BR112021008288A2

BR112021008288A2 - composição farmacêutica de proteína de fusão do receptor tgf-ss e uso da mesma

Info

Publication number: BR112021008288A2
Application number: BR112021008288-3A
Authority: BR
Inventors: Chenmin TIAN; Hao Li; Xun Liu
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-08-10
Also published as: AU2019374363A1; WO2020094122A1; TW202031279A; TWI829799B; CN112512550B; KR20210090643A; CA3118415A1; UA127771C2; EP3878461A4; JP7436477B2; JP2022512862A; CN112512550A; EP3878461A1; US20220017601A1; MX2021005018A

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE PROTEÍNA DE FUSÃO DO RECEPTOR TGF-ß E USO DA MESMA. É revelada na presente revelação uma composição farmacêutica de proteína de fusão de receptor TGF-ß e uso da mesma. Especificamente, a composição farmacêutica compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-ß em um tampão de citrato de sódio e a proteína de fusão de receptor TGF-ß compreende uma porção de direcionamento do anticorpo PD-L1 e uma região extracelular TGF-ßRII. Além disso, a composição farmacêutica também pode compreender um açúcar e um tensoativo não iônico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE PROTEÍNA DE FUSÃO DO RECEPTOR TGF-β E USO DA MESMA”

[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente 201811328326.1 depositado em 9 de novembro de 2018, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

[002] A presente revelação pertence ao campo da preparação farmacêutica e, em particular, refere-se a uma composição farmacêutica que compreende anticorpo PD- L1/proteína de fusão da região extracelular TGF-βRII e ao uso da mesma como medicamento.

Fundamentos da Invenção

[003] As declarações no presente documento fornecem apenas informações básicas relacionadas à presente revelação e não constituem necessariamente o estado da técnica.

[004] Durante o tratamento do tumor, as pessoas reconheceram a alta toxicidade devido à quimioterapia, e a quimioterapia pode levar à geração de células cancerosas resistentes aos medicamentos. Mesmo se as terapias direcionadas forem usadas, que direcionam proteínas superexpressas ou superativadas relacionadas à sobrevivência e ao crescimento do tumor, ainda haverá células cancerosas que são mutadas para reduzir ou evitar a dependência das vias direcionadas pela terapia direcionada, e aquelas células cancerosas sobreviveriam por outras vias.

[005] A imunoterapia tumoral tem atraído muita atenção nos últimos anos e é o foco no campo do tratamento de tumores.

A vantagem marcante dessa terapia é o aumento da dificuldade em gerar resistência aos medicamentos. A imunoterapia tumoral usa principalmente princípios e métodos imunológicos para melhorar a imunogenicidade das células tumorais e a sensibilidade à morte de células efetoras, e para estimular e aumentar a resposta imune antitumoral no organismo. A imunoterapia tumoral envolve a infusão de células imunológicas e moléculas efetoras em um hospedeiro, e essas duas cooperam com o sistema imunológico para matar tumores e inibir o crescimento do tumor no organismo.

[006] O receptor de morte programada 1 (PD-1) é um membro da superfamília CD28. PD-1 é expresso em células T ativadas, células B e células mieloides. PD-1 tem dois ligantes, ligante de morte programada 1 (PD-L1) e PD-L2. PD- L1 interage com o receptor PD-1 nas células T e desempenha um papel importante na regulação negativa da resposta imune.

A expressão da proteína PD-L1 pode ser detectada em muitos tecidos tumorais humanos. O microambiente no local do tumor pode induzir a expressão de PD-L1 em células tumorais e o PD-L1 expresso, por sua vez, contribui para a tumorigênese e crescimento e induz a apoptose de células T antitumorais.

Os inibidores da via PD-1/PD-L1 bloqueiam a ligação de PD-1 a PD-L1, bloqueiam sinais regulatórios negativos, restauram a atividade das células T e aumentam a resposta imune.

Portanto, a imunomodulação com PD-1/PD-L1 como o alvo é de grande significância para a supressão do tumor.

[007] O fator de transformação de crescimento-β (TGF- β) pertence à superfamília TGF-β que regula o crescimento e a diferenciação celular. O TGF-β transmite sinais através de um complexo receptor heterotetramérico, que é composto por dois receptores transmembrana de serina/treonina quinase do tipo I e dois do tipo II.

[008] O TGF-β é uma citocina multifuncional, que exerce um efeito de supressão ou promoção de tumores de uma forma dependente de células ou de fundo. O efeito de supressão tumoral do TGF-β depende da capacidade de induzir a expressão de múltiplos genes. Quando mutações ou modificações epigenéticas são introduzidas durante o desenvolvimento do tumor, as células cancerosas são gradualmente tolerantes ao efeito inibitório do TGF-β, o que em última instância leva ao desenvolvimento do tumor.

[009] Estudos constataram que o bloqueio da via de sinalização do TGF-β pode reduzir a metástase do tumor.

Constatou-se que a capacidade de metástase das células tumorais foi inibida quando a via de sinalização de TGF-β das linhas de células tumorais da mama foi inibida pelo mutante Smad2/3 truncado negativo. O estudo da instabilidade do microssatélite de câncer de cólon constatou que a mutação inativa do TGF-βRII reduziu a metástase e aumentou a taxa de sobrevida pós-operatória dos pacientes. No entanto, em geral, o efeito é fraco quando o inibidor da via de sinalização de TGF-β é administrado sozinho no tratamento clínico, provavelmente porque o TGF-β é expresso principalmente de forma anormal em células tumorais, ao passo que é difícil para o inibidor da via de sinalização de TGF- β sozinho para atingir o tumor, resultando em baixa eficácia ou baixa biodisponibilidade do inibidor.

[0010] Portanto, com base no direcionamento e neutralização do TGF-β em um microambiente tumoral, a inibição da via PD-1/PD-L1 pode restaurar a atividade das células T, aumentar a resposta imune e melhorar o efeito inibidor da tumorigênese e desenvolvimento mais efetivamente.

[0011] Um pedido PCT anterior do requerente PCT/CN2016/104320 (publicação número WO2017084495) fornece um anticorpo PD-L1. A proteína de fusão de receptor de anticorpo/TGF-β foi publicada no presente, como nos documentos nos WO2006074451A2, WO2009152610A1, WO2011109789A2, WO2013164694A1, WO2014164427A1, WO2015077540A2, WO9309228A1, WO2011109789A2, WO2013164694A1, WO2014164427A1, WO2015077540A2,

WO9309228A1, WO940215815A, etc. revela uma proteína de fusão bifuncional PD-L1/TGF-β Bintrafusp Alfa (WO2015118175, também conhecido como M7824, FP17022). Atualmente, Bintrafusp Alfa está em fase clínica de doenças tumorais, como câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer de esôfago, NSCLC, câncer biliar. No entanto, os medicamentos de anticorpos na técnica anterior tornam-se instáveis devido a grandes pesos moleculares, estruturas complexas e são suscetíveis à degradação, polimerização ou ocorrência de modificações químicas indesejáveis. A fim de tornar o anticorpo adequado para administração, manter a estabilidade durante o armazenamento e uso subsequente, e para exercer um melhor efeito, a pesquisa sobre preparações estáveis de medicamentos de anticorpos é particularmente importante.

Sumário da Invenção

[0012] A presente revelação fornece uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão PD-L1/TGF- βRII, que é mais propícia à produção e administração e é mais estável em desempenho; a composição farmacêutica compreende: - uma proteína de fusão do receptor TGF-β, e - um tampão, em que o tampão é selecionado do grupo que consiste em um tampão de sal de histidina, um tampão de succinato, um tampão de fosfato e um tampão de citrato.

[0013] Em algumas modalidades, o tampão é um tampão de citrato. Em algumas modalidades, o tampão de sal de histidina é tampão de histidina-ácido clorídrico; e o tampão succinato é tampão succinato de ácido succínico e sódio; o tampão de citrato é um tampão de ácido cítrico-citrato de sódio; Em algumas modalidades, o tampão é tampão de ácido cítrico- citrato de sódio.

[0014] Em uma modalidade alternativa, a concentração da proteína de fusão do receptor TGF-β na composição farmacêutica descrita acima é de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de um modo preferido cerca de 30 mg/ml a cerca de 70 mg/ml.

[0015] Em algumas modalidades, a concentração da proteína de fusão do receptor TGF-β na composição farmacêutica é de 0,5 mg/ml a 100 mg/ml, de um modo preferido 30 mg/ml a 70 mg/ml. Os exemplos não limitantes da concentração da proteína de fusão do receptor TGF-β envolvem: cerca de 30 mg / ml, cerca de 35 mg/ml, cerca de 40 mg/ml, cerca de 45 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cerca de 55 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 65 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, de um modo preferido cerca de 50 mg/ml.

[0016] Em algumas modalidades, a concentração da proteína de fusão do receptor TGF-β na composição farmacêutica é 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, de um modo mais preferido 50 mg/ml.

[0017] Em uma modalidade alternativa, o valor de pH do tampão na composição farmacêutica descrita acima é de cerca de 5,0 a cerca de 7,5, de um modo preferido cerca de 6,0 a cerca de 6,5 e, opcionalmente, cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de 6,4, cerca de 6,5, de um modo mais preferido cerca de 6,2.

[0018] Em algumas modalidades, o valor de pH do tampão é 5,0 a 7,5 ou 6,0 a 6,5, de um modo preferido 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4 ou 6,5, de um modo mais preferido 6,2.

[0019] Em uma modalidade alternativa, a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, de um modo preferido cerca de 5 mM a cerca de 20 mM; exemplos não limitantes dos mesmos envolvem 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, de um modo mais preferido 10 mM.

[0020] Em algumas modalidades, a concentração do tampão é de 5 mM a 30 mM, de um modo preferido 5 mM a 20 mM; e em algumas modalidades, a concentração do tampão é de cerca de 10 mM, cerca de 12 mM, cerca de 14 mM, cerca de 16 mM, cerca de 18 mM, cerca de 20 mM e, de um modo mais preferido, cerca de 10 mM.

[0021] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima também compreende sacarídeo. O “sacarídeo” na presente revelação compreende compostos/composições convencionais (CH2O)n ou derivados dos mesmos, que compreendem monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, polissacarídeos, álcoois de açúcar, sacarídeos redutores, sacarídeos não redutores e similares.

Em algumas modalidades, o sacarídeo é selecionado do grupo que consiste em: glicose, sacarose, trealose, lactose, frutose, dextrano, glicerol, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, manitol, melibiose, melezitose, melitriose, manotrose, maltose, lactulose, maltulose, sorbitol, maltitol, lactitol, iso-maltulose e assim por diante. O sacarídeo preferencial é um dissacarídeo não redutor, de um modo mais preferido trealose ou sacarose, e com a maior preferência sacarose.

[0022] Em uma modalidade alternativa, a concentração do sacarídeo na composição farmacêutica descrita acima é de cerca de 50 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de um modo preferido cerca de 60 mg/ml a cerca de 90 mg/ml; exemplos não limitantes envolvem 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml, com a maior preferência 80 mg/ml.

[0023] Em algumas modalidades, a concentração do sacarídeo é de 50 mg/ml a 100 mg/ml, de um modo preferido 60 mg/ml a 90 mg/ml; e em algumas modalidades, a concentração do sacarídeo é de cerca de 60 mg/ml, cerca de 65 mg/ml, cerca de 70 mg/ml, cerca de 75 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de

85 mg/ml ou cerca de 90 mg/ml.

[0024] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima compreende ainda um tensoativo, que pode ser selecionado do grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 80, poli-hidroxialquileno, Triton, dodecil sulfonato de sódio, lauril sulfonato de sódio, octil glicosídeo de sódio, lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearil- sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, miristil-betaína, cetil-betaína, lauril amido propil- betaína, cocamidopropil-betaína, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmitamidopropil-betaína, isostearil-amidopropil-betaína, miristamidopropil- dimetilamina, palmamidopropil-dimetilamina, isoestearamidopropil-dimetilamina, metil cocoil de sódio, metil oleil taurato de sódio, polietileno glicol, polipropileno glicol, copolímero de etileno e propileno glicol, etc. O tensoativo preferencial é polissorbato 80 ou polissorbato 20, de um modo mais preferido polissorbato 80.

[0025] Em outra modalidade alternativa, a concentração do tensoativo na composição farmacêutica descrita acima é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml, de um modo mais preferido cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração do tensoativo é de 0,1 mg/ml a

0,8 mg/ml, de um modo preferido 0,4 mg/ml a 0,8 mg/ml, de um modo mais preferido cerca de 0,4 mg/ml, cerca de 0,45 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml, cerca de 0,55 mg/ml, cerca de 0,6 mg/ml, cerca de 0,7 mg/ml, cerca de 0,8 mg/ml.

[0026] Em algumas modalidades, a concentração do tensoativo é de 0,4 mg/ml, 0,45 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,55 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml ou 0,8 mg/ml, mais especificamente 0,4 mg/ml.

[0027] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima compreende: (a) cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 100 mg/ml de proteína de fusão do receptor TGF-β, (b) cerca de 5 mM a cerca de 30 mM de tampão de citrato, (c) cerca de 50 mg/ml a cerca de 100 mg/ml de sacarose, e (d) cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml de polissorbato 80, de um modo preferido o pH da composição farmacêutica é cerca de 5,0 a cerca de 7,5, de um modo mais preferido cerca de 6,0 a cerca de 6,5.

[0028] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima compreende: 0,5 mg/ml a 100 mg/ml de proteína de fusão de receptor TGF-β tampão de citrato 5 mM a 30 mM 50 mg/ml a 100 mg/ml de sacarose, e 0,1 mg/ml a 0,8 mg/ml de polissorbato 80; de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é 5,0 a 7,5, de um modo mais preferido 6,0 a 6,5.

[0029] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima compreende: (a) cerca de 30 mg/ml a cerca de 70 mg/ml de proteína de fusão de receptor TGF-β, (b) cerca de 5 mM a cerca de 20 mM de tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, (c) cerca de 60 mg/ml a cerca de 90 mg/ml de sacarose, e (d) cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml de polissorbato 80, de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,0 a cerca de 6,5.

[0030] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica descrita acima compreende: 30 mg/ml a 70 mg/ml de proteína de fusão de receptor TGF-β Tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 5 mM a 20 mM 60 mg/ml a 90 mg/ml de sacarose, e 0,4 mg/ml a 0,8 mg/ml de polissorbato 80; o pH da composição farmacêutica é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5.

[0031] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: (a) cerca de 50 mg/ml de proteína de fusão do receptor de TGF-β, (b) cerca de 10 mM de tampão de ácido cítrico- citrato de sódio, (c) cerca de 80 mg/ml de sacarose, e (d) cerca de 0,4 mg/ml de polissorbato 80, o pH de a composição farmacêutica é de um modo preferido cerca de 6,2.

[0032] Em uma modalidade alternativa, a composição farmacêutica compreende: 50 mg/ml de proteína de fusão de receptor TGF-β Tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM 80 mg/ml de sacarose, e 0,4 mg/ml de polissorbato 80; de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,2.

[0033] Em uma modalidade alternativa, a proteína de fusão do receptor TGF-β na composição farmacêutica descrita acima é mostrada como fórmula geral (I): Ab-L-TGF-βRII ECD (I) em que o ECD de TGF-βRII é uma forma truncada de uma região extracelular de TGF-βRII; Ab é um anticorpo PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; L é uma sequência de ligante.

[0034] Em uma modalidade alternativa, a sequência de ligante na composição farmacêutica descrita acima é (G4S)xG, em que x é um número inteiro de 3 a 6. Em uma modalidade alternativa, x é 3, 4, 5 ou 6, de um modo preferido 4.

