JPH06511088A - 免疫検定の初期速度測光方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫検定の初期速度測光方法 １五 本発明者らは、生理的流体における種々の被検体を検出して定量する新規な測光 免疫検定方法を発明した。本発明は、特に、初期速度測光免疫検定方法に関する 。

低濃度の抗体、抗原およびホルモンのような種々の自然に合成される物質の検出 および定量を行なう迅速、正確および再現可能な方法が依然として待望されてい る。さらに、生理的流体中の薬剤および毒素のような他の生物活性物質を検出す ることが大いにかつ広（待望されている。治療薬および乱用薬物の検出は、例え ば、医学的治療、法律の執行および採用の決定にとって著しく重要である。

臨床化学実験室試験は、健康管理システムの重要な部分を占める。医師は、薬剤 の狭い安全血清レベルだけが存在する血清蛋白質および治療薬レベルを監視する のに、かかる試験を使用する場合がしばしばある。多くの場合、有効な医学治療 を行ないあるいはヘロイン、モルヒネおよびコカインのような鎮静剤の非治療的 使用を検出するには、血清、血漿、尿、羊水、胸膜液あるいは髄液のような生理 的流体中の特定の薬剤のマイクログラム濃度を測定しなければならない。毎年行 なわれている移しい数の臨床化学試験では、かかる試験の速度、正確さおよび費 用の管理が、重要な目標となっている数多くの広（使用されている臨床化学試験 は、生理的流体中に存在する種々の物質を免疫沈降反応を介して検出しかつ定量 するものである。免疫沈降反応は、互いに特異結合親和力を有する２つの反応パ ートナが適宜の液体培地において結合するときに起こる。反応パートナは、抗原 と、抗体のような該抗原に対する特異結合パートナとすることができる。一般に 、反応パートナの一方は、生理的流体のサンプルにおいて未知の量で存在し、被 検体と呼ばれる。多くの場合、液体培地は、緩衝作用を受けた（ｂｕｆｆｅｒｅ ｄ）水溶液である。

免疫沈降反応が開始すると、免疫沈降物、すなわち、通常は不溶性であるが、液 体培地において可溶性とすることができる抗体−抗原複合体が形成される。

液体培地に免疫沈降物が存在すると、入射する光エネルギの減衰により液体培地 の光の散乱および光吸収特性のような光学特性の変化が生ずる。これらの変化は 、適宜の光度計により検出することができる。光度計は、被検体の検出と定量を 行なうことができるように較正することができる。測定は、一般に、既知量の問 題の被検体と免疫沈降反応を行なわせることにより実施され、標準曲線すなわち 検量線を得る。検量線は、生理的流体の単位容積あたりに存在する被検体の量に 対する液体培地による光の減衰、例えば、光の吸収のレベルを示すことができる 。

測光免疫検定技術には、ネフェロ分析と比濁分析とがある。比濁免疫検定におい ては、光度計は、光検出器へ向けての免疫沈降物による光の反射または散乱を測 定するのに使用される。免疫沈降物は、被検体および被検体の特異結合パートナ の凝集体とすることができ、あるいは被検体−接合体およびその特異結合パート ナの凝集体とすることができる。免疫沈降物により散乱される光の量は、存在す る免疫沈降物の数に正比例し、免疫沈降物の数は、多くの場合、免疫沈降反応が 進むにつれて増加する。かかる比例により、被検体濃度を定量測定することがで きる。濁度測定免疫検定においては、免疫沈降物を含む液体培地を透過する光エ ネルギの減衰あるいは減少が、光路に配置された光検出器により測定される。光 エネルギの減少は、免疫沈降物による入射光の反射、散乱および吸収により生ず る。免疫沈降物による光の減少量もまた、存在する免疫沈降物の数に正比例する ので、被検体濃度を定量測定することができる。

比濁測定免疫検定あるいは濁度測定免疫検定の場合、光度計は、免疫沈降反応が 主として終了した後に、液体培地の光学特性の変化の程度の測定（すなわち、終 点の測定）に使用される。あるいは、光度計は、免疫沈降反応の開始後特定の時 間における液体培地の光学特性の変化の速度の検出（すなわち、速度測定）に使 用することができる。公知の終点測光法あるいは公知の速度測光法による免疫検 定は、特に、多数の生理的流体サンプルの薬剤および蛋白質レベルを最短可能時 間で検出して定量しようとする場合に、問題が生ずるとともに非効率なものとな る。

測光終点免疫検定に関しては、これらの問題として、終点法に固をの緩慢性の問 題がある。かくして、終点法においては、免疫沈降反応は、光の散乱または増加 があった液体培地の濁度の測光読みが行なわれる前に、反応の終了に到達しまた は反応の終了に近づ（。

従って、被検体の検出は、免疫沈降反応が開始してから少なくとも約５分以上経 過するまで遅延される。さらに、多数のサンプルを分析しようとする単位時間あ たりの処理量すなわち分析速度が低い。

かかる遅れにより、診断および治療の決定を行なう際に遅れが生ずる。

さらに、測光終点免疫検定法は、一般に、分析に先立ち少なくともある程度のサ ンプル処理を必要とする。多くの場合、被検体含有生理的流体サンプルの希釈は 、例えば、生理的流体のアリコツトを生理的食塩水に加えることにより行なわれ る。生理的流体は、通常、被検体のほかに、非特定の免疫沈降反応を引き起こし あるいは液体培地の光学特性に影響を及ぼす蛋白質、ステロイド、ホルモン、薬 剤および種々の代謝物のような数多くのその他の物質を含むので、希釈工程が必 要となる。かくして、被検体を含む生理的流体の生の（ｎｅａｔ）　（すなわち 、希釈されていない）サンプルからのアリコツトが使用されると、著しく高レベ ルの干渉または背景光の散乱および光の吸収が生ずる。従って、未希釈の生理的 流体サンプルを用いた被検体の終点測定は、著しく困難となりあるいは不可能と なる。

サンプルの希釈をはじめとするサンプルの処理は、サンプルの分析を遅延させる とともに、サンプルが汚染される危険性並びに正確な被検体の検出および定量を 妨害する危険性を本質的に招くので、望ましくない。さらにまた、サンプル処理 は、作業者である人間とサンプルとの接触時間が多くなるので、サンプルからサ ンプル取扱者への病気の感染の危険性が高まる。

測光速度免疫検定法も欠点を有する。最大速度比濁測定およびピーク速度濁度測 定は、免疫沈降反応が行なわれる液体媒体の光学特性の変化の最大速度を測定す ることにより被検体を検出する。第１の欠点は、これらの公知の方法においては 、測光検出免疫沈降反応の開始微少なくとも約１分が経過するまで測光により検 出される最大すなわちピーク速度が生じないということにある。従って、終点免 疫検定法と同様に、公知の速度法は緩慢となり、単位時間あたりのサンプル処理 量を大きくすることができない。

測光速度免疫検定法に関する第２の問題は、検出される速度信号の性状によるも のである。現在の速度免疫検定法は、一般に、実質的に一定のすなわち経時線形 （ｌｉｎｅａｒ−ｗｉｔｈ−ｔｉｍｅ）測光速度信号を検出するものではない。

経時非線形信号は、信号から得られる非線形速度曲線を線形近似に適合させるの に、時間のかかる複雑な数式を使用することが必要となる。従って、被検体検出 の迅速化およびサンプル処理量の増大化が損なわれる。

公知の測光速度免疫検定法が遭遇する第３の問題は、ピークまたは最大速度信号 が生ずる時間の変動により生ずる。被検体の濃度、特異結合パートナのｔａ度お よび被検体と特異結合パートナの性状のような因子により、最大またはピーク速 度信号は、測光により検出される免疫沈降反応の開始後広い範囲に亘って変動す る時間において生ずる。かくして、被検体１度のような１つ以上の未知要素を処 理する場合には、何時分析に有用な最大すなわちピーク速度信号が生ずるかは予 め測定することができない。従って、使用される光度計は、正しい信号を捕捉す るために特定の時間に信号を検出するように設定され、あるいは所望の信号が生 ずるまで免疫沈降反応の追跡が連続して行なわれる。最大すなわちピーク速度信 号が生ずる場合にこのような不確定要素があると、時間のロス、分析の非効率化 および余分な出費を招（ことになる。

かくして、（１）迅速な被検体の検出、（２）未希釈（生）および希釈サンプル における被検体の検出、（３）被検体の正確な分析、（４）単位時間あたりのサ ンプル処理量の増加および（５）サンプル分析コストの低減を達成することがで きる測光免疫検定法が待望されている。

斐蔚 本発明は、これらの要求を満たすものである。本発明は、未希釈および希釈サン プルの双方における広範囲に亘る被検体の迅速検出および定量を、高精度でかつ 単位時間あたりのサンプル処理量を高くし、しかもサンプル分析コストを低くし て行なうことができる。

これらの目的は、液体培地における測光により検出することができる免疫沈降反 応を開始させかつ検出する開示の方法により達成される。開示の方法は、分析上 有用で、実質的に一定で、反応の開始後実質的に一定の時間で検出することがで きるとともに、反応の開始後約１分未満の時間で検出することができる反応速度 信号を生ずる免疫沈降反応を開始させることができる。

■ 本明細書において使用されている種々の用語に関する以下の定義は、本発明の理 解を容易にするために提供されている。

「約」（”ａｂｏｕｔ”）なる語は、例えば時間の単位のような特定の数値を示 すために使用される場合には、数値が、記載されている数値よりも２０パーセン ト程度大きくあるいは２０パ一セント程度小さいものとすることができることを 意味する。

「被検体Ｊ　（ａｎａｌｙｔｅ”）なる語は、生理的流体において検出されおよ び／または定量されるべき物質または物質群を意味するものである。用語「被検 体」は被検体類似体類を含む。

「被検体類似体」（”ａｎａｌｙｔｅ　ａｎａｌｏｇ”）なる語は、被検体自体 と略同じ態様で被検体の反応パートナに特異的に結合することができる物質を意 味する。

「三原配位Ｊ　（”ｂｉｄｅｎｔａｔｅ”）または「三原配位接合体Ｊ　（”ｂ ｉｄｅｎｔａｔｅ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”）なる語は、スペーサ成分により取着 された２つの化学成分または三原配位員を有し、各員（ｍｅｎ＋ｂｅｒ）が異な る高分子に特異的に結合することができるヘテロニ官能価接合体を意味する。

三原配位に関する更なる定義および詳細については、１９９０年７月８日付で出 願された、「新規な三原配位接合体およびその使用方法」なる発明の名称の同時 係属出願中の米国特許出願第０７１５３６．０５８号に記載されている。

「接合体」（”ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”）なる語は、被検体が結合することができ あるいは結合することにより、被検体が測光法により検出することができる免疫 沈降反応において関係することができる化合物を意味する。

「ハプテン」（”ｈａｐｔｅｎ”）なる語は、それ自体では抗体類の有意な形成 を引き起こすことが一般に不可能な部分的または不完全な抗原、多くの場合、低 分子量の薬剤を意味する。

