CN109536450A

CN109536450A - 一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109536450A
Application number: CN201811302503.9A
Authority: CN
Inventors: 刘广洋; 刘拥军
Original assignee: Beijing Beilai Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Beilai Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2019-03-29
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109536450B

Abstract

本发明公开了一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞，所述间充质干细胞借助基因修饰高表达抗IL‑23单链抗体与IgG1的Fc片段的αIL23:Fc融合蛋白。所述αIL23:Fc融合蛋白可竞争性抑制IL‑23与其受体的结合，从而可用于抑制IL‑23介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。本发明还公开了所述间充质干细胞的制备方法和应用。

Description

一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞及其制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

人白介素23(hIL-23)由树突状细胞(DC细胞)、巨噬细胞或其他抗原递呈细胞分泌，是由p19和p40两个亚基以二硫键相连接组成的异二聚体结构的致炎因子[1]。IL-23与IL-12共有p40亚基,其编码基因位于人的5号染色体上；而p19为IL23特有亚单位蛋白，编码基因位于人的12号染色体上。研发发现[2]，IL23通过与其受体(IL-23R)结合，从而介导机体众多炎症反应。

IL-23R同样为异质二聚体结构,由与IL-12R共有的IL-12Rβ1亚单位(其与IL-12p40亚单位相结合),及自身特有的IL-23R亚单位(与IL23p19亚单位相结合)共同构成。编码IL-12Rβ1亚单位的基因位于人的19号染色体上；编码IL-23R亚单位的基因位于人的1号染色体上[3]。IL-12Rβ1亚单位在T细胞、NK细胞(natural killer cells，自然杀伤细胞)、DC细胞有表达。IL-23R亚单位主要表达于特定的Th17细胞,另有少量表达于B细胞和固有淋巴细胞[4]。IL-23可结合Th17细胞表面的IL23受体(IL-23R)，活化JAK激酶并使IL23受体结构域酪氨酸磷酸化，进一步激活下游STAT、MAPK等信号通路，从而激活Th17细胞，使其分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等炎症因子[5]，而IL-17A/F(白细胞介素-17A/F)的分泌可激活效应细胞的NF-kB等炎症信号通路，从而引起下游一系列炎症因子(包括TNF-a、IL-1β及IL-6等)释放和炎症发生[6,7]；IL-17A/F也可通过诱导趋化因子的释放来诱导中性粒细胞募集至炎症部位，刺激前列腺素和金属蛋白酶产生、以及抑制蛋白多糖合成，同时IL-17A可进一步促进趋化因子CCL20、CXCL1、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL8及VEGF等分泌，进而导致免疫细胞异常分化、过度增殖和免疫细胞的激活[6,8]。

研究发现[2,9]，通过阻断IL-23与其受体结合，可有效降低炎症性肠病、银屑病等众多自身免疫性疾病的发生。而最新开发的治疗自身免疫性疾病(如炎症性肠病、银屑病及类风湿性关节炎等)的新药中，Ustekinumab(优特克诺单抗)，Guselkumab及Tildrakizumab等单抗药物均针对IL-23/Th17信号通路而研发，通过阻断IL-23及其受体的结合从而抑制IL-23/Th17轴介导的组织器官的炎症反应，达到治疗炎症性肠病或银屑病的目的[10-13]。其中Ustekinumab单抗是靶向IL-12和IL-23的p40共同亚基的人源化单克隆抗体[14],而Guselkumab和Tildrakizumab单抗则是靶向IL-23p19亚基[11]，从而抑制IL23p19亚基与其受体IL23R之间的结合，阻断Th17细胞下游激活信号。然而临床研究也发现，用上述单抗治疗病人时有少数患者出现严重不良事件，包括冠状动脉疾病，充血性心力衰竭，病毒综合征，尿路感染，手术伤口蜂窝织炎和肝酶水平升高，这种不良反应更多发于高血糖、高血压及高血脂的病人[14]。另外，上述抗体在使用过程中在部分病人(4％)血清中检测出抗单抗的抗体[14]，提示靶向药物的耐药性仍是单抗药物无法突破的难题。

基于此，亟需一种新的途径解决上述单抗的不足，用于制备治疗自身免疫性疾病(如炎症性肠病、银屑病及类风湿性关节炎等)的药物。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达IL23阻断性抗体，从而特异性阻断IL23与其受体的结合，调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，从而达到治疗IL23/Th17轴介导的自身免疫性疾病的目的。

