BR112021007469A2 - anticorpos biespecíficos direcionados a exossomo - Google Patents

Abstract

“anticorpos biespecíficos direcionados a exossomo. as invenções aqui descritas são destinadas a anticorpos biespecíficos que são capazes de se direcionar seletivamente a exossomos por se ligarem especificamente a uma primeira proteína associada ao exossomo e ao ligante de morte celular programada ("pd-l1"), como uma segunda proteína associada ao exossomo. estes anticorpos biespecíficos podem interromper a supressão da atividade antitumoral pelas células imunes por serem direcionados aos exossomos derivados de células tumorais que inibem a ativação das células t. portanto, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser usados em métodos de tratamento do câncer.

Description

“ANTICORPOS BIESPECÍFICOS DIRECIONADOS A EXOSSOMO” Campo da Invenção

[001] O campo desta invenção diz respeito à terapêutica baseada em anticorpos para o tratamento do câncer.

Histórico da Invenção

[002] O sistema imune adaptativo humano responde a desafios antigênicos através dos processos celular (célula T) e humoral (célula B). A resposta humoral resulta na seleção e amplificação clonal das células B que expressam moléculas de imunoglobulina (Ig) ligadas à superfície capazes de se ligar aos antígenos. As células T se desenvolvem a partir de precursores imaturos que se originam na medula óssea e depois migram para o timo, onde se proliferam e diferenciam em linfócitos T maduros.

[003] O desenvolvimento de uma resposta humoral inclui os processos de hipermutação somática e de comutação de classe que ocorrem de forma concomitante com a amplificação clonal. Juntos, estes processos resultam em anticorpos secretados que sofreram maturação da afinidade contra um antígeno alvo e contêm um domínio constante pertencente a uma das quatro classes gerais (M, D, A, G ou E). Cada classe de anticorpos (IgM, IgD, IgA, IgG e IgE) interage de formas distintas com o sistema imune celular. As características principais dos anticorpos que sofreram maturação da afinidade contra um antígeno alvo podem incluir: 1) nucleotídeo, e aminoácidos subsequentes, mudam em relação ao gene da linhagem germinal, 2) alta afinidade de ligação ao antígeno alvo, 3) seletividade de ligação para o antígeno alvo em comparação com outras proteínas.

[004] É de conhecimento geral que pacientes oncológicos podem desenvolver uma resposta imune contra antígenos de células tumorais. Esses antígenos podem resultar das mudanças genéticas dentro do tumor que levam à mutação de proteínas ou apresentação aberrante de proteínas, de outra forma normais, ao sistema imune. A apresentação aberrante pode ocorrer através de processos que incluem, mas não estão limitados a expressão ectópica de proteínas neonatais, localização incorreta de proteínas intracelulares na superfície celular, ou lise celular. A expressão aberrante de enzimas que levam a mudanças na glicosilação das proteínas também pode resultar na geração de antígenos não próprios (non-self) que são reconhecidos pelo sistema imune humoral.

[005] Os anticorpos, que se ligam seletivamente a proteínas relacionadas a doenças, incluindo aquelas relacionadas ao câncer, têm se mostrado bem- sucedidos na modulação das funções de suas proteínas alvo de maneira que levam à eficácia terapêutica. A capacidade de o sistema imune humano desenvolver respostas de anticorpos contra proteínas mutantes, ou de alguma forma aberrantes, sugere que as respostas imunológicas dos pacientes podem incluir anticorpos capazes de reconhecer e modular a função de indutores tumorais críticos. Nesse sentido, o aumento da expressão das proteínas envolvidas no tráfego de membrana celular está associado ao aumento do crescimento tumoral e da metástase tumoral.

[006] O tráfego de membrana contribui para a regulação de uma ampla gama de processos celulares. A internalização dos receptores de superfície celular é um mecanismo crítico para a modulação apropriada da sinalização mediada pelo receptor de fator de crescimento. A internalização via vesículas revestidas por clatrina representa uma via para a internalização de receptores relevantes para o câncer a partir da superfície celular. O carregamento desses receptores em poços revestidos por clatrina (CCPs), para posterior internalização em vesículas revestidas por clatrina, é uma das primeiras etapas da via. O carregamento dos receptores nos CCPs é regido em parte pela interação com as moléculas adaptadoras, como a Epsina-1 (EPN1).

[007] A EPN1 é uma proteína de aproximadamente 60,3 kDa que se localiza nas membranas celulares. Ela contém domínios de interação PI(4,5)P2,

ubiquitina, e clatrina/AP-2. Realizar o knocking down de expressão da expressão endógena de EPN1, superexpressar as formas mutantes de EPN1, ou tratar as células com agentes desenvolvidos para bloquear a interação da EPN1 com suas moléculas de carga podem inibir a internalização de cargas dependentes de CCP conhecidas. Exemplos de tal carga são VEGFR e ERBB3A. Notavelmente, certos tipos de células tumorais cancerosas liberam exossomos carregados com EPN1, e o crescimento de tais células pode ser bloqueado ao impedir que a EPN1 interaja com seu receptor.

[008] As células T virgens ou naïve, maduras, deixam o timo e migram para os órgãos linfoides especializados, tais como linfonodos, baço e amígdalas. Se uma célula T virgem recebe um sinal de ativação, ela passa por múltiplos ciclos de divisões para produzir populações de células efetoras, bem como outras células que retornam a uma fase quiescente, na qual permanecem preparadas para responder a uma exposição subsequente ao sinal de ativação.

[009] A ativação de células T ocorre através de um modelo de coestimulação de dois sinais (Fig. 21). O primeiro sinal para ativação de células T é a ligação de um receptor de células T (TCR) na superfície de uma célula T ao seu antígeno cognato (Ag), que é apresentado na superfície de uma célula apresentadora de antígeno ("APC"), em um complexo com uma proteína do complexo principal de histocompatibilidade ("MHC"). Este modo de ativação, além de permitir a resposta a antígenos estranhos, também permite a discriminação do próprio/self daquilo que não é próprio/non-self, e a obtenção da tolerância imunológica.

[0010] O segundo sinal de ativação é transduzido para o linfócito T através de moléculas coestimuladoras presentes na superfície das APCs. A interação entre as forças dos sinais primários e secundários é necessária para a ativação apropriada da célula T. A falta de coestimulação, na presença de ativação antigênica, pode levar à exaustão das células T ou à tolerância à estimulação por antígenos estranhos. Em contrapartida, a forte sinalização primária através do TCR pode suplantar a falta de coestimulação.

[0011] A ativação das células T através da coestimulação também é equilibrada por sinais negativos de coestimulação. A interação entre os sinais de coestimulação positivos e negativos proporciona um equilíbrio adequado da ativação imune contra antígenos estranhos, ao mesmo tempo em que evita a quebra da tolerância e o desenvolvimento da autoimunidade.

[0012] As moléculas responsáveis pela coestimulação são de interesse terapêutico porque a manipulação da sinalização por meio dessas moléculas pode melhorar ou atenuar as respostas das células T. A exaustão das células T, ou anergia, está correlacionada com a expressão (do receptor) de morte celular programada 1 (PD-1, do inglês Programmed Cell Death 1) na superfície das células T. A ligação do ligante – ligante de morte celular programada 1 (PD-L1, do inglês Programmed Cell Death-Ligand 1) – a seu receptor cognato, PD-1, reduz a ativação da célula T. Demonstrou-se que a neutralização/antagonização (antagonizing) da via PD-1/PD-L1 com anticorpos capazes de impedir a ligação do PD-L1 ao PD-1, melhora a ativação das células T e melhora o resultado clínico dos pacientes oncológicos.

[0013] O PD-L1, presente nos exossomos derivados de tumores, representa um potente sinal regulador negativo para as células T. Os exossomos são vesículas de membrana de tamanho nanométrico (30 - 150nm) derivadas de corpos multivesiculares e secretados no ambiente extracelular. Os exossomos contêm ligantes e receptores ligados à membrana derivados de células, assim como componentes intracelulares, como RNA e metabólitos. As células tumorais são conhecidas por produzir exossomos, que são capazes de transferir, à distância, componentes derivados de tumores às células normais. Os exossomos derivados de tumores têm sido relacionados, entre outras coisas, à transformação de células normais e ao condicionamento do nicho metastático.

[0014] O aumento dos níveis de PD-L1 associado ao exossomo é um marcador para doenças avançadas e pode se correlacionar inversamente com o desfecho clínico em certos tipos de câncer, incluindo câncer de cabeça e pescoço, câncer gástrico, melanoma e glioblastoma multiforme. A interrupção da supressão de células T induzida por exossomo em tumores representa uma estratégia terapêutica para o tratamento do câncer. Com esse objetivo em mente, anticorpos biespecíficos, capazes de se direcionar ao PD-L1 exossomal e outro marcador exossomal são descritos neste documento como agentes eficazes para suplantar a supressão imunológica induzida por PD-L1 e tratar vários tipos de câncer. Mais particularmente, os anticorpos biespecíficos que têm como alvo o PD-L1 e a EPN1 são divulgados e exemplificados aqui.

Descrição Resumida da Invenção

[0015] A invenção descrita neste documento é destinada a anticorpos biespecíficos que são capazes de se direcionar simultaneamente a exossomos por se ligarem especificamente a uma primeira proteína associada ao exossomo e ao ligante de morte celular programada 1 ("PD-L1"), como uma segunda proteína associada ao exossomo. Tais anticorpos biespecíficos são capazes de interromper a supressão da atividade antitumoral pelas células imunes por serem direcionados aos exossomos derivados de células tumorais, que contêm ligantes, como o PD-L1, que inibem a ativação das células T. Assim, as composições e métodos da invenção podem ser usados no tratamento de cânceres.