「初期速度Ｊ　（”１ｎｉｊｉａｌ　ｒａｔｅ”）なる語は、液体培地における 測光法により検出することができる免疫沈降反応の開始後約１分以内で検出する ことができる液体培地の測光特性の変化の、測光法により検出することができる 実質的に一定の速度を意味する。

［比濁測定Ｊ　（”ｎｅｐｈｅｌｏ’ｍｅｔｒｙ”）なる語は、免疫沈降物類に よる光散乱により被検体を検出しかつ定量する測光法を意味する。免疫沈降物類 は、被検体と特異結合パートナとの凝集体および／または被検体−接合体と特異 結合パートナとの凝集体類とすることができる。使用される光度計は、互いに実 質的に対向しては整合されない、すなわち、同じ軸線に沿っては整合されない光 源と光検出器とを有する。

「測光法」じｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ”）なる語は、免疫沈降反 応の初期速度を検出するために紫外、可視または赤外光を発生しかつ検出するこ とができる光度計を使用する方法を意味する。

「比濁分析」（”ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ”）なる語は、免疫沈降物類による 光の減衰を測定することにより被検体を検出しかつ定量する測光法を意味する。

免疫沈降物類は、被検体と特異結合パートナとの凝集体類および／または被検体 −接合体と特異結合パートナとの凝集体類とすることができる。使用される光度 計は、互いに実質的に対向して整合される、すなわち、同じ軸線に沿って整合さ れる光源と光検出器とを有する。

本発明に係る初期速度測光法（イニシャル・レート・フォトメトリック・メソッ ド）は、種々の生理的流体類における数多くの異なる被検体類を迅速かつ正確に 検出しかつ定量するのに使用することができる。使用される生理的流体は希釈す ることができ、あるいは好ましくは未希釈とすることができる。本発明の方法に よれば、サンプル処理量を増やすことができるとともに、サンプルあたりの分析 コストを低くすることができる。

公知の測光免疫検定とは異なり、本発明の方法は、免疫沈降反応が行なわれてい る液体培地の測光特性の変化の初期速度を検出することにより被検体類を検出し かつ定量することができる。

初期速度法の好ましい実施態様は、液体培地において被検体含有サンプルおよび 被検体の特異結合パートナとを結合させることにより進行する。被検体−蛋白質 結合体はまた、液体培地に加えることができる。被検体と被検体−接合体の双方 は、特異結合パートナに結合することができる。測光法により検出することがで きる免疫沈降反応は、これにより液体培地において開始される。被検体の特異結 合パートナは、ポリクローナル性またはモノクローナル性抗体とすることができ る。

免疫沈降反応は、免疫沈降反応が反応の際に形成されるので、検出することがで きる。免疫沈降物類は、被検体と特異結合パートナとの複合体および／または被 検体と特異結合パートナとの複合体とすることができる。

被検体は、液体培地の測光特性の変化の実質的に一定のすなわち経時線形初期速 度の検出により検出される。好ましくは、この初期速度の検出は、測光法により 検出することができる免疫沈降反応の開始とともに開始しかつ該反応の開始後約 ６０秒で終了する時間内に、開始される。好ましくは、初期速度の検出は、反応 とともに開始しかつ反応の開始後約５分で終了する時間内に、終了される。

本発明の別の好ましい実施態様においては、液体培地の測光特性の変化の実質的 に一定の初期速度の検出は、測光法により検出することができる免疫沈降反応と ともに開始しかつ反応の開始後約４０秒、３０秒または２０秒で終了する時間内 に開始する。本発明の特に好ましい実施態様においては、実質的に一定の初期速 度の検出は、反応とともに開始しかつ反応の開始後約１０秒で終了する時間内に 開始する。

本発明の別の好ましい実施態様においては、実質的に一定の初期速度の検出は、 反応とともに開始しかつ反応の開始後約４分、３分、２分、６０秒、５０秒、４ ０秒または３０秒で終了する時間内に終了する。本発明の別の特に好ましい実施 態様においては、実質的に一定の初期速度の検出は、反応の開始とともに開始し かつ反応の開始後約２０秒で終了する時間内に終了する。

液体培地の測光特性の変化の初期速度は、既知量の被検体を用いた同じ免疫沈降 反応を行なうことにより得られる標準すなわち検量線と比較するのが好ましい。

このようにして、生理的流体の単位体積あたりの未知の被検体の濃度を測定する ことができる。かくして、本発明の方法による、測光法により検出することがで きる免疫沈降反応の初期速度測光検出により、被検体の検出と定量を極めて迅速 に行なうことができるとともに、単位時間あたりのサンプル処理量を高めること ができる。

被検体が、それ自体では測光法により検出することができる免疫反応に関与する （ｅｎｇａｇｅ）ことができないハプテンである場合には、ハプテン−被検体と ハプテン−被検体接合体との間の競争阻害免疫沈降反応が開始される。被検体と 被検体−接合体は、同じ特異結合パートナの部位に結合するために競争する。よ り大きな被検体−接合体と特異結合パートナとの反応により、測光法により検出 することができる免疫沈降反応が行なわれる。この検出可能な反応の速度は、存 在するハプテン被検体の量に反比例する。従って、未知の濃度で存在する被検体 の検出と定量を行なうことができる。

好ましくは、特異結合パートナと被検体は、約１．０の被検体に対して少な（と も約１．２の特異結合パートナのモル比（すなわち、１．２：ｌ）で液体培地に おいて結合される。被検体−接合体に対する特異結合パートナの比は、好ましく は、約１：１よりも太き（かつ約１０，１以下である。より好ましくは、被検体 −接合体に対する特異結合パートナの比は、少な（とも約１．２：ｌであり、約 １０＝１以下である。

測光法により検出することができる免疫沈降反応の速度を制御し易くするため、 液体培地は、１つ以上の添加剤を含むのが好ましい。適宜の添加剤は、デキスト ラン、グリコールまたはこれらの誘導体とすることができる。

初期速度の別の好ましい実施態様は、液体培地において、被検体を含有する生理 的流体の未希釈サンプルと被検体の特異結合パートナとを初めに結合させる工程 を有する。第２の工程は、液体培地において測光法により検出することができる 免疫沈降反応を開始させることである。第３の工程は、液体培地に光を照射する ことである。液体培地に光を照射することにより、測光法により検出することが できる開始速度信号が得られる。この信号は、光減衰信号、例えば、光散乱また は光吸収信号である。第４の工程は、検出を開始し、しかも測光法により検出す ることができる免疫沈降反応の開始とともに開始しかつ反応の開始後約６０秒で 終了する時間内に液体培地の測光特性の変化の実質的に一定の初期速度の検出を 終了することにより、被検体を検出することである。第５および最終工程は、生 理的流体の単位体積あたりに存在する被検体の量を定量することである。

好ましくは、液体培地に加える場合には、被検体を血清のような生理的流体の未 希釈サンプルに存在させることにより、被検体の検出とサンプル処理量の増大と を図る。さらに、未希釈のサンプルを使用してサンプルと技術者との接触時間を 少なくすることにより、可能性のあるサンプルの汚染およびサンプルからの病気 の感染の双方を防止する。

本発明の初期速度方法の別の好ましいかつより詳細な実施態様は、少なくとも光 源と光検出器とを有する光度計を使用するもので、この実施態様は、光検出器を 光源の前方に配置して光源と光検出器とを実質的に同じ軸線に沿って整合させる 工程：光検出器と光源との間に実質的に光学的に透明な容器を介在配置する工程 ：容器の液体培地において被検体を含有する未希釈生理的流体のサンプルと過剰 の抗被検体抗体とを組み合わせる工程；液体培地において測光法により検出する ことができる免疫沈降反応を開始させる工程：容器の液体培地に光源から適宜の 波長の光を照射する工程；液体培地における測光法により検出することができる 免疫沈降反応の開始後２０秒以内の第１の時間に光検出器を用いて液体培地の濁 度を高める実質的に一定の速度を検出する工程；反応の開始後約６０秒よりも短 い第２の遅い時間に照射工程と検出工程を繰り返す工程；第１の時間から第２の 遅い時間までの液体培地の濁度の変化を測定して液体培地の濁度の初期速度を得 る工程；及び第１の時間から第２の遅い時間までの液体培地の濁度の初期速度の 変化から生理的流体の容積あたりに存在する被検体の量を定量する工程とを有し ている。

本発明の初期速度法により検出することができるかつ定量することができる被検 体は、薬剤（治療薬と乱用薬の双方）、毒素、抗原、ペプチドホルモン、ステロ イド、ビタミン、蛋白質および代謝物並びにこれらの誘導体を含む。

図面 本発明のこれらのおよび他の特徴、様相および利点は、以下の説明、請求の範囲 および添付図面から一層良好に理解することができる： 第１図は、測光法により検出することができる免疫沈降反応を開始させるために ゲンタミシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、ゲンタミシン接合体および抗ゲンタミ シン抗体が組み合わされている液体培地による光減衰の増加の実質的に一定な速 度をグラフで示す。

第２図は、測光法により検出することができる免疫沈降反応を開始させるために 既知量のゲンタミシン、ゲンタミシン接合体および抗ゲンタミシン抗体が組み合 わされている液体培地による光減衰の増加の標準速度をグラフで示す。

第３図は、縦軸の本発明の初期速度方法による４６のサンプルにおいて検出され たゲンタミシンの濃度と、横軸の蛍光偏光免疫検定（ＦＰＩＡ）により同じ４６ のサンプルにおいて検出されたゲンタミシン濃度との相関関係をグラフで示す。

第４図は、測光法により検出することができる免疫沈降反応を開始させるために ＩｇＭおよび抗ＩｇＭ抗体が組み合わされている液体培地による光減衰を高める 実質的に一定な速度をグラフにより示す。

第５図は、縦軸の本発明の方法による８３のサンプルにおいて検出されたＩｇＭ 濃度と、横軸のアレイ（Ａｒｒａｙ）　（登録商標）比濁測定による同じ８３の サンプルにおいて検出されたＩｇＭ濃度との相関関係をグラフで示す。

第６図は、測光法により検出することができる免疫沈降反応を開始させるために バルプロン酸（ｖａｌｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ）　、バルプロン酸接合体および抗 バルプロン抗体を組み合わされている液体培地による光減衰を高める実質的に一 定な速度をグラフで示す。

第７図は、測光法により検出することができる免疫沈降反応を開始させるために ハプトグロビン（ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ）　、および抗ハプトグロビン抗体が 組み合わされている液体培地による光減衰を高める実質的に一定な速度をグラフ で示す。

１朋 本発明は、液体培地において測光法により検出することができる免疫沈降反応を 開始させると、液体培地の測光特性の変化の初期速度を使用して被検体を検出し かつ定量することができることを知得してなされたものである。本発明者は、か かる知得を応用して、種々の生理的流体中に存在する種々の被検体を素早（検出 しかつ定量することができる初期速度測光免疫検定方法を開発した。

測光検出は、液体培地を通過する光エネルギの減衰を検出することにより行なわ れる。光エネルギの減衰は、液体培地の免疫沈降物類による光の散乱および／ま たは吸収による。

