CN102124340A - IgA肾病的检查方法和检查试剂盒 - Google Patents

IgA肾病的检查方法和检查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肾病的检查方法，该方法包括从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体的复合体检测工序。优选的是，使针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体与来自待测者的尿的试样接触，从而检测所述复合体。本发明的肾病的检查方法的检测灵敏度和特异性良好，能够简便且安全地判断肾病(优选为IgA肾病)。

Description

IgA肾病的检查方法和检查试剂盒
技术领域
本发明涉及IgA肾病的检查方法和检查试剂盒。
背景技术
IgA肾病是1968年由Berger等人描述的疾病，是在除糖尿病性肾病以外的慢性肾小球肾炎中频率最高的肾病(例如，参照非专利文献1)。IgA肾病是长期预后不良的疾病，据推测，需要透析治疗的晚期肾衰竭患者中的约25％的起因疾病为IgA肾病。以往，即使存在延缓IgA肾病的发展的治疗法，也不存在可治愈的治疗法。然而，近年来堀田等人确立了一种若早期开始治疗则可获得完全缓解的治疗法。
另一方面，根据“厚生省特定疾病进行性肾功能衰竭研究班和日本肾脏学会的共同委员会( Joint Committee of the Specified ProgressiveDiseases Investigative Research Division for Progressive
另外，作为IgA肾病的诊断方法，已知有使用IgA-纤连蛋白复合体的方法等(例如，参照日本特开2000-241431号公报、日本专利2592121号公报、Cederholm et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，85：4865-8，1988)，但目前为止还没有已实用化的方法。
发明内容
本发明的课题在于，提供一种检测灵敏度和特异性良好、能够简便且安全地判断IgA肾病的IgA肾病的检查方法以及检查试剂盒。
本发明人等反复深入研究，测定了人尿中的尿调制蛋白和IgA的复合体的检测量，结果发现与健康人或除IgA肾病以外的肾病患者相比，在IgA肾病患者中所述复合体以更高的浓度存在，从而完成了本发明。
即，用于解决上述课题的具体方案如下所述。
本发明的第1方案为一种IgA肾病的检查方法，其包括从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体的复合体检测工序。所述复合体检测工序优选包括：使所述试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触。另外，优选进一步包括如下工序：获得所述复合体检测工序中检测出的所述复合体的检测量相对于来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量的比率，更优选进一步包括基于所述比率来判断是否为IgA肾病的判断工序。
本发明的第2方案为一种肾病的检查方法，其包括从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体的复合体检测工序。所述复合体检测工序优选包括：使所述试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触。
本发明的第3方案为一种IgA肾病的检查方法，其包括以下工序：复合体检测工序，从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体；第1判断工序，基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量、或所述试样中的尿蛋白质量来判断是否为肾病；第2判断工序，基于所述复合体检测工序中检测出的所述复合体的检测量相对于所述尿试样中的尿蛋白质量的比率来判断所述肾病是否为IgA肾病。
所述复合体检测工序优选为使用针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体的免疫化学方法，更优选为夹层法。
本发明的第4方案为一种人尿调制蛋白和人IgA的复合体的检测方法，其包括使来自待测者的尿的试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触的工序。优选的是，利用针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体，通过免疫化学方法检测所述复合体，所述免疫化学方法更优选为夹层法。
