JP2524778B2 - 核酸の測定方法 - Google Patents
核酸の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸の測定方法に関する。さらに詳しくは、
ペプチドまたは蛋白質を主成分とする生物製剤およびそ
の中間製品中に混在する核酸の検出測定方法に関する。
ペプチドまたは蛋白質を主成分とする生物製剤およびそ
の中間製品中に混在する核酸の検出測定方法に関する。
最近の分子生物学における進歩は著しく、特に遺伝子
組換え技術および細胞培養技術の進展には、従来の技術
では、生産が困難であつた生理活性ペプチド等の生物製
剤の生産を可能にしている。また、ハイブリドーマ技術
の進展にも細胞培養技術が不可欠である。しかし、遺伝
子組換え技術や細胞培養技術により生産された医薬品等
の認可については、安全性の基準となるガイドラインが
必要であり、その基準の一として、製品中に混在する核
酸、特に不純物DNAの含量が問題となつている。不純物D
NAとしては、特に腫瘍ウイルスDNAや癌遺伝子が問題と
なるが、一般的には、不純物DNAが１投与量当り100pg以
下に抑える必要があると考えられている（フアームテク
ジヤパン、第３巻、第45頁（1987年）。そのためには、
生産物の精製工程の各段階で不純物DNAの量をモニター
し、その減少を図ることが必要である。
組換え技術および細胞培養技術の進展には、従来の技術
では、生産が困難であつた生理活性ペプチド等の生物製
剤の生産を可能にしている。また、ハイブリドーマ技術
の進展にも細胞培養技術が不可欠である。しかし、遺伝
子組換え技術や細胞培養技術により生産された医薬品等
の認可については、安全性の基準となるガイドラインが
必要であり、その基準の一として、製品中に混在する核
酸、特に不純物DNAの含量が問題となつている。不純物D
NAとしては、特に腫瘍ウイルスDNAや癌遺伝子が問題と
なるが、一般的には、不純物DNAが１投与量当り100pg以
下に抑える必要があると考えられている（フアームテク
ジヤパン、第３巻、第45頁（1987年）。そのためには、
生産物の精製工程の各段階で不純物DNAの量をモニター
し、その減少を図ることが必要である。
生物試料中の核酸の測定方法として、従来知られてい
る一般的な方法は次のごとくである。
る一般的な方法は次のごとくである。
試料をプロテイナーゼＫで処理した後、フエノール抽
出し、次いでエタノール沈澱を行つて、核酸画分を回収
する。次にこれをニトロセルロース等のメンブランに固
定した後、予め標識したDNAプローブを用いてハイブリ
ダイゼーシヨンを行つてメンブランに結合したプローブ
の量から、試料中の核酸量を測定する。
出し、次いでエタノール沈澱を行つて、核酸画分を回収
する。次にこれをニトロセルロース等のメンブランに固
定した後、予め標識したDNAプローブを用いてハイブリ
ダイゼーシヨンを行つてメンブランに結合したプローブ
の量から、試料中の核酸量を測定する。
この方法によれば、試料中の特定の核酸配列を検出す
ることができるが、全核酸量を測定することはできな
い。これは、核酸のハイブリダイゼーシヨンの原理に基
づく方法であり、プローブに相補的なDNAのみが検出さ
れるためである。また、ハイブリダイゼーシヨンには、
標識したプローブが必要であるばかりでなく、通常一夜
のインキユベーシヨンが必要である。
ることができるが、全核酸量を測定することはできな
い。これは、核酸のハイブリダイゼーシヨンの原理に基
づく方法であり、プローブに相補的なDNAのみが検出さ
れるためである。また、ハイブリダイゼーシヨンには、
標識したプローブが必要であるばかりでなく、通常一夜
のインキユベーシヨンが必要である。
また別法としてエチジウムブロマイドによる蛍光測定
法が知られているが、その検出限界は、ナノグラムオー
ダーであり、感度的に充分とはいえない。
法が知られているが、その検出限界は、ナノグラムオー
ダーであり、感度的に充分とはいえない。
本発明の目的は、ハイブリダイゼーシヨンの原理を用
いないで生物製剤の生産工程あるいは品質検定に用いう
る高感度で迅速な核酸の測定方法をて提供することにあ
る。
いないで生物製剤の生産工程あるいは品質検定に用いう
る高感度で迅速な核酸の測定方法をて提供することにあ
る。
本発明はペプチドまたは蛋白質を主成分とする生物製
剤またはその中間製品である試料中の核酸を測定する方
法において、試料をプロテイナーゼＫにより処理する工
程、熱処理する工程、核酸をスルホン化、DNP化、アル
キル化、またはAAF化により化学修飾する工程、および
化学修飾された核酸を免疫学的に測定する工程を含むこ
とを特徴とする核酸の測定方法である。
剤またはその中間製品である試料中の核酸を測定する方
法において、試料をプロテイナーゼＫにより処理する工
程、熱処理する工程、核酸をスルホン化、DNP化、アル
キル化、またはAAF化により化学修飾する工程、および
化学修飾された核酸を免疫学的に測定する工程を含むこ
とを特徴とする核酸の測定方法である。