术语“间充质干细胞”(MSCs)来源于发育早期中胚层，因其具有的免疫调节及组织损伤修复双层功能，从而在自身免疫性疾病治疗中具有良好的临床应用前景。MSCs对炎症部位有较好的归巢和靶向作用，并通过分泌大量的可溶性细胞因子(如转化生长因子β(TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、前列腺素(PGE2)等)从而抑制免疫细胞增殖、活化，抑制过激的淋巴细胞增殖和炎症因子释放，改善炎症局部微环境等[16-18]。同时，间充质干细胞可分泌丰富的血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)以及成纤维细胞生长因子(bFGF)等细胞因子，因此对心脏、肝脏、肾脏等主要器官具有较好的保护作用；研究发现，间充质干细胞对损伤组织具有较强修复能力，其具有定向分化为内皮细胞替换损伤皮肤的能力，同时可通过分泌表皮生长因子(EGF)、角蛋白生长因子(KGF)等因子促进皮肤组织的损伤修复。

如上所述，高表达白介素23单抗的间充质干细胞具有治疗银屑病等自身免疫性疾病的临床机理并具有降低单抗药物毒副作用和耐药性的机制。其作用表现在：1.间充质干细胞可通过抑制免疫细胞增殖、活化而治疗自身免疫性疾病；2.间充质干细胞可通过抑制B淋巴细胞活化，从而抑制抗IL23单抗等靶向药物的抗体产生，降低机体对IL23单抗的耐药性；3.间充质干细胞对心脏、肝脏等主要器官具有较好的保护作用，因此可降低单抗药物的毒副作用；4.间充质干细胞可促进皮肤、膝盖等组织的损伤修复，从而对银屑病、类风湿关节炎等疾病具有较好的恢复作用。

本发明的第一方面在于提供一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞，所述间充质干细胞借助基因修饰能够高表达抗白介素23单链抗体与免疫球蛋白G1的Fc片段(可结晶片段(fragment crystallizable，Fc))的αIL23:Fc融合蛋白。所述融合蛋白可竞争性抑制IL-23与其受体的结合，从而可用于抑制IL-23介导的炎症相关信号通路以及炎症反应。

作为本发明的一种实施方式，所述抗IL-23单链抗体包含IL-2信号肽结构、IL-23抗体的轻链可变区(IL23-VL)、Linker和IL-23抗体的重链可变区(IL23-VH)；所述IgG1的Fc片段包括IgG1的重链恒定区CH2、CH3以及铰链区。

作为本发明的一种实施方式，所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ No:1所示序列：MYRMQLLSCIALSLALVTNS；

所述IL23-VL的氨基酸序列为SEQ No:2所示序列：QSVLTQPPSVSGAPAQRVTISCTGSSSNIGSGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSKRRPGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQSEDEADYYCASWTDGLSLVVFGGGTKLTVL；

所述Linker的氨基酸序列为SEQ No:3所示序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

所述IL23-VH的氨基酸序列为SEQ No:4所示序列：EVQLVQSGAEVKKPAESLKISCKGSGYSFSNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIDPSNSYTRYRPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWYYKPFDVWGQGTLVTVSS。

作为本发明的一种实施方式，所述铰链区的氨基酸序列为SEQ No:5所示序列为：DKTHTCPPCP；

所述CH2的氨基酸序列为SEQ No:6所示序列：APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA；

所述CH3的氨基酸序列为SEQ No:7所示序列：KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS。

作为本发明的一种实施方式，编码所述αIL23:IgG1Fc融合蛋白的基因，全长为1488bp，编码496个氨基酸，分子量约为60kD，包括IL2信号肽编码基因(1-20aa)、抗IL23单链抗体(αIL23scFv,包括轻链可变区、linker、重链可变区)编码基因(21-268aa)、人免疫球蛋白IgG1重链恒定区(含绞链区)(IgG1Fc)编码基因(269-496aa)。

本发明中，所采用基因修饰干细胞的方法包括但不限于，病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑以及mRNA转染等。用于基因修饰的间充质干细胞来源包括但不限于，骨髓组织、脂肪组织、脐带组织、胎盘组织等不同组织来源的间充质干细胞。

作为本发明的一种实施方式，所述基因修饰为病毒转染技术；优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰采用第四代慢病毒转染技术，慢病毒转染系统购于OriGene公司。目的基因αIL23:Fc其3'-末段连接有IRES序列，后接绿色荧光蛋白(eGFP)基因，形成αIL23:Fc-I-eGFP序列，共同处于CMV启动子下游。

