TW202031279A - 一種ＴＧＦ－β受體融合蛋白醫藥組成物及其用途 - Google Patents

Abstract

本公開涉及一種TGF-β受體融合蛋白醫藥組成物及其用途。具體而言，該醫藥組成物，其包含在枸櫞酸鈉緩衝液中的TGF-β受體融合蛋白，該TGF-β受體融合蛋白包含PD-L1抗體靶向部分和TGF-βRII胞外區。除此之外，該醫藥組成物還可含有糖和非離子型表面活性劑。本公開的醫藥組成物在儲存數月之後展現了很高的抗體穩定性。

Description

一種TGF-β受體融合蛋白醫藥組成物及其用途

本申請要求2018年11月09日提交的專利申請201811328326.1的優先權，其藉由引用整體併入此處。

本公開屬於藥物製劑領域，具體涉及一種包含PD-L1抗體/TGF-βRII胞外區融合蛋白的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。

這裡的陳述僅提供與本公開有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。

在腫瘤治療中，人們早已認識到化療所帶來的高毒性，以及化療可導致耐藥性癌細胞產生。即使是使用靶向性的治療手段，來針對過度表達或過度激活的與腫瘤生存生長相關的蛋白，仍會有癌細胞藉由變異來減少或逃脫對靶向性治療所針對通路的依賴，並利用其它的通路繼續生存。

腫瘤免疫治療近年來備受關注，是腫瘤治療領域的焦點，較難產生耐藥性是該療法的突出優勢。腫瘤免疫治療主要藉由免疫學原理和方法，提高 腫瘤細胞的免疫原性和對效應細胞殺傷的敏感性，激發和增強機體抗腫瘤免疫應答。腫瘤免疫治療將免疫細胞和效應分子輸注宿主體內，兩者協同機體免疫系統殺傷腫瘤、抑制腫瘤生長。

程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)為CD28超家族成員。PD-1表達於活化的T細胞、B細胞及髓系細胞。PD-1有兩個配體，即程序性死亡配體-1(programmed death ligand 1,PD-L1)和PD-L2。PD-L1與T細胞上的受體PD-1相互作用，在免疫應答的負調控方面發揮著重要作用。在許多人類腫瘤組織中均可檢測到PD-L1蛋白的表達。腫瘤部位的微環境可誘導腫瘤細胞上的PD-L1的表達，表達的PD-L1有利於腫瘤的發生和生長，誘導抗腫瘤T細胞的凋亡。PD-1/PD-L1通路抑制劑可以阻斷PD-1與PD-L1的結合，阻斷負向調控信號，使T細胞恢復活性，從而增強免疫應答，因此，以PD-1/PD-L1為靶點的免疫調節對腫瘤抑制有重要的意義。

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)屬於調節細胞生長和分化的TGF-β超家族。TGF-β藉由異源四聚體受體複合物傳遞信號，這個受體複合物是由兩個I型和兩個II型的跨膜絲胺酸/蘇胺酸激酶受體組成。

TGF-β是一種多功能的細胞因子，以細胞或背景依賴的方式發揮腫瘤抑制或腫瘤促進的作用。TGF-β的腫瘤抑制作用源於其誘導多個基因表達的能力。當腫瘤發展過程中引入突變或表觀遺傳修飾時，癌細胞逐漸耐受TGF-β的抑制作用，最終導致腫瘤的發展。

研究發現阻斷TGF-β信號傳導通路能夠減少腫瘤的轉移。運用截短的Smad2/3顯負性突變體抑制乳腺腫瘤細胞系的TGF-β信號通路，結果發現腫瘤細胞的轉移能力被抑制。結腸癌的微衛星不穩定性研究發現，TGF-βRII無 活性的突變，使轉移減少，增加了患者術後的存活率。但總體而言，在臨床治療中單獨施用TGF-β信號通路的抑制劑，其效果微弱，可能是因為TGF-β主要在腫瘤細胞內異常性高表達，而單獨的TGF-β信號通路的抑制劑很難集中靶向腫瘤，而導致藥效不高或抑制劑的生物利用度不高。

因此，在腫瘤微環境中靶向並中和TGF-β基礎上，抑制PD-1/PD-L1通路可以使T細胞恢復活性，增強免疫應答，更有效地提高抑制腫瘤發生和發展的效果。

本申請人在先的PCT申請PCT/CN2016/104320(公開號WO2017084495)提供了一種PD-L1抗體。目前已有抗體/TGF-β受體融合蛋白公開，如WO2006074451A2、WO2009152610A1、WO2011109789A2、WO2013164694A1、WO2014164427A1、WO2015077540A2、WO9309228A1、WO9409815A1、WO2015077540A2、WO2015118175A2等。其中，默克公開一種PD-L1/TGF-β雙功能融合蛋白Bintrafusp Alfa(WO2015118175，也稱M7824、FP17022)，目前Bintrafusp Alfa已經在胃癌、肺癌、食管癌、NSCLC、膽道癌等腫瘤疾病中開展臨床。但是，現有技術中的抗體藥物其分子量大，結構複雜，容易降解、聚合或發生不希望發生的化學修飾等而變得不穩定。為了使抗體適合於給藥，並且在儲存及隨後使用過程中能保持穩定性，發揮更好的效果，抗體藥物的穩定製劑研究顯得尤為重要。

本公開提供一種更利於生產和給藥，性能更穩定的包含PD-L1/TGF-βRII融合蛋白的醫藥組成物，其包含：

-TGF-β受體融合蛋白，以及

-緩衝液，

該緩衝液選自組胺酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液和枸櫞酸鹽緩衝液。

在一些實施方案中，該緩衝液為枸櫞酸鹽緩衝液。在一些實施方案中，該組胺酸鹽緩衝液選自組胺酸-鹽酸緩衝液，該琥珀酸鹽緩衝液選自琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝液，該枸櫞酸鹽緩衝液選自枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液；在一些實施方案中，該緩衝液選自枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該TGF-β受體融合蛋白濃度為大約0.5mg/ml至大約100mg/ml，較佳為大約30mg/ml至大約70mg/ml。

在一些實施方案中，醫藥組成物中該TGF-β受體融合蛋白濃度為0.5mg/ml至100mg/ml，較佳為30mg/ml至70mg/ml。TGF-β受體融合蛋白濃度非限制性實施例包括：大約30mg/ml、大約35mg/ml、大約40mg/ml、大約45mg/ml、大約50mg/ml、大約55mg/ml、大約60mg/ml、大約65mg/ml、大約70mg/ml，較佳大約50mg/ml；

在一些實施方案中，醫藥組成物中該TGF-β受體融合蛋白濃度為30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml，更較佳50mg/ml。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該緩衝液的pH值為大約5.0到大約7.5，較佳為大約6.0至大約6.5，還可選為約6.0、約6.1、約6.2、約63、約6.4、約6.5，更佳為大約6.2；

在一些實施方案中，該緩衝液的pH值為5.0至7.5或6.0至6.5，較佳為6.0、6.1、6.2、63、6.4或6.5，更佳為6.2。

在可選的實施方案中，緩衝液的濃度為約5mM至約30mM，較佳為大約5mM至大約20mM，非限制性實施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM，更佳為10mM。

在一些實施方案中，緩衝液的濃度為5mM至30mM，較佳為5mM至20mM，在一些實施方案中，緩衝液的濃度為約10mM、約12mM、約14mM、約16mM、約18mM、約20mM，更佳為約10mM。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物還包含糖。本公開的“糖”包含常規組合物(CH₂O)_n或其衍生物，包括單糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、還原性糖、非還原性糖等等。在一些實施方案中，該糖選自：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇(X ylitol)、山梨糖醇、甘露醇、蜜李二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水蘇糖、麥芽糖、乳果糖、麥芽酮糖、山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇、異-麥芽酮糖等等。較佳的糖是非還原性二糖，更佳為海藻糖或蔗糖，最佳為蔗糖。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中糖的濃度為約50mg/ml至約100mg/ml，較佳為約60mg/ml至約90mg/ml，非限制性實施例包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml，最佳為80mg/ml。

在一些實施方案中，糖的濃度為50mg/ml至100mg/ml，較佳為60mg/ml至90mg/ml，在一些實施方案中，糖的濃度為約60mg/ml、約65mg/ml、約70mg/ml、約75mg/ml、約80mg/ml、約85mg/ml或約90mg/ml。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物還包含表面活性劑，可選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羥亞烴、Triton、十二烷基磺酸鈉、月桂基磺酸鈉、辛基糖甙鈉、月桂基-磺基甜菜鹼、肉豆蔻基-磺基甜菜鹼、亞油基-磺基甜菜鹼、硬脂基-磺基甜菜鹼、月桂基-肌胺酸、肉豆蔻基-肌胺酸、亞油基-肌胺酸、硬脂基-肌胺酸、亞油基-甜菜鹼、肉豆蔻基-甜菜鹼、鯨蠟基-甜菜鹼、月桂醯胺基丙基-甜菜鹼、柯卡醯胺基丙基-甜菜鹼、亞油醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-甜菜鹼、棕櫚醯胺基丙基-甜菜鹼、異硬脂醯胺基丙基-甜菜鹼、肉豆蔻醯胺基丙基-二甲基胺、棕櫚醯胺基丙基-二甲基胺、異硬脂醯胺基丙基-二甲基胺、甲基可可醯基鈉、甲基油基牛磺酸鈉、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯與丙烯二醇的共聚物等等。較佳的表面活性劑是聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更佳為聚山梨醇酯80。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中表面活性劑的濃度為約0.1mg/ml至約0.8mg/ml，更佳為約0.4mg/ml至約0.8mg/ml，在一些實施方案中，表面活性劑的濃度為0.1mg/ml至0.8mg/ml，較佳為0.4mg/ml至0.8mg/ml，更佳約0.4mg/ml、約0.45mg/ml、約0.5mg/ml、約0.55mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml。

