídica e nucléica, notadamente pela sequência de suas regiões determinando sua complementaridade (CDR) para o IGF-IR. [0008] Assim, de acordo com uma primeira forma de execução, a presente invenção tem por objetivo um anticorpo isolado, ou um de seus fragmentos funcionais, esse anticorpo ou um de seus ditos fragmentos sendo capaz de se ligar especificamente ao receptor humano do fator de aumento I aparentado à insulina IGF-IR e, se for o caso, de preferência capaz, além disso, de inibir a fixação natural dos ligantes IGF1 e/ou IGF2 de IGF-IR e/ou capaz de inibir especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor IGF-IR, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma região CDR determinante da complementaridade escolhida dentre os CDRs de sequência de aminoácido SEQ ID números 2, 4 ou 6, ou pelo menos um CDR, cuja sequência apresenta pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID números 2, 4 ou 6, ou pelo fato de compreender uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um CDR escolhido dentre os CDRs de sequência de aminoácido SEQ ID números 8, 10 e 12, ou pelo menos um CDR cuja sequência apresenta pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 8, 10 e 12.

[0009] Na presente descrição, os termos se ligar e se fixar têm a mesma significação e são intercambiáveis.

[00010] Na presente descrição, os termos polipeptídeos, sequências polipeptídicas, peptídeos e proteínas ligadas aos compostos anticorpos ou à sua sequência são intercambiáveis.

[00011] Deve ser compreendido no caso que a invenção não referese aos anticorpos sob a forma natural, isto é, que são considerados em seu meio ambiente natural, mas que puderam ser isolados ou

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7/103 obtidos por purificação a partir de fontes naturais, ou obtidos por recombinação genética, ou por síntese química, e que podem então comportar aminoácidos não-naturais conforme será descrito depois.

[00012] Por região CDR ou CDR, entende-se designar as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas conforme definidas por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). Existem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. O termo CDR ou CDRs é utilizado no caso para designar, segundo os casos, uma dessas regiões ou várias, até mesmo o conjunto, dessas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis pela ligação por afinidade do anticorpo pelo antígeno ou pelo epítopo que ele reconhece.

[00013] Por porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucléico ou de aminoácido no sentido da presente invenção, entende-se designar uma percentagem de nucleotídeos ou de resíduos de aminoácidos idênticos entre as duas sequências a comparar, obtido após o melhor alinhamento (alinhamento ótimo), essa percentagem sendo puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências sendo repartidas ao acaso e por todo o seu comprimento. As comparações de sequências entre duas sequências de ácido nucléico ou de aminoácido são tradicionalmente realizadas, comparando-se essas sequências após tê-las alinhado de maneira ótima, essa comparação podendo ser realizada por segmento ou por janela de comparação. O alinhamento ótimo das sequências para a comparação pode ser realizado, além de manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Warteman (1981)[AD. App. Math. 2:482], por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por meio do método de

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8/103 pesquisa de similaridade de Pearson e Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], por meio de softwares informáticos, utilizando esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou ainda pelos programas de comparação BLAST N ou BLAST P).

[00014] A percentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucléico ou de aminoácido é determinada, comparando-se essas duas sequências alinhadas de maneira ótima na qual a sequência de ácido nucléico ou de aminoácido a comparar pode compreender adições ou deleções em relação à sequência de referência para um alinhamento ótimo entre essas duas sequências. A percentagem de identidade é calculado, determinando o número de posições idênticas para os quais o nucleotídeo ou o resíduo de aminoácido é idêntico entre as duas sequências, dividindo esse número de posições idênticas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado obtido para 100 para se obter a percentagem de identidade entre essas duas sequências.

[00015] Por exemplo, poder-se-á utilizar o programa BLAST, BLAST 2 sequências (Tatusova et al., Blast 2 sequências - a new tool for comparing portein and nucleotide sequences, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponível sobre o site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, os parâmetros utilizados sendo aqueles dados por defeito (em particular para os parâmetros open gap penaltie: 5, e extension gap penaltie : 2; a matriz escolhida sendo, por exemplo, a matriz BLOSUM 62 proposta pelo programa), a percentagem de identidade entre as duas sequências a comparar sendo calculada diretamente pelo programa.

Por sequência de aminoácido apresentando pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 % de identidade com uma

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9/103 sequência de aminoácido de referência, preferem-se aquelas que apresentam em relação à sequência de referência, certas modificações, em particular uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, um truncamento ou um alongamento. No caso de uma substituição, de um ou vários ácido(s) aminado(s) consecutivo(s) ou não consecutivo(s), preferem-se as substituições nas quais os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos equivalentes. A expressão aminoácidos equivalentes visa no caso designar qualquer aminoácido capaz de ser substituído por um dos aminoácidos da estrutura de base sem, todavia, modificar essencialmente as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e tais como serão definidas na sequência, notadamente nos exemplos.

[00016] Esses aminoácidos equivalentes podem ser determinados seja apoiando-se sobre sua homologia de estrutura com os aminoácidos aos quais substituem, seja sobre resultados de testes comparativos de atividade biológica entre os diferentes anticorpos capazes de serem efetuados.

[00017] A título de exemplo, mencionam-se as possibilidade de substituição capazes de serem efetuadas, sem que resulte em uma modificação aprofundada da atividade biológica do anticorpo modificado correspondente. Pode-se substituir assim a leucina pela valina ou a isoleucina, o ácido aspártico pelo ácido glutâmico, a glutamina pela asparagina, a arginina pela lisina, etc., as substituições inversas sendo naturalmente consideráveis nas mesmas condições. [00018] Os anticorpos, segundo a presente invenção, são, de preferência, anticorpos monoclonais específicos, notadamente de origem murina, quiméricas ou humanizadas que poderão ser obtidas segundo os métodos padrão bem-conhecidas do técnico.

[00019] Em geral, para a preparação de anticorpos monoclonais ou

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10/103 seus fragmentos funcionais, notadamente de origem murina, poder-seá fazer referência às técnicas que são, em particular, descritas no manual Antibodies(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratiry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou à técnica de preparação a partir de hibridomas descrita por Kohler e Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

[00020] Os anticorpos monoclonais, de acordo com a invenção, podem ser obtidos, por exemplo, a partir de célula de um animal imunizado contra o receptor IGF-IR, ou um de seus fragmentos que comportam o epítopo reconhecido especificamente por esses anticorpos monoclonais, de acordo com a invenção. Esse receptor IGF-IR, ou um de seus ditos fragmentos, poderá notadamente ser produzido segundo modos operacionais usuais, por recombinação genética, a partir de uma sequência de ácido nucléico contida na sequência do ADNc codificando para o receptor IGF-IR ou por síntese peptídica a partir de uma sequência de aminoácidos compreendida na sequência peptídica do receptor IGF-IR.

[00021] Os anticorpos monoclonais, de acordo com a invenção, poderão, por exemplo, ser purificados sobre uma coluna de afinidade sobre a qual foi previamente imobilizado o receptor IGF-IR ou um de seus fragmentos que comportam o epitopo reconhecido especificamente por esses anticorpos monoclonais, de acordo com a invenção. Mais particularmente, esses anticorpos monoclonais poderão ser purificados por cromatografia sobre proteína A e/ou G, seguida ou não por uma cromatografia por troca de íons visando a eliminar os contaminadores protéicos residuais, assim como o DNA e os LPS, ela própria seguida ou não por uma cromatografia de exclusão sobre gel de sefarose, a fim de eliminar os agregados potenciais, devido à presença de dímeros ou de outros multímeros. De maneira ainda mais preferida, o conjunto dessas técnicas pode ser aplicado

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11/103 simultânea ou sucessivamente.

[00022] São também compreendidos por anticorpos, de acordo com a presente invenção, os anticorpos quiméricos ou humanizados.

[00023] Por anticorpo quimérico, entende-se designar um anticorpo que contém uma região variável (cadeia leve e cadeia pesada) natural, derivada de um anticorpo de uma espécie determinada em associação com as regiões constantes de cadeia leve e cadeia pesada de um anticorpo de uma espécie heteróloga a essa espécie determinada.

[00024] Os anticorpos ou seus fragmentos de tipo quimérico, de acordo com a invenção, podem ser preparados aplicando-se as técnicas de recombinação genética. Por exemplo, o anticorpo quimérico poderá ser produzido clonando-se um DNA recombinante, comportando um promotor e uma sequência codificando para a região variável de um anticorpo monoclonal não-humano, notadamente murino, de acordo com a invenção, e uma sequência codificando para a região constante de anticorpo humano. Um anticorpo quimérico da invenção codificado por esse gene recombinante será, por exemplo, uma quimera rato-homem, a especificidade desse anticorpo sendo determinada pela região variável derivada do DNA murino e seu isótipo determinado pela região constante derivada do DNA humano. Para os métodos de preparação de anticorpos quiméricos, poder-se-á, por exemplo, se referir ao documento Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

[00025] Por anticorpos humanizados, entende-se designar um anticorpo que contém regiões CDRs derivadas de um anticorpo de origem não humana, as outras partes da molécula anticorpo sendo derivada de um (ou de vários) anticorpos humanos. Além disso, certos resíduos dos segmentos do esqueleto (denominados FR) podem ser modificados para conservar a afinidade de ligação (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536,

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1988; Riechmann et al. Nature, 332:323-327, 1988).

[00026] Os anticorpos humanizados, de acordo com a invenção, ou seus fragmentos podem ser preparados por técnicas conhecidas do técnico (como, por exemplo, aquelas descritas nos documentos Singer et al., J.Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992; ou Bebbington et al., Bio/Technology,

10:169-175, 1992). Esses anticorpos humanizados, de acordo com a invenção, são preferidos para sua utilização em métodos de diagnóstico in vitro, ou de tratamento profilático e/ou terapêutico in vivo.

[00027] Por fragmento funcional de um anticorpo, de acordo com a invenção, entende-se designar em particular um fragmento de anticorpos, tal como fragmentos Fv, scFv (sc para simples cadeia), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento cuja duração de meia-vda teria sido aumentada por modificação química, como o acréscimo de poli(alquileno) glicol, tal como o poli(etileno)glicol (PEGilação) (fragmentos pegilados, denominados Fv-PEG, scFvPEG, Fab-PEG, (Fab')2-PEG ou Fab'-PEG) (PEGpara

Poli(Etileno)Glicol), ou por incorporação em um lipossoma, esses fragmentos apresentando pelo menos um dos CDRs de sequência SEQ ID N^o 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, características de acordo com a invenção, e, notadamente, pelo fato de ser capaz de exercer de maneira geral uma atividade mesmo parcial do anticorpo do qual ele é oriundo, tal como, em particular, a capacidade de reconhecer e se ligar ao receptor IGF-IR, e, se for o caso, para inibir a atividade do receptor IGF-IR.

[00028] De preferência, esses fragmentos funcionais serão constituídos ou compreenderão uma sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo dos quais são derivados, essa sequência parcial sendo suficiente para reter a mesma especificidade

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13/103 de ligação que o anticorpo do qual ela é oriunda e uma afinidade suficiente, de preferência pelo menos igual a 1/100, de maneira mais preferida a pelo menos 1/10 daquela do anticorpo do qual ela é oriunda, face ao receptor IGF-IR.

[00029] Esse fragmento funcional comportará no mínimo 5 aminoácidos, de preferência 10, 15, 25, 50 e 100 aminoácidos consecutivos da sequência do anticorpo do qual ele é oriundo.

[00030] De preferência, esses fragmentos funcionais serão fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diacorpos, que possuem geralmente a mesma especificidade de fixação que o anticorpo do qual são oriundos. De acordo com a presente invenção, fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos, tais como descritos anteriormente por métodos, tais como a digestão por enzimas, como a pepsina ou a papaína e/ou por clivagem das pontes dissulfetos por redução química. De outra maneira, os fragmentos de anticorpos compreendidos na presente invenção podem ser obtidos por técnicas de recombinações genéticas bem-conhecidas também do técnico ou ainda por síntese peptídica por meio, por exemplo, de sintetizadores automáticos de peptídeos, tais como aqueles fornecidos pela sociedade Applied Biosystems, etc.

[00031] De maneira mais preferida, a invenção compreende os anticorpos, ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, notadamente quiméricos ou humanizados, obtidos por recombinação genética ou por síntese química.

[00032] Em um modo de realização preferido, a invenção tem por objetivo um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada que compreende pelo menos um CDR de sequência SEQ ID N^o 12 ou uma sequência que apresenta pelo menos 80 % de

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14/103 identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 12. [00033] Dentre as seis curtas sequências de CDR, a terceira CDR da cadeia pesada (CDRH3) tem maior variabilidade de tamanho (grande diversidade essencialmente devido aos mecanismos de disposição dos genes que dão origem). Pode ser tão curta quanto 2 aminoácidos, enquanto que o tamanho mais longo conhecido é de 26. Funcionalmente, o CDRH3 exerce um papel à parte na determinação da especificidade do anticorpo (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233:747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989;

Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol, 147:1709-1719, 1991).

[00034] É sabido que só uma pequena percentagem dos aminoácidos dos CDRs contribui para a construção de local de ligação do anticorpo, mas esses resíduos devem ser mantidos em uma conformação tridimensional muito específica.

[00035] De maneira mais preferida, a presente invenção é relativa a um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada, compreendendo pelo menos dois dos três CDRs ou os três CDRs de sequência SEQ ID N^os 8, 10 e 12, ou pelo menos dois de três CDRS ou três CDRS de sequência que apresentam, respectivamente, pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 8, 10 e 12.

[00036] Em um modo de realização também preferido, a invenção tem por objetivo um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve que compreende pelo menos um CDR escolhido dentre os CDRs de sequência SEQ ID N^o 2, 4 ou 6, ou um CDR, cuja

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15/103 sequência apresenta pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 2, 4 ou 6.

[00037] Em um modo de realização mais preferido, a invenção tem por objetivo um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve que compreende pelo menos dois dos três CDRS ou os três CDRs de sequência SEQ ID N^os 2, 4 e 6, ou pelo menos dois de três CDRs ou três CDRS de sequência apresentando, respectivamente, pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 2, 4 e 6.

[00038] De maneira mais preferida, o anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, é caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia pesada, compreendendo os três CDRs de sequência SEQ ID N^os 8, 10 e 12, ou três CDRs de sequência que apresenta respectivamente pelo menos 80 % de identidade, após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 8, 10 e 12 e pelo fato de compreender, além disso, uma cadeia leve que compreende os três CDRs de sequência SEQ ID N^o 2, 4 e 6, ou três CDRS de sequência que apresenta respectivamente pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 2, 4 e 6.

[00039] Sob um outro aspecto, a presente invenção tem por objetivo um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de não se fixar ou não se fixar de maneira significativa no receptor humano IR da insulina.

[00040] De maneira preferida, esses fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, serão escolhidos dentre os fragmentos Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, ou qualquer fragmento funcional, cuja meia-vda teria sido aumentada por uma modificação química, notadamente por PEGilação, ou pela

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16/103 incorporação em lipossoma.

[00041] Sob um outro aspecto, a invenção é relativa a um hibridoma murino capaz de secretar um anticorpo monoclonal, de acordo com a presente invenção, notadamente o hibridoma de origem murina, tal como depositado no Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, França), aos 19 de setembro de 2001, sob o número I-2717.

[00042] O anticorpo monoclonal denominado no caso 7C10, ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato desse anticorpo ser secretado pelo hibridoma depositado na CNCM, aos 19 de setembro de 2001 sob o número I-2717 faz naturalmente parte da presente invenção.

[00043] Em um modo de realização particular, a presente invenção é relativa a um anticorpo murino, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato desse anticorpo compreender uma cadeia leve de sequência, compreendendo a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 54, ou uma sequência que apresenta pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 54, ou/e pelo fato de compreender uma cadeia pesada de sequência que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 69, ou uma sequência que apresenta pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 69.

[00044] Sob um aspecto também particular, a presente invenção é relativa a um anticorpo quimérico, ou a um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato desse anticorpo compreender, além disso, as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga do rato, notadamente do Homem, e de maneira preferida, pelo fato das regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada

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17/103 derivadas de um anticorpo humano serem respectivamente a região kappa e, gama-1, gama-2 ou gama-4.

[00045] Sob um aspecto também particular, a presente invenção é relativa a um anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato desse anticorpo compreender uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada nas quais os segmentos de esqueleto FR1 a FR4 (tais como definidos a seguir nos exemplos 12 e 13, nas tabelas 5 e 6) dessa cadeia leve e/ou cadeia pesada são derivados respectivamente de segmentos de esqueleto FR1 a FR4 de cadeia leve e/ou de cadeia pesada de anticorpos humanos.

[00046] De acordo com um modo de realização preferido, o anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a presente invenção, é caracterizado pelo fato desse anticorpo humanizado compreender uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 61 ou 65, ou uma sequência que apresenta pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 61 ou 65, ou/e pelo fato de compreender uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 75, 79 ou 83, ou uma sequência que apresenta pelo menos 80 % de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 75, 79 ou 83.

[00047] De preferência, o anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, é caracterizado pelo fato desse anticorpo humanizado compreender uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 65, e pelo fato de compreender uma cadeia pesada de sequência que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID N^o 79 ou 83, de preferência SEQ ID N^o 83.

[00048] Sob um novo aspecto, a presente invenção é relativa a um

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18/103 ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre os seguintes ácidos nucléicos:

a) um ácido nucléico, DNA ou RNA, codificando para um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção;

b) um ácido nucléico complementar de um ácido nucléico, tal como definido em a); e

c) um ácido nucléico de pelo menos 18 nucleotídeos capaz de se hibridizar em condições de forte estringência com pelo menos um dos CDRS de sequência de ácido nucléico SEQ ID N^o 1, 3, 5, 7, 9, ou 11, ou com uma sequência que apresenta pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 %, de identidade após alinhamento ótimo com a sequência SEQ ID N^o 1,3, 5, 7, 9 ou 11.

[00049] Por ácido nucléico, sequência nucléica ou de ácido nucléico, polinucleotídeo, oligonucleotídeo, sequência de polinucleotídeo, sequência nucleotídica, termos que serão empregados indiferentemente na presente descrição, entende-se designar um encadeamento preciso de nucleotídeos, modificados ou não, permitindo definir um fragmento ou uma região de um ácido nucléico, comportando ou não nucleotídeos não-naturais, e podendo corresponder tanto a um DNA de duplo filamento, um DNA de simples filamento quanto aos produtos de transcrição desses DNAs.

[00050] Deve ser também entendido no caso que a presente invenção não refere-se às sequências nucleotídicas em seu meio ambiente cromossômico natural, isto é, no estado natural. Trata-se de sequências que foram isoladas e/ou purificadas, isto é, foram retiradas direta ou indiretamente, por exemplo por cópia, seu meio ambiente tendo sido pelo menos parcialmente modificado. Entende-se assim também designar no caso os ácidos nucléicos isolados obtidos por recombinação genética por meio, por exemplo, de células hospedeiras

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19/103 ou obtidos por síntese química.

[00051] Por sequências nucléicas que apresentam uma percentagem de identidade de pelo menos 80 %, de preferência 85 %, 90 %, 95 % e 98 %, após alinhamento ótimo com uma sequência de preferência, entende-se designar as sequências nucléicas que apresentam, em relação à sequência nucléica de referência, certas modificações como, em particular, uma deleção, um truncamento, um alongamento, uma fusão quimérica e/ou uma substituição notadamente pontual. Trata-se, de preferência, de sequências cujas sequências codificam para as mesmas sequências de aminoácidos que a sequência de referência, isto ligado à degenerescência do código genético, ou de sequências complementares que são capazes de se hibridizarem especificamente com as sequências de referência, de preferência em condições de forte estringência notadamente tais como definidas a seguir.

[00052] Um hibridização em condições de forte estringência significa que as condições de temperatura e de força iônica são escolhidas de tal maneira que permitem a manutenção da hibridização entre dois fragmentos de DNA complementares. A título ilustrativo, condições de forte estringência da etapa de hibridização para fins de definir os fragmentos polinucleotídicos descritos acima, são vantajosamente as seguintes.

[00053] A hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA é realizada em duas etapas: (1) pré-hibridização a 42 ^oC durante 3 horas em tampão fosfato (20 mH, pH 7,5) contendo 5 x SSC (1 x SSC corresponde a uma solução 0,15 M NaCl + 0,015 M citrato de sódio), 50 % de formamida, 7 % de dodecil sulfato de sódio (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfato de 1 % de DNA de esperma de salmão; (2) hibridização propriamente dita durante 20 horas a uma temperatura dependente do tamanho da sonda (isto é, 42 ^oC, para uma sonda de tamanho > 100

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20/103 nucleotídeos) seguida de 2 lavagens de 20 minutos a 20 ^oC em 2 x SSC + 2 % SDS, uma lavagem de 20 minutos a 20 ^oC em 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. A última lavagem é praticada em 0,1 x SSC + 0,1 % SDS, durante 30 minutos a 60 ^oC para uma sonda de tamanho > 100 nucleotídeos. As condições de hibridização de forte estringência descritas acima para um polinucleotídeo de tamanho definido podem ser adaptadas pelo técnico para oligonucleotídeos de tamanho maior ou menor, segundo o ensinamento de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2^a Ed. Cold Spring Harbor).

[00054] A invenção também refere-se a um vetor que compreende um ácido nucléico, de acordo com a presente invenção.

[00055] A invenção visa notadamente os vetores de clonagem e/ou de expressão que contêm uma sequência nucleotídica, de acordo com a invenção.

[00056] Os vetores, de acordo com a invenção, comportam, de preferência, elementos que permitem a expressão e/ou a secreção das sequências nucleotídicas em uma célula hospedeira determinada. O vetor deve então comportar um promotor, sinais de iniciação e de terminação da tradução, assim como regiões apropriadas de regulagem da transcrição. Deve poder ser mantido de forma estável na célula hospedeira e pode eventualmente possuir sinais particulares que especificam a secreção da proteína traduzida. Esses diferentes elementos são escolhidos e otimizados pelo versado na técnica em função da hospedeira celular utilizada. Para isso, as sequências nucleotídicas, de acordo com a invenção, podem ser inseridas em vetores de réplica autônoma no meio da hospedeira escolhida, ou ser vetores integrativos da hospedeira escolhida.

[00057] Esses vetores são preparados por métodos comumente utilizados pelo versado na técnica, e os clones resultantes podem ser introduzidos em um hospedeiro apropriado por métodos padrões, tais

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21/103 como a lipofecção, a eletroporação, o choque térmico, ou métodos químicos.

[00058] Os vetores, de acordo com a invenção, são, por exemplo, vetores de origem plasmídica ou viral. São úteis para transformar células hospedeiras, a fim de clonar ou expressar as sequências nucleotídicas, de acordo com a invenção.

