ES2902533T3

ES2902533T3 - Composiciones y métodos para tratar la hipertensión pulmonar

Info

Publication number: ES2902533T3
Application number: ES20150385T
Authority: ES
Inventors: Paul Yu; Asya Grinberg; Dianne S Sako; Roselyne Castonguay; Rita Steeves; Ravindra Kumar
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Acceleron Pharma Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc; Acceleron Pharma Inc
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2022-03-28
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: EP3685848B1; JP2017501977A; US20160287664A1; DK3071215T3; AU2020203110A1; US11951156B2; CN105934249A; US20200323955A1; ES2778201T3; EP4005585A1; EP3071215B1; JP7474729B2; WO2015077540A3; AU2014352843B2; EP3071215A2; JP2020073528A; EP4005585B1; AU2023263573A1; WO2015077540A2; JP6952100B2

Abstract

Una trampa del ligando de TGF-β que comprende un dominio de unión al ligando de TGF-β de un receptor tipo II de TGF-β y un dominio Fc de una inmunoglobulina para su uso en un método de tratamiento, prevención, o reducción de la tasa de progresión de hipertensión arterial pulmonar (PAH) en un sujeto, en el que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-β al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para tratar la hipertensión pulmonar.

Declaración sobre investigación patrocinada por el gobierno federal

Esta invención fue hecha con el apoyo del gobierno bajo 5R01AR057374 otorgado por el NIH. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo de la invención

La presente invención generalmente se refiere al campo de la medicina y las enfermedades cardiovasculares y pulmonares.

Antecedentes

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No se admite que ninguna de la información proporcionada en este documento sea técnica anterior o relevante para la invención reivindicada actualmente, o que cualquier publicación a la que se haga referencia específica o implícita es técnica anterior.

Muchos procedimientos patológicos y procedimientos biológicos indeseables se producen mediante la unión del ligando a los receptores de la superficie celular y la señalización excesiva/hiperactiva. De este modo, pueden ser útiles las composiciones y los métodos destinados a reducir o modular favorablemente tal unión y señalización.

La superfamilia TGF-p incluye un número de ligandos de importancia biológica. El TGF-p y la activina desempeñan importantes funciones patogénicas en muchas enfermedades, incluida la progresión del cáncer y la fibrosis no controlada, tales como las enfermedades fibróticas de los riñones, los pulmones y el hígado. La miostatina/GDF8 es otro ligando importante, que está relacionado con la activina y que comparte la unión al mismo receptor tipo II (ActivinRIIb). La miostatina es un poderoso inhibidor del crecimiento del músculo esquelético y es un objetivo terapéutico validado para enfermedades de desgaste muscular tal como la distrofia muscular. Los ligandos adicionales en la familia TGF-p incluyen proteínas morfogenéticas óseas (BMP), que se han implicado en enfermedades cardiovasculares. Por ejemplo, se han encontrado altos niveles de BMP2 y BMP4 en placas ateroscleróticas calcificadas y válvulas aórticas enfermas.

Se han desarrollado métodos para reducir la unión del ligando atrapando un ligando y evitando su interacción con los receptores de la superficie celular. Los agentes principales que se dirigen a estos ligandos son trampas/antagonistas de ligando que se unen y secuestran ligando. Dos ejemplos son: (1) anticuerpos antiligando y (2) ectodominios de receptores solubles.

Se ha informado sobre la inhibición de ciertos ligandos usando anticuerpos antiligando que atrapan y neutralizan el ligando directamente. Las versiones solubles de los ectodominios del receptor antagonizan los ligandos directamente al unirse a ellos y evitar que interactúen con los receptores de la superficie celular. En el caso de TGF-p, en modelos animales, la expresión de un ectodominio (ED) del receptor tipo II de TGF-p (TpRIl) restableció parcialmente la inmunidad del huésped y promovió la eliminación del tumor, lo que indica que la neutralización del TGF-p mediada por el ectodominio del receptor inhibe la progresión tumoral. Desafortunadamente, se ha demostrado que el TpRII-ED monovalente tiene una eficacia inferior a la óptima con respecto a antagonizar el TGF-p. Los intentos de superar este problema condujeron a la producción de versiones bivalentes dimerizadas artificialmente de TpRII-ED, que se dimerizan por fusión a ya sea dominios de hélice superenrollada o al dominio Fc de IgG. Esta dimerización mejoró el efecto antagonista. Se ha demostrado que la dimerización no covalente de TpRII-ED (por ejemplo, mediante fusión a hebras de hélice heterodimerizadoras (TpRII-ED de hélice superenrollada)) mejora enormemente la potencia antagonista de TpRII-ED (De Crescenzo et al., 2004, J. Biol, Chem. 279: 260l3). Una desventaja significativa del dímero fusionado en hélice superenrollada es que la naturaleza no covalente del dominio de dimerización limita su potencia, esto es, se disocia a bajas concentraciones, de modo que una gran parte del ectodominio receptor fusionado en hélice actuará como un monómero en lugar de un dímero. El uso del dominio Fc de IgG proporciona una interacción covalente, pero a costa de un gran tamaño.

Es importante destacar que entre los obstáculos para el despliegue clínico de los inhibidores de TGFpRI desarrollados hasta ahora para tratar la PH ha estado la toxicidad, incluida la necrosis de la válvula hemorrágica.

En vista de las deficiencias de los enfoques terapéuticos intentados hasta el momento, existe claramente una necesidad en la técnica de trampas/neutralizadores basados en receptores que puedan antagonizar la actividad del ligando y tengan el potencial de actuar como agentes terapéuticos o diagnósticos (formación de imágenes o sin formación de imágenes) para enfermedades/trastornos causados por sobreproducción/actividad de los ligandos diana descritos en este documento.

Resumen de la invención

Las siguientes realizaciones y aspectos de las mismas se describen e ilustran junto con sistemas, composiciones y métodos que pretenden que sean de ejemplo e ilustrativos, sin limitar su alcance.

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a una trampa del ligando de TGF-p que comprende un dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor tipo II de TGF-p y un dominio Fc de una inmunoglobulina para su uso en un método de tratamiento, prevención, o reducir la tasa de progresión de la hipertensión arterial pulmonar (PAH) en un sujeto, en la que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen una composición farmacéutica que incluye una trampa del ligando de TGF-p. En algunas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p es una proteína de fusión Fc del receptor tipo II de TGF-p recombinante soluble (TGFBRII-Fc). En ciertas realizaciones, la proteína de fusión TGFBRII-Fc comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la hipertensión pulmonar (PH) en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de PH en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la remodelación vascular pulmonar en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la remodelación vascular pulmonar en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la fibrosis pulmonar en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la fibrosis pulmonar en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la hipertrofia ventricular derecha en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la hipertrofia ventricular derecha en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad asociada con una señalización excesiva de TGF-p en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad asociada con una señalización excesiva de GDF15 en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad asociada con una señalización excesiva de PAI-1 en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de reducción de la presión sistólica del ventrículo derecho en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, reduciendo así la presión sistólica del ventrículo derecho en el sujeto.

Diversas realizaciones de la presente divulgación describen un método de formación de imágenes/detección de ligando de TGF-p en un sujeto, que incluye administrar una cantidad de una trampa del ligando de TGF-p unida a una molécula de formación de imágenes al sujeto.

Breve descripción de los dibujos

Se ilustran realizaciones de ejemplo en las figuras referenciadas. Se pretende que las realizaciones y figuras descritas en este documento se consideren ilustrativas más que restrictivas.

Las figuras 1A a 1E son gráficos que demuestran, según una realización de la invención, la hipertensión pulmonar inducida por monocrotalina (MCT) en ratas está asociada con un aumento de PAI-1 y una disminución de la actividad transcripcional Id1. Los cambios en la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP, la figura 1A) y la hipertrofia ventricular derecha (RVH, la figura 1B) se midieron a diversos intervalos después del tratamiento de ratas Sprague Dawley con MCT (40 mg/kg SC). RVSP se midió por cateterismo ventricular derecho, y RVH se determinó por la proporción del peso de la pared libre del ventrículo derecho (RV) a la suma de las paredes del ventrículo izquierdo y el tabique (LV S) (n = 3 por punto de tiempo). La RT-PCR cuantitativa de los pulmones de ratas tratadas con MCT reveló una transcripción elevada de PAI-1 que refleja un aumento de la señalización de TGF-p (Figura 1C), cuyos niveles se correlacionaron directamente con el grado de PH basado en RVSP (Figura ID y Figura IE). En contraste, se observó una disminución de la expresión de Bmpr2 y su objetivo transcripcional Id1, con niveles que se correlacionaron inversamente con RVSP. (n = 5-6, *p <0.05 y **p <0.01 en comparación con las ratas control).

