MXPA06009204A - Metodo para la determinacion de la formacion de endotelinas para propositos de diagnostico medico yanticuerpos y estuches para llevar a cabo dicho metodo - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para la determinación de la formación de endotelinas en enfermedades graves, en particular, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, septicemia y cáncer en sangre entera, plasma o suero de un paciente humano para propósitos de diagnóstico médico, en el que fragmentos de péptidos relativamente duraderos de las preproópro-endotelinas primarias procesadas se determinan, que no contienen ni la endotelina biológicamente activa real ni su precursor directo, al big-endotelina, en particular, un fragmento de péptido C-terminal.

Description

MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DE ENDOTELINAS PARA PROPÓSITOS DE DIAGNOSTICO MEDICO Y ANTICUERPOS Y ESTUCHES PARA LLEVAR A CABO DICHO MÉTODO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a métodos para la determinación de la formación de endotelinas en enfermedades graves mediante la determinación de fragmentos de péptidos de la correspondiente pro-endotelina, en particular un péptido parc- cialC-terminal de prepro-endotelina-1 de relativamente larga vida, en la circulación (sangre entera, plasma o suero) para propósitos de diagnóstico médico, en particular en la diagnosis de sepsis, cardiaca y, por ejemplo, también en la diagnosis de cáncer y/o generalmente en la diagnosis de condiciones patológicas en las que las endotelinas juegan un papel importante para el curso de la enfermedad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cuando dentro del marco de la presente solicitud se habla simplemente de "endotelina" , este término se refiere fundamentalmente a la endotelina-1 (ET-1) . Sin embargo, con frecuencia es válida la misma expresión para otras isoformas de las endotelinas, motivo por el cual a menudo no parece necesario hacer una limitación a endotelina-1 y la invención puede extenderse, en un sentido más amplio, a otras endotelinas . En la presente descripción, el término "diagnóstico" se utiliza básicamente como un término general simplificado que en especial incluye también pronóstico/pronóstico precoz y controles de seguimiento acompañantes a los tratamientos . Las determinaciones se realizan en particular por medio de métodos específicos de inmunodiagnóstico, especialmente por medio de inmunoensayo de un tipo en el que se trabaja co-mo mínimo con un anticuerpo marcado (ensayo sandwich; ensayo competitivo, por ejemplo según el principio de SPALT o de SPART) . La Endotelina-1 (ET-1) , un péptido que contiene 21 aminoácidos, es el vasoconstrictor más potente conocido. Desde que Yanagisawa et al. [27; las indicaciones numéricas en corchetes se refieren a la lista de bibliografía adjunta] lo descubrieran en 1988 se ha estudiado ampliamente su biosíntesis, modo de acción y asociación con enfermedades, y se han recopilado en artículos de revisión actuales [1, 7, 12, 17, 24] . Existen tres isoformas de endotelina (endotelina-1, en-dotelina-2 y endotelina-3) codificadas por distintos genes, estando la endotelina-1 en las mayores concentraciones y siendo la más activa. La endotelina-1 se sintetiza en las células endoteliales, en los pulmones, en el corazón, en los riñones y en el cerebro. El producto primario de traducción del gen de la endotelina-1 humana es un péptido que comprende 212 aminoácidos, prepro-endotelina-1 (SEQ ID NO : 1) . En el proceso de secreción, una secuencia señal N-terminal corta (aminoácidos 1-17) de la prepro-endotelina se remueve mediante la peptidasa señal. La pro-endotelina obtenida es procesada a continuación por la proteasa furina en los pares de aminoácidos dibásicos para dar un péptido biológicamente inactivo que comprende 38 aminoácidos, la big-endotelina (SEQ ID ?O: 3), desde la que finalmente se forma la endotelina-1 (SQ ID ?O : 2) madura, biológicamente activa mediante enzimas convertidoras de endotelina (ECEs) . La endotelina actúa fijándose en receptores específicos, localizados en células musculares, miocitos y fibroblastos. Es-te enlace conduce al eflujo de calcio, la activación de fosfolipasa C y la inhibición de la Na/K ATPasa. Además del efecto vasoconstrictor, la endotelina tiene también propiedades reguladoras del crecimiento. A la vista de los numerosos e importantes efectos fi-siológicos, demostrados y