KR20230050356A - Pd-l1 및 tgf-베타를 표적화하는 이기능적 분자 - Google Patents

Pd-l1 및 tgf-베타를 표적화하는 이기능적 분자 Download PDF

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Abstract

PD-1 및 PD-L1 상호작용을 차단하는데 있어서 우수한 활성을 가진 항-PD-L1 항체가 제공된다. 인간 TGF-베타 수용체 2형의 세포외 도메인에 융합된 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 다기능적 분자가 또한 제공된다.

Description

PD-L1 및 TGF-베타를 표적화하는 이기능적 분자
PD-1 및 PD-L1 상호작용을 차단하는데 있어서 우수한 활성을 가진 항-PD-L1 항체가 제공된다. 인간 TGF-베타 수용체 2형의 세포외 도메인에 융합된 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 포함하는 다기능적 분자가 또한 제공된다.
최근 수년간 암 면역요법의 흥미로운 발전은 종양학에서 패러다임의 변화로 이어졌다. 가장 주목할 만한 결과는 면역 체크포인트(checkpoint) 억제자 (ICI), 유전적으로 조작된 T-세포 및 이중특이적 항체 (BsAb)를 포함한 T-세포-기반 요법을 이용한 것이다. T-세포는 절묘한 특이성 및 장기간 기억으로 면역감시 및 종양 근절의 주요 클래스를 나타낸다. 하지만, 종양 미세환경에서, T-세포는 소진되거나 종양 세포에 대해 내성이 생길 수 있다. T-세포 소진은 일반적으로 예정된 사멸 수용체-1 (PD-1), 세포독성 T 림프구 항원-4 (CTLA-4), 림프구-활성화 유전자-3 (LAG-3), T-세포 면역글로불린 도메인 및 무친 도메인-3 (TIM-3), IL-10 수용체, 및 킬러 면역글로불린 수용체를 포함한 억제 수용체의 과발현과 관련이 있다.
이들 체크포인트 분자에 대응하기 위한 단클론성 항체 (mAb) 기반 요법은 종양-침윤성 T-세포를 억제하여, 상이한 악성 종양에서 상당한 임상적 이익을 달성하는 브레이크를 제거할 수 있다. 예를 들어, PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 것은 면역 표준화를 향상시키고 항암 반응을 강화할 수 있다. 하지만, PD-1/PD-L1 차단의 주목할 만한 결핍은 유사한 종양 특성을 가진 동종의 연구 집단에 걸쳐 모순이다. 또한, PD-1/PD-L1 차단 처리는 또한 일부 환자에서 특정 염증성 부작용을 유발할 수 있다. PD-1/PD-L1 차단을 이용한 단일요법의 제한 및 유망한 대안의 부족은 항종양 면역력을 활성화시키고 치료 효능을 향상시킬 수 있는 조합 치료 방법을 찾는 것을 필요하게 만들었다.
M7824 (빈트라푸스프 알파)는 3개의 모든 TGF-β 아이소폼(isoform)에 대한 "트랩(trap)"으로 기능하는 인간 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 수용체 II의 세포외 도메인에 융합된 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 대한 단클론성 항체로 구성된 이기능적 단백질이다. PD-L1 부분은 메르켈 세포(Merkel cell) 암종 및 요로상피암의 치료에 대해 승인된 아벨루맙을 기반으로 한다. 하지만, 현재 임상 데이터는 M7824의 사용이 원치 않는 피부 성장과 관련이 있고 HPV-양성 악성 종양에 걸린 환자에 대한 II기 시험에서 전반적인 반응률은 단지 약 35% 내지 40%였다는 것을 보여준다. 그러므로 개선된 요법이 필요하다.
본 발명은, 일부 구체예에서, PD-L1 단백질 및 TGF-β 둘 다를 표적화하는 이기능적 분자를 제공한다. 항-PD-L1 항체로 구성된 개시된 PD-L1 표적화 유닛은 TGF-β에 대한 트랩으로 기능하는 인간 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 수용체 II의 세포외 도메인에 융합된다. 실험 데이터는 이들 새로운 이기능적 분자가 임상 개발에서 현재 우세한 후보인 M7824보다 더 효과적이라는 것을 보여준다.
그러므로, 본 발명의 한 구체예에 따르면, 항-PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1) 항체 또는 그것의 단편 및 인간 TGF-β RII (TGF-베타 수용체 2형)의 세포외 도메인을 포함하는 다기능적 분자가 제공되며, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편은 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하며, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 7-12, 또는 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함하며, 인간 TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하고 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편에 융합된다.
한 구체예에서, 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1) 항체 또는 그것의 단편이 제공되며, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 7-12, 또는 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함한다.
또한 펩타이드 링커를 통해 서열 번호: 72의 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 다기능적 분자가 제공되며, 펩타이드 링커는 (a) 길이가 적어도 30개의 아미노산 잔기이거나, 또는 (b) 길이가 적어도 25개의 아미노산 잔기이고 알파 헬릭스(helix) 모티프를 포함한다.
또한 본 발명의 분자로 암을 치료하기 위한 용도 및 방법이 제공된다.
도 1은 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8이 높은 친화도로 인간 PD-L1에 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
도 2는 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체가 포유류 세포에서 발현되는 PD-L1에 강력하게 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
도 3은 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체가 높은 친화도로 시노몰구스(cynomolgus) PD-L1에 결합할 수 있지만 래트 또는 마우스 PD-L1에는 결합할 수 없다는 것을 보여준다.
도 4는 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8은 인간 PD1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
도 5는 재조합 PD-L1에 대한 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8의 결합 동역학을 나타낸다.
도 6A-C는 모든 테스트된 인간화된 항체가 인간 PD-L1에 대해 키메라 항체와 비슷한 결합 효율을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 7은 테스트된 인간화된 항체가 포유류 세포에서 발현되는 PD-L1에 높은 효율로 결합할 수 있으며, 키메라 항체와 비슷하다는 것을 보여준다.
도 8A-C는 일부 인간화된 항체가 인간 PD1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
도 9A-C는 일부 인간화된 항체가 인간 CD80으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
도 10은 재조합 인간 PD-L1에 대한 LP008-06, LP008-06a, LP008-06a-DA 및 LP008-06a-ES의 결합 동역학을 나타낸다.
도 11은 인간 PD-L1 및 인간 TGF-β1에 대한 LP008-02의 결합 동역학을 나타낸다.
도 12는 LP008-02 및 LP008-06a-ES가 M7824보다 더 높은 친화도로 PD1 및 PD-L1 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
도 13은 M7824, LP008-02 및 LP008-06a-ES가 TGF-β 표준 신호전달을 효율적으로 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
도 14는 LP008-02 및 LP008-06a-ES가 높은 친화도로 인간 PD-L1에 결합한다는 것을 보여준다.
도 15는 LP008-02 및 LP008-06a-ES가 더 높은 친화도로 시노몰구스 PD-L1에 결합할 수 있지만 래트 PD-L1 또는 마우스 PD-L1에는 결합할 수 없다는 것을 보여준다.
도 16은 LP008-02 및 LP008-06a-ES가 인간 TGF-β에 대해 M7824와 비슷한 결합 효율을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 17은 LP008-02 및 LP008-06a-ES가 시노몰구스 TGF-β, 마우스 TGF-β, 및 래트 TGF-β에 대해 M7824와 비슷한 결합 효율을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 18A-B는 동물 모델에서 LP008-02 및 LP008-06a-ES의 약물 효과를 나타낸다.
도 19는 모든 테스트된 변형된 이기능적 분자가 인간 TGF-β에 대해 LP008-02-1과 비슷한 결합 효율을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 20은 모든 테스트된 변형된 이기능적 분자가 TGF-β 표준 신호전달을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
도 21은 모든 테스트된 변형된 이기능적 분자가 인간 TGF-β에 대해 LP008-02-1과 비슷한 결합 효율을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 22는 모든 테스트된 변형된 이기능적 분자가 TGF-β 표준 신호전달을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
도 23은 항체 MPDL3280A, 47C6A3, Hu67F3G7-22, 및 Hu89C10H8-7이 높은 친화도로 PD1 및 PD-L1 상호작용을 차단할 수 있다는 것을 보여준다.
정의
용어 "하나의(a)" 또는 "하나의(an)" 실체물은 상기 실체물 중 하나 이상을 나타내며; 예를 들어, "하나의 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나의" (또는 "하나의"), "하나 이상의", 및 "적어도 하나"는 본원에서 교체 가능하게 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하여 그것에 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 나타낸다. 항체는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편 또는 그것들의 단일 사슬일 수 있다. 따라서, 용어 "항체"는 항원으로의 결합의 생물학적 활성을 가진 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 이러한 것들의 예는 중쇄 또는 경쇄 또는 그것들의 리간드 결합 부분의 상보성 결정 영역 (CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 그것들의 임의의 일부, 또는 결합 단백질의 적어도 하나의 일부를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 일부, 예컨대 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"은 압타머, 스피겔머(spiegelmer), 및 디아바디를 포함한다. 용어 "항체 단편"은 또한 특이적 항원에 결합하여 복합체를 형성함으로써 항체와 유사한 역할을 하는 임의의 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 폴리펩타이드의 다양한 클래스를 포함한다. 당업자들은 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며 그것들 중에서 일부 하위 클래스 (예를 들어, γ1 - γ4)를 갖는다는 것을 인정할 것이다. 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로 항체의 "클래스"를 결정하는 것이 이 사슬의 성질이다. 면역글로불린 하위 클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, 등은 잘 특성화되어 있고 기능적 특수화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스 및 아이소타입 각각의 변형된 버전은 본 발명을 고려하면 당업자가 쉽게 구별 가능하고, 따라서, 본 발명의 범위 내에 있다. 모든 면역글로불린 클래스는 분명히 본 발명의 범위 내에 있고, 다음 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스와 관련이 있을 것이다. IgG에 관하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤(Dalton)의 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 사슬은 전형적으로 "Y" 구성형태로 이황화 결합에 의해 결합되며 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 괄호로 묶는다.