Las figuras 2A a 2F muestran inmunotransfrencias y gráficos. Las figuras 2A -2C demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, TGFBRII-Fc inhibe selectivamente la señalización de TGFp1, TGFp3 y GDF15 en células de músculo liso de arteria pulmonar humana (PASMC). Las PASMC cultivadas se privaron de suero y se incubaron con ligandos BMP4, TGFpl, TGFp2, TGFp3 y GDF15 a diversas concentraciones durante 30 minutos. Western blot y qPCR se realizaron para evaluar la capacidad de TGFBRII-Fc para modular la actividad de señalización in vitro. La figura 2D-2F demuestra, de acuerdo con una realización de la invención, TGFBRII-Fc inhibe selectivamente la señalización de TGFpl y GDF15 en células vasculares del músculo liso. (Figura 2D) Células del músculo liso aórtico humano fueron privadas de suero durante la noche, y luego se incubaron con BMP4, TGFpl, TGFp2 o GDF15 a las concentraciones indicadas durante 30 minutos, y se analizaron por inmunotransferencia para la fosforilación de Smads 1, 2, 3 y 5 como se muestra. TGFpl, TGFp2 y GDF15 provocaron la activación de Smad2 y Smad3 de forma dependiente de la dosis, y Smads 1 y 5 en menor medida, mientras que BMP4 solo activó Smads 1 y 5. (Figura 2E-la figura 2F) Las HASMC se privaron de suero, se pretrataron con TGFBRII-Fc (2000 ng/ml) o vehículo seguido de incubación con TGFp1 (1 ng/ml), TGFp2 (1 ng/ml) o GDF15 (30 ng/ml) por 2 horas. El análisis de la expresión génica por qRT-PCR reveló una inhibición potente de GDF15 y expresión de ARNm de PAI-1 e Id1 inducida por TGFp1, pero no la de TGFp2 (n = 3-5 muestras cada una, *p <0.05, **p <0.01 en comparación con el vehículo).

Las figuras 3A a 3D son gráficos que demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, el tratamiento con dosis bajas de TGFBRII-Fc provoca una tendencia hacia una presión sistólica ventricular derecha (RVSP) reducida, una tendencia hacia una hipertrofia ventricular derecha reducida y una remodelación vascular pulmonar significativamente reducida. Tres semanas después del tratamiento con MCT con o sin TGFBRII-Fc (5 mg/kg, dos veces por semana), las ratas se analizaron de forma ciega mediante cateterización bajo anestesia con intubación intratraqueal y pentobarbital para determinar RVSP (Figura 3A), presiones arteriales sistémicas (no se muestra) y se sacrificaron. El grado de RVH se evaluó de forma ciega basándose en la medición de la proporción de Fulton (RV/(LV S) (Figura 3B). Los valores se representan como media ±SEM, n = 6-8 , *p <0.05 y **p <0.01 en comparación con las ratas control. Se tiñeron secciones de tejido pulmonar con actina de músculo liso alfa y factor von willebrand para identificar los vasos vasculares del músculo liso y el endotelio, respectivamente. Se cuantificó la muscularización de los vasos intraacinares distales (10-50 |im de diámetro), y se calculó el porcentaje de vasos no musculares, parcialmente muscularizados y completamente muscularizados (circunferencialmente) (Figura 3C). Se calculó el grosor de la pared medial para todos los vasos intraacinares completamente muscularizados (10-50 |im de diámetro, la figura 3D). El índice del grosor de la pared se calculó como: índice = (diámetro externo-diámetro interno)/diámetro externo x 100. El tratamiento con TGFBRII-Fc (5 mg/kg, dos veces por semana) causó una tendencia hacia un porcentaje reducido de vasos completamente muscularizados y un índice de grosor de la pared medial significativamente reducido. Los valores son representan como la media ± SEM, n = 100-150 vasos por grupo de tratamiento de 6-8 ratas cada uno, valores de p como se muestra.

Las figuras 4A a 4D muestran gráficos que demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, el tratamiento con altas dosis de TGFBRII-Fc atenúa la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP), la hipertrofia ventricular derecha y previene la remodelación vascular pulmonar. Tres semanas después del tratamiento con MCT con o sin TGFBRII-Fc (15 mg/kg, dos veces por semana), las ratas se analizaron de forma ciega para determinar RVSP (Figura 4A). El grado de RVH se evaluó de forma ciega según la medición de la proporción de Fulton (Figura 4B). Los valores se representan como la media ± SEM, n = 6-8. Se cuantificó la muscularización de los vasos intraacinares distales (10-50 |im de diámetro) (Figura 4C). Se calculó el grosor de la pared medial para todos los vasos intraacinares completamente muscularizados (10-50 |im de diámetro, la figura 4D). El tratamiento con TGFBRII-Fc (15 mg/kg dos veces por semana) redujo significativamente el porcentaje de vasos completamente muscularizados y el índice de grosor de la pared medial reducido. Los valores se representan como la media ± SEM, n = 89-127 vasos por grupo de tratamiento de 6-8 ratas cada uno, *p <0.05 y ***p <0.001 en comparación con las ratas control.

Las figuras 5A a 5D muestran gráficos que demuestran, según una realización de la invención, TGFBRII-Fc atenúa la hipertrofia ecocardiográfica del RV. Después del tratamiento con MCT (40 mg/kg SC), las ratas se trataron con vehículo o TGFBRII-Fc (15 mg/kg, dos veces por semana) comenzando 24 horas después de MCT. Dos semanas después de la MCT, las ratas se analizaron bajo anestesia con isoflurano al 1.5% por ultrasonografía en animales pequeños para medir el grosor del ventrículo derecho y la dimensión diastólica (Figura 5A y Figura 5B), tiempo de aceleración del flujo pulmonar (PAT, Figura 5C) y tiempo de eyección pulmonar (PET, Figura 5D). Los valores se representan como media ± SEM, n = 6-8 , *p <0.05 y ***p <0.001 en comparación con las ratas control.

Las figuras 6A a 6F son gráficos que demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, TGFBRII-Fc inhibió la transcripción mediada por TGFp en tejidos de pulmón PH. El PH inducido por MCT se correlacionó con un aumento modesto en TGFp1 y una disminución significativa en la expresión de ARNm de TGFp2 (Figura 6A-Figura 6C). La supresión de la expresión de Bmpr2 e Id1 después del tratamiento con MCT no se vio afectada por TGFBRII-Fc (15 mg/kg dos veces por semana, Figura 6D-Figura 6E), mientras que el tratamiento con TGFBRII-Fc produjo una disminución significativa en TGFp1 y su PAI-1 diana transcripcional (Figura 6F). Los valores se representan como media ± SEM, n = 3-5, *p <0.05 y **p <0.01 en comparación con el control.

Las figuras 7A a 7C son gráficos que demuestran, de acuerdo con una realización de la invención, el tratamiento con TGFBRII-Fc después del establecimiento de PH está asociado con el rescate parcial de PH y la mortalidad de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invención. Después del tratamiento con MCT (40 mg/kg SC), las ratas se trataron de manera retardada a partir del día 17 después del establecimiento de PH con TGFBRII-FC (15 mg/kg tres veces por semana). El análisis de Kaplan-Meier (Figura 7A) reveló una tendencia hacia una mejor supervivencia en el grupo tratado con TGFBRII-Fc en comparación con las ratas tratadas con vehículo (n = 12 por grupo, p = 0.10). Entre los animales supervivientes a los 35 días, hubo una disminución significativa de RVSP entre los animales tratados con TGFBRII-Fc (Figura 7B). Entre los animales sobrevivientes, sin embargo, no hubo diferencias significativas en RVH (C). Los valores mostrados son la media ± SEM, n = 8-11 por grupo, **p <0.01 en comparación con el control.