[0035] Em uma modalidade alternativa, a forma truncada da região extracelular de TGF-βRII é uma sequência de domínio extracelular de TGF-βRII (mostrada como SEQ ID NO: 14) com uma deleção de no máximo 26 resíduos de aminoácidos consecutivos no terminal amino (também referido como terminal N). Em algumas modalidades, a forma truncada da região extracelular de TGF-βRII é uma sequência de domínio extracelular de TGF-βRII com uma deleção de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 resíduos de aminoácidos consecutivos no terminal N. Em algumas modalidades, a sequência do ECD de TGF-βRII na composição farmacêutica descrita acima é mostrada como SEQ ID NO: 14, 15, 16 ou 17; de um modo preferido, a sequência mostrada como SEQ ID NO:

15.

[0036] Em uma modalidade alternativa, o anticorpo PD- L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na composição farmacêutica descrita acima compreende: HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.

[0037] Em uma modalidade alternativa, o anticorpo PD- L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na composição farmacêutica descrita acima compreende: HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.

[0038] Em uma modalidade alternativa, o anticorpo PD- L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na composição farmacêutica descrita acima compreende: uma região variável de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 8; ou compreende: uma região variável de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 11.

[0039] Em uma modalidade alternativa, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 na composição farmacêutica descrita acima é mostrada como SEQ ID NO: 12 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 12; a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo PD-L1 é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 13.

[0040] Em uma modalidade alternativa da composição farmacêutica descrita acima, na proteína de fusão do receptor

TGF-β, o ECD de TGF-βRII é fundido ao terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 através de uma sequência ligante.

[0041] Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor TGF-β compreende: • um peptídeo de fusão formado pela cadeia pesada do anticorpo PD-L1 fundido ao ECD de TGF-βRII, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 23 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 23, e • a cadeia leve do anticorpo PD-L1, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 13.

[0042] Em outras modalidades, a proteína de fusão do receptor TGF-β compreende: • um peptídeo de fusão formado pela cadeia pesada do anticorpo PD-L1 fundido ao ECD de TGF-βRII, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 24 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 24, e • a cadeia leve do anticorpo PD-L1, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 13.

[0043] A presente revelação também fornece um método para preparar a composição farmacêutica descrita acima, que compreende uma etapa de contato da proteína de fusão do receptor TGF-β com um tampão, por exemplo, realizando a substituição do tampão na solução estoque da proteína de fusão do receptor TGF-β, e o tampão é de um modo preferido tampão citrato; de um modo mais preferido tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, a concentração do tampão é de um modo preferido de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM; os exemplos não limitantes envolvem 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM, de um modo mais preferido 10 mM; o pH do tampão é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5, os exemplos não limitantes envolvem 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, de um modo preferido 6,2. Em uma modalidade alternativa, a concentração do tampão é de 5 mM a 20 mM, os exemplos não limitantes envolvem cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 12 mM, cerca de 14 mM, cerca de 16 mM, cerca de 18 mM, cerca de 20 mM, de um modo mais preferido cerca de 10 mM; o pH do tampão é 6,0 a 6,5, os exemplos não limitantes envolvem cerca de 6,0, cerca de 6,1, cerca de 6,2, cerca de 6,3, cerca de

6,4, cerca de 6,5, de um modo preferido cerca de 6,2.

[0044] A presente revelação também fornece um método para preparar a composição farmacêutica descrita acima, que compreende ainda as seguintes etapas após o contato da proteína de fusão do receptor TGF-β com o tampão: adicionar sacarose e polissorbato 80 à solução obtida (sem ordem de precedência entre os dois) e, então, ajustar o volume com o tampão, em que a concentração da solução tampão é de um modo preferido cerca de 5mM a cerca de 20 mM, de um modo mais preferido 5mM a 20mM, o não -exemplos limitantes envolvem 5 mM, 8 mM, 10 mM, 12 mM, 14 mM, 16 mM, 18 mM, 20 mM; o pH do tampão é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5, os exemplos não limitantes envolvem 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5.

[0045] A presente revelação também fornece um método para preparar uma preparação liofilizada que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β, que compreende uma etapa de liofilização da composição farmacêutica descrita acima.

[0046] Em uma modalidade alternativa, o método para preparar uma preparação liofilizada descrita acima que compreende a proteína de fusão do receptor TGF-β, em que a liofilização é realizada de acordo com um método conhecido na técnica, como, sem limitação, etapas que compreendem pré- congelamento, secagem primária e secagem secundária. Os especialistas no assunto entendem que qualquer método para remover água da composição farmacêutica na presente revelação é aplicável à presente revelação.

[0047] A presente revelação também fornece uma preparação liofilizada que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β, que é preparada pelo método para preparar uma preparação liofilizada descrita acima.

[0048] A presente revelação também fornece uma preparação liofilizada que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β, que pode ser reconstituída para formar a composição farmacêutica descrita acima.

[0049] Em algumas modalidades, a preparação liofilizada pode ser estável de 2 ºC a 8 ºC por pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses ou pelo menos 24 meses. Em algumas modalidades, a preparação liofilizada pode ser estável a 40 ºC por pelo menos 7 dias, pelo menos 14 dias ou pelo menos 28 dias.

[0050] A presente revelação também fornece uma solução reconstituída que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β, que é obtida por reconstituição da preparação liofilizada que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β descrita acima.

[0051] A presente revelação também fornece um método para preparar a solução reconstituída que compreende a proteína de fusão de receptor TGF-β descrita acima, que compreende: uma etapa de reconstituição da preparação liofilizada descrita acima, em que a solução usada para reconstituição compreende, sem limitação, água para preparações injetáveis, soro fisiológico ou solução de glicose, de um modo preferido água para preparações injetáveis.

[0052] A presente revelação fornece ainda um artigo de manufatura ou kit, que compreende: a composição farmacêutica de acordo com a presente revelação; e recipiente (ou recipientes).

[0053] Em algumas modalidades, o recipiente é uma garrafa de vidro, como, sem limitação, uma garrafa de injeção fabricada de frasco de vidro de borossilicato neutro.

[0054] A presente revelação também fornece um artigo de manufatura, que compreende recipiente (ou recipientes), que compreende a composição farmacêutica descrita acima, ou a preparação liofilizada da mesma, ou uma solução reconstituída da preparação liofilizada.

[0055] A presente revelação também fornece o uso de qualquer um selecionado a partir do seguinte na preparação de um medicamento: a composição farmacêutica descrita acima, ou a preparação liofilizada, ou a solução reconstituída da preparação liofilizada, ou o artigo de fabricação; o medicamento é usado para tratar ou inibir doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) de proliferação ou metástase de células tumorais.

[0056] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é tumor.

[0057] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é selecionado do grupo que consiste em: câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de rim, câncer cervical, mieloma, linfoma, leucemia, câncer de tireoide, câncer endometrial, câncer uterino, câncer de bexiga, câncer neuroendócrino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, carcinoma nasofaríngeo, câncer testicular, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, carcinoma cutâneo de células basais, carcinoma cutâneo de células escamosas, dermatofibrossarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma e síndrome mielodisplásica.

[0058] A presente revelação também fornece um método para tratar ou inibir doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) relacionados à proliferação ou metástase de células cancerosas, que compreende o fornecimento de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica descrita acima ou a preparação liofilizada, ou a solução reconstituída, ou o artigo de manufatura, para um indivíduo em necessidade. Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao indivíduo de uma dose unitária de composição que compreende: 0,1 mg a 3.000 mg da proteína de fusão do receptor TGF-β como descrito acima, da composição farmacêutica ou da preparação liofilizada, ou da solução reconstituída, ou do artigo de fabricação. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é tumor. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é selecionado do grupo que consiste em: câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de rim, câncer cervical, mieloma, linfoma, leucemia, câncer de tireoide, câncer endometrial, câncer uterino, câncer de bexiga, câncer neuroendócrino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, carcinoma nasofaríngeo, câncer testicular, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, carcinoma cutâneo de células basais, carcinoma cutâneo de células escamosas, dermatofibrossarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma e síndrome mielodisplásica.

[0059] A presente invenção também fornece a proteína de fusão de receptor TGF-β, composição farmacêutica ou preparação liofilizada, ou solução reconstituída, ou artigo de fabricação descrito acima, para tratar ou inibir doenças ou distúrbios (ou doenças ou distúrbios) relacionados à proliferação ou metástase de célula cancerosa. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é tumor. Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é selecionado do grupo que consiste em: câncer colorretal, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de próstata, câncer de rim, câncer cervical, mieloma, linfoma, leucemia, câncer de tireoide, câncer endometrial, câncer uterino, câncer de bexiga, câncer neuroendócrino, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado, carcinoma nasofaríngeo, câncer testicular, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, melanoma, carcinoma cutâneo de células basais, carcinoma cutâneo de células escamosas, dermatofibrossarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, glioblastoma, glioma, sarcoma, mesotelioma e síndrome mielodisplásica.

[0060] Como é bem conhecido pelos especialistas no assunto da técnica, uma, algumas ou todas as características das várias modalidades descritas na presente revelação podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente revelação. As modalidades acima da presente revelação e outras modalidades obtidas por combinação são ainda ilustradas pela seguinte descrição detalhada.

Descrição dos Desenhos

[0061] Figura 1: Diagrama esquemático que mostra a estrutura da proteína de fusão.

[0062] Figura 2: Resultados que mostram a ligação de proteínas de fusão a TGF-β1 humano in vitro.

[0063] Figura 3: Resultados que mostram a ligação de proteínas de fusão a TGF-β1 humano in vitro.

[0064] Figura 4: Resultados que mostram a ligação de proteínas de fusão a PD-L1 humano in vitro.

[0065] Figura 5: Resultado que mostra a detecção de bloqueio da via PD-1/PD-L1 por proteínas de fusão in vitro.

[0066] Figura 6: As proteínas de fusão inibem a atividade induzida por TGFβ do repórter pSMAD3 de uma maneira dependente da dose.

[0067] Figura 7: Todas as amostras de proteínas de fusão aumentam a secreção da citocina IFN-γ pelos linfócitos T ativados.

[0068] Figura 8: Efeito das proteínas de fusão no peso do tumor em camundongos com tumor.

Descrição Detalhada da Invenção Terminologia

[0069] Para que a revelação seja mais facilmente compreendida, certos termos técnicos e científicos são definidos especificamente a seguir. A menos que especificamente definido no presente documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado comumente compreendido por alguém com habilidades comuns na técnica a que esta revelação pertence.

[0070] “Tampão” se refere a uma solução que é tolerada à alteração do pH por meio da ação dos componentes do conjugado ácido-base. Exemplos de tampões que podem controlar o pH dentro de uma faixa apropriada incluem acetato, succinato, gluconato, histidina, oxalato, lactato, fosfato, citrato, tartarato, fumarato e glicilglicina.

[0071] “Tampão de sal de histidina” é um tampão que compreende íons de radical histidina. Exemplos de tampões de sal de histidina incluem cloridrato de histidina, acetato de histidina, fosfato de histidina, sulfato de histidina e semelhantes; de um modo preferido tampão cloridrato de histidina. O tampão cloridrato de histidina é preparado a partir de histidina e ácido clorídrico.

[0072] “Tampão de citrato” é um tampão que compreende íons de radical citrato. Exemplos de tampões de citrato incluem ácido cítrico-citrato de sódio, citrato-citrato de potássio, citrato-citrato de cálcio, citrato-citrato de magnésio e similares. O tampão de citrato preferencial é o ácido cítrico-citrato de sódio.

[0073] “Tampão de succinato” é um tampão que compreende íons de radical succinato. Exemplos de tampões de succinato incluem ácido succínico-succinato de sódio, ácido succínico- succinato de potássio, ácido succínico-succinato de cálcio e similares. O tampão succinato preferencial é ácido succínico-succinato de sódio.

[0074] “Tampão de fosfato” é um tampão que compreende íons de radical fosfato. Exemplos de tampões de fosfato incluem hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato de potássio e similares. O tampão de fosfato preferencial é hidrogenofosfato dissódico-di-hidrogenofosfato de sódio.

[0075] “Tampão de acetato” é um tampão que compreende íons de radicais de acetato. Exemplos de tampões de acetato incluem ácido acético-acetato de sódio, acetato de histidina, ácido acético-acetato de potássio, ácido acético- acetato de cálcio, ácido acético-acetato de magnésio e similares. O tampão de acetato preferencial é ácido acético- acetato de sódio.

[0076] “Composição farmacêutica” se refere a uma mistura que compreende um ou mais dos compostos descritos no presente documento ou sais ou pró-fármacos fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e outros componentes químicos, como carreador (ou carreadores) e excipiente (ou excipientes) fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável. O objetivo da composição farmacêutica é manter a estabilidade do anticorpo ingrediente ativo, promover a administração ao organismo e facilitar a absorção do ingrediente ativo para exercer a atividade biológica. A “composição farmacêutica” e a

“preparação” usadas no presente documento não são mutuamente exclusivas.

[0077] A menos que especificado de outra forma, quando se refere à forma de solução da composição farmacêutica descrita na presente revelação, o solvente na mesma é água.

[0078] “Preparação liofilizada” se refere a uma preparação ou composição farmacêutica obtida após uma etapa de liofilização (por exemplo, uma etapa de secagem por congelamento a vácuo) a composição farmacêutica em sua forma líquida ou em solução, ou liofilização da preparação em sua forma líquida ou em solução.

[0079] O termo “cerca de” ou “aproximadamente”, conforme usado na presente revelação, significa que o valor está dentro de uma faixa de erro aceitável do valor específico determinado pelos especialistas no assunto com habilidade comum na técnica, e o valor depende parcialmente de como é medido ou determinado (ou seja, o limite do sistema de medição). Por exemplo, “cerca de” ou “aproximadamente” na técnica se refere a um desvio padrão menor do que um ou mais do que um. Alternativamente, “cerca de” ou “aproximadamente” ou “que compreende substancialmente” se refere a uma faixa de até 20%. Além disso, particularmente para sistemas ou processos biológicos, o termo significa uma ordem de magnitude até um ou até 5 vezes maior do que o valor. A menos que especificado de outra forma, o significado de “cerca de

XX” ou “aproximadamente XX” ou “que compreende substancialmente XX” usado na presente revelação se refere a um valor dentro de uma faixa de erro aceitável do valor específico “XX” (incluindo o próprio valor “XX”, bem como valores dentro de uma faixa de erro aceitável do valor conforme determinado pelos especialistas no assunto com habilidade comum na técnica).

[0080] A composição farmacêutica descrita na presente revelação tem a capacidade de atingir um efeito estável: a proteína de fusão de receptor TGF-β ou a sua composição farmacêutica retém substancialmente a estabilidade física e/ou estabilidade química e/ou atividade biológica após armazenamento; de um modo preferido, a composição farmacêutica retém substancialmente a estabilidade física e química e a sua atividade biológica após armazenamento. O prazo de validade é geralmente determinado com base no prazo de validade predeterminado da composição farmacêutica.

Atualmente, existem muitas técnicas analíticas para medir a estabilidade de ingredientes ativos, que podem medir a estabilidade após o armazenamento a uma determinada temperatura por um determinado período de tempo.

[0081] Uma preparação farmacêutica estável de anticorpo ou proteína é aquela para a qual nenhuma mudança significativa é observada nas seguintes condições: ser armazenado a uma temperatura refrigerada (2 a 8 ºC) por pelo menos 3 meses, de um modo preferido por 6 meses, de um modo mais preferido por 1 ano, e ainda de um modo mais preferido até 2 anos. Além disso, as preparações líquidas estáveis incluem preparações líquidas que exibem as características desejadas após serem armazenadas a uma temperatura (incluindo 25 ºC) por 1 mês, 3 meses, 6 meses, ou armazenadas a 40 ºC por um período de 28 dias.

[0082] Os padrões aceitáveis típicos de estabilidade são os seguintes: conforme medido por SEC-HPLC, geralmente não mais do que cerca de 10%, de um modo preferido não mais do que cerca de 5% dos ingredientes ativos (tais como proteínas, anticorpos) são degradados. Por inspeção visual, a preparação farmacêutica é líquido amarelo pálido quase incolor, límpido ou incolor, ou límpido a ligeiramente branco leitoso, ou líquido amarelo pálido quase incolor límpido. A alteração da concentração, pH e osmolalidade da preparação não é superior a ±10%. Um truncamento não superior a cerca de 10%, de um modo preferido não superior a cerca de 5% é geralmente observado. Normalmente não mais do que cerca de 10%, de um modo preferido não mais do que cerca de 5% dos agregados são formados.