在一些實施方案中，表面活性劑的濃度為0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml或0.8mg/ml，更具體為0.4mg/ml。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物，其包含：

(a)大約0.5mg/ml至大約100mg/ml的TGF-β受體融合蛋白，(b)大約5mM至大約30mM的枸櫞酸鹽緩衝液，(c)大約50mg/ml至大約100mg/ml的蔗糖，和(d) 大約0.1mg/ml至大約0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，較佳該醫藥組成物的pH為大約5.0至大約7.5，更佳為大約6.0至大約6.5。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物，其包含：

較佳該醫藥組成物的pH為5.0至7.5，更佳為6.0至6.5。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物包含：

(a)大約30mg/ml至大約70mg/ml的TGF-β受體融合蛋白，(b)大約5mM至大約20mM的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，(c)大約60mg/ml至大約90mg/ml的蔗糖，和(d)大約0.4mg/ml至大約0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，較佳地，該醫藥組成物的pH為大約6.0至大約6.5。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物包含：

該醫藥組成物的pH為大約6.0至大約6.5。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：

(a)大約50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白，(b)大約10mM的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，(c)大約80mg/ml的蔗糖，和(d)大約0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，較佳該醫藥組成物的pH約為6.2。

在可選的實施方案中，該醫藥組成物包含：

較佳該醫藥組成物的pH約6.2。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該TGF-β受體融合蛋白如通式(I)所示：

Ab-L-TGF-βRII ECD (I)

其中TGF-βRII ECD為TGF-βRII胞外區的截短形式；

Ab為PD-L1抗體或其抗原結合片段；

L為連接序列。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該連接序列為(G₄S)_xG，其中x為3-6的整數。在可選的實施方案中，x為3、4、5或6，較佳為4。

在可選的實施方案中，前述TGF-βRII胞外區的的截短形式是TGF-βRII胞外結構域序列(如SEQ ID NO：14所示)在其胺基端(也稱N端)連續缺失至多26個胺基酸殘基。在一些實施方案中，TGF-βRII胞外區的的截短形式是TGF-βRII胞外結構域序列在其N端連續缺失14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個胺基酸殘基。在一些實施方案中，前述醫藥組成物 中該TGF-βRII ECD的序列如SEQ ID NO：14、15、16或17所示；較佳如SEQ ID NO：15所示的序列。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：

分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該PD-L1抗體或其抗原結合片段具有：

分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在可選的實施方案中，前述醫藥組成物中該PD-L1抗體或其抗原結合片段具有：

如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；

或，具有：

如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和

如SEQ ID NO：11所示的輕鏈可變區。

在可選的實施方案中，前醫藥組成物中該PD-L1抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示或與SEQ ID NO：12所示的序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；該PD-L1抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示的序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在可選的實施方案中，前述的醫藥組成物，其中該TGF-β受體融合蛋白中，該TGF-βRII ECD藉由連接序列融合至PD-L1抗體重鏈羧基末端。

在一些實施方案中，該TGF-β受體融合蛋白包含：

‧融合有PD-L1抗體重鏈和TGF-βRII ECD的融合肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：23所示或與SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，以及

‧PD-L1抗體輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

在另一些實施方案中，該TGF-β受體融合蛋白包含：

‧融合有PD-L1抗體重鏈和TGF-βRII ECD的融合肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示或與SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性，以及

‧PD-L1抗體輕鏈，其胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示胺基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。

本公開還提供製備前述醫藥組成物的方法，其中包括：使TGF-β受體融合蛋白和緩衝液接觸的步驟，例如將TGF-β受體融合蛋白原液經緩衝液置換，該緩衝液較佳枸櫞酸鹽緩衝液，更佳為枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，該緩衝液濃度較佳為大約5mM至大約20mM，非限制性實施例包括5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM，更佳為10mM；該緩衝液pH為約6.0至約6.5，非限制性實施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5，較佳6.2。在可選的實施方案中，該緩衝液濃度為5mM至20mM，非限制性實施例包括大約5mM、大約6mM、大約7mM、大約8mM、大約9mM、大約10mM、大約12mM、大約14mM、大約16mM、大約18mM、大約20mM，更佳為大約10mM；該緩衝液pH為6.0至6.5，非限制性實施例包括大約6.0、大約6.1、大約6.2、大約6.3、大約6.4、大約6.5，較佳大約6.2。

本公開還提供製備前述醫藥組成物的方法，在TGF-β受體融合蛋白和緩衝液接觸之後，進一步地還包括：向所得溶液中加入蔗糖和聚山梨醇80(兩者不區分先後次序)，再經緩衝液定容，其中緩衝液濃度較佳為大約5mM至大約20mM，更佳為5mM至20mM，非限制性實施例包括5mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM；該緩衝液pH為約6.0至約6.5，非限制性實施例包括6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5。

本公開還提供一種製備包含TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑的方法，其中包括將前述醫藥組成物經冷凍乾燥的步驟。

在可選的實施方案中，前述製備包含TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑的方法，其中該冷凍乾燥按照本領域公知的方法進行，例如但不限於包括預凍、一次乾燥和二次乾燥的步驟。技術人員理解，任何將水從本公開該醫藥組成物中移除的方法均適用於本公開。

本公開還提供一種含有TGF-β受體融合蛋白凍乾製劑，其是經前述的製備凍乾製劑的方法製備所得。

本公開還提供一種含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑，該含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑經複溶後可形成前述的醫藥組成物。

在一些實施方案中，該凍乾製劑於2-8℃穩定至少3個月，至少6個月，至少12個月，至少18個月或至少24個月。在一些實施方案中，該凍乾製劑於40℃穩定至少7天，至少14天或至少28天。

本公開還提供一種含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液，其是藉由將前述含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑複溶獲得。

本公開還提供一種前述含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液的製備方法，其中包括：將前述凍乾製劑經複溶的步驟，複溶所用溶液包括但不限於注射用水、生理鹽水或葡萄糖溶液，較佳注射用水。

本公開進一步提供一種製品或試劑盒，其包含：根據本公開的醫藥組成物和容器。

在一些實施方案中，容器是玻璃瓶，例如但不限於中性硼矽玻璃管制注射劑瓶。

本公開還提供一種製品，其包括容器，該容器中裝有前述的醫藥組成物、或其凍乾製劑、或凍乾製劑的複溶溶液。

本公開還提供選自以下的任一項在製備藥物中的用途：

前述的醫藥組成物、或凍乾製劑、或凍乾製劑的複溶溶液、或製品；該藥物用於治療或抑制腫瘤細胞增殖或轉移的疾病或病症。

在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤。

在一些實施方案中，該疾病或病症選自：結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭部頸部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、膠質瘤、肉瘤、間皮瘤，和骨髓增生異常綜合症。

本公開還提供前一種治療或抑制癌細胞增殖或轉移的疾病或病症的方法，包括向所需受試者提供治療有效量的前述醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品。在一些實施方案中，該方法包括向受試者施用單位劑量的組合物中含有0.1-3000mg的如前該的TGF-β受體融合蛋白、醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品。在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤。在一些實施方案中，該疾病或病症選自：結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭部頸部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、膠質瘤、肉瘤、間皮瘤，和骨髓增生異常綜合症。

本發明還提供一種用於治療或抑制癌細胞增殖或轉移的疾病或病症的前述TGF-β受體融合蛋白、醫藥組成物、或凍乾製劑、或複溶溶液、或製品。在一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤。在一些實施方案中，該疾病或病症選自：結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、腎癌、宮頸癌、骨髓瘤癌、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、膀胱癌、神經內分泌癌、頭部頸部癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、成膠質細胞瘤、膠質瘤、肉瘤、間皮瘤，和骨髓增生異常綜合症。

如本領域技術人員所熟知的，本公開中該各個實施方案的一項、一些或所有特性可以進一步組合以形成本公開的其它實施方案。本公開的以上實施方案和藉由組合得到的其他實施方案藉由下面的詳述進一步說明。

第1圖為融合蛋白結構示意圖。

第2圖為融合蛋白體外結合人源TGF-β1的結果。

第3圖為融合蛋白體外結合人源TGF-β1的結果。

第4圖為融合蛋白體外結合人源PD-L1的結果。

第5圖為融合蛋白體外檢測PD-1/PD-L1通路阻斷實驗結果。

第6圖為融合蛋白以劑量依賴性形式抑制TGFβ誘導的pSMAD3報告物活性。

第7圖為融合蛋白樣品均能夠增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ。

第8圖8為融合蛋白對荷瘤小鼠瘤重的影響。

術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

“緩衝液”指藉由其酸-鹼共軛組分的作用而耐受pH變化的溶液。將pH控制在適當範圍中的緩衝液的例子包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組胺酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘胺醯甘胺酸。