本発明者は、開示されている方法を実施することにより、進行中の免疫沈降反応 の初期において実質的に経時線形である測光速度信号を検出することができるこ とを見出した。従って、免疫沈降反応の測光検出により、液体培地の光減衰を高 める実質的に一定な速度信号が得られる。検出された信号の実質的に一定な初期 速度は、反応の開始後約５分以上の時間保持することができる。

「実質的に一定Ｊ　（”５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｃｏｎｓｔａｎｔ”）ま たは「実質的に経時線形」じ５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｌｉｎｅａｒ−ｗｉ ｔｈ−ｔｉｍｅ″）なる語は、液体培地における測光法により検出することがで きる免疫沈降反応の開始により得られかつ時間に対する光の減衰としてプロット される（すなわち、第１．４．６および７図に関して、初期速度信号データは、 時間ゼロプラス３６８秒、時間ゼロプラス３２０秒、時間ゼロプラス３３６秒お よび時間ゼロプラス３２０秒でそれぞれ開始してプロットされている）初期速度 信号データに対して少なくとも方形適合回帰分析（ｓｑｕａｒｅ　ｆｉｔ　ｒｅ ｇｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）のような回帰分析を行なうと、初期速度 信号データは、得られる回帰線に対して、約０７５以上の相関係数γを示すこと を意味する。好ましくは、相関係数γは検出される初期速度信号を実質的に一定 となるよう０．９０以上である。

検出される光減衰信号の実質的に一定な速度は、約５分以上の免疫沈降反応にお いて関与する特異結合パートナを十分に提供することにより約５分以上保持する ことができる。かかる時間に亘って実質的に一定な初期速度反応に保持する別の 重要な因子は、特異結合パートナに関して液体培地に十分な反応パートナを提供 することである。

さらに、実質的に一定な速度信号は、検定を受けている特異的被検体の性状に関 係なく、測光法により検出することができる免疫沈降反応の開始と同時に、多く の場合、はとんど同時に検出することができる。

さらにまた、本発明者は、測光法により検出することができる免疫沈降反応の実 質的に一定の初期速度はまた、反応の最大速度であることを見出した。本発明の これらの特徴により、被検体の検出と定量を正確かつ迅速に行なうことができる 。

本発明の方法は、抗体のような特異結合パートナが存在しあるいは該パートナを 発生させることができる被検体を検出しかつ定量するのに使用することができる 。かかる被検体は、薬剤、毒素、ビタミン、抗体、農薬、ステロイド、ペプチド ホルモン、蛋白質および種々の代謝物並びにこれらの誘導体を含む。特に関連す る被検体は、生物流体に低濃度で存在しあるいは狭い治療範囲にある薬剤（治療 薬と乱用薬剤の双方）および蛋白質を含む。

方法は、液体培地において、被検体含有サンプルおよび該被検体の特異結合パー トナを組み合わせることにより進行する。この第１の工程は、得られる被検体− 特異結合バートナ凝集体が液体培地において測光法により検出することができる 複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）を形成する場合には、液体培地中で測光法により 検出することができる免疫沈降反応を開始させることができる。

方法における次の工程は、液体培地の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度 の検出を開始させるものである。初期速度の検出は、被検体の検出を行なうこと ができるように十分な検出時間の経過後、終了される。多くの場合、被検体の検 出および定量には、約６０秒よりも短い全検出または信号読み取り時間が必要と される。好ましくは、サンプルの分析を促進するように、全信号検出時間は約５ 秒ないし約４０秒であり、正確な被検体の検出と定量を依然として行なうことが できる。より好ましくは、全信号検出時間は、正確な被検体の検出と定量を損な うことなくサンプルの分析をさらに促進するように、約８秒ないし約２４秒であ る。本発明の特に好ましい実施態様においては、全信号検出時間は、約８秒ない し約１６秒である。

実質的に経時線形初期速度信号の検出は、サンプルの分析を促進するように、測 光法により検出することができる免疫沈降反応の開始後約１分以内に開始するの が好ましい。初期速度法は、測光法により検出することができる免疫沈降反応の 開始後最初の約４０．２０あるいは最初の約１０秒以内に検出を開始することに より有利に実施することができる。

実質的に経時線形初期速度信号の検出の終了は、サンプルの分析を促進するよう に、測光法により検出することができる免疫沈降反応の開始後約５分以内に行な うのが好ましい。初期速度法は、測光法により検出することができる免疫沈降反 応の開始後約４．３．２または１分以内に初期速度信号の検出を終了することに より有利に実施することができる。本発明者は、得られる被検体の検出および定 量の精度は、測光法により検出することができる免疫沈降反応の開始後５０．４ ０，３０あるいは２０秒以内に初期速度信号検出を終了させることによっては損 なわれないことを見出した。

測光検出は、少なくとも１つの光源と光検出器とを有する光度計を使用して行な われる。液体培地は実質的に光学的に透明な容器により保持され、容器は光源か らの入射光の径路に配置される。光検出器は、免疫沈降反応の進行に伴う液体培 地の光学すなわち測光特性の変化を検出する。

目的とする実質的に一定な開始速度信号を得る場合に関連する因子は、液体培地 に存在する被検体または被検体−接合体の量に対して特異結合パートナを過剰に 存在させることである。従って、被検体または被検体−接合体に対する特異結合 パートの比が約１：１以下であると、一般に好ましくない。過剰の特異結合パー トナが存在すると、免疫沈降反応の所望の実質的に一定のおよび最大の速度を得 るのが容易となる。一般的には、液体培地において組み合わされる特異結合パー トナの容量に対して比較的少量の被検体含有サンプルを使用することにより、所 望の化学量論的に過剰の特異結合パートナを容易に得ることができる。

好ましくは、結合パートナの被検体または被検体−接合体に対する比は少なくと も約１．２：ｌであり、十分な結合パートナを提供して免疫沈降反応から所望の 測光法により検出することができる初期速度信号を得ることができる。より好ま しくは、十分な特異結合パートナを提供して信号検出期間に実質的に一定の初期 速度信号を得るには、被検体−接合体に対する結合パートナの比は約１，２：工 ないし約ｌＯ：１である。結合パートナの被検体−接合体に対する比が約１０： ｌよりも大きいと、非特異沈降および速度信号干渉のような問題が生じて、正確 な被検体の検出および定量を阻害する。本発明の初期速度法によるほとんどの蛋 白質免疫検定に関して、被検体−接合体が使用されない場合には、被検体対特異 結合パートナ比は、結合パートナの量が過剰になって非特異沈降および速度信号 の干渉のような問題を引き起こす前は、約１０’＋１という大きさとすることが できる。

目的の初期線形測光速度信号を得る場合に影響を及ぼす他の因子は、液体培地中 の被検体−接合体および被検体の１度を含む。

本発明の方法により検出されかつ定量される被検体類は、数多くの薬剤類を含み 、そのうちのい（つかはハプテン類である。ハプテン類は、一般に、極めて少量 であるので、液体培地において特異結合パートナと組み合わされた場合、検出す ることができる液体培地測光特性の変化を起こすことができない。従って、この ような被検体の場合には、キャリヤ蛋白質のようなより大きい分子にハブテン薬 剤（またはハブテン薬剤の代謝物）を結合させることが必要となる。被検体−接 合体は次に、初期速度法の競争阻害免疫検定法において使用される。

使用される接合体は、抗薬側抗体との測光法により検出することができる免疫沈 降反応に関与することができる薬剤接合体を得るようにハブテン薬剤に結合する ことができる物質とすることができる。かくして、アポフェリチンまたは薬剤に 共役結合されるラテックス粒子を使用することができる。好ましい接合体は、入 手の容易性および反応安定性の点から蛋白質キャリヤである。より好ましい接合 体は、アビジンを検定されるべき薬剤のビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅ ｄ）誘導体に複合体化することにより形成される。ビオチン−アビジン接合体は 、種々のハブテン−被検体を測光法により検出することができる免疫沈降反応に 関与させることができる。最も好ましい接合体は、三原配位接合体である。適宜 の三原配位接合体の調製と使用に関する詳細は、１９９０年７月８日付で出願さ れた「新規な三原配位接合体およびその使用方法」なる発明の名称の同時係属中 の米国特許出願第０７１５３６，０５８号において見受けることができ、本明細 書においてはこの出願を引用してその説明に代える。

免疫阻害反応の際には、ハブテン薬剤接合体は、特異結合パートナの部位に結合 するために遊離の薬剤（または薬剤代謝物）と競争する。得られる薬剤−接合体 −特異結合バートナ複合体は、液体培地の、濁度の増大のような測光特性の変化 を引き起こす。遊離の被検体（すなわち、ハブテン薬剤）の存在により、複合体 の形成が妨害され、従って、液体培地の濁度の増加が妨害される。かくして、検 出される濁度測定応答信号の速度はサンプル中の遊離ハブテン薬剤の濃度に反比 例する。

初期反応速度は、濁度測定のような光の減衰を測定する測光法により検出するこ とができる。濁度測定は、濁度測定信号検出が使用される場合に初期速度信号が ほとんど実質的に線形をなすので、免疫沈降反応が行なわれている液体培地の変 化する光学特性を検出する好ましい測光法である。

好ましくは、生理的流体（および特に血清）に関しては、光減衰信号は約３４０ ｎｍの波長で測定される。約３４０ｎｍよりも短い、例えば、２８０　ｎｍでは 、蛋白質吸収からの干渉または背景信号が生ずる可能性がある。か（して、約３ ４０　ｎｍよりも低い測定波長は好ましくない。約３４０　ｎｍよりも高いと、 吸収波長は長くなるので、蛋白質信号の干渉が減るが、有意の別の吸収干渉（例 えば、ビリルビンからの）が生ずる可能性がある。従って、約３４０ｎｍの吸収 波長が好ましい。

液体培地に対する１つ以上の添加剤を使用して、免疫沈降反応の際の初期速度の 制御を容易にしあるいは最適にすることができる。

添加剤は、デキストリンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなグリ コール化合物であるのが好ましい。好都合には、添加剤は液体培地の一部を形成 する緩衝剤に存在させることができる。

緩衝剤は、免疫沈降反応の開始に先立って、希釈剤と組み合わせてランニング緩 衝剤を得る。ランニング緩衝剤は測光法により検出することができる免疫沈降反 応が開始される液体培地とすることができる。ランニング緩衝剤の希釈剤成分は 、特異結合パートナと使用することができる被検体−接合体とを希釈する作用を 行なう。

希釈剤の容積に対する添加剤含有緩衝剤の容積の特定の比は、有用性を持つもの であることがわかった。かくして、ランニング緩衝剤における希釈剤に対する緩 衝剤の比が高く、従って、液体媒体中の緩衝剤添加剤の濃度が高いと、液体培地 の濁度の増加の速度が大きくなることにより、免疫沈降反応の速度が大きくなる 。逆もまたあてはまる。