另外所述待测者优选为正在发作肾病的人、疑似正在发作肾病的人、或有可能发作肾病的人，所述肾病更优选为IgA肾病。
另外，本发明的第5方案为一种肾病的检查试剂盒，其至少包含针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体。所述肾病优选为IgA肾病。
根据本发明，能够提供一种检测灵敏度和特异性良好、能够简便且安全地判断IgA肾病的IgA肾病的检查方法以及检查试剂盒。
附图说明
图1为通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的分布图。
图2为表示针对通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的ROC分析的结果的图。
图3为将通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的分布图。
图4为表示针对将通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的ROC分析的结果的图。
图5为通过ECL法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的分布图。
图6为表示针对通过ECL法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的ROC分析的结果的图。
图7为将通过ECL法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的分布图。
图8为表示针对将通过ECL法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的ROC分析的结果的图。
图9为表示与anti-IgA结合珠结合的蛋白质的蛋白印迹法(WesternBlotting)分析的结果的图。
图10为通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的分布图。
图11为表示针对通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值的ROC分析的结果的图。
图12为将通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的分布图。
图13为表示针对将通过ELISA法检测的尿中的IgA-尿调制蛋白复合体的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的ROC分析的结果的图。
图14为通过ELISA法检测的尿中的人尿调制蛋白的测定值的分布图。
图15为通过ELISA法检测的尿中的人IgA的测定值的分布图。
图16为表示针对通过ELISA法检测的尿中的人IgA的测定值的ROC分析的结果的图。
图17为将通过ELISA法检测的尿中的人IgA的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的分布图。
图18为表示针对将通过ELISA法检测的尿中的人IgA的测定值修正为单位尿蛋白浓度的值的ROC分析的结果的图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施方式，但这些说明并不限定本发明的范围。
本发明的肾病的检查方法包括从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体的复合体检测工序。通过从所述试样中检测所述复合体，能够以良好的检测灵敏度和良好的特异性检测待测者的肾病。另外，所述肾病包括IgA肾病和除IgA肾病以外的肾病。
本发明中，来自待测者的尿的试样可以是从待测者采集的尿本身，也可以是对采集的尿进行了通常所进行的稀释、浓缩等处理后的试样。本发明中，优选为利用常规方法将由人采集的尿稀释而得的尿试样。
此外，所述来自待测者的尿的试样也可以是使所述尿试样与针对人尿调制蛋白的抗体、或针对人IgA的抗体接触而得的试样。
人尿调制蛋白(以下，有时简称为“尿调制蛋白”)是肾脏来源的分子量为85kd的糖蛋白质。已知尿调制蛋白与IL1、TNF结合，而且作为IL1的抑制剂发挥作用，认为其具有抗炎症作用。此外，已知其在妊娠过程中的尿中大量存在。
另外，已知尿调制蛋白的蛋白质部分与作为正常人的尿中的主要糖蛋白质的TH糖蛋白(Tamm-Horsfall protein)的蛋白质部分相同。然而，关于尿调制蛋白与肾病的关系却一无所知。
需要说明的是，本发明中“人尿调制蛋白”或“尿调制蛋白”包含尿调制蛋白和TH糖蛋白。