“組胺酸鹽緩衝液”是包含組胺酸根離子的緩衝液。組胺酸鹽緩衝液的示例包括組胺酸-鹽酸鹽，組胺酸-醋酸鹽，組胺酸-磷酸鹽，組胺酸-硫酸鹽等緩衝液，較佳組胺酸-鹽酸鹽緩衝液。組胺酸-鹽酸鹽緩衝液是組胺酸與鹽酸配製而成。

“枸櫞酸鹽緩衝液”是包括枸櫞酸根離子的緩衝液。枸櫞酸鹽緩衝液的示例包括枸櫞酸-枸櫞酸鈉、枸櫞酸-枸櫞酸鉀、枸櫞酸-枸櫞酸鈣、枸櫞酸-枸櫞酸鎂等。較佳的枸櫞酸鹽緩衝液是枸櫞酸-枸櫞酸鈉。

“琥珀酸鹽緩衝液”是包括琥珀酸根離子的緩衝液。琥珀酸鹽緩衝液的示例包括琥珀酸-琥珀酸鈉、琥珀酸-琥珀酸鉀、琥珀酸-琥珀酸鈣鹽等。較佳的琥珀酸鹽緩衝液是琥珀酸-琥珀酸鈉。

“磷酸鹽緩衝液”是包括磷酸根離子的緩衝液。磷酸鹽緩衝液的示例包括磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀等。較佳的磷酸鹽緩衝液是磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉。

“醋酸鹽緩衝液”是包括醋酸根離子的緩衝液。醋酸鹽緩衝液的示例包括醋酸-醋酸鈉、醋酸組胺酸鹽、醋酸-醋酸鉀、醋酸醋酸鈣、醋酸-醋酸鎂等。較佳的醋酸鹽緩衝液是醋酸-醋酸鈉。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，“醫藥組成物”和“製劑”並不互相排斥。

本公開中所述醫藥組成物的溶液形式，若無特殊說明，其中的溶劑均為水。

“凍乾製劑”表示液體或溶液形式的醫藥組成物或液體或溶液製劑經冷凍乾燥步驟(例如真空冷凍乾燥步驟)之後獲得的製劑或醫藥組成物。

本文所用術語“約”或“大約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，該數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域中“約”或“大約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“大約”或“基本上包含表示至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。本公開中，除非另外說明，否則“約XX”或“大約XX”或“基本上包含XX”的含義是 該具體值“XX”的可接受誤差範圍內的數值(包括數值“XX”本身，以及本領域一般技術人員測定該數值的可接受誤差範圍內的數值)。

本公開所述的醫藥組成物能夠達到一種穩定的效果：其中TGF-β受體融合蛋白或其醫藥組成物在貯藏後，基本上保留其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性；較佳地，醫藥組成物在貯藏後基本上保留其物理和化學穩定性以及其生物學活性。貯藏期一般基於醫藥組成物的預定保存期來選擇。目前有多種測量活性成分穩定性的分析技術，可測量在選定溫度貯藏選定時間段後的穩定性。

穩定的藥物抗體或蛋白製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年，且甚至更較佳地多達2年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃的溫度保存包括1個月、3個月、6個月在內或者在40℃保存28天的時段後表現出期望的特徵。

穩定性的典型的可接受標準如下：藉由SEC-HPLC測得，通常不超過約10%、較佳不超過約5%的活性成分(例如蛋白、抗體)發生降解。藉由視覺分析，藥物製劑是淡黃色近無色澄明液體或者無色，或澄清至稍微乳白色，或淡黃色近無色澄明液體。該製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、較佳不超過約5%的截短。通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。

如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼該活性成分在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。蛋白構象的變 化可以藉由螢光光譜法(其確定蛋白三級結構)和藉由FTIR光譜法(其確定蛋白二級結構)來評價。

如果活性成分(例如蛋白或抗體)沒有顯示出顯著的化學改變，那麼該活性成分(例如蛋白或抗體)在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白或抗體，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬胺酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽譜法等來評價)。

在給定時間內，如果活性成分(例如蛋白或抗體)的生物活性在製備藥物製劑時所表現出的生物活性的預定範圍內，那麼該活性成分(例如蛋白或抗體)在藥物製劑中“保留它的生物活性”。活性成分(例如蛋白或抗體)的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本公開所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

在本公開中，本公開所述的抗體輕鏈可包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR或VL)和重鏈可變區(HCVR或VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR1-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則，“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)，“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)。

本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳人源化抗體。

本公開中所述的“抗體或其抗原結合”或“功能片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及與抗體結合的Fv片段scFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，是具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本公開的術語“與PD-L1結合”，指能與人PD-L1相互作用。本公開的 術語“抗原結合位點”指抗體或抗原結合片段上不連續或連續的三維空間位點，其能識別靶抗原並與抗原特異性結合。

術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人PD-L1的單株抗體。製備時用PD-L1抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將非人(例如小鼠)抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕非人(例如小鼠)抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌特異性單抗的融合瘤，然後從融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將非人(例如小鼠)抗體可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個較佳的實施方案中，該PD-L1嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該PD-L1嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人(例如小鼠)抗體CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人(例如小鼠)蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文 獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後獲得的人源化抗體。

本公開中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該的修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A、L234A、L235A；IgG2/4嵌合體，IgG4的F234A/L235A突變。

本公開中該“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。本公開中的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，較佳至少為95%。非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Institute網站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默認設置來進行。

術語“TGF-β受體II”或“TGFβRII”或“轉化生長因子β受體II”是指結合配體(包括但不限於TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3)，並且由此引發細胞內的信號轉導途徑的細胞表面受體。

術語“PD-L1”是指程序性死亡配體1，也稱為CD274和B7H1。PD-L1是具有胞外IgV樣和IgC樣結構域(全長PD-L1的胺基酸19-239)、跨膜結構域和約30個胺基酸的胞內結構域的290個胺基酸的蛋白質。PD-L1在許多細胞例如抗原呈遞細胞(例如，樹突細胞、巨噬細胞和B細胞)上以及造血細胞和非造血細胞(例如，血管內皮細胞、胰島、和免疫赦免部位)上組成型表達。PD-L1也在多種腫瘤和病毒感染的細胞上表達，並且是免疫抑制環境(immunosuppressive milieu)的成員(Ribas 2012，NEJM 366：2517-2519)。PD-L1與兩種T細胞共抑制劑PD-1和B7-1之一結合。

本公開所述的“PD-L1抗體或其抗原結合蛋白”可包括本領域中該任何抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。抗PD-L1抗體可以是市售可得的或已在文獻中公開的PD-L1抗體。包括但不限於BMS-936559，MPDL3280A，MEDI4736，MSB0010718C(參見US2014341917、US20130034559、US8779108)等。抗體可以是單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體，或人抗體。抗體片段包括具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及與抗體結合的Fv片段和scFv片段。

本公開示例性的PD-L1抗體的製備過程已在PCT申請PCT/CN2016/104320(公開號WO2017084495)中公開，包括如下所述的重鏈可變區的CDR序列：

HCDR1：SYWMH SEQ ID NO：1

HCDR2：RIX₁PNSG X₂TSYNEKFKN SEQ ID NO：2

HCDR3：GGSSYDYFDY SEQ ID NO：3

在可選的實施方案中，X₁選自H或G，X₂選自G或F。

在另一個實施方案中，本公開示例性的PD-L1抗體進一步包括如下所述的輕鏈可變區的CDR序列：

LCDR1：RASESVSIHGTHLMH SEQ ID NO：4

LCDR2：AASNLES SEQ ID NO：5

LCDR3：QQSFEDPLT SEQ ID NO：6；

在另一個實施方案中，本公開對上述的CDR區採用CDR移植策略進行抗體人源化，人源化構架的人源化輕鏈模板為IGKV7-3*01和hjk2.1，人源化重鏈模板為IGHV1-46*01和hjh6.1，人源化可變區序列如下：

人源化PD-L1抗體重鏈可變區：

SEQ ID NO：7，其中X₁選自H或G，X₂選自G或F。

人源化PD-L1抗體輕鏈可變區：

SEQ ID NO：8

註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列(CDR的胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋)。

在另一個實施方案中，對本公開人源化抗體的回復突變設計，回復突變設計見下表1：

註：如Y91F表示將第91位(自然順序編號)Y突變回F。“植入”代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

將表1中各種輕重鏈的突變組合可得到新的人源化抗體。

本公開的另一方面，提供一種構建人源化純株的實施例，如下：

設計引子，PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-Fc-pHr/VK-CL-pHr。

1. 引子設計：利用在線軟件DNAWorks(v3.2.2)(http：//helixweb.nih.gov/dnaworks/)設計多條引子合成VH/VK含重組所需基因片段：5’-30bp信號肽+VH/VK+30bp CH1/CL-3’。

2. 片段拼接：按照TaKaRa公司Primer STAR GXL DNA聚合酶操作說明書，用上面設計的多條引子，分兩步PCR擴增得到VH/VK含重組所需基因片段。

3. 表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)構建及酶切

利用一些特殊的限制性內切酶，如BsmBI，識別序列與酶切位點不同的特性設計構建表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)。BsmBI酶切載體，切膠回收備用。

4. 重組構建表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr

VH/VK含重組所需基因片段與BsmBI酶切回收表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)按3：1比例分別加入DH5H感受態細胞中，0℃冰浴30min，42℃熱擊90s，加入5倍體積LB介質，37℃孵育45min，塗布LB-Amp平板，37℃培養過夜，挑取單純株送測序得到各目的純株。