所定の抗体が弱い測光速度信号を生ずる場合には、高濃度の速度制御添加剤は免 疫沈降反応の際に被検体または被検体−接合体と結合して信号の強度を高めるの で、かかる添加剤が使用される。かくして、弱い測光法により検出することがで きる免疫沈降反応信号が予想される場合には、希釈剤に対する添加剤含有緩衝剤 の比を高くしてランニング緩衝剤を形成する。液体培地中の速度制御添加剤の濃 度は、非特異沈降が生ずるレベルまでは上昇しない。希釈剤の容量に対する緩衝 剤の容量の好ましい比は、以下の例において特定される特定の緩衝剤および希釈 剤試薬の場合には、約０．５：１ないし約８＋１である。ＰＥＧが速度制御添加 剤として使用される場合には、液体培地において約４％ｗ／ｖないし約１０％ｗ ／ｖの濃度で使用されるのが好ましい。約４％ｗ／ｖよりも低いと、弱い速度信 号を補強するＰＥＧの存在量は不十分である。約１０％ｗ／ｖよりも高いと、か なりの非特異沈降が生ずる可能性がある。

液体培地中の速度制御添加剤の濃度を変えても、測光法により検出することがで きる免疫沈降反応の際に検出される液体培地の濁度を高める初期速度信号の実質 的に線形性状に有意に影響を及ぼすことはない。

特異結合パートナは、例えば、全抗血清、精製された抗体、モノクローナル抗体 、またはポリクローナル抗体からなりあるいはこれらに存在させることができる 。特異結合パートナは、２つ以上の異なるポリクローナルまたはモノクローナル 抗体の混合物またはカクテルとすることができる。

抗体は、は乳動物に問題の被検体のような抗原を用いて免疫を付与することによ り得ることができる。免疫化により得られるポリクローナル抗体は、被検体の反 応パートナとして使用することができる。あるいは、免疫にされたは乳動物を周 知の手順に従ってさらに処理し、被検体に対するモノクローナル抗体を得ること ができる。

多くの場合、これは、免疫にされたは乳動物の膵臓の除去と、ミエローマ細胞を 用いた膵臓細胞の融合（ｆｕｓｉｏｎ）によるハイブリドーマの形成と、ハイブ リドーマを形成する適宜のモノクローナル抗体のクローン化とを必要とする。

初期速度法を使用して、ゲンタミシンおよびトブラマイシンのような種々の被検 体の血清濃度を、血清１　ｍ　ｌあたり約０．１μｇという低いレベルまで検出 するとともに定量を行なった。

液体培地の測光変化の初期速度は、多くの場合、手動操作の光度計で検出は困難 である。従って、本発明は、適宜検量が行なわれた自動化高速光度計を使用して 行なうのが最も好ましい。検量は、既知１度の被検体を含むサンプルと被検体の 特異結合パートナとの間の液体培地における免疫沈降反応を先づ開始させること により行なうことができる。次に、免疫沈降反応により引き起こされる液体媒体 の測光特性の変化の初期速度を光度計により検出する。次に、これら２つの工程 を、異なる既知濃度の被検体を含む少なくとも１つの以上のサンプルを用いて繰 り返す。この手順により、被検体の１度に対する測光特性の変化の速度の標準曲 線が得られ、この曲線は光度計を検量するのに使用される。

初期速度法を実施するための光度計を例示すると、ベックマン・ンンクＯ：／　 （Ｂｅｃｋｍａｎ　５ｙｎｃｈｒｏｎ）　ＣＸ　（登録商標）自動化ランダムア クセスアナライザがある。ジンクロンＣＸ（登録商標）臨床アナライザは、種々 の測光プロトコールを使用して異なる被検体の迅速検出を容易にするように種々 の測光プロトコールを使用することができる高速の自動化コンピユータ化ワーク ステーションである。この装置は、濁度測定液体培地変化をはじめとする液体培 地の種々の測光変化を検出することができる。

ジンクロンＣＸ（登録商標）自動化アナライザは、３つの区画室Ａ、ＢおよびＣ を有するカートリッジを利用している。各区隔室には、異なる流体を装填するこ とができ、次いで、カートリッジが装置に挿入される。装置により操作される自 動ピペットが、所定の順序で流体を３つの区画室から吸引して混ぜ合せ、実質的 に光学的に透明なキュベツトに入れる。その後、キュベツト内の混ぜ合せた流体 に、装置が生理的流体（例えば、未希釈の患者の血清）のアリコツトを加えるこ とができ、次いで、得られた免疫沈降反応の測光検出を行なう。

透 以下の例は、本発明の種々の特徴および実施態様を例示するものであり、請求の 範囲に記載の本発明の範囲を制限するものではない医↓ （ゲンタミンンに対するモノクローナル抗体の調製）２つの形態すなわち種のゲ ンタミンンに対するモノクローナル抗体をつくることができるハイブリドーマを 調製した。使用された物質は次の通りであった。使用されたミエローマ細胞は、 ジャーナル・オブ・イミュノロジ−（Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏ、）第１２３巻、第１ ５４８頁（１９７９年）においてキアニー（Ｋｅａｒｎｅｙ）等により開発され た非分泌マウスミエローマラインであるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３から得た。

使用された膵臓細胞は以下の手順により免疫にされたＢａ１ｂ　／　ｃマウスか ら得た。成長培地は、１０％ウシ胎児血清（ハイクローン）が補充されたＤＭＥ 低グルコース（アーパイン・サイエンティフィック（ｌｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ）　）と２ｍＭの１−グルタミン（アーパイン・サイエンティフィッ ク）であった。使用された培地は、６５３．１細胞の３日培養からの成長培地で あり、細胞を除去するため遠心分離とろ過が行なわれた。ＣＨＡＴ培地は、５０ ％成長培地および１００単位／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ア ーパイン・サイエンティフィック）と、４ｘｌＯ−’Ｍのアミノプテリン（シグ マ（Ｓｉｇｍａ）　）と、１ｘｌＣＩ’Ｍのヒポキサンチン（エムエイ・バイオ プロダクツ（ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））と、１０単位／ｍ１インシュリ ン（エリ・リリー（Ｅｌｉ　Ｌｉ１ｙ））とを有する５０％ならし培地であった 。ならし培地は、５０％成長培地−５０％使用培地および２．５−’Ｍのｂ−メ ルカプトエタノール（シグマ）であった。約１３００ないし１６００の分子量を 有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（シグマ）が使用された。注入培地は 、１００単位／ｍｌベニノリソーストレプトマイシン溶液を有するＤＭＥ低グル コースであった。２分の１ミリリツトルのプリスティン（２，６，１０，１４− テトラメチルペンタデカン、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手）を、ハ イブリドーマの注入の２週間前に各Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに腹腔的注射を行なった 。

ハイブリドーマは、ネイチ＋　（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９ ７５年）においてコーラ（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ）により開発された方法を使用してつくった。免疫にされたマウスからの膵臓 を、頚管の転移後に無菌状態で取り出し、単一細胞懸濁体が得−られるまで組織 篩において粉砕した。洗浄後、細胞を洗浄した６５３．１ミエローマ細胞と、膵 臓対ミエローマ細胞の比を２＝１にして混合し、次いでペレット成形を行なった 。上澄み液を除去し、ＰＥＧを１分間かけてゆっくりと加えた。ＰＢＳを加えて 全容量を２２ｍ１にし、次いで、細胞をＯＥＧの添加の開始後８分間ペレット成 形に供した。ベレットを、２００　ｍ　ｌのＣＨＡＴに再懸濁させ、懸濁液０． ２ｍｌを９６個の溜めを有する微量滴定プレート１０枚の各層めに加えた。融合 後６日目および７日目に新鮮なＣＨＡＴを溜めに補給した。

放射線免疫検定法（ＲＩ　Ａ）を使用して、成長に関して溜めの試験をｌＯ０日 目開始し、次の３ないし４日に亘って継続した。陰性の対照よりも大きいカウン トを有する溜めを後日再試験に供した。

読みが試験の２日目に陰性の対照よりも大きいままであった場合には、コロニー を陽性と考え、クローニングを行なった。クローニングは、ならし培地の希釈剤 を９６個の溜めのプレート２枚に制限し、一方を５細胞／′／ｉＩめに、一方を １細胞／溜めにした。クローニングから１週間後に、ソングルコロ二一の溜めを ＲＩＡにより試験した。全ての溜めが陽性であった場合には、ラインは純粋であ ると考え、次に安定化のために再クローニングを行なった。全ての溜めが１００ ％陽性でなかった場合には、陽性の溜めを使用して２度目のクローニングを行な った。クローニング後７巳目にプレートを再度試験に供した。全てのクローンが １００％陽性となるまで、この手順を繰り返した。次に、細胞を成長培地におい て膨張させ、注入培地において、マウスあたり約３ｘｌＯ＠ハイブリドーマ細胞 の１度でプリスティン感作（Ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ）　Ｂ　ａ　１　 ｂ　／　Ｃ７ウスの腹腔内に注入した。

注入に先立ち、培養された細胞からの上澄み液を、「スカンジナビアの病理学お よび微生物学の公報Ｊ　（Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　５ｃａｎ ｄ）第２６巻、第５０７頁（１９４９年）に掲載のオフテルロニーゲル拡散法に よるアイソタイプに使用した。腹水流体を、マウスにハイブリドーマ細胞を注入 してから約１０日後にマウスから取り出した。腹水流体を次にＲＩＡにより力価 測定し、ペックマンＩＣ５速度比濁計を使用してＩｇＧアイソタイプ含有量を測 定した。

ゲント（Ｇｅｎｔ）　３　Ｂ　１モノクローナル抗体の形成に関する免疫プロト コールは次の通りであった。雌のＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウスにフロイント完 全においてゲンタミシンＢＳＡ抗原２０μｇを腹腔内に注入した。１か列後、ゲ ンタミシンＢ５Ａ２０μｇを静脈内に注入した。

その２週間後、ゲンタミシンＢ５Ａ２０μｇを静脈内および腹腔的注入の組み合 わせにより与えた。その３日後、免疫にしたマウスの膵臓を取り出し、融合を行 なった。このようにして得られたハイブリドーマは、ゲンタミシンに対して特定 の親和力を有するモノクローナル抗体をつくることができた。

ＧＶ−ＡＳ５モノクローナル抗体の形成の免疫プロトコールは次の通りであった 。雌のＢａ１ｂ／ｃマウスに、フロイント完全においてゲンタミンンＢＳＡ抗原 ｌμｇの静脈内注入を行なった。３日目に、マウスにゲンタミシンＢ５Ａｌ３９ μｇを静脈内に注入した。４日目に、マウスにゲンタミシンＢ５Ａ１３０μｇを 静脈内に注入した。５日目に、ゲンタミシンＢ５Ａｌ３９μｇの静脈内注入を行 なった。６日目に、ゲンタミシンＢ５Ａｌ３９μｇを再び静脈内に注入した。７ 日目に、免疫にしたマウスの膵臓を取り出し、融合を行なった。このようにして 得られたハイブリドーマは、ゲンタミンンに対して特定の親和力を有するモノク ローナル抗体を形成することができた。

ゲンタミシンは幾つかの同様な、しかし同じではない化学種に存在するので、ゲ ンタミシゲンタミシンに対する２つの異なるモノクローナル抗体をつくった。か くして、２つのゲンタミシン種に対するモノクローナル抗体を使用するゲンタミ シンに対する検定により、存在する全ゲンタミシンの量を正確に定量することが できる。