Las figuras 8A y 8B muestran las secuencias de aminoácidos de los dominios bisagra IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos (Figura 8A) y Fc (Figura 8B). (dominio de bisagra IgG1 (SEQ ID NO: 65); dominio de bisagra IgG2 (SEQ ID NO: 66); dominio de bisagra IgG3 ^{( s E Q}ID NO: 67); dominio de bisagra IgG4 ^{( s E q}ID NO: 68); se muestra la figura 8B en el mismo orden que la figura 8A: dominio IgGI Fc (SEQ ID NO: 69), esto es, primera línea de aa; dominio IgG2 Fc (SEQ ID NO: 70), esto es, segunda línea de aa; dominio IgG3 Fc (SEQ ID NO: 71) esto es, tercera línea de aa; dominio IgG4 Fc (SEQ ID NO: 72), esto es, cuarta línea de aa. Los residuos de aminoácidos que se muestran en la figura 8A y la figura 8B están numerados según el sistema de numeración de Kabat EU. Secuencias de isotipos se alinean con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último residuo de cisteína de las regiones de bisagra respectivas, que forman los enlaces S--S de cadena interpesada, en las mismas posiciones. Para la figura 8B, se indican los residuos en el dominio CH2 mediante un signo más (+), mientras que los residuos en el dominio CH3 se indican mediante una línea ondulada. Cualquier dominio Fc se puede usar en los métodos de la invención, todas las secuencias de anticuerpos se pueden alinear como se describe en la figura 8 que proporciona guía para los diversos dominios de FC.

Las figuras 9A a 9B muestran secciones de tejido que demuestran la falta de remodelación de la válvula mitral, degeneración o anomalías en respuesta al tratamiento con TGFBRII-Fc. Figura 9A control. Figura 9B tratadas con TGFBRII-Fc.

Descripción detallada de la invención

A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en el arte al que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); and Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001), proporcionan a un experto en el arte una guía general de muchos de los términos usados en la presente solicitud.

Para referencias sobre cómo preparar anticuerpos, véase, por ejemplo, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor ^{N y ,}1988); Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6 : 511; Queen et al. U. S. Patent No. 5,585,089; and Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988). La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tales como Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, including supplements through 2011); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2011); Short Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., fifth edition 2002, including supplements through 2011; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993), Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; y Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000).

Un experto en el arte reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento, que se podrían usar en la práctica de la presente invención. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada junto con los dibujos adjuntos, que ilustran, a modo de ejemplo, diversas características de las realizaciones de la invención. De hecho, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos. Para los fines de la presente invención, ciertos términos se definen a continuación.

Los "resultados beneficiosos" pueden incluir, pero no están limitados a, disminuir o aliviar la gravedad de la enfermedad, evitar que la enfermedad empeore, curar la enfermedad, prevenir el desarrollo de la enfermedad, reducir las posibilidades de un paciente que desarrolla la enfermedad y prolonga la vida o la esperanza de vida de un paciente. En diversas realizaciones, el estado de la enfermedad es hipertensión pulmonar, remodelación vascular pulmonar, fibrosis pulmonar, hipertrofia ventricular derecha, enfermedades asociadas con señalización excesiva de TGF-p, enfermedades asociadas con señalización excesiva de GDF15 y enfermedades asociadas con señalización excesiva de PAI-1.

"Tratamiento" y "que trata", como se usa en este documento, se refieren tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objetivo es ralentizar (disminuir) la afección patológica diana, prevenir la afección patológica, buscar u obtener resultados beneficiosos o reducir las posibilidades de que el individuo desarrolle la afección incluso si el tratamiento finalmente no tiene éxito. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la afección, así como aquellos propensos a tener la afección o aquellos en quienes se debe prevenir la afección.

La "hipertensión pulmonar" (PH) como se usa en este documento puede incluir un aumento de la presión sanguínea en la arteria pulmonar (hipertensión arterial pulmonar), vena pulmonar o capilares pulmonares, juntos conocidos como la vasculatura pulmonar, que conducen a la falta de aliento, mareos, desmayos, hinchazón de las piernas y otros síntomas. La PH puede ser una enfermedad grave con una marcada disminución de la tolerancia al ejercicio y la insuficiencia cardíaca. La PH puede ser uno de al menos cinco tipos posibles diferentes, que incluyen: arterial, venosa, hipóxica, tromboembólica o miscelánea.

Una "trampa del ligando de TGF-p", como se usa en este documento, se refiere a una proteína que es capaz de atrapar a un ligando de TGF-p, incluso aunque solo sea transitoriamente, modulando así la capacidad del ligando para interactuar con una o más moléculas adicionales.

En algunas realizaciones, el ligando de TGF-p puede significar un ligando seleccionado entre TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3 y GDF 15.

Un ejemplo de una trampa del ligando de TGF-p incluye, pero no está limitado a, una proteína de fusión Fc del receptor de TGF-p recombinante soluble, que incluye el dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor TGF-p y el dominio Fc de una inmunoglobulina.

De acuerdo con lo anterior, en una realización, se describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una hipertensión pulmonar (PH) en un sujeto. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de una PH en el sujeto, en el que la trampa del ligando de TGF-p comprende 1) un dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor TGF-p y 2) un dominio Fc de una inmunoglobulina, y 3) opcionalmente un enlazante (un enlazante de inmunoglobulina u otro enlazante) entre el dominio de unión al ligando y el dominio Fc.

En una realización, el dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor TGF-p comprende SEQ ID NO: 63, o una porción del mismo, o una variante del mismo: TIPPHVQKSV NNDMIVTDNN GAVKFPQLCK FCDVRFSTCD NQKSCMSNCS ITSICEKPQE VCVAVWRKND ENITLETVCH DPKLPYHDFI LEDAASPKCI MKEKKKPGET FFMCSCSSDE CNDNIIFSEE YNTSNPD (SEQ ID NO: 63).

En una realización, el dominio de unión al ligando TGF-p de un receptor de TGF-p comprende SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO; 4, o SEQ ID NO: 5, o una porción del mismo, o una variante del mismo:

En una realización, el dominio Fc comprende SEQ ID NO: 64, o fragmento/porción de SEQ ID NO: 64, o una variante del mismo. SEQ ID NO: 64: ECPPCPAP PVAGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE KTISKTKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 64)

Además, se describen dominios Fc de ejemplo en la figura 1B, por ejemplo, SEQ ID NO:'s 69, 70, 71 y 72. En ciertas realizaciones, el dominio Fc comprende s Eq ID NO: 69, SeQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, or SeQ ID NO: 72, o comprende un fragmento de SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, o SEQ ID NO: 72, o una variante de SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, o SEQ ID NO: 72.

Está dentro de la capacidad de un experto habitual en el arte seleccionar dominios de unión apropiados a la luz de la divulgación en este documento. En algunos casos, los dominios de unión se pueden seleccionar de los ectodominios de los receptores tipo II de TGF-p y tipo I de TGF-p. Un ejemplo no limitante es una proteína de fusión Fc del receptor tipo II de TGF-p recombinante soluble (TGFBRII-Fc).

En otro ejemplo, los receptores naturales a partir de los cuales está diseñado el dominio de unión a polipéptido pueden ser TpRI-ED o TpR-II-ED.

En una realización, el dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor TGF-p comprende una secuencia del ectodominio del receptor tipo I de TGF-p, o una porción de ectodominio, por ejemplo SEQ ID NO: 73, o una porción del mismo. 1 GVQVETISPG DGRTFPKRGQ TCVVHYTGML EDGKKFDSSR DRNKPFKFML GKQEVIRGWE EGVAQMSVGQ RAKLTISPDY AYGATGHPGI IPPHATLVFD VELLKLE (SEQ ID NO: 73), o por ejemplo, SEQ ID NO: 74, o fragmento/porción del mismo, EDPSLDRPFI SEGTTLKDLI YDMTTSGSGS GLPLLVQRTI ARTIVLQESI GKGRFGEVWR GKWRGEEVAV KIFSSREERS WFREAEIYQT VMLRHENILG FIAADNKDNG TWTQLWLVSD YHEHGSLFDY LNRYTVTVEG MIKLALSTAS GLAHLHMEIV GTQGKPAIAH RDLKSKNILV KKNGTCCIAD LGLAVRHDSA TDTIDIAPNH RVGTKRYMAP EVLDDSINMK HFESFKRADI YAMGLVFWEI ARRCSIGGIH EDYQLPYYDL VPSDPSVEEM RKVVCEQKLR PNIPNRWQSC EALRVMAKIM RECWYANGAA RLTALRIKKT LSQLSQQEGI KM (SEQ ID NO: 74) (Cadena A, dominio citoplasmático del receptor tipo I Tgf-Beta sin fosforilar cristalizado sin Fkbp12 GeneBankACCESSION 1IAS_A GI:15988007.