5. 根據本實施例的設計方案構建質粒，然後表達純化蛋白，用檢測例SPR測定所得蛋白親和力。

6. 最終用BIACORE測試人源化回復突變體與人源PD-L1-his或融合瘤抗體的親和力，篩選得到的人源化回復突變位點的選擇及序列組合如下：

PD-L1抗體重鏈可變區：

SEQ ID NO：9

其中，HCDR2為SEQ ID NO：7的X₁為G，X₂為F，即序列為：RIGPNSGFTSYNEKFKN SEQ ID NO：10

PD-L1抗體輕鏈可變區：

SEQ ID NO：11註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列；下劃線為CDR序列(CDR的胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋)。

本公開的另一方面，提供一種構建和表達抗PD-L1人源IgG4類型的實施例，並進一步用於融合蛋白構建的PD-L1抗體。該PD-L1抗體也可用作本公開中的測試例對照分子。

由於PD-L1在活化T細胞中也有表達，如果採用野生型IgG1恆定區會引起Fc介導的效應作用，比如ADCC和CDC，從而導致活化T細胞的消減。本公開選擇突變IgG4以得到無ADCC和CDC的抗體。將親合力成熟得到的純株轉換成IgG4類型，IgG4的核心鉸鏈區包含S228P(對應於序列SEQ ID NO：12的自然順序第227位)突變。並進一步引入F234A(對應於序列SEQ ID NO：12的自然順序第233位)和L235A(對應於序列SEQ ID NO：12的自然順序第234位)突變(mAbs 4：3，310-318；2012五月/六月)。同時，為防止抗體重鏈C末端在引入連接肽連接TGF-βRII胞外區時發生斷裂，又將PD-L1抗體重鏈的最後一位K突變成A(對應於序列SEQ ID NO：12的最後一位)，以增加融合蛋白的穩定性。本公開用於融合蛋白構建的PD-L1抗體序列如下：

PD-L1抗體重鏈序列：Ig G4(AA)(S228P)

SEQ ID NO：12備註：下劃線部分為重鏈可變區序列，無下劃線部分為重鏈恆定區序列(斜體部分為突變位點)；

PD-L1抗體輕鏈序列：

SEQ ID NO：13備註：下劃線部分為輕鏈可變區序列，無下劃線部分為輕鏈恆定區序列。

本公開中所述的融合蛋白是一種藉由DNA重組得到的兩個基因共表達的蛋白產物。現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法(如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章)。例如，小鼠可以用人PD-L1或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟件，從 ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人PD-L1特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

本公開所述的“免疫調節分子”可用於削弱癌細胞的免疫耐受性。本公開採用TGF-βRII胞外結構域的截短形式作為融合蛋白中免疫調節分子部分。“TGF-β受體II(TGF-βRII)”以高親和力結合配體TGF-β1和TGF-β3。TGF-β RII/TGF-β複合物招募TGF-β RI以形成信號轉導複合物(Won等，Cancer Res.1999；59：1273-7)。TGF-βRII的胞外結構域是TGF-βRII細胞外自N端開始的一段長136個胺基酸殘基的肽段，其中一個示例性的例子如SEQ ID NO：14所示。其他長度約為136個胺基酸，並且來源於人的具有TGF-βRII的胞外區的能夠與TGF-β1和TGF-β3相結合的變體同樣屬本公開TGF-βRII的胞外結構域的範圍。本公開研究發現，TGF-βRII胞外結構域N端連續截短形式的結構和功能 較未截短分子穩定。含TGF-βRII胞外結構域N端未截短(SEQ ID NO：14所示的1-136多肽)形式的融合蛋白容易斷裂。尤其是在TGF-βRII胞外結構域N端作連續26個以下胺基酸的截短後更為穩定，較佳N端作連續14-26個胺基酸的截短，更佳N端作14-21個胺基酸截短形式，具有更高的表達量，最佳N端作連續19或21個胺基酸的截短。

術語“TGF-β受體融合蛋白”是包含TGF-β受體的融合蛋白。在一些實施方案中，本公開的TGF-β受體融合蛋白為描述於國際專利申請PCT/CN2018/086451(WO 2018205985 A1)中的TGF-β受體融合蛋白，WO 2018205985 A1的全文內容全部引入本公開。在一些實施方案中，該TGF-β受體融合蛋白為PD-L1抗體/TGF-βRII胞外區融合蛋白(PD-L1/TGF-β trap)，其以TGF-βRII胞外結構域作為融合蛋白的免疫調節分子部分，PD-L1抗體作為融合蛋白的靶向部分，TGF-βRII胞外結構域(例如SEQ ID NO：14、15、16或17所示)藉由連接序列(例如(G₄S)_xG，x為3-6)與PD-L1抗體的重鏈C末端(也稱羧基末端)連接形成融合序列，融合序列與PD-L1抗體輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接最終形成PD-L1/TGF-β trap融合蛋白，其結構如圖1所示。在一些實施方案中，該TGF-β受體融合蛋白為本公開實施例1的表2所述融合蛋白。

術語“Linker”或“接頭”或“連接子”或“連接序列”指用於連接蛋白質結構域的連接性多肽序列，通常具有一定的柔性，接頭的使用不會使蛋白質結構域原有的功能喪失。本公開的一些實施方案中，連接序列為(G₄S)_xG，其中x為3-6，例如連接序列為：(G₄S)₃G、(G₄S)₄G、(G₄S)₅G或(G₄S)₆G等多肽。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸， 使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“施用”或“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本公開的的組合物，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效 的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“Tm值”是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。

“置換”是指溶解抗體蛋白的溶劑體系的置換，例如，使用穩定製劑的緩衝體系經物理操作方式將含抗體蛋白的高鹽或高滲溶劑體系置換，從而使抗體蛋白存在於穩定製劑中。所稱物理操作方式包括但不限於超濾、透析或離心後複溶。

藉由以下實施例、測試例或製備例進一步詳細說明本公開。這些實施例、測試例或製備例僅用於說明性目的，而並不用於限制本公開的範圍。

本公開實施例、測試例或製備例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

[實施例]

實施例1. 融合蛋白PD-L1/TGF-β trap純株和表達

採用TGF-βRII胞外結構域(SEQ ID NO：14的全長或截短形式)作為融合蛋白中免疫調節分子部分，將PD-L1抗體作為融合蛋白的靶向部分，形成PD-L1抗體/TGF-βRII胞外區融合蛋白(PD-L1/TGF-β trap)。

出乎意料地發現，TGF-βRII胞外結構域截短形式的結構和功能較為穩定，尤其是在其N端作26個以下胺基酸的截短後更為穩定，較佳14-26個胺基酸的截短，更佳N端截短14-21個連續胺基酸的形式，具有更高的表達量和穩定的結構，更佳N端截短14、19或21個連續胺基酸的形式。

本公開TGF-βRII胞外結構域及其截短形式的非限制性實施例序列如下：

TGF-βRII胞外結構域序列：ECD(1-136)

SEQ ID NO：14

TGF-βRII胞外結構域序列在N端有19個胺基酸的截短或缺失：ECD(20-136)

SEQ ID NO：15

TGF-βRII胞外結構域序列在N端有21個胺基酸的截短或缺失：ECD(22-136)

SEQ ID NO：16

TGF-βRII胞外結構域序列在N端有14個胺基酸的截短或缺失：ECD(15-136)

SEQ ID NO：17

示例性地，利用同源重組技術將本公開PD-L1抗體(如重鏈如SEQ ID NO：12所示，輕鏈如SEQ ID NO：13所示的PD-L1抗體)的重鏈C末端胺基酸藉由連接子((G₄S)_xG，x為3-6)連接不同長度的TGF-βRII胞外區，並與PD-L1抗體輕鏈一起，藉由293表達系統進行常規表達，得到如表2所示的融合蛋白：

註：Ab為本公開所述重鏈序列如SEQ ID NO：12所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：13所示的PD-L1抗體，序列描述中ECD(n-136)為TGF-βRII胞外區的全長或截短形式，n為TGF-βRII胞外區截短後的胺基酸起始位數。本公開融合蛋白結構如第1圖所示；N19A是全長TGF-βRII胞外區(如SEQ ID NO：14所示)的第19位胺基酸由N突變為A。

編碼PD-L1抗體的核苷酸序列、編碼TGF-βRII胞外區的核苷酸序列、接頭蛋白片段((G₄S)_xG)的核苷酸序列藉由所屬領域常規技術手段獲得。利用同源重組技術將PD-L1抗體的C末端核苷酸藉由接頭蛋白連接不同長度TGF-βRII胞外區的N末端核苷酸，選殖到Phr-BsmbI載體上。重組的PD-L1/TGF-β trap在293細胞表達，藉由實施例2進行純化。純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。

實施例2. PD-L1/TGF-β trap融合蛋白純化

細胞培養液高速離心後收集上清，利用親和層析進行第一步純化。層析介質為與Fc相互作用的Protein A或者衍生填料，如GE的Mabselect。平衡緩衝液為1×PBS(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄，2mmol/L KH₂PO₄，pH7.4)，平衡5倍管柱體積後，將細胞上清上樣結合，流速控制為樣品在管柱保留時間≧1min。上樣結束後，用1×PBS(pH7.4)沖洗管柱，直至A280紫外吸收降至基線。然後用0.1M甘胺酸(pH3.0)的沖提緩衝液沖洗層析管柱，根據A280紫外吸收峰收集沖提峰，收集的沖提樣品用1M Tris(pH8.5)中和。