"특이적으로 결합한다" 또는 "~에 대한 특이성을 갖는다"는 일반적으로 항체가 그것의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 그 결합은 항원-결합 도메인과 에피토프 사이에 일부 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 무작위의 무관한 에피토프에 결합할 때보다 더 쉽게 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때 상기 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 어떤 항체가 어떤 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 정량화하는데 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 항체 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 갖는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처리 및 예방적(prophylactic) 또는 예방적(preventative) 조치 둘 다를 나타내며, 목적은 원하지 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 방지하거나 둔화시키는 (약화시키는) 것이다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 검출 가능하든 검출 불가능하든 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 관해 (부분적이든 전체적이든)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존률과 비교하여 연장된 생존률을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 이미 병태 또는 장애를 가지고 있는 것들, 뿐만 아니라 병태 또는 장애에 취약한 것들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 것들을 포함한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 요법이 필요한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체는 인간, 가축, 경작용 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 암소, 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료를 필요로 하는 환자" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은, 예를 들어, 검출, 예방 절차 및/또는 치료에 사용된 본 발명의 항체 또는 조성물의 투여로부터 이익을 얻는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
다기능적 분자
첨부된 실험예에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 항-PD-L1 유닛 및 TGF-β-표적화 유닛을 포함하는 많은 이기능적 융합 단백질을 확인할 수 있었다. 실시예 14에서 나타난 바와 같이, 예를 들어, 테스트된 이기능적 단백질, LP008-02 및 LP008-06a-ES는 둘 다 MC38 마우스 모델에서 M7824보다 더 큰 효능을 나타냈다. M7824는 HPV-양성 악성 종양에 걸린 환자에 대해 현재 II기 임상 시험 중인 PD-L1/TGF-β 이중 표적화 융합 단백질이다. M7824의 항-PD-L1 유닛은 가장 중요한 PD-L1 항체이고 메르켈 세포 암종 및 요로상피암의 치료에 대해 승인된 아벨루맙을 기반으로 한다. 그러므로 M7824와 비교하여 새롭게 개시된 이기능적 단백질의 우수한 성능은 놀랍다.
또한, 실시예 12에서 나타난 바와 같이, 본원에서 개시된 이기능적 단백질은 더 양호한 종 특이성을 갖는다. 마우스 및 래트 PD-L1과도 반응하는 M7824와 달리, 새로운 이기능적 단백질은 우수한 PD-L1 결합 활성에 더하여 인간 및 시노몰구스 PD-L1에만 결합한다.
그러므로, 한 구체예에서, 본 발명은 적어도 항-PD-L1 유닛 및 TGF-β-표적화 유닛을 가진 다기능적 분자를 제공한다. 항-PD-L1 유닛은 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 단편을 포함할 수 있다. TGF-β-표적화 유닛은 바람직하게는 인간 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 수용체 II (TGF-β RII 또는 TGFBR2)의 세포외 도메인이다.
TGF-β RII는 2개의 아이소폼을 갖는다. 아이소폼 A (NP_001020018.1; 서열 번호: 70)는 아이소폼 B (NP_003233.4; 서열 번호: 71)보다 더 긴 세포외 단편을 갖지만, 그것들은 동일한 코어 엑토도메인(ectodomain) (서열 번호: 72)을 공유한다. 그것들의 서열은 하기 표 A에서 제공된다.
Figure pct00001
일부 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 코어 엑토도메인 (서열 번호: 72), 뿐만 아니라 일부 측접(flanking) 잔기를 포함한다. 예를 들어, 실시예 8-16에서 테스트된 변이체 1 (서열 번호: 61)은 N-말단 측면에서 추가적인 25개의 잔기 및 C-말단 측면에서 9개의 잔기를 포함한다. 또 다른 변이체인 변이체 2 (서열 번호: 73)는 단지 9개의 C-말단 측접 잔기를 포함한다. 변이체 4-7 (서열 번호: 75-78)과 같은 다른 변이체는 서열 번호: 61의 N-말단 서열의 일부를 대체하는 대안의 링커를 포함한다.
일부 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 61의 처음 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 아미노산을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 61의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 아미노산을 포함하지 않는다.
또 다른 변이체인 변이체 3은 변이체 1을 기반으로 하지만 적어도 N-말단 부분 내의 X 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다 (서열 번호: 88). 이들 X 위치는 잠재적인 글리코실화 부위이다. 그러므로, 치환은 K, S, 및 N 이외의 아미노산으로 이루어진다. 치환의 예는, 제한 없이, R, A, G, Q, I, L, D, 또는 E이다.
일부 구체예에서, 항-PD-L1 유닛은 하기 추가로 기재된 바와 같이 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편으로 구성된다. 항체 또는 단편은, 제한 없이, 통상적인 완전한 IgG 포맷, Fab 단편, 단일 사슬 단편, 또는 단일 도메인 항체와 같은 임의의 항체 포맷을 취할 수 있다. 항체 또는 그것의 단편이 경쇄 및 별개의 중쇄를 가질 때, TGF-β RII 세포외 도메인은 경쇄 또는 중쇄에 융합될 수 있다. 항체 또는 그것의 단편이 단일 단백질 사슬 (예를 들어, scFv) 상에 경쇄 및 중쇄를 가질 때, TGF-β RII 세포외 도메인은 경쇄 또는 중쇄에 더 가까워지도록 융합될 수 있다.
일부 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 항-PD-L1 유닛의 사슬의 N-말단에 융합된다. 일부 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 항-PD-L1 유닛의 사슬의 C-말단에 융합된다. 바람직한 구체예에서, TGF-β RII 세포외 도메인은 선택적으로 펩타이드 링커 (예를 들어, 서열 번호: 60, 또는 1, 2, 또는 3개의 GGGGS (서열 번호: 86) 반복 부위)를 통해 항-PD-L1 유닛의 중쇄의 C-말단에 융합된다.
일부 구체예에서, 항-PD-L1 유닛은 VH (중쇄 가변 영역) 및 VL (경쇄 가변 영역)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3, 예컨대 표 1A-1C에서 예시된 것들을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 SDYAWN (서열 번호: 7), YIIYSGSTSYNPSLKS (서열 번호: 8), STMIATNWFAY (서열 번호: 9), KASQDVSLAVA (서열 번호: 10), WASTRHT (서열 번호: 11), 및 QQHYITPWT (서열 번호: 12)의 서열을 포함한다. 이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 25 (마우스) 및 26-28 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 29 (마우스) 및 30 (인간화된 것)에서 제공된다. 예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 26, 또는 27, 또는 28의 VH 및 서열 번호: 30의 VL을 갖는 것들을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 DFWVS (서열 번호: 13), EIYPNSGVSRYNEKFKG (서열 번호: 14), YFGYTYWFGY (서열 번호: 15), RASKSVSTYMH (서열 번호: 16), SASHLES (서열 번호: 17) 및 QQSNELPVT (서열 번호: 18)의 서열을 포함한다. 이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 31 (마우스) 및 32-37 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 38 (마우스) 및 39-43 (인간화된 것)에서 제공된다. 예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 34의 VH 및 서열 번호: 39, 40, 또는 43의 VL을 갖거나, 서열 번호: 35의 VH 및 서열 번호: 39의 VL을 갖거나, 또는 서열 번호: 37의 VH 및 서열 번호: 39의 VL을 가진 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 34의 VH 및 서열 번호: 43의 VL을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 대안으로, VH CDR2는 SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91) 또는 SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92)를 포함할 수 있다. 대안으로, VL CDR3은 SQYQSGNT (서열 번호: 93)일 수 있다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다.
이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 44 (마우스) 및 45-49 (인간화된 것) 및 57-58 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 50 (마우스) 및 51-55 (인간화된 것) 및 56 (인간화된 것)에서 제공된다.
예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 49의 VH 및 서열 번호: 52 또는 54의 VL을 갖거나, 또는 서열 번호: 48의 VH 서열 번호: 53 또는 54의 VL을 갖는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 48의 VH 및 VL of 서열 번호: 53을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 48의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 57의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 58의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 중쇄 불변 영역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변 영역 (예를 들어, CL)을 더 포함한다. 예시의 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 59에서 제공되고, 예시의 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 67 (잔기 108-214)에서 제공된다.
TGF-β RII x 항체 융합체
상이한 융합 단백질 디자인을 이용한 테스트 (예를 들어, 표 15)는 TGF-β RII의 코어 엑토도메인 (서열 번호: 72)만이 활성에 필요하다는 것을 입증하였다. 또한, TGF-β RII의 세포외 도메인은 항체에 직접적으로 융합되어서는 안 된다. 충분한 거리가 있어야 하며, 펩타이드 링커에 의해 제공된다.
엑토도메인에 관하여, 펩타이드 링커 (완전히 인공적인 링커일 수 있거나, 또는 엑토도메인에 대한 N-말단에 세포외 단편, 서열 번호: 89의 일부를 포함한다)는 최소한의 길이를 가져야 한다. 거리가 너무 짧으면, 융합 단백질은 감소된 안정성 또는 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 최소한의 길이는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, 링커는 35, 40, 45, 50, 55,60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170 또는 200개의 아미노산 잔기 이하이다.
일부 구체예에서 플렉시블(flexible) 링커, 예를 들어, 하나 이상의 G4S (서열 번호: 86) 유닛의 포함은 다기능적 분자의 안정성 및/또는 활성에 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 플렉시블 링커는 글리신을 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 포함한다. 일부 구체예에서, 플렉시블 링커는 하나 이상의 세린을 포함한다. 일부 구체예에서, 플렉시블 링커는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 G4S (서열 번호: 86) 반복 부위를 포함한다.