[0016] O primeiro alvo associado ao exossomo de um anticorpo biespecífico pode ser, por exemplo, uma proteína transmembrana da família Tetraspanina, o gene de suscetibilidade tumoral 101 ("TSG101"), uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II, uma proteína de interação com morte celular programada 6 ("PDCD6IP", do inglês Programmed Cell Death 6-Interacting Proteins), uma proteína de choque térmico, uma proteína de citoesqueleto, uma anexina, ou uma proteína de transporte de membrana. Portanto, a primeira porção de ligação de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode, por exemplo, se ligar especificamente a Epsina-1 ("EPN1"), CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR,

EGFRvIII, EpCAM, Flotilina-1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90 e NKCC2.

[0017] A segunda porção de ligação de um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, pode ser derivada de qualquer anticorpo PD-L1-específico, incluindo as cadeias VH e VL de um anticorpo PD-L1-específico, tais como, mas não limitado a atezolizumab, avelumab, durvalumab ou BMS 936559.

Breve Descrição das Figuras

[0018] Fig. 1 é uma representação gráfica das moléculas coestimuladoras de células T da família B7.

[0019] Fig. 2 ilustra a ligação dose-dependente dos exossomos às esferas/beads revestidas por anti-CD63 de acordo com o ensaio por citometria de fluxo. Os exossomos ligados às esferas anti-CD63 foram detectados com anticorpos anti-CD63 marcados com fluorescência.

[0020] Fig. 3 ilustra que os exossomos, capturados em esferas de látex por adsorção, são reativos com o anticorpo anti-EPN1 IMM20059, quando a ligação é avaliada por citometria de fluxo. Em contrapartida, o IMM20059 não se liga às esferas revestidas por BSA.

[0021] Fig. 4 ilustra a curva de ligação dependente de concentração observada para a ligação de IMM20059 às linhagens celulares de câncer de pulmão A549 intactas por citometria de fluxo com um instrumento Attune™ NxT (Life Technologies). A ligação de IMM20059 às células intactas foi detectada com anticorpos secundários anti-humano marcados com fluoróforo.

[0022] Fig. 5 ilustra a curva de ligação dependente de concentração observada para a ligação de IMM20059 às células de carcinoma hepatocelular Huh7 intactas por citometria de fluxo com um instrumento Attune™ NxT (Life Technologies). A ligação de IMM20059 às células intactas foi detectada com anticorpos secundários anti-humano marcados com fluoróforo.

[0023] Fig. 6 ilustra os resultados quantitativos de dot blot que demonstram a seletividade do IMM20059 a EPN1 em relação a seu homólogo EPN2. A ligação do IMM20059 foi analisada por dot blot mediante concentrações crescentes de EPN1 ou EPN2 recombinantes.

[0024] Fig. 7 ilustra uma análise por citometria de fluxo que demonstra que o IMM20059 reage de forma cruzada com o antígeno EPN1 murino. Foi realizada a marcação de superfície e intracelular das células das linhagens de células murinas NIH3T3 e humanas MFE296. A ligação a superfície celular e intracelular de IMM20059 foi observada nos pools de ambas as linhagens celulares. Um anticorpo anti-EPN1 comercialmente disponível, conhecido por ter uma reação cruzada com a EPN1 murina e humana, ligou-se de forma semelhante às células NIH3T3 e MFE296. Entretanto, o anticorpo comercial falhou em interagir com a EPN1 na superfície celular em ambos os pools de células.

[0025] Fig. 8 é uma representação em cartoon de dois anticorpos IgG monoespecíficos e um anticorpo biespecífico gerado a partir dos domínios variáveis isolados de cada um dos dois anticorpos IgG diferentes.

[0026] Fig. 9 é uma representação em cartoon que demonstra que os anticorpos anti-EPN1/anti-PDL1 biespecíficos se ligarão aos exossomos contendo ambos os marcadores.

[0027] Fig. 10 ilustra os resultados de dot blot que demonstram que a posição dos domínios variáveis de anti-PD-L1 dentro do anticorpo biespecífico influencia a capacidade de o anticorpo se ligar ao PD-L1, mas não à EPN1.

[0028] Fig. 11 ilustra a curva de ligação dependente de concentração observada para o anticorpo biespecífico Ate/PR045-2H11:L anti-EPN1/anti-PD- L1 às linhagens celulares de câncer de pulmão A549 intactas por citometria de fluxo com um instrumento Attune™ NxT (Life Technologies). A ligação de IMM20059 às células intactas foi detectada com anticorpos secundários anti- humano marcados com fluoróforo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0029] A invenção descrita neste documento é destinada a anticorpos biespecíficos que são capazes de se direcionar simultaneamente a exossomos por se ligarem especificamente a uma primeira e segunda proteínas associadas ao exossomo. Mais particularmente, a segunda proteína associada ao exossomo, de acordo com a invenção, é o ligante de morte celular programada 1 ("PD-L1"). Assim, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção possui uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo em uma proteína associada ao exossomo e uma segunda porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo em PD-L1. Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem interromper a supressão da atividade antitumoral pelas células imunes por serem direcionados aos exossomos derivados de células tumorais, que contêm ligantes, como PD- L1, que inibem a ativação das células T. Portanto, os anticorpos biespecíficos podem ser usados para tratar indivíduos afetados por vários tipos de câncer. Consequentemente, a invenção também inclui composições que são formuladas para a administração e entrega de anticorpos biespecíficos da invenção a indivíduos que precisam dos mesmos, como um componente de um protocolo de tratamento do câncer.

[0030] Em geral, os exossomos são vesículas conhecidas por conterem proteínas pertencentes a um ou mais dos seguintes grupos: Proteínas transmembrana da família Tetraspanina, tais como CD9, CD63 e CD81; gene de suscetibilidade tumoral 101 ("TSG101"); moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II; proteínas de interação com morte celular programada 6 ("PDCD6IPs") 18,22,37,38,41; proteínas de choque térmico (HSP60, HSP70, e HSP90); proteínas de citoesqueleto (actina e tubulina); anexinas (proteínas que regulam as mudanças do citoesqueleto nas membranas e fusão de membranas); e proteínas de transporte de membranas. Acredita-se, em geral, que os exossomos não contêm as proteínas do retículo endoplasmático, tais como, as proteínas do complexo de Golgi e calnexina ou proteínas nucleares. Sabe-se que os exossomos podem conter também as proteínas CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina-1, Glypican-1, HER2, HER3 ou NKCC2.

[0031] Uma estrutura básica de anticorpos inclui duas cadeias polipeptídicas pesadas (H) e duas leves (L), cada uma das quais contém uma região constante e uma região variável e são interconectadas por ligações dissulfeto. Em humanos, existem dois tipos de cadeias leves de imunoglobulina, que são denominadas lambda ("λ") e kappa ("κ"), e cinco classes principais de cadeias pesadas de imunoglobulina, também conhecidas como isotipos, que determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Juntas, uma região variável pesada ("VH") e uma região variável leve ("VL") formam um fragmento variável "Fv" que é responsável pela ligação específica do anticorpo ao seu antígeno. Uma cadeia pesada completa também possui três domínios constantes (CH1, CH2, CH3). As regiões constantes dos Abs podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema complemento clássico.

[0032] As regiões VH e VL contêm regiões "estruturais" interrompidas por três regiões hipervariáveis, chamadas regiões determinantes de complementaridade ("CDRs"). As CDRs são os principais responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As sequências das regiões estruturais de diferentes cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie e servem para posicionar e alinhar as CDRs no espaço tridimensional. As três CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir da extremidade N-terminal e são frequentemente identificadas pela cadeia em que a CDR particular está localizada. Consequentemente, as CDRs de cadeia pesada são designadas como H-CDR1, H CDR2 e H-CDR3; da mesma forma, as CDRs de cadeia leve são designadas como L-CDR1, L-CDR2 e L-CDR3. Um fragmento de ligação ao antígeno, um domínio constante e um domínio variável de cada uma das cadeias pesada e leve é referido como um fragmento Fab. Um fragmento F(ab)'2 contém dois fragmentos Fab, e pode ser gerado por clivagem de uma molécula de imunoglobulina abaixo da sua região de dobradiça.

[0033] Os anticorpos biespecíficos são capazes de se ligar simultaneamente a dois epítopos diferentes. Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode assumir a forma de qualquer imunoglobulina ou molécula derivada de imunoglobulina, ou complexo de moléculas, que se encontra na mesma molécula. Em várias concretizações, a primeira porção de ligação de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser selecionada dentre um anticorpo que se liga a um epítopo em uma proteína associada a um exossomo, tais como, mas não limitado a Epsina-1 ("EPN1"), CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina- 1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90 e NKCC2. Por exemplo, um anticorpo biespecífico pode incluir uma primeira porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo na EPN1 humana, tal como uma porção de ligação descrita no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US19/54259, que é incorporado por referência. Em várias concretizações, a primeira porção de ligação específica a EPN1 de um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, pode incluir uma cadeia pesada variável, conforme representada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6, uma cadeia leve variável, conforme representada no SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 8. Em outras concretizações, a primeira porção de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico, de acordo com a invenção, tem: (1) pelo menos uma de (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9, (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10, e (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; (2) pelo menos uma de (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

[0034] A segunda porção de ligação de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser derivada de qualquer anticorpo PD-L1-específico,

incluindo as cadeias VH e VL de um anticorpo PD-L1-específico, tal como, mas não limitado a atezolizumab, avelumab, durvalumab ou BMS-936559.