本発明者らは、試料中に混在する微量の核酸をハイブ
リダイゼーシヨンの原理を用いないで迅速に測定する方
法について検討したところ、核酸を化学修飾し、次いで
これを免疫学的手法により検出することで、試料中の核
酸を精製することなく、またハイブリダイゼーシヨンの
方法を用いないで容易に測定することができることを見
出した。
リダイゼーシヨンの原理を用いないで迅速に測定する方
法について検討したところ、核酸を化学修飾し、次いで
これを免疫学的手法により検出することで、試料中の核
酸を精製することなく、またハイブリダイゼーシヨンの
方法を用いないで容易に測定することができることを見
出した。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明における試料はペプチドまたは蛋白質を主成分
とする生物製剤またはその中間製品である。これらの試
料はプロテイナーゼＫで処理する。
とする生物製剤またはその中間製品である。これらの試
料はプロテイナーゼＫで処理する。
また核酸の化学修飾は核酸をスルホン化、DNP化〔ジ
ヤーナル・オブ・セル・バイオロジー第97巻、第377a巻
（1983）〕、アルキル化〔バイオケミストリー第21巻、
第3698頁（1982）〕、またはAFF（Ｎ−アセトキシ−２
−アセチルアミノフルオレン）化〔プロシーデイング・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス第81
巻、第3466頁（1984）〕することにより行なう。
ヤーナル・オブ・セル・バイオロジー第97巻、第377a巻
（1983）〕、アルキル化〔バイオケミストリー第21巻、
第3698頁（1982）〕、またはAFF（Ｎ−アセトキシ−２
−アセチルアミノフルオレン）化〔プロシーデイング・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス第81
巻、第3466頁（1984）〕することにより行なう。
次に化学修飾された核酸の免疫学的な測定は通常の方
法で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を使用
して行われる。
法で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を使用
して行われる。
次に化学修飾の一例としてスルホン化の場合をあげて
説明する。
説明する。
試料中の核酸のシトシン残基にスルホン基を導入する
方法としてはピロ亜硫酸ナトリウム（Na2S2O5）と０−
メチルヒドロキシルアミン塩酸塩の試薬混剤が用いられ
る。反応は、微酸性、好ましくはph6の試料および試薬
の水溶液中で温度20℃〜40℃、好ましくほ30℃で10〜20
時間インキユベートする。試料は、予めプロテイナーゼ
Ｋによりできるだけ蛋白質を分解した後、熱処理により
核酸を変性しておく必要がある。試薬の濃度としては、
ピロ亜硫酸ナトリウムは2M、０−メチルヒドロキシルア
ミン塩酸塩は1Mの原液を用意し、試料１容量部に対し、
それぞれ0.5〜１容量部、0.1〜0.5容量部の割合で加え
る。反応終了後、ゲル過等により試薬を除去しと後、
適量をニトロセルロース等のメンブレンにスポットし、
定法により固定する。
方法としてはピロ亜硫酸ナトリウム（Na2S2O5）と０−
メチルヒドロキシルアミン塩酸塩の試薬混剤が用いられ
る。反応は、微酸性、好ましくはph6の試料および試薬
の水溶液中で温度20℃〜40℃、好ましくほ30℃で10〜20
時間インキユベートする。試料は、予めプロテイナーゼ
Ｋによりできるだけ蛋白質を分解した後、熱処理により
核酸を変性しておく必要がある。試薬の濃度としては、
ピロ亜硫酸ナトリウムは2M、０−メチルヒドロキシルア
ミン塩酸塩は1Mの原液を用意し、試料１容量部に対し、
それぞれ0.5〜１容量部、0.1〜0.5容量部の割合で加え
る。反応終了後、ゲル過等により試薬を除去しと後、
適量をニトロセルロース等のメンブレンにスポットし、
定法により固定する。
このようにして調整された試料は、免疫学的手法によ
り核酸の検出に用いられる。すなわち、シトシン残基が
スルホン化された核酸は同じ試薬でスルホン化されたDN
Aを抗原として作製されたモノクローナル抗体によって
認識される。スルホン化された核酸に結合したモノケロ
ーナル抗体は、通常の標識化された第２抗体によつて容
易に検出することができる。
り核酸の検出に用いられる。すなわち、シトシン残基が
スルホン化された核酸は同じ試薬でスルホン化されたDN
Aを抗原として作製されたモノクローナル抗体によって
認識される。スルホン化された核酸に結合したモノケロ
ーナル抗体は、通常の標識化された第２抗体によつて容
易に検出することができる。
このように本発明方法によれば非酵素的に核酸にハプ
テンを導入できるので試料中の核酸を精製する必要がな
く、またハイブリダイゼーシヨンの工程を必要としない
ので、操作が簡単である。さらに、生物の種類に関係な
く全ての核酸に適用できるので、製品またはその中間体
に混在ある不純物核酸の測定に有用である。