일부 구체예 (예를 들어, 실시예 17)에서, 천연 N-말단 단편 (IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFP; 서열 번호: 89)은 치환 펩타이드로 대체되어 희생 없이 또는 심지어 활성의 개선과 함께 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 치환 펩타이드는 서열 번호: 89와 상이하지만 서열 번호: 89에 대해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는다.
예시의 치환 펩타이드는 IPPHVQXXVNNDMIVTDNXGAVKFP (서열 번호: 88)이며, 여기서 X는 K, S, 또는 N을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 치환은 강성 디펩타이드 PP를 제거하기 위해 이루어질 수 있으며, 잠재적인 분열 부위 QK, N 및/또는 K의 제거는 유연성을 증가시키고, 및/또는 소수성 잔기를 감소시키도록 다수의 글리신 잔기를 포함한다. 이러한 하나의 예는 TAGHTQTSTGGGAITTGTSGAGHGP (서열 번호: 87) 또는 서열 번호: 87에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 변이체이다. 일부 구체예에서, 변이체는 적어도 4개의 G를 포함하고, PP 디펩타이드를 포함하지 않으며, I, L, M, F, V, W, Y 및 P로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 변이체는 적어도 5개의 G 및 I, L, M, F, V, W, Y 및 P로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이하의 소수성 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편과 TGF-β RII의 엑토도메인 (서열 번호: 72) 사이의 펩타이드 링커는 플렉시블 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 서열 번호: 89의 치환 펩타이드를 포함한다. 일부 구체예에서, 펩타이드 링커는 플렉시블 링커 및 치환 펩타이드 둘 다를 포함한다. 일부 구체예에서, 플렉시블 링커는 치환 펩타이드에 대해 N-말단에 있다. 일부 구체예에서, 플렉시블 링커는 치환 펩타이드에 대해 C-말단에 있다.
일부 구체예에서, 다기능적 분자는 적어도 EEYNTSNPD (서열 번호: 90)의 전체 서열을 포함하지 않는다. 다기능적 분자는 TGF-β RII의 세포외 도메인으로부터 제거된 전체 서열 번호: 90을 가질 수도 있다. 일부 구체예에서, 다기능적 분자는 EEYNTSNPD (서열 번호: 90)의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 초과의 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
다기능적 분자의 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 임의의 항원을 표적화할 수 있다. 비-제한적 예는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, BTLA, CD4, CD2, CD8, CD47 및 CD73이다. 그것들은 또한 본원에 개시된 임의의 항체 또는 단편일 수 있다.
TGF-β RII의 엑토도메인은 항체 또는 단편의 임의의 일부에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 엑토도메인은 항체 또는 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된다. 일부 구체예에서, 엑토도메인은 항체 또는 단편의 Fc 단편의 C-말단에 융합된다.
항-PD-L1 항체 및 단편
항-PD-L1 항체 및 단편이 또한 제공되며, 이것은 다기능적 분자, 이특이적 또는 다중특이적 항체에서 항-PD-L1 유닛으로서, 또는 단일특이적 항체에서 단독으로 사용될 수 있다.
예시의 쥐 항-PD-L1 항체 및 그것들의 인간화되고 개선된 것들이 동반되는 실험예에서 제조되고 테스트되었다. 모든 쥐 항체 (47C6A3, 67F3G7, 및 89C10H8) 및 그것들의 대응되는 인간화된 버전은 우수한 결합 친화도, 교차 반응성 및 PD-1/PD-L1 결합을 억제하는데 있어서의 효과를 나타냈다.
중요하게는, MPDL3280A (아테졸리주맙)와 비교될 때, 인간화된 67F3G7, 및 89C10H8은 PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하느느데 있어서 MPDL3280A보다 더 높은 활성을 나타냈다 (예를 들어, 실시예 18 참조). 또한, 흥미롭게도, 본 발명의 테스트된 모든 항체는 MPDL3280A보다 더 낮은 소수성을 나타냈고 점성을 감소시켰다. 더 높은 소수성은 단백질 가용성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 높은 점성이 또한 고농도 단백질 제제 개발에 대한 장애물이다. 그러므로, 이러한 데이터는 본 발명의 항체가 고농도 항체 제제의 제조에 더 적합하다는 것을 입증한다.
이에 더하여, 본원에서 개시된 항체의 항원-결합 단편은 TGF-β-표적화 유닛을 또한 포함하는 이기능적 융합 단백질에 유닛으로서 포함되었다. 결과로 생성된 이기능적 융합 단백질은 MC38 마우스 모델에서 M7824보다 더 큰 효능을 나타냈다. M7824는 HPV-양성 악성 종양에 걸린 환자에 대해 현재 II기 임상 시험 중인 PD-L1/TGF-β 이중 표적화 융합 단백질이다. M7824의 항-PD-L1 유닛은 가장 중요한 PD-L1 항체이고 메르켈 세포 암종 및 요로상피암의 치료에 대해 승인된 아벨루맙을 기반으로 한다. 그러므로, 이들 데이터는 이기능적 또는 다기능적 분자를 제조하는데 있어서 본원에서 개시된 항체의 고유한 이점을 입증한다.
일부 구체예에서, 항-PD-L1 항체 또는 단편은 VH (중쇄 가변 영역) 및 VL (경쇄 가변 영역)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3, 예컨대 표 1A-1C에서 예시된 것들을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 SDYAWN (서열 번호: 7), YIIYSGSTSYNPSLKS (서열 번호: 8), STMIATNWFAY (서열 번호: 9), KASQDVSLAVA (서열 번호: 10), WASTRHT (서열 번호: 11), 및 QQHYITPWT (서열 번호: 12)의 서열을 포함한다. 이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 25 (마우스) 및 26-28 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 29 (마우스) 및 30 (인간화된 것)에서 제공된다. 예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 26, 또는 27, 또는 28의 VH 및 서열 번호: 30의 VL을 가진 것들을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 DFWVS (서열 번호: 13), EIYPNSGVSRYNEKFKG (서열 번호: 14), YFGYTYWFGY (서열 번호: 15), RASKSVSTYMH (서열 번호: 16), SASHLES (서열 번호: 17) 및 QQSNELPVT (서열 번호: 18)의 서열을 포함한다. 이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 31 (마우스) 및 32-37 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 38 (마우스) 및 39-43 (인간화된 것)에서 제공된다. 예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 34의 VH 및 서열 번호: 39, 40, 또는 43의 VL을 갖거나, 서열 번호: 35의 VH 및 서열 번호: 39의 VL을 갖거나, 또는 서열 번호: 37의 VH 및 서열 번호: 39의 VL을 가진 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 34의 VH 및 서열 번호: 43의 VL을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 대안으로, VH CDR2는 SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91) 또는 SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92)를 포함할 수 있다. 대안으로, VL CDR3은 SQYQSGNT (서열 번호: 93)일 수 있다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYNSGNT (서열 번호: 24)의 서열을 포함한다.
한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDSVKG (서열 번호: 20), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPDAVKG (서열 번호: 91), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다. 한 구체예에서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 NYWMT (서열 번호: 19), SITNTGSSTFYPESVKG (서열 번호: 92), DTTIAPFDY (서열 번호: 21), KASQNLNEYLN (서열 번호: 22), KTNTLQA (서열 번호: 23) 및 SQYQSGNT (서열 번호: 93)의 서열을 포함한다.
이러한 VH 서열의 예는 서열 번호: 44 (마우스) 및 45-49 (인간화된 것) 및 57-58 (인간화된 것)에서 제공된다. 이러한 VL 서열의 예는 서열 번호: 50 (마우스) 및 51-55 (인간화된 것) 및 56 (인간화된 것)에서 제공된다.
예시의 인간화된 항체는 서열 번호: 49의 VH 및 서열 번호: 52 또는 54의 VL을 갖거나, 또는 서열 번호: 48의 VH 및 서열 번호: 53 또는 54의 VL을 가진 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 48의 VH 및 서열 번호: 53의 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 48의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 57의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다. 한 구체예에서, 인간화된 항체는 서열 번호: 58의 VH 및 서열 번호: 56의 VL을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편은 중쇄 불변 영역 (예를 들어, CH1, CH2 및/또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변 영역 (예를 들어, CL)을 추가로 포함한다. 예시의 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 59에서 제공되고, 예시의 경쇄 불변 영역은 서열 번호: 67 (잔기 108-214)에서 제공된다.
항체의 활성을 유지하거나 심지어는 그것들을 개선할 수 있는 작은 변화 (예를 들어, 하나의 아미노산의 추가, 결실 또는 치환)가 이들 CDR 서열 중에서 디자인될 수 있다는 것이 고려된다. 이러한 변형된 CDR 서열은 CDR 변이체라고 불린다. 또한 본원에서 개시된 항체가 그것들이 유래된 자연 발생 결합 폴리펩타이드와 아미노산 서열이 다르도록 변형될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 시작 서열과 유사할 수 있으며, 예를 들어, 시작 서열에 대해 특정 퍼센트의 동일성을 가지며, 예를 들어, 그것은 시작 서열과 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 항체 또는 단편은 지정된 CDR 서열을 유지한다.
특정 구체예에서, 항체는 항체와 정상적으로 회합되지 않은 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시의 변형은 하기 더 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 플렉시블 링커 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기능적 모이어티 (예를 들어, PEG, 약물, 독소, 또는 라벨)를 추가하도록 변형될 수 있다.
단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 단백질을 제조하는 방법
본 발명의 다기능적 단백질, 항체, 그것들의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그것들의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상에서 항원-결합 폴리펩타이드, 그것들의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄의 일부를 암호화할 수 있다.