[0083] O ingrediente ativo na preparação farmacêutica é considerado como “retendo sua estabilidade física”, se o anticorpo não mostrar qualquer aumento significativo na agregação, precipitação e/ou desnaturação por inspeção visual de cor e/ou clareza, ou dispersão de luz UV, tamanho cromatografia de exclusão (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS). Mudanças na conformação da proteína podem ser avaliadas por espectroscopia de fluorescência (que determina a estrutura terciária da proteína) e por espectroscopia FTIR (que determina a estrutura secundária da proteína).

[0084] O ingrediente ativo (como proteína ou anticorpo) na preparação farmacêutica é considerado como “retendo sua estabilidade química”, se o ingrediente ativo (como proteína ou anticorpo) não mostrar nenhuma alteração química significativa. Mediante a detecção e quantificação de formas quimicamente alteradas de proteínas ou anticorpos, a estabilidade química pode ser avaliada. Os processos de degradação que muitas vezes levam a uma mudança na estrutura química das proteínas incluem hidrólise ou truncamento (avaliado por métodos como cromatografia de exclusão de tamanho e SDS-PAGE), oxidação (avaliada por métodos como mapeamento de peptídeo combinado com espectrometria de massa ou MALDI/TOF/MS, etc.), desamidação (avaliada por métodos como cromatografia de troca iônica, focagem isoelétrica capilar, mapeamento de peptídeos, medição do teor de ácido isoaspártico, etc.) e isomerização (avaliada pela medição do teor de ácido isoaspártico, mapeamento de peptídeos, etc.).

[0085] Um ingrediente ativo (por exemplo, proteína ou anticorpo) “retém sua estabilidade biológica” na preparação farmacêutica, se o ingrediente ativo (por exemplo, proteína ou anticorpo), por um determinado período de tempo, exibe uma atividade biológica dentro de um intervalo predeterminado daquele quando a formulação farmacêutica é preparada. A atividade biológica de um ingrediente ativo (como uma proteína ou anticorpo) pode ser determinada, por exemplo, por ensaio de ligação ao antígeno.

[0086] Conforme usado na revelação, o código de três letras e o código de uma letra para os aminoácidos são descritos em J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968).

[0087] Como usado na presente revelação, “anticorpo” se refere à imunoglobulina, uma estrutura de cadeia de quatro peptídeos formada por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas conectadas por ligação (ou ligações) dissulfeto intercadeias.

[0088] Na presente revelação, a cadeia leve do anticorpo descrita na presente revelação compreende ainda região (ou regiões) constante da cadeia leve, que compreende uma cadeia κ, λ humana ou murina ou uma variante (ou variantes) das mesmas.

[0089] Na presente revelação, a cadeia pesada do anticorpo descrita na presente revelação compreende ainda região (ou regiões) constante da cadeia pesada, que compreende uma IgG1 humana ou murina, IgG2, IgG3, IgG4 ou variante (ou variantes) das mesmas.

[0090] No terminal N da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo, uma região de cerca de 110 aminoácidos varia amplamente, o que é conhecido como região variável (região

Fv); a sequência de aminoácidos no terminal C é relativamente estável, o que é conhecido como região constante.

A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões FR (FR) com sequência relativamente conservada.

Três regiões hipervariáveis determinam a especificidade de um anticorpo, também conhecida como região determinante de complementaridade (CDR). Cada região variável da cadeia leve (LCVR ou VL) e cada região variável da cadeia pesada (HCVR ou VH) é composta por três regiões

CDR e quatro regiões FR, organizadas do terminal amino ao terminal carboxila da seguinte forma: FR1, CDR1, FR2, CDR2,

FR3, CDR3 e FR4. Três regiões de CDR de cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três regiões de CDR de cadeia pesada se referem a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a localização dos resíduos de aminoácidos da região CDR nas regiões LCVR e HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no presente documento estão em conformidade com os critérios de numeração Kabat conhecidos (LCDR1-3, HCDR1-3),

ou estão em conformidade com os critério de numeração Kabat e Chothia; critérios de numeração de Kabat (consulte Kabat et al (1991), Sequences of Proteins of Immunological

Interest, 5ª edição, Public Health Service, National

Institutes of Health, Bethesda, MD), e critérios de numeração de Chothia (consulte Al-Lazikani et al (1997) JMB 273: 927 a 948).

[0091] O anticorpo da presente revelação envolve anticorpo murino, anticorpo quimérico e anticorpo humanizado, de um modo preferido anticorpo humanizado.

[0092] Conforme usado na presente revelação, “o anticorpo ou o fragmento de ligação do mesmo” ou “fragmento funcional” se refere ao fragmento Fab, fragmento Fab’, fragmento F(ab’)2 com atividade de ligação ao antígeno, bem como fragmento Fv, fragmento scFv de ligação ao antígeno. O fragmento Fv é o fragmento mínimo de anticorpo que compreende todos os sítios de ligação ao antígeno, o fragmento Fv compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, mas sem região (ou regiões) constante. Geralmente, o anticorpo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL para formar uma estrutura necessária para a ligação ao antígeno. Além disso, diferentes ligantes podem ser usados para conectar as regiões variáveis de dois anticorpos para formar uma cadeia polipeptídica, denominada anticorpo de cadeia simples ou Fv de cadeia simples (sFv). Conforme usado na presente revelação, o termo “ligação com PD-L1” significa a capacidade de interagir com PD-L1 humano. Conforme usado na presente revelação, o termo “sítio de ligação ao antígeno” se refere a sítios tridimensionais inconsecutivos ou consecutivos em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que reconhecem um antígeno alvo e se ligam especificamente ao antígeno.

[0093] O termo “anticorpo murino” na presente revelação se refere a anticorpo monoclonal anti-PD-L1 humano preparado de acordo com o conhecimento e habilidades na área. Durante a preparação, o indivíduo de teste é injetado com o antígeno PD-L1 e, em seguida, o anticorpo que expressa o hibridoma que tem a sequência desejada ou características funcionais é isolado.

[0094] O termo “anticorpo quimérico” é um anticorpo que é formado pela fusão da região variável de um anticorpo não humano (como murino) com a região constante do anticorpo humano, de modo a aliviar a resposta imune induzida por anticorpo não humano (como murino). Para estabelecer um anticorpo quimérico, um anticorpo monoclonal específico secretor de hibridoma é estabelecido em primeiro lugar, então os genes da região variável são clonados a partir de células de hibridoma e, então, os genes da região constante do anticorpo humano são clonados conforme desejado, os genes da região variável de anticorpo não humano (como murino) são ligados a genes da região constante humana para formar um gene quimérico que pode ser inserido em um vetor humano, e a molécula de anticorpo quimérico é finalmente expressa em um sistema industrial eucariótico ou procariótico. Em uma modalidade preferencial da presente revelação, a cadeia leve do anticorpo quimérico PD-L1 compreende ainda a região (ou regiões) constante da cadeia leve derivada da cadeia κ, λ humana ou variante (ou variantes) das mesmas. A cadeia pesada do anticorpo quimérico PD-L1 compreende ainda a região (ou regiões) constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou variante (ou variantes) das mesmas. A região (ou regiões) constante de anticorpo humano pode ser selecionada da região (ou regiões) constante da cadeia pesada derivada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou variante (ou variantes) das mesmas, de um modo preferido compreende a região constante da cadeia pesada derivada de IgG2 humana ou IgG4 ou IgG4 sem ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) devido à mutação de aminoácidos.

[0095] O termo “anticorpo humanizado”, também conhecido como anticorpo enxertado com CDR, se refere a um anticorpo gerado por sequências CDR não humanas (como murinas) enxertadas na estrutura da região variável de anticorpo humano, isto é, anticorpo gerado a partir de diferentes tipos de sequências de linha germinal humana estrutura do anticorpo. O anticorpo humanizado supera a forte resposta antianticorpo induzida pelo anticorpo quimérico que carrega uma grande quantidade de componentes não humanos (como murinos). Tais sequências estruturais podem ser obtidas a partir de banco de dados público de DNA ou referências publicadas cobrindo sequências de genes de anticorpos da linha germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linha germinativa de genes de região variável de cadeia pesada e leve humana podem ser encontradas no banco de dados de sequência de linha germinativa humana “VBase” (disponível na web www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), bem como encontradas em Kabat, EA et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Para evitar a diminuição da atividade causada pela imunogenicidade reduzida, a estrutura da região variável do anticorpo humano é submetida a uma retromutação mínima para manter a atividade. O anticorpo humanizado da presente revelação também se refere a um anticorpo humanizado que é adicionalmente obtido por exibição de fago para o propósito de maturação de afinidade de CDR.

[0096] Conforme usado na presente revelação, o termo “ADCC”, a saber, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos, se refere às células que expressam receptores Fc que matam diretamente as células alvo revestidas por um anticorpo, reconhecendo o segmento Fc do anticorpo. A função efetora ADCC do anticorpo pode ser reduzida ou eliminada pela modificação do segmento Fc de IgG. A modificação se refere a mutações na região constante da cadeia pesada do anticorpo, como mutações selecionadas do grupo que consiste em N297A, L234A, L235A em IgG1; Quimera

IgG2/4; ou mutações F234A/L235A em IgG4.

[0097] Conforme usado na presente revelação, “identidade” indica o grau de similaridade entre as sequências de dois polinucleotídeos ou dois polipeptídeos.

A identidade de sequência na presente revelação é de pelo menos 85%, 90% ou 95%, de um modo preferido pelo menos 95%.

Exemplos não limitativos incluem, sem limitação, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. A comparação e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada com o uso das configurações padrão do algoritmo BLASTN/BLASTP disponível no site do National Center For Biotechnology Institute.

[0098] O termo “receptor II de TGF-β” ou “TGFβRII” ou “receptor de fator de crescimento transformador β II” se refere a ligantes de ligação (incluindo, sem limitação, TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3), através dos quais os receptores de superfície celular desencadeiam a via de transdução de sinalização intracelular.

[0099] O termo “PD-L1” se refere ao ligante de morte programada 1, também conhecido como CD274 e B7H1. PD-L1 é uma proteína de 290 aminoácidos, que tem um domínio extracelular semelhante a IgV e IgC (aminoácidos 19-239 de PD-L1 de comprimento completo), um domínio transmembranar e um domínio intracelular de cerca de 30 aminoácidos. PD-L1 é expresso constitutivamente em muitas células, como células apresentadoras de antígeno (como células dendríticas, macrófagos e células B), bem como células hematopoiéticas e não hematopoiéticas (como células endoteliais vasculares, ilhotas pancreáticas e sítio imunologicamente privilegiado).

PD-L1 também é expresso em uma variedade de tumores e células infectadas por vírus e é um membro do meio imunossupressor (Ribas 2012, NEJM 366: 2.517 a 2.519). PD-L1 se liga a um dos dois coinibidores de células T (PD-1 e B7-1).

[00100] O “anticorpo PD-L1 ou proteína de ligação ao antígeno do mesmo” da presente revelação inclui quaisquer anticorpos anti-PD-L1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos na técnica. O anticorpo anti-PD-L1 pode ser um anticorpo PD-L1 disponível comercialmente ou foi revelado na literatura; incluindo, sem limitação, BMS- 936559, MPDL3280A, MEDI4736, MSB0010718C (consulte os documentos US2014341917, US20130034559, US8779108) e similares. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano. O fragmento de anticorpo inclui fragmento Fab, fragmento Fab’, fragmento F(ab’)2 com atividade de ligação ao antígeno e fragmento Fv e fragmento scFv que se liga ao antígeno.

[00101] Como um processo de preparação exemplificador para o anticorpo PD-L1 da presente revelação, foi publicado no pedido PCT/CN2016/104320 (publicação nº WO2017084495), o anticorpo PD-L1 compreende sequências de CDRs em regiões variáveis da cadeia pesada, conforme descrito abaixo: HCDR1: SYWMH SEQ ID NO: -1 HCDR2: RI X1PNSG X2TSYNEKFKN SEQ ID NO: 2 HCDR3: GGSSYDYFDY SEQ ID NO: 3.

[00102] Em uma modalidade alternativa, X1 é selecionado de H ou G; e X2 é selecionado de G ou F.

[00103] Em outra modalidade, um anticorpo PD-L1 exemplificador da presente revelação compreende ainda sequências de CDRs de uma região variável de cadeia leve, conforme descrito abaixo: LCDR1: RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO: 4 LCDR2: AASNLES SEQ ID NO: 5 LCDR3: QQSFEDPLT SEQ ID NO: 6.

[00104] Em outra modalidade, as regiões CDR acima são humanizadas por estratégia de enxerto de CDR e os FR de modelos de cadeia leve humanizados são IGKV7-3*01 e hjk2.1, os FR de modelos de cadeia pesada humanizados são IGHV1- 46*01 e hjh6.1, e as sequências da região variável humanizada são as seguintes:

[00105] A região variável da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 humanizado: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIX1P NSGX2TSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQ

GTTVTVSS; SEQ ID NO: 7, em que X1 é selecionado de H ou G; e X2 é selecionado de G ou F.

A região variável da cadeia leve do anticorpo PD-L1 humanizado:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYA

ASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 8;

[00106] NOTA: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4, a parte em itálico representa a sequência de FR e a parte sublinhada representa a sequência de CDR (os resíduos de aminoácidos de CDRs são determinados e denotados com base nos critérios de numeração de Kabat).

[00107] Em outra modalidade, o projeto para mutação (ou mutações) reversa no anticorpo humanizado da presente revelação é realizado e as mutações reversas projetadas são mostradas na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. Projeto de Mutação Reversa

VL VH VL.1 enxertado VH.1 enxertado VL.1A Y91F VH.1A T74K VL.1B Y91F, G72E VH.1B T74K, R72V, M48I, M70L VL.1C Y91F, G72E, T22S VH.1C T74K, R72V, M48I, M70L, R38Q VH.1D T74K, R72V, M48I, M70L, R38Q, L83F VH.1E T74K, R72V, M48I, M70L, R38Q, L83F, V68A, V79A Nota: Por exemplo, Y91F indica uma mutação reversa de

Y para F na posição 91 de acordo com a numeração natural.

“Enxertado” indica que o CDR do anticorpo murino é implantado em sequências FR de linha germinativa humana.

[00108] Novos anticorpos humanizados podem ser obtidos por várias combinações de mutação de cadeia pesada e cadeia leve mostradas na Tabela 1.

[00109] Em outro aspecto da revelação, é fornecida uma modalidade para construir um clone humanizado, como segue: Os primers foram desenhados e fragmentos do gene VH/VK de cada anticorpo humanizado foram construídos por PCR e, em seguida, inseridos no vetor de expressão pHr (tendo o peptídeo sinal e o fragmento do gene da região constante (CH1-Fc/CL)) para realizar recombinação homóloga, a fim de para construir um vetor de expressão de anticorpo de comprimento total: VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr.

[00110] 1. Projeto de Primer: O software online DNAWorks (v3.2.2) (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) foi usado para projetar múltiplos primers para a síntese de VH/VK que compreende fragmentos de genes necessários para recombinação: peptídeo sinal 5'-30pb + VH/VK + 30pb CH1/CL-3'.

[00111] 2. Splicing de fragmento: De acordo com os manuais para o primer STAR GXL DNA polimerase de TaKaRa, com o uso dos primers projetados acima, VH/VK que compreende fragmentos de genes necessários para recombinação foi obtido por amplificação por PCR em duas etapas.

[00112] 3. Construção e digestão enzimática do vetor de expressão pHr (que tem o fragmento de peptídeo sinal e gene de região constante (CH1-FC/CL)): O vetor de expressão pHr (que tem o fragmento de peptídeo sinal e gene de região constante (CH1-FC/CL)) foi projetado e construído com o uso de alguma endonuclease de restrição especial, como BsmBI que reconhece a característica distintiva entre a sequência e o sítio de restrição. O vetor foi digerido com o uso de BsmBI e, então, os fragmentos digeridos foram extraídos com o uso de gel e armazenados para uso.