[0035] Tendo as descrições anteriores dos anticorpos biespecíficos em mente, uma concretização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode possuir uma primeira porção de ligação específica a EPN1 que tem uma CDR1 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 9, uma CDR2 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 10, e uma CDR3 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 11, uma CDR1 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 12, uma CDR2 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 13 e uma CDR3 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 14, e uma segunda porção de ligação específica a PD-L1 que tem CDRs de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo PD-L1-específico. Portanto, outra concretização de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode possuir uma primeira porção de ligação específica a EPN1 que tem uma CDR1 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 9, uma CDR2 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 10 e uma CDR3 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 11, uma CDR1 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 12, uma CDR2 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 13 e uma CDR3 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 14 e uma segunda porção de ligação específica a PD-L1 que tem uma CDR1 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 17, uma CDR2 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 18 e uma CDR3 de cadeia pesada baseada na SEQ ID NO: 19; uma CDR1 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 20, uma CDR2 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 21 e uma CDR3 de cadeia leve baseada na SEQ ID NO: 22.

[0036] Um anticorpo biespecífico anti-CD-63/anti-PD-L1 é outra concretização de um anticorpo biespecífico capaz de se direcionar seletivamente ao pool exossomal positivo para PD-L1. As concretizações dos anticorpos biespecíficos anti-CD-63/anti-PD-L1 incluem, mas não estão limitadas aos anticorpos com domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um anticorpo anti-CD-63 (SEQ ID NOS: 44 e 45) em combinação com os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um dos anticorpos anti-PD-L1: atezolizumab (SEQ ID NOS: 15 e 16); avelumab (SEQ ID NOS: 23 e 24); durvalumab (SEQ ID NOS: 25 e 26); ou BMS-936559 (SEQ ID NOS: 27 e 28). Uma concretização preferencial é um anticorpo biespecífico anti-CD-63/anti-PD-L1 compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo anti-CD-63 (SEQ ID NOS: 44 e 45) e atezolizumab, desenhado em um formato DVD-Ig. Quatro configurações diferentes dos domínios variáveis de anti-CD-63 e atezolizumab são possíveis ao se utilizar os ligantes e as orientações definidas para os anticorpos biespecíficos anti-EPN- 1/anti-PD-L1.

[0037] Um anticorpo biespecífico anti-HER2/anti-PD-L1 é uma outra concretização de um anticorpo biespecífico capaz de se direcionar seletivamente ao pool exossomal positivo para PD-L1. As concretizações dos anticorpos biespecíficos anti-CD-HER2/anti-PD-L1 incluem, mas não estão limitadas a ter domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, do anticorpo anti-HER2 trastuzumab (SEQ ID NOS: 46 e 47) em combinação com os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um dos anticorpos anti-PD-L1: atezolizumab (SEQ ID NOS: 15 e 16); avelumab (SEQ ID NOS: 23 e 24); durvalumab (SEQ ID NOS: 25 e 26); ou BMS-936559 (SEQ ID NOS: 27 e 28). Uma concretização preferencial é um anticorpo biespecífico anti-HER2/anti-PD-L1 compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo anti-HER2 (SEQ ID NOS: 46 e 47) e atezolizumab, desenhado em um formato DVD-Ig. Quatro configurações diferentes dos domínios variáveis de anti- HER2 e atezolizumab são possíveis ao se utilizar os ligantes e as orientações definidas para os anticorpos biespecíficos anti-EPN-1/anti-PD-L1.

[0038] Um anticorpo biespecífico anti-EpCAM/anti-PD-L1 é mais uma concretização de um anticorpo biespecífico capaz de se direcionar seletivamente ao pool exossomal positivo para PD-L1. As concretizações de um anti- EpCAM/anti-PD-L1 biespecífico incluem os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, do anticorpo anti-EpCAM oportuzumab (SEQ ID NOS: 48 e 49) em combinação com os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um dos anticorpos anti-PD-L1: atezolizumab (SEQ ID NOS: 15 e 16); avelumab (SEQ ID NOS: 23 e 24); durvalumab (SEQ ID NOS: 25 e 26); ou BMS-936559 (SEQ ID NOS: 27 e 28). Uma concretização preferencial é um anticorpo biespecífico anti-EpCAM/anti- PD-L1 compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo anti-EpCAM (SEQ ID NOS: 48 e 49) e atezolizumab, desenhado em um formato DVD-Ig. Quatro configurações diferentes dos domínios variáveis de anti-EpCAM e atezolizumab são possíveis ao se utilizar os ligantes e as orientações definidas para os anticorpos biespecíficos anti-EPN-1/anti-PD-L1.

[0039] Um anticorpo biespecífico anti-HER3/anti-PD-L1 é mais uma concretização de um anticorpo biespecífico capaz de se direcionar seletivamente ao pool exossomal positivo para PD-L1. As concretizações de um anti- HER3/anti-PD-L1 biespecífico incluem os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, do anticorpo anti-HER3 (SEQ ID NOS: 50 e 51) em combinação com os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um dos anticorpos anti-PD-L1: atezolizumab (SEQ ID NOS: 15 e 16); avelumab (SEQ ID NOS: 23 e 24); durvalumab (SEQ ID NOS: 25 e 26); ou BMS-936559 (SEQ ID NOS: 27 e 28). Uma concretização preferencial é um anticorpo biespecífico anti-HER3/anti-PD-L1 compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo anti-HER3 (SEQ ID NOS: 50 e 51) e atezolizumab, desenhado em um formato DVD-Ig. Quatro configurações diferentes dos domínios variáveis de anti-HER3 e atezolizumab são possíveis ao se utilizar os ligantes e as orientações definidas para os anticorpos biespecíficos anti-EPN-1/anti-PD-L1.

[0040] Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção são anticorpos monoclonais totalmente humanos ou humanizados. Em outras palavras, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode incluir regiões estruturais e CDRs derivadas de uma ou mais imunoglobulinas humanas. Na verdade, as regiões estruturais podem se originar de um anticorpo humano e ser produzidas de modo a incluir as CDRs de um anticorpo humano diferente. Por exemplo, um anticorpo de acordo com a invenção pode possuir: i) uma ou mais CDRs derivadas de um anticorpo humano que é específico para uma proteína exossomal alvo; ii) uma ou mais CDRs derivadas de um anticorpo humano que é específico para PD-L1; e regiões estruturais derivadas de outro anticorpo humano.

[0041] Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser uma variante de fragmento de anticorpo. Por exemplo, variantes de fragmento de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção incluem fragmentos F(ab)'2 bivalentes, proteínas Fv de cadeia única bivalentes ("bi-scFv'), e proteínas Fv estabilizadas por dissulfeto bivalentes (''bi-sFv"). Um fragmento F(ab)'2 é um dímero de dois fragmentos Fab', que pode ser obtido tratando o anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente, de modo que os monômeros Fab' permaneçam mantidos juntos por duas ligações dissulfeto. Um anticorpo de cadeia única ("sc"), como um fragmento bi-scFv, é uma molécula geneticamente modificada contendo as regiões VL e VH das cadeias pesada e leve de um primeiro anticorpo, e as regiões VL e VH das cadeias pesada e leve de um segundo anticorpo, todas essas sendo ligadas por um ou mais ligantes polipeptídicos adequados, para produzir uma molécula de cadeia única fundida geneticamente. Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser também um dímero de dois anticorpos scFV diferentes. Ainda outros exemplos de anticorpos biespecíficos incluem scFv em tandem (taFv ou scFv2), diacorpo, dAb2NHH2, derivados "knob-into-hole", SEED-IgG, heteroFc-scFv, Fab-scFv, scFvJun/Fos, Fab'-Jun/Fos, tricorpo, DNL-F(ab)3, scFv3-CHl/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-Fc, scDb-CH3, DbFe, scFv2-H/L, DVD-lg, diacorpo em tandem ("TandAb"), scFv-dhlx-scFv, dAb2-IgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb.

[0042] Um técnico no assunto perceberá que variantes conservadas dos anticorpos biespecíficos podem ser produzidas. Tais variantes conservadas irão reter os resíduos de aminoácidos críticos necessários para o dobramento e estabilização corretos entre as regiões VH e VL, e irão reter as características de carga dos resíduos a fim de preservar o baixo pI e a baixa toxicidade das moléculas. As substituições de aminoácidos (como no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro ou no máximo cinco substituições de aminoácidos) podem ser feitas nas regiões VH e VL para aumentar o rendimento. As tabelas de substituição conservativa de aminoácidos que geram aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas por um técnico no assunto. Os seis agrupamentos de aminoácidos abaixo são exemplos de aminoácidos que são considerados como substituições conservativas entre si: i i) Alanina (A), Serina (S) e Treonina (T); ii) Ácido aspártico (D) e Ácido glutâmico (E); iii) Asparagina (N) e Glutamina (Q); iv) Arginina (R) e Lisina (K); v) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) e Valina (V); e vi) Fenilalanina (F), Tirosina (Y) e Triptofano (W).