[00059] A invenção compreende também as células hospedeiras transformadas por ou compreendendo um vetor, de acordo com a invenção.

[00060] A hospedeira celular pode ser escolhida dentre sistemas procariotes ou eucariotes, por exemplo as células bacterianas, mas também as células de levedura ou as células animais, em particular as células de mamíferos. Podem-se também utilizar células de insetos ou células de plantas.

[00061] A invenção refere-se também aos animais, exceto o Homem, que compreendem pelo menos uma célula transformada, de acordo com a invenção.

[00062] Sob um outro aspecto, a invenção tem por objetivo um processo de produção de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a) a cultura em um meio e condições de cultura apropriados de uma células hospedeira, de acordo com a invenção; e

b) a recuperação desses anticorpos, ou um de seus fragmentos funcionais, assim produzidos a partir do meio de cultura ou dessas células cultivadas.

[00063] As células transformadas, de acordo com a invenção, são utilizáveis em processos de preparação de polipeptídeos recombinantes, de acordo com a invenção. Os processos de preparação de um polipeptídeo, de acordo com a invenção, sob a

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22/103 forma recombinante, caracterizados pelo fato de utilizarem um vetor e/ou uma célula transformada por um vetor, de acordo com a invenção, estão eles próprios compreendidos na presente invenção. De preferência, cultiva-se uma célula transformadas por um vetor, de acordo com a invenção, em condições que permitem a expressão desse polipeptídeo e recupera-se esse peptídeo recombinante.

[00064] Assim como foi dito, a hospedeira celular pode ser escolhida dentre sistemas procariotes ou eucariotes. Em particular, é possível identificar sequências nucleotídicas, de acordo com a invenção, facilitando a secreção nesse sistema procariote ou eucariote. Um vetor, de acordo com a invenção, portando essa sequência pode, portanto, ser vantajosamente utilizado para a produção de proteínas recombinantes, destinadas a serem secretadas. Com efeito, a purificação dessas proteínas recombinantes de interesse será facilitada pelo fato de estarem presentes no que flutua da cultura celular mais do que no interior das células hospedeiras.

[00065] Podem-se também preparar os polipeptídeos, de acordo com a invenção, por síntese química. Esse processo de preparação é também um objetivo da invenção. O versado na técnica conhece os processos de síntese química, por exemplo as técnicas que utilizam fases sólidas (ver notadamente Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2^a edição, (1984)) ou técnicas que utilizam fases sólidas parciais, por condensação de fragmentos ou por uma síntese em solução clássica. Os polipeptídeos obtidos por síntese química e podendo comportar aminoácidos não-naturais correspondentes estão também compreendidos na invenção.

[00066] Os anticorpos, ou um de seus fragmentos funcionais, capazes de serem obtidos por um processo, de acordo com a invenção, estão também compreendidos na presente invenção.

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23/103 [00067] De acordo com uma segunda forma de execução, a presente invenção refere-se a um anticorpo, de acordo com a invenção, tal como descrito mais acima, caracterizado pelo fato de, além disso, capaz de se ligar especificamente sobre o receptor humano do fator de crescimento da epiderme EGFR e/ou capaz de inibir especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor EGFR.

[00068] De maneira geral, os fatores de crescimento são pequenas proteínas implicadas na regulagem da proliferação e da diferenciação das células normais. Determinados desses fatores de crescimento exercem também um papel importante na iniciação e na manutenção da transformação celular, podendo funcionar como fatores autócrinos ou parácrinos. É notadamente o caso, além do IGF1 descrito mais acima, do fator de crescimento da epiderme EGF (EGF para Epidermal Growth Facto/') que parece particularmente implicado no aparecimento do fenótipo tumoral a progressão dos tumores e a geração das metástases.

[00069] O EGF e o IGF1 exercem sua ação por intermédio de seu receptor respectivo denominado no caso EGFR e IGF-IR. Trata-se nos dois casos de receptores membranários com atividade tirosina quinase, cuja superexpressão é descrita em numerosos cânceres. É preciso todavia notar que a interação desses dois receptores não é claramente estabelecida e que os estudos feitos por diversas equipes a esse propósito dão resultados contraditórios quanto à colaboração desses dois receptores.

[00070] Trabalhos feitos sobre células de tumores da próstata mostram que a interrupção do circuito autócrino EGF/EGFR por um anticorpo monoclonal (denominado no caso ACM ou AcM) antiEGFR se traduz por uma perda completa da resposta das células DU 145 ao IGF1 (Connolly J.M. and Rose D.P., Prostate, Apr. 24(4):167

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75, 1994: Putz T. et al., Cancer Res., Jan. 1, 59(1): 227-33, 1999). Esses resultados sugeririam que um bloqueio do receptor ao EGF seria suficiente para conseguir uma inibição total dos sinais de transformação gerados pela ativação dos dois receptores (EGFR e IGF-IR). Ao contrário, outros estudos (Pietrzkowski et al., Cell Growth Differ, Apr., 3(4):199-205, 1992; Coppola et al., Mol Cell Biol., Jul., 14(7):4588-95, 1994) mostraram que uma superexpressão do EGFR necessita da presença de um IGF-IR funcional para exercer seu potencial mitogênico e transformador, enquanto que o IGF-IR não necessita, por sua vez, da presença de EGFR funcional para mediar sua ação. Essa segunda série de estudos estaria mais em acordo com uma estratégia tendendo a bloquear preferencialmente o IGF-IR com a finalidade de atingir simultaneamente os dois receptores.

[00071] De maneira surpreendente, os inventores, em uma primeira etapa, colocaram assim em evidência que uma co-inibição da fixação do IGF1 e/ou IGF2 sobre o receptor IGF-IR e da fixação do EGF sobre o receptor EGFR permitia obter uma sinergia de ação significativa dessas duas ações contra o aumento tumoral in vivo em ratos nude portadores de um tumor que expressa esses dois receptores. Uma das hipóteses as mais prováveis que podem explicar essa sinergia de ação é que os dois fatores de aumento EGF e IGF1 (e/ou IGF2) agem eles próprios em sinergia na transformação de células normais em células de caráter tumoral e/ou no aumento e/ou na proliferação de células tumorais para certos tumores, notadamente para aquelas que superexpressam os dois receptores EGFR e IGF-IR e/ou apresentando uma superativação do sinal de transducção mediado por esses dois receptores, em particular ao nível da atividade tirosina quinase desses receptores.

[00072] De acordo com um aspecto preferido dessa forma de execução, a invenção refere-se a um anticorpo, tal como descrito mais

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25/103 acima, caracterizado pelo fato de consistir em um anticorpo biespecífico, compreendendo um segundo motivo que inibe especificamente a fixação do EGF sobre o EGFR e/ou que inibe especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor EGFR. [00073] Pelo termo segundo motivo, entende-se designar acima notadamente uma sequência de aminoácidos compreendendo um fragmento capaz de se ligar especificamente ao EGFR, em particular uma região CDR de uma cadeia variável de um anticorpo anti-EGFR, ou um dos fragmentos dessa região CDR de um anticorpo anti-EGFR. [00074] Os anticorpos biespecíficos ou bifuncionais constituem uma segunda geração de anticorpos monoclonais, nas quais duas regiões variáveis diferentes são combinadas na mesma molécula (Hollinger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). Sua utilidade foi colocada em evidência tanto no domínio do diagnóstico quanto no domínio da terapia em função de sua capacidade para recrutar novas funções de efeito ou para alvejar várias moléculas na superfície de células tumorais. Esses anticorpos podem ser obtidos por métodos químicos (Glennie MJ et al. 1987 J. Immunol. 139, 23672375; Repp R. et al. 1995 J. Hemat. 377-382) ou somáticos (Starez U.D. and Bevan M.J. 1986 PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. et. A;. 1986 Method Enzymol, 121: 210-228), mas também e preferencialmente por técnicas de engenharia genética que permitem forçar a heterodimerização e facilitam assim o processo de purificação do anticorpo buscado (Merchand et al. 1998 Nature Biotech. 16: 677681).

[00075] Esses anticorpos biespecíficos podem ser construídos como os IgG inteiros, como os Fab'2 biespecíficos, como Fab'PEG ou como diacorpos ou ainda como scFv biespecíficos, mas também como um anticorpo biespecífico tetravalente ou dois locais de fixação estão presentes para cada antígeno alvejado (Park et al. 2000 Mol. Immunol.

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37(18): 1123-30) ou seus fragmentos conforme descrito mais acima. [00076] Além disso, uma vantagem econômica devido à produção e à administração de um anticorpo biespecífico serem menos onerosas do que a produção de dois anticorpos específicos, a utilização desses anticorpos biespecíficos tem por vantagem reduzir a toxicidade do tratamento. Com efeito, a utilização de um anticorpo biespecífico permite diminuir a quantidade global de anticorpos circulantes, e, por conseguinte, a toxicidade eventual.

[00077] Em uma forma de realização preferida da invenção, o anticorpo biespecífico é um anticorpo bivalente ou tetravelente.

[00078] Na prática, o interesse de utilizar um anticorpo biespecífico tetravelente é que ele apresenta uma avidez mais importante em relação a um anticorpo bivalente devido à presença de dois locais de fixação para cada alvo, respectivamente IGF-IR e EGFR na presente invenção.

[00079] De maneira similar à seleção dos fragmentos funcionais do anticorpo anti-IGF-IR descrito mais acima, esse segundo motivo é selecionado dentre os fragmentos Fv, Fab, (Fab')2. Fab', scFV, scFVFc e os diacorpos, ou qualquer forma cuja meia-vda teria sido aumentada como os fragmentos pegilados, tais como Fv-PEG, scFvPEG, Fab-PEG, (Fab')2-PEG ou Fab'-PEG. Segundo um aspecto ainda mais preferido da invenção, esse segundo motivo anti-EGFR é proveniente do anticorpo monoclonal de rato 225, seu derivado quimérico rato-homem C225, ou um anticorpo humanizado derivado desse anticorpo 225.

[00080] Ainda sob um outro aspecto, a invenção tem por objetivo um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção a título de medicamento, de preferência um anticorpo humanizado, tal como definido acima. Por anticorpo, é preciso compreender, na sequência da presente descrição, tanto um anticorpo

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27/103 anti-IGF-IR, quanto um anticorpo biespecífico anti IGF-IR/EGFR. [00081] A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica, compreendendo a título de princípio ativo um composto que consiste em um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, de preferência adicionado de um excipiente e/ou de um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00082] Ainda de acordo com uma outra forma de execução, a presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica, tal como descrita mais acima, que compreende um segundo composto escolhido dentre os compostos capazes de inibir especificamente a fixação do EGF sobre o receptor humano do fator de crescimento da epiderme EGFR e/ou capaz de inibir especificamente a atividade tirosina quinase desse receptor EGFR.

[00083] Em um aspecto preferido da invenção, esse segundo composto é escolhido dentre os anticorpos anti-EGFR isolados, ou seus fragmentos funcionais, capazes de inibirem por competição a fixação do EGF sobre o EGFR. Mais particularmente, esse anticorpo anti-EGFR é escolhido dentre os anticorpos anti-EGFR monoclonais, quiméricos ou humanizados, ou seus fragmentos funcionais. Ainda mais particularmente, esses fragmentos funcionais do anticorpo antiEGFR são escolhidos dentre os fragmentos Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFV-Fc e os diacorpos, ou qualquer fragmento cuja meia-vda teria sido aumentada, como fragmentos pegilados. Esse anticorpo pode consistir, de maneira ainda mais preferida, no anticorpo monoclonal de rato 225, seu derivado quimérico rato-homem C225 (denominado ainda IMC-C225) ou um anticorpo humanizado derivado desse anticorpo 225.

[00084] Uma outra forma de execução complementar da invenção consiste em uma composição, tal como descrita mais acima que compreende, além disso, como produto de combinação para uma

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28/103 utilização simultânea, separada ou aferida no tempo, um agente citotóxico/citostático e/ou um inibidor da atividade tirosina quinase respectivamente dos receptores ao IGF-I e ao EGF.

[00085] Entende-se por utilização simultânea, a administração dos dois compostos de composição, de acordo com a invenção, compreendidos em uma única e mesma forma farmacêutica.

[00086] Entende-se por utilização separada, a administração, ao mesmo tempo, dos dois compostos da composição, de acordo com a invenção, compreendidos em formas farmacêuticas distintas.

[00087] Entende-se por utilização aferida no tempo, a administração sucessiva dos dois compostos da composição, de acordo com a invenção, compreendidos cada um em uma forma farmacêutica distinta.

[00088] De uma forma geral, a composição, de acordo com a invenção, aumenta consideravelmente a eficácia do tratamento do câncer. Em outros termos, o efeito terapêutico do anticorpo anti-IGFIR, de acordo com a invenção, é potencializado de maneira inesperada pela administração de um agente citotóxico. Uma outra vantagem subsequente maior gerada por uma composição, de acordo com a invenção, refere-se à possibilidade de utilizar doses eficazes em princípio ativo menores, o que permite evitar ou reduzir os riscos de aparecimento dos efeitos secundários, em particular o efeito do agente citotóxico. Além disso, essa composição, de acordo com a invenção, permitiria atingir o efeito terapêutico computado mais rapidamente.

[00089] Em um modo de realização particularmente preferido, essa composição como produto de combinação, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo fato desse agente citotóxico/citostático ser escolhido dentre os agentes que interagem com o DNA, os antimetabólitos, os inibidores de topoisomerases I ou II, ou ainda os agentes inibidores ou estabilizadores do fuso ou ainda qualquer

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29/103 agente capaz de ser utilizado em quimioterapia. Esses agentes citotóxicos/citostáticos, para cada uma das classes de agentes citotóxicos pré-citadas, são, por exemplo, citados na edição 2001 do VIDAL, na página consagrada aos compostos ligados à cancerologia e à hematologia coluna Citotóxicos, esses compostos citotóxicos citados por referência a esse documento são citados no caso como agentes citotóxicos preferidos.

[00090] Em um modo de realização particularmente preferido, essa composição como produto de combinação, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo fato desse agente citotóxico ser acoplado quimicamente a esse anticorpo para uma utilização simultânea.

[00091] Em um modo de realização particularmente preferido, essa composição, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo fato desse agente citotóxico/citostático ser escolhido dentre os agentes inibidores ou estabilizadores do fuso, de preferência a vinorelbina e/ou a vinflumina e/ou a vincristina.

[00092] A fim de facilitar o acoplamento entre esse agente citotóxico e esse anticorpo, de acordo com a invenção, poder-se-ão notadamente introduzir moléculas espaçadoras entre os dois compostos a acoplar, tais como poli(alquilenos) glicóis como o polietilenoglicol, ou ainda aminoácidos, ou, em um outro modo de realização, utilizar derivados ativos desses agentes citotóxicos nos quais foram introduzidas funções capazes de reagir com esse anticorpo, de acordo com a invenção. Essas técnicas de acoplamento são bem-conhecidas do técnico e não serão desenvolvidas na presente descrição.

[00093] Em um outro modo de realização preferido, esse inibidor da atividade tirosina quinase dos receptores ao IGF-I e/ou ao EGF é selecionado no grupo que consiste em agentes naturais derivados, dos dianilinoftalimidas, pirazolo- ou pirrolo-piridopirimidinas ou ainda

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30/103 quinazilinas. Esses agentes inibidores são bem-conhecidos do técnico e descritos na literatura (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1,25-32). [00094] Outros inibidores do EGFR podem consistir, sem qualquer limitação, nos anticorpos monoclonais C225 e 22Mab anti-EGFR (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (merck KgaA), ou os compostos ZD-1834, ZD-1838 e ZD1839 (AstraZeneca), PKI-166 (novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (WyethAyerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidina A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382)Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFMA12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) ou oEGFR Vaccine(York Medical/Centro de Imunologia Molecular).

[00095] De acordo ainda com uma outra forma de execução da invenção, a composição, tal como descrita mais acima, pode também compreender um outro composto anticorpo dirigido contra o domínio extracelular do receptor HER2/neu, como produto de combinação para uma utilização simultânea, separada ou aferida no tempo, destinada à prevenção e ao tratamento de câncer, notadamente os cânceres que superexpressam esse receptor HER2/neu e o receptor IGF-IR e/ou EGFR, como notadamente o câncer do seio.

[00096] Poder-se-á notadamente se referir às publicações de

Albanell et al. (J. of the National Cancer Institute, 93(24): 1830-1831, 2001) e de Lu et al. (J. of the National Cancer Institute, 93(24):18521857, 2001) justificando o interesse inesperado de associar um

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31/103 anticorpo anti-HER2/neu com um anticorpo anti-IGF-IR, segundo a presente invenção.

[00097] De maneira particular, esse anticorpo anti-HER2/neu da composição, de acordo com a invenção, é o anticorpo denominado Trastuzumab (denominado ainda Herceptin).

[00098] A invenção é, sob um outro aspecto, relativa a um composição caracterizada pelo fato de um, pelo menos, desses anticorpos, ou um de seu fragmento funcional, ser conjugado com uma toxina celular e/ou um radioelemento.

[00099] De preferência, essa toxina ou esse radioelemento é capaz de inibir pelo menos uma atividade celular das células que expressam o receptor IGF-IR e/ou EGFR, de maneira mais preferida capaz de impedir o aumento ou a proliferação dessa células notadamente de inativar totalmente essa célula.

[000100] De preferência ainda, essa toxina é uma toxina de enterobactérias, notadamente a exotoxina A de Pseudomonas.

[000101] Os radioelementos (ou radioisótopos) preferidos conjugados aos anticorpos empregados para a terapia são radiosótopos emissores de raios gama e, de preferência, o Iodo¹³¹, o Ítrio⁹⁰, o Ouro¹⁹⁹, o Paládio¹⁰⁰, o Cobre⁶⁷, o Bismuto²¹⁷ e o Antimônio²¹¹. Os radioisótopos emissores de raios beta e alfa podem também ser utilizados para a terapia.

[000102] Por toxina ou radioelemento conjugado a pelo menos um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, entende-se designar qualquer meio que permita ligar essa toxina ou esse radioelemento a pelo menos um anticorpo, notadamente por acoplamento covalente entre os dois compostos com ou sem introdução de molécula de ligação.

[000103] Dentre os agentes que permitem ligar, de maneira química (covalente), eletrostática, não covalente todo ou partes dos

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32/103 componentes do conjugado, podem-se citar notadamente a benzoquinona, a carbodiimida e mais particularmente o EDC (cloridrato de 1-Etil-3[3-Dimetilaminopropil]carbodiimida), o dimaleimida, o ácido ditio-bis-nitrobenzóico (DTNB), o N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), os agentes de pontes que possuem um ou vários grupamentos fenilazida que reagem com os ultravioletas (U.V.) e, de preferência, a N-[4-(azido-salicilamino)butil]-3'-(2'-piridilditio)propionamida (APDP), o N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP), a 6hidrazinonicotimida (HYNIC).

[000104] Uma outra forma de acoplamento, notadamente para os radioelementos, pode consistir na utilização de um quelante de íons bifuncional.

[000105] Dentre esses quelatos, podem-se citar os quelatos derivados do EDTA (ácido etilenodiamina-tetraacético) ou o DTPA (ácido dietilenotriamina-pentaacético) que foram desenvolvidos para ligar os metais, notadamente os metais radioativos, e as imunoglobulinas. Assim, o DTPA e seus derivados podem ser substituídos por diferentes grupos sobre a cadeia carbonada, a fim de aumentar a estabilidade e a rigidez do complexo ligante-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); patente US 4 831 175).

[000106] Por exemplo, o ácido dietilenotriamina-pentaacético (FTPA) e seus derivados, que são há muito tempo amplamente utilizados em medicina e em biologia, seja sob sua forma livre, seja sob a forma de complexo com um íon metálico, apresentam a característica notável de formar quelatos estáveis com os íons metálicos e ser acoplados com proteínas de interesse terapêutico ou diagnóstico, tais como os anticorpos para o desenvolvimento de radioimunoconjugados em terapia do câncer (Meases et al., (1984); Gansow et al. (1990)).

[000107] De preferência também, pelo menos um anticorpo que

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33/103 forma esse conjugado, de acordo com a invenção, é escolhido dentre seus fragmentos funcionais, notadamente os fragmentos amputados de sua componente Fe, tais como os fragmentos scFv.

[000108] A presente invenção compreende, além disso, a utilização da composição, de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento.

[000109] Mais particularmente, de acordo com uma outra forma de execução, a invenção refere-se à utilização de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, e/ou de uma composição para a preparação de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento de uma doença induzida por uma superexpressão e/ou uma ativação anormal do receptor IGF-IR e/ou EGFR, e/ou ligada a uma hiperativação da via de transdução do sinal mediado pela interação de I-IGF1 ou IGF2 com IGF-IR e/ou o EGF com EGFR e/ou HER2/neu.

[000110] De preferência, essa utilização, de acordo com a invenção, é caracterizada pelo fato da administração desse medicamento não ter efeitos secundários ou induzir poucos efeitos secundários, efeitos esses ligados a uma inibição do receptor IR da insulina, isto é, a uma inibição da interação do receptor IR com seus ligantes naturais devido à presença desse medicamento, notadamente por uma inibição competitiva ligada à fixação desse medicamento sobre o IR.

[000111] A presente invenção compreende, além disso, a utilização de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de preferência humanizado, e/ou de uma composição, de acordo com a invenção, para a preparação de um medicamento destinado a inibir a transformação de células normais em células de caráter tumoral, de preferência IGF, notadamente IGF1 e/ou IGF2, dependente e/ou EGF dependente e/ou HER2/neu dependente.

[000112] A presente invenção é relativa também à utilização de um

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34/103 anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de preferência humanizado, e/ou de uma composição, de acordo com a invenção, para o preparo de um medicamento destinado a inibir o aumento e/ou a proliferação de células tumorais, de preferência IGF, notadamente IGF1 e/ou IGF2 dependente e/ou EGF dependente e/ou estrogênios, dependente e/ou HER2/neu dependente.

[000113] De maneira geral, a presente invenção tem por objeto a utilização de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de preferência humanizado, e/ou de uma composição, de acordo com a invenção, para o preparo de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento de câncer, de preferência expressando o IGF-IR e/ou EGFR, e/ou de câncer que apresenta, de preferência, uma hiperativação da via de transducção do sinal mediado pela interação do IGF1 com IGF-IR, como, por exemplo, a superexpressão de IRS1 e/ou o EGF com o EGFR.