supuestos, de las endotelinas, en especial de la endotelina-1, desde el momento de su identificación se desarrollaron diversos ensayos destinados a su determinación inmunodiagnóstica y se han utilizado en las mediciones de endotelina (s) , en especial en plasmas humanos. Los resultados de las determinaciones de este tipo son objeto de numerosas publicaciones. Se han descrito para diversos cuadros patológicos aumentos en las concentraciones de endotelina-1 y big- endotelina en plasma [17] . Entre ellos se incluyen enfermedades cardiovasculares [1] (entre otras, hipertensión pulmonar [21] , aterosclerosis [13] , insuficiencia cardiaca congestiva [25] , infarto de miocardio [20] ) , septicemia y shock séptico [11, 22, 23], cáncer [2, 3, 15, 18], etc. Los inmunoensayos utilizados para las mediciones de las endotelinas en muestras de plasma (véase revisión en [17] ) pertenecían en especial al tipo de los radioinmunoensayos (con endotelina-1 marcada como competidor) o al tipo EIA/ELISA y se dirigían exclusivamente a la determinación de la endotelina o a la determinación de una inmunorreactividad de la endotelina. Los ensayos del tipo RÍA señalan una especificidad menor y registran también los péptidos relacionados que contienen la secuencia de la endotelina. No obstante, se estableció que la endotelina-1 (ET-1) presenta una permanencia extremadamente corta en la circulación y que ya al cabo de 1-2 minutos se elimina del sistema circulatorio [6] . Ya que se considera que la endotelina-1 en sangre y plasma [6] es estable, como razón más importante para la breve permanencia se contempla su distribución en otros tejidos y su fijación a los receptores, que es rápida y altamente afín. Por consiguiente, en determinados tejidos y fluidos corporales pudieron determinarse concentraciones de endotelina-1 claramente superiores a, como por ejemplo, en el plasma [1, 7] . La validez de la determinación de ET-1 en las muestras de plasma se puso en duda a la vista de estas circunstancias [17] . Hay que suponer que para los efectos fisiológicos de la endotelina (ET-1) no son importantes las concentraciones de ET-1 determinadas de manera instantánea en una muestra de plasma, y que en ciertas circunstancias sólo se reflejan en un estado transitorio, sino que tiene una relevancia mucho mayor la suma de todas las concentraciones de ET-1 libres y ligadas que existen en el organismo, como por ejemplo las fisiológicas ligadas a tejidos y receptores. La determinación del precursor de la ET-1, la llamada big-endotelina ("big ET-1"; SEQ ID N0:3) presenta frente a la determinación de ET-1 la ventaja de que la permanencia de "big-ET-1" en la circulación es claramente superior a la de ET-1 liberada. En una serie de análisis se determinó por lo tanto esta "big-endotelina" en lugar de la auténtica endotelina. Para su determinación específica se emplearon en especial ensayos de tipo sandwich que permiten distinguir con seguridad la big-endotelina-1 de la ET-1 procesada y otras endotelinas [4, 8, 10] . Mostraron que en caso de determinadas enfermedades el aumento de las inmunorreactividades de ET medidas pueden atribuirse a big-ET. La medición selectiva de la big-ET-1 constituye sólo una mejora gradual, aunque no una solución real del problema, puesto que también la big-endotelina puede procesarse rápidamente en la circulación sanguínea para dar endotelina [1, 5, 9] . Tiene igualmente un período de vida media biológica relativamente corto (20-25 minutos) [10] y, por consiguiente, un valor de medición para la big-endoteliina determinable en plasma representa igualmente sólo una concentración instantánea en plasma y no refleja las concentraciones reales fisiológicamente eficaces de endotelina. Bajo las condiciones de una enfermedad, la ET-1 formada fisiológicamente pero ya procesada y fijada en tejidos o a receptores, no resulta detec-tada en la determinación de big-ET-1 en plasma. Por consiguiente, la cantidad total de endotelina fisiológicamente activa es infravalorada también en una medición de big-endotelina. El ensayo de una medición específica complementaria del fragmento de péptido C-terminal de la big-ET-1 (con los aminoácidos 74-90 de la prepro-endotelina o los aminoácidos 20-38 de la big-endotelina) formando junto a ET-1 en la disociación enzimática de la big-ET-1 dio que este péptido es todavía menos estable que ET-1 y, por consiguiente, no es adecuado para mediciones [10] .