將上述中和後的沖提樣品超濾濃縮後進行體積排阻層析，緩衝液為1×PBS，層析管柱為XK26/60 Superdex200(GE)，流速控制在4ml/min，上樣體積小於5ml，根據A280紫外吸收合併目的蛋白峰。收集的蛋白經SEC-HPLC鑒定純度大於95%，經LC-MS鑒定為正確後分裝備用。得到PD-L1/TGF-β trap。

以下用生化測試方法驗證本公開中PD-L1抗體/TGF-β融合蛋白性能及有益效果。

測試例(體內、外活性生物學評價)

測試例1. ELISA檢測PD-L1/TGF-β trap體外結合TGF-β1實驗

檢測流程描述如下：

a. 以1μg/ml濃度的人源TGF-β1(8915LC，CST)為抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃過夜。

b. 250μl 1×PBST洗滌3次，加入250μl 5%牛奶PBS，37℃封閉2小時。

c. 250μl 1×PBST洗滌3次，加入梯度稀釋的PD-L1/TGF-β trap，TGF-β trap為陽性對照，37℃孵育1小時。

d. 250μl 1×PBST洗滌3次。

e. 每孔加入100μl抗-人FC抗體-HRP(1：4000)，37℃孵育40分鐘。

f. 每孔加入100μl TMB，室溫孵育10分鐘後加入100μl 1M H₂SO₄終止反應。

g. 酶標儀上檢測450nm測吸收值，Graphpad Prism5分析數據。

融合蛋白體外結合人源TGF-β1的結果如第2圖、第3圖所示。ELISA顯示表2中融合蛋白1未保留對人源TGF-β1的結合活性。質譜分析結果顯示融合蛋白1(即TGF-βRII胞外區非截短形式(1-136))不穩定，容易在重鏈TGF-βRII部分斷裂，陽性對照同樣存在相同情況，而融合蛋白7、9、10、12-15等TGFβRII胞外區N端截短形式的融合蛋白對於結合至人源TGF-β1是具有特異性的。

測試例2. ELISA檢測PD-L1/TGF-β trap體外結合PD-L1實驗

檢測用抗原：PD-L1-His

SEQ ID NO：18

檢測流程描述如下：

a. 以5μg/ml濃度的人源PD-L1-His(SEQ ID NO：18)為抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃過夜。

b. 250μl 1×PBST洗滌3次，加入250μl 5%牛奶PBS 37℃封閉2小時。

c. 250μl 1×PBST洗滌3次，加入梯度稀釋的PD-L1/TGF-β trap，PD-L1抗體為陽性對照，37℃孵育1小時。

d. 250μl 1×PBST洗滌3次。

e. 每孔加入100μl抗人FC抗體-HRP(1：4000)，37℃孵育40分鐘。

f. 每孔加入100μl TMB，室溫孵育10分鐘後加入100μl 1M H2SO4終止反應。

g. 酶標儀上檢測450nm測吸收值，Graphpad Prism5分析數據。

本公開融合蛋白體外結合人源PD-L1的結果如第4圖所示。ELISA結果顯示融合蛋白均保留了對人源PD-L1的結合活性。

測試例3. 體外檢測PD-1/PD-L1通路阻斷實驗

1. 測試目的：

為了研究PD-L1/TGF-β trap對PD-1/PD-L1信號通路的阻斷作用，採用來自Promaga公司構建的分別帶有人源PD-1和PD-L1受體分子的細胞，進行基於細胞水平上的抗體阻斷實驗。

2. 測試樣品：

①PD-L1抗體：重鏈序列如SEQ ID NO：12所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：13所示；

②對照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc，TGF-βRII胞外區截短片段ECD(20-136)與Fc的融合蛋白，序列如下：

SEQ ID NO：19；

③對照2(22T-Fc)：ECD(22-136)-Fc，TGF-βRII胞外區截短片段ECD(22-136)與Fc的融合蛋白，序列如下：

SEQ ID NO：20；

④本公開實施例1製備的TGF-β受體融合蛋白：融合蛋白9、融合蛋白15：

融合蛋白9中融合PD-L1抗體重鏈-(G₄S)₄G-TGF-βRII ECD(20-136)的融合肽序列如下：

SEQ ID NO：23；

備註：正體字為PD-L1抗體重鏈序列，斜體為連接序列，下劃線為TGF-βRII胞外區截短片段ECD(20-136)序列。

融合蛋白9中的PD-L1抗體輕鏈序列如下：

SEQ ID NO：13；

融合蛋白15中的融合PD-L1抗體重鏈-(G₄S)₅G-TGF-βRII ECD(22-136)的融合肽序列如下：

SEQ ID NO：24；

備註：正體字為PD-L1抗體重鏈序列，斜體為連接序列，下劃線為TGF-βRII胞外區截短片段ECD(22-136)序列；

融合蛋白15中的PD-L1抗體輕鏈序列如下：

SEQ ID NO：13；

⑤人IgG：空白對照，從混合的正常人血清中，利用傳統的親和層析方法如ProteinA純化獲得的人免疫球蛋白；

⑥陽性對照(FP17022)：PD-L1抗體2/TGF-βRII胞外區融合蛋白

FP17022融合蛋白中的PD-L1抗體2輕鏈的胺基酸序列

SEQ ID NO：21；

FP17022融合蛋白中的PD-L1抗體2重鏈/TGF-βRII胞外區(1-136)的融合肽的胺基酸序列：

SEQ ID NO：22；

3. 測試過程

取CHO/PD-L1細胞(CS187108，Promega)，消化並用F-12 Nutrient Mixture(Ham)完全培養基重新懸浮細胞。根據細胞計數結果使用完全培養基調整細胞密度至4×10⁵/mL，將細胞懸液轉移至加樣槽中，使用多道移液器以100μL/孔加入到96孔板中，放置於37℃，5%CO₂培養箱培養20~24h；第二天製備Jurkat/PD-1(CS187102，Promega)細胞懸液，根據細胞計數結果使用分析培養基重新懸浮細胞，並調整細胞密度至1.25×10⁶/mL；將加入CHO/PD-L1細胞的細胞培養板從培養箱中取出，使用多道移液器每孔取出95μL培養液，按照40μL/孔加入梯度稀釋的融合蛋白，以PD-L1抗體及陽性對照(FP17022)，然後將Jurkat/PD-1細胞懸液轉移至加樣槽中，以40μL/孔加入到細胞培養板中，置於37℃，5%CO₂培養箱培養5~6h。在蛋白孵育期間，將Bio-Glo^TM Reagent取出使其溫度恢復至室溫。取出細胞培養板，置於室溫放置5~10min，然後每孔加入40μL Bio-Glo^TM Reagent，置於安全櫃中孵育5~10min，使用多功能酶標儀讀取化學發光信號值。

4. 結果

如第5圖所示，本公開融合蛋白9同陽性分子一樣均能夠有效地阻斷表達有PD-1分子的Jurkat細胞同CHO/PD-L1細胞結合，並且有藥物濃度劑量依賴效應。融合蛋白15與融合蛋白9有相同水平的阻斷能力。

測試例4. Biacore檢測體外結合親和力和動力學實驗

藉由Biacore T200(GE)測定待測分子與人或鼠源TGF-β1或人源PD-L1蛋白的親和力，實驗過程描述如下：

用Protein A芯片親和捕獲一定量的PD-L1/TGF-β trap，然後於芯片表面流經人或鼠源TGF-β1(8915LC，CST)或人源PD-L1(Sino Biological)，利用Biacore實時檢測反應信號，從而獲得結合和解離曲線，然後用甘胺酸-鹽酸(pH 1.5，GE)將生物芯片洗淨再生。實驗中用到的緩衝溶液為HBS-EP Buffer(GE)。實驗得到的數據用BIAevaluation version 4.1軟件(GE)以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出如表3所示的親和力數值。

*對應序號的融合蛋白形式見表2。

融合蛋白結合活性見表3，結果表明，本公開融合蛋白9和融合蛋白15均對人、小鼠TGF-β1以及人PD-L1具極高的親和力。

測試例5. SMAD3報告基因抑制實驗

1、測試目的

該實驗藉由HepG2細胞表達帶螢光素酶報告基因的Smad3結合原件(SBE)來研究PD-L1/TGF-β trap對TGF-β1誘導Smad3活化的抑制作用，根據IC50大小評價PD-L1/TGF-β trap的體外活性。

2、測試樣品：融合蛋白9、陽性對照(FP17022)

3、測試過程

HepG2細胞使用含有10% FBS的MEM完全培養基(GE，SH30243.01)培養，每3天傳代一次。實驗第一天以每孔25,000個細胞的密度接種於96孔板(Corning，3903)，在37℃、5% CO₂條件下培養24小時。第二天，棄去細胞培養板中的培養基，每孔轉染100ng 3TP-Lux質粒。細胞在37℃、5% CO₂條件下繼續培養24小時。加入待測樣品前6小時，棄去96孔板中完全培養基，每孔加入80μL不完全培養基(MEM+0.5%FBS)。6小時後再加入10μL使用不完全培養基配製的人TGF-β1(R&D，240-B-010)溶液，終濃度為2ng/mL和10μL待測樣品，終濃度為500、50、5、0.5、0.05、0.005、0.0005和0nM，以人TGF-β1溶劑為對照，細胞在37℃、5% CO₂條件下繼續培養18h。然後每孔加入100μL配製好的螢光素酶底物ONE-GloTM Luciferase Assay system(promega，E6110)，室溫避光放置10分鐘，然後使用Victor3多功能酶標儀(Perkin Elmer)讀取發光信號值。待測樣品的IC50值使用數據處理軟件Graphpad Prism5.0計算得到。