En una realización, el dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor TGF-p comprende una secuencia del TpRIII-ED, o una porción de SEQ ID NO: 75; 1 MTSHYVIAIF ALMSSCLATA GPEPGALCEL SPVSASHPVQ ALMESFTVLS GCASRGTTGL PQEVHVLNLR TAGQGPGQLQ REVTLHLNPI SSVHIHHKSV VFLLNSPHPL VWHLKTERLA TGVS RLFLVS EGSVVQFSSA NFSLTAETEE RNFPHGNEHL LNWARKEYGA VTSFTELKIA RNIYIKVGED QVFPPKCNIG KNFLSLNYLA EYLQPKAAEG CVMSSQPQNE EVHIIELITP NSNPYSAFQV DITIDIRPSQ EDLEVVKNLI LILKCKKSVN WVIKSFDVKG SLKIIAPNSI GFGKESERSM TMTKSIRDDI PSTQGNLVKW ALDNGYSPIT SYTMAPVANR FHLRLENNEE MGDEEVHTIP PELRILLDPG ALPALQNPPI RGGEGQNGGL PFPFPDISRR VWNEEGEDGL PRPKDPVIPS IQLFPGLREP EEVQGSVDIA LSVKCDNEKM IVAVEKDSFQ ASGYSGMDVT LLDPTCKAKM NGTHFVLESP LNGCGTRPRW SALDGVVYYN SIVIQVPALG DSSGWPDGYE DLESGDNGFP GDMDEGDASL FTRPEIVVFN CSLQQVRNPS SFQEQPHGNI TFNMELYNTD LFLVPSQGVF SVPENGHVYV EVSVTKAEQE LGFAIQTCFI SPYSNPDRMS HYTIIENICP KDESVKFYSP KRVHFPIPQA DMDKKRFSFV FKPVFNTSLL FLQCELTLCT KMEKHPQKLP KCVPPDEACT SLDASIIWAM MQNKKTFTKP LAVIHHEAES KEKGPSMKEP NPISPPIFHG LDTLT (SEQ ID NO: 75), (también conocido como receptor de TGF-p soluble III, por ejemplo, TGF-psRIII soluble recombinante humano se describe en Moren A, et al. Molecular cloning and characterization of the human and porcine transforming growth factor-beta type III receptors, 1992, J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 189 (1), 356-362).

El ADNc de TGF-pR tipo II soluble recombinante se describe en Melissa A. Rowland-Goldsmith et al. Soluble Type II Transforming Growth Factor-p (TGF-p) Receptor Inhibits TGF-p Signaling in COLO-357 Pancreatic Cancer Cells in Vitro and Attenuates Tumor Formation1, 2001, Clin Cancer Res, 7: 2931. El ADNc completo de TpRII humano se usó como plantilla para la amplificación por PCR de la secuencia de codificación del dominio extracelular de TpRII (nucleótidos 1-477 incluyendo la secuencia señal). La PCR se realizó usando el cebador sentido, 5'-AAGCTTGCCGCCGCCATGGGTCG (SEQ ID NO: 76), y el cebador antisentido, 5'-CTGGAATTCGTCAGGATTGCTGG (SEQ ID NO: 77). SEQ ID NO: 78 es un ejemplo del dominio extracelular del receptor del factor-p de crecimiento transformante tipo II (TGF-p): MGRGLLRGLW PLHIVLWTRI ASTIPPHVQK SVNNDMIVTD NNGAVKFPQL CKFCDVRFST CDNQKSCMSN CSITSICEKP QEVCVAVWRK NDENITLETV CHDPKLPYHD FILEDAASPK CIMKEKKKPG ETFFMCSCSS DECNDNIIFS EEYNTSNPDL LLVIFQVTGI SLLPPLGVAI SVIIIFYCYR VNRQQKLSST WETGKTRKLM EFSEHCAIIL EDDRSDISST CANNINHNTE LLPIELDTLV GKGRFAEVYK AKLKQNTSEQ FETVAVKIFP YEEYASWKTE KDIFSDINLK HENILQFLTA EERKTELGKQ YWLITAFHAK GNLQEYLTRH VISWEDLRKL GSSLARGIAH LHSDHTPCGR PKMPIVHRDL KSSNILVKND LTCCLCDFGL SLRLDPTLSV DDLANSGQVG TARYMAPEVL ESRMNLENVE SFKQTDVYSM ALVLWEMTSR CNAVGEVKDY EPPFGSK (SEQ ID NO: 78).

La porción extracelular completa de los receptores de TGF beta por lo general incluye segmentos no estructurados que flanquean su dominio de unión al ligando plegado. Estas porciones extracelulares no estructuradas son evidentes a partir de las estructuras 3D determinadas experimentalmente disponibles en la base de datos PDB (Berman et al., 2000, Nucl. Acid Res. 28: 235), por ejemplo, estructuras cristalinas para el ectodominio del receptor tipo II de TGF-p (Hart et al., 2002 Nat. Struct. Biol. 9: 203; Boesen et al., 2002, Structure 10: 913; Groppe et al., 2008, Mol. Cell 29: 157), ectodominio del receptor tipo I de TGF-p (Groppe et al., 2008, Mol. Cell 29:157), o la estructura de RMN del ectodominio receptor tipo II de TGF-p (Deep et al., 2003, Biochemistry 42: 10126). Un experto en el arte es bien versado en la identificación de dominios de unión del ligando de los receptores de TGF beta. Para las trampas de TGF beta, la unión de ligando se puede confirmar usando ensayos de unión de ligando estándar, bien conocidos para los expertos en el arte, por ejemplo, ensayos de unión de ligando de radio. (Véase por ejemplo, Sittampalam, G. S.; Kahl, S. D.; Janzen, W. P. High-throughput screening: Advances in assay technologies, 1997, Current Opinion in Chemical Biology 1 (3): 384-391; and De Jong, L. A. A.; et al. Receptorligand binding assays: Technologies and Applications, 2005, Journal of Chromatography B 829 (1-2 ): 1-25).

"TGFBRII-Fc", como se usa en este documento, se refiere a una proteína de fusión que incluye el dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor tipo II de TGF-p o una variante o porción biológicamente activa del mismo y el dominio Fc de una inmunoglobulina. En diversas realizaciones, entre el dominio de unión al ligando de TGF-p y el dominio Fc, se puede incluir un enlazante. Además, una proteína de fusión puede incluir la porción extracelular completa de un receptor tipo II de TGF-p o una variante del mismo y el dominio Fc de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína de fusión puede incluir parte de la porción extracelular de un receptor tipo II de TGF-p o una variante del mismo y el dominio Fc de una inmunoglobulina. Los ejemplos de variantes pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos que incluyen mutaciones conservadoras de aminoácidos, variantes de SNP y variantes de empalme. Un ejemplo no limitante es la variante de empalme IIb del receptor tipo II de TGF-p. En diversas realizaciones, el dominio de unión al ligando de TGF-p y/o el dominio Fc se pueden modificar, por ejemplo, para facilitar la purificación, siempre que tales modificaciones no reduzcan las funciones de estos dominios a un nivel inaceptable.

La tecnología básica de las fusiones de Fc se ha descrito generalmente en la técnica, por ejemplo, en Czajkowsky et al. Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives, EMBO Mol Med. 2012 Oct;4(10):l0l5-28. El receptor tipo II de TGF-p puede ser de un mamífero. En algunos ejemplos, el receptor es de un humano, mono, simio, perro, gato, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo, conejo, ratón o rata. La inmunoglobulina puede ser de un mamífero. Simplemente a modo de ejemplo, puede ser de un humano, mono, simio, perro, gato, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo, conejo, ratón o rata.

Cuando se hace referencia a los dominios de anticuerpos, la asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat (Véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" by Elvin A. Kabat, Tai Te Wu, Kay S. Gottesman, Carl Foeller 5th edition, Publication no. 91 3242. National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991, y ediciones anteriores). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se designan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para anticuerpos, identificó una secuencia consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de residuo a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es extensible a los anticuerpos no incluidos en su compendio al alinear el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias de consenso en Kabat por referencia a los aminoácidos conservados. Este método para asignar números de residuos se ha convertido en estándar en el campo e identifica fácilmente aminoácidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, incluidas las variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo de ratón.