Para la determinación de regiones de la pro-endotelina fuera de la big-endotelina, del estado actual de la técnica se conoce únicamente una prueba competitiva comercial (región N-terminal 18-50, se obtiene comercialmente en Phoenix Phar-maceuticals; aplicación para el diagnóstico de septicemia descrita en O00/22439) . Sobre la estabilidad y la naturaleza de los análisis medidos con este ensayo no se han publicado informaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene como objetivo desarrollar un método de determinación que refleje de manera más fidedigna las determinaciones convencionales de ET o big-ET en plasma, la formación endógena de big-endotelina y endotelina, es decir, toda la concentración fisiológica y con ello el efecto de la endotelina. Un procedimiento de este tipo debe ser válido y apto para las rutinas y debe poder facilitar valores confiables para la producción fisiológica de ET (ET-1) y/o sus precurso-res en distintos estados patológicos en los que los valores elevados de endotelina desempeñen un cierto papel. Este objetivo se consigue haciendo que con fines diagnósticos no se determine ET o big-ET en una muestra de sangre entera, plasma o suero de un paciente humano, sino en un péptido parcial de preproendotelina o proendotelina de duración comparable que no contiene las secuencias ET o big-ET, en especial un péptido parcial C-terminal que contiene como mínimo los aminoácidos 168-212 de la preproET-1. La reivindicación 1 se refiere a la teoría de la presente invención. En las restantes reivindicaciones se describen modalidades ventajosas y actualmente preferidas de la invención. La invención se- basa en estudios experimentales del so- licitante en los que se ha demostrado que las partes de la prepro-endotelina que no constituyen precursores directos de la endotelina comprenden péptidos duraderos adecuados para fines de medición, que pueden medirse en muestras de sangre de manera confiable y con un elevado valor clínico. La endotelina-1 se forma fisiológicamente mediante el proceso de la prepro-endotelina (SEQ ID N0 : 1) , molécula precursora de mayor tamaño, o de la pro-endotelina secretada que se obtiene de ella. En un proceso de este tipo, en adición a la big-endotelina (y de ahí en-dotelina) , aparecen en cantidades estequiométricas primarias otros péptidos que sin embargo, hasta la fecha, no han sido nunca objeto de estudios científicos y sobre cuyo posible posterior procesamiento y su estabilidad nada se sabe. Al comienzo de los estudios del solicitante existía la esperanza de que pudiera demostrarse que se encontraría como mínimo uno de los hipotéticos productos adicionales de la disociación del péptido en muestras de sangre (muestras de sangre entera, plasma o suero) , y que resultaría ser relativamente estable, y por consiguiente podría ser adecuado para servir de medida de la formación fisiológica de endotelinas, independientemente de una concentración actual de endotelina medible en el plasma. La medición de un producto de disociación de este tipo podría representar así el método buscado para determinar la producción o concentración fisiológica de endotelina, que en las reivindicaciones se designa como determinación de la "formación de endotelinas" . Con este concepto se señala que -bajo el supuesto de sólo una vía de formación, la única cono-cida, de la endotelina-1 a partir de prepro-endotelina - las concentraciones fisiológicas de la endotelina-1 formadas en relación con una enfermedad podrían corresponder sólo a la cantidad de la prepro-endotelina o pro-endotelina previamente procesadas. Si los péptidos parciales formados en adición a la big-endotelina o la endotelina en la misma concentración estequiométrica representan "residuos metabólicos" estables, que no están ligados a receptores ni distribuidos en tejidos, deberán estar presentes en la circulación. Por consiguiente, sin querer implicar necesariamente un determinado mecanismo fisiológico, la "determinación/medición de la formación de endotelinas" puede considerarse también como medición de la "actividad secretora" o la "producción secretora de pro- endotelina" . En esta solicitud, los fragmentos de péptido que hay que determinar se designan como "duraderos" . Con este concepto quiere decirse que el tiempo de permanencia en la circulación (en la sangre entera) del fragmento de péptido que hay que determinar es considerablemente mayor que el de la endo- telina o de los fragmentos de big-endotelina. Con "duradero" quiere decirse en especial que los fragmentos de péptido de este tipo en la sangre entera o un plasma obtenido de ella no experimentan una disociación proteolítica rápida adicional y, en comparación con la velocidad del enlace de la endotelina a los receptores y de la disociación proteolítica de fragmentos disociables, se eliminan de la circulación o del metabolismo con una velocidad claramente menor. Debido a la citada mayor estabilidad o "duración" , en presencia de fragmentos de este tipo la información acerca de las actividades secretoras que ya han transcurrido se almacena durante un período que es apropiado, como mínimo, para una medición no problemática. Si se supone por ejemplo que el precursor de la endotelina se libera en el sentido de una