第6圖顯示融合蛋白9以劑量依賴性形式抑制TGF β誘導的pSMAD3報告物活性，且與陽性對照FP17022具有相當的功效和IC₅₀(抑制最大活性的50%所需的濃度)。PD-L1抗體的測試結果顯示其不具有抑制作用(IC₅₀>500nM)。

測試例6. 體外檢測結核桿菌素(TB)刺激PBMC釋放IFNγ實驗

1、測試目的

為了研究PD-L1/TGF-β trap對T淋巴細胞的激活作用，收集和純化人外周血單核細胞(PBMC)，採用結核桿菌素(TB)體外刺激5天，檢測IFNγ細胞因子的分泌水平。

2、測試樣品：

①人IgG；

②PD-L1抗體；

③融合蛋白9；

④對照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc；

⑤PD-L1抗體+對照1(20T-Fc)。

3、測試過程

新鮮分離純化的PBMC，15mL約3×10⁷個，加入20μL結核菌素，37℃、5% CO₂培養箱培養5天。第6天，收集上述培養的細胞離心，用PBS洗一次，重新懸浮至新鮮的培養基中，調整密度為1×10⁶個每毫升，接種至96孔細胞培養板，每孔90μL。將不同濃度的抗體分別加入上述96孔細胞培養板的對應孔中，每孔10μL，對照組和空白組分別加入10μL PBS。細胞培養板置於37℃，5% CO₂培養箱孵育3天。取出細胞培養板，離心(4000rpm，10min)每孔取上清，10倍稀釋後，採用ELISA的方法(人IFN-γ檢測試劑盒，欣博盛，EHC102g.96)檢測IFN-γ的水平。具體操作參考試劑說明書。結果如下表4所示，PD-L1/TGF-β trap融合蛋白樣品均能夠增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ，並且有藥物濃度劑量效應。

4、結果

如第7圖、表4所示，融合蛋白9能夠劑量依賴地增強激活的T淋巴細胞分泌細胞因子IFN-γ，並且具有比PD-L1抗體，20T-FC更強的激活作用。

測試例7. 藥物代謝動力學評價

實驗用SD大鼠3隻，雌性，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。購自傑思捷實驗動物有限公司。實驗當天對SD大鼠分別尾靜脈注射融合蛋白，給藥劑量為6mg/kg，注射體積為5ml/kg。

取血時間點為：第1天給藥後15min、7h、24h(第2天)，第3天，第4天，第6天，第8天，第10天，第15天，於大鼠眼底靜脈取血，每次200μl(相當於取血清100μl)；收集的血樣在室溫下置放半小時至凝集，然後4℃下10000 x g離心10分鐘。收集上清，立即放置-80℃貯存。用ELISA檢測血清中的融合蛋白濃度。

檢測流程描述如下：

a. 以2μg/ml濃度的人源PD-L1-His為抗原按100μl/孔包被96孔板，4℃過夜。

b. 250μl 1×PBST洗滌4次，加入250μl 5%牛奶PBS，37℃封閉3小時。

c. 250μl 1×PBST洗滌4次，加入100μl梯度稀釋的待測血清，以融合蛋白9為陽性對照，37℃孵育1小時。

d. 250μl 1×PBST洗滌5次。

e. 每孔加入100μl生物素化的抗人源TGF-βRII的抗體(R&D)，37℃孵育1小時。

f. 250μl 1×PBST洗滌5次。

g. 每孔加入100μl TMB，室溫孵育10分鐘後加入100μl 1M H₂SO₄終止反應。

h. 酶標儀上檢測450nm測吸收值，Graphpad Prism5分析數據。

參見表5，PK分析結果表明，本公開的融合蛋白9在大鼠體內的半衰期約為236h(9.8天)。

測試例8. PD-L1/TGF-β trap對人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的療效

本實驗應用的小鼠品系為NOD/SCID雌性小鼠(卡文斯)，實驗使用的人外周血單個核細胞從新鮮採集的血液中提取獲得，提取方法如下：將肝素抗凝處理的靜脈血與同體積含2% FBS的PBS混合，混勻後將25ml稀釋後的血液緩慢加入 到含15ml淋巴細胞分離液的離心管中，室溫下1200g離心10分鐘，吸取淋巴細胞層轉移到另一個離心管，加入PBS清洗細胞，室溫下300g離心8分鐘，重複一次後，用含10%FBS的RPMI-1640培養基重新懸浮細胞，將細胞加入到事先包被好CD3抗體(OKT3，40ng/ml)的6孔板中，每孔2×10⁶個細胞(2ml)，置於37℃培養箱中培養4天。

實驗樣品：

①空白對照：PBS；

②融合蛋白9：4.8mpk；

③融合蛋白9：24mpk；

④PD-L1抗體：4mpk；

⑤PD-L1抗體：20mpk；

⑥PD-L1抗體4mpk+對照1(20T-Fc)2.14mpk；

⑦對照1(20T-Fc)：2.14mpk。

將MDA-MB-231細胞重新懸浮於無血清RPMI-1640培養基中，與等體積基質膠混合後100μl(2.3×10⁶)接種於NOD/SCID小鼠右肋部皮下，11天後去除腫瘤體積過大過小動物後，將小鼠隨機分組，每組9隻。將5×10⁵個刺激後的PBMC(60μl)注射到腫瘤組織中，剩餘的PBMC停止刺激並繼續培養，1週後將5×10⁶個PBMC(100μl)腹腔注射到荷瘤小鼠體內，視為第1輪注射。整個實驗週期，進行2輪半、共5次PBMC注射。首次瘤內注射當日開始腹腔給藥，一週三次，共給藥14次，給藥方式見表6。每週2次測量瘤體積，稱體重。實驗結果見表7。實驗結束後將荷瘤小鼠安樂死並剝瘤稱重。

第0天：第一次給藥時間；*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001藉由student t檢驗與PBS對比。

實驗結果如第8圖顯示，抗體融合蛋白9(4.8mg/kg、24mg/kg)能明顯抑制人乳腺癌MDA-MB-231小鼠皮下移植瘤的生長，高低劑量間呈現劑量依賴關係，且優於各自等同莫耳劑量的參比藥物PD-L1抗體(4mg/kg、20mg/kg)、TGF-βRII對照分子20T-FC(2.14mg/kg)和聯用組(PD-L1抗體-4mg/kg+20T-FC-2.14mg/kg)。各劑量的融合蛋白9從給藥後14天開始，就一直保持理想的抑瘤效果，且其高劑量與PD-L1抗體-20mpk相比，優勢非常明顯(p<0.05)；給藥後25天，各抗體抑瘤效果最好，融合蛋白9和PDL-1抗體低、高劑量與聯用組的抑瘤率分別為37.24%、52.38%、30.24%、28.01%、31.38%；給藥後32天，融合蛋白9的抑瘤作用仍十分明顯，低高劑量組%TGI分別為36.68%和50.76%，且瘤體積與對照組相比都存在統計學差異(p<0.05)。

測試例9. PD-L1/TGF-β trap的物理穩定性

本測試例用於檢測融合蛋白融合蛋白9和融合蛋白15的穩定性。

利用DSC(Differential scanning calorimetry，差示掃描量熱法)檢測不同抗體的熱穩定性，比較了不同的緩衝體系下的穩定性情況，不同緩衝體系如10mM醋酸鹽/135mM NaCl(pH 5.5)和10mM醋酸鹽/9%海藻糖(pH 5.5)。

將樣品置換到對應緩衝液中，控制樣品濃度在50mg/ml左右，利用MicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。檢測前，將各個樣品及空白緩衝液用真空脫氣器脫氣1~2min。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白緩衝液(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH₂O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑料軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如下表8所示，在兩個測試體系中融合蛋白9、融合蛋白15均表現了良好的熱穩定性。

藉由SEC-HPLC監測樣品純度考察一定濃度條件下週期性穩定性，示例性的條件比如將樣品濃度控制在約50mg/ml，在10mM醋酸鹽/135mM NaCl(pH 5.5)比較在比如-80℃重複凍融5次及40℃保存一個月的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC管柱子檢測。檢測結果如下表9所示，兩個融合蛋白均表現出良好的穩定性。

注：△%表示變化率。

測試例10. 融合蛋白的化學穩定性

脫醯胺修飾是抗體中可能影響後期穩定性的一種常見的化學修飾，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺修飾一般選擇儘量避免或者突變降低。取1600μg待測抗體溶於200μl 10mM醋酸鹽/135mM NaCl(pH 5.5)中，40℃恆溫箱 存放；分別於0、14、28天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl，8M Gμa-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT,50℃水浴1小時，後用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測脫醯胺修飾情況，結果如下表10所示。