匹ｌ （ゲンタミシンの検定） 未希釈の血清サンプル中のゲンタミシンを検出するために、初期速度比濁測定免 疫検定を次のようにして行なった。腹水症流体のバイアル２つを例１の手順に従 って得た。一方のバイアルはモノクローナル抗体ゲント３Ｂ１の溶液を含み、も う一方の腹水症流体のバイアルはモノクローナル抗体ＧＶ−ＡＳ５を含んでいた 。腹水症流体の各バイアルを４℃で３０分間１０ｇで遠心処理に供した。次に、 上澄み液１　ｍ　ｌを各バイアルから除去し、腹水流体各１ｍｌを希釈剤３ｍｌ と組み合わせた。使用した希釈剤は、ベックマンＩＣ８（商標）蛋白質、パー１ −１６６３７６３０であった。同じ希釈剤が、以下に説明する全ての初期速度免 疫検定例において使用された。

希釈された腹水流体の４ｍｌ容器２つを組み合わせて、６ｍｌの希釈剤中の腹水 流体２ｍｌからなる流体８ｍｌを得た。

次に、２つの抗ゲンタミシンモノクローナル抗体を含む希釈された腹水流体を、 ０．４５μｍ低蛋白質結合７ィルタ（バクスタ（Ｂａｘｔｅｒ）、アクロディス ク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）、パート＃Ｆ３０５７−３）でろ過した。ろ過された流 体４ｍｌをジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区画室 Ｃに入れた。ジンクロンＣＸ）（登録商標）５は、カリフォルニア州フラートン （Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）に所在するベックマン・インストルメンツ・インコーホ レイテッド（Ｂｅｃｋａ＋ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）からパ ート＃７５９３００として入手することができる。

ランニング緩衝剤を、緩衝剤６０　ｍ　ｌを希釈剤４０　ｍ　ｌと組み合わせる ことにより調製した。使用された緩衝剤は、ベックマンＩＣ５（商標）蛋白質緩 衝剤パート＃６６３６００であった。同じ緩衝剤を、以下に説明する全ての初期 速度免疫検定例において使用した。得られたランニング緩衝剤１００ｍ１を、ジ ンクロンｃＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区画室Ａに入れた。

所望の特異的接合体に関して修正して１９９０年６月８日付で出願された同時係 属の米国特許出願第０７１５３６，０５８号に開示されているプロトコールに従 ってゲンタミシンー二座配位接合体をつくった。次に、三原配位接合体をアビジ ンと組み合わせ、接合体のビオチン部分をアビジンに結合させた。得られた接合 体を、希釈剤で希釈剤１　ｍ　ｌあたり接合体０．３０ｍｇの濃度まで希釈した 。

希釈された接合体１０　ｍ　ｌをジンクロンＣＸ（登録商標）５の区画室Ｂに入 れた。

時間ゼロで、区画室Ｃのモノクローナル抗体２４μｌをジンクロン（登録商標） ５臨床アナライザにより吸引し、ランニング緩衝剤２３０μｌとともにキュベツ トに加えた。キュベツトは、実質的に光学的に透明な容器すなわちバイイアルで ある。時間ゼロプラス３２０秒で、未希釈のゲンタミシン含有血清サンプル８μ ｌをキュベツトに加えた。

ゼロプラス３６８秒の時間で、区画室Ｂからのゲンタミシンー二座配位接合体２ ８μｌをキュベツトに加えた。時間ゼロプラス３７４秒（接合体の添加後８秒） で、時間プラス４０６秒（接合体の添加後３２秒）まで、キュベツト内の液体培 地の濁度を高める速度を測定した。か（して、液体培地の濁度を高める速度は全 ２４秒であった。液体培地の濁度を高める速度は、接合体がキュベツトの溶液混 合物に定着するように、キュベツトへの接合体の添加後約８秒まで読み取らない のが好ましい。発明者は、濁度の測定の開始は、本発明の初期速度法による薬剤 定量結果の精度に著しい負の影響を及ぼすことな（、複合物の添加後直ちに（す なわち、この例においては時間ゼロプラス３６８秒）に起こることができること を見出した。しかしながら、好ましくは、競争阻害免疫沈降反応が開始すると、 数秒の短い待ち時間を、上記したように速度信号測定の開始前に経過させる。こ の速度とゲンタミシンの標準速度曲線とを比較することにより、存在するゲンタ ミシンの量を定量することができた。

第１図は、上記のようにして行なわれたゲンタミシン検定のグラフである。図示 されている各データポイントは、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザ により１秒間隔で得られた測定値である。かくして、８つの測定が８秒間にわた って行われている。次に、別の８つの測定を行なう前に、装置を８秒間止めた。

装置を８秒間作動し、８秒間停止してデータを取ることにより、データポイント の明らかな集落化が生ずる。

第１図の縦軸は、３４０ｎｍにおいてミリアブソーバンス（ｍａｂｓ）単位で測 定され、７００ｎｍでフラッシュ補正された（ｆｌａｓｈｃｏｒｒｅｃｔｅｄ） キュベツトの溶液の濁度を示す。第１図の横軸は、時間の経過示す。第１図は、 時間ゼロから時間ゼロプラス３２０秒までは、緩衝剤処理された抗ゲンタミシン モノクローナル抗体の存在により測定可能なキュベツトサンプルの濁度があるこ とを示している。これは、「試薬ブランク」濁度と云われる。Ｏ＋３２０秒から ｏ＋３６８秒までは、時間ゼロプラス３２０秒における被検体サンプルの添加に よる高いレベルの溶液濁度が、読み取られる。重要なことは、時間ゼロから時間 ゼロプラス３２０秒までおよび時間ゼロプラス３２０秒から時間ゼロプラス３６ ８秒までに観察される濁度は、時間に対する変化はなく、すなわち、濁度変化の 速度はこれらの期間では検出されていない。

時間ゼロプラス３６８秒において、接合体を加えた。本質的にすぐキュベツト液 体培質濁度の時間とともに実質的に直線的に変化する速度が検出された。さらに 、濁度変化の最大速度信号が、キュベツトの液体培地に存在するゲンタミシン接 合体に対する抗ゲンタミシン抗体の過剰を一部原因として、この被検体検出法に 関して増加すると、濁度変化の初期の実質的に直線的な比濁度変化速度信号が生 じる。

皿旦 （ゲンタミシン検量線の作成） 例２に記載されている同じジンクロンｃＸ（登録商標）臨床アナライザを使用し た。同じ試薬を装置のカートリッジの区画室ＡＳＢおよびＣに装填した。ゲンタ ミシン含有サンプル８μｌを使用する代わりに、既知量のゲンタミシンを含む６ つのキャリブレータ（０，１１２，４，８および１２μｇ／ｍｌ）を使用した。

各キャリブレークについて接合体の添加時間に対するキュベツト液体培地濁度の 変化の速度を測定した。速度信号を、第２図に示すように、横軸におけるキャリ ブレータのゲンタミシン濃度に対して縦軸にプロットした。ジンクロンＣＸ（登 録商標）５臨床アナライザにより、得られたこれらの定量値を、サンプル中の未 知量のゲンタミシンにより生ずるキュベツト液体培地濁度の変化の初期速度と自 動的に比較することにより、生理的流体サンプルの単位容積あたりに存在するゲ ンタミシンの量を検出しかつ定量することができた例」− （ゲンタミシン検定の精度の測定） 本初期速度法により測定したゲンタミンンの量の精度を測定するため、通常の回 帰分析技術を使用して相関関係のプロットを行なった。上記例２により説明した ような本初期速度法と、蛍光偏光免疫検定［Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａ、バクスタ・サイエ ンティフィックからパート番号Ｂ５７００−２　（低）、Ｂ５７００−３　（中 間範囲）およびＢ５７００−４　（高対照）として入手することができるダイト ＴＤＭ　（治療薬剤監視）を有するアボットＴＤＸ　（商標）アナライザを使用 ］の双方により４６の患者血清サンプルのゲンタミシンレベルを測定した。

結果を、算出した回帰線とともに、第３図にプロットして示す。

初期速度濁度法により検定されたゲンタミシン値の回帰線に対する近接により、 本発明の精度および信頼性が高いことがわかる。

再現性のあるゲンタミシン検出および定量結果が、血清１　ｍ　ｌあたり０．１ μｇないし１２μｇの範囲において初期速度法により得られた。ラン内検定の精 度は、血清の１．２．６．２および８．８μｇ　／　ｍ　１ゲンタミシン濃度に おいてそれぞれ７．１％、２．０％および２．０％の変動率が得られた。ラン間 の変動率は、同じレベルで、１１．７％、２．５％および５．６％であった。

区立 （ヤギ抗ＩｇＭポリクローナル抗体の調製）ヤギ抗ＩｇＭポリクローナル抗体を 次のようにしてつくった。４匹のヤギのそれぞれに、フロイント完全アジュバン ト３ｍｌに乳化させたＩｇＭ２５μｇを注入した。各ヤギについて、０．５ｍｌ を２本の脚のそれぞれに静脈内注入を行ない、残りの２．０ｍｌを皮下注入によ り１０の異なる部位に注入した。

２８日後、各ヤギに再度、フロイント完全アジュバント３　ｍ　ｌに乳化させた ＩｇＭ２５μｇを注入した。０．５ｍｌを静脈内投与により各ヤギあたり２本の 脚のそれぞれに注入し、残りの２．０ｍｌを、皮下注入により１０の異なる部位 に注入した。

第２および第３のブーストを、１日目の当初の免疫後８週間目および１２週間目 のそれぞれに与えた。プラス８透口およびプラス１２通口の注入は、フロイント 完全アジュバントに乳化させたＩｇＭ２５μｇであった。いずれの注入とも、ヤ ギ１匹あたり少な（とも１５の異なる部位に皮下に行なわれた。

最初の免疫後１４週目間、各ヤギから血液のサンプルを取り出し、抗ＩｇＭ含量 について力価測定を行なった。

匠立 （ＩｇＭの検出と定量） 未希釈血清サンプルのＩｇＭを検出しかつ定量するため初期速度比濁測定法を次 のようにして行なった。例５の手順により得たヤギ抗ＩｇＭを使用した。この抗 体はまた、ベックマンパート＃４４９５２０として購入することができる。

抗１ｇＭポリクローナル抗体を含むヤギ血清１　’ｍ　１を希釈剤２ｍｌに希釈 し、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区画室Ｂに入 れた。

ランニング緩衝剤を、緩衝剤６０　ｍ　ｌを希釈剤４０　ｍ　ｌと混合すること によりつくった。ランニング緩衝剤１００　ｍ　ｌをジンクロンＣＸ（登録商標 ）５臨床アナライザカートリツジの区画室Ａに入れた。

時間ゼロにおいて、区画室Ａのランニング緩衝剤２００μｌをキュベツトにおい て区画室Ｂからの抗ＩｇＭ抗体７０μｌと組み合わせた。時間ゼロプラス３２０ 秒において、ＩｇＭを含む未希釈のヒト血清サンプル３μｌもキュベツトに加え た。