[0043] Um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode incluir também um domínio CH3 de imunoglobulina etiquetado/marcado (tagged) para facilitar a detecção do biológico contra um background de anticorpos endógenos. Mais particularmente, um domínio CH3 etiquetado é um epítopo de anticorpo heterogêneo que foi incorporado em um ou mais dos loops estruturais AB, EF ou CD de um domínio CH3 derivado de IgG humana. As etiquetas de CH3 são preferencialmente incorporadas no contexto estrutural de um anticorpo da subclasse IgG1, outras subclasses de IgG humana, incluindo IgG2, IgG3 e IgG4, também estão disponíveis de acordo com a invenção. Domínios CH3 etiquetados com epítopo, também referidos como "CH3 scaffolds", podem ser incorporados em qualquer anticorpo da invenção tendo uma região constante de cadeia pesada geralmente na forma de uma porção Fc de imunoglobulina. Os exemplos de etiquetas CH3 scaffolds, e métodos para incorporá-las em anticorpos, encontram-se divulgados no Pedido de Patente PCT No. PCT/US19/32780. Os anticorpos usados para detectar CH3 scaffolds etiquetados com epítopo são geralmente referidos aqui como "anticorpos detectores".

[0044] A eficácia terapêutica e diagnóstica de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção se correlaciona com sua afinidade de ligação a seus antígenos alvo. A afinidade de ligação pode ser calculada através de uma modificação do método Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. De forma alternativa, a afinidade de ligação pode ser medida pela taxa de dissociação de um anticorpo do seu antígeno. Vários outros métodos podem ser usados para medir a afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, a ressonância plasmônica de superfície (SPR), radioimunoensaio de competição, ELISA, e citometria de fluxo.

[0045] Um anticorpo que "se liga especificamente a" um antígeno é um anticorpo que se liga ao antígeno com alta afinidade e não se liga significativamente a outros antígenos não relacionados. A ligação de alta afinidade de um anticorpo ao seu antígeno é mediada pela interação por ligação de uma ou mais das CDRs do anticorpo a um epítopo, também conhecido como determinante antigênico, do antígeno alvo. Os epítopos são grupos químicos ou sequências peptídicas específicas em uma molécula que são antigênicos, o que significa que eles são capazes de induzir uma resposta imune específica. Um epítopo que é especificamente ligado por um anticorpo de acordo com a invenção pode estar, por exemplo, contido em uma proteína expressa por células de um ou mais tipos de câncer. Em geral, um anticorpo exibe uma "ligação de alta afinidade" se o seu valor da constante de dissociação ("K D") for de 50 nM, ou menos. Por conseguinte, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção apresenta ligação de alta afinidade a seus alvos de ligação, PD-L1 ou proteína exossomal, se a KD entre o anticorpo e pelo menos um dos alvos de ligação for de 50 nM ou menos, 40 nM ou menos, 30 nM ou menos, 20 nM ou menos, 10 nM ou menos, 9 nM ou menos, 8 nM ou menos, 7 nM ou menos, 6 nM ou menos, 5 nM ou menos, 4 nM ou menos, 3 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos.

[0046] A ligação de alta afinidade de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser descrita em relação à sua ligação a uma célula que expressa PD-L1. Mais particularmente, um anticorpo de acordo com a invenção apresenta ligação de alta afinidade às células que expressam PD-L1 se apresentar um valor da concentração média efetiva máxima (EC 50) de 10 nM ou menos, 9 nM ou menos, 8 nM ou menos, 7 nM ou menos, 6 nM ou menos, 5 nM ou menos, 4 nM ou menos, 3 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos. Da mesma forma, além de se ligar a PD-L1 com alta afinidade, o mesmo anticorpo também pode se ligar a uma proteína associada ao exossomo diferente com alta afinidade, como se ligar a TSG101, CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina-1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90 ou NKCC2. Em várias variantes, por exemplo, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção apresenta uma EC50 para: (i) exossomos ou células que expressam EPN1 de 10 nM ou menos, 9 nM ou menos, 8 nM ou menos, 7 nM ou menos, 6 nM ou menos, 5 nM ou menos, 4 nM ou menos, 3 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos; e para (ii) epissomos ou células que expressam PD-L1 de 10 nM ou menos, 9 nM ou menos, 8 nM ou menos, 7 nM ou menos, 6 nM ou menos, 5 nM ou menos, 4 nM ou menos, 3 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos.

[0047] Tal como referido acima, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser utilizados em métodos para prevenir, tratar ou melhorar uma doença em um indivíduo. Mais particularmente, anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser utilizados para prevenir, tratar ou melhorar o câncer. "Prevenir" uma doença refere-se a inibir o desenvolvimento completo de uma doença. "Tratar" refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após ter começado a se desenvolver, tal como uma redução na carga tumoral ou uma diminuição no número e tamanho das metástases. "Melhorar" refere-se à redução no número ou gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença, como o câncer. A quantidade de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, que proporciona alívio subjetivo de um(ns) sintoma(s) ou uma melhora objetivamente identificável observada por um médico ou outro profissional de saúde qualificado.

Um método para prevenir, tratar ou melhorar o câncer pode exigir administrar uma composição, compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, a um indivíduo para inibir o crescimento tumoral ou metástase pela interrupção da supressão da atividade antitumoral pelas células imunes por ser direcionado aos exossomos derivados de células tumorais que contêm: i) PD-L1, que é um supressor de ativação das células T antitumorais induzidas; e ii) uma outra proteína exossomal, que pode ou não suprimir também a ativação de células T. Portanto, o anticorpo biespecífico administrado entra em contato com os exossomos derivados de células tumorais, (ou seja, são colocados em associação física direta com os exossomos), onde o anticorpo biespecífico pode se ligar a pelo menos um de seus alvos exossomais para evitar que o PD-L1 funcione como um supressor da ativação de células T. Em várias concretizações, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção impede a sinalização celular mediada por PD-L1, que transmitiria de alguma forma um sinal inibitório que reduz a proliferação de células T antígeno-específicas nos linfonodos, ao mesmo tempo em que reduz simultaneamente a apoptose das células T reguladoras (células T anti- inflamatórias e supressoras).

[0048] Os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção, que são administrados a indivíduos que precisam dos mesmos, são formulados em composições. Mais particularmente, os anticorpos biespecíficos podem ser formulados para administração sistêmica ou administração local, tal como administração intratumoral. Por exemplo, um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser formulado para administração parenteral, tal como administração intravenosa. As composições podem ser preparadas em formas de dosagem única para administração a um indivíduo. A quantidade e o momento da administração para atingir o resultado desejado ficam a critério do médico assistente. A administração de anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção também pode ser acompanhada pela administração de outros agentes antineoplásicos ou tratamentos terapêuticos, tais como a ressecção cirúrgica de um tumor. Qualquer agente antineoplásico adequado pode ser administrado em combinação com os anticorpos biespecíficos aqui divulgados. Exemplos de agentes antineoplásicos incluem, mas não estão limitados aos agentes quimioterápicos, tais como, por exemplo, inibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos intercalantes, inibidores do fator de crescimento, inibidores de ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, agentes antissobrevivência, modificadores de resposta biológica, anti-hormônios (por exemplo, antiandrógenos) e agentes antiangiogênicos. Outros tratamentos antineoplásicos incluem a radioterapia e outros anticorpos direcionados especificamente a células cancerosas.

[0049] As composições para administração podem incluir uma solução de um anticorpo biespecífico dissolvido em um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como um veículo aquoso. Em geral, a natureza do carreador dependerá do modo particular de administração a ser empregado. Por exemplo, as formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, como água, soro fisiológico, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa ou glicerol como veículo. Para composições sólidas, tais como formas de pó, pílula, comprimido ou cápsula, os carreadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além dos carreadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conservantes e agentes de tamponamento de pH e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitan. As soluções carreadoras acima citadas são estéreis e geralmente isentas de matéria indesejável e podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis necessárias para se aproximarem às condições fisiológicas, tais como agentes de tamponamento e ajuste de pH, e agentes de ajuste de toxicidade, tais como acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e lactato de sódio. A concentração de anticorpo nessas formulações pode variar amplamente e será selecionada principalmente com base nos volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e semelhantes de acordo com o modo particular de administração selecionado e as necessidades do indivíduo.

[0050] As opções para a administração de composições de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitadas à administração por infusão lenta ou administração por infusão rápida ou bólus intravenoso. Antes de ser administrada, uma composição de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção pode ser fornecida na forma liofilizada e reidratada em uma solução estéril até uma concentração desejada antes da administração. A solução de anticorpo biespecífico pode então ser adicionada a uma bolsa de infusão contendo cloreto de sódio a 0,9%, USP e, em alguns casos, administrada em uma dosagem de 0,5 a 20 mg/kg de peso corporal. Em um exemplo de administração de uma composição de anticorpo de acordo com a invenção, uma dose de carga mais elevada é administrada, com as doses de manutenção subsequentes sendo administradas em um nível mais baixo. Por exemplo, uma dose de carga inicial de 4 mg/kg pode ser infundida por um período de cerca de 90 minutos, seguida por doses de manutenção semanais por 4-8 semanas de 2 mg/kg infundidas por um período de 30 minutos se a dose anterior foi bem tolerada.

[0051] As composições de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção podem ser ainda formulações de liberação controlada. As formulações parenterais de liberação controlada, por exemplo, podem ser feitas como implantes ou injeções oleosas. Os sistemas de partículas, incluindo microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas e nanopartículas, também podem ser usados para fornecer as composições de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção. As microcápsulas, como aqui referidas, contêm um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção como um componente do núcleo central. Em microesferas, um anticorpo de acordo com a invenção é disperso por toda a partícula. Partículas, microesferas e microcápsulas menores do que cerca de 1 µm são geralmente referidas como nanopartículas, nanoesferas e nanocápsulas, respectivamente.