对所述复合体的检测方法没有特别限定，可以应用通常使用的蛋白质的检测方法，但优选为能够对所检测的复合体定量或半定量的方法。例如，可列举出使用与所述复合体结合的抗体的方法、离子交换色谱法、质谱等。
本发明中对复合体的检测中使用的装置没有特别限定，可以根据复合体的检测方法适当选择。具体而言，例如可列举出HPLC仪、质谱仪(massspectrometry)、电泳仪(毛细管电泳装置等)、全自动或半自动酶免疫测定仪、比色皿清洗器(cell washer)、全自动或半自动化学发光免疫测定仪、发光测定装置、全自动或半自动电化学发光免疫测定仪、光学测定装置、酶标仪(Plate Reader)、CCD照相机、全自动或半自动荧光免疫测定仪、荧光测定装置、全自动或半自动放射免疫测定仪、液体闪烁计数器、库尔特计数器(Coulter Counter)、表面等离子体测定装置、印迹装置、光密度计等。
本发明中，从检测灵敏度、特异性和简便性的观点出发，优选为使用针对所述复合体的抗体的免疫化学方法。所述针对复合体的抗体只要是能免疫特异性地识别所述复合体并与之结合的抗体，则没有特别限定。例如，可列举出识别所述复合体中的尿调制蛋白与IgA的结合部位并与之结合的抗体、识别所述复合体中的尿调制蛋白并与之结合的抗体、和识别所述复合体中的IgA并与之结合的抗体等。
另外，本说明书中“针对复合体的抗体”是指“识别复合体的抗体”、“与复合体结合的抗体”等抗体中以通常所使用的意义而使用的抗体。即，所述“针对复合体的抗体”与由人尿调制蛋白和人IgA构成的复合体的至少一部分结合，形成新的复合体。以下，关于“针对人尿调制蛋白的抗体”、“针对人IgA的抗体”等也是同样的。
作为本发明中的免疫化学方法，可以没有特别限定地使用通常进行的方法。具体而言，例如可列举出酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法(ECL)、吸光度测定、荧光抗体法、放射免疫测定法(RIA)、表面等离子体共振、蛋白印迹法、斑点印迹(dot blot)法等。本发明中，从检测灵敏度、特异性和简便性的观点出发，优选使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)或电化学发光免疫测定法(ECL)。
作为本发明中的免疫化学方法，从特异性和简便性的观点出发，优选为使用识别所述复合体中的尿调制蛋白并与之结合的抗体、和识别所述复合体中的IgA并与之结合的抗体的夹层法。
所述夹层法例如可以如下进行。将与所述复合体结合的抗体(一次抗体)固定至盘(plate)等载体上。通常，为了堵塞盘等的非特异性结合部位，利用酪蛋白等蛋白质或表面活性剂进行封闭操作。接着，添加来自尿的试样或待测试样并进行孵育。将盘等清洗后，添加作为与所述复合体结合的抗体的、经标记的二次抗体，孵育后，清洗盘等，并检测标记，利用上述方法能够进行所述夹层法。
本发明中，从检测灵敏度和特异性的观点出发，作为所述一次抗体和所述二次抗体，优选使用选自与所述复合体结合的抗体中的2种抗体，更优选使用针对尿调制蛋白的抗体作为所述一次抗体和所述二次抗体中的一种抗体，使用针对人IgA的抗体作为另一种抗体。
本发明中，与所述复合体结合的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但从肾病的检测特异性的观点出发，优选为单克隆抗体。
与所述复合体结合的抗体可以利用通常进行的方法制备。
针对尿调制蛋白的多克隆抗体可以利用通常的制作方法获得，例如可以如下获得。对兔、山羊等动物用尿调制蛋白进行免疫，获得血清。可以通过利用例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱法、偶联了尿调制蛋白的亲和柱等对其进行纯化来制备。
本发明中，优选对尿调制蛋白特异性更高的抗体，其是利用通常进行的方法(例如吸收操作等)从使用人尿调制蛋白制作的抗体中除去了与除尿调制蛋白以外的抗原结合的抗体后的抗体。
另外，针对尿调制蛋白的单克隆抗体可以利用通常的制作方法获得。例如，对小鼠等小动物用尿调制蛋白进行免疫。从该小鼠中取出脾脏，将其研碎分离细胞，利用聚乙二醇等试剂与小鼠骨髓瘤细胞融合。从由此形成的融合细胞(杂交瘤)中选择产生与尿调制蛋白结合的抗体的克隆。接着，将所选择的杂交瘤移植至小鼠腹腔内，从该小鼠中回收腹水。可以通过利用例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换色谱法、偶联了尿调制蛋白的亲和柱等对所得到的单克隆抗体进行纯化来制备。
另外，作为针对尿调制蛋白的抗体，还可以使用市售的抗人TH糖蛋白抗体、抗人尿调制蛋白抗体等。此外，所述针对尿调制蛋白的单克隆抗体也可以是如上述那样得到的来自小鼠等小动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和全人抗体等中任一种。