[000114] A presente invenção tem também por objeto a utilização de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de preferência humanizado, e/ou de uma composição, de acordo com a invenção, para o preparo de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento da psoríase, psoríase cuja hiperproliferação epidérmica pode ser ligada à expressão ou a superexpressão do IGF-IR e/ou do EGFR e/ou à hiperativação da via de transducção do sinal mediado pela interação de IGF-IR com seus ligantes naturais (Wraight C.J. et al. Nat. Biotechnol., 2000, 18(5): 521-526. Reversal of epidermal hiperproliferação in psoríase by insulin-like growth factor I receptor antisense oligonucleotides) e/ou do EGFR com seus ligantes naturais.

[000115] Dentre os cânceres que podem ser prevenidos e/ou tratados, prefere-se o câncer da próstata, os osteossarcomas, o câncer de pulmão, o câncer do seio, o câncer do endométrio ou o câncer do cólon ou qualquer outro câncer superexpressando IGF-IR.

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35/103 [000116] Ainda sob um outro aspecto, a presente invenção tem por objeto um método de diagnóstico, de preferência in vitro, de doenças ligadas a uma superexpressão ou uma subexpressão, de preferência uma superexpressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR a partir de uma amostra biológica da qual se suspeita da presença anormal em receptor IGF-IR e/ou EGFR, caracterizada pelo fato de se colocar em contato essa amostra biológica com um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, esse anticorpo podendo ser, se for o caso, marcado.

[000117] De preferência, essas doenças ligadas pela superexpressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR nesse método de diagnóstico serão cânceres.

[000118] Esse anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, pode se apresentar sob a forma de imunoconjugado ou de anticorpo marcado, a fim de obter um sinal detectável e/ou quantificável.

[000119] Os anticorpos marcados, de acordo com a invenção, ou seus fragmentos funcionais incluem, por exemplo, anticorpos ditos imunoconjugados que podem ser conjugados por exemplo com enzimas, tais como a peroxidase, a fosfato alcalina, a a-Dgalactosidase, a glicose oxidase, a glicose amilase, a anidrase carbônica, a acetilcolinesterase, o lisosima, a malato desidrogenase ou por uma molécula como a biotina, o digoxigenina ou a 5-bromodesoxiuridina. Marcadores fluorescentes podem ser também conjugados aos anticorpos ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, e incluem notadamente a fluorosceína e seus derivados, o fluorocromo, a rodamina e seus derivados, a GFP (GFP para Green Fluorescent Protein) o dansil, a umbeliferona, etc... Nesses conjugados, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos funcionais podem ser preparados por métodos conhecidos da técnica. Eles podem ser acoplados às enzimas ou aos marcadores

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36/103 fluorescentes direta ou por intermédio de um grupo espaçador ou de um grupo de ligações, tal como polialdeído, como glutaraldeído, o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), o ácido dietilenotriaminapentaacético (DPTA), ou em presença de agentes de acoplamento, tais como aqueles citados antes para os conjugados terapêuticos. Os conjugados que comportam marcadores de tipo fluoresceína podem ser preparados por reação com um isotiocianato. [000120] Outros conjugados podem incluir também marcadores quimiluminescentes, tais como o luminol e os dioxetanos, marcadores bioluminescentes, tais como a luciferase e a luciferina, ou ainda marcadores radioativos, tais como o Iodo¹²³, Iodo¹²⁵, Iodo¹²⁶, Iodo¹³³, Bromo⁷⁷, Tecnécio^99m, Índio¹¹¹, Índio^113m, Gálio⁶⁷, Gálio⁶⁸, Rutênio⁹⁵, Rutênio⁹⁷, Rutênio¹⁰³, Rutênio¹⁰⁵, Mercúrio¹⁰⁷, Mercúrio²⁰³, Rênio^99m, Rênio¹⁰¹, Rênio¹⁰⁵, Escândio⁴⁷, Telúrio^121m, Telúrio^122m, Telúrio^125m, Túlio¹⁶⁵, Túlio¹⁶⁷, Túlio¹⁶⁸, Flúor¹⁸, Ítrio¹⁹⁹, Iodo¹³¹. Os métodos conhecidos do técnico existente para acoplar os radioisótopos terapêuticos aos anticorpos, seja diretamente, seja via um agente quelante, tal como o EDTA, o DTPA, citados antes podem ser aplicados para os radioelementos utilizáveis em diagnóstico. Pode-se também citar no caso a marcação com o Na[I¹²⁵] pelo método à cloramina T. [Hunter W.M. e Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] ou ainda com o Tecnécio^99m pela técnica de Crockford et coll. (patente US 4 424 200) ou ligado via o DPTA, conforme descrito por Hnatowich (patente US 4 479 930).

[000121] Assim, os anticorpos, ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, podem ser empregados em um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma superexpressão ou de subexpressão, de preferência uma superexpressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:

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a) colocação em contato da amostra biológica com um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção; e

b) colocação em evidência do complexo IGF-IR e/ou EGFR/anticorpos eventualmente formado.

[000122] Em um modo de realização particular, os anticorpos, ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, poderão ser empregados em um processo para a detecção e/ou a quantificação do receptor IGF-IR e/ou EGFR em uma amostra biológica, para o acompanhamento da eficácia de um tratamento profilático e/ou terapêutico de um câncer IGF e/ou EGF dependente ou ainda de uma psoríase.

[000123] Mais geralmente, os anticorpos, ou seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção, podem ser vantajosamente utilizados em qualquer simulação na qual a expressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR deve ser observada de maneira qualitativa e/ou quantitativa.

[000124] De preferência, a amostra biológica é constituída por um fluido biológico, tal como o soro, o sangue total, células, uma amostra de tecido ou biópsias de origem humana.

[000125] Qualquer procedimento ou teste clássico pode ser utilizado para realizar essa detecção e/ou dosagem. Esse teste pode ser um teste por competição ou por Sanduíche, ou qualquer teste conhecido do técnico dependendo da formação de um complexo imuno de tipo anticorpo-antígeno. De acordo com as aplicações, conforme a invenção, o anticorpo ou um de seus fragmentos funcionais pode ser imobilizado ou marcado. Essa imobilização pode ser realizada sobre numerosos suportes conhecidos do técnico. Esses suportes podem notadamente incluir o vidro, o poliestireno, o polipropileno, o polietileno, o dextran, o náilon, ou celuloses naturais ou modificadas.

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Esses suportes podem ser solúveis ou insolúveis.

[000126] A título de exemplo, um método preferido coloca em jogo processos imunoenzimáticos segundo a técnica ELISA, por imunofluorescência, ou radioimunológica (RIA) ou equivalente.

[000127] Assim, a presente invenção compreende também os kits ou necessárias para a aplicação de um método de diagnóstico de doenças induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR ou para a aplicação de um processo para a detecção e/ou a quantificação de uma superexpressão ou de uma subexpressão do receptor IGF-IR e/ou EGFR em uma amostra biológica, de preferência uma superexpressão desse receptor, caracterizado pelo fato desse kit ou necessária compreende os seguintes elementos:

a) um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a invenção;

b) eventualmente, os reagentes para a constituição do meio propício à reação imunológica;

c) eventualmente, os reagentes que permitem a colocação evidência dos complexos IGF-IR e/ou EGFR/anticorpos produzidos pela reação imunológica.

[000128] A invenção é, além disso, relativa à utilização de uma composição como produto de combinação, de acordo com a invenção, para o preparo de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento de câncer, notadamente cânceres para os quais esse agente citotóxico ou esse anticorpo anti-HER2/neu é geralmente prescrito e, notadamente, para os quais cânceres, as células tumorais expressam ou superexpressam o receptor IGF-IR e/ou EGFR.

[000129] A invenção tem também por objeto a utilização de um anticorpo, de acordo com a invenção, para o preparo de um medicamento destinado ao alvo específico de um composto

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39/103 biologicamente ativo para células que expressam ou superexpressam o receptor IGF-IR e/ou EGFR.

[000130] Entende-se designar no caso por composto biologicamente ativo qualquer composto capaz de modular, notadamente inibir, a atividade celular, em particular o aumento, a proliferação, a transcrição ou a tradução de gene.

[000131] A invenção tem também por objeto um reagente de diagnóstico in vivo, compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção, ou um de seus fragmentos funcionais, de preferência marcado, notadamente radiomarcado, e sua utilização em conjunto médio de imagens médicas, em particular para a detecção de câncer ligado à expressão ou à superexpressão por uma célula do receptor IGF-IR e/ou EGFR.

[000132] A invenção é também relativa a uma composição como produto de combinação ou a um conjugado anti-IGF-IR e/ou EGFR/toxina ou radioelemento, de acordo com a invenção, a título de medicamento.

[000133] De preferência, essa composição como produto de combinação ou esse conjugado, de acordo com a invenção, será adicionado de um excipiente e/ou de um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000134] Na presente descrição, entende-se designar por veículo farmaceuticamente aceitável, um composto ou uma combinação de compostos que entram em uma composição farmacêutica não provocando reações secundárias e que permite, por exemplo, a facilitação da administração do(s) composto(s) ativo(s), o aumento de sua duração de vida e/ou de sua eficácia não-organismo, o aumento de sua solubilidade em solução ou ainda a melhoria de sua conservação. Esses veículos farmaceuticamente aceitáveis são bemconhecidos e serão adaptados pelo técnico em função da natureza e

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40/103 do modo de administração do ou dos compostos ativos escolhidos. [000135] De preferência, esses compostos serão administrados por via sistêmica, em particular por via intravenosa, por via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal ou subcutânea, ou por via oral. De maneira mais preferida, a composição que compreende os anticorpos, de acordo com a invenção, será administrada em várias vezes, de maneira aferida no tempo.

[000136] Seus modos de administração, posologias e formas galênicas ótimas podem ser determinados segundo os critérios geralmente considerados no estabelecimento de um tratamento adaptado a um paciente como, por exemplo, a idade ou o peso corporal do paciente, a gravidade de seu estado geral, a tolerância ao tratamento e os efeitos secundários constatados.

[000137] Outras características e vantagens da invenção aparecem na sequência da descrição com os exemplos e as figuras, cujas legendas estão representadas a seguir.

LEGENDAS DAS FIGURAS [000138] Figura 1: representação esquemática do IGF-IR.

[000139] Figura 2: esquema da transducção dos sinais mediada pelo IGF-IR, quando da fixação dos IGFs.

[000140] Figuras 3A, 3B e 3C: reconhecimento do IGF-IR nativo expresso na superfície das células MCF-7 pelo anticorpo monoclonal 7C10.

[000141] Para essa experiência, as células MCF-7 são incubadas com o anticorpo 7C10 ou com um anticorpo controle negativo, depois reveladas com o auxílio de um anticorpo secundário antiespécie fluorescente. A marcação é lida no FACS. O primeiro histograma (figura 3A) corresponde às células MCF-7 sozinhas. No segundo histograma (figura 3B) a curva não-cinza corresponde à marcação não-específica por um anticorpo murino isótipo controle. No terceiro

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41/103 histograma (figura 3C), a curva não cinza mostra o reconhecimento do IGF-IR pelo ACM 7C10.

[000142] Figuras 4A, 4B e 4C: marcação de células de insetos Sf9 expressando respectivamente o IGF-IR ou o IR.

[000143] A figura 4A mostra a marcação de células não transfectadas sozinhas (1) ou marcadas com anticorpos monoclonais comerciais de provas reconhecendo respectivamente o IGF-IR (2) ou o IR (3). Na figura 4B, células Sf9 expressando unicamente o IGF-IR são marcadas com o aIR3 (2) ou o anti-IR (3), o pico (1) representando as células sozinhas. Na figura 4C, células Sf9 expressando unicamente o IR são marcadas com um anti-IR (3) ou o aIR3(2), o pico (1) representando as células sozinhas.

[000144] Figura 5: efeito inibidor do anticorpo 7C10 sobre a proliferação das células MCF-7 induzida pelo IGF-I.

[000145] As células MCF-7 são incubadas em presença de concentrações crescentes de IGF1 em presença ou na ausência dos ACM a testar. A proliferação celular é avaliada por acompanhamento da incorporação de ³H Timidina. O anticorpo comercial aIR3 é utilizado como controle positivo da experiência. O 7G3 é um IgG1 murino antiIGF-IR sem atividade sobre a proliferação e utilizado com o isótipo controle.

[000146] Figuras 6A, 6B e 6C:

[000147] - figura 6A: efeito in vivo do anticorpo monoclonal 7C10 sobre o aumento de tumores MCF-7 estabelecidos no rato nú [000148] - figuras 6B e 6C: figuras provenientes respectivamente das publicações de Arteaga et al. (J. Clin. Invest., 84, 1418-1423, 1989) et de Li et al. (Cancer Immunol. Immonother., 49, 243-252), mostrando para a figura 6B o efeito de aIR3 murino (também anotado aIR3) e para a figura 6C o efeito de um scFv-Fc recombinante derivado do anticorpo 1H7 sobre o aumento tumoral.

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42/103 [000149] Figura 7: estudo comparado do efeito do AcM7C10 e do tamoxifen sobre o aumento in vivo do tumor MCF-7.

[000150] Figuras 8A, 8B e 8C: estudo da atividade antitumoral do anticorpo murino 7C10 em diferentes modelos de xenoenxerto de células tumorais in vivo.

[000151] A figura 8A mostra os resultados obtidos sobre um modelo de osteossarcoma SK-ES-1, a figura 8B refere-se a um tumor da próstata andrógeno independente DU-145 e a figura 8C um modelo de tumor de pulmão não com pequenas células A549. Nesses três modelos, o tratamento foi feito 2 vezes por semana em i.p à razão de 250 pg/dose/rato. As curvas 7G3, EC2 e 9G4 correspondem, respectivamente, a três IgG1 murinos utilizadas como isótipo controle de experiência em cada um dos modelos.

[000152] Figura 9: estudo do efeito antitumoral do AcM 7C10 comparado à navelbina (vinorelbina), assim como a sinergia dos dois compostos sobre o aumento in vivo da linhagem A549.

[000153] Figura 10: atividade comparada dos AcM aIR3, 7C10 e 1H7 sobre a proliferação IGF-2 induzida das células MCF-7.

[000154] Figura 11: comparação dos AcM 7C10 murino e C7C10 quimérico para a inibição da proliferação IGF1 das células MCF-7 in vitro. O anticorpo 9G4 é uma IgG1 murina utilizada como isótipo controle de experiência.

[000155] Figura 12: efeito comparado dos AcM 7C10 e h7C10 (humanizado 1, anotado no caso 7H2HM) sobre o modelo in vitro de proliferação IGF1 induzida das células MCF-7.

[000156] Figura 13: efeito dos AcM 7C10 e h7C10 (humanizado 1, anotado no caso 7H2HM) sobre a transducção do sinal induzida pelo IGF1. A primeira linha de pontos corresponde à revelação, por um anticorpo antifosfotirosina, da fosforilação da cadeia β imunoprecipitada a partir de células incubadas em presença de IGF1

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43/103 sozinho ou de IGF1 adicionado dos diferentes anticorpos a testar. O 9G4 e o hIgG1 são respectivamente os isótipos controle das formas 7C10 e h7C10 (também anotado 7H2HM). A segunda linha de pontos corresponde à revelação da cadeia β e mostra que a quantidade depositada no conjunto dos poços é perfeitamente equivalente.

[000157] Figura 14: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 48), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 50) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 49), do fragmento de PCR amplificado a partir do hibridoma de rato 7C10 com as atrações MKV-1 e MKC e que codifica para a extremidade 3' do peptídeo leader e 7C10 VL.

[000158] Figura 15: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 51), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 53) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 52), do fragmento de PCR amplificado a partir do hibridoma de rato 7C10 com os pares de atrações MHV-12 e MHC-1, ou MHV-8 e MHC-1 e que codifica para a extremidade 3' do peptídeo leader e 7C10 VH.

[000159] Figura 16: reconhecimento do IGF-1 receptor pelo anticorpo quimérico 7C10, também denominado C7C10 (o que flutua de cultura de células cos7 transfectadas).

[000160] Figura 17: comparação da sequência em aminoácidos de 7C10 VL de rato (SEQ ID N^o 54) com aquelas de outros anticorpos de rato que têm a mais forte homologia da sequência.

[000161] A numeração dos aminoácidos é aquela de Kabat et al. (1991). Os resíduos nas regiões de inclinação (fora CDRS) que diferem entre 7C10 VL e Kabat subgrupo II de rato (SEQ ID N^o 57) são sublinhados. Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VL. DRB1-4.3 (SEQ ID N^o 55) representa a sequência da cadeia leve de um anticorpo de rato antihumano MHC CLASS II B-Chain (número de acesso no banco de dados de Kabat é N^o 11794). C94-5B11'CL (SEQ ID N^o 56) representa

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44/103 a sequência da cadeia leve de um anticorpo de rato (número de acesso no banco de dados de Kabat é P019314).

[000162] Figura 18: comparação das sequências em aminoácidos de 7C10 VL de rato (SEQ ID N^o 54) com aquelas de cadeias leves humanas pertencentes ao subgrupo II humano de Kabat (SEQ ID N^o60) e tendo a mais forte homologia de sequência.

[000163] As sequências em aminoácidos são alinhadas e comparadas com aquela de 7C10 VL de rato. Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VL. GM607 (SEQ ID N^o 58) representa a sequência da cadeia leve kappa secretada pela linhagem linfoblastóide humana GM607 (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12:6995-7006, 1984a e Klobeck et al., Nature, 309: 73-76, 1984b, o número de acesso no banco de dados Kabat é

N011606). DPK15/A19 (SEQ ID N^o 59) representa a sequência da linhagem germinal humana V kappa II.

[000164] Figura 19: comparação das sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias leves (VL) de 7C10 de rato (SEQ ID N^o54), do anticorpo humano GM 607 (SEQ ID N^o 58) e das duas versões de 7C10 humanizadas e 1 e 2 (SEQ ID N^os 61 e 65).

[000165] As sequências em aminoácidos são alinhadas e comparadas com aquelas de 7C10 VL de rato. Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VL. GM607 representa a sequência da cadeia leve kappa secretada pela linhagem linfoblastóide humana GM607 (Klobeck et al., 1984a e 1984b, número de acesso no banco de dados Kabat: N011606).

[000166] Figura 20: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 63), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 64) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 63)do gene produzido por ligação de novo codificando para o peptídeo leader e a versão humanizada 1 de 7C10 VL.

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45/103 [000167] Figura 21: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 66), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 68) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 67), do gene produzido por ligação de novo codificando para o peptídeo leader e a versão humanizada 2 de 7C10 VL.

[000168] Figura 22: comparação das sequências em aminoácidos de 7C10 VH de rato (SEQ ID N^o 69) com aquelas de cadeias pesadas de rato humanos pertencente ao subgrupo I(A) rato de Kabat e tendo a mais forte homologia de sequência.

[000169] A numeração dos aminoácidos é aquela de Kabat et al. (1991). Os resíduos nas regiões de sustentação (fora CDRs) que diferem entre 7C10 VH e Kabat subgrupo I(A) (SEQ ID N^o 71) de rato são sublinhados. Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VH rato. Na o3'CL (SEQ ID N^o 70) representa a sequência da cadeia pesada de um anticorpo de rato (número de acesso no banco de dados de Kabat: P001289).

[000170] Figura 23: comparação das sequências em aminoácidos de 7C10 VH de rato (SEQ ID N^o 69) com aquelas de cadeias pesadas humanas pertencentes ao subgrupo II humano de Kabat (SEQ ID N^o72) e tendo a mais forte homologia de sequência.

[000171] Os resíduos sublinhados fazem parte das estruturas canônicas definidas por Chothia et al. (1989). Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VH rato humano VH FUR1'CL (SEQ ID N^o 73) representa a sequência da cadeia pesada de um anticorpo humano antilamin B IgM/K de origem autoimune (Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36:1315-1324, 1993; número de acesso em Kabat: N^o020619). Humano germline (SEQ ID N^o 74) representa a sequência da linhagem germinal 4.22 VH IV humana (Sanz et al., EMBO. J. 8:3741-3748, 1989).

[000172] Figura 24: comparação das sequências de aminoácidos das

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46/103 regiões variáveis das cadeias pesadas (VH) de 7C10 de rato (SEQ ID N^o 69) e das três versões humanizadas por CDR-grafting VH humanizado 1,2 e 3 (respectivamente SEQ ID N^os 75, 79 e 83).

[000173] A numeração dos resíduos corresponde àquela de Kabat. As sequências são alinhadas e comparadas àquela de 7C10 VH de rato. Um ponto indica que o resíduo é idêntico a essa posição em relação à sequência de 7C10 VH rato.

[000174] Figura 25: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 76), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 78) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 77), do gene produzido por ligantes de novo codificando para o peptídeo leader e a versão humanizada 1 de 7C10 VH.

[000175] Figura 26: sequência do ADNc (SEQ ID N^o 80), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 82) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 81), do gene produzido por ligação de novo codificando para o peptídeo leader e a versão humanizada 2 de 7C10 VH.

[000176] Figura 27: sequência o ADNc (SEQ ID N^o 84), de seu filamento complementar (SEQ ID N^o 86) e sua tradução em aminoácidos (SEQ ID N^o 85), do gene produzido por ligação de novo codificando para o peptídeo leader e a versão humanizada 3 de 7C10 VH.

[000177] Figura 28: comparação da atividade de reconhecimento do IGF-1 receptor pelo anticorpo quimérico 7C10 (denominado C7C10) e sua versão humanizada 1 (7C10 hum 1) em ELISA.

[000178] Figura 29: influência sobre a atividade de reconhecimento do IGF-1 receptor das versões humanizadas 1 e 2 da cadeia leve do anticorpo 7C10 em ELISA.

[000179] Figura 30: comparação da atividade de reconhecimento do IGF-1 receptor pelo anticorpo quimérico 7C10 e três versões

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47/103 humanizadas da cadeia pesada (7C10 hum 1, 2 e 3) em associação com 7C10 VL humanizada 2 em ELISA.

[000180] Figura 31: atividade antitumoral do anticorpo 7C10 em um modelo ortotópico A549.

[000181] Figuras 32A, 32B, 32C e 32D: estudo do ADCC observada ao nível de células A549 e MCF-7 cultivadas durante 4 horas em presença do anticorpo 7H2HM (respectivamente, figuras 32C e 32D). O anticorpo h4D5 é utilizado em paralelo como prova positiva de experiência para as células A549 e MCF-7 (respectivamente figuras 32A e 32B).

[000182] Figuras 33A, 33B e 33C: efeito dos anticorpos 7C10 e 7H2HM sobre o ciclo celular das células MCF-7.

[000183] As figuras 33A representa a proporção de células MCF-7 em fase G0/G1, S e G2/M na ausência de IGF1, expressa em percentagem de células MCF-7 totais observadas significativa.