[00113] 4. Construção recombinante do vetor de expressão VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr

[00114] VH/VK que compreende fragmentos de genes necessários para recombinação e vetor de expressão pHr (que tem o fragmento de peptídeo sinal e gene de região constante (CH1-Fc/CL)) que foi digerido com BsmBI foram adicionados em células competentes DH5H a uma razão de 3:1, incubado a 0 ºC em gelo por 30 min, submetido a choque térmico a 42 ºC por 90 s, 5 volumes de meio LB foram adicionados e, então, incubado a 37 ºC por 45 min, então semeado em placa LB-Amp,

cultivado a 37 ºC de um dia para o outro. O clone único foi escolhido para sequenciação e foi obtido um clone de interesse.

[00115] 5. O plasmídeo foi construído de acordo com o projeto no presente exemplo, então a proteína purificada foi expressa e a afinidade da proteína obtida foi medida pela detecção descrita no Exemplo SPR.

[00116] 6. Finalmente, a afinidade do mutante (ou mutantes) humanizado de mutação reversa ou anticorpos de hibridoma para PD-L1-his humano foi medida por BIACORE, os sítios de mutação reversa humanizados e combinações de sequências obtidas a partir da triagem são as seguintes:

[00117] A região variável da cadeia pesada do anticorpo PD-L1:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPN

SGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGT TVTVSS SEQ ID NO: 9; em que HCDR2 é como mostrado em RIGPNSGFTSYNEKFKN SEQ ID NO: 10, isto é, X1 em SEQ ID NO: 7 é G, e X2 em SEQ ID NO: 7 é F; A região variável da cadeia leve do anticorpo PD-L1:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYA

ASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 11; NOTA: A ordem é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, a parte em itálico representa a sequência de FR e a parte sublinhada representa a sequência de CDR (os resíduos de aminoácidos de CDRs são determinados e denotados com base nos critérios de numeração de Kabat).

[00118] Em outro aspecto da presente revelação, é fornecida uma modalidade para construir e expressar um anticorpo do tipo IgG4 humano anti-PD-L1, e ainda é fornecido um anticorpo PD-L1 usado para a construção da proteína de fusão. O anticorpo PD-L1 também pode ser usado como uma molécula de controle nos Exemplos de Teste da presente revelação.

[00119] Uma vez que PD-L1 também é expresso em células T ativadas, portanto, o uso de regiões constantes de IgG1 de tipo selvagem pode causar efeitos mediados por Fc (como ADCC e CDC), que podem resultar na redução de células T ativadas.

A presente revelação selecionou IgG4 mutado para obter anticorpos sem ADCC e CDC. O clone obtido por maturação de afinidade foi convertido no tipo IgG4, e a região central de dobradiça de IgG4 compreende a mutação S228P (correspondendo à posição 227 na sequência natural de SEQ ID NO: 12). F234A (correspondendo à posição 233 na sequência natural de SEQ ID NO: 12) e mutação L235A (correspondendo à posição 234 na sequência natural de SEQ ID NO: 12) foram posteriormente introduzidas (mAbs 4:3, 310-318; maio/junho de 2012). Ao mesmo tempo, a fim de evitar a quebra ocorrida no terminal

C da cadeia pesada do anticorpo quando o peptídeo ligante (que é usado para ligar o domínio extracelular TGF-βRII) foi introduzido, K na posição final da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 foi ainda mutado para A (correspondendo à última posição na sequência natural de SEQ ID NO: 12), de modo a aumentar a estabilidade da proteína de fusão. A sequência de anticorpo PD-L1 da presente revelação usada para a construção da proteína de fusão é a seguinte: cadeia pesada do anticorpo PD-L1: IgG4 (AA) (S228P)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPN SGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGA SEQ ID NO: 12; NOTA: A parte sublinhada é a sequência da região variável da cadeia pesada e a parte não sublinhada é a sequência da região constante da cadeia pesada (a parte em itálico é o sítio de mutação); cadeia leve do anticorpo PD-L1:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYA ASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 13; NOTA: A parte sublinhada é a sequência da região variável da cadeia leve e a parte não sublinhada é a sequência da região constante da cadeia leve.

[00120] Conforme usado na presente revelação, uma proteína de fusão descrita na presente revelação é um produto de proteína obtido pela coexpressão de dois genes por meio da tecnologia de recombinação de DNA. Os métodos para produzir e purificar anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados (por exemplo, em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, capítulos 5 a 8 e 15). Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com PD-L1 humano ou fragmentos dos mesmos, e os anticorpos resultantes podem então ser renovados, purificados e sequenciados para sequências de aminoácidos com o uso de métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. O anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente revelação são projetados para enxertar CDRs derivados de anticorpos não humanos em um ou mais FRs humanos. Alinhando com o banco de dados da linha germinativa da região variável do anticorpo humano IMGT usando o software MOE, as sequências da linha germinativa da estrutura humana podem ser obtidas no site da ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr, ou no The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351.

[00121] Os anticorpos projetados ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente revelação podem ser preparados e purificados com o uso de métodos conhecidos.

Por exemplo, sequências de cDNA que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e projetadas em um vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina projetado pode, então, ser transfectado de forma estável em células CHO. Como um método mais recomendado conhecido na técnica, o sistema de expressão de mamífero resultará na glicosilação do anticorpo, tipicamente em locais N-terminais altamente conservados na região Fc. Os clones estáveis podem ser obtidos pela expressão de um anticorpo que se liga especificamente a PD-L1 humano. Os clones positivos podem ser expandidos em meio de cultura sem soro para a produção de anticorpos em biorreatores. O meio de cultura, para o qual o anticorpo foi segregado, pode ser purificado por técnicas convencionais. Por exemplo, o meio pode ser carregado em uma coluna de Proteína A ou G Sepharose FF que foi equilibrada com um tampão compatível. A coluna é lavada para remover componentes de ligação não específicos.

O anticorpo ligado é eluído por gradiente de pH e as frações de anticorpo são detectadas por SDS-PAGE e, então, coletadas.

O anticorpo pode ser filtrado e concentrado com o uso de técnicas comuns. O agregado solúvel e os multímeros podem ser eficazmente removidos por técnicas comuns, incluindo exclusão de tamanho ou troca iônica. O produto pode ser congelado imediatamente, por exemplo a -70 ºC, ou pode ser liofilizado.

[00122] A “molécula imunomoduladora” da presente revelação pode ser usada para atenuar a tolerância imunológica das células cancerosas. A presente revelação usa uma forma truncada do domínio extracelular TGF-βRII como a molécula imunomoduladora na proteína de fusão. O “receptor II de TGF-β (TGF-βRII)” liga-se aos ligantes TGF-β1 e TGF- β3 com alta afinidade. O complexo TGF-β RII/TGF-β recruta TGF-β RI para formar um complexo de transdução de sinal (Won et al, Cancer Res. 1999; 59: 1273-7). O domínio extracelular de TGF-βRII é um peptídeo de 136 resíduos de aminoácidos do terminal N de TGF-βRII extracelular, um exemplo exemplificador do qual é mostrado na SEQ ID NO: 14. Outras variantes com cerca de 136 aminoácidos de comprimento e derivadas do domínio extracelular de TGF-βRII humano, que têm a capacidade de se ligar a TGF-β1 e TGF-β3, também pertencem ao domínio extracelular de TGF-βRII da revelação.

A presente revelação revelou que a estrutura e função da forma truncada consecutiva do terminal N do domínio extracelular TGF-βRII é mais estável do que aquela da molécula não truncada. Uma proteína de fusão que compreende a forma N-terminal não truncada do domínio extracelular TGF- βRII (um polipeptídeo mostrado como aa.1-136 de SEQ ID NO: 14) é suscetível de ser quebrada. Em particular, o domínio extracelular de TGF-β RII que é truncado por menos de 26 aminoácidos consecutivos do terminal N é mais estável; de um modo preferido, o domínio extracelular TGF-β RII que é truncado por 14-26, e de um modo mais preferido, truncado por 14-21 aminoácidos consecutivos do terminal N, tem um nível de expressão mais alto; e com a maior preferência, truncado por 19 ou 21 aminoácidos consecutivos.

[00123] O termo “proteína de fusão de receptor TGF- β” é uma proteína de fusão que compreende o receptor TGF-β.

Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor TGF- β da presente revelação é a proteína de fusão do receptor TGF-β descrita no pedido de patente internacional PCT/CN2018/086451 (WO 2018205985A1). O conteúdo completo do documento WO 2018205985A1 está totalmente incorporado na presente revelação. Em algumas modalidades, a proteína de fusão do receptor TGF-β é uma proteína de fusão de domínio extracelular de anticorpo PD-L1/domínio extracelular TGF- βRII (armadilha de PD-L1/TGF-β), com o domínio extracelular de TGF-βRII servido como parte de molécula imunomoduladora de proteína de fusão, o anticorpo PD-L1 é servido como a parte de direcionamento da proteína de fusão, o domínio extracelular TGF-βRII (por exemplo, mostrado como SEQ ID NO: 14, 15, 16 ou 17) é conectado ao terminal C (também conhecido como extremidade carboxila) da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 por uma sequência de ligante (por exemplo (G4S)XG, x é 3-6), para formar uma sequência de fusão, e a sequência de fusão é conectada com a cadeia leve do anticorpo PD-L1 através de ligação (ou ligações) dissulfeto intercadeia para formar a proteína de fusão de armadilha de PD-L1/TGF-β, finalmente, a estrutura é mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, a proteína de fusão de receptor TGF-β é a proteína de fusão descrita na Tabela 2 do Exemplo 1 da revelação.

[00124] O termo “ligante” ou “sequência ligante” se refere a uma sequência de peptídeo de conexão usada para conectar domínios de proteína, geralmente com um certo grau de flexibilidade, e o uso de ligantes não levará à perda da função original do domínio de proteína. Em algumas modalidades da presente revelação, a sequência de ligação é (G4S)xG, em que x é 3-6, por exemplo, a sequência de ligação é um polipeptídeo, como: (G4S)3G, (G4S)4G, (G4S)5G ou (G4S)6G.

[00125] “Modificação conservadora” ou “substituição ou recolocação conservadora” se refere a substituições de aminoácidos em uma proteína por outros aminoácidos com características similares (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade,

conformação e rigidez da estrutura principal, etc.), de modo que as mudanças possam ser realizadas frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. Os especialistas no assunto da técnica reconhecem que, em geral, a substituição de um único aminoácido em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (consulte, por exemplo, Watson et al.

(1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p224 (4a edição)). Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente similares têm menos probabilidade de interromper a atividade biológica.

[00126] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou situação que se segue pode ocorrer, mas não necessariamente, e a descrição inclui as instâncias em que o evento ou circunstância ocorre ou não ocorre. Por exemplo, “que compreende opcionalmente 1-3 regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo” significa que a região variável da cadeia pesada do anticorpo com sequência específica pode estar presente, mas não necessariamente.

[00127] “Administração”, “administrar” e “tratamento”, conforme se aplicam a um animal, ser humano, indivíduo experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, se referem ao contato de um agente farmacêutico, terapêutico, diagnóstico exógeno ou composição para o animal, ser humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico. “Administração”, “administrar” e “tratamento” podem referir-se a, por exemplo, métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento de uma célula envolve colocar um reagente em contato com uma célula, bem como colocar um reagente em contato com um fluido, em que o fluido está em contato com a célula. “Administração”, “administrar” e “tratamento” também significam tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou por outra célula.

“Administração” ou “tratamento”, conforme se aplica a um indivíduo humano, veterinário ou de pesquisa, se refere a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, para aplicações de pesquisa e diagnóstico.

[00128] “Tratar” significa administrar um agente terapêutico, como uma composição da presente revelação, interna ou externamente, a um indivíduo com um ou mais sintomas de doença para os quais o agente tem atividade terapêutica conhecida. Tipicamente, o agente é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar um ou mais sintomas da doença no indivíduo ou na população a ser tratada, para induzir a regressão ou prevenir a progressão de tal sintoma (ou sintomas) em um grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer sintoma de doença particular (também referida como a “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade e peso do indivíduo, e a capacidade de o agente para provocar uma resposta desejada no indivíduo. Se um sintoma de doença foi aliviado pode ser avaliado por qualquer medição clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde qualificados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão do sintoma. Embora uma modalidade da presente revelação (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) possa não ser eficaz no alívio do sintoma (ou sintomas) da doença alvo em cada indivíduo, a mesma deve aliviar o sintoma (ou sintomas) da doença alvo em um número estatisticamente significativo de indivíduos conforme determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como o teste t de Student, o teste do qui-quadrado, o teste U de acordo com Mann e Whitney, o teste de Kruskal- Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e o teste de Wilcoxon.

[00129] “Quantidade eficaz” abrange uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal da condição médica. Quantidade efetiva também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um determinado indivíduo ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores, como a condição a ser tratada, a condição geral de saúde do indivíduo, a via e dosagem de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dosagem máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

[00130] “Valor de Tm” se refere a uma temperatura na qual ocorre a desnaturação térmica de uma proteína, isto é, a temperatura na qual metade da proteína é desdobrada. Nesse momento, a estrutura espacial da proteína é destruída.

Portanto, quanto maior o valor de Tm, maior a estabilidade térmica da proteína.

[00131] “Substituição” se refere a uma substituição do sistema de solvente que dissolve a proteína do anticorpo.

Por exemplo, o sistema de alto teor de sal ou solvente hipertônico que compreende a proteína do anticorpo é substituído com o uso de operação física contra um sistema tampão para preparação estável, de modo que a proteína do anticorpo possa estar presente na preparação estável. A operação física inclui, sem limitação, ultrafiltração, diálise ou reconstituição após centrifugação.

Descrição Detalhada da Invenção

[00132] Doravante no presente documento, a presente revelação é ainda descrita com referência a exemplos, exemplos de teste ou exemplos de preparação. No entanto, os exemplos, exemplos de teste ou exemplos de preparação são apenas para fins ilustrativos, o escopo da presente revelação não se limita aos mesmos.

[00133] Nos exemplos, exemplos de teste ou exemplos de preparação da presente revelação, em que condições específicas não são descritas, os mesmos são geralmente conduzidos sob condições convencionais ou sob condições propostas pelos fabricantes do material ou produto. Quando a fonte dos reagentes não é especificamente indicada, os reagentes são reagentes convencionais disponíveis comercialmente.

Exemplos Exemplo 1: Clonagem e Expressão de Armadilha de Proteína de Fusão PD-L1/TGF-β

[00134] O domínio extracelular TGF-βRII (comprimento total ou forma truncada de SEQ ID NO: 14) foi usado como a porção para a molécula imunomoduladora na proteína de fusão, e o anticorpo PD-L1 é usado como uma porção de direcionamento da proteína de fusão para formar um anticorpo PD-L1/proteína de fusão de domínio extracelular TGF-βRII (Armadilha PD- L1/TGF-β).

[00135] Foi surpreendentemente constatado que a forma truncada do domínio extracelular TGF-βRII é relativamente estável, especialmente mais estável após ser truncada por menos de 26 aminoácidos de seu terminal N, de um modo preferido, nível de expressão mais alto e estrutura mais estável são obtidos após ser truncado por 14-26 aminoácidos,

de um modo mais preferido sendo truncado por 14-21 aminoácidos consecutivos do terminal N, e de um modo mais preferido sendo truncado por 14, 19 ou 21 aminoácidos consecutivos do terminal N.