另外，作为针对人IgA的抗体，只要是能够与所述复合体中的IgA结合的抗体则没有特别限定，可以是识别人IgA的H链、J链、分泌片(secretory component)等中任一种的抗体。
另外，针对人IgA的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，但从复合体的检测特异性的观点出发，优选为针对人IgA的单克隆抗体。
所述针对人IgA的单克隆抗体可以使用人IgA作为抗原，与上述针对尿调制蛋白的抗体同样地进行制备。另外，作为针对人IgA的抗体，还可以使用市售的抗人IgA抗体。此外，所述针对人IgA的单克隆抗体也可以是如上述那样得到的来自小鼠等小动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体、和全人抗体等中任一种。
对所述标记没有特别限定，可以使用公知的标记。例如，可列举出酶、化学发光物质、电化学发光物质、放射性物质等。
本发明中，从检测灵敏度和简便性的观点出发，优选使用酶或电化学发光物质作为所述标记。
作为所述酶，只要是能够利用物理方法、化学方法定量的酶则没有特别限定。例如，可列举出碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(luciferase)等酶。
另外，标记的检测方法只要是能够将标记定量或半定量的检测方法则没有特别限定，可以根据标记适当选择。例如，可列举出吸光度、发光强度、荧光强度、辐射计数等。
可以通过对标记定量或半定量，来对所述复合体定量或半定量。
在通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)利用吸光度检测标记从而进行本发明的复合体检测工序的情况下，作为本发明优选使用的测定所述复合体的检测量的测定装置，可列举出以下吸光度测定装置：该吸光度测定装置能够测定与复合体结合的标记所产生的色素的吸光度，该吸光度测定装置具备：放置含有由标记产生的色素的试样的试样放置部；对所述试样照射光的光照射部；接受来自所述试样的反射光和透射光的至少任一种，并测定所接受的光量的光量测定部。
本发明中，利用所述光照射部，对含有通过与样本(来自待测者的尿的试样)中所含的人尿调制蛋白和人IgA的复合体结合的标记所产生的色素的试样照射光，并利用光量测定部对所述色素的吸光度进行定量化，从而能够测定样本中人尿调制蛋白和人IgA的复合体的存在量。
另外，还可以不测定吸光度，而通过检测来自试样的发光来进行所述标记的检测。该情况下，可以不使用所述吸光度测定装置，而使用与后述的电化学发光免疫测定法中所用的装置相同的装置。
在利用电化学发光免疫测定法(ECL)通过来自试样的发光的测定来检测标记，从而进行本发明的复合体检测工序的情况下，作为本发明优选使用的测定所述复合体的检测量的测定装置，可列举出以下测定装置：该测定装置能够测定由与复合体结合的标记自身或由反应液中的标记的底物发出的光，该测定装置具备：放置含有标记的试样的试样放置部；接受来自所述试样的发光，并测定所接受的光量的光量测定部。
本发明中，利用所述光量测定部，对由含有与样本中所含的人尿调制蛋白和人IgA的复合体结合的标记的试样所发出的光进行定量化，能够测定样本中人尿调制蛋白和人IgA的复合体的存在量。
本发明的肾病的检查方法优选包括判断工序，即，基于所述来自尿的试样中所含的所述复合体的检测量来判断肾病。作为本发明中的所述复合体的检测量，只要是所述来自尿的试样中所含的所述复合体的浓度或与其对应的定量值或半定量值，则可以没有特别限定地使用。例如，可列举出直接测定所述复合体的检测量的测定值、介由标记的检测而间接测定所述复合体的检测量的测定值等。
另外，本发明的肾病的检查方法中，在检查IgA肾病的情况下，用于判断为IgA肾病中的复合体的检测量优选为复合体的检测量相对于来自待测者的尿的试样中的总尿蛋白质量的比率。所述比率既可以是将复合体的检测量的测定值除以来自待测者的尿的试样中的总尿蛋白质量的测定值所得到的值，也可以是以相对于总尿蛋白质量的相对值的形式所得到的复合体的检测量。通过基于该比率进行判断，能够以更高的灵敏度和特异性判断IgA肾病。
另外，测定总尿蛋白质量的来自待测者的尿的试样既可以是从相同的待测者得到的试样，也可以是与用于所述复合体的检测的来自尿的试样不同的试样。
本发明的肾病的检查方法中的判断工序优选包括以下工序：对由来自待测者的尿的试样检测出的尿调制蛋白和人IgA的复合体的检测量、和作为对照的由来自正常人的尿的试样检测出的所述复合体的检测量进行比较的工序；将所述来自待测者的尿的试样中的所述复合体的检测量大于作为对照的来自正常人的尿的试样中的所述复合体的检测量的情况与肾病关联的工序。