secreción única, la cantidad medible de fragmentos "duraderos" equivale después de un tiempo determinado a la cantidad originalmente secretada, menos una cantidad que va ligada al período de vida media fisiológico en la circulación del fragmento de péptido que hay que medir. Por otro lado, si se su-pone, por ejemplo, una producción más o menos continua del precursor de endotelina durante el proceso patológico, la producción fisiológica previa del precursor se refleja en forma acumulativa en la concentración medible de un fragmento de péptido que es duradero, como se indica en el sentido an-terior y se reduce sólo por la reducción de la concentración del fragmento del péptido que tiene lugar en el mismo período, conforme a su velocidad de eliminación fisiológica. La endotelina activa, o su precursor la big-endotelina, pueden haberse procesado o retirado de la circulación en el mismo período y, por ejemplo, estar ligadas a receptores y por lo tanto no poderse medir. Cuanto más duradero es un fragmento de péptido, o menor es su velocidad de eliminación, menor es la influencia del tiempo de medición sobre el grado de corrección en la determinación de la "formación" antes citada de un biomarcador, es decir, de la endotelina. Una concentración constante durante un período prolongado significa en este contexto que la formación y la eliminación se mantienen equilibradas. Si disminuye la concentración, esto puede significar que ha cesado la secreción de la molécula precursora (por ejemplo de la proendotelina) , por ejemplo porque se han agotado las reservas moleculares, y los cambios de concentración observados sólo pueden determinarse mediante la velocidad de eliminación. Los resultados de la medición de un fragmento de péptido duradero sin función fisiológica conocida proporcionan así, tanto cuantitativa como cualitativamente, resultados distintos a los de la medición de un péptido activo de breve duración o su precursor, asimismo relativamente de poca dura-ción. Los estudios del solicitante descritos con más detalle a continuación muestran que el planteamiento antes descrito en el caso de la determinación de la formación de endotelinas proporciona resultados fructíferos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los estudios realizados y los resultados más significativos de estos estudios se explicarán con mayor precisión a continuación , tomando como referencia las figuras. La Figura 1 muestra una curva estándar típica para un Ensayo sandwich actualmente preferido, y descrito con más precisión en la parte experimental, con dos anticuerpos que se fijan a secuencias de aminoácidos que corresponden a las posiciones 168-181 y 200-212 de la prepro-endotelina-1, para determinar una secuencia de péptidos de pro-endotelina C-terminal en plasma humano; La Figura 2 es un diagrama que muestra que al almacenar muestras de plasma-EDTA de pacientes septicémicos y cardiológicos a temperatura ambiente durante más de 12 horas, no se produce ninguna pérdida apreciable de la inmunorreactividad en un ensayo según la Figura 1; La Figura 3a muestra la medición de plasmas de 5 grupos de pacientes humanos con distintas enfermedades/diagnósticos, comparado con las mediciones de personas sanas en ese momento; la línea de puntos muestra el máximo valor encontrado en personas sanas (línea para 100% de especificidad, referida a controles sa- nos) ; La Figura 3b es un diagrama equivalente al de la Figura 3a para otros cuatro grupos de plasmas de pacientes. El método según la invención se refiere en su aspecto general a la determinación de un fragmento de péptido durade-ro de la pro-endotelina-1, que no contiene las secuencias de aminoácidos de la endotelina-1 o de su precursor la big-endotelina, en muestras de sangre entera, plasma o suero, es decir, en la circulación en pacientes, para la determinación indirecta de la formación de endotelinas, en especial de en- dotelina-1, en caso de enfermedades graves. Según una modalidad preferida, el fragmento de péptido determinado es un fragmento C-terminal al que se fijan dos anticuerpos que se fijan a secuencias de aminoácidos que equivalen a las posi- ciones 168-181 y 200-212 de la prepro-endotelina-1. Para la realización práctica de la invención se prevén de manera especialmente preferida ensayos sandwich no competitivos, por ejemplo del tipo que se ha utilizado para los estudios más profundos y que se describirán a continuación con mayor precisión. Los inmunoensayos sandwich no competitivos (inmunoensayos de dos lados) tienen una serie de ventajas frente a los inmunoensayos competitivos, entre las que se incluye que pueden prepararse mejor como ensayos en fase sólida (ensayos heterogéneos) , que pueden ser más robustos en su -manejo, que pueden proporcionar resultados de medición de una sensibilidad más alta y que son más apropiados para una automatización y una medición en serie. Además, en comparación con los inmunoensayos competitivos, que funcionan con un tipo de anti-cuerpos, pueden proporcionar también explicaciones adicionales, al reconocer los inmunoensayos sandwich sólo aquellas moléculas o péptidos en los que existen en la misma molécula los dos lugares de fijación para los anticuerpos utilizados en la formación de tipo sandwich.