[00136] As sequências dos exemplos não limitativos do domínio extracelular TGF-βRII e sua forma truncada na presente revelação são as seguintes: Sequência do domínio extracelular TGF-βRII: ECD (1-136)

IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSIC EKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMC

SCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 14; Sequência de domínio extracelular de TGF-β RII, com uma truncação ou deleção de 19 aminoácidos no terminal N: ECD (20-136)

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENIT LETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNT

SNPD SEQ ID NO: 15; Sequência de domínio extracelular de TGF-β RII, com uma truncação ou deleção de 21 aminoácidos no terminal N: ECD (22-136)

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLE TVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSN PD

SEQ ID NO: 16; Sequência de domínio extracelular de TGF-β RII, com uma truncação ou deleção de 14 aminoácidos no terminal N: ECD (15-136)

VTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKN DENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFS

EEYNTSNPD SEQ ID NO: 17.

[00137] Como um exemplo, o aminoácido C-terminal da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 da presente revelação (um anticorpo PD-L1, em que a cadeia pesada é mostrada como SEQ ID NO: 12, e cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 13) foi ligado ao domínio extracelular TGF-βRII com comprimentos variados pelo ligante (G4S)xG (x é 3-6), pela técnica de recombinação homóloga, e foi convencionalmente expresso no sistema de expressão 293 juntamente com a cadeia leve do anticorpo PD-L1, e as proteínas de fusão obtidas são mostradas na Tabela 2: Tabela 2. Proteína de Fusão de Anticorpo PD-L1/Domínio Extracelular TGF-βRII o número de aminoácidos Proteína de Descrição da consecutivos Fusão sequência deletados no terminal

N Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (1- Sem deleção fusão 1 136) Proteína de Ab-(G4S)3G-ECD (15- 14 o número de aminoácidos Proteína de Descrição da consecutivos Fusão sequência deletados no terminal

N fusão 2 136) Proteína de Ab-(G4S)3G-ECD (15- 14 fusão 3 136, N19A) Proteína de Ab-(G4S)3G-ECD (20- 19 fusão 4 136) Proteína de Ab-(G4S)3G-ECD (22- 21 fusão 5 136) Proteína de Ab-(G4S)3G-ECD (27- 26 fusão 6 136) Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (15- 14 fusão 7 136) Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (15- 14 fusão 8 136, N19A) Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (20- 19 fusão 9 136) Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (22- 21 fusão 10 136) Proteína de Ab-(G4S)4G-ECD (27- 26 fusão 11 136) Proteína de Ab-(G4S)5G-ECD (15- 14 fusão 12 136) Proteína de Ab-(G4S)5G-ECD (15- 14 fusão 13 136, N19A) Proteína de Ab-(G4S)5G-ECD (20- 19 fusão 14 136) Proteína de Ab-(G4S)5G-ECD (22- 21 fusão 15 136) Proteína de Ab-(G4S)5G-ECD (27- 26 fusão 16 136) Proteína de Ab-(G4S)6G-ECD (27- 26 fusão 17 136)

[00138] Nota: Ab representa o anticorpo PD-L1 da presente revelação (a cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO:

12, e cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 13); ECD (n-136) na Descrição da Sequência representa a forma de comprimento total ou truncada do domínio extracelular de TGF-βRII; n representa o número inicial de aminoácidos após truncamento do domínio extracelular TGF-βRII. A estrutura da proteína de fusão da presente revelação é mostrada na Figura 1; N19A indica que o aminoácido na posição 19 do domínio extracelular TGF-βRII de comprimento total (SEQ ID NO: 14) é mutado de N para A.

[00139] A sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo PD-L1, a sequência de nucleotídeos que codifica o domínio extracelular TGF-βRII e a sequência de nucleotídeos do fragmento de proteína de ligação ((G4S)xG) foram obtidas por técnica convencional na técnica. O nucleotídeo C- terminal do anticorpo PD-L1 foi ligado através da proteína ligante ao N-terminal nucleotídeo do domínio extracelular TGF-βRII com comprimento diferente por técnica de recombinação homóloga e, então, clonado no vetor Phr-BsmbI.

A armadilha PD-L1/TGF-β recombinante foi expressa em células 293 e purificada conforme descrito no Exemplo 2. A proteína purificada pode ser usada nos experimentos dos exemplos seguintes.

Exemplo 2: Purificação de Proteína de Fusão de Armadilha PD-L1/TGF-β

[00140] O meio de cultura celular foi centrifugado em alta velocidade, o sobrenadante foi coletado e a primeira etapa de purificação foi realizada por cromatografia de afinidade. O meio cromatográfico é a Proteína A ou enchimento derivado que interage com Fc, como o Mabselect da GE. A tampão de equilíbrio era 1×PBS (137 mmol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 10 mmol/l Na2HPO4, 2 mmol/l KH2PO4, pH 7,4). Depois de equilibrar os volumes da coluna de 5×, o sobrenadante da célula foi carregado para ligação e a taxa de fluxo foi controlada de modo que a amostra foi deixada permanecer na coluna por ≥ 1 min. Após o carregamento da amostra, a coluna foi lavada com 1×PBS (pH 7,4) até a absorção de UV A280 ser reduzida à linha de base. Então, a coluna foi lavada com tampão de eluição de glicina 0,1 M (pH 3,0) e o pico eluído foi coletado de acordo com o pico de absorção de UV A280, e a amostra eluída coletada foi neutralizada com Tris 1 M (pH 8,5).

[00141] A amostra eluída neutralizada foi concentrada por ultrafiltração e, então, submetida a cromatografia de exclusão por tamanho, o tampão era 1×PBS e a coluna era XK26/60 Superdex 200 (GE). A taxa de vazão foi controlada a 4 ml/min, o volume de carga foi inferior a 5 ml e o pico da proteína alvo foi agrupado de acordo com a absorção de UV A280. A pureza da proteína coletada era maior do que 95%, conforme identificado por SEC-HPLC, e foi verificada por LC- MS. A amostra verificada foi dividida em alíquotas para uso.

A armadilha PD-L1/TGF-β foi obtida.

[00142] O desempenho e o efeito benéfico da proteína de fusão de armadilha de PD-L1/TGF-β na presente revelação são verificados por métodos de teste bioquímico conforme indicado abaixo.

Exemplo de Teste (Avaliação Biológica in Vivo, in Vitro) Exemplo de Teste 1: Detecção ELISA in vitro de Armadilha PD-L1/TGF-β que se Liga a TGF-β1

[00143] O processo de detecção é descrito a seguir: a. Placas de 96 poços foram revestidas com 100 μl/poço de TGF-β1 humano (8915LC, CST) a uma concentração de 1 μg/ml a 4 ºC de um dia para o outro.

b. Lavagem 3 vezes com 250 μl de 1×PBST, 250 μl de PBS de leite a 5% foram adicionados para bloqueio a 37 ºC por 2 horas.

c. Lavagem 3 vezes com 250 μl de 1×PBST, diluições de gradiente de armadilha de PD-L1/TGF-β foram adicionadas e a armadilha de TGF-β foi usada como controle positivo e incubada por 1 hora a 37 ºC.

d. Lavagem 3 vezes com 250 μl 1×PBST.

e. 100 μl de Anticorpo Fc anti-humano-HRP (1:4.000) foram adicionados a cada poço e incubado por 40 minutos a 37 ºC.

f. 100 μl de TMB foram adicionados a cada poço, incubados por 10 minutos em temperatura ambiente, e a reação foi interrompida pela adição de 100 μl de H2SO4 1M.

g. A absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de microplaca e os dados foram analisados pelo Graphpad Prism

5.

[00144] Os resultados da ligação das proteínas de fusão ao TGF-β1 humano in vitro são mostrados nas Figuras 2 e 3. O ELISA mostrou que a proteína de fusão 1 na Tabela 2 não reteve a atividade de ligação ao TGF-β1 humano. A análise de espectrometria de massa mostrou que a proteína de fusão 1 (isto é, a forma não truncada do domínio extracelular TGF- βRII (1-136)) era instável e foi facilmente quebrada na cadeia pesada TGF-βRII, e o controle positivo tem o mesmo defeito. As proteínas de fusão que compreendem a forma truncada do terminal N do domínio extracelular de TGFβRII, como proteínas de fusão 7, 9, 10, 12-15, ligam-se especificamente ao TGF-β1 humano.

Exemplo de Teste 2: Detecção ELISA in vitro de Armadilha PD-L1/TGF-β que se Liga a PD-L1

[00145] Antígeno usado para detecção: PD-L1-His

FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEE DLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVN APYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKL FNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNEREQKLISEEDLH HHHHH

[00146] SEQ ID NO: 18.

[00147] O processo de detecção é descrito a seguir: a. Placas de 96 poços foram revestidas com 100 μl/poço de PD-L1-His humano (SEQ ID NO: 18) a uma concentração de 5 μg/ml a 4 ºC de um dia para o outro.

c. Lavagem 3 vezes com 250 μl de 1×PBST, diluições de gradiente de armadilha PD-L1/TGF-β e anticorpo PD-L1 como controle positivo foram adicionados e incubados por 1 hora a 37 ºC.

d. Lavagem 3 vezes com 250 μl 1×PBST.

e. 100 μl de Anticorpo-Fc anti-humano-HRP (1:4.000) foi adicionado em cada poço e incubado por 40 minutos a 37 ºC.

5.

[00148] Os resultados da ligação das proteínas de fusão da presente revelação ao PD-L1 humano in vitro são mostrados na Figura 4. O ELISA mostrou que todas as proteínas de fusão retiveram a atividade de ligação ao PD-L1 humano.

Exemplo de Teste 3: Detecção de Bloqueio de Via PD-

1/PD-L1 in vitro

1. Propósito de Teste: A fim de investigar o efeito de bloqueio da armadilha de PD-L1/TGF-β na via de sinalização de PD-1/PD-L1, o experimento de bloqueio de anticorpo baseado em células foi realizado em células portadoras de moléculas receptoras de PD-1 e PD-L1 humanas que eram construídos pelo Promaga, respectivamente.

2. Amostras de Teste Anticorpo PD-L1 com cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 12, e cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 13; Controle 1 (20T-Fc): ECD (20-136) -Fc, uma proteína de fusão que compreende ECD de fragmento de domínio extracelular de TGF-βRII truncado (20-136) e Fc, e a sequência é a seguinte:

GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENIT LETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNT SNPDAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSS IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN

YKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 19; Controle 2 (22T-Fc): ECD (22-136) -Fc, uma proteína de fusão de ECD de fragmento de domínio extracelular de TGF-

βRII truncado (22-136) e Fc, e a sequência é a seguinte:

VKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLE TVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSN PDAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 20; Proteína de fusão do receptor TGF-β preparada no Exemplo 1 da presente revelação: a proteína de fusão 9, proteína de fusão 15: Na proteína de fusão 9, a sequência do peptídeo de fusão da cadeia pesada do anticorpo PD-L1- (G4S) 4G-TGF-β RII ECD (20-136) é a seguinte:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPN SGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVC

HDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO: 23;

NOTA: A fonte regular é a sequência da cadeia pesada do anticorpo PD-L1, o itálico é a sequência do ligante e o sublinhado é a sequência do fragmento truncado ECD (20-136) da região extracelular TGF-βRII.

[00149] A sequência da cadeia leve do anticorpo PD- L1 na proteína de fusão 9 é a seguinte:

KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 13; A sequência do peptídeo de fusão da cadeia pesada do anticorpo PD-L1- (G4S) 5 G-TGF-β RII ECD (22-136) na proteína de fusão 15 é a seguinte:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGRIGPN SGFTSYNEKFKNRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSSYDYFDYWGQGT TVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSR LTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLE

TVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSN PD SEQ ID NO: 24;

NOTA: A fonte regular é a sequência da cadeia pesada do anticorpo PD-L1, o itálico é a sequência do ligante e o sublinhado é a sequência do fragmento truncado ECD (22-136) da região extracelular TGF-βRII.

[00150] A sequência da cadeia leve do anticorpo PD- L1 na proteína de fusão 15 é a seguinte:

DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYA ASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEAEDTANYYCQQSFEDPLTFGQGTKLEIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 13; IgG humana: controle branco, imunoglobulina humana obtida a partir de soro humano normal misto por purificação com o uso de um método de cromatografia de afinidade convencional, como Proteína A; Controle positivo (FP17022): proteína de fusão de anticorpo PD-L1 2/domínio extracelular TGF-βRII; A sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo PD-L1 2 na proteína de fusão FP17022:

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVS NRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQP KANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQS

NNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO:21; A sequência de aminoácidos do peptídeo de fusão do domínio extracelular do anticorpo PD-L1 2 de cadeia pesada/TGF-βRII (1-136) na proteína de fusão FP17022:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPS GGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICE

KPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCS CSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD SEQ ID NO:22;

3. Processo de Teste Células CHO/PD-L1 (CS187108, Promega) foram digeridas e ressuspensas em meio completo de Mistura de Nutrientes F- 12 (Ham). A densidade celular foi ajustada para 4×105/ml com o uso de meio completo de acordo com os resultados da contagem de células. A suspensão de células foi transferida para o tanque de carregamento, adicionada à placa de 96 poços a 100 μl/poço com o uso de uma pipeta multicanal e incubada a 37 ºC, incubadora de 5% de CO2 por 20 a 24 h; A suspensão de células Jurkat/PD-1 (CS187102, Promega) foi preparada no dia seguinte, e as células foram ressuspensas de acordo com os resultados da contagem de células com o uso de meio de ensaio, e a densidade celular foi ajustada para 1,25×106/ml; As placas de cultura de células que compreendem células CHO/PD-L1 foram retiradas da incubadora, 95 μl da solução de cultura foram retiradas por poço com o uso de uma pipeta multicanal e a proteína de fusão diluída em gradiente, anticorpo PD-L1 e cocontrole positivo (FP17022) foram adicionados respectivamente a 40 μl/poço. Então, a suspensão de células Jurkat/PD-1 foi transferida para um tanque de carregamento, adicionada à placa de cultura de células a 40 μl/poço e incubada a 37 ºC, 5% de CO2 por 5 a 6 h. Durante a incubação com proteína, o reagente Bio-GloTM foi retirado e deixado retornar à temperatura ambiente. As placas de cultura de células foram retiradas e colocadas em temperatura ambiente por 5 a 10 min. Então, 40 μl de reagente Bio-GloTM foram adicionados a cada poço, incubados em um gabinete de segurança por 5 a 10 min, e o valor do sinal de quimioluminescência foi lido com o uso de um leitor de microplaca multifuncional.

4. Resultados

[00151] Como mostrado na Figura 5, de forma similar à molécula de controle positivo, a proteína de fusão 9 da presente revelação teve a capacidade de bloquear efetivamente a ligação de células Jurkat que expressam PD-1 a células CHO/PD-L1, e havia uma concentração de fármaco e efeito dependente da dose. A Proteína de fusão 15 tem a mesma capacidade de bloqueio da proteína de fusão 9.

Exemplo de Teste 4: Detecção de afinidade e cinética de ligação in vitro pela Biacore

[00152] A afinidade da molécula de teste para TGF-β1 humano ou murino ou proteína PD-L1 humana foi determinada por Biacore T200 (GE). O procedimento experimental é descrito a seguir: Uma certa quantidade de armadilha PD-L1/TGF-β foi capturada com o chip de Proteína A e, então, o TGF-β1 humano ou murino (8915LC, CST) ou PD-L1 humano (Sino Biological) fluiu através da superfície do chip. O sinal de reação foi detectado em tempo real com o uso de Biacore para obter as curvas de associação e dissociação. O biochip foi, então, lavado e regenerado com ácido clorídrico glicina (pH 1,5, GE). A solução tampão usada na experiência foi o tampão HBS- EP (GE). Os dados experimentais foram ajustados ao modelo de Langmuir (1:1) com o uso do software BIAevaluation versão

4.1 (GE), e os valores de afinidade foram obtidos e conforme mostrado na Tabela 3.