此处作为对照的正常人是指预先明确没有发作肾病的个体。另外，检测量大是指，与为了区别正常人和肾病患者而设定的正常检测量(分界值，cut-off value)相比，来自待测者的所述复合体的检测量更大。
所述分界值例如可以通过将来自肾病患者的尿的试样组中的所述复合体的检测量、与作为对照的来自正常体组的尿的试样组中的所述复合体的检测量付之于ROC分析等来进行设定。ROC分析是能够评价例如疾病的检查方法的检测能力、诊断能力的分析方法，是日本临床检查自动化学会会志“临床检查的诊断有用性评价手册”Ver.1.3(2004.9.1)、Vol.29Suppl.1(通卷第154号)(2004年9月1日发行)中记载的分析方法。
另外，分界值例如还可以以在正常人的检测水平的平均值上加上2倍或3倍的标准偏差而得的值的形式来确定，此外，可以适当确定为均衡地满足灵敏度(检测率)和特异性(假阳性率低的程度)的值。
作为本发明中的肾病，例如，可列举出IgA肾病(IgAN)、膜性肾病(MN)、狼疮性肾炎(SLE)、局灶性肾小球硬化症(FGS)、微小病变性肾病综合征(MCNS)、糖尿病性肾病(DMN)、淀粉样变性、遗传性肾病(Alport)、燃尽性IgA肾病(IgA肾病的自然缓解状态)、膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)、与抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)相关的肾炎、薄基底膜肾病(TBMD)、肾硬化症等。
本发明的肾病的检查方法可以通过检测尿中的所述复合体来检测以IgA肾病为首的各种肾病。
本发明的IgA肾病的检查方法的特征在于包括以下工序：从来自待测者的尿的试样中检测尿调制蛋白和人IgA的复合体的复合体检测工序；基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量、或来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量来判断肾病的判断工序；基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量相对于来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量的比率将所述肾病判断为IgA肾病的判断工序。
通过基于所述复合体的检测量相对于来自尿的试样中的总蛋白质量的比率来判断IgA肾病，能够高灵敏度且高特异性地判断IgA肾病，即使在通过治疗介入而得到完全缓解的初期阶段，也能够简便且安全地判断IgA肾病。
本发明中的复合体检测工序与所述肾病的检查方法中的复合体检测工序相同。
另外，尿蛋白质量的检测方法只要能够测定来自尿的试样中的总蛋白质量则没有特别限定，可以应用通常进行的对来自尿的试样的蛋白质进行检测的方法。例如，可以应用金井光正等人著的“临床检查法概要改订版第32版”、173～174页、2005年中记载的方法。
本发明中的第1判断工序中，基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量来判断肾病的工序与所述肾病的检查方法中的判断工序相同。
另外，基于所述来自尿的试样中的尿蛋白质量来判断肾病的工序优选包括以下工序：将来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量大于为了区别正常人和肾病患者而设定的正常检测量(分界值)的情况与肾病关联。
此处，尿蛋白质量的正常检测量可以利用通常的方法设定。
本发明中的第2判断工序优选包括以下工序：对来自待测者的尿的试样中的所述复合体的检测量相对于所述试样中的总蛋白质量的比率(复合体/总蛋白质)、和作为对照的来自除IgA肾病以外的肾病患者的尿的试样中的所述复合体的检测量相对于所述试样中的总蛋白质量的比率进行比较的工序；将所述来自待测者的尿的试样中的所述复合体的检测量相对于所述试样中的总蛋白质量的比率大于作为对照的来自除IgA肾病以外的肾病患者的尿的试样中的所述复合体的检测量相对于所述试样中的总蛋白质量的比率的情况与IgA肾病关联的工序。
此处，比率大是指，与为了区别IgA肾病和除IgA肾病以外的肾病而设定的分界值相比，来自待测者的尿的试样中的所述复合体的检测量比率更大。
所述分界值可以与上述肾病的检查方法中的分界值同样设定，但从检测特异性的观点出发，优选基于ROC分析的结果设定分界值。
本发明的IgA肾病的检查方法中测定尿中的所述复合体的检测量和总蛋白质量，能够基于所述复合体的检测量相对于所述总蛋白质量的比率检测IgA肾病，因此是简便且安全的IgA肾病的检查方法。