テンを導入できるので試料中の核酸を精製する必要がな
く、またハイブリダイゼーシヨンの工程を必要としない
ので、操作が簡単である。さらに、生物の種類に関係な
く全ての核酸に適用できるので、製品またはその中間体
に混在ある不純物核酸の測定に有用である。
以下に実施例をあげて本発明を説明する。
実施例 １ 牛血清アルブミン（BSA）中のDNAの検出 5w/v％BSA中に２〜200mg/mlの種々の濃度のサケ精子D
NAを含む試料水溶液を調製した。試料0.5mlを取り、0.5
mlのプロテエイナーゼＫバツフアー〔0.2Mのトリス塩酸
緩衝液（ph7.5）、25mMのEDTA、0.3MのNaCl、2w/v％SD
S〕および10μのプロテイナーゼＫ（ベーリンガー社
製、20mg/ml H2O）を加え37℃で30分間インキユユベー
トする。100℃で10分煮沸したのち氷冷する。100μを
別のチユーブに移し取り、直ちに2MのNa2S2O5（pH6.0）
を50μ、および1MのNH2OCH3（pH6.0）を12.5μ加
え、30℃で一夜インキユベートする。反応液の一定量
（１〜２μ）をニトロセルロースまたはナイロンメン
ブランにスポツトし、ベーキングまたはUV照射により固
定する。メンブランをブロツキング液（オルジエニクス
社製、DNA CHEMIPROBEキツトに含まれる）に浸し、室温
で１時間インキユベートする。次に、同ブロツキング液
で1/250に希釈したマウス抗スルホン化DNAモノクローナ
ル抗体（オルジエニクス社製、DNA CHEMIPROBEキツトに
含まれる）と室温で１時間インキユベートする。メンブ
ランを、洗浄液１（0.15w/v％のポリオキシエチレング
リコールアルキルエーテル界面活性剤：ブリジ35および
0.5MのNaCl）に浸して20分間ずつ３回洗浄する。次にメ
ンブランをブロツキング液で1/250に希釈したアルカリ
ホスフアターゼ標識抗マウスIgG抗体（オルジエニクス
社製）と室温で１時間インキユベートする。メンブラン
を洗浄液１で10ずつ３回洗浄した後洗浄液２〔0.1Mのト
リス塩酸緩衝液（pH9.5）、0.5MのNaCl、5mMのMgCl2〕
で10分間ずつ２回洗浄する。メンブランを紙上に置
き、過剰の水分を除く。予め調製したアルカリホスフア
ターゼの発色基質〔ニトロブル−テトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフエート
がそれぞれ0.3mg/ml、0.2mg/mlとなるように、0.1Mのト
リス塩酸緩衝液（pH9.5）、0.1MのNaCl、5mMのMgCl2を
含むバツフアーにとかしたの〕を添加して、室温で１時
間インキユベートする。
NAを含む試料水溶液を調製した。試料0.5mlを取り、0.5
mlのプロテエイナーゼＫバツフアー〔0.2Mのトリス塩酸
緩衝液（ph7.5）、25mMのEDTA、0.3MのNaCl、2w/v％SD
S〕および10μのプロテイナーゼＫ（ベーリンガー社
製、20mg/ml H2O）を加え37℃で30分間インキユユベー
トする。100℃で10分煮沸したのち氷冷する。100μを
別のチユーブに移し取り、直ちに2MのNa2S2O5（pH6.0）
を50μ、および1MのNH2OCH3（pH6.0）を12.5μ加
え、30℃で一夜インキユベートする。反応液の一定量
（１〜２μ）をニトロセルロースまたはナイロンメン
ブランにスポツトし、ベーキングまたはUV照射により固
定する。メンブランをブロツキング液（オルジエニクス
社製、DNA CHEMIPROBEキツトに含まれる）に浸し、室温
で１時間インキユベートする。次に、同ブロツキング液
で1/250に希釈したマウス抗スルホン化DNAモノクローナ
ル抗体（オルジエニクス社製、DNA CHEMIPROBEキツトに
含まれる）と室温で１時間インキユベートする。メンブ
ランを、洗浄液１（0.15w/v％のポリオキシエチレング
リコールアルキルエーテル界面活性剤：ブリジ35および
0.5MのNaCl）に浸して20分間ずつ３回洗浄する。次にメ
ンブランをブロツキング液で1/250に希釈したアルカリ
ホスフアターゼ標識抗マウスIgG抗体（オルジエニクス
社製）と室温で１時間インキユベートする。メンブラン
を洗浄液１で10ずつ３回洗浄した後洗浄液２〔0.1Mのト
リス塩酸緩衝液（pH9.5）、0.5MのNaCl、5mMのMgCl2〕
で10分間ずつ２回洗浄する。メンブランを紙上に置
き、過剰の水分を除く。予め調製したアルカリホスフア
ターゼの発色基質〔ニトロブル−テトラゾリウムおよび
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフエート
がそれぞれ0.3mg/ml、0.2mg/mlとなるように、0.1Mのト
リス塩酸緩衝液（pH9.5）、0.1MのNaCl、5mMのMgCl2を
含むバツフアーにとかしたの〕を添加して、室温で１時
間インキユベートする。
試料中のDNA量に応じて暗青色のスポツトが検出さ
れ、検出限界10pgであつた。DNAを含まない試料は発色