備註：N代表檢測到修飾的天冬醯胺，數字代表所處輕鏈或者重鏈N端開始計數所處的位置。百分含量代表LC-MS檢測到的脫醯胺修飾占該位點所處全部肽段信號的比例。

質譜檢測結果顯示兩個融合蛋白都沒有明顯的脫醯胺修飾位點，提示其後期化學穩定性良好。

製備例

示例性融合蛋白醫藥組成物(製劑)製備工藝

第一步：取一定量的純化的TGF-β受體融合蛋白原液，用不含蛋白的緩衝液(如10mM，pH 6.2枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液)進行溶劑置換(較佳超濾)，經超濾膜至少6倍體積置換，蛋白濃縮到約70mg/mL。加入一定體積的蔗糖母液，混 勻，使最終蔗糖濃度為80mg/mL。加入一定體積的吐溫-80母液，混勻，使最終吐溫-80濃度為0.4mg/mL。加10mM pH 6.2枸櫞酸鹽緩衝液定容，使蛋白濃度為50mg/mL(其他待測試製劑或穩定性製劑參照相似步驟進行配製)。

產品經過濾後中控取樣檢測無菌。將原液過0.22μm PVDF濾芯，收集濾液。

第二步：調節裝量至6.3ml，將濾液灌裝於6ml西林瓶中，加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第四步：目檢，確認產品無裝量不准等缺陷。打印、黏貼西林瓶標簽；打印紙盒標簽，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標簽。

製備例1. TGF-β受體融合蛋白製劑緩衝體系pH值的篩選

用下列緩衝液，配製蛋白濃度為50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)製劑：

1)10mM組胺酸-醋酸，pH 5.0

2)10mM組胺酸-醋酸，pH 6.0

3)10mM組胺酸-醋酸，pH 6.5

4)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.0

5)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 7.5

過濾每種製劑並以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。取樣品分別進行40℃高溫和振搖實驗，實驗結果如表11所示，結果表明TGF-β受體融合蛋白在pH 6.0-6.5時穩定性較好。

註：振搖條件為：D1：130rpm，D2：200rpm，D3-D7：300rpm；D表示天，T表示時間，M表示月。

製備例2. TGF-β受體融合蛋白製劑緩衝體系的篩選

用下列緩衝液，配製蛋白濃度為50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)製劑：

1)10mM琥珀酸-琥珀酸鈉，pH 6.0

2)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，pH 6.0

3)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，pH 6.5

4)10mM磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.5

5)10mM組胺酸-鹽酸鹽，pH 6.5

過濾每種製劑並以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。取樣品進行振搖(25℃，300rpm)實驗，實驗結果見表12，結果表明，磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉組在振搖第6天見大量小顆粒，SEC檢測聚體達1.8%，而其它組僅偶見小顆粒，可見TGF-β受體融合蛋白在枸櫞酸、組胺酸和琥珀酸鹽緩衝體系中的穩定性優於磷酸鹽緩衝體系。

注：D表示天。

製備例3. TGF-β受體融合蛋白製劑緩衝體系的進一步篩選

用pH 6.2的含10mM組胺酸-鹽酸鹽或10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉的緩衝液製備含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)濃度為50mg/ml的製劑。

過濾每種製劑並以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。將樣品保存於25℃，進行穩定性分析，6個月的SEC或非還原CE-SDS檢測。

實驗結果見表13，結果表明，枸櫞酸-枸櫞酸鈉體系優於組胺酸-鹽酸鹽體系(M6的SEC聚體：1.8% V 2.2%；非還原CE-SDS：94.5% V 92.2%)，因此可選擇枸櫞酸體系作為TGF-β受體融合蛋白的緩衝體系。

註：T表示時間；D表示天；M表示月。

製備例4. TGF-β受體融合蛋白製劑中穩定劑的篩選

用下列不同糖種類的緩衝液，製備蛋白濃度為50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)製劑：

1)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，80mg/ml蔗糖，pH 6.2

2)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，80mg/ml α,α-二水合海藻糖，pH 6.2

過濾每種製劑並以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。取樣品分別進行25℃常溫和2-8℃低溫長期保存實驗。

實驗結果見表14，結果表明蔗糖與海藻糖對TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)的穩定性作用相似，選擇蔗糖作為TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)的穩定劑。當蔗糖濃度為80mg/ml時，滲透壓約為300mosm/kg，接近等滲，因此可選蔗糖濃度為80mg/ml。

註：T表示時間，M表示月。

製備例5. TGF-β受體融合蛋白製劑中表面活性劑的篩選

用下列不同濃度及種類表面活性劑的緩衝液，製備蛋白濃度為50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)製劑：

1)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.1mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

2)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

3)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.4mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

4)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.6mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

5)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.8mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

6)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.1mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

7)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.2mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

8)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

9)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.6mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

10)10mM組胺酸-鹽酸鹽，0.8mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

過濾每種製劑並取0.5mL注射入50mL生理鹽水注射液或5%葡萄糖注射液，使稀釋後蛋白濃度為0.5mg/mL。觀察樣品的稀釋穩定性。實驗結果見表15，結果表明，處方中聚山梨酯20濃度達到0.2mg/ml以上時，稀釋後不溶性微粒有顯著下降；聚山梨酯80，氯化鈉稀釋產生的不溶性微粒隨著其濃度增加而減少，當達到0.4mg/ml以上時，10μm以上顆粒可降低到10個/ml以內。

製備例6. TGF-β受體融合蛋白製劑中表面活性劑的進一步篩選

用下列不同種類表面活性劑的緩衝液，製備蛋白濃度為50mg/ml的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)：

1)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2

2)10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉，0.6mg/ml聚山梨醇酯20，pH 6.2

過濾每種製劑並以1.2mL/瓶填充入2mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中，水針壓塞軋蓋封口。取樣品進行2-8℃低溫長期保存實驗。

實驗結果見表16，結果表明聚山梨醇酯80對TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)的穩定性作用更好，因此選擇聚山梨醇酯80作為TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)的表明活性劑。

註：T表示時間，D表示天，M表示月。

製備例7. TGF-β受體融合蛋白製劑濾膜相容性實驗

TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)以50mg/ml配製在10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80，pH 6.2中。將製劑分別過0.22μm PES濾膜和PVDF濾膜並於開始、中間和最後取樣檢測。

實驗結果見表17，蛋白含量、外觀和純度分析表明，TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)在與濾膜接觸的時間內是穩定的，該製劑與PES和PVDF濾膜均可以相容。

注：T表示時間。

製備例8. TGF-β受體融合蛋白製劑的凍乾

用pH6.2的含10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉的緩衝劑，製備TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)濃度為50mg/ml，含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨醇酯80的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)製劑。將抗體以6.3mL/瓶填充入20mL西林瓶中，裝入凍乾箱中，凍乾。

凍乾程序為預凍、一次乾燥和二次乾燥。凍乾程序結束後，真空加塞。複溶樣品進行凍乾前後對比。結果表明，複溶溶液可保持液體製劑良好的性能。

製備例9. 其它可選擇製劑組成

此外，本公開還提供其它製劑配方的TGF-β受體融合蛋白(融合蛋白9)藥物製劑：

(1)70mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和20mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.4；

(2)80mg/ml融合蛋白9，85mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.2；

(3)60mg/ml融合蛋白9，90mg/ml蔗糖，0.6mg/ml的聚山梨醇酯80，和5mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.2；

(4)30mg/ml融合蛋白9，60mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.3；

(5)90mg/ml融合蛋白9，95mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.0；

(6)100mg/ml融合蛋白9，70mg/ml蔗糖，0.1mg/ml的聚山梨醇酯80，和25mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.5；

(7)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為7.0；

(8)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為7.5；

(9)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為5.0；

(10)60mg/ml融合蛋白9，70mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和15mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為5.5；

(11)40mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.5mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.2；

(12)55mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.3mg/ml的聚山梨醇酯80，和5mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為6.0；

(13)65mg/ml融合蛋白9，90mg/ml蔗糖，0.7mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為7.5；

(14)70mg/ml融合蛋白9，75mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和30mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為7.0；

(15)50mg/ml融合蛋白9，80mg/ml蔗糖，0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，和10mM枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液，最終pH為7.0。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 一種TGF-β受體融合蛋白醫藥組成物及其用途

<150> 201811328326.1

<151> 2019-11-09

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HCDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HCDR2

<220>

<221> 結構域

<222> (3)..(3)

<223> Xaa選自His或Gly

<220>

<221> 結構域

<222> (8)..(8)

<223> Xaa選自Gly或Phe

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HCDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> LCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> LCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> LCDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 人源化PD-L1抗體重鏈可變區

<220>

<221> 結構域

<222> (52)..(52)

<223> Xaa選自His或Gly

<220>

<221> 結構域

<222> (57)..(57)

<223> Xaa選自Gly或Phe

<400> 7

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> 人源化PD-L1抗體輕鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> PD-L1抗體重鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> HCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<223> PD-L1抗體輕鏈可變區

<400> 11

<210> 12

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> PD-L1抗體重鏈序列：Ig G4(AA)(S228P)

<400> 12

<210> 13

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> PD-L1抗體輕鏈序列

<400> 13

<210> 14

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> TGF-β RII胞外結構域序列：ECD(1-136)

<400> 14

<210> 15

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> TGF-β RII胞外結構域序列在N端有19個胺基酸的截短或缺失：ECD(20-136)

<400> 15

<210> 16

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> TGF-β RII胞外結構域序列在N端有21個胺基酸的截短或缺失：ECD(22-136)