Los anticuerpos utilizados pueden ser fundamentalmente cualquier anticuerpo monoclonal y/o policlonal apropiado, aunque actualmente se prefieren anticuerpos policlonales purificados por afinidad. Se obtienen los anticuerpos de manera especialmente preferida mediante la inmunización de un animal, en especial ovejas, con un antígeno que contiene una secuencia de péptidos sintética, que equivale a una secuencia de aminoácidos corta de la prepro-endotelina-1 y presenta un residuo adicio-nal de cisteína en el extremo N. En la parte experimental siguiente se describen en especial anticuerpos, que se fijan a las secuencias de aminoácidos 161-181 y 200-212, o su utilización en un ensayo. No obstante, dentro del marco de los estudios se utilizaron también anticuerpos adicionales que se fijan de manera correspondiente a las posiciones 184-203 y 136-148. Los resultados complementarios obtenidos con estos anticuerpos adicionales en las mediciones se discuten en esta solicitud sólo de manera global. En una modalidad preferida el método se realiza como inmunoensayo sandwich heterogéneo, en el que uno de los anticuerpos se inmoviliza en una fase sólida cualquiera, por ejemplo en las paredes de tubos de ensayo revestidas (por ejemplo de poliestireno; "Coated Tubes"; CT) o en placas de microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o en partícu- las, por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro anticuerpo lleva un residuo que constituye una etiqueta o permite una unión selectiva con una etiqueta y sirve para la detección de las estructuras sandwich formadas. También es posible una inmovilización posterior o retrasada utilizando las fases sólidas adecuadas. Básicamente pueden aplicarse todas las técnicas de mareaje utilizadas en los ensayos del tipo descrito, entre las que se incluyen mareajes con radioisótopos, enzimas y etiquetas de fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminis- cencia y mareajes cromáticos detectables ópticamente de manera directa, como por ejemplo átomos de oro y partículas de colorante, como los que se utilizan en especial para los llamados Point-of-Care (POC) o pruebas aceleradas para la deter-minación en muestras de sangre entera. En el caso de los inmunoensayos sandwich heterogéneos, los dos anticuerpos pueden presentar también partes de un sistema de detección del tipo descrito a continuación en relación con los ensayos homogéneos . Está también dentro del alcance de la presente invención configurar el procedimiento según la invención como una prueba acelerada. El método según la invención puede configurarse además como un método homogéneo, en el que los complejos sandwich formados por los dos anticuerpos y el fragmento de péptido que hay que detectar permanecen suspendidos en la fase líquida. En un caso de este tipo se prefiere marcar ambos anticuerpos con partes de un sistema de detección que entonces, cuando ambos anticuerpos se integran en un único sandwich, permite generar o desencadenar una señal. Las técnicas de este tipo pueden diseñarse en especial como ensayos de detección por intensificación o atenuación de la fluorescencia. Un método de este tipo especialmente preferido se refiere a la utilización de reactivos detectores que deben utilizarse por pares, tal como se describen por ejemplo en los documentos US-A-4 822 733, EP-B1-180 492 ó EP-B1-539 477 y el arte previo de la técnica allí descrito. Permiten, directamente en la mezcla de reacción, una medición que registra selectivamente sólo productos de reacción que contienen ambos componentes de mareaje en un único inmunocomplejo. Como ejemplo puede remitirse a la tecnología ofrecida bajo las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) o KRYPTOR®, que implementan lo descrito en las solicitudes antes mencionadas. En los estudios del solicitante se demostró que la determinación según la invención del fragmento de péptido C-terminal de la prepro-endotelina-1 proporciona resultados de medición muy interesantes y relevantes . Esta afirmación es válida, tal como se mostrará a continuación, no sólo para el diagnóstico de la septicemia sino también para el diagnóstico cardiaco y el diagnóstico del cáncer. Se asume además que el método de determinación según la invención puede realizarse de manera especialmente ventajosa también dentro del marco de un denominado diagnóstico de parámetros múltiples, y concretamente tanto en el campo del diagnóstico cardiaco como también en el del diagnóstico de la septicemia y del cáncer. Otros parámetros determinados son, por ejemplo, los parámetros cardiacos ANP , B?P, proANP, proADM o proB?P o parámetros septicémicos, que se eligen por ejemplo del grupo formado por anticuerpos antiglangiósidos, las proteínas procalcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B, proteínas S100A, LASP-1, fragmentos solubles de citoqueratina, en especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos solubles de citoquera-tina-1 (sCYlF) , los péptidos inflamina y CHP, otras protohor-monas de péptidos, la glicina-?-acetiltransferasa (G?AT) , la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína C-reactiva (CRP) o fragmentos de las mismas. En los citados ensayos de parámetros múltiples está previsto que los resultados de la medición se determinen para varios parámetros de manera simultánea o paralela y que, por ejemplo, se evalúen con ayuda de un programa informático, que utiliza también correlaciones entre parámetros significativos desde el punto de vista de diagnóstico.