[000184] A figura 33B representa a proporção de células MCF-7 em fase G0/G1, S e G2/M em presença de IGF1, expressa em percentagem de células MCF-7 totais observadas.

[000185] A figura 33C representa a proporção de células MCF-7 em fase S (γ) e G2/M (0) expressa em percentagem de células MCF-7 totais observadas, em presença dos compostos indicados na figura comparada a uma prova controle na ausência de IGF1 (0).

[000186] Figuras 34A e 34B: efeito comparado dos anticorpos 7C10 e 7H2HM sobre o aumento das células A549 in vitro (figura 34A) e sobre o aumento das células MCF-7 in vivo (figura 34B).

[000187] Figuras 35A e 35B: estudo da sinergia do anticorpo 7H2HM associado à navelbine (NA) sobre o modelo A549 in vivo, comparada às provas de controle. A figura 35A representa a evolução do volume do tumor implantado em função do tratamento feito a partir do começo do tratamento e em aproximadamente 50 dias (figura 35A). A figura

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35B representa de maneira particular os resultados obtidos para essa evolução comparada a aproximadamente 48 dias. Nessa figura, os resultados obtidos com o anticorpo 7C10 foram introduzidos a título de comparação (os asteriscos (*) correspondem à comparação grupo controle/grupo (7C10 + Na) ou grupo controle/grupo (7H2HM + Na) em um teste t).

[000188] Figura 36: estudo do efeito dos anticorpos 7C10 e 7H2HM sobre apoptose.

[000189] Essa figura representa a potencialização do efeito da doxorrubicina pelos anticorpos 7C10 e 7H2HM (doxorrubicina 2 pg/ml). [000190] Figuras 37A a 37D: colocação em evidência por uma marcação ao FACS da presença do EGFR e do IGF-IR na superfície de células A549.

[000191] Figura 38: efeito de uma co-administração dos ACM 7C10 e 225 sobre o aumento in vivo do tumor in vivo do tumor A549.

[000192] Figura 39: efeito de uma co-administração dos ACM 7C10 e 225 sobre a sobrevida de ratos implantados em ortotópico com células A549.

[000193] Figuras 40A e 40B: colocação em evidência da inibição da tirosina-fosforilação da cadeia beta do IGF-IR e do IRS-1 pelos ACM 7C10 e 7H2HM.

[000194] Figura 41: colocação em evidência da indução da internalização do IGF-IR pelos ACM 7C10 e 7H2HM.

[000195] Figuras 42A a 42C: colocação em evidência da degradação do IGF-IR pelos ACM 7C10 e 7H2HM.

EXEMPLO 1 Produção e seleção do anticorpo monoclonal (AcM) murino [000196] Com a finalidade de produzir AcM dirigidos especificamente contra o IGF-IR e não reconhecendo o IR, um protocolo compreendendo 6 etapas de alvo foi considerado.

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49/103 [000197] Ele consistia em:

- imunizar ratos com IGF-IR recombinante, para gerar hibridomas;

- alvejar o que flutua de cultura por ELISA sobre a proteína recombinante que serviu à imunização;

- testar tudo o que flutua de hibridomas positivos em ELISA sobre o receptor nativo superexpresso na superfície de células tumorais MCF-7;

- avaliar o que flutua de hibridomas positivos nos dois primeiros alvos em termos de reconhecimento diferencial do IGF-IR e do IR sobre células de insetos infectadas com bacilovírus expressando respectivamente o IGF-IR ;

- verificar que os anticorpos selecionados nessa etapa eram capazes de inibir in vitro a proliferação IGF1 induzida das células MCF-7;

- se assegurar da atividade in vivo, no rato nú do candidato retido em termos de impacto sobre o aumento do tumor MCF-7. [000198] O conjunto dessas diferentes etapas e dos resultados obtidos será brevemente descrito a seguir no exemplo 1.

[000199] Para a etapa de imunização, ratos foram injetados duas vezes, por via subcutânea com 8 pg de IGF-IR recombinante. Três dias antes da fusão das células do rato com as células do mieloma murino Sp20Ag14, os ratos foram estimulados por uma injeção intravenosa de 3 pg do receptor recombinante. Quatorze dias após a fusão, o que flutua de hibridomas foi alvejado por ELISA, sobre placas sensibilizadas pelo IGF-IR recombinante. Os hibridomas dos quais o que flutua foi encontrado positivo foram conservados e amplificados antes de serem testados ao FACScan, a fim de verificar que os anticorpos produzidos eram também capazes de reconhecer o IGF-IR nativo. Para isso, células MCF-7 oriundas de um tumor do seio

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50/103 estrogênio dependente e superexpressando o IGF-IR foram incubadas com o que flutuou de cultura produzido pelos hibridomas selecionados em ELISA. Os complexos receptor nativo/AcM na superfície da célula foram revelados por um anticorpo secundário antiespécie acoplado a um fluorocromo. As figuras 3A a 3C mostram um histograma tipo obtido como que flutua do hibridoma 7C10 (figura 3C) comparado a uma marcação células sozinhas + anticorpo secundário (figura 3A) ou a uma marcação que utiliza um isótipo controle (figura 3B).

[000200] Nesse estágio da seleção, só os hibridomas secretando AcM reconhecendo ao mesmo tempo o receptor recombinante e o receptor nativo foram selecionados e clonados. Os AcM secretados por esses hibridomas foram produzidos, depois purificados, antes de serem testados no FACScan, segundo o método descrito acima, sobre células de insetos Sf9 expressando o IGF-IR ou o IR, a fim de eliminar os hibridomas reconhecendo, ao mesmo tempo, os dois receptores. A figura 4A mostra um recobrimento total dos histogramas 1, 2, 3 correspondendo respectivamente às células não-infectadas + anticorpos secundários (1), às células não-infectadas marcadas pelo aIR3 + anticorpos secundários (2) e às células não-infectadas marcadas por um anticorpo anti-IR + anticorpos secundários (3). Esse primeiro resultado mostra bem a ausência de IGF-IR e de IR detectáveis na superfície dessas células de inseto não-infectadas. A figura 4B mostra uma marcação de células infectadas por um bacilovírus expressando o IGF-IR. Nessa segunda figura o aIR3, utilizado como prova positiva, marca bem como esperado as células (pico 2), enquanto que o anti-IR (pico 3) se superpõe ao pico de células sozinhas. Enfim, na figura 4C, é mostrado que o anti- IR (pico 3) se superpõe ao pico de células sozinhas. Enfim, na figura 4c, é mostrado que o anti-IR marca bem conforme esperado as células Sf9 expressando o IR (pico 3), mas, de maneira inesperada, o aIR3

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51/103 descrito na literatura como específico do IGF-IR, parece reconhecer também o IR (pico 2).

[000201] Os resultados obtidos nesse terceiro sistema de alvo estão resumidos na tabela 1 e mostram a geração de um AcM: o 7C10, satisfazendo os critérios de reconhecimento do IGF-IR e de não reconhecimento do IR. A isotipagem do AcM 7C10 mostrou que se tratava de um IgG1.

TABELA 1: reatividade comparada de AcM 7C10 sobre células de insetos Sf9, expressando o IGF-IR ou o IR.

	MFI (Média da intensidade de fluorescência
	Células não-infectadas	Células IGF1R+	Células IR +
Células	8	8	7
Anti-IR	4,6	9	91
Anti-IGF-IR (aIR3)	9	35	32
EC2	8	13	11
Anti-rato FITC	4,3	9	13
Meio UltraCultura	9	10	11
15B9	7,5	25	77,8
9F5D	8	41	40
13G5	7,8	37	24
7C10	8,6	49	13
[000202] Os dois últimos alvos previsl	tos para a seleção do AcM

consistiam em verificar que este era bem capaz de inibir a proliferação celular induzida pelo IGF-1 in vitro e in vivo sobre a linhagem celular MCF-7.

[000203] Para a seleção in vitro, as células MCF-7 foram inseminadas, retirado delas o soro de bezerro fetal, depois incubadas em presença de concentrações crescentes de IGF-1 (de 1 a 50 ng/ml) em presença ou na ausência do anticorpo 7C10 a testar adicionado a uma concentração final de 10 pg/ml. Nessa experiência, o AcM comercial aIR3 foi introduzido como prova positiva e o AcM 7G3 (isolado paralelamente ao 7C10 e reconhecendo ligeiramente o

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52/103 receptor nativo (MFI ao FACS de 50 compara a 200 para o ACM 7C10) como isótipo controle. A proliferação celular é estimada por acompanhamento ao computador β da incorporação de timidina tritiada pelas células. Os resultados estão expressos em índice de proliferação. Os dados apresentados na figura 5 mostram que o IGF1 é capaz de estimular de forma dose dependente a proliferação das células MCF-7. O AcM aIR3, utilizado como controle positivo, inibe completamente a proliferação das células MCF-7 induzida pelo IGF-1. Do mesmo modo, o AcM 7C10 é capaz de inibir significativamente o aumento das células MCF-7 induzida pelo IGF-1. Enfim, o AcM 7G3 utilizado como controle isotípico se mostra bem, como esperado, sem efeito sobre o aumento celular tumoral in vitro da célula MCF-7.

[000204] A seleção in vivo foi feita em um modelo de tumor estabelecido. Para isso, ratos nús receberam um implante subcutâneo de estrogênio com liberação lenta, indispensável à retirada do tumor em um modelo murino. Vinte e quatro horas após a implantação dos estrogênios, 5.106 células MCF-7 foram enxertadas sobre o flanco direito do rato em subcutâneo. Cinco dias após este enxerto celular, os tumores eram mensuráveis e lotes de 6 ratos foram constituídos ao acaso. O tratamento dos ratos foi feito duas vezes por semana, durante 5 a 6 semanas, à dose de 250 pg/dose/rato. No grupo controle, os ratos foram tratados da mesma forma com um isótipo controle murino. Os resultados apresentados na figura 6A mostram uma inibição muito significativa do aumento tumoral induzido pelo anticorpo 7C10. Essa atividade será particularmente inesperada, caso se refira aos dados disponíveis referentes ao aIR3, sempre utilizado como referência no domínio do receptor ao IGF1, e conhecido por não ter nenhuma atividade in vivo sobre o aumento dos tumores estrogênios dependentes (ver a figura 6B). Da mesma forma, comparado aos resultados obtidos com o anticorpo recombinante

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53/103 scFv-Fc derivado do AcM murino 1H7 (ver a figura 6C), o AcM 7C10 é muito mais eficaz na inibição in vivo do aumento das células MCF-7. EXEMPLO 2. Comparação do efeito do 7C10 e do tamoxifen sobre o aumento in vivo do tumor MCF-7 [000205] Com a finalidade de determinar a potência do tratamento pelo anticorpo 7C10 no quadro do câncer do seio estrogênio dependente, o 7C10 foi comparado ao tamoxifen composto comumente utilizado para o tratamento do carcinoma mamário no quadro das formas evoluídas com progressão local e/ou metastáticas e no quadro da prevenção das recidivas (ver VIDAL 2000, páginas 1975-1976).

[000206] Nos cânceres do seio hormono-dependentes, existe uma correlação significativa entre a expressão dos receptores aos estrogênios (ER) e aquela do IGF-IR (Surmacz E. et al., Breast Cancer Res. Treat., fev., 47(3):255-267, 1998). Por outro lado, parece que os estrogênios (E2) agem em sinergia com o IGF-1 (às vezes anotado a IGF-I ou IGFI) para estimular a proliferação celular. Com efeito, foi mostrado que um tratamento por E2 aumentava de aproximadamente 10 vezes a taxa de mRNA do IGF-IR, assim como o nível de expressão da proteína (Lee A.V. et al., Mol. Endocrinol., May. 13(5):787-796, 1999). Esse aumento se traduz por um aumento significativo da fosforilação do IGF-IR. Além disso, os E2 estimulam significativamente a expressão do IRS-1 (IRS-1 para Insulin Receptor Substrat-Γ) que é um dos substratos do IGF-IR fosforilado.

[000207] O tamoxifen é amplamente utilizado há anos em hormonoterapia para o tratamento dos pacientes atingidos pelo câncer de seio E2-dependente (Forbes J.F., Semin. Oncol., Feb., 24 (1.Suppl.1):S1-5-S1-19, 1997). Essa molécula entra em competição como estradiol e inibe a fixação deste em seu receptor (Jordan V.C., Breast Cancer Res. Treat., 31(1):41-52, 1994). Por outro lado, foi

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54/103 demonstrado que o tamoxifen é capaz de inibir a proliferação IGF-IR dependente, inibindo a expressão do receptor e sua fosforilação (Guvakova M.A. et al., Cancer Res., July 1, 57(13):2606-2610, 1997). O conjunto desses dados parece indicar que o IGF-IR é um importante mediador da proliferação induzida pela interação E2/ER.

[000208] A utilização a longo prazo do tamoxifen sendo associada com um aumento significativo do risco de câncer do endométrio (Fisher et al, Journal of National Cancer Institute, 86,7:527-537, 1994; VIDAL 2000, 1975-1976) e de recidiva colateral de câncer do seio E2 independentes (Li C.I. et al., J Natl. Cancer Inst., July 4, 93(13):10081013, 2001). Nesse contexto, uma comparação do efeito antitumoral in vivo do anticorpo 7C10 e do tamoxifen foi feita sobre o modelo MCF-7, a fim de determinar a parte da atividade ligada ao IGF-IR na proliferação ER mediada. Para isso, 7.106 células MCF-7 foram implantadas em sc (subcutânea) em ratos nude, 24 horas após implantação nesses mesmos ratos de um grânulo de estradiol de liberação prolongada (0,72 mg/comprimido liberado em 60 dias), indispensável ao estabelecimento de qualquer tumor humano E2 dependente nessa espécie animal. Cinco dias após essa implantação, os tumores foram medidos e grupos de 6 ratos constituídos. Esses grupos são respectivamente tratados com 1) o anticorpo 7C10 injetado em ip (intraperitoneal) à razão de 250 pg/rato, 2 vezes por semana, 2)10 pg de tamoxifen retomado em PBS contendo 3 % hidroxipropilcelulose (HPC) ip ou 3) o solvente no qual é retomado o tamoxifen (hidroxipropil celulose). O tamoxifen é administrado diariamente durante 4 semanas exceto no fim de semana. Os ratos tratados com o ACM 7C10 recebem também diariamente uma injeção de PBS 3 % HPC. Um estudo foi previamente feito para verificar que o solvente sozinho não tem influência sobre o aumento tumoral.

[000209] Os resultados apresentados na figura 7 mostram que o

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ACM 7C10 é capaz de inibir significativamente o aumento do tumor MCF-7 in vivo (os asteriscos (*) correspondem à comparação grupo controle/grupo 7C10 em um teste t). De forma surpreendente, o anticorpo 7C10 parece ser significativamente mais eficaz do que o tamoxifen para a inibição do aumento tumoral (os redondos (^o) correspondem à comparação grupo Tamoxifen/grupo 7C10 em um teste t), sugerindo que esse tipo de tratamento por ACM possa ser substituído pelo tratamento pelo tamoxifen.

EXEMPLO 3: colocação da atividade antitumoral do AcM 7C10 in vivo em evidência sobre tumores humanos de diferentes origens.

a) atividade in vivo do anticorpo 7C10 em três modelos tumorais.

[000210] A fim de generalizar a atividade anticorpo 7C10 a outros tumores expressando o receptor ao IGF1, o 7C10 foi testado in vivo em um modelo de tumor da próstata andrógeno independente DU145 (também anotado DU-145), em um modelo de osteossarcoma SKES-1 e em um modelo de tumor do pulmão não com pequenas células A549. O protocolo é comparável àquele descrito acima para MCF-7 e os resultados apresentados nas figuras 8A a 8C mostram uma atividade significativa desse ACM nos 3 modelos tumorais. A atividade observada no modelo de tumor da próstata deve ser anotada particularmente à medida que a simples cadeia scFv do ACM 1H7 não tem atividade em um modelo de tumor da próstata andrógena independente (Li et al., 2000).

b) Atividade in vivo do anticorpo 7C10 em um modelo ortotópico A549 [000211] Os modelos de xenoenxerto clássico conforme descrito acima não permitem o estudo das drogas sobre a disseminação metastática. Com efeito, os tumores implantados em s.c. (subcutâneo) permanecem localizados no local de injeção e não são portanto,

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56/103 realmente o reflexo da situação no homem. A fim de avaliar nosso anticorpo em um modelo mais próximo da realidade, as células A549 foram implantadas em localização intrapleural. Esse modelo, bem descrito (Clin. Cancer Res. 2000 jan; 6(1):297-304) permite observar uma disseminação metastática próxima daquela observada no homem com metástases mediastinais, pulmonares cardíacas e vertebrais. No estudo que foi feito, 10⁶ células A549 foram injetadas em intrapleural em ratos nús fêmeas. 7 dias após a implantação, os ratos foram repartidos em 2 lotes de 22. Um desses lotes recebeu uma dose de recorrência de 500 pg/rato e foi em seguida tratado duas vezes por semana à razão de 250 pg de 7C10/dose. O segundo lote foi tratado segundo o mesmo esquema com o isótipo controle 9G4. A figura 31 mostra um prazo significativo da sobrevida nos ratos tratados com o ACM 7C10, indicando que esse anticorpo é capaz de ter uma ação sobre a disseminação metastática.

EXEMPLO 4. Comparação do ACM 7C10 com a navelbina in vivo; efeito de uma co-administração dos dois tratamentos [000212] A navelbina é um composto de quimioterapia indicado no câncer do pulmão não com pequenas células e no câncer do seio metastático. O estudo comparativo do 7C10 e da navelbina e a sinergia eventual entre os dois produtos foi estudada sobre o modelo tumoral A549. Para esse estudo 5.10⁶ células A549 foram enxertados subcutaneamente sobre o flanco direito do rato. Cinco dias após o enxerto celular, os tumores são mensuráveis e os tratamentos com o AcM e/ou a navelbina foram começados. A dose de AcM é sempre de 250 pg/dose/rato, duas vezes por semana, intraperitoneal. Com referência à navelbina, ela será administrada na dose máxima tolerada pelo rato, seja 10 mg/kg, em intraperitoneal. Para esse tratamento três injeções serão aplicadas em 7 dias de intervalo. Quando das coadministrações, os dois produtos serão misturados, antes da injeção.

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57/103 [000213] Os resultados apresentados na figura 9 mostram, de forma surpreendente, que, nesse modelo, o anticorpo 7C10 é tão ativo quanto o tratamento clássico pela navelbina. Uma sinergia muito significativa dos dois produtos é também observada com cinco ratos em sete não apresentando tumores mensuráveis no 72^o dia.

EXEMPLO 5: estudo da inibição in vitro do aumento IGF2 induzido dos tumores MCF-7.

[000214] Conforme assinalado anteriormente, o IGF-IR foi superexpresso por numerosos tumores, mas foi descrito, por outro lado, que, em uma boa parte dos cânceres do seio e do cólon notadamente, o sinal de proliferação foi dado a esse receptor via o IGF2 (às vezes anotado IGF-II ou IGFII). É portanto primordial se assegurar que o AcM 7C10 é também capaz de inibir o aumento IGF2 induzido sobre o tumor MCF-7 in vitro. Para isso, células foram inseminadas em placa 96 poços, privadas de soro de bezerro fetal e estimuladas pela adição de 200 ng de IGF2 por ml final de meio, em presença e na ausência dos AcM a testar introduzidos a uma concentração de 10 pg/ml. Os resultados apresentados na figura 10 mostram que o IGF2, como o IGF1 estimula significativamente o aumento das células MCF-7. A adição de um isótipo controle, o 9G4 continua sem efeito sobre essa estimulação. Conforme descrito por De Léon et al. (Growth Factors, 6:327-334, 1992), nenhum efeito foi observado quando da adição do AcM aIR3. Ao contrário, o 7C10 inibe totalmente o aumento induzido pelo IGF2. Sua atividade é significativamente melhor do que aquela do 1H7.

EXEMPLO 6: atividade biológica dos anticorpos 7C10 quiméricos (C7C10) e humanizados (h7C10)

a) Comparação 7C10/C7C10 e 7C10/h7C10 sobre o modelo MCF-7 in vitro [000215] A forma quimérica do AcM 7C10 e a forma humanizada 1

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58/103 (anotada no caso 7H2HM) purificada foram testadas in vitro no modelo MCF-7 conforme descrito acima. Os resultados apresentados respectivamente nas figuras 11 e 12 mostram que essas duas formas conservaram perfeitamente suas propriedades de inibirem o aumento IGF1 induzido do tumor MCF-7.

b) Efeito comparado dos AcM 7C10 e h7C10 sobre a transducção do sinal induzido pela fixação do IGF1 em seu receptor [000216] A ativação da inibição do aumento IGF1 induzida in vitro sobre a linhagem MCF-7 deveria ser a tradução de uma inibição da transducção do sinal mediado pelo IGF1, quando da fixação do AcM 7C10 no receptor. A fim de verificar essa hipótese, células MCF-7 foram incubadas com ou sem IGF1, em presença ou na ausência dos anticorpos a testar. Após um tempo curto de incubação, as células foram lisadas, a cadeia β imunoprecipitada e a fosforilação dessa subunidade estimada com o auxílio de um anticorpo antifosfotirosina quinase. Os resultados apresentados na figura 13 mostram que a fixação do 7C10 e do h7C10 inibem significativamente a fosforilação da subunidade β do IGF-IR contrariamente a um anticorpo irrelevante murino (9G4) ou humano (anotado IgG1 no esquema).

c) Implicação do anticorpo 7H2HM nos mecanismos de ADCC [000217] A inibição da transducção do sinal descrito acima no parágrafo b) é o principal mecanismo de ação implicado na atividade biológica dos anticorpos 7C10 e 7H2HM. Todavia é provável que, quando de sua administração no homem, o anticorpo 7H2HM, de isótipo IgG1, seja capaz de induzir uma lise celular por um mecanismo de tipo ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity). A fim de verificar esse ponto, células NK (Natural Killer) provenientes do sangue periférico de doadores humanos são colocadas em presença de células A549 ou MCF-7 previamente incubadas 4 horas com 10 pg

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59/103 de anticorpos 7H2HM para 5.10⁵ células e, marcadas no Cr ⁵¹(50 pg). Nessa experiência o herceptin (anotada nas figuras 32A e 32B h 4D5) é utilizado como prova positiva de experiência. As figuras 32A a 32D mostram que, conforme esperado, o herceptin induz uma ADCC significativa sobre as duas células A549 e MCF-7 (ver respectivamente as figuras 32A e 32B). O 7H2HM é também capaz de induzir uma ADCC sobre as células A549 (ver a figura 32C), mas esse fenômeno é de menor amplitude sobre as células MCF-7 (ver a figura 32D).

d) Efeito dos anticorpos 7C10 e 7H2HM sobre o ciclo celular [000218] A inibição do aumento celular observada in vitro sobre a linhagem MCF-7 deveria se traduzir por um efeito sobre o ciclo celular. A fim de responder a essa questão 4.10⁵ células são inseminadas em placa 6 poços, 24 após inseminação, o soro de bezerro é retirado e o IGF1 acrescentado em presença ou na ausência dos anticorpos a testar. Após 24 horas de incubação, as células são recuperadas para o estudo do ciclo celular. A figura 33B coloca em evidência o efeito do IGF1 sobre a entrada em ciclo e o aumento das células MCF-7 isto comparado à entrada em ciclo e o aumento das células MCF-7 na ausência de IGF1 (ver a figura 33A). Após adição do fator de crescimento, uma diminuição significativa da fase G0/G1 (de 88,2 % a 56,3 %) em proveito das fases S (de 7,8 a 31 %) e G2/M (de 4 % a 12,7 %) foi observada. Quando da adição dos anticorpos 7C10 e 7H2HM (ver a figura 33C), uma inibição significativa da entrada em ciclo foi observada. Deve ser observado que o anticorpo murino e seu homólogo humanizado têm uma atividade comparável sobre o ciclo celular. O aIR3, introduzido como prova positiva, parece ligeiramente menos ativo do que o 7C10 e o 7H2HM nesse teste. O anticorpo 9G4 utilizado como isótipo controle não tem efeito sobre o ciclo celular.

e) Atividade comparada in vivo dos anticorpos 7C10 e

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7H2HM sobre o modelo A549 [000219] A fim de confirmar a atividade do anticorpo humanizado 7H2HM in vivo, este foi comparado ao 7C10 no modelo de tumor do pulmão não com pequenas células A549. Essa experiência foi feita exatamente conforme descrito antes, exceto a dose de anticorpos que é de 125 pg/dose duas vezes por semana ao invés de 250 pg/dose duas vezes por semana e isto devido ao fato da não disponibilidade de fortes quantidades de 7H2HM. O anticorpo 9G4 foi utilizado como controle isotípico para o 7C10 e uma imunoglobulina humana irrelevante de isótipo IgG1 (a seguir denominada HIgG1) foi utilizada como controle para o anticorpo humanizado 7H2HM.