항체를 제조하는 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있고 본원에서 기재되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드의 가변 영역 및 불변 영역 둘 다는 완전한 인간이다. 완전한 인간 항체는 해당 분야에 기재된 기술을 사용하여 그리고 본원에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항원에 대한 완전한 인간 항체는 항원 시험에 반응하여 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 내인성 유전자좌(loci)가 비활성화된 트랜스제닉(transgenic) 동물에게 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 예시의 기술은 미국 특허 6,150,584; 6,458,592; 6,420,140 (그 전문이 참조로 포함됨)에서 기재되어 있다.
암 치료
본원에서 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체, 변이체 또는 유도체 는 특정 치료 및 진단 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에서 기재된 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위한 환자, 예컨대 동물, 포유류, 및 인간에게 본 발명의 다기능적 분자 또는 항체의 투여를 수반하는 다기능적 분자- 또는 항체-기반 요법에 관한 것이다. 본 발명의 치료 화합물은 본 발명의 항체 (본원에서 기재된 바와 같이 그것의 변이체 및 유도체를 포함함) 및 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 (본원에서 기재된 바와 같이 그것의 변이체 및 유도체를 포함함)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 또한 암을 치료하거나 억제하는데 사용될 수 있다. PD-L1은 종양 세포에서 과발현될 수 있다. 종양-유래된 PD-L1은 면역 세포 상의 PD-1에 결합하여 항종양 T-세포 면역력을 제한할 수 있다. 쥐 종양 모델에서 소분자 억제자, 또는 PD-L1을 표적화하는 단클론성 항체를 이용한 결과는 표적화된 PD-L1 요법이 중요한 대안이고 종양 성장의 효과적인 제어에 대한 현실적인 접근법이라는 것을 나타낸다. 실험예에서 입증된 바와 같이, 항-PD-L1 항체는 적응성 면역 반응 기작을 활성화시켰으며, 이것은 암 환자에서 개선된 생존률로 이어질 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 필요로 하는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 환자에게 본 발명의 다기능적 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 환자에서 암 세포 중 적어도 하나 (예를 들어, 간질 세포)는 PD-L1을 발현하거나, 과발현하거나, 또는 발현하도록 유도된다. 예를 들어, PD-L1 발현의 유도는 종양 백신의 투여 또는 방사선 요법에 의해 실행될 수 있다.
PD-L1 단백질을 발현하는 종양은 방광암, 비-소세포 폐암, 신장암, 유방암, 요도암, 결장직장암, 두경부암, 편평세포암, 메르켈 세포 암종, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 및 소세포 폐암을 포함한다. 따라서, 본원에서 개시된 항체는 임의의 하나 이상의 이러한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포 요법이 또한 본 발명에서 제공된다. 본 발명의 항-PD-L1 항체와 접촉하게 되는 (또는 대안으로는 본 발명의 항-PD-L1 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포가 사용될 수 있다. 이러한 접촉 또는 조작시, 세포는 치료를 필요로 하는 암 환자에 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시도니 유형 중 어느 것의 암을 가질 수 있다. 세포 (예를 들어, T 세포)는, 제한 없이, 예를 들어, 종양-침윤성 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 암 환자 자체로부터 단리되었다. 일부 구체예에서, 세포는 공여체에 의해 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 단리될 때, 원치 않는 면역 반응이 최소화될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수 있는, 증가된 세포 생존률과 관련된 추가적인 질환 또는 병태는 악성 종양 및 관련된 장애, 예컨대 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병 (예컨대 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성, 및 적백혈병)) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함함), 진성다혈구증(polycythemia vera), 림프종 (예를 들어, 호지킨 병(Hodgkin's disease) 및 비-호지킨 병(non-Hodgkin's disease)), 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄병, 및, 제한되는 것은 아니지만, 섬유 육종, 점액 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 척색종, 혈관 육종, 내피 육종, 림프관 육종, 림프관 내피 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 갑상선암, 내막암, 흑색종, 전립선암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간세포암, 담관암종, 융모막암종, 정상피종, 배아암종, 윌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경집종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아종과 같은 육종 및 암종을 포함하는 고체 종양의 진행, 및/또는 전이를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
조성물
본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 항체의 유효량, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제 (예를 들어, 면역 체크포인트 억제자)를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 또한, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제제화 보조제일 것이다.
용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클(vehicle)을 나타낸다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등을 포함하는 오일일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 또한, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트를 함유할 수 있다. 항세균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 바이설파이트; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 장성의 조정을 위한 작용제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 또한 구상된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 분말, 지속 방출형 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 바인더(binder) 및 담체, 예컨대 트리글리세리드와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 표준 담체, 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카르보네이트, 등을 포함할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin (본원에 참조로 포함됨)에서 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 항원-결합 폴리펩타이드의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다회수 용량 바이알에 동봉될 수 있다.
구체예에서, 조성물은 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 사세(sachet)와 같은 밀봉된 용기 내의 동결건조된 분말 또는 무수 농축액으로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우에, 멸균 약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 조사에 의해 투여되는 경우에, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 PD-L1에 대한 마우스 단클론성 항체의 생성
이 실시예는 하이브리도마(hybridoma) 기술을 사용한 항-인간-PD-L1 마우스 단클론성 항체의 생성을 기재한다.
항원: CHOK1 세포주 (PDL1- CHOK1 세포주)에서 고도로 발현되는 인간 PDL1-Fc 단백질 및 인간 PD-L1.
면역화: 인간 PD-L1을 표적화하는 마우스 단클론성 항체를 생성하기 위해, Balb/c 마우스 및 Wistar 래트를 먼저 PD-L1-Fc 단백질로 면역화하였다. 면역화된 마우스 및 래트를 그 이후에 각각 PD-L1-Fc 단백질 및 CHO-K1/PD-L1 안정한 세포로 부스팅하였다(boosted). PD-L1 단백질에 결합된 항체를 생산하는 마우스 또는 래트를 선택하기 위해서, 면역화된 마우스 또는 래트의 혈청을 ELISA에 의한 항체 역가를 평가하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 ELISA 코팅 완충액 중의 0.5 μg/ml의 인간 PD-L1 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 1% BSA의 150 μl/웰로 블로킹하였다. 면역화된 마우스로부터의 혈청의 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 37℃에서 1시간 동안 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (Horse Radish Peroxidase: HRP)와 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체 또는 HRP와 컨쥬게이션된 항-래트 IgG 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다. 면역화 3라운드 이후, 면역 반응을 또한 rhPD-L1 단백질에 대한 혈청 ELISA 및 CHO-K1/PDL-1 안정한 세포주에 대한 FACS로 테스트하였으며, CHO-K1 모 세포주가 음성 대조군의 역할을 하였다. 충분한 역가의 항-PDL1 IgG를 나타낸 마우스를 면역화 3라운드 이후 25 μg 인간 PDL1-Fc 단백질로 부스팅하였다. 결과로 생성된 마우스를 융합에 사용하였다. 하이브리도마 상층액을 ELISA로 항-PD-L1 IgG에 대해 테스트하였다.
세포 융합: 전기 융합으로 융합을 수행하였다. 융합된 세포를 각각의 융합체에 대해 50개의 96웰 플레이트에 평판 배양하였다.
스크리닝: 상층액을 재조합 인간 (rh) PD-L1-Fc 단백질 및 대응 스크리닝 항원에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. 그 다음에, 양성 상층액은 CHO-K1/PD-L1 안정한 세포주 및 rhPD-1-Fc 단백질에 대한 수용체 블로킹 FACS로의 1차 스크리닝으로부터 확인 스크리닝을 거쳤다.
서브클로닝 및 스크리닝: 각각의 융합체로부터의 양성 1차 클론을 단일 모 세포로부터 유래되었다는 것을 보장하기 이해 희석배수를 제한함으로써 서브클로닝하였다. 서브클로닝을 1차 클론과 동일한 접근법으로 스크리닝하였고 양성 클론의 배양 상층액은 친화도 순위 결정에 의해 추가적인 확인 스크리닝을 거쳤다. 하이브리도마 클론 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8을 추가의 분석을 위해 선택하였다. 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8의 가변 영역의 아미노산 서열은 하기 표 1에서 나열되어 있다.
Figure pct00002
실시예 2: PD-L1 항원에 대한 결합 활성
ELISA 테스트
하이브리도마 클론 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8의 결합 활성을 평가하기 위해서, 이들 클론의 키메라 mAb를 ELISA 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5μg/ml의 인간 PD-L1-Fc 단백질 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 37℃에서 30 min 동안 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 마우스-항-인간 IgG Fab 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450 nm에서 분석하였다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8은 인간 PD-L1에 높은 친화도로 결합하였다 (47C6A3에 대해 EC50=10.24ng/ml, 67F3G7에 대해 EC50=10.76ng/ml, 89C10H8에 대해 EC50=8.112ng/ml).
세포-기반 결합: FACS를 사용하여 인간 PD-L1 과발현된 CHOK1 세포에서 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 키메라 mAb의 결합 활성을 평가하였다.
간략히 말하면, PDL1-CHOK1 세포를 먼저 100nM에서 시작하여 3배 단계 희석된 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 키메라 mAb와 함께 4℃에서 40 min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, Alexa Fluor® 647 AffiniPure 염소 항-인간 IgG (H+L)를 각 웰에 추가하고 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. Alexa Fluor® 647의 평균 형광 강도 (MFI)를 FACSCanto에 의해 평가하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8은 PDL1-CHOK1 세포에 높은 친화도로 결합하였다 (47C6A3에 대해 EC50=0.1476 nM, 67F3G7에 대해 EC50=0.1035 nM, 89C10H8에 대해 EC50=0.1696 nM).
교차 종 활성
각각 인간, 마우스, 래트, 및 시노몰구스 PD-L1으로의 키메라 항체의 결합을 평가하기 위해 ELISA 테스트를 수행하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5 μg/ml의 인간, 마우스, 래트 및 시노몰구스 PD-L1 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150 μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 키메라 항체의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 마우스-항-인간 IgG Fab 항체와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다. 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체는 인간 및 시노몰구스 PD-L1에 결합했지만 래트 및 마우스 PD-L1에는 결합하지 않았다 (도 3 및 표 2).