<400> 16

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> TGF-β RII胞外結構域序列在N端有14個胺基酸的截短或缺失：ECD(15-136)

<400> 17

<210> 18

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 檢測用抗原：PD-L1-His

<400> 18

<210> 19

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 對照1(20T-Fc)：ECD(20-136)-Fc,TGF-β RII胞外區截短片段ECD(20-136)與Fc的融合 蛋白

<400> 19

<210> 20

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 對照2(22T-Fc)：ECD(22-136)-Fc,TGF-β RII胞外區截短片段ECD(22-136)與Fc的融合 蛋白

<400> 20

<210> 21

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<223> FP17022融合蛋白中的PD-L1抗體2輕鏈的胺基酸序列

<400> 21

<210> 22

<211> 607

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> FP17022融合蛋白中的PD-L1抗體2重鏈/TGF-β RII胞外區(1-136)的融合肽序列

<400> 22

<210> 23

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 融合蛋白9中融合PD-L1抗體重鏈-(G4S)4G-TGF-β RII ECD(20-136)的融合肽序列

<400> 23

<210> 24

<211> 587

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<223> 融合蛋白15中融合PD-L1抗體重鏈-(G4S)5G-TGF-β RII ECD(22-136)的融合肽序列

<400> 24

Claims (51)

1. 一種醫藥組成物，其包含：

   TGF-β受體融合蛋白，以及

   緩衝液；

   其中，該緩衝液選自：組胺酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、枸櫞酸鹽緩衝液。
2. 如申請專利範圍第1項所述的醫藥組成物，其中，

   該組胺酸鹽緩衝液是組胺酸-鹽酸緩衝液，

   該琥珀酸鹽緩衝液是琥珀酸-琥珀酸鈉緩衝液，

   該枸櫞酸鹽緩衝液是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液。
3. 如申請專利範圍第2項所述的醫藥組成物，其中，該緩衝液是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該緩衝液的濃度為大約5mM至大約30mM。
5. 如申請專利範圍第4項所述的醫藥組成物，其中，該緩衝液的濃度為大約5mM至大約20mM。
6. 如申請專利範圍第5項所述的醫藥組成物，其中，該緩衝液的濃度為大約10mM。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-β受體融合蛋白的濃度為大約0.5mg/ml至大約100mg/ml。
8. 如申請專利範圍第7項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-β受體融合蛋白的濃度為大約30mg/ml至大約70mg/ml。
9. 如申請專利範圍第8項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-β受體融合蛋白的濃度為大約50mg/ml。
10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物的pH為大約5.0至大約7.5。
11. 如申請專利範圍第10項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物的pH為大約6.0至大約6.5。
12. 如申請專利範圍第11項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物的pH為大約6.2。
13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的醫藥組成物，其中，

    該醫藥組成物還包含糖。
14. 如申請專利範圍第13項所述的醫藥組成物，其中，該糖選自：海藻糖和蔗糖。
15. 如申請專利範圍第14項所述的醫藥組成物，其中，該糖為蔗糖。
16. 如申請專利範圍第13至15項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該糖的濃度為大約50mg/ml至大約100mg/ml。
17. 如申請專利範圍第16項所述的醫藥組成物，其中，該糖的濃度為大約60mg/ml至大約90mg/ml。
18. 如申請專利範圍第17項所述的醫藥組成物，其中，該糖的濃度為大約80mg/ml。
19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的醫藥組成物，其中，

    該醫藥組成物還包含表面活性劑。
20. 如申請專利範圍第19項所述的醫藥組成物，其中，該表面活性劑為聚山梨醇酯。
21. 如申請專利範圍第20項所述的醫藥組成物，其中，該表面活性劑為聚山梨醇酯80。
22. 如申請專利範圍第19至21項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該表面活性劑的濃度為大約0.1mg/ml至大約0.8mg/ml。
23. 如申請專利範圍第22項所述的醫藥組成物，其中，該表面活性劑的濃度為大約0.4mg/ml至大約0.8mg/ml。
24. 如申請專利範圍第23項所述的醫藥組成物，其中，該表面活性劑的濃度為大約0.4mg/ml。
25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的醫藥組成物，其包含：

    

    該醫藥組成物的pH為大約5.0至大約7.5。
26. 如申請專利範圍第25項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物的pH為大約6.0至大約6.5。
27. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的醫藥組成物，其包含：

    大約30mg/ml至大約70mg/ml TGF-β受體融合蛋白，

    

    該醫藥組成物的pH為大約6.0至大約6.5。
28. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的醫藥組成物，其包含：

    

    該醫藥組成物的pH為約6.2。
29. 如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-β受體融合蛋白如通式(I)所示：

    Ab-L-TGF-βRII ECD (I)

    其中TGF-βRII ECD為TGF-βRII胞外區的截短形式；

    Ab為PD-L1抗體或其抗原結合片段；

    L為連接序列。
30. 如申請專利範圍第29項所述的醫藥組成物，其中，該連接序列為(G₄S)_xG，其中x為3、4、5或6。
31. 如申請專利範圍第30項所述的醫藥組成物，其中，x為4。
32. 如申請專利範圍第29至31項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-βRII胞外區的截短形式是TGF-βRII胞外結構域序列在胺基端連續缺失至多26個胺基酸殘基。
33. 如申請專利範圍第32項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-βRII胞外區的截短形式是TGF-βRII胞外結構域序列在胺基端連續缺失14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個胺基酸殘基。
34. 如申請專利範圍第29至33項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-βRII ECD的序列如SEQ ID NO：14、15、16或17所示。
35. 如申請專利範圍第34項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-βRII ECD的序列如SEQ ID NO：15所示。
36. 如申請專利範圍第29至35項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：

    (A)分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

    分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

    (B)分別如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

    分別如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
37. 如申請專利範圍第29至36項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該PD-L1抗體或其抗原結合片段包含：

    (C)如SEQ ID NO：7所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：8所示的輕鏈可變區；或

    (D)如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，和如SEQ ID NO：11所示的輕鏈可變區。
38. 如申請專利範圍第29至37項中任一項所述的醫藥組成物，其中：

    該PD-L1抗體的重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示或與SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列具有至少85%的同一性，

    該PD-L1抗體的輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示胺基酸序列具有至少85%的同一性。
39. 如申請專利範圍第29至38項中任一項所述的醫藥組成物，其中，該TGF-βRII ECD藉由連接序列融合至PD-L1抗體重鏈羧基末端。
40. 如申請專利範圍第39項中所述的醫藥組成物，其中，該TGF-β受體融合蛋白包含：

    (E)PD-L1抗體重鏈和TGF-βRII ECD形成的融合肽，其序列如SEQ ID NO：23所示或與SEQ ID NO：23所示序列具有至少85%同一性，和

    PD-L1抗體輕鏈，其序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示序列具有至少85%的同一性；或

    (F)PD-L1抗體重鏈和TGF-βRII ECD形成的融合肽，其序列如SEQ ID NO：24所示或與SEQ ID NO：24所示序列具有至少85%的同一性，和

    PD-L1抗體輕鏈，其序列如SEQ ID NO：13所示或與SEQ ID NO：13所示序列具有至少85%的同一性。
41. 一種製備如申請專利範圍第1至40項中任一項所述的醫藥組成物的方法，該方法包括：使TGF-β受體融合蛋白和緩衝液接觸的步驟。
42. 如申請專利範圍第41項所述的方法，其中，該緩衝液是枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩衝液。
43. 如申請專利範圍第42項所述的方法，其中，該緩衝液的濃度為大約5mM至大約20mM，該緩衝液的pH為約6.0至約6.5。
44. 一種含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑，該含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑藉由將申請專利範圍第1至40項中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
45. 一種含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑，該含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑經複溶後可形成如申請專利範圍第1至40項中中任一項所述的醫藥組成物。
46. 一種含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液，該含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液是藉由將申請專利範圍第44或45所述的凍乾製劑經複溶獲得。
47. 一種製品，其包括容器，該容器中包含：

    如申請專利範圍第1至40項中任一項所述的醫藥組成物、或

    如申請專利範圍第44或45項所述的含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑、或

    如申請專利範圍第46項所述的含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液。
48. 一種選自以下的任一項在製備藥物中的用途：

    如申請專利範圍第1至40項中任一項所述的醫藥組成物、或如申請專利範圍第44或45項所述的含有TGF-β受體融合蛋白的凍乾製劑、或如申請專利範圍第46項所述的含有TGF-β受體融合蛋白的複溶溶液、或如申請專利範圍第47項所述的製品；

    該藥物用於治療或抑制與腫瘤細胞增殖或腫瘤細胞轉移相關的疾病或病症。
49. 如申請專利範圍第48項所述的用途，其中，該疾病或病症為腫瘤。
50. 如申請專利範圍第49項所述的用途，其中，該疾病或病症選自：頭部頸部癌、成膠質細胞瘤、膠質瘤、鼻咽癌、甲狀腺癌、肺癌、骨髓瘤癌、骨髓增生異常綜合症、神經內分泌癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、基底細胞皮膚癌、鱗狀細胞皮膚癌、隆突性皮膚纖維肉瘤、梅克爾細胞癌、肉瘤、間皮瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、結直腸癌、乳腺癌、子宮內膜癌、子宮癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌。
51. 如申請專利範圍第50項所述的用途，其中，該肺癌選自：小細胞肺癌和非小細胞肺癌。

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