[000220] A figura 34A mostra que não há diferenças significativas entre as curvas controles 9G4 e HIgG1. Conforme esperado, uma inibição significativa do aumento tumoral foi observada como anticorpo murino 7C10. Referindo ao anticorpo humanizado 7H2HM, a atividade observada é exatamente da mesma intensidade que aquela observada com sua contrapartida murina. Esse dado, adicionado às observações descritas antes in vitro, indica que a humanização não modificou as propriedades do anticorpo gerado. Por outro lado, nos modelos de xenoenxerto no rato, a atividade do anticorpo humanizado parece ser integralmente ligada a um mecanismo de inibição da transducção do sinal. Com efeito, se uma parte ADCC estava em jogo na inibição do aumento tumoral no rato nú, uma diferença deveria ser observada entre a atividade dos anticorpos murinos e humanizados.

[000221] Uma experiência in vivo foi também feita sobre o modelo de tumor do seio MCF-7 e mostra que, conforme esperado, o anticorpo 7H2HM é perfeitamente comparável ao anticorpo murino 7V10 para a inibição do aumento desse tumor in vivo (figura 34B).

f) colocação de uma sinergia em evidência entre o 7H2HM e navelbina

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61/103 [000222] O protocolo descrito no exemplo 4 foi retomado com a finalidade de reproduzir os resultados obtidos com o 7C10 com sua homologia humanizada: o anticorpo 7H2HM.

[000223] Os resultados apresentados nas figuras 35A e 35B mostram que, conforme no caso do 7C10, uma sinergia significativa é colocada em evidência entre o anticorpo humanizado 7h e a navelbina.

g) Efeito dos anticorpos 7C10 e 7H2HM sobre a apoptose das células MCF-7 in vitro [000224] Conforme indicado antes, o IGF-IR é capaz de conferir uma proteção contra a apoptose, quando é superexpresso na superfície das células. Por outro lado, foi mostrado nesses exemplos que os anticorpos 7C10 e 7H2HM eram capazes de potencializar um composto ativo em quimioterapia. A fim de testar o poder dos anticorpos 7C10 e 7H2HM para induzir a apoptose, e explicar em parte seu potencial de sinergia com a quimioterapia, experiências foram feitas sobre as células MCF-7 em presença ou na ausência de doxorrubicina, um medicamento conhecido para induzir a apoptose dessa linhagem celular in vitro. Nessas experiências, as células MCF-7 foram inseminadas em 2.10⁴/cm² em caixa de Petri e cultivadas durante 24 horas em RPMI, sem vermelho de fenol suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal (SVF). As células foram em seguida lavadas duas vezes com PBS e recolocadas em cultura em meio a 0 % SVF. Um tempo de adaptação de 10 minutos, a 37 ^oC, acrescentouse ao meio de cultura IGF-I recombinante (Sigma) a uma concentração final de 50 ng/ml. As células foram de novo deixadas a 37 ^oC, durante uma hora para permitir a fixação dos anticorpos e do IGF-I. Enfim, a doxorrubicina (Sigma) foi acrescentada ao meio de cultura com 2 pg/ml e as células foram incubadas durante 24 horas a 37 ^oC.

[000225] As experiências foram também feitas com a navelbina a uma concentração de 10 pg/ml.

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62/103 [000226] A análise da viabilidade celular foi feita por análise ao citômetro de fluxo após marcação à anexina V-FITC (20 minutos, 4 ^oC) e DAPI (2 pg/ml). A percentagem de células mortas considerado é a população marcada Anexina + / DAPI +. O anticorpo 5C2 é utilizado como isótipo controle.

[000227] Os resultados representados na figura 36 mostram que a doxorrubicina induz uma apoptose nos 8 % das células MCF-7.

Quando as células são tratadas conjuntamente com o anticorpo 7C10 e a doxorrubicina um aumento significativo da morte celular é observado. Um mesmo efeito é mostrado com o anticorpo 7H2HM. O mesmo tipo de resultados foi observado, quando o anticorpo é associado à navelbina.

EXEMPLO 7. Estratégia de clonagem dos genes codificando para as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal (AcM) 7C10 [000228] O RNA total foi extraído a partir de 10⁷ células de hibridomas secretando o anticorpo 7C10, utilizando o TRI REAGENT^TM(segundo as instruções dadas pelo fornecedor, SIGMA, T9424). O primeiro filamento de cADN foi sintetizado com o auxílio do kit First strand cDNA synthesis de Amersham-Pharmacia (n^o 27-9261-01, segundo as instruções determinadas pelo fornecedor). Para as duas cadeias, a r eação foi atraída com o oligonucleotídeo Not I-d(T)18, compreendido no Kit.

[000229] O híbrido cADN: mARN assim obtido foi utilizado para a amplificação por PCR dos genes codificando para as cadeias pesada e leve do AcM 7C10. As PCR foram produzidas, utilizando uma combinação de oligonucleotídeos específicos para as cadeias pesadas e leves (Kappa) das imunoglobulinas de rato. As atrações correspondentes às extremidades 5' se hibridam na região correspondente aos peptídeos de sinal (Tabela 2 para cadeias

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63/103 pesadas, Tabela 3 para cadeias leves). Essas atrações foram compiladas a partir de um grande número de sequências de anticorpos de ratos encontradas nos bancos de dados (Jones S.T. et al., Bio/Technology 9:88-89, 1991). As atrações correspondentes às extremidades 3' se hibridam nas regiões constantes das cadeias pesadas (domínio CH1 da subclasse IgG1, não longe da junção V-C, atração MHC-1 Tabela 4) e leves (domínio Kappa não longe da junção V-C, atração MKC Tabela 4).

TABELA 2: atrações nucleotídicas para a região 5' dos domínios variáveis das cadeias pesadas de imunoglobulina de rato (MHV) (MHV para Mouse Heavy Variable)

MHV-1

5' ATGAAATGCAGCTGGGTCATSTTCTT 3' (SEQIDNo. 13)

MHV-2

MHV-3

MHV-4

MHV-5

MHV-6

MHV-7

MHV-8

5’ ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 3'

5' ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTT 3’

5' ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRT 3'

5' ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT 3'

5' ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTG 3'

5' ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT 3'

5' ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG 3' (SEQ ID No. 14) (SEQIDNo. 15) (SEQIDNo. 16) (SEQIDNo. 17) (SEQIDNo. 18) (SEQIDNo. 19) (SEQ ID No. 20)

MHV-9 : 5' ATGGMTTGGGTGTGGÁMCTTGCTATT 3' (SEQ ID No. 21)

MHV-10 : 5' ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT 3' (SEQ ID No. 22)

MHV-11 : 5' ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG 3’ (SEQ ID No. 23)

MHV-12 : 5' ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT 3' (SEQ ID No. 24) NB KEY : R=A/G, Y=T/C, W=A/T, K=T/G, M=A/C, S=C/G.

TABELA 3: atrações oligonucleotídicas para a região 5' dos domínios variáveis das cadeias kappa (leves) de imunoglobulina de rato (MKV) (MKV para Mouse Kappa Variable)

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MKV-1 : 5’ ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT 3' (SEQ ID No. 25)

MKV-2 : 5’ ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGT 3' (SEQ ID No. 26)

MKV-3 : 5' ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT 3’ (SEQ ID No. 27)

MKV-4 : 5' ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGG 3' (SEQ ID No. 28)

MKV-5 : 5' ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTT 3' (SEQ ID No. 29)

MKV-5 A : 5 ’ ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT 3 ’ (SEQ ID No. 30)

MKV-6 : 5' ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRG 3' (SEQ ID No. 31)

MKV-7 : 5' ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACA 3’ (SEQ ID No. 32)

MKV-8 : 5' ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAAT 3' (SEQ ID No. 33)

MKV-9 : 5' ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTT 3' (SEQ ID No. 34)

MKV-10 : 5' ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC 3' (SEQ ID No. 35)

MKV-11 : 5’ ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT 3' (SEQ ID No. 36)

MKV-12A : 5’ ATGRAGTYWCAGACCCAGGTCTTYRT 3’ (SEQ ID No. 37)

MKV-12B : 5’ ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT 3’ (SEQ ID No. 38)

MKV-13 : 5' ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT 3' (SEQ ID No. 39)

NB KEY : R=A/G, Y=T/C, W=A/T, K=T/G, M=A/C, S=C/G.

TABELA 4: atrações oligonucleotídicas para as extremidades 3' dos genes Vh e Vl de rato [000230] Cadeia leve (MKC):

5' ACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' (SEQ ID No. 40)

Região constante do domínio Kappa de rato:

ADAAPTVSIFPPSS (SEQ ID No. 41)

GCT GAT GOT GCA CCA ACT GTA TCC ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No. 42)

II III III III III III III (MKC) CC ATC TTC CCA CCA TCC AGT (SEQ ID No. 43)

Cadeia pesada (MHC-1)

5' CCAGTGGATAGACAGATG 3' (SEQ ID No. 44)

Domínio CH1 de gama-1 de rato (subclasse IgG1):

akttppsvypl (SEQ ID No.46)

GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG (SEQ ID No.45)

III III III III III IIIIII (MHC-1) CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG (SEQ ID No.47)

EXEMPLO 8: sequências das imunoglobulinas clonadas a partir do hibridoma de rato 7C10 [000231] Seguindo-se a estratégia de amplificação descrita acima,

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65/103 produtos de PCR correspondentes às regiões variáveis da cadeia pesada (VH) e leve (VL) foram clonados utilizando-se o pGEM®-T Easy Vector Systems(Promega). Para 7C10 VL, produtos de PCR foram obtidos com a atração de MKC em combinação com as atrações de MKV1 e MKV2. Para 7C10 VH, produtos de PCR foram obtidos com a atração de MHC-1 em associação com as atrações MHV8 e MHC12. Uma sequenciação aprofundada dos produtos de PCR clonados nos vetores pGEM-T fácil revelou duas sequências diferentes para a cadeia leve e uma sequência única para a cadeia pesada.

a) Região variável isolada a partir do oligo MKV1 [000232] A sequência de DNA obtida é característica de uma região variável de Ig funcional. Essa nova sequência é, portanto, presumida ser aquela codificando para 7C10 VL. As sequências DNA (SEQ ID N^o48 e 50) e aminoácidos (SEQ ID N^o 49) do cDNA codificando para 7C10 VL estão representadas na figura 14.

b) Região variável isolada a partir do oligo MKV2 [000233] O gene codificando para essa cadeia leve provém de um transcrito de mRNA aberrante que está presente em todos os parceiros de fusão padrão derivados do tumor original MOPC-21 da qual faz parte o mieloma de ratos Sp2/Oag14 que foi utilizado para produzir o hibridoma 7C10. Essa sequência comporta uma recombinação aberrante entre os genes V e J (deleção de quatro bases nucleotídicas acarretando uma mudança do quadro de leitura) e uma mutação da cisteína invariável em posição 23 em tirosina. Essas mudanças sugerem que essa cadeia leve seria não-funcional embora todavia transcrita em RNA mensageiro. A sequência DNA dessa pseudo cadeia leve não-mostrada.

c) Região variável isolada a partir dos oligos MHV8 e MHV12 [000234] As sequências de DNA obtidas com esses dois oligos são

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66/103 idênticas, com exceção da sequência codificada pelo próprio oligo. Essa sequência é uma nova sequência codificando para uma cadeia pesada funcional presumida ser aquela do anticorpo monoclonal 7C10. As sequências DNA (SEQ ID N^o 51 e 53) e aminoácidos (SEQ ID N^o52) do cDNA codificando para 7C10 VH estão representadas na figura 15.

EXEMPLO 9: produção dos genes quiméricos rato-homem [000235] O anticorpo quimérico 7C10 foi construído de maneira a ter as regiões 7C10 VL e VH de rato ligadas às regiões constantes humanas kappa e gamma-1, respectivamente. Oligos foram utilizados para modificar as extremidades 5'e 3' das sequências que contornam o DNA codificando para 7C10 VL e VH, a fim de permitir sua clonagem em vetores de expressão em células mamalianas. Esses vetores utilizam o promotor forte HCMV para transcrever eficazmente as cadeias pesada e leve do anticorpo quimérico 7C10. Por outro lado, esses vetores contêm também a origem de réplica de SV40, permitindo uma réplica eficaz do DNA e consequentemente uma expressão transitória das proteínas em células cos.

EXEMPLO 10. Expressão e avaliação da atividade de reconhecimento do IGF-1 receptor do anticorpo quimérico 7C10 [000236] Os dois plasmídeos contendo o DNA codificando para o anticorpo 7C10 quimérico foram co-transfectados em células cos-7 (ATCC number CRL-1651) para estudar a expressão transitória do anticorpo recombinante. Após 72 horas de incubação, o meio de cultura foi retirado, centrifugado para eliminar os restos celulares e analisado por técnica ELISA para a produção em IgG1 humano (ver o Exemplo 16) e o reconhecimento do receptor ao IGF-1 (ver Exemplo 17).

[000237] Os testes ELISA de medida de concentrações em IgG1/Kappa humanos mostraram que a expressão do anticorpo

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67/103 quimérico 7C10 nas células cos7 estava compreendida entre 300 e 500 ng/ml o que é comparável aos valores obtidos com a maior parte dos anticorpos.

[000238] Os testes ELISA de reconhecimento do receptor ao IGF-1 mostram que o anticorpo quimérico o reconhece especificamente e com uma boa avidez relativa (ver as figuras 3A, 3B e 3C). Isto fornece a prova funcional que as boas VH e VL do anticorpo 7C10 foram identificadas. Além disso, essa forma quimérica de 7C10 aparece como sendo um instrumento indispensável à avaliação da afinidade das formas humanizadas.

EXEMPLO 11. Modelização molecular das regiões variáveis do anticorpo de rato 7C10 [000239] A fim de auxiliar e de afinar o processo de humanização por CDR-grafting, um modelo molecular das regiões VL e VH do anticorpo de rato 7C10 foi construído. O modelo é baseado na estrutura cristalográfica da cadeia pesada 1AY1 e da cadeia leve 2PCP.

EXEMPLO 12: processo de humanização por CDR-grafting da região variável da cadeia leve do anticorpo 7C10 (7C10 VL)

a) Comparação da sequência em aminoácidos de 7C10 VL com todas as sequências de ratos VL conhecidas.

[000240] Como etapa preliminar à humanização por CDR-grafting, a sequência em aminoácidos de 7C10 VL foi comparada em uma primeira etapa a todas as sequências de VL de ratos presentes no banco de dados de Kabat (endereço Internet: ftp:ftp.ebi.ac.uk/pub data base/kabat/fasta-format/, último informação dos dados data de 1999). 7C10 VL foi assim identificado como pertencente ao subgrupo II das cadeias leves Kappa conforme definido por Kabat et al. (In Sequences of proteins of immunological interest (5^th ed.), NIH publication N^o 913242, US Department of Health and Human Services, Public Health

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Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991). Regiões VL de anticorpos monoclonais de rato que têm uma identidade de sequências que vão até 95 % foram identificadas (DRB1-4.3 (SEQ ID N^o 55): 95 % e C94-5B11'CL (SEQ ID N^o 56): 95 %, ver a figura 17). A fim de tentar identificar os resíduos fora do comum na sequência de 7C10 VL, a sequência em aminoácidos de 7C10 VL (SEQ ID N^o 54) foi alinhada com a sequência consenso do subgrupo II das cadeias kappa de ratos (SEQ ID N^o 57), conforme definido por Kabat (ver a figura 17). [000241] Na posição Kabat número 3, a valina (V) normalmente apresenta no subgrupo II cadeias leves Kappa segundo Kabat (71 %) é substituída por uma leucina (L). Uma leucina nessa posição não é rara, já que é encontrada, por exemplo, em DRB1-4.3 e C94-5B11'CL. A partir do modelo molecular, esse resíduo não parece exercer um papel particular. Em consequência a conservação desse resíduo na forma humanizada não será considerada.

[000242] Na posição Kabat número 7, a treonina (T) normalmente apresenta no subgrupo II das cadeias leves Kappa, segundo Kabat (66 %) é substituída por uma isoleucina (I). Uma isoleucina com essa posição é relativamente rara, já que só é encontrada 15 vezes dentre todas as sequências VL de ratos conhecidas e jamais dentre sequências VL humanas. O modelo molecular mostra que esse resíduo (17) aponta para a superfície da molécula, mas não contacta os CDRs (o resíduo de um CDR o mais próximo seria a arginina na posição Kabat número 42). Além disso, parece pouco provável que esse resíduo 17 contacte diretamente o antígeno. Em consequência, a conservação desse resíduo na forma humanizada não será considerada pelo menos na primeira etapa.

[000243] Na posição Kabat, número 77, a arginina (R) normalmente apresenta no subgrupo II cadeias leves Kappa, segundo Kabat (95,5 %) é substituída por uma serina (S). Uma Serina nessa posição não é

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69/103 rara.

b) Comparação da sequência de aminoácidos de 7C10 VL com todas as sequências humanas VL conhecidas.

[000244] A fim de identificar o melhor candidato humano para o CDR-grafting, procurou-se a região VL kappa de origem humana que tem a maior homologia possível com 7C10 VL. Para isso, comparou-se a sequência em aminoácidos de 7C10 VL kappa de ratos com todas as sequências VL kappa humanas presentes na base de dados de Kabat. 7C10 VL de ratos tinha a maior homologia de sequência com as regiões VL kappa humanas do subgrupo II, conforme definido por Kabat et al. (1991). Regiões VH de anticorpos monoclonais de origem humana foram identificados tendo uma identidade de sequências que vai até 75,9 % (GM607 (SEQ ID N^o 58) (ver figura 18) sobre a totalidade dos 112 aminoácidos que compõem a região variável. Uma linhagem germinal de origem humana, DPK15/A19 (SEQ ID N^o 59), tendo uma identidade de sequência de 76 % (ver figura 18) foi também identificado. GM607 (Klobeck et al., 1984). GM607 foi portanto escolhido como sequência humana receptora dos CDRs (de acordo com a definição de Kabat) de 7C10 VL de ratos. Comparando-se as sequências de GM607 com aquela da sequência consenso do subgrupo II humano (SEQ ID N^o 60) (figura 18), nenhum resíduo particular nas regiões de sustentação (Rch) pôde ser identificado, indicando que GM607 era um bom candidato para o CDR-grafting.

c) Versões humanizadas de 7C10 VL [000245] A etapa seguinte no processo de humanização consistiu em juntar os CDRs de 7C10 VL de ratos nas regiões de sustentação (Rch) da cadeia leve humana selecionada, GM607 (Klobeck et al., 1984). Nesse estágio do processo, o modelo molecular das regiões de ratos de 7C10 é particularmente útil na escolha dos resíduos de ratos a conservar, pois podem exercer um papel seja na manutenção da

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70/103 estrutura tridimensional da molécula (estrutura canônica dos CDRs, interface VH/VL, etc.) ou na ligação ao antígeno. Nos Rch, cada diferença entre os ácidos aminado de ratos (7C10 VL) e humano (GM607) foi examinada escrupulosamente (ver Tabela 5). Além disso, os resíduos particulares na sequência 7C10 VL de ratos que foram identificados (ver Exemplo 12.a) foram considerados, caso seja necessário.

[000246] Na primeira versão humanizada por CDR-grafting de 7C10 VL, humano 1, uma só mudança nas regiões de sustentação (Rch) de GM607 foi feita. Essa mudança refere-se ao resíduo 2 (nomenclatura de Kabat) situado em Rch 1. Esse resíduo entra, com efeito, na composição da estrutura canônica do CDR 1 de 7C10 VL e poderia, portanto ser crítica para a manutenção dessa lupa em sua boa conformação. A valina presente nessa posição na sequência 7C10 VL de rato é, portanto, conservada nessa mesma posição na forma humanizada (ver a tabela 5 e a figura 19 para a sequência em aminoácidos (SEQ ID N^o 61) e a figura 20 para a sequência DNA (SEQ ID N— 62 e 64) e a sequência em aminoácidos compreendendo o peptídeo sinal (SEQ ID N^o 63).

[000247] Na segunda versão humanizada por CDR-grafting de 7C10VL, humano 2, nenhuma mudança nos Rchs da cadeia leve humana GM 607 foi feita.