Como se usa en este documento, el término "región Fc", "dominio Fc" o términos análogos se usan para definir la región C-terminal CH2/CH3 de una cadena pesada de IgG. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos que contiene la IgG1 humana se muestra en la figura 8B. Aunque los límites pueden variar ligeramente, según el número según el sistema Kabat, el dominio Fc se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 447 (los residuos de aminoácidos en la figura 8B están numerados según el sistema Kabat: Véase Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991)). La figura 8B también proporciona ejemplos de las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc de los isotipos IgG IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

La región Fc de una IgG comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana generalmente se extiende desde los aminoácidos 231 hasta el aminoácido 341 según el sistema de numeración de Kabat (Figura 8B). El dominio CH3 de una región Fc de IgG humana generalmente se extiende desde los aminoácidos 342 a 447 según el sistema de numeración de Kabat (Figura 8B). El dominio CH2 de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio "Cy2") es único en el sentido de que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificados unidos a N están interpuestas entre los dos dominios CH2 de una IgG nativa intacta.

Los ejemplos de TGFBRII-Fc incluyen, pero no se limitan a, una proteína que tiene la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma. En una realización, una variante de SEQ ID NO: 1 incluye una secuencia con al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.

TIPPHVQKSV NNDY1IVTDNN GAVKPPQLCK FCDVRFSTCD NQKSC MSNCS

ITSICEKPQE VCVAVWRKND ENITLETVCH DPKLPYHDFI LEDAASPKCI

VIKEKKKPGET FFMCSCSSDE CNDNIIFSEE YNTSNPDTGG GVECPPCPAP

PVAGPSVFLF PPKPKDTI.MI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV QFNWYVDGVF,

VIINAKTKPRE EQFNSTFRVV SVLTVVHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPAPIE

KTISKTKGQP REPQVYTLPP SRF.F.MTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES

NGQPENNYKT TPPMLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH

NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO:l ).

En la SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1-137 son un dominio de unión al ligando TGF-p, los aminoácidos 138-141 son un enlazante y los aminoácidos 142-364 son un dominio Fc. Este TGFBRII-Fc de ejemplo se puede expresar mediante un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 2, o una variante degenerada de la misma. Una "variante degenerada" como se usa en este documento se refiere a una variante que tiene una secuencia de nucleótidos mutada, pero aún codifica el mismo polipéptido debido a la redundancia del código genético.

1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC

51 ^{a g t c t t c g t t}TCGCCCGGCG CCACGATCCC ACCGCACGTT CAGAAGTCGG

101 TTAATAACGA CATGATAGTC ACTGACAACA ACGGTGCAGT CAAGTTTCCA

151 CAACTGTGTA AATTTTGTGA TGTGAGATTT TCCACCTGTG ACAACCAGAA

201 ATCCTGCATG AGCAACTGCA GCATCACCTC CATCTGTGAG AAGCCACAGG

251 AAGTCTGTGT GGCTGTATGG AGAAAGAATG ACGAGAACAT AACACTAGAG

301 ACAGTTTGCC ATGACCCCAA GCTCCCCTAC CATGACTTTA TTCTGGAAGA

351 TGCTGCTTCT CCAAAGTGCA TTATGAAGGA AAAAAAAAAG CCTGGTGAGA

401 CTTTCTTCAT GTGTTCCTGT AGCTCTGATG AGTGCAATGA CAACATCATC

451 TTCTCAGAAG AATATAACAC CAGCAATCCT GACACCGGTG GTGGAGTCGA

501 GTGCCCACCG TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT

551 TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC

601 ACGTGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA

651 CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG

701 AGGAGCAGTT CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCGTG

751 CACCAGGACT GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCA ACAA

801 AGGCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC

851 CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC

901 AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA

951 CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA

1001 CCACACCTCC CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG

1051 CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC

1101 CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC

1151 TGTCTCCGGG TAAA (SEQ ID NO: 2)

La "región de bisagra" o "dominio de bisagra" de una IgG de cadena pesada se define generalmente como estiramiento de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana usando la numeración de Kabat. Un ejemplo de la secuencia de aminoácidos de la región bisagra de IgG1 humana se muestra en la figura 8A (los residuos de aminoácidos en la figura 8A están numerados según el sistema Kabat). Las regiones de bisagra de otros isotipos de IgG se pueden alinear con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último residuo de cisteína que forman cadenas S--S intercalados en las mismas posiciones que se muestran en la figura 8A. En ciertas realizaciones, el enlazante entre el dominio de unión al ligando y el dominio Fc comprende una región bisagra, por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO: 65-68 (Véase, la figura 8A). En una realización, el enlazante comprende TGG G (SEQ ID NO: 79). En ciertas realizaciones, el enlazante comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 6-48 (véase el ejemplo 3).

Un experto en el arte apreciará fácilmente que se contemplan péptidos sustancialmente idénticos a los descritos específicamente en este documento y pueden incluir una o más mutaciones conservadoras de aminoácidos. Se sabe en la técnica que una o más mutaciones conservadoras de aminoácidos a un péptido de referencia pueden producir un péptido mutante sin un cambio sustancial en las propiedades fisiológicas, químicas o funcionales, en comparación con el péptido de referencia; y en tal caso, los péptidos de referencia y mutantes se considerarían polipéptidos "sustancialmente idénticos".

Una mutación conservadora de aminoácidos puede incluir la adición, eliminación o sustitución de un aminoácido. Una sustitución conservadora de aminoácidos se define en este documento como la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, tamaño, carga o polaridad). En un ejemplo no limitante, una mutación conservadora puede ser una sustitución de aminoácidos. Tal sustitución conservadora de aminoácidos puede sustituir un aminoácido básico, neutro, hidrófobo o ácido por otro del mismo grupo.

Como se usa en este documento, "aminoácido básico" incluye aminoácidos hidrófilos que tienen un valor de pKa de cadena lateral mayor que 7, que por lo general están cargados positivamente a pH fisiológico. Los aminoácidos básicos incluyen histidina (His o H), arginina (Arg o R) y lisina (Lys o K). Como se usa en este documento, "aminoácido neutro" (también "aminoácido polar") significa aminoácidos hidrófilos que tienen una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero en la que al menos un enlace en el que el par de electrones comparten en común dos átomos se mantienen más cerca de uno de los átomos. Los aminoácidos polares incluyen serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y), asparagina (Asn o N) y glutamina (Gin o Q). El término "aminoácido hidrófobo" (también "aminoácido no polar") incluye aminoácidos que exhiben una hidrofobicidad mayor que cero según la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg (1984). Los aminoácidos hidrófobos incluyen prolina (Pro o P), isoleucina (Ile o I), fenilalanina (Phe o F), valina (Val o V), leucina (Leu o L), triptófano (Trp o W), metionina (Met o M), alanina (Ala o A) y glicina (Gly o G). "Aminoácido ácido" se refiere a aminoácidos hidrófilos que tienen un valor de pKa de cadena lateral de menos de 7, que por lo general están cargados negativamente a pH fisiológico. Los aminoácidos ácidos incluyen glutamato (Glu o E) y aspartato (Asp o D).

La identidad de secuencia se usa para evaluar la similitud de dos secuencias; se determina calculando el porcentaje de residuos que son iguales cuando las dos secuencias están alineadas para una correspondencia máxima entre las posiciones de residuos. Se puede usar cualquier método conocido para calcular la identidad de secuencia; Por ejemplo, el software está disponible para calcular la identidad de secuencia. A modo de ejemplo no limitativo, la identidad de secuencia se puede calcular mediante un software tal como BLAST-P, Blast-N o FASTA-N, o cualquier otro software apropiado que se conozca en la técnica. Las secuencias sustancialmente idénticas de la presente divulgación pueden ser al menos 80% idénticas. En otros ejemplos, las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idénticas a nivel de aminoácidos a las secuencias descritas en este documento.

Como se indicó anteriormente, en diversas realizaciones, entre el dominio de unión al ligando TGF-p y el dominio Fc, puede haber un enlazante. Se proporcionan en este documento secuencias de tales enlazantes. En una realización, el enlazante es una secuencia polipeptídica flexible y no estructurada. La región de enlazante proporciona un segmento que es distinto de la unión de ligando estructurado y los dominios Fc y, de este modo, se puede usar para la conjugación con moléculas accesorias (por ejemplo, moléculas útiles para aumentar la estabilidad, tales como unidades estructurales de PEGilación) o moléculas de carga tales como agentes de contraste para formación de imágenes y toxinas sin tener que modificar químicamente la unión del ligando y los dominios Fc. Las metodologías de conjugación son algo diversas, pero por lo general se pueden realizar usando kits comerciales que permiten la conjugación a través de grupos reactivos comunes tales como aminas primarias, ésteres de succinimidilo (NHS) y grupos reactivos con sulfhidral. Algunos ejemplos no limitantes son: kit de etiquetado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen detection technologies) y kits de PEGilación (Pierce Biotechnology Inc.).