[0052] Uma composição de anticorpo biespecífico de acordo com a invenção também pode ser embalada em um kit para o tratamento de um câncer em um indivíduo. Esse kit inclui qualquer composição aqui divulgada. Os kits também podem incluir recipientes de armazenamento adequados, tais como ampolas, frascos e tubos, para cada composição farmacêutica e outros reagentes incluídos, tais como tampões e soluções salinas balanceadas, para uso na administração das composições aos indivíduos. As composições e outros reagentes podem estar presentes nos kits em qualquer forma conveniente, tal como, em forma de pó ou solução. Os kits podem incluir ainda instruções para o uso das composições. Os kits podem incluir ainda um recipiente de embalagem, que pode ter uma ou mais divisórias para acondicionar a composição farmacêutica e outros reagentes.

[0053] Os métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser produzidos de forma recombinante utilizando-se a coexpressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Milstein, et al. (1983) Nature 305: 537-39. De forma alternativa, os anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando-se ligação química. Vide, por exemplo, Brennan, et al. (1985) Science 229: 81. Os anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de anticorpo biespecífico. Vide, por exemplo, Bolliger, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-48, Gruber, et al. (1994) J. Immunol. 152: 5368. Consequentemente, os anticorpos biespecíficos de acordo com a invenção podem ser produzidos pela expressão de sequências de ácido nucleico que codificam suas sequências de aminoácidos em células vivas em cultura. Um anticorpo biespecífico "isolado" de acordo com a invenção é aquele que foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos no ambiente, como uma célula, proteínas e organelas. Por exemplo, um anticorpo biespecífico pode ser isolado se for purificado a: i) mais de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em peso de proteína conforme determinado pelo método de Lowry e, de forma alternativa, mais de 99% em peso; ii) um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador spinning cup; iii) homogeneidade por SDS-PAGE, em condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou coloração com prata. O anticorpo isolado pode ser também um anticorpo de acordo com a invenção que está in situ dentro de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0054] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão-hospedeiro pode ser utilizada para expressar um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção por meio da transformação ou transfecção das células com uma sequência nucleotídica codificante adequada de um anticorpo de acordo com a invenção. Exemplos de células hospedeiras de expressão incluem, mas não estão limitados a: Bactérias, tais como E. coli e B. Subtilis, que podem ser transfectadas com as sequências codificantes do anticorpo biespecífico contidas nos vetores de expressão de DNA bacteriófagos, DNA plasmidiais ou DNA cosmidiais recombinantes; Leveduras, tais como Saccharomyces e Pichia, transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo as sequências codificantes de anticorpo; Sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão virais recombinantes, como baculovírus, contendo sequências codificantes de anticorpo; Sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão virais recombinantes, tais como vírus do mosaico da couve-flor ("CaMV") ou vírus do mosaico do tabaco ("TMV"), contendo as sequências codificantes de anticorpo; e Sistemas de células de mamífero, tais como, mas não se limitando a COS, células de ovário de hamster chinês ("CHO"), células ExpiCHO, células de rim de hamster bebê ("BHK"),

células HEK293, Expi293, 3T3, NSO, que carregam as construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero, como o promotor de metalotioneína ou promotor do fator de alongamento I alfa, ou de vírus de mamíferos, como o promotor tardio de adenovírus e o promotor 7.5K do vírus vaccinia. Por exemplo, as células de mamíferos, como de Rim Embrionário Humano 293 (HEK293) ou um derivado deste, como Expi293, em conjunto com um vetor promotor duplo que incorpora promotores do fator de alongamento 1 alfa de camundongo e rato para expressar os fragmentos da cadeia pesada e leve, respectivamente, é um sistema de expressão eficaz para os anticorpos de acordo com a invenção, que podem ser selecionados de forma vantajosa, dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo a ser expressa.

[0055] Quando uma grande quantidade de um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção precisa ser produzida para a geração de uma composição farmacêutica do anticorpo, vetores que dirigem a expressão de altos níveis de produtos proteicos de fusão rapidamente purificados podem ser desejáveis. Esses vetores incluem, mas não estão limitados a: um vetor pUR278 (Ruther et al. EMBO J. 2: 1791 (1983)), em que a sequência codificante do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em fase com uma região codificante de lac Z para que uma proteína de fusão seja produzida; um vetor plN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109 (1985) e Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509 (1989)); vetores pGEX para fundir os anticorpos da invenção com glutationa S-transferase ("GST"). Uma proteína de fusão GST de um anticorpo de acordo com a invenção e uma etiqueta polipeptídica são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas, por adsorção e ligação a esferas de glutationa-agarose de matriz, seguida por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX, em contrapartida, são desenhados para incluir sítios de clivagem da protease do fator Xa ou trombina de modo que o produto do gene alvo clonado – um anticorpo de acordo com a invenção – possa ser liberado da porção GST.

[0056] Um sistema de expressão em célula hospedeira que modula a expressão da(s) sequência(s) inserida(s) que codifica(m) um anticorpo de acordo com a invenção, ou modifica e processa o produto gênico, se o desejar, pode ser escolhido também. Por exemplo, modificações, incluindo a glicosilação e processamento, como a clivagem de produtos proteicos, podem ser importantes para a função da proteína. Na verdade, diferentes células hospedeiras têm mecanismos característicos e específicos para o processamento e modificação pós-traducionais das proteínas e produtos gênicos. Para este fim, células hospedeiras eucarióticas que possuam uma maquinaria celular apropriada para o processamento adequado de um transcrito primário, bem como a glicosilação e fosforilação de um produto gênico de acordo com a invenção, podem ser utilizadas.

Exemplos

[0057] Os seguintes exemplos descrevem o desenvolvimento e caracterização dos anticorpos biespecíficos direcionados a exossomos.

[0058] Exemplo 1. Os exossomos contêm proteínas ligadas à membrana que podem ser alvos dos anticorpos. As células, derivadas de ambos os tecidos normais e tumorais, podem gerar pelo menos duas classes de vesículas extracelulares (EV), exossomos e ectosomos, que são derivadas de diferentes processos biológicos. As EVs são reconhecidas por desempenhar um papel na comunicação celular. As EVs são caracterizadas por uma série de diferentes constituintes proteicos, incluindo proteínas que são inseridas na bicamada lipídica das vesículas. As proteínas conhecidas por estarem presentes em membranas exossomais podem ser divididas em classes funcionais que incluem, mas não estão limitadas a tetraspaninas, proteínas de choque térmico, transportadores de membrana, receptores de superfície celular e moléculas ligadas a lipídeos. As proteínas reconhecidas que compreendem essas classes funcionais incluem, mas não estão limitadas a TSG101, CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina-

1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90, NKCC2 e PD-L1. As proteínas presentes na superfície dos exossomos, como o CD63, podem ser detectadas por anticorpos específicos para essas moléculas de superfície. A Fig. 2 demonstra que os exossomos derivados de células de câncer de próstata 22Rv1 podem ser isolados, de uma maneira dose-dependente, por meio da interação com esferas revestidas por anti-CD63. A composição das proteínas transmembrana associadas aos exossomos pode ser dependente do tipo de célula a partir do qual os exossomos se originam. As preparações em massa de exossomos podem ser conjugadas com esferas de látex e detectadas com anticorpos anti-CD63 por citometria de fluxo (Fig. 3). As esferas revestidas por exossomo em massa também foram reativas com o anticorpo anti-EPN1 IMM20059. A marcação de IMM20059 dependia da presença de exossomos na superfície da esfera; esferas revestidas por BSA falharam em interagir com IMM20059. Os dados sugerem que a EPN1 está presente na superfície de, pelo menos, uma porção dos exossomos.

[0059] Exemplo 2. IMM20059 é um anticorpo que se liga a EPN1. O hibridoma humano PR045-2H11 foi criado a partir da fusão de células B humanas isoladas do linfonodo de um paciente com câncer de cabeça e pescoço, com uma linhagem celular parceira de fusão B5-6T. A fusão de células B humanas com células B5-6T foi realizada por eletrofusão essencialmente como descrito no documento USPTO#EP2242836 ("Method of making hybrid cells that express useful antibodies"). As sequências nucleotídicas, que codificam os domínios de cadeia pesada variável (VH) e cadeia leve variável (VL) de PR045-2H11, foram obtidas pela amplificação por RT-PCR do RNA isolado das células da linhagem de hibridoma que produziu PR045-2H11, e submetendo o cDNA do anticorpo resultante às reações de sequenciamento. A SEQ ID NO: 1 corresponde a VH e a SEQ ID NO: 3 corresponde a VL de PR045-2H11 isolado do hibridoma. Devido à estratégia de RT-PCR, essas sequências carecem das regiões correspondentes à porção mais 5' da estrutura 1 dos domínios variáveis. As determinações dos genes IGHV e IGKL foram previstas com base na homologia das sequências gênicas de linhagem germinativa conhecidas, e usadas como substitutos para as extremidades 5' genuínas das sequências VH e VL. O IMM20059 é um anticorpo IgG1 humano expresso de forma recombinante compreendendo os domínios VH e VL de PR045-2H11. Um fragmento de expressão para VH de IMM20059 (SEQ ID NO: 5) foi gerado utilizando-se a sequência da linhagem germinativa correspondente à extremidade 5' da estrutura 1 de IGHV3-48*02. Um fragmento de expressão completo para VL de PR045-2H11 (SEQ ID NO: 7) foi gerado utilizando-se a sequência da linhagem germinativa correspondente à extremidade 5' da estrutura 1 de IGKV3-11*01. Os fragmentos correspondentes a SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 7 foram sintetizados com extensões 5' e 3' adicionais para facilitar a clonagem do estilo Gibson em um vetor de expressão de IgG1 de promotor duplo. As sequências de proteína correspondentes codificadas pelos fragmentos VH e VL são definidas nas SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, respectivamente. A região codificante dos domínios VH e VL têm as características de hipermutação somática, diferindo das sequências da linhagem germinativa por 15 e 14 nucleotídeos, respectivamente.