[000248] Todos os resíduos dos Rchs são, portanto, de origem humana aí incluído o resíduo 2 que foi, portanto, mudado para substituir a valina presente em 7C10 VL de ratos por isoleucina encontrada nessa mesma posição na cadeia leve humana GM 607 (ver a tabela 5 e a figura 19 para a sequência em aminoácidos (SEQ ID N^o 65) e a figura 21 para a sequência DNA (SEQ ID N^o 66 e 68) e a sequência em aminoácidos compreendendo o peptídeo sinal (SEQ ID N^o 67)). Essa forma humana 2 é, portanto, totalmente humanizada

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71/103 (fora naturalmente dos próprios CDRs), já que todos resíduos dos Rchs são aqueles da cadeia leve de origem humana, GM 607.

TABELA 5: Alinhamento das sequências de aminoácidos que levaram ao desenho das regiões 7C10 VL humanas rearranjadas.

Kabat	N^o	R ou CDR	Cadeia leve 7C10 de ratos	Linhagem germinal humana DPK15/A 19	GM 607	7C10L humano 1 rearranj ado	7C10L humano 2 rearranj ado	Comentários
1	1	FR1	D	D	D	D	D
2	2	\|	V*	I*	I*	V*	I*	Cano L1 4 (16) Zona Vernier
3	3	\|	L	V	V	V	V
4	4	\|	M	M	M	M	M	Zona Vernier

TABELA 5: Continuação.

Kabat	N^o	R ou CDR	Cadeia leve 7C10 de ratos	Linhagem germinal humana DPK15/A 19	GM 607	7C10L humano 1 rearranj ado	7C10L humano 2 rearranj ado	Comentários
5	5	\|	T	T	T	T	T
6	6	\|	Q	Q	Q	Q	Q
7	7	\|	I	S	S	S	S
8	8	\|	P	P	P	P	P
9	9	\|	L	L	L	L	L
10	10	\|	S	S	S	S	S
11	11	\|	L	L	L	L	L
12	12	\|	P	P	P	P	P
13	13	\|	V	V	V	V	V
14	14	\|	S	T	T	T	T
15	15	\|	L	P	P	P	P
16	16	\|	G	G	G	G	Q
17	17	\|	D	E	E	E	E
18	18	\|	Q	P	P	P	P
19	19	\|	A	A	A	A	A

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72/103

20	20	\|	S	S	S	S	S
21	21	\|	I	I	I	I	I
22	22	\|	S	S	S	S	S
23	23	FR1	C	C	C	C	C
24	24	CDR1	R	R	R	R	R
25	25	\|	S*	S*	S*	S*	S*	Cano L1 4 (16)
26	26	\|	S	S	S	S	S
27	27	\|	Q	Q	Q	Q	Q
27A	28	\|	S	S	S	S	S
27B	29	\|	I*	L*	L*	I*	I*	Cano L1 4 (16)
27C	30	\|	V	L	L	i	I
27D	31	\|	H	H	H	H	H

TABELA 5: Continuação.

Kabat	N^o	R ou CDR	Cadeia leve 7C10 de ratos	Linhagem germinal humana DPK15/A 19	GM 607	7C10L humano 1 rearranj ado	7C10L humano 2 rearranj ado	Comentários
27E	32	\|	S	S	S	S	S
28	33	\|	N	N	N	N	N
29	34	\|	G	G	G	G	G
30	35	\|	N	Y	Y	n	N
31	36	\|	T	N	N	T	T
32	37	\|	Y	Y	Y	Y	Y
33	38	\|	L*	L*	L*	L*	L*	Cano L1 4 (16)
34	39	CDR1	Q	D	D	q	D
35	40	FR2	W	W	W	W	W	Zona Vernier
36	41	\|	Y	Y	Y	Y	Y	VH/VL inter Zona Vernier
37	42	\|	L	L	L	L	L
38	43	\|	Q	Q	Q	Q	Q	VH/VL inter
39	44	\|	K	K	K	K	K
40	45	\|	P	P	P	P	P

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73/103

41	46	\|	G	G	G	G	G
42	47	\|	Q	Q	Q	Q	Q
43	48	\|	S	S	S	S	S
44	49	\|	P	P	P	P	P	VH/VL inter (+)
45	50	\|	K	Q	Q	Q	Q
46	51	\|	L	L	L	L	L	VH/VL inter Zona Vernier
47	52	\|	L	L	L	L	L	Zona Vernier
48	53	\|	I	I	I	I*	I*	Cano L2 1 (7) Zona Vernier
49	54	FR2	Y	Y	Y	Y	Y	Zona Vernier
50	55	CDR2	K	L	L	k	K
51	56	\|	V*	G*	G*	v*	v*	Cano L2 1 (7)

TABELA 5: Continuação.

Kabat	N^o	R ou CDR	Cadeia leve 7C10 de ratos	Linhagem germinal humana DPK15/A 19	GM 607	7C10L humano 1 rearranj ado	7C10L humano 2 rearranj ado	Comentários
52	57	\|	S*	S*	S*	S*	S*	Cano L2 1 (7)
53	58	\|	N	N	N	N	N
54	59	\|	R	R	R	R	R
55	60	\|	L	A	A	I	L
56	61	CDR2	Y	S	S	y	Y
57	62	FR3	G	G	G	G	G
58	63	\|	V	V	V	V	V
59	64	\|	P	P	P	P	P
60	65	\|	D	D	D	D	D
61	66	\|	R	R	R	R	R
62	67	\|	F	F	F	F	F
63	68	\|	S	S	S	S	S
64	69	\|	G*	G*	G*	G*	G*	Cano L2 1 (7) Zona Vernier
65	70	\|	S	S	S	S	S
66	71	\|	G	G	G	G	G	Zona Vernier

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74/103

67	72	\|	S	S	S	S	S
68	73	\|	G	G	G	G	G	Zona Vernier
69	74	\|	T	T	T	T	T	Zona Vernier
70	75	\|	D	D	D	D	D
71	76	\|	F*	F*	F*	F*	F*	Cano L1 4 (16) Zona Vernier
72	77	\|	T	T	T	T	T
73	78	\|	L	L	L	L	L
74	79	\|	K	K	K	K	K
75	80	\|	I	I	I	I	I
76	81	\|	S	S	S	S	S
77	82	\|	S	R	R	R	R

TABELA 5: Continuação.

Kabat	N^o	R ou CDR	Cadeia leve 7C10 de ratos	Linhagem germinal humana DPK15/A 19	GM 607	7C10L humano 1 rearranj ado	7C10L humano 2 rearranj ado	Comentários
78	83	\|	V	V	V	V	V
79	84	\|	E	E	E	E	E
80	85	\|	A	A	A	A	A
81	86	\|	E	E	E	E	E
82	87	\|	D	D	D	D	D
83	88	\|	L	V	V	V	V
84	89	\|	G	G	G	G	G
85	90	\|	V	V	V	V	V
86	91	\|	Y	Y	Y	Y	Y
87	92	\|	Y	Y	Y	Y	Y	VL/VH inter
88	93	FR3	C	C	C	C	C
89	94	CDR3	F	M	M	f	F	VL/VH inter
90	95	\|	Q*	Q*	Q*	Q*	Q*	Cano L3 1(9)
91	96	\|	G	A	A	g	G	VL/VH inter
92	97	\|	S	L	L	s	S
93	98	\|	H	Q	Q	h	H
94	99	\|	V	T	T	v	V
95	100	\|	P*	P*	P*	P*	P*	Cano L3 1(9)

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75/103

96	101	\|	W	Q	w	W	VL/VH inter (+)
97	102	CDR3	T	T	T	T
98	103	FR4	F	F	F	F	VL/VH inter Zona Vernier
99	104	\|	G	G	G	G
100	105	\|	G	Q	Q	Q
101	106	\|	G	G	G	G
102	107	\|	T	T	T	T
103	108	\|	K	K	K	K
104	109	\|	L	V	V	V
105	110	\|	E	E	E	E
106	111	\|	I	I	I	I
107	112	FR4	K	K	K	K

[000249] Legenda: A primeira coluna (Kabat) indica a posição do resíduo de aminoácido, segundo Kabat et al. (1991); a segunda coluna (#) indica as posições do resíduo de aminoácido na sequência regular; a terceira coluna (FR ou CDR) foi realizada para identificar facilmente os segmentos do esqueleto (FR1, FR2, FR3 e FR4) e os segmentos CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) (CDR para ComplementaryDetermining Region) com os três CDRs que separam os quatro FRs; a quarta coluna (Cadeia leve de ratos 7C10) representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N^o 54) da região VL do anticorpo de ratos 7C10; a quinta coluna (linhagem germinal humana DPK15/A19) representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N^o 59) da cadeia leve humana V kappa II da linhagem germinal; a sexta coluna (GM 607) representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N^o 58) da região VL do anticorpo GM 607 humano; a sétima e a oitava colunas (7C10 L humanos 1 e 2 rearranjados) representam as sequências de aminoácidos dos anticorpos 7C10 VL humanizada 1 e 2 (respectivamente SEQ ID N^o 61 e 65). indica as partes da estrutura canônica do circuito CDR, tal como definida por Chothia et al. (Nature, 342, 877-883, 1989).

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76/103

EXEMPLO 13: Processo de humanização por CDR-grafting da região variável da cadeia pesada do anticorpos 7C10 (7C10 VH)

a) Comparação da sequência em aminoácidos de 7C10 VH com todas as sequências de ratos VH conhecidas.

[000250] Como etapa preliminar à humanização por CDR-grafting, a sequência em aminoácidos de 7C10 VH foi comparada em uma primeira etapa a todas as sequências de VH de ratos presentes no banco de dados de Kabat (endereço Internet:

ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/, último esclarecimentos dos dados data de 1999). 7C10 VH foi assim identificado como pertencente ao subgrupo I(A) das cadeias pesadas conforme definido por Kabat et al. (1991). Regiões VH de anticorpos monoclonais de ratos que uma identidade de sequências que vai até 90,5 % foram identificados (An03'CL (SEQ ID N^o 70), ver a figura 22). A fim de tentar identificar os resíduos fora do comum na sequência de 7C10 VH, foi alinhada a sequência em aminoácidos de 7C10 VH (SEQ ID N^o 69) com a sequência consenso (SEQ ID N^o 71) do subgrupo I(A) das cadeias pesadas de ratos conforme definido por Kabat (ver a figura 22).

[000251] O resíduo 17 (numeração de Kabat), Thr para a sequência consenso do subgrupo I(A) e Ser em 7C10 VH, é localizado na superfície da molécula do lado da interface com a região constante. Esse resíduo não parece importante.

[000252] O resíduo 27 (numeração de Kabat), Asp para a sequência consenso do subgrupo I(A) e Tyr em 7C10 VH, é um resíduo canônico para o CDR 1. Tyr nessa posição não é raro e é provavelmente crítico para a manutenção do CDR 1 em sua boa conformação.

[000253] O resíduo 84 (numeração de Kabat), Thr para a sequência consenso do subgrupo I(A) e Asn em 7C10 VH. Asn, encontrou 93 vezes em VH de ratos e 3 vezes em VH humana. A partir do modelo

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77/103 molecular, é um resíduo de superfície afastado do paratopo.

[000254] A numeração dos aminoácidos é aquela de Kabat et al. (1991). Os resíduos nas regiões de sustentação (fora CDRs) que diferem entre 7C10 VH e Kabat subgrupo I(A) de ratos são sublinhados. AN03'CL representa a sequência da cadeia pesada de um anticorpo de ratos (número de acesso no banco de dados de Kabat é p001289).

b) Comparação da sequência em aminoácidos de 7C10 VH com todas as sequências humanas VH conhecidas [000255] A fim de identificar o melhor candidato humano para o CDR-grafting, pesquisou-se a região VH de origem humana que tem a maior homologia possível com 7C10 VH. Para esse fim comparou-se a sequência em aminoácidos de 7C10 VH de ratos com todas as sequências VH humanas presentes na base de dados de Kabat. 7C10 VH de ratos tinha a maior homologia de sequência com as regiões VH humanas do subgrupo II como definido por Kabat et al. (1991). Regiões VH de anticorpos monoclonais de origem humano foram identificadas tendo uma identidade de sequências que vão até 67,3 % (humano VH FUR1'CL (SEQ ID N^o 73, ver a figura 23) sobre a totalidade dos 98 aminoácidos codificados pelo gene variável (isto é, fora CDR3 e região J). Uma linhagem germinal de origem humana, 4.22 VH IV (Sanz et al, 1989), tendo uma identidade de sequência de 68,4 %, segundo os mesmos critérios que para VH FUR1'CL, foi também identificada (human Germ-line (SEQ ID N^o 74), ver a figura 23). A sequência codificada pela linhagem germinal 4.22 VH IV foi escolhida como sequência humana receptora dos CDRs (segundo a definição de Kabat) de 7C10 VH de ratos mais do que VH FUR1'CL, pois comparando as sequências de 4.22 VH IV e VH FUR1'CL com aquela da sequência consenso do subgrupo II humano (human Kabat sg II (SEQ ID N^o 72), ver a figura 23 e a tabela 6), nenhum resíduo

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78/103 atípico nas regiões de sustentação (Rch) pôde ser identificado para 4.22 VH IV, enquanto que a presença de dois resíduos atípicos (Gln e Arg às posições 81 e 82A, segundo a nomenclatura de Kabat, respectivamente) foram identificados na sequência codificada por VH FUR1'CL.

c) Versões humanizadas de 7C10 VH [000256] A etapa seguinte no processo de humanização consistiu em juntar os CDRs de 7C10 VH de ratos nas regiões de sustentação (Rch) da linhagem germinal humana 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989). Nesse estágio do processo, o modelo molecular das regiões Fv de ratos de 7C10 é particularmente útil na escolha dos resíduos de ratos a conservar, pois podendo exercer um papel seja na manutenção da estrutura tridimensional da molécula (estrutura canônica dos CDRs, interface VH/Vl, etc.) ou na ligação ao antígeno (pertença ao paratopo). Nos Rch, cada diferença entre os aminoácidos de ratos (7C10 VH) e humano (4.22 VH IV) foi examinada escrupulosamente (ver a Tabela 6). Além disso, os resíduos particulares na sequência 7C10 VH de ratos que foram identificados (ver Exemplo 8.a) foram considerados, se necessário.

[000257] Na primeira versão humanizada por CDR-grafting de 7C10 VH, humanizado 1, quatro mudanças nas regiões de sustentação (Rch) de 4.22 VH IV foram feitas (ver a tabela 6, figura 24 para a sequência em aminoácidos (SEQ ID N^o 75) e a figura 25 para a sequência de DNA (SEQ ID N^o 76 e 78) e a sequência de aminoácidos compreendendo o peptídeo sinal (SEQ ID N^o 77). Essas quatro mudanças referem-se:

. ao resíduo 30 (nomenclatura de Kabat) situado em Rch 1. Esse resíduo entra com efeito na composição estrutural do CDR1 de 7C10 VH (conforme definido por Chothia et al., 1989) e poderia portanto ser crítica para a manutenção dessa lupa em sua boa

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79/103 conformação. A Thr apresenta nessa posição na sequência 7C10 VH de ratos é, portanto, conservada nessa mesma posição na forma humanizada;

. ao resíduo 48 (nomenclatura de Kabat) situado em Rch 2. Esse resíduo fica próximo dos CDRs, embora a partir do modelo molecular não em contato direto com estes, e poderá influenciar sobre sua conformação fina. A metionina presente nessa posição na sequência 7C10 VH de ratos é, portanto, conservada nessa mesma posição na forma humanizada 1;

. ao resíduo 67 (nomenclatura de Kabat) situado em Rch 3. Esse resíduo fica próximo dos CDRs e a partir do modelo molecular poderia contactar a Lysina 60 (nomenclatura de Kabat) no CDR 2. A isoleucina presente nessa posição na sequência 7C10 VH de ratos é, portanto, conservada nessa posição na forma humanizada 1;

. o resíduo 71 (nomenclatura de Kabat) situado em Rch 3. Esse resíduo faz parte da estrutura canônica do CDR 2 e deveria, portanto, ser crítica para manter essa lupa em sua boa conformação. A arginina presente nessa posição na sequência 7C10 VH de rato é, portanto, conservada nessa posição na forma humanizada 1.

[000258] Na segunda versão humanizada por CDR-grafting de 7C10 VH, humanizado 2, duas mudanças nas regiões de sustentação (Rch) de 4.22 VH IV foram feitas. Essas duas mudanças referem-se aos resíduos 30 e 71 (nomenclatura de Kabat), já descritos na forma humanizada 1 (ver a Tabela 6, figura 24 para a sequência em aminoácidos (SEQ ID N^o 79) e a figura 26 para a sequência de DNA (SEQ ID N^o 80 e 82) e a sequência de aminoácidos compreendendo o peptídeo sinal (SEQ ID N^o 81).

[000259] Na terceira forma humanizada por CDR-grafting de 7C10 VH, humanizado 3, nenhuma mudança nas regiões de sustentação (Rch) de 4.22 VH IV foi feita. Todos resíduos dos Rchs são, portanto,

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80/103 de origem humana aí incluídos os resíduos 30, 48, 67 e 71 (nomenclatura de Kabat) que foram conservados (ver a Tabela 6, figura 24 para a sequência em aminoácidos (SEQ ID N^o 83) e a figura 27 para sequência de DNA (SEQ ID N^o 84 e 86) e a sequência de aminoácidos compreendendo o peptídeo sinal (SEQ ID N^o 85)). Essa forma humanizada 3 é, portanto, totalmente humanizada (fora naturalmente dos próprios CDRs, conforme definido por Kabat), já que todos os resíduos dos Rchs são aqueles codificados pelo gene VH da linhagem germinal 4.22 VH IV.

Tabela 6: Alinhamento das sequências de aminoácidos que levaram ao desenho das regiões 7C10 VH humanas rearranjados

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
1	FR1	D	Q	Q	Q	Q	Q
2	\|	V	V	V	V	V	V	Zona Vernier
3	\|	Q	Q	Q	Q	Q	Q
4	\|	L	L	L	L	L	L
5	\|	Q	Q	Q	Q	Q	Q
6	\|	E	E	E	E	E	E
7	\|	S	S	S	S	S	S
8	\|	G	G	G	G	G	G
9	\|	P	P	P	P	P	P
10	\|	G	G	G	G	G	G
11	\|	L	L	L	L	L	L
12	\|	V	V	V	V	V	V
13	\|	K	K	K	K	K	K
14	\|	P	P	P	P	P	P
15	\|	S	S	S	S	S	S
16	\|	Q	E	E	E	E	E
17	\|	S	T	T	T	T	T

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81/103

18	\|	L	L	L	L	L	L
19	\|	S	S	S	S	S	S
20	\|	L	L	L	L	L	L
21	\|	T	T	T	T	T	T

Tabela 6: Continuação.

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
22	\|	C	C	C	C	C	C
23	\|	S	T	T	T	T	T
24	\|	V	V	V	V*	V*	V*	H1 2(6) canônico
25	\|	T	S	S	S	S	S
26	\|	G*	G*	G*	G*	G*	G*	H1 2(6) canônico
27	\|	Y*	Y*	Y*	Y*	Y*	Y*	H1 2(6) canônico Zona Vernier
28	\|	S	S	S	S	S	S	Zona Vernier
29	\|	I*	I*	I*	I*	I*	I*	H1 2(6) canônico Zona Vernier
30	FR1	T	S	S	t	T	S	Zona Vernier Próxima dos CDRs
31	CDR1	G	S	S	g	G	g
32	\|	G	G	G	G	G	G
33	\|	Y	Y	Y	Y	Y	Y
34	\|	L	Y	Y	I	L	I
35	\|	W*	W*	W*	W*	W*	W*	H1 2(6) canônico VH/VL interface
35A	CDR1	N	G	G	n	N	n
36	FR2	W	W	W	W	W	W
37	\|	I	I	I	I	I	I	VH/VL interface

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82/103

38	\|	R	R	R	R	R	R
39	\|	Q	Q	Q	Q	Q	Q	VH/VL interface
40	\|	F	P	P	P	P	P

Tabela 6: Continuação.

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
41	\|	P	P	P	P	P	P
42	\|	G	G	G	G	G	G
43	\|	N	K	K	K	K	K
44	\|	K	G	G	G	G	G
45	\|	L	L	L	L	L	L	VH/VL interface (+)
46	\|	E	E	E	E	E	E
47	\|	W	W	W	W	W	W	VH/VL interface Zona Vernier
48	\|	M	I	I	m	I	I	Zona Vernier Próxima dos CDRs
49	FR2	G	G	G	G	G	G	Zona Vernier
50	CDR2	Y	S	S	y	Y	y	Zona Vernier
51	\|	I	I	M	I	I	I
52	\|	S	Y	F	s	S	s
53	\|	Y	H	H	y	Y	y
54	\|	D	S	S	d	D	d
55	\|	G*	G*	G*	G*	G*	G*	H2 1(6) canônico
56	\|	T	S	S	t	T	t
57	\|	N	T	S	n	N	n
58	\|	N	Y	Y	n	N	n
59	\|	Y	Y	Y	Y	Y	Y
60	\|	K	N	N	k	K	k
61	\|	P	P	P	P	P	P

Petição 870190125606, de 29/11/2019, pág. 88/119

83/103

62	\|	S	S	S	S	S	S
63	\|	L	L	L	L	L	L
64	\|	K	K	K	K	K	K

Tabela 6: Continuação.

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
65	CDR2	D	S	S	d	d	d
66	FR3	R	R	R	R	R	R
67	\|	I	V	V	i	V	V	Zona Vernier Próxima dos CDRs
68	\|	S	T	T	T	T	T
69	\|	I	I	I	I	I	I	Zona Vernier
70	\|	T	S	S	S	S	S
71	\|	R*	V*	V*	r*	r*	V*	H2 1(16) canônico Zona Vernier
72	\|	D	D	D	D	D	D
73	\|	T	T	T	T	T	T	Zona Vernier
74	\|	S	S	S	S	S	S
75	\|	K	K	K	K	K	K
76	\|	N	N	N	N	N	N
77	\|	Q	Q	Q	Q	Q	Q
78	\|	F	F	F	F	F	F	Zona Vernier
79	\|	F	S	S	S	S	S
80	\|	L	L	L	L	L	L
81	\|	K	K	Q	K	K	K
82	\|	L	L	L	L	L	L
82A	\|	N	S	R	S	S	S
82B	\|	S	S	S	S	S	S
82C	\|	V	V	V	V	V	V
83	\|	T	T	T	T	T	T

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84/103

84	\|	N	A	A	A	A	A
85	\|	E	A	A	A	A	A
86	\|	D	D	D	D	D	D
87	\|	T	T	T	T	T	T

Tabela 6: Continuação.