Figure pct00003
실시예 3. 항체에 의한 PD-1으로의 PD-L1 결합의 차단
수용체 PD-1로의 재조합 인간 PD-L1 결합에 대한 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 키메라 mAb의 차단 효과를 평가하기 위해, ELISA 기반 수용체 차단 검정을 이용하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5 μg/ml의 인간 PD-L1-Fc 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150 μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 50 μl 비오틴-라벨링된 인간 PD-1-Fc 단백질 및 10 μg/ml에서 시작하는 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체의 3배 희석액 50 μl를 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 스트렙타비딘-HRP와 함께 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8은 각각 91.18 ng/ml, 139.8 ng/ml,129.8 ng/ml으로 검출된 IC50에서 인간 PD1로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제하였다.
실시예 4: mAb의 결합 친화도
재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his 태그)로의 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 항체의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 Biacore로 테스트하였다. 47C6A3, 67F3G7 및 89C10H8 mAb를 단백질 A 칩을 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his 태그 단백질의 단계 희석액을 캡쳐된 항체 위에 2min 동안 30 μl/min의 유속으로 주사하였다. 항원을 480-1500s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200 상에서 수행하였다. Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 결과는 하기 도 5 및 표 3에서 나타나 있다.
Figure pct00004
실시예 5. 마우스 항체의 인간화
47C6A3, 67F3G7, 및 89C10H8 가변 영역 유전자를 이용하여 인간화된 mAb를 생성하였다. 이 공정의 첫 번째 단계에서, 47C6A3, 67F3G7, 및 89C10H8의 VH 및 VL 또는 VK의 아미노산 서열을 인간 Ig 유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스와 비교하여 전반적으로 가장 일치하는 인간 생식계열 Ig 유전자 서열을 발견하였다. 47C6A3의 경쇄에 대해, 인간 Vk1-4가 가장 적합한 생식계열이고, 중쇄에 대해, 인간 VH1-2를 백본으로 선택하였다. 67F3G7의 경쇄에 대해, 가장 가까운 인간 일치는 Vk1-39/JK4 유전자이고, 중쇄에 대해 가장 가까운 인간 일치는 VH1-2/JH4-FW4 유전자이다. 89C10H8의 경쇄에 대해, 가장 가까운 인간 일치는 Vk1-17/JK2 유전자이고, 중쇄에 대해 가장 가까운 인간 매치는 VH3-21/JH3 유전자이다.
47C6A3의 VL에 대해, 인간 Vk1-4가 가장 적합한 생식계열이고, 47C6A3의 VH에 대해, 인간 VH1-2를 백본으로 선택하였다. CDRL1, L2, 및 L3이 Vk1-4 유전자의 프레임워크 서열로 이식되고, CDRH1, H2, 및 H3이 VH1-2 유전자의 프레임워크 서열로 이식된 47C6A3의 인간화된 가변 도메인 서열을 디자인하였다. 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 미칠 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 3D 모델을 생성하였다. 중쇄의 경우에, 프레임워크에서 R, M, 및 I가 역돌연변이에 수반되었다.
CDRL1, L2 및 L3이 Vk1-39/JK4 유전자의 프레임워크 서열에 이식되고, CDRH1, H2, 및 H3이 VH1-2/JH4-FW4 유전자의 프레임워크 서열에 이식된 67F3G7의 인간화된 가변 도메인 서열을 디자인하였다. 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 미칠 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 3D 모델을 생성하였다. 중쇄의 경우에, 프레임워크에서 V, K, T, 및 I가 역돌연변이에 수반되었다. 경쇄의 경우에, 프레임워크에서 T, V, L, 및 Q가 역돌연변이에 수반되었다.
CDRL1, L2 및 L3이 Vk1-17/JK2 유전자의 프레임워크 서열에 이식되고, CDRH1, H2, 및 H3이 VH3-21/JH3 유전자의 프레임워크 서열에 이식된 89C10H8의 인간화된 가변 도메인 서열을 디자인하였다. 마우스 아미노산을 인간 아미노산으로 대체하는 것이 결합 및/또는 CDR 입체구조에 영향을 미칠 수 있는 임의의 프레임워크 위치가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 3D 모델을 생성하였다. 중쇄의 경우에, 프레임워크에서 A, T, I, 및 S가 역돌연변이에 수반되었다. 경쇄의 경우에, 프레임워크에서 Y, I, E, 및 F가 역돌연변이에 수반되었다.
인간화된 항체 중 일부의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이 하기 표 4에서 나열된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
유전자를 pcDNA 3.4 벡터에 클로닝하고 293F 세포로 트랜스펙션하였다. 항체를 다음 표에 따라 생산하였다.
인간화된 VH 및 VL 유전자를 합성에 의해 생산한 다음 각각 인간 감마 1 및 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 벡터에 클로닝하였다. 인간 VH 및 인간 VL의 쌍 형성은 41개의 인간화된 항체를 생성하였다 (표 5 참조).
Figure pct00008
실시예 6: 인간화된 항체의 항원 결합 성질
재조합 인간 PD-L1로의 결합
항원 결합 활성을 평가하기 위해서, 인간화된 항체를 ELISA 테스트하였다. 간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5 μg/ml의 인간 PD-L1-Fc 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 200 μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 인간화된 항체의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 마우스-항-인간 IgG Fab 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 모든 인간화된 항체는 키메라 항체로서 인간 PD-L1과 비슷한 결합 효율을 나타냈다.
인간화된 항체의 결합 동역학을 분석하기 위해서, 이 실시예는 Biacore를 사용하여 친화도 순위 결정을 수행하였다. 표 6에서 나타난 바와 같이, Hu67F3G7-2, Hu67F3G7-3, Hu67F3G7-5, Hu67F3G7-7, Hu67F3G7-22, Hu89C10H8-4, Hu89C10H8-7, Hu89C10H8-11, 및 Hu89C10H8-12는 높은 친화도를 나타냈으며, 이것은 키메라 항체와 비슷하다.
Figure pct00009
포유류 세포 상에서 과발현된 인간 PD-L1로의 결합
항원 결합 성질을 평가하기 위해서, 인간화된 항체를 FACS에 의해 포유류 세포 상에서 과발현된 PD-L1으로의 결합에 대해 분석하였다. 간략히 말하면, PDL1- CHOK1 세포를 먼저 15 μg/ml에서 시작하여 3배 단계 희석된 인간화된 항체와 함께 4℃에서 40 min 동안 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, Alexa Fluor® 647 AffiniPure 염소 항-인간 IgG (H+L) 항체를 각 웰에 추가하고 4℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. Alexa Fluor® 647의 MFI를 FACSCanto로 평가하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 모든 인간화된 항체는 포유류 세포 상에서 발현된 PD-L1에 고도로 효율적으로 결합할 수 있다.
Biacore에 의한 인간화된 항체의 전체 동역학 친화도
재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his 태그)로의 인간화된 항체의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 Biacore에 의해 테스트하였다. Hu47C6A3-1, Hu47C6A3-2, Hu47C6A3-3, Hu67F3G7-2, Hu67F3G7-3, Hu67F3G7-5, Hu67F3G7-7, Hu67F3G7-22, Hu89C10H8-4, Hu89C10H8-7, Hu89C10H8-11, 및 Hu89C10H8-12 mAb를 단백질 A 칩을 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his 태그 단백질의 단계 희석액을 30 μl/min의 유속으로 2 min 동안 캡쳐된 항체 위에 주사하였다. 항원을 1500s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200 상에서 수행하였다. 데이터 분석을 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였고 결과는 하기 표 7에서 나타나 있다.
Figure pct00010
실시예 7: 인간화된 항체에 의한 PD1로의 PDL1의 결합의 차단
재조합 인간 PD-L1을 사용하는 수용체 차단 검정
인간 PD-L1에 대해 2개의 수용체, PD-1 및 CD80이 있다. 이들 2개의 단백질에 대한 인간화된 PD-L1 항체의 차단 성질을 분석하기 위해서, 단백질 기반 수용체 차단 검정을 본원에서 이용하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5μg/ml의 인간 PD-L1-Fc 단백질 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150 μl/웰의 1% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블로킹하였다. 50μl 비오틴-라벨링된 인간 PD-1-Fc 또는 CD80-Fc 단백질 및 10 μg/ml에서 시작하는 PD-L1 항체의 3배 희석액 50 μl를 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween로 세척한 다음 스트렙타비딘-HRP와 함께 37℃에서 10 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다. 도 8에서 나타난 바와 같이, Hu47C6A3-1, Hu47C6A3-2, Hu47C6A3-3, Hu67F3G7-2, Hu67F3G7-3, Hu67F3G7-5, Hu67F3G7-7, Hu67F3G7-22, Hu89C10H8-4, Hu89C10H8-7, Hu89C10H8-11, 및 Hu89C10H8-12는 인간 PD1으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제하였다. 게다가, Hu47C6A3-1, Hu47C6A3-2, Hu47C6A3-3, Hu67F3G7-2, Hu67F3G7-3, Hu67F3G7-5, Hu67F3G7-7, Hu67F3G7-22, Hu89C10H8-4, Hu89C10H8-7, Hu89C10H8-11, 및 Hu89C10H8-12는 용량 의존적 방식으로 인간 CD80으로의 인간 PD-L1의 결합을 효율적으로 억제하였다 (도 9).
실시예 8. PD-L1 및 TGF-β 경로 둘 다에서 이기능적 단백질 표적화
이기능적 재조합 항-PD-L1 항체 및 TGF-β RII 융합 단백질을 이 실시예에서 제조하고 테스트하였다.