El enlazante puede incluir una secuencia de aminoácidos no estructurada que puede ser la misma o derivada de modificaciones conservadoras a la secuencia de una región no estructurada natural en la porción extracelular del receptor para el ligando de interés u otro receptor en la superfamilia de TGF-p. En otros casos, tales enlazantes pueden ser completamente artificiales en composición y origen pero contendrán aminoácidos seleccionados para proporcionar un enlazante flexible no estructurado con una baja probabilidad de encontrar complicaciones de impedimento electrostático o estérico cuando se acerquen al ligando de interés.

Se considera que la longitud del enlazante es el número de aminoácidos entre: (a) el átomo de carbono de la cadena principal C-terminal del dominio de unión ubicado en el extremo N-terminal del enlazante; y (b) el átomo de nitrógeno de la cadena principal N-terminal del dominio de unión ubicado en el extremo C-terminal del enlazante. La longitud del enlazante se considerará aceptable cuando permita que los dominios de unión se unan a sus sitios de unión naturales en su ligando natural. En la tabla 2 se dan ejemplos de secuencias enlazantes naturales y artificiales de longitud variable. Por ejemplo, y sin querer limitarse de ninguna manera, la longitud del enlazante puede estar entre aproximadamente 18-80 aminoácidos, 25-60 aminoácidos, 35-45 aminoácidos, o cualquier otra longitud apropiada.

En algunos casos, puede ser deseable someter el diseño de enlace basado en polipéptido de los agentes de unión del ligando descritos en este documento a la optimización de las características deseadas para una aplicación particular. Por ejemplo, el enlazante se puede modificar en longitud y composición en base a simulaciones de nivel atómico y diseño basado en el conocimiento para mejorar la afinidad, especificidad, inmunogenicidad y estabilidad de la unión. Esto es aplicable a una amplia gama de sistemas moleculares que exhiben características estructurales de receptor de ligando homomérico, heteromérico, dimérico y multimérico. Se pueden incorporar diferentes dominios de unión diferentes para generar trampas multivalentes con una potencia de unión aún mayor.

Los enlazantes pueden estar diseñados para facilitar la purificación del enlazante y/o la trampa de unión al ligando. El esquema de purificación exacto elegido determinará qué modificaciones son necesarias, por ejemplo y sin querer ser limitantes, se contemplan adiciones de "etiquetas" de purificación tales como las etiquetas de His; en otros ejemplos, el enlazante puede incluir regiones para facilitar la adición de carga o moléculas accesorias. Cuando tales adiciones afectan la naturaleza no estructurada del enlazante o introducen posibles preocupaciones electrostáticas o estéricas, se realizarán aumentos apropiados en la longitud del enlazante para asegurar que los dominios de unión puedan unir sus sitios en el ligando. A la luz de los métodos y enseñanzas en este documento, un experto en el arte podría hacer tales determinaciones de forma rutinaria.

En una realización en la que los dominios de unión del ligando y el enlazante contienen principalmente secuencias naturales, normalmente no se esperaría que fueran severamente inmunogénicos o tóxicos en un paciente típico.

Los polipéptidos de la divulgación pueden ser útiles como agentes terapéuticos que neutralizan la acción de ligandos diméricos estabilizados covalentemente asociados a la enfermedad tales como factores de crecimiento. También pueden tener potencial comercial para su uso como agentes de diagnósti

diméricos estabilizados covalentemente asociados a la enfermedad, tales como factores de crecimiento en aplicaciones de diagnóstico mediante formación de imágenes y sin formación de imágenes.

La presente divulgación también abarca secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de la divulgación. Estas secuencias de nucleótidos pueden clonarse e insertarse en cualquier vector apropiado (incluido el vector de expresión) y, por lo tanto, son muy susceptibles a la producción de polipéptidos de la divulgación.

El término "vector", como se usa en este documento, se refiere a una molécula portadora de ácido nucleico en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para su introducción en una célula donde se puede replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es extraña a la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que la secuencia normalmente no se encuentra. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (por ejemplo, y Ac ). Un experto en el arte estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1988 and Ausubel et al., 1994). Además, las técnicas descritas en este documento y demostradas en las figuras referenciadas también son instructivas con respecto a la construcción efectiva de vectores.

El término "vector de expresión" se refiere a cualquier tipo de construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un ARN capaz de transcribirse. En algunos casos, las moléculas de a Rn se traducen en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en una célula huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones y se describen a continuación.

El término "polipéptido" o "proteína", como se usa en este documento, significa un polímero de aminoácidos unidos en una secuencia específica por enlaces peptídicos. Como se usa en este documento, el término "aminoácido" se refiere a la forma estereoisómera D o L del aminoácido, a menos que se designe específicamente de otro modo.

Una porción "biológicamente activa" de una molécula, como se usa en este documento, se refiere a una porción de una molécula más grande que puede realizar una función similar a la molécula más grande. Simplemente a modo de ejemplo no limitativo, una porción biológicamente activa de una proteína es cualquier porción de una proteína que retiene la capacidad de realizar una o más funciones biológicas de la proteína de longitud completa (por ejemplo, unión con otra molécula, fosforilación, etc.), aunque solo sea un poco. Como ejemplo no limitante, el dominio de unión al ligando es una porción biológica de un receptor de TGFp.

Como se usa en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de una trampa del ligando de TGF-p que atenúa o inhibe la señalización excesiva de TGF-p y, por lo tanto, da como resultado el tratamiento, prevención o disminución de la tasa de progresión de una enfermedad condición descrita en este documento. Una cantidad eficaz variará, dependiendo de la patología o afección que se va a tratar, por el paciente y su estado, y otros factores bien conocidos para los expertos en el arte. Los expertos en el arte determinan fácilmente las cantidades eficaces. En algunas realizaciones, se administra una dosis terapéutica en un intervalo de cada día a cada mes a través de la ruta subcutánea, intratecal, mejorada por convección, intravenosa o intraarterial a una dosis que varía desde 0.05 mg a 50 mg/kg de peso corporal, y opcionalmente 1.0 mg. a 10 mg/kg de peso corporal o 0.3 mg a 3.0 mg/kg de peso corporal. En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto 1 7 veces por semana o una vez por semana, o una vez cada dos, tres o cuatro semanas. En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto durante 1-5 días, 1-5 semanas, 1-5 meses o 1-5 años.

Aunque se proporcionan ciertas rutas de administración de ejemplo, cualquier ruta de administración apropiada de una trampa del ligando de TGF-p se puede adaptar, y por lo tanto las rutas de administración descritas en este documento no pretenden ser limitantes. Las rutas de administración pueden incluir, pero no están limitadas a, intravenosa, oral, bucal, intranasal, inhalación, aplicación tópica a una membrana mucosa o inyección, incluyendo inyección intradérmica, intratecal, intracisternal, intralesional o cualquier otro tipo de inyección. La administración se puede realizar de forma continua o intermitente y variará con el sujeto y la condición que se va a tratar. Un experto en el arte apreciaría fácilmente que las diversas rutas de administración descritas en este documento permitirían que una trampa o composiciones de ligando de TGF-p se administren en, dentro o cerca de las ubicaciones de la enfermedad pulmonar o células diana. Un experto en el arte también apreciaría fácilmente que las diversas rutas de administración descritas en este documento permitirán que una trampa del ligando de TGF-p y las composiciones descritas en este documento se administren a una región cercana a tejidos, órganos o células individuales enfermos que se van a tratar. "En las proximidades" puede incluir cualquier tejido o fluido corporal en el sujeto que esté lo suficientemente cerca o en comunicación suficiente con tejidos, órganos o células individuales enfermos de manera que al menos una parte de la trampa del ligando de TGF-p o las composiciones administradas al sujeto alcanzan sus objetivos previstos y ejercen sus efectos terapéuticos.

Composiciones Farmacéuticas

En diversas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye una trampa del ligando TGF- p descrita en este documento. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para liberación modificada, liberación sostenida o liberación controlada, o una combinación de las mismas. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración oral, por inhalación, nasal, sublingual, bucal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o parenteral.

En diversas realizaciones, la composición farmacéutica incluye además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes, antioxidantes, plastificantes, agentes gelificantes, espesantes, endurecedores, agentes de fraguado, agentes de suspensión, surfactantes, humectantes, portadores, estabilizantes y combinaciones de los mismos.