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
88	\|	A	A	A	A	A	A
89	\|	T	V	V	V	V	V
90	\|	Y	Y	Y	Y	Y	Y
91	\|	Y	Y	Y	Y	Y	Y	VH/VL interface
92	\|	C	C	C	C	C	C
93	\|	A	A	A	A	A	A	VH/VL interface Zona Vernier
94	FR3	R*	R*	R*	R*	R*	R*	H1 2(6) canônico Zona Vernier
95	CDR3	Y		G	y	y	y	VH/VL interface
96	\|	G		R	g	g	g
97	\|	R		Y	r	r	r
98	\|	V		C	v	v	v
99	\|	F		S	f	f	f
100	\|			S
100A	\|			T
100B	\|			S
100C	\|			C
100D	\|			N
100E	\|			W
100K	\|	F		F	f	f	f	VH/VL interface (+)
101	\|	D		D	d	d	d

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102	CDR3	Y	P	y	y	y
103	FR4	W	W	W	W	W	VH/VL interface (+) Zona Vernier
104	\|	G	G	G	G	G

Tabela 6: Continuação.

Kabat	FR ou CDR	Cadeia pesada 7C10 de ratos	Linhag em germin al 4.22 VH IV	FUR1' CL VH human o	7C10 H humano 1 Rearranj ado	7C10 H human o 2 Rearra njado	7C10 H humano 3 Rearranj ado	Comentários
105	\|	Q		Q	Q	Q	Q
106	\|	G		G	G	G	G
107	\|	T		T	T	T	T
108	\|	T		L	L	L	L
109	\|	L		V	V	V	V
110	\|	T		T	T	T	T
111	\|	V		V	V	V	V
112	\|	S		S	S	S	S
113	FR4	S		S	S	S	S

[000260] Legenda: A primeira coluna (Kabat) indica a posição do resíduo aminoácido, segundo Kabat et al. (1991); a segunda coluna (FR ou CDR) foi realizada para identificar facilmente os segmentos do esqueleto (FR1, FR2, FR3 e FR4) e os segmentos CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) com os três CDRs que separam os quatro Frs; a terceira coluna (cadeia pesada de ratos 7C10) representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N^o 69) da região VH do anticorpo de rato 7C10; a quarta coluna (linhagem germinal 4.22 VH IV) representa a sequência de aminoácidos do gene 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989) (SEQ ID N^o 74); a quinta coluna (FUR1'CL VH humana, kabat número de acesso n020619) representa a sequência de aminoácidos (SEQ ID N^o 73) IgMK antilâmina B de origem humana (Mariette et al., 1993); a sexta, a sétima e a oitava colunas (7C10 H humanos 1, 2 e 3

Petição 870190125606, de 29/11/2019, pág. 91/119

86/103 rearranjados) representam as sequências de aminoácidos da região VH de 7C10 humano rearranjado respectivamente para as versões 1 (SEQ ID N^o 75), 2 (SEQ ID N^o 79) e 3 (SEQ ID N^o 83). * indica as partes da estrutura canônica do circuito CDR, tal como definido por Chothia et al. (1989).

EXEMPLO 14: Produção dos genes codificando para as versões humanizadas 1 de 7C10 VL e VH por ligação de oligonucleotídeos

a) Princípio [000261] Os genes (peptídeo leader + regiões variáveis VDJ para VH ou VJ para VK) codificando para as regiões variáveis humanizadas foram sintetizadas por ligação em fase sólida sobre esferas magnéticas cotadas na estreptavidina. Os genes codificando para 7C10 VH humanizados (445 pares de bases) e 7C10 VL humanizada (433 pares de bases) são construídos fundindo dois fragmentos de DNA, graças à presença de um local de restrição KpnI presente nas duas sequências e situado aproximadamente na metade do gene (a 200 e 245 nucleotídeos em relação à extremidade 5' do gene para VL e VH, respectivamente). Os dois fragmentos que são fundidos juntos são eles próprios ligados por uma técnica de ligação que consiste em utilizar oligonucleotídeos fosforilados (aproximadamente 30-35 mer85) hibridados dois por dois (um oligo sentido e o outro anti-sentido, sobre uma homologia de aproximadamente 50 %) de forma que se sobrepõem, quando da elongação. Um primeiro oligonucleotídeo biotinilado em 5' é fixado sobre as esferas magnéticas, depois os pares de oligonucleotídeos fosforilados são acrescentados um por um. A ligação fosfodiéster entre os oligonucleotídeos fosforilados justapostos é feita pela enzima T4 DNA ligase.

[000262] Os genes assim sintetizados de novo podem ser diretamente clonados (por digestão com enzimas de restrição

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87/103 compatíveis como vetor de expressão escolhido) ou amplificados por PCR para se obter mais material em preâmbulo na clonagem direcional por digestão enzimática. A sequência do gene assim produzido por ligação de novo é então verificada por sequenciação automática do DNA.

b) Protocolo experimental da técnica de ligação de novo [000263] Oligonucleotídeos fosforilados em 5' ou biotinilados em 5' cuja concentração foi ajustada a 100 pM foram comandados em MWG Biotech (ver as sequências dos oligonucleotídeos utilizados na Tabela 7 para a produção de 7C10 VL humanizada, e a Tabela 8 para a produção de 7C10 VH humanizada). Os oligonucleotídeos foram hibridados por pares (uma mistura equimolar, 500 pmoles, de um oligo sentido e de um oligo anti-sentido no tampão T4 DNA ligase é aquecido a 95 ^oC, durante 5 minutos, depois deixado resfriar sobre o colchão até temperatura ambiente), segundo um esquema descrito na Tabela 9.

[000264] O primeiro oligonucleotídeo biotinilado é fixado sobre esferas magnéticas cotadas na estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal product N^o 112-05). Para isso, a 50 pl de esferas decantadas (utilização de um porta ímã) previamente lavadas duas vezes com 100 pl de tampão TE 1X (tampão Tris-EDTA 100 X: 1M Tris-HCl, pH 8, 0,1 M EDTA, Sigma T-9285) acrescentam-se 500 pmoles do oligonucleotídeo biotinilado em uma solução NaCl a 15 mM. Após uma incubação a 37 ^oC, durante 15 min, as esferas são lavadas duais vezes com o tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM EDTA e 50 mM NaCl) e os pares de oligonucleotídeos hibridados são então acrescentados um por um. A cada acréscimo de um par de oligonucleotídeos, aquece-se a 95 ^oC, durante 5 min, depois se deixa resfriar sobre o colchão até à temperatura ambiente. Uma vez a temperatura ambiente atingida, acrescentam-se 2 pl de T4 DNA ligase

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88/103 a 10 U/μΙ (Biolabs) e incuba-se durante 20 minutos a 37 ^oC. As esferas são em seguida lavadas (tampão de lavagem) e os pares de oligonucleotídeos seguintes são acrescentados assim sucessivamente.

[000265] O último oligo (anti-sentido) não emparelhado é ligado da seguinte forma. 5 μl de oligo (500 pmoles) e 43 μl de tampão T4 DNA ligase são acrescentados às esferas decantadas, depois se aquece a mistura a 95 ^oC durante 5 minutos e deixa-se-a resfriar sobre o colchão até a temperatura ambiente. Uma vez a temperatura ambiente atingida, acrescentam-se 2 μl de T4 DNA ligase e incuba-se a 37 ^oC durante 20 minutos. As esferas são em seguida lavadas duas vezes com o tampão de lavagem, depois duas vezes com o tampão TE 1X.

[000266] As esferas podem então ser conservadas a 4 ^oC, antes de proceder à clonagem e sequenciação do gene ligado de novo.

TABELA 7: Sequência de DNA dos oligonucleotídeos que foram utilizados para a produção de 7C10 VL humanizada 1 pela ligação de novo

LeaderMluI.biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQIDNo. 87)

7C10Lresh. Isens 5' -ACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT (SEQIDNo. 88)

7C10Lresh.2sens 5'-GATGTTCTGGTTTCCTGCTTCCAGCAGTGATG (SEQIDNo. 89)

7C10Lresh.3sens 5' -TTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC (SEQ ID No. 90)

7C10Lresh.4 sens 5' -GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTG (SEQ ID No. 91)

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89/103

7C10Lresh.5sens	5 ' -CAGGTCTAGTCAGACCATTATACATAGTAATG (SEQ ID No. 92)
7C10Lresh.6sens	5 ' -GAAACACCTATTTGGAATGGTACCTGCAGA (SEQ JD No. 93)
7C10Lresh.7anti	5 ’ -GGCAACTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQ ID No. 94)
7C10Lresh.8anti	5' -GAAACCAGAACATCAGCACCAACAGCCTAACA (SEQ ID No. 95)
7C10Lresh.9anti	5 ’ -CTGAGTCATCACAACATCACTGCTGGAAGCAG (SEQ ID No. 96)
7C10Lresh.lOanti	5' -TCTCCAGGGGTGACGGGCAGGGAGAGTGGAGA (SEQ ID No. 97)
7C10Lresh.llanti	5' -TCTGACTAGACCTGCAGGAGATGGAGGCCGGC (SEQ ID No. 98)
7C10Lresh.12anti	5 ' -AAATAGGTGTTTCCATTACTATGTACAATGC (SEQ ID No. 99)
7C10Lresh.13sens	5' -CAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAA (SEQ ID No. 100)
7C10Lresh.14sens	5 ' -GTTTCTAATCGGCTTTATGGGGTCCCTGACAG (SEQ ID No. 101)
7C10Lresh.15sens	5' -GTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTA (SEQIDNo. 102)
7C10Lresh.16sens	5 ’ -CACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGAT (SEQ ID No. 103)
7C10Lresh.17sens	5'-GTTGGGGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACA (SEQIDNo. 104)
7C10Lresh.18sens	5 ' -TGTTCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG (SEQ ID No. 105)
7C10Lresh.19sens	5' -TGGAAATCAAACGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID No. 106)
7C10Lresh.KpnIREV	5 ' -TCTGCAGGTACCATTGC (SEQ ID No. 107)

7C10Lresh. Kpnlbiotin 5'-TGCAATGGTACCTGCAGAAGC (SEQ ID No. 108)

7C10Lresh.20anti	5 ' -AGACTGCCCTGGCTTCTGCAGGTACCATTGCA (SEQ ID No. 109)
7C10Lresh.21anti	5 ’ -CGATTAGAAACTTTATAGATCAGGAGCTGTGG (SEQ ID No. 110)
7C10Lresh.22anti	5 ' -TGCCACTGAACCTGTCAGGGACCCCATAAAGC (SEQ ID No. 111)
7C10Lresh.23anti	5'-GATTTTCAGTGTAAAATCTGTGCCTGATCCAC (SEQIDNo. 112)
7C10Lresh.24anti	5' -TAAACCCCAACATCCTCAGCCTCCACTCTGCT (SEQ ID No. 113)
7C10Lresh.25anti	5 ’ -TCCACGGAACATGTGAACCTTGAAAGCAGTAA (SEQ ID No. 114)
7C10Lresh.2 6anti	5' -TTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAAC (SEQIDNo. 115)

7C10Lresh.BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCACG (SEQ ID No. 116)

TABELA 8: Sequência de DNA dos oligonucleotídeos que foram utilizados para a produção de 7C10 VH humanizada 1 por ligação de novo

LeaderMluI.biotin 5'-GTCAGAACGCGTGCCGCC (SEQ ID No. 117)

7C10Hresh. Isens 5 '-ACCATGAAAGTGTTGAGTCTGTTGTACCTCTTGA (SEQIDNo. 118) 7C10Hresh.2sens 5' -CAGCCATTCCTGGTATCCTGTCTCAGGTGCAGCT (SEQIDNo. 119) 7C10Hresh.3sens 5 '-TCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCG (SEQIDNo. 120) 7C10Hresh. 4 sens 5 ’ -GAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGT (SEQIDNo. 121)

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7C10Hresh.5sens 5'-TACTCCATCACCGGTGGTTATTTATGGAACTGG (SEQ ID No. 122) 7C10Hresh.6sens 5'-ATACGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGG (SEQ ID No. 123) 7C10Hresh.7sens 5'-ATGGGGTATATCAGCTACGACGGTACCAATAAC (SEQ ID No. 124)

7C10Hresh.8antisens 5'-TCAACACTTTCATGGTGGCGGCACGCGTTCTGAC (SEQ ID No. 125) 7C10Hresh.9antisens 5'-ATACCAGGAATGGCTGTCAAGAGGTACAACAGAC (SEQ ID No. 126) 7C10Hresh.10antisens5'-TGGGCCCGACTCCTGAAGCTGCACCTGAGACAGG (SEQ ID No. 127) 7C10Hresh.llantisens5'-TGAGGGACAGGGTCTCCGAAGGCTTCACCAGTCC (SEQ ID No. 128) 7C10Hresh.12antisens5'-CCACCGGTGATGGAGTAACCAGAGACAGTGCAGG (SEQIDNo. 129) 7C10Hresh.13antisens5'-CCCTGGGGGCTGCCGTATCCAGTTCCATAAATAA (SEQ ID No. 130)

7C10Hresh.l4antisens 5’-TAGCTGATATACCCCATCCACTCCAGTCCCTT (SEQ ID No. 131)

7C10Hresh.KpnIREV 5'-GTTATTGGTACCGTCG (SEQ ID No. 132)

7C10Hresh.Kpnlbiotin 5'-TACGACGGTACCAATAACTAC (SEQ ID No. 133)

7C10Hresh.15sens 5'-AAACCCTCCCTCAAGGATCGAATCACCATATC (SEQ ID No. 134)

7C10Hresh.16sens 5'-ACGTGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA (SEQ ID No. 135)

7C10Hresh.17sens 5'-AGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACTGCA (SEQ ID No. 136)

7C10Hresh.ISsens 5'-GTGTATTACTGTGCGAGATACGGTAGGGTCTT (SEQ ID No. 137)

7C10Hresh.19sens

5'-CTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA (SEQ ID No. 138)

7C10Hresh.20sens 5'-CCGTCTCCTCAGGTGAGTGGATCCTCTGCG (SEQ ID No. 139)

7C10Hresh.21antisens 5'-AGGGAGGGTTTGTAGTTATTGGTACCGTCGTA (SEQ ID No. 140) 7C10Hresh.22antisens 5'-ACGTGTCACGTGATATGGTGATTCGATCCTTG (SEQ ID No. 141) 7C10Hresh.23antisens 5'-AGAGCTCAGCTTCAGGGAGAACTGGTTCTTGG (SEQIDNo. 142) 7C10Hresh. 24antisens 5' -CAGTAATACACTGCAGTGTCCGCAGCGGTCAC (SEQIDNo. 143) 7C10Hresh.25antisens 5'-AGTAGTCAAAGAAGACCCTACCGTATCTCGCA (SEQIDNo. 144)

7C10Hresh.2 6antisens 5 '-CTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCC (SEQIDNo. 145)

7C10Hresh.BamHIantisens 5'-CGCAGAGGATCCACTCAC (SEQ ID No. 146)

TABELA 9: Protocolo de emparelhamento dos oligonucleotídeos para a ligação de novo dos genes codificando para as formas humanizadas de 7C10 VH e VL

Ligação de novo do fragmento

M1Ui - KpnI de 7C10 VL humanizado 1 humanizado 1

Oligo-líder MluI 7C10 VL Biotinilado

Par de oligo 1 e 7

Par de oligo 2 e 8

Par de oligo 3 e 9

Ligação de novo do fragmento

KpnI - BamHI de 7C10 VL

Oligo 7C10 L KpnI Biotinilado

Par de oligo 13 e 20

Par de oligo 14 e 21

Par de oligo 15 e 22

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91/103

Par de oligo 4 e 10

Par de oligo 5 e 11

Par de oligo 6 e 12

Oligo anti-sentido 7C10 VL Kpnl

Ligação de novo do fragmento

M1Ui - Kpnl de 7C10 VL humanizado 1 humanizado 1

Par de oligo 16 e 23

Par de oligo 17 e 24

Par de oligo 18 e 25

Par de oligo 19 e 26

Oligo anti-sentido 7C10 L BamHl Ligação de novo do fragmento

KpnI - BamHI de 7C10 VL

Oligo-líder Mlul 7C10 VL Biotinilado

Par de oligo 1 e 8

Par de oligo 2 e 9

Par de oligo 3 e 10

Par de oligo 4 e 11

Par de oligo 5 e 12

Par de oligo 6 e 13

Par de oligo 7 e 14

Oligo anti-sentido 7C10 VL KpnI

Oligo 7C10 L KpnI Biotinilado

Par de oligo 15 e 21

Par de oligo 16 e 22

Par de oligo 17 e 23

Par de oligo 18 e 24

Par de oligo 19 e 25

Par de oligo 20 e 26

Oligo anti-sentido 7C10 L BamHI

EXEMPLO 15: Produção dos genes codificando para as versões humanizadas 2 de 7C10 VL e 7C10 VH e 3 de 7C10 VH por mutagênese dirigida [000267] A versão humanizada 2 de 7C10 VH foi obtida por mutação dirigida dos resíduos 48 e 67 (segundo a nomenclatura de Kabat) da versão 1. Essa mutagênese dirigida foi realizada com o auxílio do sistema QuikChange® Site-directed mutagenesis de Stratagene (kit #200518) segundo o protocolo descrito pelo fabricante. A produção é feita em dois tempos, em uma primeira etapa o resíduo 48 sobre a versão 1 foi mutado com o auxílio do par de atrações 7C10H humanizado1QCM48 sentido e anti-sentido (ver a Tabela 10) e em uma segunda etapa essa versão mutada ao resíduo 48 foi ela mesma mutada no resíduo 67 com o auxílio do par de atrações

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7C10Hhumanizado1QCI67 sentido e anti-sentido (ver tabela 10). [000268] A versão humanizada 3 de 7C10 foi obtida por mutação dirigida dos resíduos 30 e 71 (segundo a nomenclatura Kabat) da versão 2, utilizando-se igualmente o sistema QuikChange®. A produção é feita em dois tempos. Em uma primeira etapa, o resíduo 30 sobre a versão2 foi mutado com o auxílio do par de atrações 7C10H humanizado QCT 30 sentido e anti-sentido (ver a tabela 10). Em uma segunda etapa, essa versão mutada ao resíduo 30 foi ela mesma mutada ao resíduo 71, utilizando-se o par de atrações 7C10H humanizado 1V67QCR71 sentido e anti-sentido (ver tabela 10).

[000269] A versão humanizada 2 de 7C10 VL foi obtida por mutação dirigida do resíduo 2 (segundo a nomenclatura de Kabat) da versão 1, utilizando o sistema QuikChange®. O resíduo 2 sobre a versão 1 foi mutado, utilizando o par de atrações 7C10L humanizado1QCV2 sentido e anti-sentido (ver a Tabela 10).

TABELA 10: Lista dos oligonucleotídeos utilizados para a mutagênese dirigida pelo sistema QuikChange^® de estratagênio

7C10Hhumanizad o1QCT30.sentido	5'-CTGGTTACTCCATCAGCGGTGGTTATTTATG	(SEQ ID No. 147)
7C10Hhumanizad o1QCT30.antisentido	5'-CATAAATAACCACCGCTGATGGAGTAACCAG	(SEQ ID No. 148)
7C10Hhumanizad o1QCM48.sentido	5'-GGGACTGGAGTGGATCGGGTATATCAGCTAC	(SEQ ID No. 149)
7C10Hhumanizad o1QCM48.antisentido	5'-GTAGCTGATATACCCGATCCACTCCAGTCCC	(SEQ ID No. 150)
7C10Hhumanizad o1QCI67.sentido	5'-TCCCTCAAGGATCGAGTCACCATATCACGTG	(SEQ ID No. 151)
7C10Hhumanizad o1QCI67.antisentido	5'-CACGTGATATGGTGACTCGATCCTTGAGGGA	(SEQ ID No. 152)
7C10Hhumanizad o1V67QCR71.sen tido	5'GATCGAGTCACCATATCAGTGGACACGTCCAAGAA CCAG	(SEQ ID No. 153)

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7C10Hhumanizad o1V67QCR71.anti -sentido	5'- CTGGTTCTTGGACGTGTCCACTGATATGGTGACTC GATC	(SEQ ID No. 154)
7C10Lhumanizad o1QCV2.sentido	5'-GCTTCCAGCAGTGATATTGTGATGACTCAGT	(SEQ ID No. 155)
7C10Lhumanizad o1QCV2.antisentido	5'-ACTGAGTCATCACAATATCACTGCTGGAAGC	(SEQ ID No. 156)
EXEMPLO 16: T	rransfecção das células cos7 por eletroporação

[000270] Os vetores de expressão mamaliana contendo as versões quiméricas ou humanizadas das cadeias pesadas e leves do anticorpo 7C10 foram testados em células cos7 para a expressão transitória dos anticorpos recombinantes 7C10. O DNA foi introduzido nas células cos por eletroporação com o auxílio de um instrumento Biorad (Gene Pulsar). O DNA (10 pg de cada vetor) é acrescentado em alíquotas de 0,8 ml de células cos a uma concentração de 1 x 10⁷ células por ml em tampão PBS (sem Ca++ e Mg++). Uma pulsação de 1.900 volts e de uma capacidade de 25 pF foi liberada. As células cos transfectadas são então acrescentadas a 8 ml de meio DMEM, contendo 5 % de soro de bezerro e incubadas a 37 ^oC, durante 72 horas. O que flutua é então coletado, centrifugado para eliminar os restos celulares e testado por ELISA para a medida de sua concentração em anticorpos 7C10 recombinante de tipo IgG1/Kappa humana.

EXEMPLO 17. Método ELISA para medir as concentrações em anticorpos recombinantes IgG1/Kappa humano presentes no que flutua dos transfectantes cos [000271] O que flutua produzido por expressão transitória em células cos7 foi testados para a presença de anticorpos 7C10 de tipo IgG1/Kappa humana. Para a detecção da imunoglobulina IgG1/Kappa humana, placas ELISA de 96 poços (Maxisorb, Nunc) foram cotadas com um anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana (específica para o fragmento Fc gama, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-005-098). O que flutua de células cos foi diluído em série e

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94/103 acrescentado aos poços cotados. Após uma incubação de uma hora a 37 ^oC e lavagem, um anticorpo policlonal de cabra anticadeia leve Kappa humana conjugado à peroxidase (HRP, Sigma, A-7164) foi acrescentado. Após 45 minutos de incubação a 37 ^oC e lavagem, o substrato TMB (KPL #50-76-04) foi acrescentado. Após 10 minutos de incubação a reação foi parada pela adição de ácido sulfúrico 1M e a densidade óptica lida a 450 nm. Uma imunoglobulina humana IgG1/Kappa humana purificada (Sigma, I-3889) de concentração conhecida foi utilizada como anticorpo de referência padrão.