本質的にすぐにキュベツトの液体培質濁度の時間とともに実質的に直線的に変化 する速度を検出した。キュベツトの液体培地濁度を高める初期速度を、時間ゼロ プラス３２０秒から時間ゼロプラス３４４秒まで３４０ｎｍ（７００ｎｍでフラ ッシュ補正）で装置により測定（すなわち、２４秒初期速度測定）を行なった。

速度測定時間帯（ｗｉｎｄｏｗ）を時間ゼロプラス３２０秒から時間ゼロプラス ３３６秒まで、実質的に同じ結果をもって読み取ることができる（１６秒初期速 度測定時間帯または信号検出期間）ことがわかった。

第４図は、初期速度法により実施された濁度免疫検定の結果を示す。血清サンプ ルに存在するＩｇＭの量を定量するための相関関係曲線を、ゲンタミノンキャリ ブレークの代わりに適宜の商業的に入手することができるＩｇＭキャリブレータ を使用して、例３と同じ態様で得た。

第５図は、血ｆｉ１ｇＭを検出しかつ定量する初期速度法と、アレイ（Ａｒｒａ ｙ）　（登録商標）３６０　（比濁測定）装置法（ベックマン、アレイ（登録商 標）蛋白質システムアナライザ、パート＃７５７１００）とを使用して得た回帰 分析の結果を示す。８３の異なるヒト血清サンプルの評価を、初期速度法により ＩｇＭ含量に関して、さらに標準アレイ定量法を使用して同じサンプルに関して 行なりた。

第５図に示すように、初期速度濁度測定法により検定されたＩｇＭ値の回帰線に 対する近似により、本発明の高い制度および信頼性がわかる。

医ユ （バルプロン酸の検出と定量） 未希釈血清サンプルのバルプロン酸を検出しかつ定量するため、初期速度比濁測 定免疫検定法を次のように実施した。ヤギ抗バルプロン酸ポリクローナル抗体を 例５の手順により得るとともに、所望の特定の抗体のために改質を行なった。

抗バルプロン酸ポリクローナル抗体を含むヤギ血清１ｍｌを希釈剤２ｍｌに希釈 し、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区画室Ｃに入 れた。

ランニング緩衝剤を、緩衝剤４０　ｍ　ｌを希釈剤５　ｍ　ｌと混合することに よりつくった。ランニング緩衝剤４５ｍ１をジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床 アナライザカートリツジの区画室Ａに入れた。

バルプロン酸−三原配位接合体を例２に記載の手順に従ってつくり、希釈剤１ｍ ｌあたり接合体０．４０ｍｇの濃度に希釈剤で希釈した。希釈された接合体１０ 　ｍ　ｌをジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区画室 Ｂに入れた。

時間ゼロにおいて、区画室Ｃのポリクローナル抗体４０μｌをランニング緩衝剤 ２２５μｌとともにキュベツトに加えた。時間ゼロプラス３２０秒において、バ ルプロン酸含有血清サンプル３μｌをキュベツトに加えた。

時間ゼロプラス３３６秒において、区画室Ｂからのバルプロン酸−三原配位接合 体４５μｌをキュベツトに加えた。次に、本質的にすぐキュベツト液体培質濁度 の時間とともに実質的にすぐ直線的に変化する速度を検出した。時間ゼロプラス ３５２秒（接合体の添加後１６秒）で、時間ゼロプラス３８４秒（接合体の添加 後４８秒）まで、キュベツトの溶液の濁度を高める初期速度を測定した。この速 度をバルプロン酸に関する標準速度曲線と比較することにより、存在するバルプ ロン酸の量を定量することができた。

第６図は、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザを用い、上記のように して行なわれたバルプロン酸検定のグラフである。

第６図の縦軸は、３４０ｎｍにおいてミリアブソーバンス（ｍａｂＳ）単位で測 定し、７００ｎｍでフラッシュ補正を行なったキュベツトの溶液の濁度を示す。

時間ゼロプラス３３６秒で、接合体を加えた。すぐ、実質的時間に直線的なキュ ベツトの溶液濁度の変化速度が明らかである。さらに、キュベツトの液体培地に 存在するバルプロン酸接合体に対して抗バルプロン酸抗体の過剰が少な（とも一 部原因となって濁度の最大速度がこの被検体検出手順に関して増加すると、濁度 変化の初期の実質的に直線的な比濁度変化速度信号が生じている。

バルプロン酸検量および回帰分析を、既知量のバルプロン酸とともに適宜のキャ リブレータを使用し、例３および４においてゲンタミシンに関してそれぞれ記載 したように行なった。バルプロン酸の回帰曲線に関しては、７２人の患者の血清 バルプロン酸レベルを、初期速度法と蛍光偏光免疫検定の双方により測定した。

初期速度濁度測定法により検定されたバルプロン酸値の回帰ラインに対する近似 が、本発明の精度および信頼性を示している。

匠ｌ （ハプトグロビンの検出と定量） 未希釈血清サンプルのハプトグロビンを検定しかつ定量するために初期速度濁度 免疫検定法を実施した。所望の特異的抗体に関して修正してヤギ抗ハプトグロビ ンポリクローナル抗体を例５の手順によりつくった。

抗ハプトグロビンポリクローナル抗体を含むヤギの血清１ｍｌを希釈剤］、　ｍ 　Ｉで希釈し、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザカートリツジの区 画室Ｃに入れた。

緩衝剤１５０ｍ１を希釈剤３００　ｍ　ｌと混合することによりランニング緩衝 剤をつくった。このランニング緩衝剤１００ｍ１をジンクロンＣＸ（登録商標） ５臨床アナライザカートリツジの区画室Ａに入れた。

時間ゼロで、区画室Ｃのポリクローナル抗体溶液５０μｌを、区画室Ａからのラ ンニング緩衝剤２２５μｌとともにキュベツトに加えた。時間ゼロプラス３２０ 秒において、ヒト血清サンプルを含む未希釈ハプトグロビン３μｌをキュベツト に加えた。次に、キュベツトの液体培質濁度の時間とともに実質的に直線的に変 化する速度を検出した。

時間ゼロプラス３３６から時間ゼロプラス３６０秒まで（血清サンプルの添加後 １６から４０秒まで）、溶液の濁度を高める初期速度を測定した。この初期速度 検定はまた、キュベツトの溶液の濁度を高める速度を時間ゼロプラス３２０秒か ら時間ゼロプラス３４４秒まで（被検体サンプルの添加後ゼロから２４秒まで） 測定するために実施され、実質的に同じハプトグロビン定量結果が得られた。

これらの濁度増加速度をハプトグロビンの検量曲線と比較したところ、存在する ハプトグロビンの量を定量することができた。

第７図は、ジンクロンＣＸ（登録商標）５臨床アナライザを用い、上記したよう にして行なったハプトグロビン検定のグラフである。第７図の縦軸は、３４０ｎ ｍにおいてミリアブソーバンス（ｍａｂｓ）単位で測定され、７００ｎｍにおい てフラッシュ補正されたキュベツト溶液の濁度を示す。第７図の横軸は時間であ る。時間ゼロプラス３２０秒で、ハプトグロビン含有サンプル３μｍｌを加えた 。キュベツト溶液濁度の時間とともに実質的に直線的に変化する速度が明らかで ある。さらに、キュベツトの液体培地に存在するハプトグロビンに対して抗ハプ トグロビン抗体の過剰が少なくとも一部原因となって、濁度の最大速度が増加す ると、濁度変化の初期路線形速度が生じている。

ハプトグロビン検量曲線を、適宜のキャリブレータを既知量のハプトグロビンと ともに用いることにより、上記したようにしてつくった。初期速度法により５０ のヒト血清サンプルに関して得たハプトグロビン定量結果を、アレイ（登録商標 ）装置により同じサンプルに関して得たハプトグロビン定量結果と比較すること によりハプトグロビンの回帰分析を行なった。初期速度濁度測定法により検定さ れたハプトグロビンの回帰ラインに対する近似性により、本発明の精度および信 頼性が明らかとなった。

■ （フエノパルビクールの検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、次のようにして未希釈血清サンプル中のフエ ノバルビクールの検出と定量を行なった。初期速度方法によるゲンタマイシン（ ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）免疫検定で用いたようにして、２つの異なるモノクロー ナル抗体の組み合わせをフエノバルビタール免疫検定に用いないことを別として 、所望の特異的モノクローナル抗体に関して修正して、例１の手順によりフエノ バルビタールに対するモノクローナル抗体を含むマウス腹水を例１の手順により 得た。

バイアルに入れた腹水を４°Ｃで３０分間１０ｇで遠心分離にかけた。次に、上 澄み液を１　ｍ　ｌバイアルから取り出し、２ｍｌの希釈剤と一緒にした。

抗フェノバルビクールモノクローナル抗体を含む希釈した腹水を次に、０．４５ μの低たんばく質パインディングフィルター（Ｂａｘｔｅｒ；　Ａｃｒｏｄｉｓ ｃ、バート＃Ｆ３０５７−３）によりろ過した。ろ過した流体を３ｍ１ＳＳｙｎ ｃｈｒｏｎ　ＣＸ５　臨床アナライザーカートリッジの区画Ｃに入れた。

ランニング緩衝液は、４０　ｍ　ｌの緩衝液を１０ｍ１の希釈剤と混合すること により準備した。５０　ｍ　ｌのランニング緩衝液を５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　 ５臨床アナライザーカートリツジの区画Ａに入れた。

フェノパルビタールー三原接合体を、例２に記載した手順により準備し、希釈剤 により希釈して、希釈剤１ｍｌ中に接合体０．５０ｍｇを含む濃度とした。希釈 した接合体１０ｍ１を、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーカートリ ツジの区画Ｂに入れた。

時間０で、区画Ｃのモノクロナール抗体溶液３６μｌを、区画Ａからの２００μ ｌのランニング緩衝液を有するキュベツトに加えた。時間０＋３２０秒で、３μ ｌの未希釈フエノバルビタール含有血清サンプルをキュベツトに加えた。

時間０＋３３６秒で、区画Ｂがらの３２μｍのフェノパルビタールー三原接合体 をキュベツトに加えた。本質的にすぐキュベツト液体媒質濁度の時間とともに、 実質的に直線的に変化する速度（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｉｍｍｅｉｄａｔｅ 、　５ｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ　ｌｉｎｅａｒ−ｗｉｔｈ　ｔｉｍｅ　ｒａｔ ｅ　ｏｆｃｈａｎｇｅ）が検出された。時間０＋３６０秒（接合体の添加後２４ 秒）で、時間０＋３９６秒（接合体の添加後６０秒）まで、キュベツトの溶液の 増加する濁度の初期速度を測定した。この速度をフェノバルビタールについての 検量（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）と比較することにより、存在するフエノバルビ クールの量の定量が可能となった。