En diversas realizaciones, la composición farmacéutica incluye además al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones acuosas tales como solución salina regulada fisiológicamente u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de oliva) o ésteres orgánicos inyectables. Se puede usar un portador farmacéuticamente aceptable para administrar las composiciones de la invención a una célula in vitro o a un sujeto in vivo. Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por ejemplo, para estabilizar la composición o aumentar la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente aceptable puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son particularmente útiles para prevenir el crecimiento o la acción de microorganismos. Diversas conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en el arte sabría que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, que incluye un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la ruta de administración del polipéptido. Por ejemplo, un compuesto fisiológicamente aceptable tal como el monosterato de aluminio o la gelatina es particularmente útil como agente retardador, que prolonga la velocidad de absorción de una composición farmacéutica administrada a un sujeto. Se pueden encontrar más ejemplos de portadores, estabilizantes o adyuvantes en Martin, Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975). Otros ejemplos de portadores incluyen, pero no se limitan a, un portador a base de nanopartículas (por ejemplo, un polímero N-(2-horoxilpropil)metacrilamida (HPMA), ácido glutámico, PEG, dextrano) y un nanoportador (por ejemplo, nanocápsula, liposoma, nanoliposoma).

Métodos de tratamiento

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la hipertensión pulmonar (PH) en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de PH en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto. La hipertensión arterial pulmonar es un tipo de hipertensión pulmonar que puede ser particularmente susceptible de tratamiento con una trampa del ligando de TGF-p. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la hipertensión arterial pulmonar en el sujeto, incluyendo cualquiera de las siguientes subcategorías de hipertensión arterial pulmonar. La hipertensión arterial pulmonar puede surgir secundaria a otras afecciones o como hipertensión arterial pulmonar primaria o idiopática. De particular interés, ciertos tipos de hipertensión arterial pulmonar familiar están asociados con una disminución de la expresión o función del receptor de proteína morfogenética ósea tipo II (BMPRII), que se cree que produce una señalización excesiva por TGF-p.

La hipertensión pulmonar puede ser de cinco tipos principales, de este modo se realiza una serie de pruebas para distinguir la hipertensión arterial pulmonar de las variedades venosa, hipóxica, tromboembólica o miscelánea. Estas generalmente incluyen pruebas de función pulmonar; análisis de sangre para excluir HIV, enfermedades autoinmunes y enfermedad hepática; electrocardiografía (ECG); mediciones de gases en sangre arterial; rayos-X de tórax (seguidas de CT de alta resolución si se sospecha enfermedad pulmonar intersticial); y perfusión de ventilación o exploración V/Q para excluir la hipertensión pulmonar tromboembólica crónica. El diagnóstico de PAH requiere la presencia de hipertensión pulmonar. Aunque la presión arterial pulmonar se puede estimar en base a la ecocardiografía, las mediciones de presión con un catéter Swan-Ganz a través del lado derecho del corazón proporcionan la evaluación más definitiva para el diagnóstico.

Un experto en el arte conoce bien el control de la mejora de la hipertensión pulmonar, por ejemplo, la mejora clínica a menudo se mide mediante una "prueba de caminata de seis minutos", esto es, la distancia que un paciente puede caminar en seis minutos. La estabilidad y la mejora en esta medida se correlacionan con una mejor supervivencia. El nivel de BNP en sangre también se está usando ahora para seguir el progreso de los pacientes con hipertensión pulmonar. La mejora de los síntomas también se puede controlar mediante el análisis de la presión arterial. Por ejemplo, la presión arterial pulmonar normal en una persona que vive al nivel del mar tiene un valor medio de 8-20 mm Hg (1066-2666 Pa) en reposo. La hipertensión pulmonar está presente cuando la presión media de la arteria pulmonar excede los 25 mm Hg (3300 Pa) en reposo. La presión media de la arteria pulmonar (mPAP) no debe confundirse con la presión sistólica de la arteria pulmonar (sPAP), que a menudo se informa en los informes de ecocardiograma. Una presión sistólica de 40 mm Hg generalmente implica una presión media de más de 25 mm Hg. Aproximadamente, mPAP = 0.61 • sPAP 2.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la remodelación vascular pulmonar en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la remodelación vascular pulmonar en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la remodelación vascular en el corazón de un sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto. En ciertas realizaciones, los métodos reducen la degeneración de la válvula mitral, o por ejemplo, prolapso de la válvula mitral. Los efectos beneficiosos se pueden controlar mediante ecocardiografía.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la fibrosis pulmonar en un sujeto. En ciertas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la fibrosis pulmonar en el sujeto. En diversas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de la hipertrofia ventricular derecha en un sujeto. En diversas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la hipertrofia ventricular derecha en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad pulmonar asociada con una señalización excesiva de TGF-p en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, el TGF-p puede ser TGF-p1, TGF-p3, o una combinación de los mismos.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad pulmonar asociada con una señalización excesiva de GDF15 en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de tratamiento, prevención o reducción de la tasa de progresión de una enfermedad pulmonar asociada con una señalización excesiva de PAI-1 en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, tratando, previniendo o reduciendo así la tasa de progresión de la enfermedad en el sujeto. En algunas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, la presente divulgación describe un método de reducción de la presión sistólica del ventrículo derecho en un sujeto. En algunas realizaciones, el método incluye administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una trampa del ligando de TGF-p al sujeto, reduciendo así la presión sistólica del ventrículo derecho en el sujeto. En ciertas realizaciones, el método puede incluir además mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

En diversas realizaciones, los sujetos en los ejemplos descritos anteriormente son mamíferos. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano, mono, simio, perro, gato, vaca, caballo, cabra, oveja, cerdo, conejo, ratón o rata. En diversas realizaciones, el TGF-p es TGF-p1, TGF-p3, o una combinación de los mismos.

En diversas realizaciones, la cantidad de trampa del ligando de TGF-p administrada al sujeto es de 0.05 mg a 50 mg/kg de peso corporal, y opcionalmente de 1.0 mg a 10 mg/kg de peso corporal o de 0.3 mg a 3,0 mg/kg de peso corporal. En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto 1-7 veces por semana o una vez por semana, o una vez cada dos, tres o cuatro semanas. En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto durante 1-5 días, 1-5 semanas, 1-5 meses o 1-5 años. La trampa del ligando de TGF-p se puede administrar por cualquier ruta usada para la terapéutica de proteínas, incluida, pero no se limita a, la administración subcutánea, intravenosa o intramuscular.

Como se indicó anteriormente, en diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto por vía oral, por inhalación, nasal, sublingual, bucal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o parenteral. En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p se administra antes, durante o después de que el sujeto desarrolle una enfermedad, incluyendo pero no limitando a hipertensión pulmonar, remodelación vascular pulmonar, fibrosis pulmonar, hipertrofia ventricular derecha, enfermedades pulmonares asociadas con un exceso de señalización de TGF-p, enfermedades pulmonares asociadas con una señalización excesiva de GDF15 y enfermedades pulmonares asociadas con una señalización excesiva de PAI-1.

En diversas realizaciones, la trampa del ligando de TGF-p es parte de una composición farmacéutica. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para liberación modificada, liberación sostenida o liberación controlada, o una combinación de las mismas. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración oral, por inhalación, nasal, sublingual, bucal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal o parenteral.

En diversas realizaciones, la composición farmacéutica incluye además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, conservantes, antioxidantes, plastificantes, agentes gelificantes, espesantes, endurecedores, agentes de fraguado, agentes de suspensión, surfactantes, humectantes, vehículos, estabilizantes y combinaciones de los mismos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. En la medida en que se mencionen materiales específicos, es meramente para fines de ilustración y no pretende limitar la invención. Un experto en el arte puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Antecedentes adicionales y breve resumen de resultados

Como se indicó anteriormente, los ligandos del factor de crecimiento transformante (TGF-p) coordinan procedimientos importantes en el desarrollo y regulan la fibrosis y la remodelación de los tejidos en la enfermedad. Un exceso de señalización de TGF-p se ha implicado en la remodelación arterial de la hipertensión pulmonar (PH), basada en parte en la capacidad de los inhibidores de la quinasa del receptor tipo I de TGFp (ALK5) para mejorar el PH experimental en modelos animales. Sin embargo, el despliegue clínico de inhibidores de ALK5 se ha visto limitado por la toxicidad cardiovascular. Los experimentos y resultados descritos en este documento demuestran que una proteína de fusión Fc del receptor tipo II de TGFp recombinante soluble (TGFBRII-Fc) inhibe la señalización de TGFp en PH inducida por monocrotalina de rata (MCT). Cuando se administró profilácticamente después de MCT, el tratamiento con TGFBRII-Fc redujo la presión sistólica del ventrículo derecho, la hipertrofia ventricular derecha y la remodelación vascular pulmonar atenuada. TGFBRII-Fc corrigió los niveles elevados de ARNm del PAI-1 diana transcripcional de TGFp en los pulmones de ratas MCT, lo que concuerda con la atenuación de la señalización de TGFp. Cuando se administró 2.5 semanas después de MCT, TGFpRII-Fc rescató parcialmente la PH establecida con una tendencia hacia una mejor supervivencia a las 5 semanas. Es de destacar que no se encontraron anormalidades cardíacas estructurales o valvulares en asociación con el tratamiento con TGFpRII-Fc en ninguna dosis. Colectivamente, los datos descritos en este documento respaldan la conclusión de que una trampa del ligando TGFp podría ser una estrategia eficaz y aceptablemente segura para corregir la remodelación vascular pulmonar mediada por TGFp y el PH.