A continuación se explicará con más detalle la invención mediante la descripción de la preparación de los componentes preferidos del ensayo, el método de una modalidad preferida de un ensayo de tipo sandwich y los resultados de la determinación, utilizando un ensayo de este tipo, de un fragmento de péptido C-terminal en plasmas EDTA de personas de control y pacientes de septicemia, cardiacos y de cáncer.

Parte experimental A. Materiales y métodos 1. Síntesis de péptidos Partiendo de la secuencia de aminoácidos conocida de la prepro-endotelina-1 humana (SEQ ID N0.- 1) se seleccionaron tres regiones (Posiciones 168-181, 184-203, 200-212) . Completadas cada una con un resto de cisteína ?-terminal, estas regiones se sintetizaron como péptidos solubles siguiendo procedimientos estándar, se depuraron, se controló su calidad por medio de espectrometría de masas y Cromatografía Líquida de Alto Desempeño (HPLC) de fase inversa y se liofilizaron en alícuotas (empresa JERI?I AG, Berlín, Alemania) . Las secuencias de aminoácidos de los péptidos son: Péptido PCT15 (168-181 + cisteína ?-terminal) CRSSEEHLRQTRSET (SEQ ID ?O:4) Péptido PC 14 (200-212 + cisteína N-terminal) CSRERYVTHNRAH (SEQ ID NO : 5) Péptido P?R20 (184-203 + cisteína ?-terminal) NSVKSSFHDPKLKGKPSRER (SEQ ID NO : 6) Además, como estándar para calibración del ensayo se sintetizó el siguiente péptido: Péptido estándar PS 44 (169-212) SSEEHLRQTRSETMR?SVKSSFHDPKLKGKPSRERYVTH?RAH (SEQ ID NO : 7) 2. Conjugación e inmunización Mediante MBS (m-maleimidobenzoil -N-hidroxisuccinimida éster) se conjugaron los péptidos PCT15 y PCW14 en la proteína portadora KLH (Keyhole limpet hemocyanin) (véanse instrucciones de operación "?HS-Esters-Maleimide Crosslinkers" , em-presa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Con estos conjugados se inmunizaron ovejas según el protocolo siguiente: cada oveja recibió inicialmente 100 µg de conjugado (datos de masa referidas a la fracción de péptido del conjugado) y a continuación durante 4 semanas 50 µg de conjugado (datos de masa re-feridas a la fracción de péptido del conjugado) . Comenzando al cuarto mes después del inicio de la inmunización se tomaron 700 ml de sangre a cada oveja 4 veces por semana y por centrifugación se obtuvo de ella el antisuero. Las conjugaciones, las inmunizaciones y la obtención de antisueros los realizó la empresa MicroPharm, Car arthenshire, Reino Unido. 3. Purificación de anticuerpos En un método de un paso se prepararon anticuerpos específicos del péptido a partir de los antisueros obtenidos a partir del cuarto mes de la inmunización. Para ello se acoplaron primero los péptidos PCT15 y PCW14 a Sulfo-Link Gel (véanse instrucciones de operación "SulfoLink Kit", empresa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Para el acoplamiento se usaron 5 mg de péptido por cada 5 ml de gel . La purificación por afinidad de los anticuerpos específicos del péptido a partir de antisueros de oveja contra ambos péptidos se realizó de la manera siguiente: Primero se lavaron las columnas de péptido tres veces alternativamente con 10 ml de regulador de elución (50 mM ácido cítrico, pH 2.2) y regulador de enlace (100 mM fosfato sódico, 0.1% Tween, pH 6.8) cada vez. 100 ml de antisueros se filtraron a través de 0.2 µm y se mezclaron con el material existente en la columna. Se lavó el gel cuantitativamente con 10 ml de regulador de enlace de la columna. Se incubó durante la noche a temperatura ambiente y con agitación. Los lotes se pasaron cuantitativamente a columnas vacías (NAP 25, Pharmacia, vacías). Se eliminó el material de paso. A continuación se lavaron las columnas con 250 ml de regulador de enlace hasta dejar libre de proteína (contenido de proteína del eluato de lavado < 0.02 A280 nm) . Se añadió regulador de elución a las columnas lavadas y se recolectaron fracciones de 1 ml . De cada fracción se determinó el contenido en proteína por medio del método BCA (véanse instrucciones, empresa PIERCE, Rockford, IL, EE.UU.). Se agruparon las fracciones con concentraciones de proteína > 0,8 mg/ml . Tras la determinación de la proteína del grupo de fracciones mediante el método BCA resultaron rendimientos de 97 mg para el anticuerpo anti-PCT15 0407-pAK y 60 mg para el anticuerpo anti-PC 14 0410-pAK. 4. Mareaje El anticuerpo anti-PCW14 0410~pAK se trató de la si-guíente manera: Mediante una columna de filtración en gel NAP-5 (Pharmacia) , siguiendo las instrucciones de operación se purificaron y volvieron a regular 500 µl del anticuerpo purificado en 1 ml de regulador de fosfato potásico 100 mM (pH 8.0) . La de-terminación de la concentración de proteína de la solución de anticuerpo dio un valor de 1.5 mg/ml. Para el mareaje por quimioluminiscencia del anticuerpo se mezclaron 67 µl de la solución de anticuerpo con 10 µl de MA70 -acridinio-NHS-éster (1 mg/ml; empresa HOECHST Behring) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron después 423 µl de glicina 1 M y se incubó durante otros 10 minutos. A continuación, siguiendo las instrucciones de operación se purificó y volvió a regular el preparado de mareaje mediante una columna de filtración en gel NAP-5 (Pharmacia) en 1 ml de fase móvil A (50 mM fosfato potásico, 100 mM NaCl , pH 7.4) y se liberó de cuatro componentes de bajo peso molecular. Para separar los últimos residuos de etiqueta no ligada al anticuerpo se realizó un HPLC de filtra- ción en gel (columna: Waters Protein Pak SW300) . Se extendió la muestra y se cromatografió con el medio fluyente A a una velocidad de 1 ml/min. con un fotómetro de flujo se midieron las longitudes de onda 280 nm y 368 nm. La proporción de absorción 368 nm/280 nm como medida del grado de mareaje del anticuerpo fue de 0,10 en el pico. Se recogieron las fracciones conteniendo anticuerpos monómeros (tiempo de retención 8-10 min) y se reunieron en 3 ml 100 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl , 5% Bovines Serum Albumin, 0,1% azida sódica, pH 7,4.