[0060] O IMM20059 foi expresso de forma recombinante por transfecção transitória em células Expi293 utilizando as condições recomendadas pelo fabricante. O anticorpo recombinante foi purificado do meio condicionado pela cromatografia por afinidade à Proteína A/G, tampão trocado para PBS e analisado quanto à atividade por citometria de fluxo. IMM20059 exibiu atividade de ligação consistente com o anticorpo original produzido por hibridoma PR045- 2H11. Conforme representado nas Figs. 4 e 5, IMM20059 exibe ligação saturável à superfície de linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão A549 e carcinoma hepatocelular Huh7, quando analisadas por citometria de fluxo. IMM20059 liga-se a A549 e Huh7 com uma EC50 de 0,9 e 1,3 µg/mL, respectivamente. Esses valores correspondem aos valores de EC50 entre 6-9 nM.

[0061] IMM20059 se liga seletivamente, de uma maneira dose-dependente, a EPN1 recombinante em comparação com seu homólogo EPN2 (Fig. 6). IMM20059 também exibiu seletividade para EPN1 em comparação com EPN3 em um ensaio de proteína de fase reversa (RPPA). A força da interação com EPN1 recombinante foi definida ainda pela ressonância plasmônica de superfície (Tabela 1). IMM20059, ou um controle de isotipo, foi capturado em uma superfície de sensor Fc anti-humano para gerar superfícies de ligação e controle. A EPN1 recombinante foi aplicada sobre as superfícies em concentrações crescentes, em triplicata. Os dados duplamente subtraídos foram ajustados a um modelo de ligação 1: 1. Conforme descrito na Tabela 1, IMM20059 demonstrou uma ligação reproduzível a EPN1 com uma KD média de 950 +/- 10 pM.

Tabela 1. Parâmetros de ligação determinados para IMM20059 / EPN1 a 25°C Teste ka (M-1 s-1) kd (s-1) KD (pM) 1º 7,3(2)e5 7,05(7)e-1 960(20) 2º 7,87(7)e5 7,36(7)e-4 940(10) 3º 7,6(1)e5 7,21(8)e-4 950(10) Média 7,6[3]e5 7,2[2]e-4 950[10] Os números entre parênteses são os erros nos últimos dígitos para os ajustes determinados nos testes individuais. Os números entre colchetes são os erros experimentais determinados nos três testes.

[0062] IMM20059 se liga à superfície de células murinas positivas para EPN-

1. Como representado na Fig. 7, IMM20059 liga-se a ambos os pools de superfície celular e intracelulares de antígenos presentes nas células murinas NIH-3T3. Este padrão de ligação também é observado em relação à linhagem celular humana MFE296. Anticorpos anti-EPN1 murinos comercialmente disponíveis não reconhecem o pool de superfície celular de EPN1.

[0063] Exemplo 3. Desenvolvimento de um anticorpo biespecífico anti- EPN-1/anti-PD-L1. Anticorpos biespecíficos – anticorpos capazes de se ligar a dois antígenos alvo únicos – podem ser criados pela combinação dos domínios variáveis de dois anticorpos monoespecíficos em uma molécula semelhante a um anticorpo. Múltiplas estruturas de anticorpo biespecífico foram descritas na literatura (Brinkman, U. e Kontermann, R. mAbs, 9: 182-212; 2017). Uma concretização de uma estrutura de anticorpo biespecífico é o domínio variável duplo - Ig (DVD-Ig). A Fig. 8 é uma representação em cartoon de dois anticorpos monoespecíficos e um anticorpo biespecífico no formato DVD-Ig gerado a partir dos dois anticorpos monoespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são capazes de melhorar a seletividade de direcionamento às células e, por extensão aos exossomos, que expressam ambos os antígenos alvo em comparação com aqueles que expressam apenas um dos alvos (Robinson et al. BR J Cancer 99: 1415-1425; 2008). A Fig. 9 é uma representação em cartoon do direcionamento exossomal por um anticorpo biespecífico, capaz de se ligar a EPN1 e PD-L1, em comparação com anticorpos monoespecíficos capazes de se direcionar a EPN- 1 ou PD-L1, apenas.

[0064] Uma série de anticorpos anti-PD-L1 é descrita na literatura. Eles incluem, mas não estão limitados a atezolizumab, avelumab, durvalumab e BMS-

936559. Um anticorpo biespecífico capaz de direcionamento concomitante a PD- L1 exossomal e a um segundo marcador exossomal, pode ser desenvolvido para direcionar seletivamente a PD-L1 exossomal em comparação com PD-L1 localizado em células tumorais. Os marcadores exossomais que podem ser alvo de um biespecífico PD-L1 incluem, mas não estão limitados a CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina- 1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90, NKCC2 e EPN-1. Um anticorpo biespecífico anti-EPN-1/anti-PD-L1 representa uma concretização possível. Uma concretização preferencial é um anti-EPN-1/anti-PD-L1 biespecífico compreendendo os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de IMM20059 em combinação com os domínios variáveis, ou as CDRs presentes dentro dos domínios variáveis, de um dos anticorpos anti- PD-L1: atezolizumab (SEQ ID NOS: 15 e 16), avelumab (SEQ ID NOS: 23 e 24), durvalumab (SEQ ID NOS: 25 e 26) ou BMS-936559 (SEQ ID NOS: 27 e 28). Uma concretização preferencial é um anticorpo biespecífico anti-EPN-1/anti-PD-

L1 compreendendo os domínios VH e VL de IMM20059 e atezolizumab, desenvolvido em um formato DVD-Ig. Quatro diferentes configurações dos domínios variáveis de IMM20059 e atezolizumab foram desenvolvidas. Os domínios VH foram ligados através do ligante peptídico ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 29) em ambas as orientações IMM20059-L-atezolizumab (SEQ ID NO: 33) e atezolizumab-L-IMM20059 (SEQ ID NO: 39). Os domínios VL de IMM20059 e atezolizumab foram fundidos em um único polipeptídeo com dois ligantes diferentes e em ambas as ordens da extremidade N- à C-terminal. O ligante "L" compreende a sequência de aminoácidos TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 30) e o ligante "S" compreende a sequência de aminoácidos TVAAP (SEQ ID NO: 31). SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 41 representam o ligante "L" contendo as construções nas ordens IMM20059-L-atezolizumab e atezolizumab-L- IMM20059, respectivamente. SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 43 correspondem às construções biespecíficas ligadas pela sequência do ligante "S".

[0065] Exemplo 4. Atividade de ligação de anticorpos biespecíficos anti- EPN1/anti-PD-L1 DVD-IgG. Quatro anticorpos biespecíficos anti-EPN1/anti-PD- L1 foram purificados, pela cromatografia por afinidade à Proteína A, do meio condicionado de um derivado da linhagem celular de mamíferos HEK293 que foi transfectada transitoriamente com os plasmídeos que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo biespecífico. As sequências de aminoácidos dos domínios pesado variável e leve variável compreendendo os quatro anticorpos biespecíficos foram as SEQ ID NOS: 33 e 35, SEQ ID NOS: 33 e 37, SEQ ID NOS: 39 e 41 e SEQ D NOS: 39 e 43. Os anticorpos purificados foram submetidos a análise por dot blot para determinar se os mesmos eram capazes de se ligar a EPN1 recombinante e PD-L1 recombinante. As proteínas recombinantes purificadas foram colocadas em três níveis de dose, conforme representado na Fig. 10, e detectadas por sonda com os quatro anticorpos biespecíficos anti-EPN1/anti-PD-L1. IMM20059/PR045-2H11 monoespecífico e atezolizumab serviram como controles positivos para a ligação a EPN1 e PD-L1, respectivamente. Um anticorpo específico para uma proteína de capsídeo do vírus da dengue serviu como controle negativo. Todos os quatro anticorpos biespecíficos ligaram-se a EPN1 em níveis semelhantes aos do IMM20059. A ligação a PD-L1 exigiu que os domínios variáveis de anti-PD-L1 estivessem presentes na extremidade N-terminal do DVD-IgG (Ate/PR045-2H11:S e Ate/PR045-2H11:L). Posicioná-los na extremidade C-terminal ao domínio variável de anti-EPN1 (PR045-2H11/Ate:S e PR045-2H11/Ate:L), diminuiu a capacidade de se ligar a PD-L1 no formato dot blot. O comprimento do ligante dentro da construção leve variável não afetou a ligação. Os anticorpos contendo domínios leves variáveis correspondentes a SEQ ID NOS: 37 e 39 ligam-se de forma equivalente a PD-L1 recombinante no formato dot blot.

[0066] Quando analisado por citometria de fluxo, o anticorpo biespecífico compreendendo os domínios variáveis definidos pela SEQ ID NOS: 33 e 39 ligou-se à superfície das células A549, que são conhecidas por expressarem EPN1 e PD-L1 na superfície celular. A ligação do anticorpo biespecífico à superfície celular exibiu um perfil de ligação dose-dependente com uma EC50 de aproximadamente 0,3 micrograma/mL (Fig. 11).