作为本发明的一种实施方式，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，通过慢病毒转染技术将αIL23:Fc-I-GFP融合蛋白基因导入人脐带间充质干细胞中，从而使间充质干细胞可表达αIL23:Fc-I-eGFP蛋白及绿色荧光蛋白(GFP)。

本发明的第二方面在于提供一种根据本发明的间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括：

(1)利用病毒载体系统构建αIL23:Fc融合蛋白病毒表达质粒，

(2)将所述αIL23:Fc融合蛋白病毒表达质粒导入T细胞，收获病毒；以及

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达抗IL-23单链抗体与IgG1的Fc片段的αIL23:Fc融合蛋白。

作为本发明的一种实施方式，所述制备方法包括：

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建αIL23:Fc融合蛋白慢病毒表达质粒，

(2)将所述αIL23:Fc融合蛋白慢病毒表达质粒分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒；

(3)将收获的病毒转染至间充质干细胞，24h后加入嘌呤霉素筛选被病毒转染的间充质干细胞，其高表达抗IL-23单链抗体与IgG1的Fc片段的αIL23:Fc融合蛋白。

作为本发明的一种实施方式，所述转染的方法为第四代慢病毒转染技术，慢病毒转染系统购于例如OriGene公司。目的基因αIL23:Fc其3'-末段连接有IRES序列，后接绿色荧光蛋白(eGFP)基因，形成αIL23:Fc-I-eGFP基因序列，共同处于CMV启动子下游。

作为本发明的一种实施方式，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞，通过慢病毒转染技术将αIL23:Fc-I-GFP融合蛋白(下称“αIL23:Fc融合蛋白”)基因导入人脐带间充质干细胞中，从而使间充质干细胞可表达抗IL23抗体(含IgG1:Fc)及绿色荧光蛋白(GFP)。

作为本发明的一种实施方式，基因修饰人脐带间充质干细胞表达αIL23:Fc融合蛋白，可通过荧光显微镜检测绿色荧光表达判断转染成功率，通过IgG1ELISA方法确定融合蛋白Fc段表达情况，通过IL23蛋白结合实验检测αIL23抗体与IL23的结合能力，通过IL23/IL23R阻断实验检测αIL23单抗对IL23与其受体的结合抑制能力。

作为本发明的一种实施方式，所述IgG1蛋白检测方法采用IgG1ELISA检测试剂盒(购于Invitrogen公司)检测细胞上清中IgG1的含量，具体方法参照说明书；所述IL23蛋白结合实验，方法为：采用2ug/ml重组人IL-23蛋白(购于R&Dsystems)包被酶标板，采用抗人IL-23阻断性抗体(α-IL23Ab购于R&Dsystems)作为阳性对照，并选择0-160ng/mlα-IL23Ab绘制标准曲线；样品孔加入MSC细胞培养上清(原倍、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用HRP结合的抗人IgG1抗体(购于Invitrogen公司)作为酶标抗体孵育1h，最后加入底物进行显色。

作为本发明的一种实施方式，所述IL23/IL23R结合阻断实验，采用2ug/ml重组人IL23蛋白(购于R&Dsystems)包被酶标板，加入0、50、100、200ng/ml IL23R进行孵育，同时加入0-200ng/mlα-IL23Ab绘制标准曲线；样品孔加入MSC细胞培养上清(原倍、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用生物素结合的IL23R(终浓度为1ug/ml，购于BPS Bioscience公司)孵育1h，加入HRP结合的链霉亲和素(购于Invitrogen公司)作为二抗孵育30min，最后加入底物进行显色。

本发明的第三方面在于提供所述的间充质干细胞在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种实施方式，所述免疫性疾病包括人银屑病(parapsoriasis,PS)、人类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、慢性阻塞性肺炎(chronicobstructivepneumonia，COPD)、儿童多发性风湿性关节炎(JRA)、克隆氏病(Crohn’s disease,CD)和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。

本发明具有以下突出的优点：

本发明所得到的经修饰的间充质干细胞能够高表达抗白介素23单链抗体与免疫球蛋白G1的Fc片段的αIL23:Fc融合蛋白，利用间充质干细胞对炎症部位的靶向作用及损伤部位的修复能力，通过基因修饰的方法，使间充质干细胞特异表达IL23阻断性抗体。通过IL23/IL23R阻断实验，可以确定基因修饰后的间充质干细胞表达的αIL23抗体可以显著阻断IL23与其受体的结合。因此，所述经修饰的间充质干细胞表达的αIL23:Fc融合蛋白，能够特异性阻断IL23与其受体的结合，调节人体免疫细胞功能、降低机体炎症反应，修复损伤的组织器官，从而达到治疗IL23/Th17轴介导的自身免疫性疾病的目的。