EXEMPLO 18: Método ELISA para determinar a atividade de reconhecimento dos anticorpos recombinantes 7C10 de tipo IgG1/Kappa humanos sobre o receptor ao IGF-1 (IGF-IR) [000272] O que flutua de cultura cos7 foi testado para sua capacidade de reconhecer o IGF-1 R por um método ELISA. Placas ELISA de 96 poços (Dynex Immulon 2HB) foram cotadas foram cotadas com 100 pl por poço de uma solução de PBS contendo 0,31 ng/pl de IGF-1 R (Human Insulin-like Growth Factor I soluble Receptor, R & D Systems, #391-GR) por incubação para uma noite a 4 ^oC. Após lavagem com PBS contendo 0,05 % Tween 20, as placas foram saturadas pela adição de uma solução de PBS contendo 0,5 % Gelatina e incubação a 37 ^oC durante 1 hora. Após 3 lavagens com PBS, as amostras do que flutua cos a testar, previamente diluídas em série em PBS contendo 0,1 % Gelatina e 0,05 % Tween 20, foram acrescentadas às placas. Após uma incubação a 37 ^oC durante uma hora seguida de 3 lavagens (PBS contendo 0,05 % Tween 20), um anticorpo anti-IgG humano (específico para o fragmento Fc) conjugado à peroxidase (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-035-098) foi acrescentado (diluição em 1/5000 em PBS contendo 0,1 % Gelatina e 0,05 % Tween 20). Após 45 minutos de incubação a 37 ^oC e 3 lavagens (PBS contendo 0,05 % Tween 20), o substrato

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TMB (KPL #50-76-04) foi acrescentado. Após 10 minutos de incubação a reação foi parada pela adição de ácido sulfúrico 1M e a densidade óptica lida a 450 mm.

EXEMPLO 19: determinação da atividade de reconhecimento do IGF1R pelas diferentes versões do anticorpo 7C10 humanizado por CDRgrafting [000273] Em uma primeira etapa, comparamos a atividade de reconhecimento das formas humanizadas 1 das cadeias pesada e leve de 7C10 para o IGF-1 receptor em relação à forma quimérica. A figura 28 mostra os resultados de um teste ELISA de reconhecimento do IGF-1R (ver exemplo 18) a partir do que flutuou de células cos7, cuja concentração em IgG1/Kappa humana fora previamente determinada por ELISA (ver Exemplo 17). As curvas de titulação dos quatro anticorpos recombinantes testados se sobrepõem perfeitamente, indicando que suas afinidades relativas para o IGF-IR são muito semelhantes. Conclui-se daí portanto que a forma humanizada 1 de 7C10, composta da cadeia leve humanizada 1 (1 só resíduo de ratos presente nas regiões de sustentação) em combinação com a cadeia pesada humanizada 1 (4 resíduos de ratos presentes nas regiões de sustentação), reconhece especificamente o IGF-1 receptor e tem uma afinidade muito semelhante com aquela do anticorpo quimérico (regiões variáveis de ratos).

[000274] Em uma segunda etapa observamos a influência do resíduo 2 (segundo a nomenclatura de Kabat) da cadeia leve humanizada de 7C10 (versão humanizada 1 versus humanizada 2, ver a figura 19) sobre o reconhecimento do IGF-IR. A figura 29 mostra os resultados do teste ELISA de reconhecimento do IGF-IR (ver Exemplo 18), a partir do que flutua de células cos7 cuja concentração em IgG1/Kappa humana fora previamente determinada por ELISA (ver Exemplo 17). As duas versões humanizadas 1 e 2 da cadeia leve foram associadas

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96/103 sucessivamente com 7C10 VH humanizada 1. As curvas de titulação das duas combinações se superpõem, indicando que a mutação do resíduo 2 da cadeia leve, que foi mudado de uma vanila na versão humanizada 1 para uma isoleucina na forma humanizada 2, não tem aparentemente nenhuma influência sobre a afinidade relativa de reconhecimento do IGF1 receptor. A forma humanizada 2 da cadeia leve de 7C10 constitui assim uma versão ou nenhum resíduo de ratos (fora CDRs) foi conservado. Essa versão, totalmente humanizada, representa a versão preferida de 7C10 VL.

[000275] A versão totalmente humanizada da cadeia leve 7C10 (versão humanizada 2, ver acima) foi testada em associação com as três versões humanizadas da cadeia pesada de 7C10. A figura 30 mostra os resultados do teste ELISA de reconhecimento do IGF-1R a partir do que flutua de células cos7, cuja concentração em IgG1/Kappa humana fora previamente determinada por ELISA (ver Exemplo 17). As curvas de titulação são muito semelhantes e se sobrepõem praticamente com a curva referência correspondente ao anticorpo quimérico, indicando que as três versões humanizadas 1, 2 e 3 de 7C10 VH dão uma mesma afinidade relativa para o IGF-1R, quando elas são associadas a 7C10 VL humanizada 2. Outros testes ELISA feitos em paralelo (resultados não-mostrados) revelaram todavia que uma mutação pontual do resíduo 71 (nomenclatura de Kabat) de uma arginina (ratos) a uma valina (humana) acarretava uma pequena perda de afinidade do anticorpo correspondente para o IGF-1R. Assim, é razoável pensar que 7C10 VH humanizado 2 tem a mesma afinidade relativa para o IGF-1R que 7C10 VH humanizada 1. Essa forma humanizada 2 será, portanto, preferida em relação à forma 1 já que ela só comporta dois aminoácidos de ratos (resíduos 30 e 71, ver a figura 24). A forma humanizada 3 que não comporta mais nenhum resíduo de ratos (com exceção dos CDRs) será ela também preferida, já que

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97/103 ela parece acarretar apenas uma perda mínima de afinidade.

[000276] Em conclusão, aparece que duas formas humanizadas do anticorpo 7C10, de acordo com a presente invenção, são particularmente preferidas. Uma forma constituída da associação de 7C10 VH humanizada 2 (2 resíduos de ratos conservados) com 7C10 VL humanizada 2 (nenhum resíduo de ratos conservado) e uma outra forma constituída da associação de 7C10 VH humanizada 3 (nenhum resíduo de ratos conservado) com 7C10 VL humanizada 2 (nenhum resíduo de ratos conservado). Esta última forma constitui a versão humanizada última já que nenhum resíduo de ratos está presente ao mesmo tempo nas cadeias pesada e leve.

EXEMPLO 20: expressão do EGFR e do IGF-IR na superfície das células A549.

[000277] A sinergia de ação obtida pela co-administração de dois ACM respectivamente dirigidos contra o IGF-IR e o EGFR foi estudada no ratos nús portadores de um tumor do pulmão não com pequenas células estabelecida por injeção subcutânea (s.c.) de células A549 (linhagem celular de carcinoma de pulmão).

[000278] Em uma primeira etapa, a fim de se assegurar da presença dos dois receptores IGF-IR e EGFR na superfície da célula A549 antes de injetar esta no rato, uma marcação para leitura FACS dessas células foi feita com respectivamente o ACM murino 7C10 anti-IGF-IR (figura 37B) e o ACM murino 225 anti-EGFR (figura 37D). Para isso, as células foram saturadas 30 minutos a 4 ^oC com uma solução de PBS 10 % SVF (soro de bezerro fetal), lavadas depois incubadas durante 30 minutos a 4 ^oC com o ACM de interesse. Após 3 novas lavagens, o anticorpo secundário anti-espécie acoplado ao FITC (isotiocianato de fluoresceína) é acrescentado. Após 30 minutos de incubação a leitura ao FACS (Fluorescence Activated Cells Sorter) é feita a 520 nm (excitação 488 nm).

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98/103 [000279] Os resultados apresentados nas figuras 37A a 37D mostram que as células A549 apresentam em sua superfície um número comparável de receptores ao EGF e ao IGF1. Nos dois casos a população é homogênea em relação à distribuição de cada um dos receptores. A especificidade da marcação é confirmada pela utilização de um controle isotípico (figura 37C). Esses resultados validam a utilização da célula A549 como modelo para o estudo de uma sinergia de ação sobre dois receptores IGF-IR e EGFR e para o estudo de uma colaboração desses dois receptores.

EXEMPLO 21: Sinergia de ação de um ACM anti-IGF-IR e de um ACM anti-EGFR co-administrados in vivo, no rato nú no quadro de um tratamento antitumoral [000280] Para esse estudo, ratos nús foram enxertados em s.c. com 5.106 células A549. Cinco dias após o enxerto de células, os tumores foram medidos e um lote homogêneo de ratos em termos de volume tumoral foi constituído. A partir desse lote dos grupos de 6 ratos foram gerados ao acaso. Esses ratos foram tratados em intraperitoneal (i.p.), duas vezes por semana com cada um dos ACM 7C10 e 225 individualmente na dose de 250 pg/ratos ou com os dois ACM em coadministração. O ACM 9G4 foi administrado como controle isotípico de experiência.

[000281] Os resultados apresentados na figura 38 mostram que cada um dos anticorpos 7C10 e 225 administrados sozinhos é capaz de induzir uma diminuição significativa do aumento tumoral in vivo. Podese notar que os dois ACM testados têm uma atividade comparável sobre o aumento do tumor A549. De forma surpreendente em relação à literatura, uma sinergia significativa foi observada, quando da administração simultânea dos dois ACM (p < ou = a 0.01 a cada um dos tempos da cinética em um teste t) sugerindo que existe uma colaboração dos dois receptores para o aumento ótimo de um tumor in

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99/103 vivo e que, contrariamente aos dados da literatura, o bloqueio de um dos dois eixos não basta inibir totalmente o aumento mediado pelo segundo.

EXEMPLO 22: Estudo da atividade antitumoral dos anticorpos murinos 7C10 e 225 co-administrados nos ratos implantados em ortotópica com células A549.

[000282] A utilização de modelos ortotópicos para a avaliação da atividade antitumoral apresenta um interesse particular em relação ao processo de disseminação metastática de um tumor. A fim de avaliar a atividade antitumoral de uma mistura de anticorpos dirigidos respectivamente contra o IGF-IR e EGFR, 106 células A549 (câncer do pulmão não com pequenas células) foram implantadas na cavidade intrapleural de rato nú. Deve-se notar que esse tipo de implantação tumoral tem por consequência uma disseminação metastática semelhante àquela observada no homem e chega à morte dos animais. A figura 39 mostra que a administração dos anticorpos 225 e 7C10 sozinhos permite observar um ganho comparável e significativo de sobrevida. De forma surpreendente, a co-administração desses dois anticorpos aumenta de forma considerável a sobrevida dos animais sugerindo que esse tratamento tenha um impacto sobre a disseminação metastática das células tumorais.

EXEMPLO 23: 7C10 e 7H2HM inibem a fosforilação da tirosina da cadeia β do IGF-IR e do IRS-I [000283] Células MCF7 são colocadas em cultura durante 24 horas a 5.104 células/cm² (caixas de 75 cm², COSTAR) em 20 ml de RPMI sem vermelho de fenol adicionado de 5mM de glutamina, penicilina/estreptomicina (respectivamente 100 U / 100 pg / ml) e 10 % de soro de bezerro fetal. Após três lavagens em PBS, as células foram incubadas durante 12 horas em meio (RPMI) sem vermelho de fenol, desprovido de soro de bezerro fetal e adicionado de 5 mM de

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100/103 glutamina, penicilina/estreptomicina, soroalbumina bovina a 0,5 pg/ml (Sigma A-8022) e transferrina a 5 pg/ml (Sigma T8158).

[000284] Para a ativação, as células foram inicialmente incubadas a 37 ^oC durante 2 minutos com anticorpos bloqueando (10 pg/ml), depois o IGF-I (Sigma 13769, 50 ng/ml) foi acrescentado para dois minutos suplementares. A reação foi parada por aspiração do meio de incubação e as caixas foram depositadas sobre gelo. As células foram solubilizadas por adição de 0,5 ml de tampão de lise (50 mM tris-HCL pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P40, 0,5 % sódio deoxicolato), adicionado de inibidores de protease (1 comprimido para 50 ml, Boehringer Ref.: 1697 498) e de inibidores de fosfatase (Calbiochem Ref.: 524625 (1/100)). As células foram raspadas e a suspensão foi recuperada e colocada sobre um agitador a 4 ^oC, durante 1,5 hora. As soluções foram centrifugadas a 12000 rpm, durante 10 minutos (4 ^oC) e as concentrações em proteínas do que flutuou foram quantificadas por BCA.

[000285] 500 pg de proteínas do lisado celular foram misturados com o anti-IGF-IR (Santa Cruz, Ref.: sc-713) para imunoprecipitação e incubadas sobre agitador a 4 ^oC, durante 1,5 hora. Os imunoprecipitados foram recuperados por adição de proteína Aagarose (Boehringer Ref.: 1 134 515) e incubados durante toda a noite sobre agitador a 4 ^oC. Para a imunoprecipitação de IRS-1, anticorpos anti IRS-1 acoplados a esferas de agarose (Santa- Cruz Ref.: 559Ac) foram utilizados. As esferas de agarose foram lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de lise, duas vezes com um tampão de lavagem 1 (50 mM Tris-HCL pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,1 % Nonidet P40; 0,05 % sódio deoxicolato (Boehringer 1 332 597), adicionado de inibidores de protease e de inibidores de fosfatase) e uma vez com um tampão de lavagem 2 (50 mM Tris-HCL; 0,1 % Nonidet P40; 0,05 % sódio deoxicolato (Boehringer Ref.: 1 332 597), adicionado de inibidores de

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101/103 protease e de inibidores de fosfatase 1/100). Os imunoprecipitados foram recolocados em suspensão em um tampão Laemmli, aquecidos a 100 ^oC, durante 5 minutos. O que flutua foi analisado por eletroforese sobre gel SDS de poliacrilamida (8 % Novex EC6015). As proteínas foram transferidas sobre membrana de nitrocelulose seguido por um imunoblot com anticorpos antifosfotirosina conjugados ao HRP (upstate Biotechnology 4G10) ou anticadeia beta do IGF-IR ou antiIRS-1 (Santa Cruz Ref.: sc 8038) seguido por um anticorpo anti-coelho conjugado a HRP. As impressões foram reveladas por quemiluminescência (Amersham RPN 2209) seguido de uma radioautografia sobre películas Kodak X-mat AR.

[000286] A figura 40A representa células MCF7 não-estimuladas (0) ou estimuladas seja com IGF-1 (50 ng/ml) sozinho (0+IGF-1) ou combinado com anticorpos monoclonais ou humanizados anti-IGF-IR (10 pg/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM. Os anticorpos 9G4 ou hIgG1 são imunoglobulinas murinas ou humanas de isótipo IgG1 utilizadas como controle negativo da experiência. As cadeias beta do IGF-IR foram imunoprecipitadas e integradas com anticorpos antitirosina fosforilada. Os resultados obtidos mostram que os anticorpos monoclonais ou humanizados anti-IGF-IR 7C10, 1H7 e 7H2HM inibem a fosforilação da tirosina da cadeia beta do IGF-IR.

[000287] A figura 40B representa células MCF7 não estimuladas (0) ou estimuladas seja com IGF-1 (50 ng/ml) sozinho (0+IGF-1) ou combinado com anticorpos monoclonais ou humanizados anti-IGF-IR (10 pg/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM. Conforme descrito mais acima, os anticorpos 9G4 ou hIgG1 são imunoglobulinas murinas ou humanas de isótipo IgG1 utilizadas como controle negativo da experiência. O IRS-1 foi imunoprecipitado e integrado com anticorpos antitirosina fosforilada. Os resultados obtidos mostram que os anticorpos monoclonais 7C10, 7H2HM e 1H7 inibem a fosforilação da tirosina do IRS-1.

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EXEMPLO 24. 7C10 e 7H2HM induz a internalização do IGF-IR [000288] Células MCF7 e A549 foram colocadas em suspensão a 1.10⁷ células/ml em PBS com 10 % de soro de bezerro fetal (tampão FACS). 1.16 células foram incubadas durante 30 minutos a 37 ^oC com os anticorpos monoclonais a 10 pg/ml (7C10, 7G3, 9G4) ou a 20 pg/ml para 7H2HM. Após lavagem, as células foram marcadas a 4 ^oC durante 30 minutos com um anti-IGF-IR biotinilado (anticorpo monoclonal 12B1) e enfim incubadas a 4 ^oC durante 30 minutos com um conjugado de estreptavidina-488 alexa Fluor®. As células foram analisadas por FACScan (Becton-Dickinson, Enembogegem, Bélgica) com o soft Cellquest, após eliminação dos restos.

[000289] A figura 41 mostra as células A549 sem coloração (1^o pico), as células A549 incubadas com 7C10 7H2HM (2^o pico) e as células A549 incubadas com uma IgG1 de ratos ou de rato irrelevante (3^opico). Observa-se uma diminuição por dois da expressão d e superfície do IGF-IR pelas células quando as células foram previamente incubadas com 7C10 e 7H2HM.

EXEMPLO 25: 7C10 e 7H2HM induz a degradação do IGF-IR [000290] Células MCF-7 foram cultivadas durante 24 horas a 10.10⁴células/cm² (75 cm², Costar) em 15 ml de meio completo. Em seguida, as culturas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante 12 horas com meio desprovido de soro. Em seguida, as células foram incubadas com a ciclo-heximida a 25 pg/ml sozinho ou com 10 pg/ml de anticorpo monoclonal 7C10, 9G4, 7G3 ou o IGF-I (50 ng/ml). Em certas experiências, antes da incubação com os anticorpos monoclonais, as células foram tratadas durante 1 hora a 37 ^oC com MG-132 (10 pM, Calbiochem 4747791) para inibir as atividades do proteasoma. Após incubação, as células foram lavadas e solubilizadas por adição de um tampão de lise. 20 pg de proteínas foram analisadas por efetroforese sobre gel de poliacrilamida a 8 % de SDS e

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103/103 transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose seguida por imunoblot anti-cadeia beta do IGF-IR, tal como descrito mais acima. [000291] A análise por western-blot (figura 42A) da integridade do IGF-IR mostra que 7C10 e 7H2HM induzem a degradação do receptor, enquanto que o ligante natural não acarreta nenhuma degradação deste. Nenhuma degradação do receptor foi observada com o 9G4, anticorpo irrelevante utilizado como controle isotípico. A figura 42B coloca em evidência que a degradação é inibida por um inibidor de proteasoma MG132 (período de incubação de 2 horas).

[000292] Resultados comparáveis foram obtidos com o anticorpo humanizado 7H2HM (figura 42C).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado, ou um de seus fragmentos funcionais, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar ao receptor do fator de crescimento I semelhante à insulina IGF-IR humano, em que compreende uma cadeia leve que compreende as três CDRs de sequências SEQ ID NOs: 2, 4 e 6, e compreende uma cadeia pesada que compreende as três CDRs de sequências SEQ ID NOs: 8, 10 e 12, e em que o referido fragmento funcional é escolhido dentre os fragmentos Fv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, scFv-Fc e os diacorpos, e em que o referido fragmento compreende as três CDRs de sequências SEQ ID NOs: 2, 4 e 6 e as três CDRs de sequências SEQ ID NOs: 8, 10 e 12.
2. Hibridoma murino, caracterizado pelo fato de que secreta um anticorpo, como definido na reivindicação 1, depositado na CNCM, Institut Pasteur, Paris, aos 19 de setembro de 2001, sob o número I2717.
3. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que é secretado pelo hibridoma, como definido na reivindicação 2.
4. Anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 54, e compreende uma cadeia pesada de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 69.
5. Anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico e compreende ainda as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo de uma espécie heteróloga ao rato.

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6. Anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida espécie heteróloga é o homem.
7. Anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as regiões constantes de cadeia leve e de cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano são, respectivamente, a região kappa e gama-1, gama-2 ou gama-4.
8. Anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende uma cadeia leve ou uma cadeia pesada, nas quais os segmentos de esqueleto FR1 a FR4 da referida cadeia leve ou cadeia pesada são derivados, respectivamente, de segmentos de esqueleto FR1 a FR4 de cadeia leve ou de cadeia pesada de anticorpos humanos.
9. Anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 61 ou 65, ou compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 75, 79 ou 83.
10. Anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 65, e compreende uma cadeia pesada de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 79 ou 83.
11. Anticorpo humanizado, ou um de seus fragmentos funcionais, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10,

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3/4 caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 65, e compreende uma cadeia pesada de sequência compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 83.
12. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que é escolhido dentre os seguintes ácidos nucléicos:

(a) um ácido nucléico, DNA ou RNA de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11, codificando para um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, ou sequências de nucleotídeos degeneradas dos mesmos que codificam as mesmas sequências de aminoácido.
13. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico, como definido na reivindicação 12.
14. Processo de produção de um anticorpo, ou de um de seus fragmentos funcionais, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

(a) o cultivo em um meio e condições de cultura apropriados de uma célula hospedeira compreendendo o vetor, como definido na reivindicação 13; e (b) a recuperação dos referidos anticorpos, ou um de seus fragmentos funcionais, assim produzidos a partir do meio de cultura ou das referidas células cultivadas.
15. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende, a título de princípio ativo, um composto que consiste em um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 11, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Uso de um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, como definido em uma das reivindicações 1 e 3 a 11 ou de uma composição, como definida na reivindicação 15, caracterizado

Petição 870190125606, de 29/11/2019, pág. 112/119

4/4 pelo fato de que é para a preparação de um medicamento destinado à prevenção ou ao tratamento de câncer, em que o dito câncer é um câncer selecionado de câncer de próstata, osteossarcomas, câncer de pulmão ou câncer de mama.
17. Método de diagnóstico in vitro de doenças induzidas por uma superexpressão ou uma subexpressão do receptor IGF-IR a partir de uma amostra biológica, da qual se suspeita a presença normal em receptor IGF-IR, caracterizado pelo fato de que se coloca em contato a referida amostra biológica com um anticorpo, como definido em uma das reivindicações 1 e 3 a 11, e a ligação do anticorpo à amostra indica a superexpressão ou a subexpressão do receptor IGF-IR.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está marcado.
19. Kit ou conjunto para a detecção ou quantificação de uma superexpressão ou de uma subexpressão do receptor IGF-IR em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende os seguintes elementos:

(a) um anticorpo, ou um de seus fragmentos funcionais, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 e 3 a 11; e (b) os reagentes para a constituição do meio propício à reação imunológica.
20. Kit ou conjunto, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

(c) os reagentes que permitem a colocação em evidência dos complexos IGF-IR/anticorpos produzidos pela reação imunológica.
21. Kit ou conjunto, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que é para a detecção ou quantificação da superexpressão do receptor IGF-IR.