Listagem de Sequências

[0067] SEQ ID NO: 1 – sequência nucleotídica de VH de PR045-2H11

GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTATCCATAGCCTGAATT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCGTATATTAGT AGTAACAGTACTACCATATATTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACC ATCTCCAGAGACAATGCCAAGGACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTC AGAGACGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGACTACTACTGTAC TGGTGGTACCTGCTTCTTTCTTCCTGACCTCTGGGGCCGGGGAGCCCTGG TCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCG C

[0068] SEQ ID NO: 2 – sequência de aminoácidos de VH de PR045-2H11

LSCAASGFTFSIHSLNWVRQAPGKGLEWVSYISSNSTTIYYADSVKGRFTISRD NAKDSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDYYCTGGTCFFLPDLWGRGALVTVSSA STKKGPSVFPLA

[0069] SEQ ID NO: 3 – sequência nucleotídica de VL de PR045-2H11

AAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATATCAGCAACTTCTTAG CCTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGAT GCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTGGGACAGACTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTT GCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTTACAACTGGCTCACTTTCGGCGGAGG GACCAAGGTAGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT

[0070] SEQ ID NO: 4 – sequência de aminoácidos de VL de PR045-2H11

RATLSCRASQNISNFLAWYQHKPGQAPRLLIYDASIRATGIPARFSGSGSGTD FSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI

[0071] SEQ ID NO: 5 – sequência nucleotídica do domínio VH de IMM20059

ACAGGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGG TACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACC TTCAGTATCCATAGCCTGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACT GGAGTGGGTTTCGTATATTAGTAGTAACAGTACTACCATATATTACGCAGA CTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGGACTCCC TGTATCTGCAAATGAACAGCCTCAGAGACGAGGACACGGCTGTATATTACT GTGCGAGAGACTACTACTGTACTGGTGGTACCTGCTTCTTTCTTCCTGACC TCTGGGGCCGGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGG CCCATC

[0072] SEQ ID NO: 6 – sequência de aminoácidos do domínio VH de IMM20059

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIHSLNWVRQAPGKGLEWVSYIS SNSTTIYYADSVKGRFTISRDNAKDSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDYYCTGG TCFFLPDLWGRGALVTVSSASTKGPSVFPL

[0073] SEQ ID NO: 7 – sequência nucleotídica do domínio VL de IMM20059

TCAGATACCTCCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCT TTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATAT CAGCAACTTCTTAGCCTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGC TCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGGA GCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTTACAACTGGCTCAC TTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGAGATCAAACGAACTGTGGCTG

[0074] SEQ ID NO: 8 – sequência de aminoácidos do domínio VL de IMM20059

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISNFLAWYQHKPGQAPRLLIYDASIR ATGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNWLTFGGGTKVEIKR TVA

[0075] SEQ ID NO: 9 – H-CDR1 de IMM20059

SIHSLN

[0076] SEQ ID NO: 10 – H-CDR2 de IMM20059

YISSNSTTIYYADSVKG

[0077] SEQ ID NO: 11 – H-CDR3 de IMM20059

DYYCTGGTCFFLPDL

[0078] SEQ ID NO: 12 – L-CDR1 de IMM20059

RASQNISNFLA

[0079] SEQ ID NO: 13 – L-CDR2 de IMM20059

DASIRAT

[0080] SEQ ID NO: 14 – L-CDR3 de IMM20059

QQRYNWLT

[0081] SEQ ID NO: 15 – domínio VH de atezolizumab

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPG

GFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA SEQ ID NO: 16 – domínio VL de atezolizumab

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEI KRTVA

[0082] SEQ ID NO: 17 – H-CDR1 de atezolizumab

SDSWIH

[0083] SEQ ID NO: 18 – H-CDR2 de atezolizumab

PYGGSTYYADSVKG

[0084] SEQ ID NO: 19 – H-CDR3 de atezolizumab

ARRHWPGGFDY

[0085] SEQ ID NO: 20 – L-CDR1 de atezolizumab

RASQDVSTAVA

[0086] SEQ ID NO: 21 – L-CDR2 de atezolizumab

SASFLYS

[0087] SEQ ID NO: 22 – L-CDR3 de atezolizumab

QQYLYHPAT

[0088] SEQ ID NO: 23 – domínio VH de avelumab

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIY PSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTT VDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA

[0089] SEQ ID NO: 24 – domínio VL de avelumab

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYD VSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTG TKVTVLG

[0090] SEQ ID NO: 25 – domínio VH de durvalumab

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANI KQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGW FGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA

[0091] SEQ ID NO: 26 – domínio VL de durvalumab

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKV EIKRTVA

[0092] SEQ ID NO: 27 – domínio VH de BMS-936559

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGII PIFGKAHYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARKFHFVSG SPFGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLA

[0093] SEQ ID NO: 28 – domínio VL de BMS-936559

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASN RATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIKRTVA

[0094] SEQ ID NO: 29 – ligante “L” de VH

ASTKGPSVFPLAP

[0095] SEQ ID NO: 30 – ligante “L” de VL

TVAAPSVFIFPP

[0096] SEQ ID NO: 31 – ligante “S” de VL

TVAAP

[0097] SEQ ID NO: 32 – sequência nucleotídica do domínio VH de IMM20059-L-ATE biespecífico

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGT CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTATCCATAGCC TGAATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCGTAT ATTAGTAGTAACAGTACTACCATATATTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGA TTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGGACTCCCTGTATCTGCAAATGAAC AGCCTCAGAGACGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGACTACTA CTGTACTGGTGGTACCTGCTTCTTTCTTCCTGACCTCTGGGGCCGGGGAG CCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGAGCACAAAAGGACCATCTGTATTTCCA CTCGCCCCCGAAGTACAGCTCGTAGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTCCAAC CTGGTGGTTCCCTTCGACTGTCATGTGCCGCGTCTGGCTTCACTTTTTCCG ATTCATGGATACACTGGGTGAGGCAAGCACCTGGCAAAGGTTTGGAATGG GTGGCCTGGATCTCACCGTATGGGGGTAGTACTTATTATGCGGATTCAGTA AAGGGAAGATTTACCATTTCAGCGGACACAAGTAAAAATACCGCCTATTTG CAGATGAACAGCCTGCGAGCGGAAGACACTGCTGTCTATTATTGTGCTAG ACGCCACTGGCCTGGTGGTTTTGACTACTGGGGGCAGGGCACTTTGGTGA CCGTTTCCTCA

[0098] SEQ ID NO: 33 – sequência de aminoácidos do domínio VH de IMM20059-L-ATE biespecífico

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIHSLNWVRQAPGKGLEWVSYIS SNSTTIYYADSVKGRFTISRDNAKDSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDYYCTGG TCFFLPDLWGRGALVTVSSASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISA DTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

[0099] SEQ ID NO: 34 – sequência nucleotídica do domínio VL de IMM20059- L-ATE biespecífico

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAA AGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATATCAGCAACTTCTTAGC CTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATG CATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGC AGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTTACAACTGGCTCACTTTCGGCGGAGGGAC CAAGGTAGAGATCAAACGAACAGTAGCAGCTCCGTCAGTTTTTATTTTTCC TCCAGATATTCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCTCTCTCCGCTAGTGTAGG TGATAGAGTGACAATAACATGCCGGGCCAGCCAGGATGTATCCACGGCGG TCGCGTGGTACCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCCAAACTGCTTATTTATA GCGCCAGCTTCTTGTACTCAGGAGTACCTAGCAGATTTAGCGGTTCAGGA AGTGGGACTGATTTTACACTCACTATATCTTCCCTGCAACCGGAGGATTTT GCAACATATTATTGTCAACAATATCTCTACCATCCCGCGACATTCGGGCAG GGCACAAAAGTAGAGATCAAACGA

[00100] SEQ ID NO: 35 – sequência de aminoácidos do domínio VL de IMM20059-L-ATE biespecífico

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISNFLAWYQHKPGQAPRLLIYDASIR ATGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNWLTFGGGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPG KAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHP ATFGQGTKVEIKR

[00101] SEQ ID NO: 36 – sequência nucleotídica do domínio VL de 2H11-S- ATE biespecífico

GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAA AGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATATCAGCAACTTCTTAGC CTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATG CATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCT GGGACAGACTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGC AGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTTACAACTGGCTCACTTTCGGCGGAGGGAC CAAGGTAGAGATCAAACGAACAGTAGCAGCTCCGGATATTCAGATGACCC AGTCCCCGTCCTCTCTCTCCGCTAGTGTAGGTGATAGAGTGACAATAACAT GCCGGGCCAGCCAGGATGTATCCACGGCGGTCGCGTGGTACCAGCAGAA ACCTGGGAAAGCCCCCAAACTGCTTATTTATAGCGCCAGCTTCTTGTACTC AGGAGTACCTAGCAGATTTAGCGGTTCAGGAAGTGGGACTGATTTTACACT CACTATATCTTCCCTGCAACCGGAGGATTTTGCAACATATTATTGTCAACAA TATCTCTACCATCCCGCGACATTCGGGCAGGGCACAAAAGTAGAGATCAA ACGA

[00102] SEQ ID NO: 37 – sequência de aminoácidos do domínio VL de 2H11- S-ATE biespecífico

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISNFLAWYQHKPGQAPRLLIYDASIR ATGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNWLTFGGGTKVEIKR TVAAPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQG TKVEIKR