분자의 경쇄는 항-PDL1 mAb의 경쇄이다. 중쇄는 플렉시블 (Gly4Ser)4Gly 링커를 통한 TGF-β RII의 가용성 세포외 도메인의 N-말단에 대한 항-PDL1 mAb의 중쇄의 융합체이다. 융합 접합부에서, 항체 중쇄의 C-말단 리신 잔기를 알라닌으로 돌연변이시켜 잠재적인 단백질 가수분해 분열을 감소시켰다.
일부 예에서, CDR에서 잠재적인 변형 부위를 유사한 아미노산으로 돌연변이시켰다. 항-PD-L1 부분의 서열은 하기 표 8에서 나타나 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
VH 외에, 이기능적 분자의 중쇄는 불변 영역 (A로 돌연변이된 C-말단 K를 가짐), (Gly4Ser)4Gly 링커, 및 TGF-β RII의 가용성 세포외 도메인의 N-말단을 더 포함한다. 그것들의 서열은 표 10에서 나타나 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
실시예 9: 이기능적 분자의 결합 친화도
재조합 PD-L1 단백질 (인간 PD-L1-his 태그)로의 LP008-06, LP008-06a, LP008-06a-DA, 및 LP008-06a-ES 이기능적 분자의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 Biacore로 테스트하였다.
이기능적 분자를 단백질 A 칩을 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his 태그 단백질의 단계 희석액을 30 μl/min의 유속으로 2 min 동안 캡쳐된 항체 위에 주사하였다. 항원을 1500s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200 상에서 수행하였다. 데이터 분석을 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 결과는 하기 도 10 및 표 11에서 나타나 있다.
Figure pct00015
재조합 PD-L1 단백질 및 인간 TGF-β1로의 LP008-02의 결합을 캡쳐 방법을 사용하여 Biacore로 테스트하였다.
LP008-02를 단백질 A 칩을 사용하여 캡쳐하였다. 인간 PD-L1-his 태그 단백질 및 인간 TGF-β1의 단계 희석액을 30 μl/min의 유속으로 2 min 동안 캡쳐된 항체 위에 주사하였다. PD-L1을 680s 동안 해리시키고, TGF-β1을 1000s 동안 해리시켰다. 모든 실험을 Biacore T200 상에서 수행하였다. 데이터 분석을 Biacore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 결과는 하기 도 11 및 표 12에서 나타나 있다.
Figure pct00016
실시예 10: PD-1/PD-L1 차단에 대한 기능적 검정
PD1/PD-L1 상호작용을 차단하는데 있어서 이기능적 분자의 활성을 이 실시예에서 생체 발광 세포-기반 검정으로 측정하였다.
이 검정에서, PD1 효과기 세포가 PD-L1 표적 세포와 동시-배양될 때, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호전달 및 NFAT-RE-매개된 발광을 억제한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 추가는 억제 신호를 방출하고 TCR 활성화 및 NFAT-RE-매개된 발광을 초래할 것이다.
도 12에서 나타난 바와 같이, LP008-02 및 LP008-06a-ES는 M7824보다 훨씬 더 높은 활성으로 PD1 및 PD-L1 상호작용을 차단하였다 (M7824 EC50=0.8504nM, LP008-02 EC50=0.3630nM, LP008-06a-ES EC50=0.4553nM).
실시예 11: TGF-β에 대한 기능적 검정
이 실시예는 루시퍼라제 검정을 사용하여 표준 TGF-β 신호전달에 대한 LP008-02 및 LP008-06a-ES의 효과를 평가하였다.
M7824 (이기능적 항-PD-L1/TGFβ Trap 융합 단백질, 예를 들어, Knudson et al., Oncoimmunology. 2018; 7(5): e1426519 참조), LP008-02 또는 LP008-06a-ES의 단계 희석액을 재조합 인간 TGF-β의 존재 하에 SBE 루시퍼라제 리포터-트랜스펙션된 293 세포와 함께 약 20시간 동안 인큐베이션하였다.
도 13에서 나타난 바와 같이, M7824, LP008-02 및 LP008-06a-ES는 293 세포에서 구성된 TGF-β SBE 루시퍼라제 리포터 검정 시스템에서 TGF-β 표준 신호전달을 차단하였다 (IC50 = 0.06687nM, IC50=0.07352nM, IC50=0.07167nM).
실시예 12: 인간 PD-L1에 대한 결합 활성
재조합 인간 PD-L1로의 ELISA
M7824, LP008-02, 및 LP008-06a-ES의 결합 활성을 평가하기 위해, 이기능적 분자를 ELISA 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5μg/ml의 인간 PD-L1-His 단백질 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 1 μg/ml에서 시작하는 M7824, LP008-02, 및 LP008-06a-ES의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG 항체와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
도 14에서 나타난 바와 같이, LP008-02 및 LP008-06a-ES는 M7824보다 훨씬 더 높은 활성으로 인간 PD-L1에 결합하였다 (EC50=11.82ng/ml, 및 EC50=14.36 ng/ml 대 EC50=23.68ng/ml).
교차 종 활성
마우스 PD-L1, 래트 PD-L1, 시노몰구스 PD-L1로의 이중특이적 항체의 결합을 평가하기 위해서, 항체를 ELISA로 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 0.5 μg/ml의 마우스, 래트 및 시노몰구스 PD-L1 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150 μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 1 μg/ml에서 시작하는 이중특이적 항체의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG 항체와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
LP008-02 및 LP008-06a-ES는 M7824보다 더 높은 친화도로 시노몰구스 PD-L1에 결합할 수 있지만, M7824만이 래트 및 마우스 PD-L1에 결합할 수 있다 (도 15 및 표 13).
Figure pct00017
실시예 13: 인간 TGF-β에 대한 결합 활성
재조합 인간 TGF-β를 사용한 ELISA
인간 TGF-β에 대한 M7824, LP008-02, 및 LP008-06a-ES의 결합 활성을 평가하기 위해서, 이들 이기능적 분자를 ELISA 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1μg/ml의 인간 TGF-β 단백질 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 M7824, LP008-02, 및 LP008-06a-ES 이기능적 분자의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG 항체를 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
도 16에서 나타난 바와 같이, M7824, LP008-02, 및 LP008-06a-ES는 모두 높은 활성으로 결합 활성으로 인간 TGF-β에 결합하였다 (C50=43.43 ng/ml, EC50=28.58 ng/ml, EC50=39.38 ng/ml).
교차 종 활성
마우스, 래트, 및 시노몰구스 TGF-β로의 이중특이적 항체의 결합을 평가하기 위해서, 이기능적 분자를 ELISA 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1 μg/ml의 마우스, 래트 및 시노몰구스 TGF-β 단백질 100 μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150 μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 10 μg/ml에서 시작하는 이중특이적 항체의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG 항체와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
테스트된 모든 이기능적 분자는 시노몰구스, 래트, 및 마우스 TGF-β에 높은 활성으로 결합하였다 (도 17 및 표 14).
Figure pct00018
실시예 14: MC38 종양 마우스 모델에서의 효능
이 실시예는 종양 마우스 모델을 사용하여 이기능적 분자의 생체 내(in vivo) 효능을 테스트하였다.
PBS에서 재현탁된 인간 PD-L1을 발현하는 MC38 세포를 0.2 mL의 부피 중의 5 x 105 세포의 농도로 B-hPD-L1 인간화된 마우스의 오른쪽 피부로 피하에 분주하였다. 평균 종양 부피가 대략 55 mm3에 도달했을 때, 적절한 개개의 종양 부피를 가진 24마리의 마우스를 군에 대해 선택하였고, 동물을 종양 부피에 따라 4개의 실험군으로 무작위로 할당하였으며, 각 군에 동물은 6마리였다. 항-mCD20 mAb 주사 후, 전체 인간 IgG, M7824, LP008-02 및 LP008-06a-ES를 복강내 주사로 주 3회 투여하였다. 용량은 10 μg/g으로 실험 동물의 체중을 기반으로 계산하였다. 마우스 중량 및 종양 크기를 주 2회 테스트하였다.
결과는 도 18에서 나타나 있다. 이기능적 분자 LP008-02 및 LP008-06a-ES는 종양 성장 억제에 관하여 이들 동물 모델에서 M7824보다 더 양호한 효능을 나타냈다. 게다가, IgG 및 M7824 군 둘 다에서 동물 사망이 관찰되었지만, LP008-02 및 LP008-06a-ES 군에서는 관찰되지 않았으며, 새로운 이기능적 분자의 더 양호한 안전성 프로파일을 입증한다.
실시예 15. 이기능적 분자의 변형
이 실시예는 특정 변형된 이기능적 분자 (Table 15)를 TGF-β에 대한 기능적 검정의 시험관 내(in vitro) 효능에 대해 테스트하였다. 그것들 중 일부는 TAGHTQTSTGGGAITTGTSGAGHGP (서열 번호: 87)의 링커 서열, HYP, 및/또는 G4S (서열 번호: 86) 반복부위를 포함하였다. 이들 분자는 각각 LP008-02-1 내지 LP008-02-7이라고 불린다.
Figure pct00019
재조합 인간 TGF-β1로의 ELISA
변형된 LP008-02 이기능적 분자의 결합 활성을 평가하기 위해서, 이들 이기능적 분자를 ELISA로 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1μg/ml의 인간 TGF-β1 단백질 (Acro, TG1-H4212) 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 30nM에서 시작하는 변형된 LP008-02 이기능적 분자의 3배 희석액을 각 웰에 추가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG (H+L) 항체와 함께 37℃에서 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 TMB 기질로 현상하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
도 19에서 나타난 바와 같이, 모든 변형된 LP008-02 이기능적 분자가 인간 TGF-β1에 높은 활성으로 결합하였으며, LP008-02-1과 비슷하다.