. Acoplamiento El anticuerpo anti-PCT15 0407-pAK se trató de la siguiente manera: Tubos de ensayo de poliestireno (empresa Greiner) de 5 ml irradiados se revistieron de anticuerpos purificados de la siguiente manera: el anticuerpo se diluyó en 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.8 hasta una concentración de 6.6 µg/ml. En cada tubo de ensayo se pipetearon 300 µl de esta solución. Los tubos de ensayo se incubaron 20 horas a 22 °C. Se aspiró la so- lución. Se llenó después cada tubo con 4.2 ml de 10 M fosfato sódico, 2% Karion FP, 0.3% Albúmina de Suero Bovino, pH 6.5. Al cabo de 20 horas se aspiró la solución. Por último se secaron los tubos en una estufa de vacío.

B. Realización y valoración del inmunoensayo Se preparó un regulador de ensayo de la siguiente composición: 100 mM fosfato sódico, 150 mM NaCl , 5% Albúmina de Suero Bovino (BSA), 0.1% IgG de oveja no específica, 0.1% azida sódica, pH 7.4. Como material estándar sirvió el péptido sintetizado químicamente (péptido PSW44) antes mencionado, que equivale a las posiciones 169-212 de prepro-endotelina-1. Se le diluyó en serie en suero normal de caballo (empresa SIGMA) . Al estándar así preparado se le asignaron concentraciones conforme al peso de péptido. Las muestras de medición fueron plasmas EDTA de personas aparentemente sanas, de pacientes con septicemia y de pacientes con distintas enfermedades cardiovasculares. Se pipetearon en los tubos 50 µl de estándares o mués- tras y 200 µl de regulador de ensayo. Se incubaron durante dos horas, a 22 °C y con agitación. Después se lavó y dejó gotear 4x con 1 ml de solución de lavado (0.1% Twenn 20) por cada tubo. Se pipetearon después 200 µl de regulador de ensa-yo conteniendo 1 millón de Unidades de Luz Relativa (RLU) del anticuerpo marcado con MA70. Se incubó durante dos horas, a 22 °C y con agitación. Después se lavó y dejó gotear 4x con 1 ml de solución de lavado (0.1% Twenn 20) por cada tubo y en un luminómetro (empresa BERTHOLD, LB952T; reactivos de base BRAHMS AG) se midió la quimioluminiscencia ligada a los tubos . Utilizando el software MultiCalc (Spline Fit) se leyeron las concentraciones de las muestras en la curva estándar.

C. Resultados El analito medible con el inmunoensayo sandwich desarrollado (anticuerpos frente a las posiciones 168-181 y 200-212) se designará a continuación como pro-endotelina-C-terminal o pro-endotelina-Ct . En la Figura 1 se muestra una curva estándar típica para la prueba desarrollada. Con la prueba pueden determinarse concentraciones de pro-endotelina-Ct claramente inferiores a 50 pg/ml. Para verificar la cuestión de si en una medición del fragmento de péptido C-terminal existen problemas debido a una estabilidad insuficiente en una muestra o solución de medición, se midieron 5 plasmas de septicemia en fresco y otro tanto después de un almacenamiento de 12 horas a temperatura ambiente . Los resultados se resumen en la Figura 2. Muestran que tras un almacenamiento de 12 días la inmunorreactividad se mantuvo casi inalterable con aproximadamente un 93% de la inmunorreactividad medida inicialmente. .Esta estabilidad demostrada es una gran ventaja para el diagnóstico desde el punto de vista del manejo. Con la prueba se midieron plasmas de pacientes cardiológicos y septicémicos . Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 3a y 3b. Para todos los cuadros clínicos cardiológicos analizados se encontraron valores elevados comparados con los controles normales . Se encontraron igualmente valores elevados para pacientes con Sín-drome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS) y condiciones sépticas. La sensibilidad del diagnóstico (para especificidad del 100% dada referida a controles sanos) aumentó con el grado de gravedad de la enfermedad: septicemia 32.3%, septicemia grave 65.5% y shock septicémico 75%. Cuando se medían las muestras de un ensayo modificado, en el que uno de los anticuerpos del ensayo sandwich antes indicado se sustituía por un anticuerpo que reconocía los aminoácidos 184-203 de la prepro-endotelina-1, se obtenían, tal como se esperaba, resultados esencialmente idénticos.

Por el contrario, cuando uno de los anticuerpos utilizados reconocía una secuencia de aminoácidos localizada más cercana al término N de la prepro-endotelina (32-52 o 136-148) no se obtenían valores de medición más altos que los de las personas sanas. Esto indica que la pro-endotelina como tal no estaba presente en las muestras de plasma medidas y que no sólo se procesa proteolíticamente formando big-endotelina, sino que la secuencia 93-212 C-terminal liberada se sigue disociando, debiendo haber como mínimo un punto de disociación de este tipo en la región de los aminoácidos 149-167. Esta afirmación es válida para los plasmas de pacientes con las enfermedades estudiadas. No obstante, no puede excluirse que en otros grupos de pacientes, se conserve por ejemplo todo el fragmento 93-212 C-terminal y que su medición selectiva pueda proporcionar resultados diagnósticamente relevantes .

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para determinar la formación de endotelinas en sangre entera, plasma o suero en enferme- dades graves, en particular, cardiovasculares, inflamatorias, septicemia y cáncer en un paciente humano con fines de diagnóstico médico, caracterizado porque se determina la formación de endotelina-1 (SEQ ID NO: 2) y big-endotelina-1 (SEQ ID NO : 3) , y porque se determinan aquellos fragmentos C-terminal de la prepro-endotelina- 1 (SEQ ID ?O: 1) que son reconocidos por los anticuerpos que se fijan a péptidos y que corresponden a las secuencias de péptidos en la región de los aminoácidos 93 a 212 de la prepro-endotelina-1.