Tabela 3: Afinidade de Proteínas de Fusão da Presente Revelação para TGF-β1 ou PD-L1 humano in Vitro Proteína de Amostra de ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) fusão* afinidade Proteína de fusão TGF-β1 1,73E7 7,28E-4 4,22E-11 9 Humano Proteína de fusão 2,69E7 6,08E-4 2,26E-11 15

Proteína de Amostra de ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) fusão* afinidade Proteína de fusão TGF-β1 4,33E7 1,33E-3 3,07E-11 9 murino Proteína de fusão 3,57E7 1,22E-3 3,42E-11 15 Proteína de fusão PD-L1 1,97E6 1,24E-4 6,31E-11 9 humano Proteína de fusão 2,00E6 1,24E-4 6,10E-11 15 * A forma da proteína de fusão é mostrada na Tabela 2.

[00153] A atividade de ligação da proteína de fusão é mostrada na Tabela 3. Os resultados indicam que a proteína de fusão 9 e a proteína de fusão 15 da presente revelação têm afinidade extremamente elevada para TGF-β1 humano, murino e PD-L1 humano.

Exemplo de Teste 5: Ensaio de Inibição de gene Repórter SMAD3

1. Propósito de Teste:

[00154] Nesse experimento, o elemento de ligação Smad3 (SBE) com o gene repórter de luciferase foi expresso em células HepG2 para estudar o efeito inibitório da armadilha de PD-L1/TGF-β na ativação de Smad3 induzida por TGF-β1 e a atividade de Armadilha PD-L1/TGF-β in vitro foi avaliada de acordo com o valor IC50.

2. Amostras de Teste: Proteína de Fusão 9, Controle Positivo (FP17022).

3. Processo de Teste

[00155] As células HepG2 foram cultivadas em meio completo MEM (GE, SH30243.01) que compreende FBS a 10% e subcultivadas a cada 3 dias. No primeiro dia do experimento,

25.000 células por poço foram inoculadas em placas de 96 poços (Corning, 3903) e cultivadas a 37 ºC, 5% de CO2 por 24 horas. No dia seguinte, o meio nas placas de cultura de células foi descartado e 100 ng de plasmídeo 3TP-Lux foram transfectados por poço. As células foram posteriormente cultivadas a 37 ºC, 5% de CO2 por 24 horas. Seis horas antes da adição da amostra de teste, o meio completo na placa de 96 poços foi descartado e 80 μl de meio incompleto (MEM + 0,5% FBS) foram adicionados a cada poço. Após 6 horas, 10 μl de solução de TGF-β1 humano (R&D, 240-B-010) preparada em meio incompleto (concentração final de 2 ng/ml) e 10 μl da amostra de teste (a concentração final é 500, 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005, 0,0005 e 0 nM) foram adicionados, o solvente TGF-β1 humano foi usado como um controle e as células foram cultivadas a 37 ºC, 5% de CO2 por mais 18 h. Em seguida, 100 μl do sistema de ensaio de luciferase ONE-GloTM do substrato de luciferase preparado (promega, E6110) foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro e, então, o valor de sinal luminescente foi lido com o uso de um leitor de multiplaca Victor 3 (Perkin Elmer). O valor IC50 da amostra de teste foi obtido por cálculo com o uso do software de dados Graphpad Prism

5.0.

[00156] A Figura 6 mostrou que a proteína de fusão 9 inibiu a atividade do repórter pSMAD3 induzida por TGFβ de uma maneira dependente da dose e teve eficácia e IC50 (concentração necessária para inibir 50% da atividade máxima) comparável ao do controle positivo FP17022. Os resultados do teste do anticorpo PD-L1 mostraram que ele não teve efeito inibitório (IC50>500 nM).

Exemplo de Teste 6: Detecção in vitro de secreção de IFNɣ por PBMC devido à estimulação da tuberculina (TB)

1. Propósito de Teste

[00157] Para investigar a ativação de linfócitos T por armadilha PD-L1/TGF-β, células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram coletadas e purificadas e foram estimuladas in vitro com tuberculina (TB) por 5 dias para detectar o nível de secreção de IFNγ citocina.

2. Amostras de Teste IgG Humano; anticorpo PD-L1; Proteína de fusão 9; Controle 1 (20T-Fc): ECD (20-136)-Fc; anticorpo PD-L1+controle 1 (20T-Fc).

3. Processo de Teste

[00158] 20 μl de tuberculina foram adicionados a PBMCs recentemente isoladas e purificadas, 15 ml, cerca de 3×107, e cultivados em uma incubadora por 5 dias a 37 ºC, 5% de CO2.

No dia 6, as células cultivadas foram coletadas e centrifugadas, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em meio fresco com a densidade ajustada para 1×106 células/ml, 90 μl de células ressuspensas foram adicionados à placa de 96 poços. 10 μl/poço de diferentes concentrações de anticorpos foram adicionados separadamente aos poços correspondentes da placa de cultura de células de 96 poços acima, 10 μl de PBS foi adicionado no grupo de controle e em branco, respectivamente. Em seguida, a placa de cultura de células foi incubada na incubadora por três dias a 37 ºC, 5% de CO2. A placa de cultura de células foi retirada e o sobrenadante foi retirado de cada poço após centrifugação (4.000 rpm, 10 min). Após diluição de 10 vezes, a secreção de IFN- foi detectada por ELISA (kit de detecção de IFN-γ humano, NEOBIOSCIENCE, EHC 102g.96), de acordo com as instruções do reagente para operações específicas. Conforme mostrado na Tabela 4, todas as amostras de proteína de fusão de armadilha de PD-L1/TGF-β tiveram a capacidade de aumentar a secreção de citocina IFN-γ pelos linfócitos T ativados e houve um efeito de dose de concentração de fármaco.

Tabela 4. O Resultado da Secreção da Citocina IFN-ɣ

Secreção Secreção Dobra EC50 máxima de mínima de Anticorpo (secreção (nM) IFNɣ IFNɣ de IFNɣ) (pg/ml) (pg/ml) anticorpo PD-L1 0,05 2.684 737 3,6 Proteína de fusão 0,12 3.422 638 5,4 9 Controle 1(20T- >50 780 490 1,6 Fc) anticorpo PD-L1 + 0,054 2.879 746 3,9 controle 1 IgG Humano >50 375 298 1,2 Controle branco / 536 536 -1

4. Resultado

[00159] Conforme mostrado na Figura 7 e na Tabela 4, a proteína de fusão 9 teve a capacidade de aumentar o linfócito T ativado para secretar citocina IFN-ɣ de maneira dependente da dose e teve um efeito de ativação mais forte do que o do anticorpo PD-L1 e 20T-FC.

Exemplo de Teste 7: Avaliação Farmacocinética

[00160] Três ratos SD, fêmeas, foram adquiridos da Jie Si Jie Laboratory Animal Co., Ltd. e mantidos em ciclo claro-escuro de 12/12 horas (a temperatura era de 24±3 ºC, a umidade relativa era de 50 a 60%), os ratos tiveram livre acesso a água e dieta. No dia do experimento, ratos SD foram injetados com proteína de fusão na veia da cauda a uma dose de 6 mg/kg e um volume de injeção de 5 ml/kg.

[00161] O sangue foi coletado no momento: 15 min, 7 h (no primeiro dia), 24 h (2º dia), 3º dia, 4º dia, 6º dia, 8º dia, 10º dia e 15º dia após a administração, 200 μl de sangue

(equivalente a 100 μl de soro) foram retirados da veia do fundo do rato. A amostra de sangue foi colocada em temperatura ambiente por 30 min para permitir a aglutinação e, então, centrifugada a 10.000 g por 10 min a 4 ºC. O sobrenadante foi retirado e armazenado a -80 ºC imediatamente. A concentração da proteína de fusão no soro foi medida por ELISA.

[00162] O processo de medição é descrito a seguir: a. Placas de 96 poços foram revestidas com 100 μl/poço de PD-L1-His humano a uma concentração de 2 μg/ml, de um dia para o outro a 4 ºC.

b. Lavagem 4 vezes com 250 μl de 1×PBST, 250 μl de PBS de leite a 5% foram adicionados para bloqueio a 37 ºC por 3 horas.

c. Lavagem 4 vezes com 250 μl de 1×PBST, 100 μl da amostra de soro diluída em gradiente foram adicionados e incubados a 37 ºC por 1 hora, com a proteína de fusão 9 servindo como controle positivo.

d. Lavagem 5 vezes com 250 μl 1×PBST.

e. 100 μl/poço de anticorpo anti-TGF-βRII humano biotinilado (R&D) foram adicionados e incubados por 1 hora a 37 ºC.

f. Lavagem 5 vezes com 250 μl 1×PBST.

g. 100 μl/poço de TMB foram adicionados, incubados por 10 minutos em temperatura ambiente, e a reação foi interrompida pela adição de 100 μl de H2SO4 1M.

h. A absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de microplaca e os dados foram analisados pelo Graphpad Prism

5.

Tabela 5: T1 / 2 de Proteína de Fusão em Rato SD Modo de Fármaco de teste T1/2 (Média ± SD, h) administração Proteína de fusão IV (6 mg/kg) 236±10 9

[00163] Os resultados da análise de PK indicaram que a meia-vida da proteína de fusão 9 da presente revelação em ratos foi de cerca de 236 h (9,8 dias), consulte a Tabela 5.

Exemplo de Teste 8: Efeito da Armadilha PD-L1/TGF-β no Xenoenxerto Subcutâneo Murino de Câncer de Mama Humano MDA- MB-231

[00164] A cepa murina usada nesse experimento foi um camundongo fêmea NOD/SCID (Cavens). As células mononucleares de sangue periférico humano usadas no experimento foram extraídas de sangue recém-coletado e o método de extração foi o seguinte: O sangue venoso anticoagulado com heparina foi misturado com o mesmo volume de PBS contendo 2% de FBS e, após a mistura, 25 ml do sangue diluído foram adicionados lentamente a um tubo de centrífuga contendo 15 ml de solução de separação de linfócitos e centrifugados a 1.200 g por 10 minutos em temperatura ambiente. A camada de linfócitos foi pipetada para outro tubo de centrifugação; as células foram lavadas por PBS e centrifugadas a 300 g durante 8 minutos à temperatura ambiente. Após repetido uma vez, as células foram ressuspensas em meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS, e as células foram adicionadas a uma placa de 6 poços pré- revestida com anticorpo CD3 (OKT3, 40 ng/ml) a 2×106 células/poço (2 ml) e, então, colocadas em uma incubadora a 37 ºC por 4 dias.

[00165] Amostras de teste: controle branco: PBS proteína de fusão 9: 4,8 mpk; proteína de fusão 9: 24 mpk; anticorpo PD-L1: 4 mpk; anticorpo PD-L1: 20 mpk; anticorpo PD-L1 4 mpk + controle 1 (20T-Fc) 2,14 mpk; Controle 1 (20T-Fc): 2.14 mpk.

[00166] As células MDA-MB-231 foram ressuspensas em meio RPMI-1640 sem soro e misturadas com um volume igual de Matrigel, 100 μl (2,3×106) foram inoculadas por via subcutânea no flanco direito de camundongos NOD/SCID. 11 dias depois, os animais com tumor sobredimensionado ou subdimensionado foram excluídos, os camundongos foram randomizados em grupos, com 9 animais em cada grupo. 5×105 PBMCs estimulados (60 μl) foram injetados nos tecidos tumorais e os PBMCs restantes foram posteriormente cultivados sem estimulação. Uma semana depois, 5×106 PBMCs (100 μl) foram injetados intraperitonealmente em camundongos com tumor, como a primeira rodada de injeção. Ao longo do período experimental, 2 voltas e meia, um total de 5 injeções de PBMC foram fornecidas. No dia da primeira injeção intratumoral, a administração intraperitoneal foi realizada, três vezes por semana para um total de 14 administrações. O regime de administração foi mostrado na Tabela 6. O volume do tumor e o peso corporal foram medidos duas vezes por semana. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela

7. No final do experimento, os camundongos com tumor foram sacrificados e o tumor foi removido e pesado.

Tabela 6: Agrupamento de Teste e administração Grupo Dose de Administração Controle branco: PBS 0 Proteína de fusão 9- 4,8 mpk 4,8 mg/kg Proteína de fusão 9- 24 mpk 24 mg/kg PD-L1antibody- 4 mpk 4 mg/kg anticorpo PD-L1 – 20 mpk 20 mg/kg Anticorpo PD-L1 – 4 mpk+controle 4 mg/kg +2,14 mg/kg 1- 2,14 mpk Controle 1- 2,14 mpk 2,14 mg/kg Tabela 7: Efeito de Proteína de Fusão 9 no Xenoenxerto Subcutâneo Murino de MDA-MB-231

Dia 0 Dia 25 Dia 32 Dia 33

P Médio Médio % Médio ± % Médio Grupo (vs ± SEM ± SEM de SEM de ± SEM PBS)

TGI TGI (V mm3) (V mm3) (V mm3) (TW g) (TW) 0,859 Controle 62,5±2 623,4 ± - 941,1 ± - ± - branco: PBS ,9 43,3 54,9 0,063 0,454 Proteína de 414,6 ± 2,06 62,6±3 37, 618,9 ± 36, ± fusão 9- 17,1** E - ,5 24% 28,7*** 68% 0,025* 4,8mpk * 05 ** 0,367 Proteína de 62,7 329,8 ± 2,20 ± 52, 495,3 ± 50, ± fusão 9- 3,3 22,5** E - 38% 42,6*** 76% 0,026* 24mpk * 06 ** 0,592± Anticorpo 63,1±3 454,4± 30, 722,8± 24, 0,00 0,052* PD-L1 - 4mpk ,5 40,8* 24% 65,8* 91% 50 * 0,650± Anticorpo 62,6±3 466,4± 28, 741,8± 22, 0,01 0,033* PD-L1 - 20mpk ,3 17,2** 01% 32,9** 70% * 00 Anticorpo 0,566± PD-L1 - 62,6±3 447,5± 31, 669,2± 30, 0,039* 0,00 4mpk+controle ,3 29,6** 38% 45,3** 96% * 12 1-2,14mpk Controle 1 - 60,7±3 601,5± 3,5 861,7± 8,8 0,652± 0,01 2,14mpk ,3 30,9 8% 34,2 3% 0,041* 78 Dia 0: horário da primeira administração; *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001, quando comparado com PBS pelo teste t de Student.

[00167] Os resultados são mostrados na Figura 8, a proteína de fusão de anticorpo 9 (4,8 mg/kg, 24 mg/kg) pode inibir significativamente o crescimento de xenoenxerto subcutâneo murino de câncer de mama humano MDA-MB-231. Houve uma relação dependente da dose entre doses altas e baixas, e foi superior ao anticorpo PD-L1 do fármaco de referência (4 mg/kg, 20 mg/kg), molécula de controle TGF-βRII 20T-FC (2,14 mg/kg) e o grupo de combinação (anticorpo PD-L1 -4 mg/kg + 20 T-FC - 2,14 mg/kg) na dose molar equivalente, respectivamente. Cada dose de proteína de fusão 9 manteve um efeito antitumoral desejado desde o 14º dia após a administração; quando comparado com o anticorpo-20 mpk PD- L1, a proteína de fusão 9 em alta dose teve uma vantagem óbvia (p<0,05). No 25o dia após a administração, o efeito antitumoral de cada anticorpo atingiu um nível ótimo. A taxa antitumoral da dose baixa e alta de proteína de fusão 9 e anticorpo PDL-1 e o grupo de combinação foi de 37,24%, 52,38%, 30,24%, 28,01% e 31,38%, respectivamente. No 32o dia após a administração, o efeito antitumoral da proteína de fusão 9 ainda era muito significativo. O percentual de TGI do grupo de baixa e alta dose foi de 36,68% e 50,76%, respectivamente, e o volume do tumor foi estatisticamente diferente, quando comparado ao grupo controle (p <0,05).

Exemplo de Teste 9: Estabilidade Física da Armadilha PD-L1/TGF-β

[00168] Esse exemplo de teste foi usado para detectar a estabilidade da proteína de fusão 9 e da proteína de fusão

15.