TGF-β 기능적 검정
변형된 LP008-02 이기능적 분자의 단계 희석액을 재조합 인간 TGF-β1의 존재 하에 SBE 루시퍼라제 리포터-트랜스펙션된 293 세포와 함께 약 22시간 동안 인큐베이션하였다.
도 20에서 나타난 바와 같이, LP008-02-2, LP008-02-3, 및 LP008-02-4는 293 세포에서 구성된 TGF-β SBE 루시퍼라제 리포터 검정 시스템에서 TGF-β 표준 신호전달을 효과적으로 차단하였으며 (IC50 = 0.1435nM, IC50=0.1639 nM, IC50=0.1882 nM), 이것을 LP008-02-1과 비교하였다.
실시예 16. 이기능적 분자의 비교
표 15의 분자 1-7은 엑토도메인 (서열 번호: 72)의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에서 상이한 서열을 포함하였다. 그것들을 안정성 및 활성에 대해 테스트하여 이들 서열의 영향을 평가하였다.
분자 1 (LP008-02-1)은 세포외 도메인의 N-말단으로부터의 25개의 아미노산 (IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFP, 서열 번호: 89, 또는 아이소폼 B, 서열 번호: 71의 아미노산 24-48), 및 C-말단 단편 (EEYNTSNPD, 서열 번호: 90)을 함유하는 단백질 (서열 번호: 61)의 전체 세포외 부분을 포함하였다. 이에 더하여, 이 분자는 링커에 몇몇 G4S (서열 번호: 86) 반복부위를 추가하였다.
분자 1과 비교하여, 분자 2 (LP008-02-2)는 세포외 도메인의 N-말단 부분 (아이소폼 B의 아미노산 24-48, 서열 번호: 89)을 인공 링커 TAGHTQTSTGGGAITTGTSGAGHGP (서열 번호: 87)로 대체하였다. 이 링커는 서열 번호: 89를 기반으로 하여 모델링되었다. 변화는 (i) 강성 디펩타이드 PP의 제거, (ii) 잠재적 분열 부위 QK, N 및 K의 제거, (iii) 유연성을 증가시키기 위한 다수의 글리신 잔기의 포함, (iv) 소수성 잔기의 부분적 제거 (예를 들어, 하나의 I만을 유지함)를 포함하였다. 이들 변화는 하기 표 16에서 예시된다. 분자 2는 또한 N-말단에서 단일 G4S 유닛을 포함하였다.
Figure pct00020
분자 3 (LP008-02-3)은 분자 2보다 더 긴 G4S 링커를 포함하였다. 분자 3의 상부에서, 분자 4는 C-말단 단편, EEYNTSNPD (서열 번호: 90)의 결실을 갖는다. 분자 5 (LP008-02-5)는 인공 링커, 서열 번호: 87을 짧은 링커 HYP로 대체하였다. 분자 6 (LP008-02-6) 및 7 (LP008-02-7)은 HYP 링커의 N-말단 측면에서 상이한 길이의 G4S 링커를 포함하였다.
실시예 17. 이기능적 분자의 결합 활성 및 안정성
이 실시예는 SEC-HPLC 및 CE-SDS를 사용하여 LP008-02-1, 및 4개의 추가로 변형된 것들, LP008-02-2, LP008-02-3, LP008-02-6 및 LP008-02-7을 포함하는 변형된 이기능적 분자 중 일부의 안정성을 평가하였다.
5개의 서열이 폴리에틸렌이민 (PEI) 매개된 일과성 트랜스펙션에 의해 CHO-K1 세포에서 발현되었고, 상층액을 10일 후 수확하였다. 이기능적 분자를 단백질 A에 의해 배양 상층액으로부터 정제하고, 그 이후 Superdex 200pg로 정제하였으며, SEC-HPLC에 의해 검출될 때 99% 초과의 순도 수준을 나타냈다 (표 17).
Figure pct00021
변형된 LP008-02 이기능적 분자의 결합 활성을 평가하기 위해서, 이들 이기능적 분자를 ELISA로 테스트하였다.
간략히 말하면, 미세역가 플레이트를 PBS 중의 1μg/ml의 인간 TGF-β1 단백질 (Acro, TG1-H4212) 100μl/웰로 4℃에서 밤새도록 코팅한 다음, 150μl/웰의 1% BSA로 블로킹하였다. 30nM에서 시작하는 변형된 LP008-02 이기능적 분자의 4배 단계 희석액을 각 웰에 추가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 홀스 래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 컨쥬게이션된 염소-항-인간 IgG Fc 항체와 함께 30 min 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 플레이트를 발색을 위해 TMB 기질과 함께 인큐베이션하고 분광광도계로 OD 450nm에서 분석하였다.
도 21에서 나타난 바와 같이, 모든 다른 변형된 LP008-02 이기능적 분자는 인간 TGF-β1에 높으 활성으로 결합하였으며, 이것은 LP008-02-1과 비슷하다.
표준 TGF-β 신호전달에 대한 변형된 LP008-02 이기능적 분자의 효과를 평가하기 위해서, 변형된 이기능적 분자를 루시퍼라제 검정으로 테스트하였다. 이기능적 분자의 단계 희석액을 재조합 인간 TGF-β1의 존재 하에 SBE 루시퍼라제 리포터-트랜스펙션된 293 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 도 22에서 나타난 바와 같이, LP008-02-1과 유사하게, LP008-02-2, LP008-02-3, LP008-02-6 및 LP008-02-7은 293 세포에서 구성된 TGF-β SBE 루시퍼라제 리포터 검정 시스템에서 TGF-β 표준 신호전달을 효율적으로 차단하였다 (IC50=0.04231nM, IC50 = 0.0527nM, IC50=0.09616nM, 및 IC50=0.1962nM).
이기능적 분자를 항체 안정성 검출을 위해 2개의 완충액에 별도로 용해시켰다. 완충액 정보는 다음과 같이 나열된다: 완충액 A: 20mM 아세트산-나트륨 아세테이트, 250mM 소르비톨, 0.02% 폴리소르베이트 80, pH 4.9; 완충액 B: 20mM His/His-HCl, 250mM 트레할로스, pH 5.4.
3.0 mg/ml로 제조된 샘플을 40℃에서 인큐베이션한 다음, 각각 제0 일 및 제14 일에 SEC-HPLC 및 CE-SDS로 검출하였다. 표 18에서 나타난 바와 같이, 완충액 A 및 완충액 B 둘 다에서 제제화된 LP008-02-2, LP008-02-3, LP008-02-6, 및 LP008-02-7은 SEC-HPLC, 비-환원된 CE-SDS 및 환원된 CE-SDS에서 LP008-02-1보다 더 높은 안정성을 나타냈다.
Figure pct00022
그러므로, 이 실시예는 변형된 이기능적 분자 LP008-02-2, LP008-02-3, LP008-02-6, 및 LP008-02-7이 LP008-02-1과 유사한 활성을 나타냈지만, LP008-02-1보다 훨씬 더 높은 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다.
인공 링커 (예를 들어, TAGHTQTSTGGGAITTGTSGAGHGP (서열 번호: 87) 또는 HYP)로의 LP008-02-1에서 TGF-β RII의 N-말단 부분 (IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFP, 서열 번호: 89)의 대체는 크게 개선된 안정성으로 이어졌다.
실시예 18. 항-PD-L1 항체의 고농도 제제
이실시예는 HIC-HPLC, 및 점성 테스트를 사용하여 고농도 항-PD-L1 분자 제제 개발의 가능성 및 위험을 평가하였다.
4개의 항-PD-L1 분자를 일과성 트랜스펙션에 의해 CHO-K1 또는 293F 세포에서 발현시켰다. 중쇄의 불변 영역은 인간 IgG1(N297A)-Fc이다. 정제된 MPDL3280A (아테졸리주맙), 47C6A3, Hu67F3G7-22, 및 Hu89C10H8-7 항체를 HIC-HPLC로 테스트하고, 소수성 용출 시간에 상응하는 암모늄 설페이트의 농도를 얻었으며, 이것을 사용하여 이들 분자의 가용성 범위를 예측하였다. 표 19에서 나타난 바와 같이, MPDL3280A, 47C6A3, Hu67F3G7-22, 및 Hu89C10H8-7의 소수성 용출 시간에 상응하는 암모늄 설페이트의 농도는 각각 0.41M, 0.78M, 0.97M, 및 1.10 M이다. 모든 새롭게 개발된 항체는 기준 항체 MPDL3280A보다 더 낮은 소수성을 갖는다.
Figure pct00023
PD1/PD-L1 상호작용을 차단하는데 있어서 항-PD-L1 항체의 활성을 생체 발광 세포-기반 검정으로 측정하였다. 이 검정에서, PD1 효과기 세포가 PD-L1 표적 세포와 동시-배양될 때, PD-1/PD-L1 상호작용은 TCR 신호전달 및 NFAT-RE-매개된 발광을 억제한다. PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 항-PD-1 또는 항-PD-L1 항체의 추가는 억제 신호를 방출시키고 TCR 활성화 및 NFAT-RE-매개된 발광을 초래할 것이다. 도 23에서 나타난 바와 같이, MPDL3280A, 47C6A3, Hu67F3G7-22, 및 Hu89C10H8-7은 훨씬 높은 활성으로 PD1 및 PD-L1 상호작용을 차단하였다 (MPDL3280A EC50= 0.1327nM, 47C6A3 EC50=0.1501nM, Hu67F3G7-22 EC50=0.1034nM, Hu89C10H8-7 EC50=0.2138nM).