フエノバルビクールの検量と回帰分析は、既知量のフエノバルビタールを用いた 適当なカリブレーク−（ｃ　ａ　１　ｉ　ｂ　ｒ　ａ　ｔ　ｏ　ｒ）を用いるこ とにより、それぞれ例３および４でゲンタマイシンについて記載したようにして 行なった。フエノバルビタール回帰分析について、多数の患者の血清フエノバル ビタールレベルを、ラテックスに基づ（免疫検定方法と初期速度方法の両方によ り測定した。回帰線への初期速度比濁方法により検定されたフエノバルビクール 値の近接は、本発明の高い精度と信頼性とを示した。

皿上ユ （テオフィリンの検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、次のようにして未希釈血清サンプル中のテオ フィリンの検出と定量を行なった。初期速度方法によるゲンタマイシン免疫検定 手順で用いたようにして、２つの異なるモノクローナル抗体の組み合わせをテオ フィリン免疫検定に用いないことを別として、所望の特異的モノクローナル抗体 に対して変形して、例１の手順によりテオフィリンに対するモノクローナル抗体 を含むマウス腹水を例１の手順により得た。

バイアルに入れた腹水を４℃で３０分間１０ｇで遠心分離にかけた。次に、上澄 み液をｌ　ｍ　ｌバイアルから取り出し、２．５０ｍ１の希釈剤と一緒にした。

抗テオフィリンモノクローナル抗体を含む希釈した腹水を次に、０．４５μの低 たんばく質パインディングフィルター（Ｂａｘｔｅｒ；　Ａｃｒｏｄｉｓｃ、パ ート＃Ｆ３０５７−３）によりろ過した。ろ過した流体を４ｍｌ、５ｙｎｃｈｒ ｏｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーカートリツジの区画Ｃに入れた。

ランニング緩衝液は、３０ｍ１の緩衝液を２０　ｍ　ｌの希釈剤と混合すること により準備した。５０　ｍ　ｌのランニング緩衝液を５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　 ５臨床アナライザーカートリツジの区画Ａに入れた。

テオフィリンー三原接合体を、例２に記載した手順により準備し、希釈剤により 希釈して、希釈剤１　ｍ　ｌ中に接合体０．５２４ｍｇを含む濃度とした。希釈 した接合体１０ｍ１を、５ｙｎｃｈｒｏｎＣＸ　５臨床アナライザーカートリツ ジの区画Ｂに入れた。

時間０で、区画Ｃのモノクロナール抗体溶液４５μｌを、区画Ａからの２３０μ ｌのランニング緩衝液を有するキュベツトに加えた。時間０＋３２０秒で、３μ ｌの未希釈テオフィリン含有血清サンプルをキュベツトに加えた。

時間０＋３３６秒で、区画Ｂからの３２μｌのテオフィリンー三原接合体をキュ ベツトに加えた。実質的にすぐキュベツト液体媒質濁度の時間とともに、実質的 に直線的に変化する速度が検出された。時間０＋３６０秒（接合体の添加後２４ 秒）で、時間０＋３９６秒（接合体の添加後６０秒）まで、キュベツトの溶液の 増加する濁度の初期速度を測定した。この初期速度をテオフィリンについての検 量線と比較することにより、存在するテオフィリンの量の定量が可能となった。

テオフィリンの検量と回帰分析は、既知量のテオフィリンを用いた適当なカリブ レーク−を用いることにより、それぞれ例３および４でゲンタマイシンについて 記載したようにして行なった。回帰線への初期速度比濁方法により検定されたテ オフィリン値の近接は、本発明の高い精度と信頼性とを示した。

例」」。

（プロカインアミドの検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、次のようにして未希釈血清サンプル中のプロ 力インアミドの検出と定量を行なった。所望の特異的抗体に関して修正して、例 ５の手順によりヤギ抗プロ力インアミドポリクロナール抗体を得た。

抗プロ力インアミドボリクロナール抗体を含むヤギ血清１ｍｌを２　ｍ　ｌの希 釈剤で希釈し、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーカートリツジの区 画Ｃに入れた。

ランニング緩衝液は、３５　ｍ　ｌの緩衝液を１０　ｍ　ｌの希釈剤と混合する ことにより準備した。４５ｍ１のランニング緩衝液を５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　 ５臨床アナライザーカートリツジの区画Ａに入れた。

プロ力インアミドー三原接合体を、例２に記載した手順により準備し、希釈剤に より希釈して、希釈剤１ｍＩ中に接合体０．４０ｍｇを含む濃度とした。希釈し た接合体１０ｍ１を、５ｙｎｃｈｒ。

ｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーの区画Ｂに入れた。

時間０で、区画Ｃのポリクロナール抗体溶液３５μｍを、区画Ａからの２２５μ ｌのランニング緩衝液を有するキュベツトに加えた。時間０＋３２０秒で、１０ μｌの未希釈プロ力インアミド含有血清サンプルをキュベツトに加えた。

時間０±３３６秒で、区画Ｂからの４５μｌのプロ力インアミドー三原接合体を キュベツトに加えた。本質的にすぐキュベツト液体媒質濁度の時間とともに、実 質的に直線的に変化する速度が検出された。時間０＋３５２秒（１６秒が接合体 の添加である）で、時間０＋３８８秒（接合体の添加後５２秒）まで、キュベツ トの液体媒質の増加する濁度の初期速度を測定した。この速度をプロカインアミ ドについての検量速度線と比較することにより、存在するプロ力インアミドの量 の定量が可能となった。

プロカインアミドの検量と回帰分析は、既知量のプロ力インアミドを用いた適当 なカリブレーク−を用いることにより、それぞれ例３および４でゲンタマイシン について記載したようにして行なった。プロカインアミド回帰分析について、５ ２人の患者の血清プロ力インアミドレベルを、初期速度方法と蛍光偏光免疫検定 方法との両方により測定した。回帰線への初期速度比濁方法により検定されたプ ロ力インアミド値の近接は、本発明の高い精度と信頼性とを示した。

皿上１ （Ｎ−アセチルプロカインアミドの検出と定量）初期速度比濁免疫検定方法によ り、次のようにして未希釈血清サンプル中のＮ−アセチルブロ力インアミドの検 出と定量を行なった。所望の特異的抗体に関して修正して、例５の手順によりヤ ギ抗−Ｎ−アセチルプロ力インアミドボリクロナール抗体を得た。

抗−Ｎ−アセチルブロ力インアミドボリクロナール抗体を含むヤギ血清１ｍｌを ２ｍｌの希釈剤に希釈し、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ５臨床アナライザーカートリ ツジの区画Ｃに入れた。

ランニング緩衝液は、４０　ｍ　ｌの緩衝液を５ｍｌの希釈剤と混合することに より準備した。４５　ｍ　ｌのランニング緩衝液を５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　５ 臨床アナライザーカートリツジの区画Ａに入れた。

Ｎ−アセチルプロカインアミドー三原接合体を、例２に記載した手順により準備 し、希釈剤により希釈して、希釈剤１ｍＩ中に接合体０．４０ｍｇを含む濃度と した。希釈した接合体１０　ｍ　ｌを、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　５臨床アナラ イザーカートリツジの区画已に入れた。

時間０で、区画Ｂのポリクロナール抗体溶液４５μｌを、区画Ａからの２２５μ ｌのランニング緩衝液を有するキュベツトに加えた。時間０＋３２０秒で、１０ μｌの未希釈Ｎ−アセチルブロ力インアミド含有血清サすプルをキュベツトに加 えた。

時間０＋３３６秒で、区画Ｂからの４０μｍのＮ−アセチルプロカインアミドー 三原接合体をキュベツトに加えた。不買的にすぐキュベツト液体媒質濁度の時間 とともに、実質的に直線的に変化する速度が検出された。時間０＋３５２秒（接 合体の添加後１６秒）で、時間０＋３８８秒（接合体の添加後５２秒）まで、キ ュベツトの液体の増加する濁度の初期速度を測定した。この初期速度をＮ−アセ チルブロ力インアミドについての標準速度線と比較することにより、存在するＮ −アセチルプロ力インアミドの量の定量が可能となった。

Ｎ−アセチルプロ力インアミドの検量と回帰分析は、既知量のＮ−アセチルブロ 力インアミドを用いた適当なカリブレーターを用いることにより、それぞれ例３ および４でゲンタマイシンについて記載したようにして行なった。Ｎ−アセチル プロカインアミド回帰分析について、多数の患者の血清Ｎアセチルブロ力インア ミドレベルを、初期速度方法と蛍光偏光免疫検定方法との両方により測定した。

回帰線への初期速度比濁方法により検定されたＮ−アセチルブロ力インアミド値 の近接は、本発明の高い精度と信頼性とを示した。

例」−１ （ＩｇＧの検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、未希釈血清サンプル中のＩｇＧの検出と定量 を行なった。使用した抗体は、所望の特異的抗体に関して修正して、例５の手順 により得た抗−ＩｇＧポリクロナール抗体であった。５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　 ５臨床アナライザーも用いた。

液体媒質中で抗体と血清サンプルを一緒にした後、実質的にすぐキュベツト液体 媒質濁度の時間とともに、実質的に直線的に変化する速度が検出された。キュベ ツト溶液濁度は、キュベツト中の液体媒質へのＩｇＧ含有未希釈血清サンプルの アリコートの添加後時間０〜時時間中＋２４で読み取れた。

ＩｇＧ検量と回帰分析は、既知量のＩｇＧを用いた適当なカリブレーク−を使用 してそれぞれ例３および４でのゲンタマイシンについて記載したようにして行な った。ＩｇＧ回帰曲線について、５７人の患者の血清ＩｇＧレベルを、同じ５７ のサンプルに対しＡｒｒａｙ　測定器と初期速度方法の両方により測定した。回 帰線への初期速度比濁方法により検定されたＩｇＧ値の近接は、本発明の高い精 度と信頼性とを示した。

立上１ （ＩｇＡの検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、未希釈血清サンプル中のＩｇＡの検出と定量 を行なった。使用した抗体は、所望の特異的抗体に対して変形して、例５の手順 により得た抗−ＩｇＡポリクロナール抗体であった。５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　 ５臨床アナライザーも用いた。

液体媒質中で抗体と血清サンプルを一緒にした後、不買的にすぐキュベツト液体 媒質濁度の時間とともに、実質的に直線的に変化する速度が検出された。キュベ ツト溶液濁度は、ＩｇＡ含有未希釈血清サンプルのアリコートの添加後時間０〜 時時間中＋２４で読み取れた。

ＩｇＡ検量と回帰分析は、既知量のＩｇＡを用いた適当なカリブレーターを使用 してそれぞれ例３および４でのゲンタマイシンについて記載したようにして行な った。ＩｇＡ回帰曲線について、５４−人の患者の血１１１ＩｇＡレベルを、同 じ５４のサンプルに対しＡｒｒａｙｉ１１Ｉ定器と初期速度方法の両方により測 定した。回帰線への初期速度比濁方法により検定されたＩｇＡ値の近接は、本発 明の高い精度と信頼性とを示した。

…ユ」− （Ｃ３の検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、未希釈血清サンプル中のたんばく質補体Ｃ３ の検出と定量を行なった。使用した抗体は、所望の特異的抗体に対して変形して 、例５の手順により得た抗−Ｃ３ポリクロナ一ル抗体であった。５ｙｎｃｈｒｏ ｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーも用いた。