[00103] SEQ ID NO: 38 – sequência nucleotídica do domínio VH de ATE-L- 2H11 biespecífico

GAAGTACAGCTCGTAGAGTCCGGAGGAGGCCTGGTCCAACCTGGTGGTT CCCTTCGACTGTCATGTGCCGCGTCTGGCTTCACTTTTTCCGATTCATGGA TACACTGGGTGAGGCAAGCACCTGGCAAAGGTTTGGAATGGGTGGCCTG GATCTCACCGTATGGGGGTAGTACTTATTATGCGGATTCAGTAAAGGGAAG ATTTACCATTTCAGCGGACACAAGTAAAAATACCGCCTATTTGCAGATGAA CAGCCTGCGAGCGGAAGACACTGCTGTCTATTATTGTGCTAGACGCCACT GGCCTGGTGGTTTTGACTACTGGGGGCAGGGCACTTTGGTGACCGTTTCC TCAGCCGCGAGCACAAAAGGACCATCTGTATTTCCACTCGCCCCCGAGGT GCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTATCCATAGCCTGAAT TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTTCGTATATTAG TAGTAACAGTACTACCATATATTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCAC CATCTCCAGAGACAATGCCAAGGACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT CAGAGACGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGACTACTACTGTA CTGGTGGTACCTGCTTCTTTCTTCCTGACCTCTGGGGCCGGGGAGCCCTG GTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC

[00104] SEQ ID NO: 39 – domínio de sequência de aminoácidos do domínio VH de ATE-L-2H11 biespecífico

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWI SPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPG GFDYWGQGTLVTVSSAASTKGPSVFPLAPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSC AASGFTFSIHSLNWVRQAPGKGLEWVSYISSNSTTIYYADSVKGRFTISRDNA KDSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARDYYCTGGTCFFLPDLWGRGALVTVSSAST KGPSV

[00105] SEQ ID NO: 40 – sequência nucleotídica do domínio VL de ATE-L- 2H11 biespecífico

GATATTCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCTCTCTCCGCTAGTGTAGGTGAT AGAGTGACAATAACATGCCGGGCCAGCCAGGATGTATCCACGGCGGTCG CGTGGTACCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCCAAACTGCTTATTTATAGC GCCAGCTTCTTGTACTCAGGAGTACCTAGCAGATTTAGCGGTTCAGGAAGT GGGACTGATTTTACACTCACTATATCTTCCCTGCAACCGGAGGATTTTGCA ACATATTATTGTCAACAATATCTCTACCATCCCGCGACATTCGGGCAGGGC ACAAAAGTAGAGATCAAACGAACCGTCGCCGCACCATCAGTTTTTATTTTT CCTCCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAATATCAGCAACTT CTTAGCCTGGTACCAACACAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCT ATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGT GGGTCTGGGACAGACTTCAGTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGA TTTTGCAGTTTATTTCTGTCAGCAGCGTTACAACTGGCTCACTTTCGGCGG AGGGACCAAGGTAGAGATCAAACGA

[00106] SEQ ID NO: 41 – sequência de aminoácidos do domínio VL de ATE- L-2H11 biespecífico

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISNFLAWYQHKP GQAPRLLIYDASIRATGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNW LTFGGGTKVEIKR

[00107] SEQ ID NO: 42 – sequência nucleotídica do domínio VL de ATE-S- 2H11 biespecífico

GATATTCAGATGACCCAGTCCCCGTCCTCTCTCTCCGCTAGTGTAGGTGAT AGAGTGACAATAACATGCCGGGCCAGCCAGGATGTATCCACGGCGGTCG CGTGGTACCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCCAAACTGCTTATTTATAGC GCCAGCTTCTTGTACTCAGGAGTACCTAGCAGATTTAGCGGTTCAGGAAGT GGGACTGATTTTACACTCACTATATCTTCCCTGCAACCGGAGGATTTTGCA ACATATTATTGTCAACAATATCTCTACCATCCCGCGACATTCGGGCAGGGC ACAAAAGTAGAGATCAAACGAACAGTAGCAGCTCCGGAAATTGTGTTGACA CAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTC CTGCAGGGCCAGTCAGAATATCAGCAACTTCTTAGCCTGGTACCAACACAA ACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCA CTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGT CTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTTCTGTCAG CAGCGTTACAACTGGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGAGATCAA A

[00108] SEQ ID NO: 43 – sequência de aminoácidos do domínio VL de ATE- S-2H11 biespecífico

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEI KRTVAAPEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQNISNFLAWYQHKPGQAPRL LIYDASIRATGIPARFSGSGSGTDFSLTISSLEPEDFAVYFCQQRYNWLTFGGG TKVEIK

[00109] SEQ ID NO: 44 – sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-CD-63

QVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYVIHWVKQKPGQGLEWIGYFD PNNDGTKYNERFKGKATLTSDRSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSRTYYD ASMDYWGQGTSVTVSS

[00110] SEQ ID NO: 45 – sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-CD-63

DIWMTQSPSSLAVSPGEKVTMNCKSSQSVLYSSNQKNFLAWYQQKPGQSPK LLIYWASTRESGVPDRFTGSGGSGTDFTLTISNIQTEDLAVYYCQQIFSSYTFG GGTKLELKR

[00111] SEQ ID NO: 46 – sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-HER2

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIY PTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGF YAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA

[00112] SEQ ID NO: 47 – sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-HER2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEI K

[00113] SEQ ID NO: 48 – sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-EpCAM

EVQLVQSGPGLVQPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLEWMGW INTYTGESTYADSFKGRFTFSLDTSASAAYLQINSLRAEDTAVYYCARFAIKGD YWGQGTLLTVSS

[00114] SEQ ID NO: 49 – sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-EpCAM

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSTKSLLHSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIY QMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEIPRTFGQGT KVELK

[00115] SEQ ID NO: 50 – sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-HER3

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSHWMHWVRQAPGQGLEWIGE FNPSNGRTNYNEKFKSKATMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCASRDYD YDGRYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA

[00116] SEQ ID NO: 51 – sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-HER3

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNL ASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSHIFTFGQGTKVEIK

[00117] SEQ ID NO: 52 – sequência de aminoácidos do domínio VH do anticorpo anti-EGFR

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVI WSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDY EFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPL

[00118] SEQ ID NO: 53 – sequência de aminoácidos do domínio VL do anticorpo anti-EGFR

DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESI SGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELK

Claims (20)

Reivindicações

1. ANTICORPO BIESPECÍFICO caracterizado por compreender: (a) uma primeira porção de ligação ao antígeno específica para uma proteína exossomal, e (b) uma segunda porção de ligação ao antígeno específica para o ligante de morte celular programada 1 (PD-L1).

2. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela segunda porção de ligação ao antígeno compreender: (1) pelo menos uma de: (a) uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada ("CDR")1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19; e (2) pelo menos uma de: (a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21; e (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22.

3. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela segunda porção de ligação ao antígeno compreender uma cadeia VH, ou fragmento da mesma, e uma cadeia VL, ou fragmento da mesma, de um anticorpo anti-PD-L1 selecionado dentre atezolizumab, avelumab, durvalumab, e BMS-936559.

4. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno se ligar especificamente a uma proteína exossomal selecionada dentre EPN1, CD9, CD10, CD26, CD37, CD45/ICAM-1, CD63, CD69, CD81, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, Flotilina-1, Glypican-1, HER2, HER3, HSP70, HSP90 e NKCC2.

5. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno se ligar especificamente a um epítopo na EPN1 humana.

6. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno compreender: (1) uma cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou um fragmento da mesma; e (2) uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, ou um fragmento da mesma.

7. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno compreender: (1) uma cadeia pesada variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, ou um fragmento da mesma; e (2) uma cadeia leve variável compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, ou um fragmento da mesma.

8. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela primeira porção de ligação ao antígeno compreender: (1) pelo menos uma de: (a) uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9; (b) uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e (c) uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:11; e (2) pelo menos uma de:

(a) uma CDR1 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12; (b) uma CDR2 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, e (c) uma CDR3 de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

9. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelas primeira e segunda porções de ligação ao antígeno serem ligadas diretamente ou por um ligante.

10. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo ligante ser selecionado do grupo que consiste em um ligante químico ou um ligante polipeptídico.

11. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo anticorpo biespecífico ser selecionado do grupo que consiste em: um derivado "knob-into-hole"; SEED-IgG, DEKK Fc mutada, DVD-Ig, heteroFc-scFv, IgG-scFv, scFv2-Fc, scDB-Fc.

12. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo anticorpo biespecífico não conter um domínio Fc, e ser selecionado do grupo que consiste em scFv em tandem, diacorpo, Fab-scFv

13. ANTICORPO BIESPECÍFICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo totalmente humano ou humanizado.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender um anticorpo biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 1-13 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

15. KIT caracterizado por compreender pelo menos um anticorpo biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 1-13 e pelo menos um de: um recipiente de armazenamento adequado, uma solução com pH tamponado e instruções de uso do kit.

16. MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER EM UM INDIVÍDUO caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapêutica eficaz de um anticorpo biespecífico definido em qualquer uma das reivindicações 1-13.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo anticorpo biespecífico interromper a supressão da atividade antitumoral pelas células imunes por serem direcionados aos exossomos derivados de células tumorais.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela supressão da atividade antitumoral ser mediada pelas células T supressoras CD8+.

19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, caracterizado pelo indivíduo ser humano.

20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-19, caracterizado por cerca de 0,5-20 mg/kg do anticorpo biespecífico ser administrado ao indivíduo.