本发明的人尿调制蛋白和人IgA的复合体的检测方法包括使来自待测者的尿的试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触的工序。由此能够以高灵敏度且高特异性检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体。
本发明的复合体的检测方法中，在所述肾病的检查方法的复合体检测工序中说明的事项也能同样地适用。
另外，所述待测者优选为正在发作肾病的人、疑似正在发作肾病的人、或有可能发作肾病的人。此处所述的有可能发作肾病的人是指，并非正在发作肾病的人或疑似正在发作肾病的人中任一种的所有的人。另外所述肾病更优选为IgA肾病。
本发明的肾病的检查试剂盒的特征在于，其含有至少1种针对人尿调制蛋白的抗体和至少1种针对人IgA的抗体。通过使用所述针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体来检测来自尿的试样中的人尿调制蛋白和人IgA的复合体，能够以良好的检测灵敏度和特异性判断肾病。
本发明的肾病的检查试剂盒中除了所述抗体以外，优选进一步包括操作说明书，该操作说明书中记载了如下步骤：使来自待测者的尿的试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触，检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体，将其检测量与肾病关联。
本发明的肾病的检查试剂盒可以更优选作为IgA肾病的检查用试剂盒使用。
日本国申请号第2008-144882号的全部公开内容作为参考引入到本说明书中。
关于本说明书中记载的全部文献、专利申请和技术标准，与具体且分别记载了将各文献、专利申请和技术标准作为参考而引入的情况同样程度地作为参考引入到本说明书中。
实施例
以下，通过实施例来具体说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。另外，只要没有特别说明，则“％”为质量基准。
[实施例1]
<肾病的检测>
～基于ELISA法的尿中IgA-尿调制蛋白复合体的检测～
利用PROSEP-A(MILLIPORE社制造)纯化抗人TH糖蛋白(Tamm-Horsfall protein)抗体(Cedarlane Laboratories社制造)后，进一步用50mM Tris/HCl(pH7.5)、0.15M NaCl透析，将纯化的纯化抗体用50mMTris/HCl(pH7.5)、0.15M NaCl稀释至5μg/ml～10μg/ml的浓度后，以50μl/孔注入PolySorp杯(NUNC社制造)中。将杯放入湿润盒中，在4℃包被一晚。包被后，用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.01％Tween20)清洗3次，以150μl/孔注入封闭液(50％N102(日本油脂社制造)、25mM Tris/HCl(pH7.5)、75mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药社制造))后，在室温封闭2小时或在4℃封闭1天以上(以下，称为“anti-Tamm-Horsfall杯”)。
将anti-Tamm-Horsfall杯用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mMNaCl、0.01％Tween20)清洗3次，以50μl/孔注入经样本稀释液(50％N102(日本油脂社制造)、50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药社制造))稀释了50倍的尿样本，在室温反应1小时。用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mMNaCl、0.01％Tween20)清洗3次后，以50μl/孔注入用Can Get Signal2(TOYOBO社制造)稀释了3000倍的HRP-GOATAnti-Human IgA(Zymed社制造)，在室温反应1小时。用清洗液清洗3次后，以100μl/孔注入ELISA用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SIGMA社制造)，在室温反应30分钟。以100μl/孔注入0.5MH2SO4停止反应后，测定OD(450-650nm)。对于包括95例IgA肾病患者在内的147例肾病患者和20例健康人(正常人)进行测定的结果示于图1。
通过对减去了空白的值进行比较，得到能够显著区别包括95例IgA肾病患者在内的147例肾病患者和20例健康人的结果。