[00169] DSC (Calorimetria de Varredura Diferencial)

foi usado para detectar a estabilidade térmica de diferentes anticorpos, e a estabilidade em diferentes sistemas tampão foi comparada. Os sistemas tampão compreendem acetato 10 mM/NaCl 135 mM (pH 5,5) e acetato 10 mM/trealose 9% (pH 5,5).

[00170] A amostra foi dissolvida nos tampões correspondentes e a concentração foi controlada a cerca de 50 mg/ml. A detecção foi realizada por MicroCal* VP-Capillary DSC (Malvern). Antes do teste, cada amostra e tampão em branco foram desgaseificados por 1 a 2 min com o uso de um dispositivo de desgaseificação a vácuo. Cada poço da placa foi adicionado com 400 μl de amostra ou tampão em branco (a quantidade de carga foi de 300 μl). Finalmente, dois pares de placas de poços foram adicionados com 14% Decon 90 e ddH2O, respectivamente, e estavam prontos para lavar. A amostra foi carregada na placa e, então, a placa foi vedada com uma tampa de plástico. A varredura começou com uma temperatura de 25 ºC e terminou em 100 ºC, e a taxa de varredura é 60 ºC/h. Os resultados são apresentados na Tabela 8, indicando que tanto a proteína de fusão 9 como a proteína de fusão 15 apresentam boa estabilidade térmica nesses dois sistemas de teste.

Tabela 8. Teste de Estabilidade Térmica Tm-início Amostra Tampão TM (ºC) (ºC) Proteína acetato 10 mM/NaCl 135 57,99 66,33 de fusão 9 mM

Tm-início Amostra Tampão TM (ºC) (ºC) acetato 10 mM/9% 58,64 67,83 trealose acetato 10 mM/NaCl 135 Proteína 57,33 66,17 mM de fusão 15 acetato 10 mM/9% 57,41 67,44 trealose

[00171] A estabilidade periódica em certa concentração foi investigada monitorando a pureza via SEC- HPLC, condições exemplificadoras, por exemplo, a concentração da amostra foi controlada em cerca de 50 mg/ml, em acetato 10 mM/NaCl 135 mM (pH 5,5), e a estabilidade foi comparada sob condições como 5 ciclos de congelamento e descongelamento a -80 ºC versus após armazenamento a 40 ºC por um mês. A coluna de HPLC Xbridge protein BEH SEC 200A (Waters) foi usada para a detecção. Os resultados são apresentados na Tabela 9 a seguir, essas duas proteínas de fusão mostraram boa estabilidade.

Tabela 9. Estabilidade proteína de fusão proteína de fusão 9(△%) 15(△%) 40 ºC 3,39% 1,8% -80 ºC congelamento- 1,44% 1,39% descongelamento Nota: △% indica a taxa de mudança.

Exemplo de Teste 10: Estabilidade Química de Proteína de Fusão

[00172] A desamidação é uma modificação química comum que influenciará a estabilidade do anticorpo em um estágio posterior, especialmente é geralmente escolhida para evitar ou reduzir a modificação altamente desamidada de alguns aminoácidos nas regiões CDR tanto quanto possível por meio de mutação. O anticorpo de 1.600 µg a ser testado foi dissolvido em 200 µl de acetato 10 mM/NaCl 135 mM (pH 5,5) e colocado em incubadora a 40 ºC. As amostras foram retiradas nos dias 0, 14 e 28 para o ensaio de hidrólise enzimática.

100 µg de cada amostra retirada em diferentes pontos de tempo foram dissolvidos em 100 µl de His-HCl 0,2 M, solução de Gua-HCl 8 M, pH 6,0; Adicionou-se 3µl 0,1 g/ml de DTT e, então, a amostra foi incubada em banho-maria a 50 ºC por 1 hora. Em seguida, a amostra foi ultrafiltrada duas vezes com His-HCl 0,02 M (pH 6,0) e digerida de um dia para o outro a 37 ºC em banho-maria pela adição de 3 µl de 0,25 mg/ml de tripsina. A modificação de desamidação foi examinada com o uso de um Agilent 6530 Q-TOF LC-MS e os resultados são mostrados na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10. Modificação de Desamidação Cadeia Sítio de Amostra Dia 0 Dia 14 Dia 28 pesada modificação Proteína de Cadeia N314 2,38% 2,28% 2,45% fusão 9 pesada N324 0,20% 3,60% 7,88% Proteína de Cadeia N314 2,87% 2,86% 2,87%

Cadeia Sítio de Amostra Dia 0 Dia 14 Dia 28 pesada modificação fusão 15 pesada N324 0,00% 3,61% 7,93%

[00173] Nota: N representa a asparagina modificada detectável e o número representa a posição na cadeia leve ou cadeia pesada do terminal N. O conteúdo percentual representa a proporção de modificação de desamidação detectada por LC- MS para o sinal de todos os peptídeos naquele sítio.

[00174] Os resultados da espectrometria de massa mostraram que as duas proteínas de fusão não têm sítios de modificação de desamidação óbvios, sugerindo que as proteínas de fusão têm boa estabilidade química.

Exemplo de Preparação Processos de Preparação Exemplificadores para Composição Farmacêutica de Proteína de Fusão (Preparação)

[00175] A primeira etapa: uma certa quantidade de solução estoque de proteína de fusão de receptor de TGF-β purificada foi tomada, e a substituição de solvente (de um modo preferido por ultrafiltração) foi realizada com o uso de um tampão livre de proteína (tal como tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, pH 6,2) passando através de uma membrana de ultrafiltração por pelo menos 6 vezes o volume, então a proteína foi concentrada a cerca de 70 mg/ml.

Um certo volume de solução estoque de sacarose foi adicionado e misturado para atingir uma concentração final de sacarose de 80 mg/ml. Um certo volume de solução estoque de Tween-80 foi adicionado e misturado para atingir uma concentração final de Tween-80 de 0,4 mg/ml. Adicionou-se tampão citrato 10 mM pH 6,2 para atingir um volume especificado de modo a obter uma concentração de 50 mg/ml de proteína (outras preparações a serem testadas ou preparações estáveis foram preparadas de acordo com etapas similares).

[00176] Após ter sido filtrado, o produto foi amostrado para teste de esterilidade devido ao propósito de controle do meio. A solução estoque passou por um filtro de PVDF de 0,22 μm e o filtrado foi coletado.

[00177] A segunda etapa: o volume de enchimento foi ajustado para 6,3 ml, o filtrado foi carregado em um frasco de 6 ml, que foi então tampado com uma rolha, e as amostras foram retiradas no início, no meio e no final do enchimento a fim de detectar a diferença no volume de enchimento, devido ao propósito de controle do meio.

[00178] A terceira etapa: a máquina de nivelamento foi iniciada, as tampas de alumínio foram tampadas.

[00179] A quarta etapa: a inspeção visual foi realizada para confirmar que o produto não apresenta defeitos como carregamento impreciso. As etiquetas foram impressas e etiquetadas em frascos; etiquetas de papelão foram impressas, embalagens foram dobradas, carregadas com frascos e etiquetadas.

Exemplo de Preparação 1. Triagem do valor de pH para o Sistema de Tampão de Preparação da Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00180] As preparações da proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foram preparadas com o uso dos seguintes tampões, com uma concentração de proteína de 50 mg/ml: 1) histidina-ácido acético 10 mM, pH 5,0; 2) histidina-ácido acético 10 mM, pH 6,0; 3) histidina-ácido acético 10 mM, pH 6,5; 4) di-hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 10 mM, pH 7,0; 5) di-hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 10 mM, pH 7,5.

[00181] Cada preparação foi filtrada e adicionada a 1,2 ml/frasco em um frasco de injeção de 2 ml fabricado de vidro de borosilicato neutro. O frasco de injeção foi fornecido com uma rolha, tampado e vedado. As amostras foram retiradas e submetidas a uma temperatura elevada de 40 ºC e experimentos de agitação. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 11. Os resultados mostram que as proteínas de fusão do receptor TGF-β têm melhor estabilidade em pH 6,0 a 6,5.

Tabela 11. Resultados de Triagem do Experimento de Degradação Forçada

SEC (%) Ponto no No Aparência fragment tempo agregado monômero o opalescência T0 2,0 97,1 1,0 forte com -1 agitação turvo 3,5 94,8 1,7 D7 límpido e 40 ºC M2 8,1 87,1 4,7 incolor opalescência T0 2,7 97,0 0,3 azul claro com 2 agitação turvo 3,0 96,2 0,9 D7 límpido e 40 ºC M2 5,9 91,1 3,0 incolor límpido e T0 2,7 96,9 0,3 incolor grande com quantidade de 3 agitação 3,0 95,7 1,3 precipitado D7 floculento límpido e 40 ºC M2 5,0 91,7 3,3 incolor incolor e T0 partículas 3,1 96,5 0,5 finas grande com 4 quantidade de agitação 3,6 95,3 1,2 precipitado D7 floculento límpido e 40 ºC M2 4,5 71,5 23,9 incolor incolor e T0 partículas 3,2 96,5 0,4 finas 5 grande com quantidade de agitação 3,7 95,0 1,3 precipitado D7 floculento límpido e 40 ºC M2 4,9 60,8 34,3 incolor Nota: A condição de agitação era: D1: 130 rpm, D2: 200 rpm, D3-D7: 300 rpm; D significa dia, T significa tempo e M significa mês.

Exemplo de Preparação 2 Triagem do Sistema Tampão para Preparações de Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00182] As preparações da proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foram preparadas com o uso dos seguintes tampões, com uma concentração de proteína de 50 mg/ml: 1) ácido succínico-succinato de sódio 10 mM, pH 6,0; 2) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, pH 6,0; 3) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, pH 6,5; 4) di-hidrogenofosfato de sódio-hidrogenofosfato dissódico 10 mM, pH 6,5; 5) cloridrato de histidina 10 mM, pH 6,5.

[00183] Cada preparação foi filtrada e adicionada a 1,2 ml/frasco em um frasco de injeção de 2 ml de vidro de borosilicato neutro. O frasco de injeção foi fornecido com uma rolha, tampado e vedado. As amostras foram retiradas para o experimento de agitação (a 25 ºC, 300 rpm). Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 12. Os resultados mostram que uma grande quantidade de pequenas partículas foi observada no grupo do di-hidrogenofosfato- hidrogenofosfato dissódico no 6º dia sob agitação, sendo que os agregados atingiram 1,8% detectados por SEC. No entanto, apenas partículas minúsculas foram ocasionalmente observadas em outros grupos. Pode-se observar que a estabilidade da proteína de fusão do receptor de TGF-β em sistemas tampão de ácido cítrico, histidina e succinato é melhor do que em sistemas tampão de fosfato.

Tabela 12. Resultados do Experimento de Triagem para Sistema Tampão e Valor de pH SEC (%) Ponto no No Aparência agrega monôme fragme tempo do ro nto D0 límpido e incolor 1,6 98,1 0,3 -1 partículas com minúsculas 1,7 97,7 0,6 agitação D6 ocasionalmente D0 límpido e incolor 1,5 98,0 0,5 2 partículas com minúsculas 1,5 97,8 0,7 agitação D6 ocasionalmente D0 límpido e incolor 1,6 98,0 0,4 3 partículas com minúsculas 1,7 97,7 0,6 agitação D6 ocasionalmente D0 límpido e incolor 1,6 98,0 0,4 4 grande quantidade de com partículas 1,8 97,6 0,7 agitação D6 minúsculas D0 límpido e incolor 1,5 98,0 0,5 5 partículas com minúsculas 1,6 97,8 0,7 agitação D6 ocasionalmente

Nota: D representa dias.

Exemplo de Preparação 3 Triagem Adicional do Sistema Tampão para Preparação de Proteína de Fusão do Receptor TGF- β

[00184] Um tampão de pH 6,2 que compreende histidina- cloridrato 10 mM ou ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM foi usado para preparar uma preparação que compreende 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80, proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9) a uma concentração de 50 mg/ml.

[00185] Cada preparação foi filtrada e adicionada a 1,2 ml/frasco em um frasco de injeção de 2 ml fabricado de vidro de borosilicato neutro. O frasco de injeção foi fornecido com uma rolha, tampado e vedado. As amostras foram armazenadas a 25 ºC para análise de estabilidade, SEC de 6 meses ou detecção de CE-SDS não redutor.

[00186] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 13. Os resultados mostram que o sistema de ácido cítrico-citrato de sódio é melhor do que o sistema de histidina-cloridrato (agregado M6 SEC: 1,8% v.s. 2,2%; CE- SDS não redutor: 94,5% v.s. 92,2%); Assim, o sistema de ácido cítrico pode ser selecionado como o sistema tampão para a proteína de fusão do receptor TGF-β.

Tabela 13. Resultados do Teste de Estabilidade

Acelerada para Triagem do Sistema Tampão a 25 ºC SEC (%) Sistema CE-SDS não Tempo Aparência agreg monôm fragme tampão redutor (%) ado ero nto T0 límpido 1,6 97,6 0,7 91,2 D24 límpido 1,6 97,7 0,7 90,4 M2 límpido 1,7 97,5 0,8 N/A sistema M3 límpido 1,8 97,9 0,3 96,2 tampão de citrato grande quantidade M6 de 1,8 97,9 0,4 94,5 partículas turvas T0 límpido 1,5 97,7 0,8 91,3 D24 límpido 1,6 97,4 1,1 90,4 M2 límpido 1,7 97,5 0,8 N/A sistema tampão de M3 límpido 1,8 97,7 0,5 95,4 sal de grande histidina quantidade M6 de 2,2 97,3 0,5 92,2 partículas turvas Nota: T significa tempo; D significa dia; M significa mês.

Exemplo de Preparação 4 Triagem de Estabilizadores para Preparações de Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00187] As preparações da proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foram preparadas com o uso dos seguintes tampões de diferentes sacarídeos, com uma concentração de proteína de 50 mg/ml: 1) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, 80 mg/ml de sacarose, pH 6,2; 2) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, 80 mg/ml α, α- trealose di-hidratada, pH 6,2.

[00188] Cada preparação foi filtrada e adicionada a 1,2 ml/frasco em um frasco de injeção de 2 ml fabricado de vidro de borosilicato neutro. O frasco de injeção foi fornecido com uma rolha, tampado e vedado. As amostras foram retiradas para experimentos de armazenamento de longo prazo em temperatura ambiente de 25 ºC e em temperatura baixa de 2 a 8 ºC.

[00189] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 14. Os resultados mostram que a sacarose e a trealose têm efeitos similares na estabilidade da proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9). A sacarose foi selecionada como o estabilizador da proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9). Quando a concentração de sacarose é de 80 mg/ml, a pressão osmótica é de cerca de 300 mosm/kg que está próxima de ser isotônica, portanto a concentração de sacarose pode ser de 80 mg/ml.

Tabela 14. Resultados de Experimentos de Triagem para Tipos de Sacarídeo SEC (%) CE-SDS não Ponto no No Aparência agre monôm fragm redutor tempo gado ero ento (%) límpido e -1 T0 1,6 97,6 0,7 91,2 incolor

SEC (%) CE-SDS não Ponto no No Aparência agre monôm fragm redutor tempo gado ero ento (%) grande quantidade 25 ºC M6 de 1,8 97,9 0,4 94,5 partículas turvas 2 a 8 ºC límpido e 1,7 98,1 0,1 96,8 M6 incolor T0 límpido 1,6 97,7 0,7 91,6 partículas turvas 25 ºC M6 1,9 97,8 0,3 94,1 2 significati vas 2 a 8 ºC límpido e 1,8 97,8 0,4 97,5 M6 incolor Nota: T significa tempo e M significa mês.

Exemplo de Preparação 5 Triagem de Tensoativos para Preparações de Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00190] As preparações da proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foram preparadas com o uso dos seguintes tampões de diferentes tipos de tensoativos em diferentes concentrações, com uma concentração de proteína de 50 mg/ml: 1) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 20 0,1 mg/ml, pH 6,2; 2) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 20 0,2 mg/ml, pH 6,2; 3) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 20 0,4 mg/ml, pH 6,2;

4) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 20 0,6 mg/ml, pH 6,2; 5) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 20 0,8 mg/ml, pH 6,2; 6) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 80 0,1 mg/ml, pH 6,2; 7) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 80 0,2 mg/ml, pH 6,2; 8) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 80 0,4 mg/ml, pH 6,2; 9) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 80 0,6 mg/ml, pH 6,2; 10) cloridrato-histidina 10 mM, polissorbato 80 0,8 mg/ml, pH 6,2.