另外，现有抗体药物在人体内半衰期较短，单一疗程内需要反复多次大剂量注射，从而增加了治疗成本和药物毒副作用的发生。而IL23单抗基因修饰的间充质干细胞治疗银屑病等自身免疫性疾病，单次注射细胞后即可在病人体内持续分泌低剂量IL23单抗，达到持续阻断IL23与其Th17上的受体结合的目的，治疗效果更为持久、稳定，治疗成本和毒副作用更低。同时，间充质干细胞具有较好的免疫调节能力和组织损伤修复能力，因此该发明为银屑病等自身免疫性疾病的治疗提供了较为理想的新方法。

附图说明

图1.αIL23:Fc融合蛋白基因载体构建，目的基因αIL23:Fc 3'-末段连接有IRES序列，后接增强绿色荧光蛋白(eGFP)基因，形成αIL23:Fc-I-eGFP序列，共同处于CMV启动子下游。对照病毒为LV-eGFP病毒，CMV启动子后表达GFP基因。

图2.免疫荧光检测基因修饰间充质干细胞表达绿色荧光。LV-eGFP以及LV-αIL23:Fc-I-eGFP融合蛋白(以下简称“LV-αIL23:Fc融合蛋白”)慢病毒转染后的间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白(GFP)，而正常间充质干细胞(对照)则不表达GFP。

图3.通过IgG1ELISA检测试剂盒检测融合蛋白中IgG1Fc的表达情况，发现LV-αIL23融合蛋白基因修饰的间充质干细胞(下简称“IL23Ab-MSCs”)高表达IgG1(105±13.8ng/ml)，而正常MSCs以及对照组LV-eGFP转染的间充质干细胞(以下简称“GFP-MSCs”)不表达IgG1。

图4.通过IL23结合实验，确定IL23Ab-MSCs表达αIL23抗体，且可以与重组IL23蛋白较好结合，通过α-IL23Ab标准曲线计算其IL23抗体表达量达110±22.5ng/ml，与IgG1ELISA检测试剂盒检测数据一致。而正常MSCs以及对照组GFP-MSCs不表达αIL23抗体。

图5.通过IL23/IL23R阻断实验，确定IL23Ab-MSCs表达的αIL23抗体可以显著阻断IL23与其受体的结合，而正常MSCs以及对照组GFP-MSCs上清液蛋白则没有阻断作用。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：LV-αIL23:Fc融合蛋白基因载体构建

我们设计的αIL23:Fc基因质粒，利用第四代慢病毒载体系统构建αIL23:Fc融合蛋白基因慢病毒表达质粒，并以LV-eGFP作为对照病毒。(图1为LV-αIL23:Fc融合蛋白和LV-eGFP质粒结构)

实施例2：LV-αIL23:Fc融合蛋白基因修饰间充质干细胞

将上述LV-αIL23:Fc融合蛋白质粒以及LV-eGFP分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G等框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒后转染MSCs，24h后加入嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。

实施例3：免疫荧光检测基因修饰干细胞表达绿色荧光蛋白

通过荧光显微镜检测病毒转染后细胞绿色荧光，发现LV-eGFP及LV-αIL23:Fc融合蛋白均可成功转染MSCs细胞，转染率达到90％以上(图2为荧光显微镜检测基因修饰MSCs转染效果)。

实施例4：ELISA检测基因修饰的间充质干细胞表达IgG1

采用IgG1ELISA检测试剂盒(购于Invitrogen公司)检测细胞上清中IgG1的含量，具体方法参照说明书；通过IgG1ELISA检测试剂盒检测融合蛋白中IgG1Fc的表达情况，发现IL23Ab-MSC高表达高表达IgG1(105±13.8ng/ml)，而正常组MSC以及对照组GFP-MSC不表达IgG1(图3)。

实施例5：检测基因修饰的间充质干细胞表达IL-23抗体及其功能

采用IL23蛋白结合实验检测αIL23抗体表达情况，方法为：采用2ug/ml重组人IL-23蛋白(购于R&D systems)包被酶标板，采用抗人IL-23阻断性抗体(α-hIL23Ab购于R&Dsystems)作为标准品，并选择0-160ng/mlα-hIL23Ab绘制标准曲线；样品孔加入MSC细胞培养上清(原倍、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用HRP结合的抗人IgG1抗体(购于Invitrogen公司)作为酶标抗体孵育1h，最后加入底物进行显色。

通过IL23结合实验，确定IL23Ab-MSC表达的抗IL23抗体可以与重组IL23蛋白较好结合，通过α-hIL23Ab标准曲线计算IL23表达量达110±22.5ng/ml，与IgG1ELISA检测试剂盒检测数据一致。正常MSC以及对照组GFP-MSC细胞不表达αIL23抗体(图4)。

实施例6：检测基因修饰的间充质干细胞表达IL-23抗体及其功能

采用IL23/IL23R结合阻断实验检测αIL23抗体阻断IL23及其受体结合情况，具体方法如下：采用2ug/ml重组人IL23蛋白(购于R&D systems)包被酶标板，加入0、50、100、200ng/ml IL23R进行孵育，同时加入0-200ng/mlα-hIL23Ab(购于R&D systems，作为标准品)绘制标准曲线；样品孔加入MSC细胞培养上清(原倍、2倍及4倍稀释)孵育2h，然后用生物素结合的IL23R(终浓度为1ug/ml，购于BPS Bioscience公司)孵育1h，加入HRP结合的链霉亲和素(购于Invitrogen公司)作为二抗孵育30min，最后加入底物进行显色。通过IL23/IL23R阻断实验，确定IL23Ab-MSC表达的αIL23抗体可以显著阻断IL23与其受体的结合，而正常组MSC以及对照组GFP-MSC上清液则没有阻断作用(图5,*p<0.05,**p<0.01：IL23Ab-MSC vs GFP-MSC)。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

以下出版物通过引用并入本文。这些出版物在本文中由下面提供的数字引用。在该出版物列表中包括任何出版物不应被视为承认本文提及的任何出版物是现有技术。

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SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝来生物科技有限公司

<120> 一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Ala Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Lys Arg Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Thr Asp Gly

85 90 95

Leu Ser Leu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Ala Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asn Ser Tyr Thr Arg Tyr Arg Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Tyr Tyr Lys Pro Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

100 105

<210> 7

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

1 5 10 15

Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

20 25 30

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

35 40 45

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

50 55 60

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

65 70 75 80

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

85 90 95

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

100 105

Claims

1.一种阻断Th17信号通路治疗自身免疫病的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞借助基因修饰高表达抗IL-23单链抗体与IgG1的Fc片段的αIL23:Fc融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于，所述抗IL-23单链抗体包含IL-2信号肽结构、IL23-VL、Linker和IL23-VH；所述IgG1的Fc片段包括IgG1的CH2、CH3以及铰链区。

3.根据权利要求2中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述IL-2信号肽的氨基酸序列为SEQ No:1所示序列；所述IL23-VL的氨基酸序列为SEQ No:2所示序列；所述Linker的氨基酸序列为SEQ No:3所示序列；所述IL23-VH的氨基酸序列为SEQ No:4所示序列。

4.根据权利要求2中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述铰链区的氨基酸序列为SEQ No:5所示序列；所述CH2的氨基酸序列为SEQ No:6所示序列；所述CH3的氨基酸序列为SEQ No:7所示序列。

5.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰采用的技术为病毒转染、脂质体转染、电转移、基因编辑或mRNA转染的技术。

6.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述基因修饰为病毒转染技术；优选地，所述基因修饰为慢病毒转染技术；更优选地，所述基因修饰为第四代慢病毒转染技术。

7.根据权利要求1中所述的间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓组织、脂肪组织、脐带组织或胎盘组织来源的间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。

8.一种根据权利要求1-7任一项中所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)利用病毒载体系统构建αIL23:Fc融合蛋白病毒表达质粒，

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

(1)利用第四代慢病毒载体系统构建αIL23:Fc融合蛋白慢病毒表达质粒；

(2)将所述αIL23:Fc融合蛋白慢病毒表达质粒分别与慢病毒pGag/Pol、pRev、pVSV-G框架质粒混合，通过LTX脂质体导入293T细胞，包装得到成熟慢病毒，收获病毒；以及

10.根据权利要求1-7任一项所述的间充质干细胞在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用；优选地，所述免疫性疾病包括人银屑病、人类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺炎、儿童多发性风湿性关节炎、克隆氏病和系统性红斑狼疮。