しなかつた。
れ、検出限界10pgであつた。DNAを含まない試料は発色
しなかつた。
実施例 ２ 試料中のDNAの定量 実施例１と同様にして、調製して発色させたメンブラ
ンをオーバーヘツドプロジエクター用の透明なフィルム
に移し取り、バイオラツド社製ビデオデンシトメーター
で測定したところ、7.7pg〜31pgまで直線関係が得られ
た。
ンをオーバーヘツドプロジエクター用の透明なフィルム
に移し取り、バイオラツド社製ビデオデンシトメーター
で測定したところ、7.7pg〜31pgまで直線関係が得られ
た。
実施例 ３ 可溶性色素を用いる定量法 実施例１において発色操作を水溶液の発色色素を用い
て定量した。すなわち、標識第２抗体を反応させ、洗浄
液２で洗浄後のメンブランから各スポツトの位置に対応
する部分を切り取りそれぞれを小試験管に入れる。これ
に0.3mlの水溶性発色基質〔フエノールフタレンモノホ
スフエートを1mg/mlとなるように、0.1Mのトリス塩酸緩
衝液（pH9.5）、0.1MののNaCl、5mMのMgCl2を含むバツ
フアーにとかす〕を加え、室温で一夜インキユベートす
る。各150μをマイクロタイタープレートに分注し、
反応停止液（0.4w/v％NaOHおよび12.5w/v％Na3PO4・12H
2O）を50μで加える。540nmで吸光度を測定したとこ
ろ、第１図に示すとおり15pg以上で測定できた。
て定量した。すなわち、標識第２抗体を反応させ、洗浄
液２で洗浄後のメンブランから各スポツトの位置に対応
する部分を切り取りそれぞれを小試験管に入れる。これ
に0.3mlの水溶性発色基質〔フエノールフタレンモノホ
スフエートを1mg/mlとなるように、0.1Mのトリス塩酸緩
衝液（pH9.5）、0.1MののNaCl、5mMのMgCl2を含むバツ
フアーにとかす〕を加え、室温で一夜インキユベートす
る。各150μをマイクロタイタープレートに分注し、
反応停止液（0.4w/v％NaOHおよび12.5w/v％Na3PO4・12H
2O）を50μで加える。540nmで吸光度を測定したとこ
ろ、第１図に示すとおり15pg以上で測定できた。
本発明方法によれば試料の精製をする必要なく、非常
に簡単な操作で試料中の核酸濃度を測定できる。
に簡単な操作で試料中の核酸濃度を測定できる。
第１図は実施例３の結果を示す図であり、BSA中に含ま
れるサケ白子DNA量と540nmの関係を表わす。
れるサケ白子DNA量と540nmの関係を表わす。
Claims (1)
- 【請求項１】ペプチドまたは蛋白質を主成分とする生物
製剤またはその中間製品である試料中の核酸を測定する
方法において、試料をプロテイナーゼＫにより処理する
工程、熱処理する工程、核酸をスルホン化、DNP化、ア
ルキル化、またはAAF化により化学修飾する工程、およ
び化学修飾された核酸を免疫学的に測定する工程を含む
ことを特徴とする核酸の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292669A JP2524778B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | 核酸の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62292669A JP2524778B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | 核酸の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01134254A JPH01134254A (ja) | 1989-05-26 |
| JP2524778B2 true JP2524778B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=17784766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62292669A Expired - Fee Related JP2524778B2 (ja) | 1987-11-19 | 1987-11-19 | 核酸の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2524778B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5811857A (ja) * | 1981-07-15 | 1983-01-22 | Yamasa Shoyu Co Ltd | アデノシンの定量法 |
-
1987
- 1987-11-19 JP JP62292669A patent/JP2524778B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01134254A (ja) | 1989-05-26 |
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