MPDL3280A 및 Hu67F3G7-22는, 인간 IgG1 Fc와 함께, 일과성 트랜스펙션에 의해 CHO-K1 세포에서 발현되었다. 정제된 MPDL3280A-hIgG1 Fc 및 Hu67F3G7-22-hIgG1 Fc 항체를 HIC-HPLC로 테스트하고, 소수성 용출 시간에 상응하는 암모늄 설페이트의 농도를 얻었으며, 이것을 사용하여 2개의 분자의 가용성 범위를 예측하였다. 표 20에서 나타난 바와 같이, MPDL3280A-hIgG1 Fc 및 Hu67F3G7-22-hIgG1 Fc의 소수성 용출 시간에 상응하는 암모늄 설페이트의 농도는 각각 0.42M 및 0.99M이다. 다시 말하면, 동일한 Fc 단편으로, Hu67F3G7-22는 MPDL3280A보다 더 낮은 소수성을 나타냈다.
Figure pct00024
항체의 가용성 및 점성 성질을 추가로 확인하기 위해서, 2개의 정제된 후보물질을 한외여과에 의해 포스페이트 완충액 (60mM NaCl 포함)에서 직접 농축시켰다. 한외여과 공정 동안에, 농도, SEC-HPLC, 및 점성 성질을 상이한 단계에서 측정하였다. 표 21에서 나타난 바와 같이, MPDL3280A-hIgG1 Fc의 점성은 유사한 농도에서 Hu 67F3G7-22-hIgG1 Fc보다 훨씬 더 높다. 그리고 고농도 제제에 대해, 일반적으로 더 높은 점성을 가진 것보다 더 낮은 점성을 가진 항체가 바람직하다. 따라서, 치료 단백질로서, Hu67F3G7-22 항체가 MPDL3280A보다 더 높은 가능성을 갖는다.
Figure pct00025
* * *
본 발명은 본 발명의 개개의 양태의 단일 예시로서 의도되는 기재된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되지 않고 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 본 발명의 사상 또는 범위에서 벗어나지 않으면서 본 발명의 방법 및 조성물에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 그 동등물의 범위 내에 있는 한 본 발명의 변형 및 변화를 커버하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 개개의 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Lepu Biopharma Co., Ltd. <120> BIFUNCTIONAL MOLECULES TARGETING PD-L1 AND TGF-BETA <130> 20F-1637-WOP3 <150> PCT/CN2020/105286 <151> 2020-07-28 <150> PCT/CN2021/098476 <151> 2021-06-04 <160> 93 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Met Ile Ala Thr Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 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Phe Met 100 105 110 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 115 120 125 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 130 135 <210> 76 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 Thr Ala Gly His Thr Gln Thr Ser Thr Gly Gly Gly Ala Ile Thr Thr 1 5 10 15 Gly Thr Ser Gly Ala Gly His Gly Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 20 25 30 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 35 40 45 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 50 55 60 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 65 70 75 80 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 85 90 95 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 100 105 110 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 115 120 125 <210> 77 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 His Tyr Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 1 5 10 15 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met 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Claims (50)

  1. 항-PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1) 항체 또는 그것의 단편 및 인간 TGF-β RII (TGF-베타 수용체 2형)의 세포외 도메인을 포함하는 다기능적 분자로서,
    항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편은 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하고,
    VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 7-12, 또는 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함하고,
    인간 TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하고 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편에 융합된, 다기능적 분자.
  2. 제1 항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편은 VH를 포함하는 중쇄 및 VL을 포함하는 별개의 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  3. 제2 항에 있어서, TGF-β RII 세포외 도메인은 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편의 중쇄에 융합되는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  4. 제3 항에 있어서, TGF-β RII 세포외 도메인은 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편의 중쇄의 C-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  5. 제3 항 또는 제4 항에 있어서, TGF-β RII 세포외 도메인은 펩타이드 링커를 통해 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편의 중쇄에 융합되는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 72를 포함하고 서열 번호: 71의 아미노산 잔기 24-48의 적어도 부분적 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  7. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β RII 세포외 도메인은 서열 번호: 61, 및 73-78로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 74에 대해, X는 K, S, 또는 N을 제외한 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  8. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 72와 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편 사이에 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  9. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 72와 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편 사이에 알파 헬릭스 모티프를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  10. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  11. 제10 항에 있어서, VH는 서열 번호: 31-37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 38-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  12. 제11 항에 있어서, VH는 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  13. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23을 포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  14. 제13 항에 있어서, VH는 서열 번호: 44-49 및 57-58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 50-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  15. 제13 항에 있어서, VH는 서열 번호: 48, 57 또는 58의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 53 또는 56의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  16. 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 19, 92, 21, 22, 23 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  17. 제16 항에 있어서, VH는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  18. 제1 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, VL을 포함하는 경쇄 및 경쇄 불변 영역, 및 VH를 포함하는 중쇄, 중쇄 불변 영역, 펩타이드 링커, 및 TGF-β RII 세포외 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  19. 제18 항에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  20. 인간 PD-L1 단백질에 대한 특이성을 갖고 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 항-PD-L1 (예정된 사멸-리간드 1) 항체 또는 그것의 단편으로서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 7-12, 또는 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함하는, 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  21. 제20 항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 13-18의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  22. 제21 항에 있어서, VH는 서열 번호: 31-37로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 38-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  23. 제21 항에 있어서, VH는 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  24. 제20 항에 있어서, VH CDR1은 서열 번호: 19를 포함하고, VH CDR2는 서열 번호: 20, 91 또는 92를 포함하고, VH CDR3은 서열 번호: 21을 포함하고, VL CDR1은 서열 번호: 22를 포함하고, VL CDR2는 서열 번호: 23포함하고, VL CDR3은 서열 번호: 24 또는 93을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  25. 제24 항에 있어서, VH는 서열 번호: 44-49 및 57-58로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 50-56으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  26. 제24 항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 19, 92, 21, 22, 23 및 93의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  27. 제26 항에 있어서, VH는 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  28. 제20 항에 있어서, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3은 각각 서열 번호: 7-12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  29. 제28 항에 있어서, VH는 서열 번호: 25-28로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 29-30으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  30. 제28 항에 있어서, VH는 서열 번호: 26, 27 또는 28의 아미노산 서열을 포함하고, VL은 서열 번호: 30의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편.
  31. 펩타이드 링커를 통해 서열 번호: 72의 아미노산 서열의 N-말단에 융합된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 포함하는 다기능적 분자.
  32. 제31 항에 있어서, 펩타이드 링커는 플렉시블 링커 및/또는 IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFP (서열 번호: 89)의 치환 펩타이드를 포함하며, 치환 펩타이드는 서열 번호: 89와 상이한 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  33. 제32 항에 있어서, 치환 펩타이드는 IPPHVQXXVNNDMIVTDNXGAVKFP (서열 번호: 88)의 아미노산 서열을 포함하며, X는 K, S, 또는 N을 제외한 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  34. 제33 항에 있어서, 치환 펩타이드는 서열 번호: 88에 대해 적어도 50% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  35. 제32 항에 있어서, 치환 펩타이드는 TAGHTQTSTGGGAITTGTSGAGHGP (서열 번호: 87)의 아미노산 서열 또는 서열 번호: 87에 대해 적어도 75% 서열 동일성을 가진 변이체를 포함하며, 변이체는 적어도 4개의 G를 포함하고, PP 디펩타이드를 포함하지 않으며, I, L, M, F, V, W, Y 및 P로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  36. 제35 항에 있어서, 변이체는 적어도 5개의 G를 포함하고 I, L, M, F, V, W, Y 및 P로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이하의 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  37. 제32 항 내지 제36 항 중 어느 한 항에 있어서, 플렉시블 링커는 S를 포함하고 G를 적어도 50% 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  38. 제37 항에 있어서, 플렉시블 링커는 하나 이상의 GGGGS (서열 번호: 86) 유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  39. 제31 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 C-말단은 서열 번호: 72의 아미노산 서열의 N-말단으로부터의 적어도 20개의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  40. 제31 항 내지 제39 항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 EEYNTSNPD (서열 번호: 90)의 전체 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  41. 제31 항 내지 제40 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, CD28, CD122, 4-1BB, TIM3, OX-40, OX40L, CD40, CD40L, LIGHT, ICOS, ICOSL, GITR, GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, BTLA, CD4, CD2, CD8, CD47 및 CD73으로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  42. 제31 항 내지 제41 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그것의 단편은 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  43. 제42 항에 있어서, 펩타이드 링커는 Fc 단편의 C-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 다기능적 분자.
  44. 제1 항 내지 제19 항, 및 제31 항 내지 제43 항 중 어느 한 항의 다기능적 분자 또는 제20 항 내지 제30 항 중 어느 한 항의 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  45. 제1 항 내지 제19 항, 및 제31 항 내지 제43 항 중 어느 한 항의 다기능적 분자 또는 제20 항 내지 제30 항 중 어느 한 항의 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드.
  46. 제1 항 내지 제19 항, 및 제31 항 내지 제43 항 중 어느 한 항의 다기능적 분자 또는 제20 항 내지 제30 항 중 어느 한 항의 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편 및 약학적으로 적합한 담체를 포함하는 조성물.
  47. 암 치료용 의약의 제조를 위한 제1 항 내지 제19 항, 및 제31 항 내지 제43 항 중 어느 한 항의 다기능적 분자 또는 제20 항 내지 제30 항 중 어느 한 항의 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편의 용도.
  48. 필요로 하는 환자에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, 환자에게 제1 항 내지 제19 항, 및 제31 항 내지 제43 항 중 어느 한 항의 다기능적 분자 또는 제20 항 내지 제30 항 중 어느 한 항의 항-PD-L1 항체 또는 그것의 단편의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제47 항 또는 제48 항에 있어서, 암은 고체 종양인 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
  50. 제47 항 내지 제49 항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 방광암, 간암, 결장암, 직장암, 내막암, 백혈병, 림프종, 췌장암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 유방암, 요도암, 두경부암, 위장암, 위암, 식도암, 난소암, 신장암, 흑색종, 전립선암 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
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