Ejemplo 2

Tabla 1. Dominios de unión de ligandos de TGFp de ejemplo no limitantes

Ejemplo 3

Tabla 2. Enlazantes de ejemplo no limitantes

Se contemplan también secuencias de ácido nucleico que codifican cada uno de los enlazantes y dominios de unión anteriores.

Ejemplo 4

Materiales y métodos

Modelo de rata de PAH

Se compraron ratas macho Sprague-Dawley (6-8 semanas de edad, peso 150 a 170 g) en Charles River Laboratory. Todos los protocolos y procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el comité local de cuidado de animales. Los animales fueron alojados a 24 °C en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. La comida y el agua eran accesibles ad libitum. Para inducir la PAH, las ratas recibieron una única inyección subcutánea de monocrotalina (MCT, 40 mg/kg). La mortalidad y el número total de ratas incluidas en el presente estudio se resumen en la tabla 3.

Tabla 3

Tratamiento farmacológico

Protocolo de profilaxis: a las 24 horas después de la inducción de PAH, las ratas se aleatorizaron en TGFBRII-Fc (5 o 15 mg/kg, dos veces por semana) o grupos de vehículos. Las ratas fueron tratadas durante 21 días. En el día 14, la función ventricular y la remodelación del RV se examinaron mediante ecocardiograma. En el día 21, las ratas fueron sometidas a hemodinámica y se realizaron las mediciones de hipertrofia ventricular derecha.

Protocolo de rescate: En otra cohorte, se examinó la capacidad de TGFBRII-Fc para revertir la progresión de la PAH. En el día 18, las ratas fueron inyectadas con MCT y aleatorizadas para TGFBRII-Fc (15 mg/kg, tres veces por semana) o vehículo. La hemodinámica y la hipertrofia ventricular derecha (RVH) se examinaron el día 35.

Evaluación ecocardiográfica de la función del L V y del RV

En el día 14 después de la inducción de PAH, las ratas se anestesiaron con isoflurano al 1.5% y se mantuvieron en posición supina. Se usó una sonda de ultrasonido de alta frecuencia para animales pequeños de VisualSonics para detectar la aceleración del flujo pulmonar, la función ventricular derecha y la hipertrofia, y la función ventricular izquierda. Se realizó un Doppler a través de las válvulas mitral y tricúspide para determinar si el tratamiento con TGFBRII-Fc induce alguna regurgitación o lesiones obvias.

Medición hemodinámica y R VH

En momentos específicos, las ratas se anestesiaron con pentobarbital y se intubaron a través de la tráquea. Las ratas se ventilaron mecánicamente con un ventilador para roedores y la evaluación hemodinámica con un catéter lleno de líquido a través del vértice del ventrículo derecho (RV), como se describió anteriormente (Megalou, A. J., Glava, C., Vilaeti, A. D., Oikonomidis, D. L., Baltogiannis, G. G., Papalois, A., Vlahos, A. P., and Kolettis, T. M. (2012) Pulm Circ 2, 461-469). Los pulmones se perfundieron con PBS y un lóbulo derecho se extirpó y se congeló rápidamente para la extracción de ARN y proteínas. Los pulmones se perfundieron adicionalmente con paraformaldehído al 1% (PFA) en la arteria pulmonar, seguido de tráquea durante 1 minuto. Los lóbulos izquierdos fueron incrustados en parafina. Para acceder al grado de RVH, se extrajo el corazón y se diseccionó la pared libre de RV del ventrículo izquierdo más el tabique (LV S) y se pesó por separado. El grado de RVH se determinó a partir de la ración RV/(LV S).

Cuantificación de remodelación vascular

Para determinar el grado de remodelación vascular pulmonar, se tiñeron secciones de tejido pulmonar con actina de músculo liso alfa y factor de von Willebrand. Se cuantificó la muscularización de los vasos intraacinares distales (10 50 |im de diámetro) y se calculó el porcentaje de vasos no musculares, parcialmente musculares y totalmente musculares.

El grosor de la pared medial se calculó para todos los vasos intraacinares completamente muscularizados (10-50 |im de diámetro). El índice de espesor de pared se calculó como: índice = (diámetro externo-diámetro interno)/diámetro externo x 100.

Estudios de expresión

Las muestras de pulmón congeladas se homogeneizaron y la extracción de ARN total usando el reactivo TRIZOL se realizó como se describió previamente (Long, L., Crosby, A., Yang, X., Southwood, M., Upton, P. D., Kim, D. K., and Morrell, N. W. (2009) Circulation 119, 566-576). La transcripción inversa y la PCR cuantitativa se realizaron como se describe (Long, L., Crosby, A., Yang, X., Southwood, M., Upton, P. D., Kim, D. K., and Morrell, N. W. (2009) Circulation 119, 566-576). La proporción de un gen específico a la p-actina se calculó y expresó como cambio de pliegue. Las secuencias de ratas específicas se resumen en la tabla 4.

Tabla 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una trampa del ligando de TGF-p que comprende un dominio de unión al ligando de TGF-p de un receptor tipo II de TGF-p y un dominio Fc de una inmunoglobulina para su uso en un método de tratamiento, prevención, o reducción de la tasa de progresión de hipertensión arterial pulmonar (PAH) en un sujeto, en el que el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

2. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la PAH está mediada por una señalización excesiva de TGF-p y/o en la que el sujeto es un humano.

3. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el dominio de unión al ligando de TGF-p comprende la secuencia que se establece en la SEQ ID NO: 3.

4. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la trampa del ligando de TGF-p comprende además un enlazador entre el dominio de unión al ligando de TGF-p del receptor tipo II de TGF-p y el dominio Fc.

5. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que: i) la trampa del ligando de TGF-p es una proteína de fusión Fc del receptor tipo II de TGF-p recombinante soluble (TGFBRII-Fc); o

ii) la trampa del ligando de TGF-p es una proteína de fusión Fc del receptor tipo II de TGF-p recombinante soluble (TGFBRII-Fc), y en la que el TGFBRII-Fc comprende una secuencia que es al menos 80% idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 1.

6. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que: i) la cantidad de trampa del ligando de TGF-p administrada al sujeto es de 0.1-10 mg/kg de peso corporal;

ii) la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto de 1-7 veces por mes;

iii) la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto durante 1-5 días, 1-5 semanas, 1-5 meses, o 1-5 años; iv) la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto por vía oral, por inhalación, nasal, sublingual, bucal, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, o parenteral;

v) la trampa del ligando de TGF-p se administra antes, durante o después de que el sujeto desarrolle PAH; y/o vi) la trampa del ligando de TGF-p es parte de una composición farmacéutica y el método comprende además mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

7. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que: i) la cantidad de trampa del ligando de TGF-p administrada al sujeto es de 0.3-3.0 mg/kg de peso corporal;

ii) la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto una vez cada dos, tres, o cuatro semanas;

iii) la trampa del ligando de TGF-p se administra al sujeto por vía subcutánea;

iv) la trampa del ligando de TGF-p se administra antes, durante, o después de que el sujeto desarrolle PAH; o v) la trampa del ligando de TGF-p es parte de una composición farmacéutica y el método comprende además mezclar un vehículo farmacéuticamente aceptable con la trampa del ligando de TGF-p antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la trampa del ligando de TGF-p al sujeto.

8. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en la que: i) la composición farmacéutica está formulada para liberación modificada, liberación sostenida, o liberación controlada, o una combinación de las mismas;

ii) la composición farmacéutica comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable; o iii) la composición farmacéutica comprende además al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. La trampa del ligando de TGF-p para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el TGF-p es TGF-p1, TGF-p3 o una combinación de los mismos.