[00191] Cada preparação foi filtrada, 0,5 ml da preparação foram injetados em 50 ml de injeção de soro fisiológico ou em solução de injeção de glicose a 5%, para atingir uma concentração de proteína de 0,5 mg/ml após a diluição. A estabilidade da amostra após diluição foi observada. Os resultados do experimento são mostrados na Tabela 15. Os resultados mostram que quando a concentração de polissorbato 20 na preparação atingiu mais de 0,2 mg/ml, as partículas insolúveis diminuíram significativamente após a diluição; quanto ao polissorbato 80, as partículas insolúveis produzidas pela diluição do cloreto de sódio diminuíram com o aumento da concentração do polissorbato 80.

Quando o polissorbato 80 atingiu 0,4 mg/ml ou mais, as partículas maiores do que 10 μm foram reduzidas para menos do que 10 partículas/ml.

Tabela 15. Resultados da Triagem de Polissorbato - Experimento de Diluição e Agitação Partículas insolúveis após diluição (partículas/ml) No 0,9% NaCl 5% Glicose 2 μm 10 μm 25 μm 2 μm 10 μm 25 μm -1 1.454 18 0 318 10 0 2 48 -1 0 104 2 0 3 65 2 0 177 3 0 4 26 -1 0 102 -1 0 5 112 3 0 82 2 0 6 568 36 -1 46 -1 0 7 668 14 0 30 -1 0 8 135 3 0 92 4 0 9 623 8 0 30 -1 0 10 113 2 0 97 6 0 Exemplo de Preparação 6. Triagem Adicional de Tensoativos para Preparações de Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00192] As preparações da proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foram preparadas com o uso dos seguintes tampões de diferentes tipos de tensoativos, com uma concentração de proteína de 50 mg/ml: 1) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 6,2; 2) ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, 0,6 mg/ml de polissorbato 20, pH 6,2.

[00193] Cada preparação foi filtrada e adicionada a 1,2 ml/frasco em um frasco de injeção de 2 ml fabricado de vidro de borosilicato neutro. O frasco de injeção foi fornecido com uma rolha, tampado e vedado. As amostras foram retiradas para experimentos de armazenamento de longo prazo em temperatura baixa de 2 a 8 ºC.

[00194] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 16. Os resultados indicam que o polissorbato 80 tem um melhor efeito de estabilidade na proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9). Portanto, o polissorbato 80 foi selecionado como tensoativo para a proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9).

Tabela 16. Resultados do Experimento de Estabilidade de Longo Prazo a 2 a 8 ºC para Triagem de Polissorbato Ponto SEC (%) CE-SD não No no Aparência agreg monôm fragme redutor (%) tempo ado ero nto límpido e T0 1,6 97,6 0,7 91,2 incolor límpido e D45 1,7 97,4 1,0 N/A incolor -1 límpido e M3 1,8 98,0 0,3 97,4 incolor límpido e M6 1,7 98,1 0,1 96,8 incolor 2 T0 límpido e 1,6 97,8 0,6 91,7

Ponto SEC (%) CE-SD não No no Aparência agreg monôm fragme redutor (%) tempo ado ero nto incolor grande quantidade D45 1,7 97,5 0,8 N/A de partículas grande quantidade M3 1,8 97,9 0,3 97,5 de partículas grande quantidade M6 de 1,7 97,8 0,4 96,7 partículas e turvas Nota: T significa tempo, D significa dia e M significa mês.

Exemplo de Preparação 7. Teste de Compatibilidade de Membrana de Filtro para Preparações de Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00195] A proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9) foi formulada a 50 mg/ml em tampão ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80, pH 6,2. As preparações passaram por uma membrana de filtro PES de 0,22 μm e uma membrana de filtro de PVDF, respectivamente, e as amostras foram coletadas no início, no meio e no final do teste.

[00196] Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 17. A análise do teor de proteína, aparência e pureza mostram que a proteína de fusão do receptor TGF-β (proteína de fusão 9) era estável durante o contato com a membrana do filtro, e a preparação era compatível com as membranas de filtro PES e PVDF.

Tabela 17. Resultados do Teste de Compatibilidade com Membranas de Filtro Concentr % de SEC Teor de % de CE- Membrana de ação de polisorb SDS não filtro proteína agreg monôm fragm ato ado ero ento redutor mg/ml mg/ml T0 50,8 0,8 98,9 0,3 98,1 0,46 PES, filtrado 51,4 0,9 98,9 0,2 98,0 0,46 primário PES, filtrado 49,8 0,9 98,9 0,3 98,0 0,46 médio PES, filtrado 50,0 0,9 98,9 0,2 98,0 0,46 final PVDF, filtrado 49,6 0,9 98,7 0,4 97,9 0,46 primário PVDF, filtrado 50,2 0,9 98,8 0,3 98,0 0,46 médio PVDF, filtrado 50,0 0,9 98,8 0,3 97,9 0,45 final Nota: T representa tempo.

Exemplo de Preparação 8. Liofilização da Preparação da Proteína de Fusão de Receptor TGF-β

[00197] A preparação da proteína de fusão de receptor

TGF-β (proteína de fusão 9) que compreende uma concentração de 50 mg/ml de proteína de fusão de receptor TGF-β (proteína de fusão 9), 80 mg/ml de sacarose e 0,4 mg/ml de polissorbato 80 foi preparada com um pH 6,2 tampão que compreende ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM. O anticorpo foi adicionado a 6,3 ml/frasco em um frasco de 20 ml e colocado em um congelador para secagem por congelamento.

[00198] Os procedimentos de liofilização incluem pré- congelamento, secagem primária e secagem secundária. Uma vez que o processo de liofilização terminou, o frasco foi rolhado sob vácuo. As amostras foram reconstituídas e foi realizada uma comparação entre antes e depois da liofilização. Os resultados mostram que a solução reconstituída pode manter um desempenho favorável ao preparo da solução.

Tabela 18. Etapas de Liofilização das Preparações Ajuste de Parâmetros de grau de vácuo temperatura liofilização (mBar) (ºC) 5 N/A pré-congelamento -45 N/A secagem primária -27 0,1 25 0,1 secagem secundária 25 0,01 Exemplo de Preparação 9. Outras Composições de Preparação Opcionais

[00199] Além disso, a presente revelação também fornece outras preparações de preparações farmacêuticas de proteína de fusão de receptor de TGF-β (proteína de fusão

9):

(1) 70 mg/ml de proteína de fusão 9, 75 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 20 mM, o pH final é 6,4;

(2) 80 mg/ml de proteína de fusão 9, 85 mg/ml de sacarose, 0,5 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 15 mM, o pH final é 6,2;

(3) 60 mg/ml de proteína de fusão 9, 90 mg/ml de sacarose, 0,6 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 5 mM, o pH final é 6,2;

(4) 30 mg/ml de proteína de fusão 9, 60 mg/ml de sacarose, 0,3 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 30 mM, o pH final é 6,3;

(5) 90 mg/ml de proteína de fusão 9, 95 mg/ml de sacarose, 0,2 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 6,0;

(6) 100 mg/ml de proteína de fusão 9, 70 mg/ml de sacarose, 0,1 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 25 mM, o pH final é 6,5;

(7) 50 mg/ml de proteína de fusão 9, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 7,0;

(8) 50 mg/ml de proteína de fusão 9, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 7,5;

(9) 50 mg/ml de proteína de fusão 9, 80 mg/ml de sacarose, 0,4 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 5,0;

(10) 60 mg/ml de proteína de fusão 9, 70 mg/ml de sacarose, 0,5 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 15 mM, o pH final é 5,5;

(11) 40 mg/ml de proteína de fusão 9, 80 mg/ml de sacarose, 0,5 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 6,2;

(12) 55 mg/ml de proteína de fusão 9, 75 mg/ml de sacarose, 0,3 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 5 mM, o pH final é 6,0;

(13) 65 mg/ml de proteína de fusão 9, 90 mg/ml de sacarose, 0,7 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 30 mM, o pH final é 7,5;

(14) 70 mg/ml de proteína de fusão 9, 75 mg/ml de sacarose, 0,8 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 30 mM, o pH final é 7,0;

(15) 50 mg/ml de proteína de fusão 9, 80 mg/ml de sacarose, 0,8 mg/ml de polissorbato 80 e tampão de ácido cítrico-citrato de sódio 10 mM, o pH final é 7,0.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: uma proteína de fusão do receptor TGF-β, e um tampão, em que o tampão é selecionado do grupo que consiste em um tampão de sal de histidina, um tampão de succinato e um tampão de citrato.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que: o tampão de sal de histidina é um tampão de ácido clorídrico-histidina, o tampão-succinato é um tampão succinato de sódio-ácido succínico, o tampão de citrato é um tampão de ácido cítrico-citrato de sódio; de um modo preferido, o tampão é um tampão de ácido cítrico-citrato de sódio;

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, de um modo preferido cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, com a maior preferência cerca de 10 mM.

4. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a concentração da proteína de fusão do receptor TGF-β é de cerca de 0,5 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de um modo preferido cerca de 30 mg/ml a cerca de 70 mg/ml, com a maior preferência cerca de 50 mg/ml.

5. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o pH da composição farmacêutica é cerca de 5,0 a cerca de 7,5, de um modo preferido cerca de 6,0 a cerca de 6,5, com a maior preferência cerca de 6,2.

6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que: a composição farmacêutica compreende ainda um sacarídeo, de um modo preferido, o sacarídeo é selecionado do grupo que consiste em: uma trealose e uma sacarose, com a maior preferência, o sacarídeo é uma sacarose.

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a concentração do sacarídeo é de cerca de 50 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, de um modo preferido cerca de 60 mg/ml a cerca de 90 mg/ml, com a maior preferência cerca de 80 mg/ml.

8. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que:

a composição farmacêutica compreende ainda um tensoativo, de um modo preferido, o tensoativo é um polissorbato, de um modo mais preferido, o tensoativo é um polissorbato 80,

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a concentração do tensoativo é de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml, de um modo preferido cerca de 0,4 mg/ml a cerca de 0,8 mg/ml, de um modo mais preferido cerca de 0,4 mg/ml.

10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende: cerca de 0,5 mg/ml a cerca de a proteína de fusão de 100 mg/ml receptor TGF-β, cerca de 5 mM a cerca de 30 mM tampão citrato, cerca de 50 mg/ml a cerca de sacarose, e 100 mg/ml cerca de 0,1 mg/ml a cerca de polissorbato 80; 0,8 mg/ml de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a cerca de 7,5; de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5; de um modo preferido, a composição farmacêutica compreende:

cerca de 30 mg/ml a cerca de 70 a proteína de fusão de mg/ml receptor TGF-β, cerca de 5 mM a cerca de 20 mM Tampão de ácido cítrico- citrato de sódio, cerca de 60 mg/ml a cerca de 90 sacarose, e mg/ml cerca de 0,4 mg/ml a cerca de polissorbato 80; 0,8 mg/ml de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5; de um modo mais preferido, a composição farmacêutica compreende: cerca de 50 mg/ml a proteína de fusão de receptor TGF-β, cerca de 10 mM tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, cerca de 80 mg/ml sacarose, e cerca de 0,4 mg/ml polissorbato 80; de um modo preferido, o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,2.

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão do receptor TGF-β é mostrada como fórmula geral (I): Ab-L-TGF-βRII ECD (I) em que o ECD de TGF-βRII é uma forma truncada de uma região extracelular de TGF-βRII; Ab é um anticorpo PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; L é uma sequência de ligante.

12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a sequência de ligante é mostrada como (G4S)xG, em que x é 3, 4, 5 ou 6, de um modo preferido x é 4.

13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que a forma truncada da região extracelular de TGF-βRII é uma sequência do domínio extracelular de TGF-βRII com uma deleção de no máximo 26 resíduos de aminoácidos consecutivos no terminal amino; de um modo preferido, uma sequência de domínio extracelular de TGF-βRII com uma deleção de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26 resíduos de aminoácidos consecutivos no terminal amino; de um modo mais preferido, a sequência de TGF-βRII ECD é mostrada como SEQ ID NO: 14, 15, 16 ou 17; de um modo preferido, mostrada como SEQ ID NO: 15.

14. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de que o anticorpo PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (A) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente; e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 4, SEQ ID

NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente; ou (B) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 mostrado como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.

15. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo PD-L1 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (C) uma região variável de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 8; ou (D) uma região variável de cadeia pesada mostrada como SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve mostrada como SEQ ID NO: 11.

16. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de que: a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 é mostrada como SEQ ID NO: 12 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 12; a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo PD-L1 é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 13.

17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizada pelo fato de que o ECD de TGF-βRII é fundido ao terminal carboxila da cadeia pesada do anticorpo PD-L1 através de uma sequência ligante; de um modo preferido, a proteína de fusão do receptor TGF-β compreende: (E) um peptídeo de fusão formado pela cadeia pesada do anticorpo PD-L1 e ECD de TGF-βRII, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 23 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 23, e a cadeia leve do anticorpo PD-L1, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 13; ou (F) um peptídeo de fusão formado pela cadeia pesada do anticorpo PD-L1 e ECD de TGF-βRII, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 24 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 24, e a cadeia leve do anticorpo PD-L1, cuja sequência é mostrada como SEQ ID NO: 13 ou tem pelo menos 85% de identidade com a sequência mostrada como SEQ ID NO: 13.

18. Método para preparar a composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17,

em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de contato entre a proteína de fusão de receptor de TGF-β com o tampão; de um modo preferido, o tampão é um tampão de ácido cítrico-citrato de sódio, de um modo preferido, a concentração do tampão é de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM, e o pH do tampão é de cerca de 6,0 a cerca de 6,5.

19. Preparação liofilizada caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-β, que é obtida por liofilização da composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

20. Preparação liofilizada caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-β, que pode ser reconstituída para formar a composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.

21. Solução reconstituída caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína de fusão de receptor de TGF-β, que é obtida pela reconstituição da preparação liofilizada, conforme definido na reivindicação 19 ou 20.

22. Artigo de fabricação caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais recipientes, em que o recipiente compreende: a composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou a preparação liofilizada que compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-β, conforme definido na reivindicação 19 ou 20, ou a solução reconstituída que compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-β, conforme definido na reivindicação

21.

23. Uso de qualquer um selecionado a partir do seguinte caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento: a composição farmacêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou a preparação liofilizada que compreende uma proteína de fusão de receptor TGF-β, conforme definido na reivindicação 19 ou 20, ou a solução reconstituída que compreende uma proteína de fusão do receptor TGF-β, conforme definido na reivindicação 21, ou o artigo de fabricação, conforme definido na reivindicação 22; de um modo preferido, o medicamento é usado para tratar ou inibir doenças ou distúrbios (ou doenças ou distúrbios) relacionados com a proliferação de células tumorais ou metástases de células tumorais; de um modo mais preferido, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é um tumor; de um modo mais preferido, a doença ou distúrbio (ou doenças ou distúrbios) é selecionado do grupo que consiste em: câncer de cabeça e pescoço, glioblastoma, glioma,

carcinoma nasofaríngeo, câncer de tireoide, câncer de pulmão, câncer de mieloma, síndrome mielodisplásica, câncer neuroendócrino, linfoma, leucemia, melanoma, carcinoma cutâneo de células basais, carcinoma cutâneo de células escamosas, dermatofibrossarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma, mesotelioma, câncer gástrico,

câncer de fígado, câncer de pâncreas, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer colorretal, câncer de mama, câncer endometrial, câncer uterino, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de próstata e câncer testicular; o câncer de pulmão é selecionado do grupo que consiste em: câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas.