CN113330037B - 二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物 - Google Patents

二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物 Download PDF

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Abstract

提供二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。该二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，和b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即scFv1‑CL或CL‑scFv1；或者包括：c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链。

Description

二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物
本申请要求于2018年12月28日提交中国专利局、申请号为201811622069.2、发明名称为“二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，特别涉及二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。
背景技术
双特异性抗体(bispecific monoclonal antibody,BsAb)是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体能够同时识别肿瘤靶细胞和免疫效应细胞，因此兼有抗体特异性和介导效应细胞的细胞毒作用的双重功能。双特异性抗体能将效应细胞聚集于肿瘤部位并激活效应细胞发挥抗肿瘤作用，其杀伤肿瘤细胞的作用机理包括细胞增殖、细胞因子释放、细胞毒性多肽和酶的调控。体内及临床研究证明双特异性抗体介导的免疫治疗可使部分动物的肿瘤缓解，临床上可使肿瘤患者病情减轻，延长生命。因此，双特异性抗体介导的免疫活性细胞在肿瘤治疗中的应用具有良好的前景。
双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。本领域中双或多特异性抗体能够结合2种以上抗原，可以利用细胞融合、化学缀合或重组DNA技术产生。最近己经开发了广泛多样的重组双特异性抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Co1oma,M.J.,等,Nature Biotech.15(1997)159-163；WO2001077342；和Morrison,S.L.,Nature Biotech.25(2007)1233-1234)。此外，还开发了能够结合2种以上抗原的诸多其他新型形式，其中抗体中心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再保持如双抗体、三链抗体或四链抗体、minibodies和若干单链形式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.,等，Nature Biotech.23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobio1ogy74(2007)3-14；Shen,J.，等，Journa1 of Immunogica1 Methods 318(2007)65-74；Wu,C.，等.,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
在一种方法中，利用细胞杂交瘤(quadroma)技术(见Mi1stein,C.和A.C.Cue11o,Nature，305(1983)537-40)生成了与天然抗体非常类似的双特异性抗体，所述细胞杂交瘤技术基于表达具有所需的双特异性抗体特异性的鼠单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合。因为在产生的细胞杂交瘤细胞系中的两个不同抗体重链和轻链的随机配对，所以生成至多10种不同抗体类型，其中只有一种是所需的功能双特异性抗体。由于存在错配副产物和显著降低的产率，其意味着需要复杂的纯化程序(参见例如Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。一般地，如果使用重组表达技术，则相同的错配副产物问题仍存在。
用于避开错配副产物问题的方法，称为“凸起一进入一孔洞(knobs-into-ho1es)”，目的在于通过将突变引入CH3结构域以修饰接触界面来迫使两个不同抗体重链配对。在一条链上，大体积氨基酸被具有短侧链的氨基酸替换，以形成“孔洞”。相反地，将具有大侧链的氨基酸引入到另一个CH3结构域中，以形成“凸起”。通过共表达这两条重链，观察到与同型二聚体形式(“孔洞一孔洞”或“凸起-凸起”)相比高产率的异二聚体形式(“凸起-孔洞”)(Ridgway,J.B.,Presta,L.G.,Carter,P.和WO1996027011)，异二聚体的百分比可以通过利用噬菌体展示法重建两个CH3结构域的相互作用表面和引入二硫键来稳定该异二聚体而得到进一步增加(Merchant,A.M.，等,Nature Biotech16(1998)677-681；Atwell，S.,Ridgway,J.B.,Wells,J.A.，Carter，P.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)。这种策略的一个重要制约是两个母体抗体的轻链必须相同，以防止错配和形成失活的分子。
除“杵臼”结构之外，还可通过IgG和IgACH3的链交换(strand-exchangeengineered domain，SEED)技术实现不同半抗体的Fc配对(Davis,J.H,等.,ProteinEng.Des.Sel.,2010,23(4):195-202.)。
为了解决不同轻链正确装配的问题，近年来又开发了双细胞系分别表达半抗体、体外装配的新工艺。受到人体IgG4抗体在生理条件下自然发生的半抗体随机交换过程的启示，GenMab公司开发了FAE(Fab-arm exchange)双功能抗体技术(Gramer,M.J,等.,MAbs2013,5(6):962-973.)。在两个目标抗体IgG1重链CH3区分别引入K409R和F405L两个点突变，就能够形成类似于IgG4抗体的半抗体交换重排。将突变后的两个不同IgG1抗体在两个CHO细胞系中分别表达并完成半抗体轻重链间的装配，经过蛋白A亲和纯化后，利用温和的氧化剂系统可在体外实现异源半抗体之间的精确装配。
除了共用序列相同的轻链或进行体外装配，通过Crossmab技术也可促进抗体轻链的正确装配。代表产品是罗氏公司的Ang-2/VEGF CrossMab CH1-CL。Crossmab技术是在“杵臼”改造的基础上，将Ang-2抗体Fab结构域中的CL与CH1互换，而VEGF抗体的Fab结构则保持不变。经过改造的Ang-2抗体轻链不易与VEGF抗体的重链发生错配，同时“杵臼”结构可促进两条重链异源二聚化(Schaefer,W,等.,ProcNatl.Acad.Sci.U S A,2011,108(27):11187-11192.)。
此外，还可以将两个单链抗体(scFv)或者两个Fab通过肽段链接，形成双功能抗体片段。具有代表性的是德国Micromet公司开发的BiTE(bispecific T-cell engager)系列产品。该系列产品是将抗CD3单链抗体与不同抗肿瘤细胞表面抗原单链抗体通过肽段进行连接获得的(Baeuerle,P.A,等.,Cancer Res.,2009,69(12):4941-4944.)。这类抗体结构的优点是分子量小、可以在原核细胞中表达、不需要考虑正确装配的问题；缺点是由于没有抗体Fc段，不能介导相应的生物学功能、半衰期短等。
公开号为US2015/0284475 A1和CN101896504A的专利中均公开了二价双特异性抗体，但两件专利中的二价双特异性抗体与抗原的亲和力较低。邵长利发表的《基于柔性链连接的双特异性抗体分子的设计和结构模拟》中的柔性肽结构对前述两件专利中的二价双特异性抗体进行改造，但抗体的亲和力依然不理想。
针对上述双特异性抗体技术平台所具有的轻链错配，轻重链正确装配率不高或者分子偏大或偏小等问题，需要发明新型的二价双特异性抗体。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。该抗体的轻重链正确装配率高，且分子大小适中。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，即CH1-partial hinge(铰链区部分序列)-linker(柔性肽)-scFv2或scFv2-linker-CH1-partial hinge；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即scFv1-CL或CL-scFv1；
或者包括：
c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和
d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连，重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。
作为优选，柔性肽为(G4S/G4SAS)n，n为大于或等于0的整数，且与柔性肽相连的IgG1铰链区部分序列为：EPKSCDK(SEQ ID NO:24)；其中(G4S/G4SAS)n表示(G4S)n或(G4SAS)n,n为大于或等于0的整数；
链接肽为L/GGGC(L/GGGC表示LGGC或GGGC)，且与链接肽相连的重链铰链区第一个半胱氨酸残基(C)突变为丝氨酸(S)。
作为优选，在a)和b)步骤中，CL和CH1能形成异源二聚体，CL的末端半胱氨酸残基可以与重链的铰链区上的半胱氨酸残基形成二硫键。
作为优选，在c)和d)步骤中，其中一条重链的链接肽L/GGGC与一条轻链的链接肽L/GGGC的末端半胱氨酸残基能形成二硫键；和其中一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域被改变为促进形成二价双特异性抗体的结构。
作为优选，改变为：
a)改变第一重链的CH3结构域：在与二价双特异性抗体内的第二重链的CH3结构域的初始界面相接触的第一重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第一重链的CH3结构域的界面内生成凸起，凸起可以定位在第二重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；且
b)改变第二重链的CH3结构域：在与二价双特异性抗体内的第一重链的CH3结构域的初始界面相接触的第二重链的CH3结构域的初始界面内，氨基酸残基被替换为具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基，在第二重链的CH3结构域的界面内生成凹洞，在凹洞中可以定位第一重链的CH3结构域的界面内的凸起，
其中第一重链可变区与轻链可变区分别连接(G4S/G4SAS)n以及L/GGGC，并在两个L/GGGC的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
作为优选，具有大于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基氨基酸残基由精氨酸(R)、苯丙氨酸(P)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)组成。
具有小于原始氨基酸残基体积的氨基酸残基氨基酸残基由丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)组成。
作为优选，本发明提供的二价双特异性抗体，其包括：
a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，即SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；和
b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列；
或者包括：
c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链，即SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；和
d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，即SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连，重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。
本发明还提供了该二价双特异性抗体的制备方法，其包括下列步骤：
a)用以下载体转化宿主细胞，
第一载体(包括编码SEQ ID NO:2的基因)，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段和重链恒定区CH1的核酸分子，和
第二载体(包括编码SEQ ID NO:11的基因)，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段和轻链恒定区的核酸分子；
或者
第三载体(包括编码SEQ ID NO:14的基因)，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；
第四载体(包括编码SEQ ID NO:5的基因)，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链的核酸分子；
第五载体(包括编码SEQ ID NO:15的基因)，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链的核酸分子，其中轻链可变区与链接肽相连；和
第六载体(包括编码SEQ ID NO:6的基因)，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的重链的核酸分子，其中重链可变区通过链接肽与重链Fc片段相连；
b)在容许合成抗体分子的条件下培养宿主细胞；
c)从培养物中回收抗体分子。
本发明还提供了编码本发明二价双特异性抗体的基因，其包括：
第一核酸分子(编码SEQ ID NO:2的基因)，其为编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列的核酸分子；和
第二核酸分子(编码SEQ ID NO:11的基因)，其为编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL的核酸分子；
或者包括：
第三核酸分子(编码SEQ ID NO:14的基因)，其为编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链；
第四核酸分子(编码SEQ ID NO:5的基因)，其为编码特异性结合第一抗原的抗体的重链；
第五核酸分子(编码SEQ ID NO:15的基因)，其为编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链；其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连；和
第六核酸分子(编码SEQ ID NO:6的基因)，其为编码特异性结合第二抗原的抗体的重链，其中重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包括：
第一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段和重链恒定区CH1的核酸分子，和
第二载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段和轻链恒定区的核酸分子；
或者包括：
第三载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的轻链的核酸分子；
第四载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的重链的核酸分子；
第五载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的轻链的核酸分子，其中轻链可变区与链接肽相连；和
第六载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的重链的核酸分子，其中重链可变区通过链接肽与重链Fc片段相连。
本发明还提供了包括该二价双特异性抗体的组合物，二价双特异性抗体的组合物为药物组合物或诊断组合物。
作为优选，药物组合物还包括至少一种药用赋形剂。
本发明提供了二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物。该二价双特异性抗体包括：a)特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，即CH1-partial hinge-linker-scFv2或scFv2-linker-CH1-partial hinge；和b)特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，即scFv1-CL或CL-scFv1；
或者包括：
c)特异性结合第一抗原的抗体的轻链和重链；和d)特异性结合第二抗原的抗体的轻链和重链，其中轻链可变区与柔性肽以及链接肽相连，重链可变区通过柔性肽以及链接肽与重链Fc片段相连。
本发明具有的技术效果为：
本发明的二价双特异性抗体与第一抗原分子及第二抗原分子的亲和力均较高，均与亲本单克隆抗体分子相当，如B2和FV1与PD-L1的亲和力分别为1.09E-10M和2.71E-10M；B2和FV1与PD-L1的亲和力分别为2.58E-8M和1.50E-8M。可见，本发明抗体的轻重链正确装配率高，且分子大小适中。
附图说明
图1为B结构二价双特异性抗体示意图，包括B1、B2、B3和B4四种结构；
图2为FV结构二价双特异性抗体示意图，包括FV1、FV2、FV3和FV4四种结构；
图3为B和FV结构双特异性抗体瞬转表达SDS-PAGE检测结果：M为Maker；泳道1、3、5、7、9、11、13、15分别为B1、B2、B3、B4、FV1、FV2、FV3、FV4的非还原电泳；泳道2、4、6、8、10、12、14、16分别为B1、B2、B3、B4、FV1、FV2、FV3、FV4的还原电泳；
图4为B和FV结构二价双特异性抗体Elisa检测结果，包括B1、B2、B3和B4四种结构(4-1)以及包括FV1、FV2、FV3和FV4四种结构(4-2)的Elisa检测结果；
图5为优选的B2和FV1结构双特异性抗体纯化后SDS-PAGE检测结果：M为Maker；泳道1、2、3为B2双特异性抗体非还原瞬转上清、Protein L亲和层析非还原洗脱液、PD-L1亲和层析非还原洗脱液；泳道4、6、8为FV1双特异性抗体MabSelectSure亲和层析非还原洗脱液、Protein L亲和层析非还原洗脱液、hCD47亲和层析非还原洗脱液；泳道5、7、9为FV1双特异性抗体Mab SelectSure亲和层析还原洗脱液、Protein L亲和层析还原洗脱液、hCD47亲和层析还原洗脱液；
图6为优选的B2和FV1结构二价双特异性抗体纯化后Elisa检测结果。
具体实施方式
本发明公开了二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
术语“抗体”用于本文中时，指完整的、单克隆抗体。所述完整抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)。所述抗体的轻链和重链是由若干结构域组成的多肽。在完整抗体中，每条重链包括重链可变区VH和重链恒定区。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体类型IgA，IgD，和IgG)和任选地，重链恒定结构域CH4(抗体类型IgE和IgM)。每条轻链包括轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。一种天然存在的完整抗体，即IgG抗体。可变结构域VH和VL可以进一步再分为高变区，称为互补性决定区CDR，它们之间分布有更加保守的区域，称为框架区FR。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端向羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、F3、CD3和FR4(Janeway,C.A.，Jr.等.,(2001)Immunobiology，第5版，加兰出版社；和Woof,J.,Burton D.Nat.Rev.Immunol.4(2004)89-99)。两对重链和轻链能够特异性结合相同抗原。因此所述完整抗体是二价、单特异性抗体。所述“抗体”包括例如小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传改造的抗体，条件是保持它们的特有特性。特别优选人或人源化抗体，尤其作为重组人或人源化抗体。
存在5种由希腊字母表示的哺乳动物抗体重链类型：α、δ、ε、γ和μ(Janeway,C.A.，Jr.等.,(2001)Immunobiology，第5版，加兰出版社)。存在的重链的类型运义抗体的类型；这些链分别存在于IgA，IgD，IgE，IgG,和IgM抗体中(Rhoades,R.A.,Pflanzer,R.G.(2002).Human Physiology，第4版，汤姆森知识)。不同的重链在尺寸和组成上不同；α和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε具有约550个氨基酸。
每条重链具有两种区域，即恒定区和可变区。恒定区在相同同种型的所有抗体中相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链γ、α和δ具有由3个恒定结构域CH1、CH2和CH3组成的恒定区和用于增加柔性的饺链区(Woof,J.,BurtonD.Nat.Rev.Immunol.4(2004)89-99)重链μ和ε具有由4个恒定结构域CH1、CH2，CH3和CH4组成的恒定区(Janeway,C.A.，Jr.等.,(2001)Immunobiology，第5版，加兰出版社)。重链的可变区在由不同B细胞产生的抗体中不同，但对由单个B细胞或B细胞克隆产生的所有抗体都相同。每条重链的可变区长约110个氨基酸且由单个抗体结构域组成。
在哺乳动物中，仅存在两类轻链，其称为λ和K。轻链具有两个连续的结构域：1个恒定结构域CL和1个可变结构域VL。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。优选地，轻链是K轻链，且恒定结构域CL优选是CK。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单个氨基酸组合物的抗体分子制剂。
按照本发明的“抗体”可以是任意类型例如(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，优选IgG或IgE)，或亚型例如(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，优选IgG1)，其中按照本发明的二价双特异性抗体所源自的两种抗体具有相同亚型(例如IgGl、IgG4等，优选IgG1)的Fc部分，优选相同同种异型的Fc部分。
“抗体的Fc部分”是技术人员公知的术语并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解而定义。按照本发明的抗体包含如Fc部分，优选源自人来源的Fc部分和优选人恒定区的全部其他部分。抗体的Fc部分直接参与补体活化、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。虽然抗体对补体系统的影响取决于某些条件，但是与C1q的结合由Fc部分中确定的结合位点导致。所述结合位点是现有技术且记述在例如Lukas，T.J.，等.,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse；Cebra，J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.，等.，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.，等.,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.，等.,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.，等.,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.,Immunology86(1995)319-324；和EP0307434中。所述结合位点是例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(按照Kabat的EU目录编号)。亚型IgGl、IgG2和IgG3的抗体通常显示补体活化、C1q结合和C3活化，而IgG4不活化补体系统，不结合C1q且不活化C3。优选地，Fc部分是人Fc部分。
用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NSO或CHO细胞的抗体或分离白人免疫球蛋白基因的转基因动物的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。
“可变结构域”用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个框架区(FR)，所述框架区的序列普遍保守，其通过3个高变区(CDRs)相连接。框架区采用自折叠构象且CDR可以形成连接自折叠结构的环。每条链中的CDR通过框架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和性方面起特别重要的作用。
用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”的氨基酸残基。“框架区”是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of lmmunological Interest)，第5版，公众健康服务；国家健康研究所(Public Health Service,National Institutes of Health),Bethesda,MD.(1991)的标准定义确定CDR和FR区域。
重链和轻链的“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合但是表现出多种效应子功能。
术语“二价双特异性抗体”用于本文中时，指如上所述的抗体，其中两个单链可变片段分别特异性结合不同抗原，既第一单链可变片段和轻链恒定区特异性结合第一抗原，第二单链可变片段和重链恒定区1以及部分铰链区特异性结合第二抗原；所述二价双特异性抗体能够同时特异性结合两种不同的抗原，且不超过两种抗原，与其相对照的是，一方面仅能够结合一种抗原的单特异性抗体和另一方面例如能够同时结合四种抗原分子的四价、四特异性抗体。
术语“抗原”或“抗原分子”用于本文中时，可交替使用并指能够被抗体特异性结合的所有分子。二价双特异性抗体特异性结合第一抗原和第二不同抗原。术语“抗原”用于本文中时，包括例如蛋白、蛋白上的不同表位(在本发明含义内作为不同抗原)和多糖。这主要包括细菌、病毒和其他微生物的部分(外壳、被膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。脂质和核酸仅在与蛋白和多糖结合时具有抗原性。非微生物外源(非自身)抗原可以包括花粉、蛋清和来自被移植组织和器官的或被灌输的血细胞表面上的蛋白。优选地，抗原选自由细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体细胞因子、细胞表面蛋白、酶和受体组成的组。
肿瘤抗原是由肿瘤细胞表面上的MHCI或MHCII分子里边的那些抗原。这些抗原有时可以由肿瘤细胞来呈递，且从来不由正常细胞来呈递。由此，它们称为肿瘤特异性抗原(TSAs)且典型地由肿瘤特异性突变产生。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，且它们称为肿瘤相关抗原(TAAs)。识别这些抗原的细胞毒性T淋巴细胞可能能够在肿瘤细胞增殖或转移前破坏它们。肿瘤抗原还可以采用例如突变受体的形式存在于肿瘤表面上，在这种情形中它们应该被B细胞识别。
在一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)中的至少一种是肿瘤抗原。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)均是肿瘤抗原；在该情形中，所述第一和第二抗原还可以是相同肿瘤特异性蛋白上的两种不同表位。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原，且另一种是效应细胞抗原，例如T细胞受体、CD3、CD16等。
在另一个优选的实施方案中，二价双特异性抗体特异性结合的两种不同抗原(第一和第二抗原)之一是肿瘤抗原，且另一种是抗癌物质诸如毒素或激酶抑制剂。
用于本文中时，“特异性结合”或“与……特异性结合”指特异性结合抗原的抗体。优选地，特异性结合该抗原的抗体的结合亲和性是KD值10-9mol/L以下例如10-10mol/L，优选具有KD值10-10mo1/L以下例如10-12mo1/L。结合亲和性使用标准结合测定，诸如表面等离振子共振技术(Biacore)来确定。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学洁性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷眈基或磺眈基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，且或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。
术语“核酸或核酸分子”，用于本文中时，意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。
用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。在意指不同名称时，其将由于上下文而清楚。
术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham和van der Eh,Virology 52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氧化钙的钙处理，如Cohen，F.N.，等，PNAS.69(1972)7110ff所述。
利用转化重组生成抗体是现有技术公知的且记述在，例如，综述文章Makrides，S.C.,ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,等.,Arzneimittel Forschung 48(1998)870-880中以及US6,331,415和US4,816,567中。
用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。
“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将括入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA括入细胞的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一个上述功能的载体。
“表达载体”是多核苷酸，其在引入合适的宿主细胞后能够被转录和翻译为多肽。"表达系统"通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体的功能是产生所需的表达产物。
按照本发明的二价双特异性抗体优选通过重组手段生成。所述方法是本领域中普遍已知的，且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达及随后分离抗体多肽和通常纯化到药用纯度。为了蛋白质表达，通过标准方法将编码轻链和重链的核酸或其片段括入表达载体。表达在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行，且从所述细胞(溶胞后的上清液或细胞)中回收抗体。二价双特异性抗体可以以完整细胞、以细胞裂解物或以部分纯化或基本纯形式存在。通过标准技术，包括碱/SDS处理，柱层析法和本领域中其他公知技术进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。参见Ausube l，F.，等.,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wileylnter science，纽约(1987)在NSO细胞中的表达记述在，例如，Barnes,L.M.，等.,Cytotechnology 32(2000)109-123；和Barnes，L.M.，等.,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.,Nucl.Acids Res.30(2002)四中。可变结构域的克隆记述在Orlandi,R.，等.,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.，等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；和Norderha，L.，等.，J.Immunol.Methods204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK293)记述在Schlaeger，E.J.，和Christensen,K.,Cytotechnology30(1999)71-83中和Schlaeger，E.J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中。
适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和聚腺苷酸化信号。
核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读杠中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸接合体或连接体根据常规实践使用。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A一琼脂糖、连磷灰石层析法、凝胶电泳、透析、或亲合层析法，从培养基中适当分离二价双特异性抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以起所述DNA和RNA来源的作用。一旦分离后，可以将DNA括入到表达载体中，所述表达载体随后转染到否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
二价双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适当的核苷酸改变引入到抗体DNA中，或通过核苷酸合成来制备。然而，这样的修饰仅能在非常有限的范围内，例如如上所述的范围内进行。另外，所述修饰不改变上述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可以提高重组产物的产率、蛋白稳定性或促进纯化。
本发明提供的二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物中所用原料或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：二价双特异性抗体制备
1、二价双特异性抗体瞬时转染表达载体的构建
(1)材料
抗人CD47的人源化单克隆抗体059-4.16.2 H1L2的VL(SEQ ID NO:18)和VH(SEQID NO:19)的序列，059-4.16.2 H1L2是通过杂交瘤得到鼠源抗体(201610436519.3)，然后进行人源化改造得到；
抗人PD-L1的人源单克隆抗体047 Ab-6的VL(SEQ ID NO:20)和VH(SEQ ID NO:21)的序列，047 Ab-6是对天然人源库进行淘筛得到(201810044303.1)，IgG1重链恒定区CH1的编码核苷酸、铰链区和Fc的编码核苷酸，和Kappa链恒定区的核苷酸。
(2)方法
选择pGS003构建二价双特异性抗体(8个，结构示意图见图1和图2)的重链和轻链的表达载体。根据抗人CD47的人源化单克隆抗体059-4.16.2 H1L2的VL和VH的编码核苷酸，抗人PD-L1的人源化单克隆抗体047 Ab-6的VL和VH的编码核苷酸，IgG1重链恒定区CH1的编码核苷酸、铰链区和Fc的编码核苷酸，和Kappa链恒定区的核苷酸序列及载体中的多克隆位点设计引物。经PCR扩增后，使用体外重组的方法(苏州泓迅，iMulli多片段重组克隆试剂盒)将9个重链编码序列和8个轻链编码序列克隆至pGS003，如表1。测序鉴定抗体基因正确插入后，将重组表达载体转化大肠杆菌TOP10F’，挑取单菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时。使用ZymoResearch的去内毒素大提试剂盒抽提质粒，最后将质粒溶于1mL超纯水，用分光光度计测定质粒浓度和OD260/280。OD260/280在1.8～1.9为纯度较高的质粒DNA。
表1、重链和轻链瞬时转染表达载体列表
重链表达载体名称 重链氨基酸序列 轻链表达载体名称 轻链氨基酸序列
H1 SEQ ID NO:1 L1 SEQ ID NO:10
H2 SEQ ID NO:2 L2 SEQ ID NO:11
H3 SEQ ID NO:3 L3 SEQ ID NO:12
H4 SEQ ID NO:4 L4 SEQ ID NO:13
H5 SEQ ID NO:5 L5 SEQ ID NO:14
H6 SEQ ID NO:6 L6 SEQ ID NO:15
H7 SEQ ID NO:7 L7 SEQ ID NO:16
H8 SEQ ID NO:8 L8 SEQ ID NO:17
H9 SEQ ID NO:9 / /
2、在哺乳动物细胞293E中的转染、表达和检测
将上述9个重链表达载体和8个轻链表达载体中H1、L2、L3和H4表达anti-h CD47的scFv，L1、H2、H3和L4表达anti-h PD-L1的scFv，H5和L5分别表达anti-h PD-L1的VH和VL，H6、H7、H8和H9表达anti-h CD47的VH，L6、L7和L8表达anti-h CD47的VL。
上述载体按照H1+L1(B1结构)、H2+L2(B2结构)、H3+L3(B3结构)、H4+L4(B4结构)、H5+L5+H6+L6(FV1结构)、H5+L5+H7+L7(FV2结构)、H5+L5+H8+L8(FV3结构)和H5+L5+H9+L7(FV4结构)组合后进行2mL293E体系的瞬时转染表达评估，其中FV1结构为(G4S/G4SAS)0+L/GGGC，其中FV2结构为(G4S/G4SAS)1+L/GGGC，其中FV3结构为(G4S/G4SAS)3+L/GGGC，其中FV4结构轻链为(G4S/G4SAS)1+L/GGGC，重链为L/GGGC+(G4S/G4SAS)1。检测表达量及抗体与人CD47和人PD-L1结合的ELISA检测值，结果见图3、图4(其中4-1为B结构二价双特异性抗体Elisa检测结果，4-2为FV结构二价双特异性抗体Elisa检测结果)。B2结构在B类结构双特异性抗体中表达、组装以及与抗原的结合都最佳；FV1结构在FV类结构双特异性抗体中表达、组装以及与抗原的结合都最佳。因此B2、FV1为优选抗体。
使用293E在Freestyle培养基中进行B2和FV1结构2个优选抗体的放大瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×106细胞/mL的293E细胞300mL，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取300μL的293fectin加入到5.7mL的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将B2结构及FV1结构分子所用到的表达质粒总量各300μg使用OPtiMEM稀释至6mL。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养7天。
实施例2：优选抗体的纯化及检测
B2结构蛋白纯化：
2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过Protein L(GE)层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。Protein L层析后样品再经过偶联人PDL1蛋白的亲和层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图5，结果显示优选抗体B2纯度为95％。
FV1结构蛋白纯化：
2000g、20min离心细胞培养液，收集上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，经过Mabselect Sure(GE)层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。Mabselect Sure层析后样品再经过Protein L(GE)层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。Protein L层析后样品再经过偶联人CD47蛋白的亲和层析，利用20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。纯化样品利用4～20％梯度胶(金斯瑞生物科技有限公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图5，结果显示优选抗体FV1纯度为90.8％。
实施例3：优选抗体结合人CD47及人PD-L1的ELISA检测
1、第一抗原包被：人PD-L1-mFc(金赛自构，SEQ ID NO:22)用PBS稀释成1μg/mL，加至96孔酶标板中，每孔50μL，4℃下孵育过夜。
2、封闭：洗板三次后用3％BSA封闭，每孔250μL，37℃条件下孵育2小时。
3、加候选抗体：洗板3次后，加入起始浓度为10mg/mL2倍稀释12个浓度梯度候选抗体样品或阳性对照或阴性对照。每孔50μL，25℃条件下孵育1小时。
4、加入第二抗原：人CD47-His(金赛自构，SEQ ID NO:23)用PBS稀释成10μg/mL，加至96孔酶标板中，每孔50μL，25℃条件下孵育1h。
5、加二抗：洗板3次后，加入HRP标记链霉亲和素(1:10000)，每孔50μL，25℃条件下孵育1小时。
6、显色：洗板4次后，加TMB显色液，每孔50μL，室温下避光显色10分钟。
7、终止：直接加入50μL每孔的终止液终止反应。
8、检测：终止反应后立即把酶标板放入酶标仪中，在450nm处测其OD值，保存原始数据整理。结果见图6，纯化后的优选抗体B2EC50＝0.5636，FV1EC50＝1.662。
实施例4：优选抗体亲和力测定
使用Biacore T200仪器检测B2和FV1结构抗体的亲和力。具体方法如下：将人PD-L1-His及人CD47-His偶联在CM5生物传感芯片(GE)上，将不同浓度的抗体以30μL/min流速流过芯片，抗原与候选抗体进行结合，结合时间为120s，解离时间为300s。用BIAevalution软件(GE)进行动力学拟合，获得亲和力常数结果如下表2、表3，B2和FV1与PD-L1的亲和力分别为1.09E-10M和2.71E-10M；B2和FV1与CD47的亲和力分别为2.58E-8M和1.50E-8M。
表2、候选抗体与PD-L1的亲和力测定结果
Figure BDA0003090517730000191
表3、候选抗体与CD47的亲和力测定结果
抗体名称 KD(M) Rmax(RU)
B2 2.58E-08 50.00
FV1 1.50E-08 60.00
CD47阳性单抗 2.36E-08 50.92
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 长春金赛药业有限责任公司
<120> 二价双特异性抗体及其制备方法、编码基因、宿主细胞、组合物
<130> MP21006412P
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser
            100                 105                 110
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
        115                 120                 125
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val Leu His Trp Val Arg Gln
    130                 135                 140
Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn
145                 150                 155                 160
Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr
                165                 170                 175
Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
            180                 185                 190
Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser
        195                 200                 205
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp
225                 230                 235                 240
Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Gln
                245                 250                 255
Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ala His Ser Asn
            260                 265                 270
Gly Tyr Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
        275                 280                 285
Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
    290                 295                 300
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser
305                 310                 315                 320
Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr
                325                 330                 335
His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            340                 345                 350
<210> 2
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
        115                 120                 125
Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln
    130                 135                 140
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Asp Arg Phe Thr Ile Ser
                165                 170                 175
Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
            180                 185                 190
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg His Trp Pro Gly
        195                 200                 205
Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser
225                 230                 235                 240
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
                245                 250                 255
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
            260                 265                 270
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        275                 280                 285
Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    290                 295                 300
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
305                 310                 315                 320
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser
                325                 330                 335
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            340                 345
<210> 3
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly
            180                 185                 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
                245                 250                 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
            260                 265                 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
        275                 280                 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
    290                 295                 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305                 310                 315                 320
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
                325                 330                 335
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
            340                 345
<210> 4
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
    130                 135                 140
Leu Pro Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Gln Ser Leu Ala His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
                245                 250                 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
            260                 265                 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
        275                 280                 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
    290                 295                 300
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
305                 310                 315                 320
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
                325                 330                 335
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
            340                 345                 350
<210> 5
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
    210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
                245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
            260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
        275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
    290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
                325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
            340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
        355                 360                 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
    370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
                405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
            420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        435                 440                 445
<210> 6
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Leu Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
        115                 120                 125
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
    130                 135                 140
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
                165                 170                 175
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
            180                 185                 190
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
        195                 200                 205
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
    210                 215                 220
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
225                 230                 235                 240
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
                245                 250                 255
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
            260                 265                 270
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
        275                 280                 285
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
    290                 295                 300
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
305                 310                 315                 320
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
                325                 330                 335
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
            340                 345                 350
<210> 7
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Leu Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Gly Gly
        115                 120                 125
Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
    130                 135                 140
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145                 150                 155                 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
                165                 170                 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
            180                 185                 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
        195                 200                 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
    210                 215                 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225                 230                 235                 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
                245                 250                 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
            260                 265                 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
        275                 280                 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
    290                 295                 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
                325                 330                 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
            340                 345                 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        355                 360
<210> 8
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Leu Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Gly Gly Cys Glu Pro Lys Ser Ser Asp
    130                 135                 140
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                165                 170                 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            180                 185                 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        195                 200                 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    210                 215                 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225                 230                 235                 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                245                 250                 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            260                 265                 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        275                 280                 285
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    290                 295                 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305                 310                 315                 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                325                 330                 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            340                 345                 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        355                 360                 365
Gly
<210> 9
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Ser Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Gly Gly Leu Phe Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Leu Thr Val Ser Ser Leu Gly Gly Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
        115                 120                 125
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
    130                 135                 140
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
145                 150                 155                 160
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
                165                 170                 175
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
            180                 185                 190
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
        195                 200                 205
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
    210                 215                 220
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
225                 230                 235                 240
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
                245                 250                 255
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
            260                 265                 270
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
        275                 280                 285
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
    290                 295                 300
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
305                 310                 315                 320
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
                325                 330                 335
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
            340                 345                 350
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
        355                 360
<210> 10
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly
            180                 185                 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
        195                 200                 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225                 230                 235                 240
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
                245                 250                 255
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
            260                 265                 270
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
        275                 280                 285
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
    290                 295                 300
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
305                 310                 315                 320
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
                325                 330                 335
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            340                 345
<210> 11
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Gly Ser Ala Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser
    130                 135                 140
Leu Pro Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Gln Ser Leu Ala His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu
                165                 170                 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
        195                 200                 205
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile
                245                 250                 255
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val
            260                 265                 270
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys
        275                 280                 285
Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
    290                 295                 300
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
305                 310                 315                 320
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr
                325                 330                 335
His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu
            340                 345                 350
Cys
<210> 12
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln Val Gln Leu Val
            100                 105                 110
Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser
        115                 120                 125
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Val Leu His Trp Val
    130                 135                 140
Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Asn Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr
                165                 170                 175
Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser
            180                 185                 190
Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr
        195                 200                 205
Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    210                 215                 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
225                 230                 235                 240
Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro
                245                 250                 255
Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ala His
            260                 265                 270
Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        275                 280                 285
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val
    290                 295                 300
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
305                 310                 315                 320
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln
                325                 330                 335
Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            340                 345                 350
Lys
<210> 13
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Glu Val Gln Leu Val
            100                 105                 110
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
        115                 120                 125
Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val
    130                 135                 140
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro
145                 150                 155                 160
Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Asp Arg Phe Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
            180                 185                 190
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg His Trp
        195                 200                 205
Pro Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
    210                 215                 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225                 230                 235                 240
Ala Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
                245                 250                 255
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr
            260                 265                 270
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        275                 280                 285
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe
    290                 295                 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
305                 310                 315                 320
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His
                325                 330                 335
Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            340                 345
<210> 14
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Leu Gly Gly Cys
        115
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu Gly Gly Cys
        115                 120
<210> 17
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
            20                  25                  30
Lys Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
        115                 120                 125
Ser Leu Gly Gly Cys
    130
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Leu Ala His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
                85                  90                  95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Tyr Phe Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Ser Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Val Thr Thr Ala
            20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Phe Pro Tyr Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr His Pro Ser
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 21
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Tyr Phe Pro Phe Ser Asp Ser
            20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Gln Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210> 22
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 22
Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser
1               5                   10                  15
Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu
            20                  25                  30
Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln
        35                  40                  45
Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg
    50                  55                  60
Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys
                85                  90                  95
Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val
            100                 105                 110
Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro
        115                 120                 125
Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys
    130                 135                 140
Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys
145                 150                 155                 160
Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr
            180                 185                 190
Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile
        195                 200                 205
Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Ser Gly Gly
    210                 215                 220
Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr
225                 230                 235                 240
Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
                245                 250                 255
Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
            260                 265                 270
Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
        275                 280                 285
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
    290                 295                 300
Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro
                325                 330                 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala
            340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp
        355                 360                 365
Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile
    370                 375                 380
Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn
385                 390                 395                 400
Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys
                405                 410                 415
Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys
            420                 425                 430
Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu
        435                 440                 445
Ser His Ser Pro Gly Lys
    450
<210> 23
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 23
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1               5                   10                  15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
            20                  25                  30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
        35                  40                  45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
    50                  55                  60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
                85                  90                  95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
            100                 105                 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser His
        115                 120                 125
His His His His His His
    130
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1               5

Claims (5)

1.二价双特异性抗体，其特征在于，所述二价双特异性抗体包括：
（1）a) 特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，其连接顺序依次为重链IgG1恒定区CH1、铰链区部分序列、柔性肽和单链可变片段scFv；和b) 特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其连接顺序依次为单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其中特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21所示，特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ IDNO: 18和SEQ ID NO: 19所示，所述轻链恒定区CL为kappa链恒定区，所述铰链区部分序列为：EPKSCDK；
（2）a) 特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，其连接顺序依次为重链IgG1恒定区CH1、铰链区部分序列、柔性肽和单链可变片段scFv；和b) 特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其连接顺序依次为单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其中特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示，特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ IDNO: 20和SEQ ID NO: 21所示，所述轻链恒定区CL为kappa链恒定区，所述铰链区部分序列为：EPKSCDK；
（3）a) 特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，其连接顺序依次为单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1和铰链区部分序列；和b) 特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其连接顺序依次为轻链恒定区CL和单链可变片段scFv，其中特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21所示，特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ IDNO: 18和SEQ ID NO: 19所示，所述轻链恒定区CL为kappa链恒定区，所述铰链区部分序列为：EPKSCDK；或者
（4）a) 特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列，其连接顺序依次为单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1和铰链区部分序列；和b) 特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL，其连接顺序依次为轻链恒定区CL和单链可变片段scFv，其中特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19所示，特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv中VL和VH的氨基酸序列分别如SEQ IDNO: 20和SEQ ID NO: 21所示，所述轻链恒定区CL为kappa链恒定区，所述铰链区部分序列为：EPKSCDK。
2.权利要求1所述二价双特异性抗体的制备方法，其特征在于，其包括下列步骤：
a) 用以下载体转化宿主细胞，
第一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列的核酸分子，和
第二载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL的核酸分子；
b) 在容许合成抗体分子的条件下培养所述宿主细胞；
c) 从培养物中回收所述抗体分子。
3.编码权利要求1所述二价双特异性抗体的基因，其特征在于，其包括：
第一核酸分子，其为编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列的核酸分子；和
第二核酸分子，其为编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL的核酸分子。
4.宿主细胞，其特征在于，其包括：
第一载体，其包括编码特异性结合第一抗原的抗体的单链可变片段scFv、柔性肽、重链IgG1恒定区CH1以及铰链区部分序列的核酸分子，和
第二载体，其包括编码特异性结合第二抗原的抗体的单链可变片段scFv和轻链恒定区CL的核酸分子；
所述第一载体和第二载体用于制备权利要求1所述二价双特异性抗体。
5.包括权利要求1所述二价双特异性抗体的组合物，其特征在于，所述二价双特异性抗体的组合物为药物组合物或诊断组合物。
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