液体媒質中で抗体と血清サンプルを一緒にした後、キュベツト液体媒質濁度の時 間とともに、実質的に直線的に変化する速度が検出された。キュベツト溶液濁度 は、Ｃ３含有未希釈血清サンプルのアリコートの添加後時間０〜時間０＋２４秒 で読み取れた。

Ｃ３検量と回帰分析は、既知量の０３を用いた適当なカリブレーターを使用して それぞれ例３および４でのゲンタマイシンについて記載したようにして行なった 。Ｃ３回帰曲線について、１０２人の患者の血清０３レベルを、同じ１０２のサ ンプルに対しＡｒｒａ７測定器と初期速度方法の両方により測定した。回帰線へ の初期速度比濁方法により検定されたＣ３値の近接は、本発明の高い精度と信頼 性とを示した。

立上１ （Ｃ４の検出と定量） 初期速度比濁免疫検定方法により、未希釈血清サンプル中のたんば（質補体Ｃ４ の検出と定量を行なった。使用した抗体は、所望の特異的抗体に対して変形して 、例５の手順により得た抗−Ｃ４ポリクロナール抗体であった。５ｙｎｃｈｒｏ ｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーも用いた。

液体媒質中で抗体と血清サンプルを一緒にした後、実賀上すぐキュベツト液体媒 質濁度の時間とともに、実質的に直線的に変化する速度が検出された。キュベツ ト溶液濁度は、Ｃ４含有未希釈血清サンプルのアリコートの添加後時間Ｏ〜時時 間中＋２４で読み取れたＣ４検量と回帰分析は、既知量の０４を用いた適当なカ リブレーク−を使用してそれぞれ例３および４でのゲンタマイシンについて記載 したようにして行なった。Ｃ４回帰曲線について、９９人の患者の血清Ｃ４レベ ルを、同じ９９のサンプルに対しＡｒｒａｙ　測定器と初期速度方法の両方によ り測定した。回帰線への初期速度比濁方法により検定されたＣ４値の近接は、本 発明の高い精度と信頼性とを示した。

多数の他の被検体が、開示した初期速度方法により検出され、定量された。これ らの追加の被検体は、トランスフェリン、フェニトイン（シランチン（ｄｉｌａ ｎｔｉｎ））、ＣＲＰ、トブラマイシン、カルバメザピ：／　（ｃａｒｂａｍｅ ｚａｐｉｎｅ）　、：ｌカイン、アンフェタミン、メタアンフェタミン、リウマ トイド因子および抗−ストレプトリシン−〇を含む。

これらの被検体のそれぞれにより、液体媒質中で抗−被検体抗体と血清サンプル とを一緒にすると、または、液体媒質中で抗−被検体抗体と被検体−接合体とを 一緒にすると、キュベツト液体媒質濁度の時間とともに本質的に直接的で、実質 的に比例して変化する速度が起こった。この実質的に一定のオーバータイム初期 速度信号は、次に、５ｙｎｃｈｒｏｎ　ＣＸ　５臨床アナライザーを用いて検出 された。このように、本発明の初期速度方法は、広範囲の被検体を迅速にかつ正 確に検出し定量するために使用された。

本明細書に開示した初期速度測光免疫検定方法は、多くの利点を有し、以下にそ のいくつかを示す： １、初期速度方法は、既存の速度方法または終点測光方法よりも、測光特性の変 化の初期速度が検知されるのでより速い。

２、初期速度方法は、既存の速度方法または終点測光方法同様に精確であり、終 点方法とは異なり、初期速度方法は、未希釈生理学的流体サンプルを終点方法で 用いたとき得られる広範囲な干渉信号を生じない。

３、初期速度方法は、血清、尿または脳を髄液などのような生理学的流体の未希 釈サンプルに実施できる。

４、初期速度方法は、時間に実質的に比例する初期速度信号の検出を可能とする ので、被検体の検出と定量とを有意的に簡素化する５、初期速度方法は、測光的 に検出可能な免疫沈降反応の開始と本質的に直接的に、時間に実質的に比例する 初期速度信号の検出を可能とし、被検体含有サンプル分析を有意的に促進する。

６、初期速度方法は、非常に鋭敏であり、生理学的流体０．ｉｎ１当たり少なく とも約０．１μｇの濃度の被検体を検出できる。

７　初期速度方法は、多様な生理学的流体中での、広い範囲の生物学的な分子、 例えば、ハブテン、毒素、抗原、ペプチドホルモン、ステロイド、ビタミン、薬 剤（治療薬剤および悪用薬剤）および代謝物およびその誘導体の検出と定量に容 易に適用できる。

本発明を、ある好ましい方法に関して詳述したが、本発明の範囲に入る他の実施 態様、変形、変更が、可能である。例えば、広範囲の接合体が、ハブテン−被検 体検出に用いることができ、特定の緩衝液−希釈剤組み合わせおよび液体媒質添 加剤濃度が、関与する被検体の性質にしたがって、容易に最適化される。

さらに、初期速度発明は、多数の追加の特異的被検体例えばピリミドン、エトス クシミド、リドカイン、バンコマイシン、アセトアミノフェノンおよびカンナビ ノール化合物（テトラヒドロカンナビノールを含む）を検出し定量するのに使用 され得る。したがって、次の請求の範囲と精神は、上記の好ましい例の記載に限 定されるべきでない。

θ　ＪＯθ　３θθ！２０　／≦Ｊ　／ｌθ時間（秒） ゲンタミシン（ｕｇ／ｍ１） ゲンタミシン（ｕｇ／ｍ１） ＦＰＩＡによる 時間（秒） ＩｇＭ　（ｕｇ／ｍ１） ＡＲＲＡＹによる θ　〃θ　〃θ３１’（Ｈ亮　１１Ｚ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．被検体の検出のための初期速度測光方法において：（ａ）液体媒質中で、 （ｉ）被検体を含むサンプル、及び （ｉｉ）被検体に対する特異的結合パートナーを一緒にする工程、 （ｂ）液体媒質中で測光的に検出可能な免疫沈降反応を開始させる開始工程、及 び （ｃ）被検体を （ｉ）開始工程で始まり開始工程の始まりから約６０秒で終わる期間内に液体媒 質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始める工程、及び （ｉｉ）開始工程で始まり開始工程の始まりから約５分で終わる期間内に液体媒 質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工程 により検出する工程 の各工程を含むことを特徴とする被検体の検出のための初期速度測光方法。 ２．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始める工程が 、開始工程で始まり開始工程の始まりから約４０秒で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ３．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始める工程が 、開始工程で始まり開始工程の始まりから約３０秒で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ４．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始める工程が 、開始工程で始まり開始工程の始まりから約２０秒で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ５．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始める工程が 、開始工程で始まり開始工程の始まりから約１０秒で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ６．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工程 が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約４分で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ７．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工程 が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約３分で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ８．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工程 が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約２分で終わる期間内におこる請求 項１の方法。 ９．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工程 が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約６０秒で終わる期間内におこる請 求項１の方法。 １０．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工 程が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約５０秒で終わる期間内におこる 請求項１の方法。 １１．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工 程が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約４０秒で終わる期間内におこる 請求項１の方法。 １２．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工 程が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約３０秒で終わる期間内におこる 請求項１の方法。 １３．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を終了する工 程が、開始工程で始まり開始工程の始まりから約２０秒で終わる期間内におこる 請求項１の方法。 １４．被検体に対する特異的な結合パートナーが、ポリクロナール抗体とモノク ロナール抗体とからなる群から選択される請求項１の方法。 １５．開始工程が、被検体一接合体を液体媒質に加えることにより行なわれ、か つ、被検体と被検体一接合体の両方が、特異的結合パートナーに結合し得る請求 項１の方法。 １６．特異的結合パートナーと被検体一接合体とが、液体媒質中で、約１．２： １より大きく約１０：１以下の比で一緒にされる請求項１５の方法。 １７．特異的結合パートナーと被検体とが、液体媒質中で、少なくとも約１．２ ：１の比で一緒にされる請求項１の方法。 １８．液体媒質が、免疫沈降反応の速度の制御を促進し得る添加剤を含んでなる 請求項１の方法。 １９．サンプルが、未希釈の生理学的流体である請求項１の方法。 ２０．被検体が、薬剤、毒素、抗原、ペプチドホルモン、ステロイド、ビタミン 、たんぱく質、それらの代謝物およびそれらの誘導体からなる群から選択される 請求項１の方法。 ２１．被検体を検出する初期速度測光方法において：（ａ）液体媒質中で、 （ｉ）被検体含有生理学的流体の未希釈サンプル、及び（ｉｉ）被検体に対する 特異的結合パートナーを一緒にする工程、 （ｂ）液体媒質中で測光的に検出可能な免疫沈降反応を開始させる開始工程、 （ｃ）液体媒質に光を照射する工程、 （ｄ）開始工程で始まり開始工程の始まりから約６０秒で終わる期間内で、液体 媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出を始めて次に終わらせる ことにより被検体を検出する工程、（ｅ）生理学的流体の単位体積あたりに存在 する被検体の量を定量する工程 の各工程を含むことを特徴とする被検体を検出する初期速度測光方法。 ２２．液体媒質の測光特性の変化の実質的に一定な初期速度の検出の始まりが、 開始工程で始まり開始工程の始まりから約２０秒で終わる期間内おこる請求項２ １の方法。 ２３．開始工程が、被検体一接合体を液体媒質に加えることにより始められ、か つ、被検体と被検体一接合体の両方が、特異的結合パートナーに結合し得る請求 項２１の方法。 ２４．（１）光源、および （２）光検出器 を含む適当な光度計により被検体を検出する初期速度測光方法において、 該方法が： （ａ）光源の前に光検出器を配置して、光源と光検出器とが実質的に同じ軸線に 沿って整合するようにする配置工程、（ｂ）光検出器と光源との間に実質的に光 学的に透明な容器を設置する工程、 （ｃ）容器の中の液体媒質中で、 （Ａ）被検体を含む未希釈の生理学的流体のサンプル、及び（Ｂ）過剰の抗被検 体抗体 を一緒にする工程、 （ｄ）液体媒質中で測光的に検出可能な免疫沈降反応を開始させる開始工程、 （ｅ）光源からの適当な波長の光で、容器の中の液体媒質を照射する照射工程、 （ｆ）開始工程（ｄ）の開始後約２０秒以内の第１回目で光検出器により液体媒 質の増加する比濁度の実質的に一定な速度を検出する検出工程、 （ｇ）開始工程（ｄ）の開始後約６０秒未満の第２回目の遅い回で照射工程（ｅ ）と検出工程（ｆ）とを繰り返す工程、（ｈ）第１回目から第２回目の遅い回ま での液体媒質の比濁度の変化を測定する工程、 （ｉ）被検体を検出する工程、および （ｊ）第１回目から第２回目の遅い回までの液体媒質の比濁度の変化から未希釈 の生理学的流体の単位体積当りに存在する被検体の量を定量する工程 の各工程を含むことを特徴とする適当な光度計により被検体を検出する初期速度 測光方法。