另外，针对147例肾病患者和20例健康人进行了ROC分析。ROC曲线示于图2。由ROC曲线求得的分界值为0.066，由该分界值求出的147例肾病患者和20例健康人的阳性率的结果示于表1。如表1所示，在147例肾病患者中阳性为134例(91.2％)，在20例健康人中阳性为1例(5％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为91.2％，特异度(特异性)为95％，诊断效率为91.6％。
[表1]
  肾病患者   健康人
  样本数   147   20
  阳性数   134   1
  阳性率   91.2％   5.0％
<IgA肾病的检测>
接着，对于显示出分界值以上的显色值的样本，通过邻苯三酚红法对尿中的尿蛋白浓度进行定量。将上述得到的复合体检测量的值除以尿蛋白浓度，算出单位尿蛋白量的复合体检测量。结果示于图3。通过比较单位尿蛋白量的复合体检测量，得到能够显著区别86例IgA肾病患者和47例除IgA肾病以外的肾病患者的结果。
另外，对于86例IgA肾病患者和47例除IgA肾病以外的肾病患者进行ROC分析，结果得到图4所示的ROC曲线。由ROC曲线求得的分界值为6.5。将由该分界值求出的86例IgA肾病患者和47例除IgA肾病以外的肾病患者的阳性率的结果示于表2。如表2所示，在86例IgA肾病患者中阳性为62例(72.1％)，在47例除IgA肾病以外的肾病患者中阳性为13例(27.7％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为72.1％，特异度为72.3％，诊断效率为72.2％。
[表2]
  IgA肾病  除IgA肾病以外的肾病
  样本数   86   47
  阳性数   62   13
  阳性率   72.1％   27.7％
[实施例2]
<肾病的检测>
～基于电化学发光(ECL)法的尿中IgA-尿调制蛋白复合体的检测～
用磁铁捕获30mg/ml的Dynabeads M-450Epoxy(Invitrogen社制造)1ml，用1ml的PBS-1(10mM磷酸钾缓冲液、150mMNaCl、pH7.8)清洗5次。接着，在用磁铁捕获的珠中加入在用上述PBS-1对纯化抗人TH糖蛋白(Tamm-Horsfall protein)抗体(Cedarlane Laboratories社制造)进行透析后制备为0.2mg/ml的浓度的溶液1ml，在25℃混合20小时。
接着，用磁铁捕获上述得到的珠，用1ml的上述PBS-1清洗后，加入含有1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl，在室温混合2小时。用磁铁捕获珠，用1ml的上述PBS-1清洗5次后，悬浮于含有0.1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl中(以下，称为“anti-Tamm-Horsfall结合珠”)。
将24.3μg的钌络合物(Igen社制造)和1.425mg的GOAT Anti-HumanIgA(Cappel社制造)在室温遮光下混合30分钟，添加25μl的2M甘氨酸/PBS-1，在室温遮光下混合10分钟后，用Sephdex G-25柱凝胶过滤，将在抗人IgA抗体上结合有钌络合物的级分(以下，称为“anti-IgA钌标记抗体”)蓄积起来。
将30mg/ml的anti-Tamm-Horsfall结合珠用样本稀释液(50％N102(日本油脂)、50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药))稀释60倍(0.5mg/ml)。另外，将anti-IgA钌标记抗体用Can GetSignal2(TOYOBO社制造)稀释，制备为0.5μg/ml浓度。将60倍稀释的anti-Tamm-Horsfall结合珠和制备为0.5μg/ml浓度的anti-IgA钌标记抗体分别设置于专用架上。在反应管中注入200μl的样本稀释液，接着分别添加5μl样本并混合搅拌。在专用的反应管架上装入反应管，在电化学发光法自动测定装置(PICOLUMI系列，三光纯药社制造)中设置试剂和样本，以第一反应时间9分钟、第二反应时间9分钟的反应条件自动测定。对于包括88例IgA肾病患者在内的128例肾病患者和19例健康人进行测定的结果示于图5。
对从测定计算值减去空白值的值进行比较时，得到能够显著区别包括88例IgA肾病患者在内的128例肾病患者和19例健康人的结果。
另外，针对包括88例IgA肾病患者在内的128例肾病患者和19例健康人进行ROC分析，结果得到图6所示的ROC曲线。由ROC曲线求得的分界值为510.3。由该分界值求出的包括88例IgA肾病患者在内的128例肾病患者和19例健康人的阳性率的结果示于表3。如表3所示，在128例肾病患者中阳性为109例(85.2％)，在19例健康人中阳性为3例(15.8％)，能够显著地区别两者。另外此时的灵敏度为85.2％，特异度为84.2％，诊断效率为85.0％。