2 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la determinación en el líquido biológico se realiza con ayuda de un inmunoensayo que funciona, como mínimo, con un anticuerpo marcado que reconoce específicamente sólo el fragmento de péptido que hay que determinar.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el inmunoensayo es un inmunoensayo competitivo o un inmunoensayo sandwich.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, ca- racterizado porque se determinan aquellos fragmentos C- terminales de la prepro-endotelina-1 que son reconocidos por los anticuerpos que se fijan a péptidos, que corresponden a las secuencias de péptidos en la región de los aminoácidos 168 a 212 (SEQ ID NO: 7) de la pre- pro-endotelina-1.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque para la determinación de un fragmento C-terminal con los aminoácidos 168 a 212 (SEQ ID NO: 7) de la prepro-endotelina-1, se utilizan pares de anticuerpos que se fijan a dos secuencias de péptidos distintas seleccionadas de las secuencias de péptidos con los aminoácidos 168-181, 184-203 y 200-212 de la prepro-endotelina-1.

6 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es un método para la determinación cuantitativa o semicuantitativa de los fragmentos de péptidos que hay que determinar. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es una prueba Point-of-Care (POC) inmunocromatográfica u otra prueba rápida. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7 caracterizado porque los anticuerpos utilizados para la determinación son anticuerpos monoclonales y/o policlonales purificados por afinidad. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque se utilizan an- 5 ticuerpos obtenidos mediante inmunización de un animal con un antígeno que contiene un péptido sintético seleccionado de los péptidos (SEQ ID N0:4) , (SEQ ID N0:5) y (SEQ ID NO : 6) . 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivin-10 dicaciones 4 a 9, caracterizado porque para la determinación se utilizan dos anticuerpos de los cuales uno está marcado y el otro está fijado a una fase sólida o puede fijarse a una fase sólida. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivín-15 dicaciones 4 a 9, caracterizado porque para la determinación se utilizan dos anticuerpos que están dispersos en la mezcla de reacción líquida, estando fijado al primer anticuerpo un primer componente de mareaje que es parte de un sistema de mareaje basado en la amortice? guación o intensificación de la fluorescencia o quimioluminiscencia y al segundo anticuerpo el segundo componente de mareaje de este sistema de mareaje, de tal manera que después de la fijación de ambos anticuerpos al fragmento de péptido que hay que detectar se genera una señal medible que permite una detección en la solución medible del complejo intermedio formado. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el sistema de mareaje comprende cri- patos o quelatos de tierras raras en combinación con un colorante de fluorescencia o quimioluminiscencia, en especial del tipo cianina. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se utiliza para el diagnóstico-, para la determinación del grado de gravedad y para el pronóstico así como para el control acompañante del tratamiento de la septicemia. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque se realiza dentro del marco de una determinación de parámetros múltiples en la que se determina al mismo tiempo como mínimo otro parámetro relevante para el diagnóstico de la septicemia. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el o los parámetros relevantes adi- cionales para el diagnóstico de la septicemia se seleccionan del grupo formado por anticuerpos antigangliósi- do, las proteínas calcitonina, CA 125, CA 19-9, S100B, proteínas S100A, LASP-1, fragmentos solubles de cito- queratina, en especial CYFRA 21, TPS y/o fragmentos so- lubles de citoqueratina-1 (sCYlF) , los péptidos infla- mina y CHP, fragmentos de las prohormonas pro-ANP, pro- BNP o pro-ADM, la glicina-?-aciltransferasa (G?AT) , la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1) y la proteína C- reactiva (CRP) o fragmentos de los mismos. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque se aplica en el campo del diagnóstico cardiaco. 1

7. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se realiza en el marco de una determinación de parámetros múltiples en la que al mismo tiempo se determinan otros parámetros relevantes para el diagnóstico cardiaco. 1

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivin- dicaciones 1 a 12, caracterizado porque se aplica en el campo del diagnóstico de cáncer. 1

9. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se realiza en el marco de una determinación de parámetros múltiples en la que al mismo tiempo se determinan otros parámetros relevantes para el diagnóstico del cáncer. 20. Un anticuerpo que se fija específicamente a péptidos formados por las secuencias de aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 168-181, 184-203 y 200-212 de la prepro-endotelina-1. 21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque son anticuerpos policlonales purificados por afinidad o anticuerpos monoclonales. 22. Un estuche para la realización de un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque comprende al menos: (a) un primer anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, (b) un segundo anticuerpo distinto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 y 21, estando uno de los anticuerpos marcado y el otro anticuerpo inmovilizado o pudiendo ser inmovilizado, y (c) un péptido estándar que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende al menos los aminoáci- dos 168-203 o 168-212 de la prepro-endotelina. 23. El estuche de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el anticuerpo inmovilizado está inmovilizado en las paredes de un tubo de ensayo (CT) .