[表3]
  肾病患者   健康人
  样本数   128   19
  阳性数   109   3
  阳性率   85.2％   15.8％
<IgA肾病的检测>
接着，对于测定计算值减去空白值的值显示为分界值以上的值的样本，利用邻苯三酚红法对尿中的蛋白浓度进行定量。将上述得到的复合体检测量的值除以尿蛋白浓度，算出单位尿蛋白量的复合体检测量。结果示于图7。由图7可知，能够显著区别77例IgA肾病患者和32例除IgA肾病以外的肾病患者。
另外，针对77例IgA肾病患者和32例除IgA肾病以外的肾病患者进行ROC分析，结果得到图8所示的ROC曲线。由ROC曲线求得的分界值为39.525。将由该分界值求出的77例IgA肾病患者和32例除IgA肾病以外的肾病患者的阳性率的结果示于表4。如表4所示，在77例IgA肾病患者中阳性为58例(75.3％)，在32例除IgA肾病以外的肾病患者中阳性为9例(28.1％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为75.3％，特异度为71.9％，诊断效率为74.3％。
[表4]
  IgA肾病  除IgA肾病以外的肾病
  样本数   77   32
  阳性数   58   9
  阳性率   75.3％   28.1％
[实施例3]
<尿中的尿调制蛋白-IgA复合体中所含的尿调制蛋白基于蛋白印迹法的分析>
用磁铁捕获30mg/ml的Dynabeads M-450 Epoxy(Invitrogen社制造)1ml，用1ml的PBS-1(10mM磷酸钾缓冲液、150mM NaCl、pH7.8)清洗3次后，在用磁铁捕获的珠中加入在用上述PBS-1对抗人IgA抗体(Cappel社制造)进行透析后制备为0.2mg/ml的浓度的溶液1ml，在25℃混合1昼夜。
用磁铁捕获所得到的珠，用1ml的上述PBS-1清洗后，加入含有1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl，在4℃混合1昼夜。用磁铁捕获珠，用1ml的上述PBS-1清洗3次后，悬浮于含有0.1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、15mM NaCl中(以下，称为“anti-IgA结合珠”)。
同样地，用磁铁捕获30mg/ml的Dynabeads M-450Epoxy 1ml，用1ml的上述PBS-1清洗3次后，在用磁铁捕获的珠中加入含有1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl，在4℃混合1昼夜。用磁铁捕获所得到的珠，用1ml的上述PBS-1清洗3次后，悬浮于含有0.1％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、150mM NaCl中(以下，称为“BSA结合珠”)。
在45ml的尿样品中加入2.5ml的1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、1.5ml的5M NaCl，此外加入0.25ml的anti-IgA结合珠或BSA结合珠，在4℃混合1昼夜。分别用磁铁捕获珠，用50ml至1ml的上述PBS-1清洗5次后，加入0.5ml的0.1M柠檬酸缓冲液(pH3)，在室温混合30分钟。用磁铁捕获珠并回收上清，用1/10浓度的上述PBS-1、0.01％NaN3透析后，离心浓缩为约10倍的浓度，制备成蛋白质溶液。
取制备的蛋白质溶液3μl实施SDS-PAGE，印迹于硝化纤维素滤膜(Schleicher&Schuell、BA85)上。将滤膜浸渍于封闭液(50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、5％脱脂乳、0.01％Tween20、0.1％NaN3)中，在4℃振荡一晚后，更换封闭液。以1/1000浓度加入作为一次抗体的抗尿调制蛋白抗体(抗人TH糖蛋白单克隆抗体(Cedarlane Laboratories，Ltd.))，在室温振荡2小时，用清洗液清洗3次。接着以1/1000浓度在清洗液中加入作为二次抗体的HRP标记抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.)，在室温振荡1小时，用清洗液清洗3次后，加入显色液(8.3mM Tris-HCl(pH6.5)、125mM NaCl、0.05％4-氯-1-萘酚，0.01％H2O2)使其显色。
将与上述得到的anti-IgA结合珠结合的蛋白质基于蛋白印迹法分析的结果示于图9。另外，图9中，泳道C泳动10μg纯化尿调制蛋白，泳道1～3泳动IgA肾病患者尿的与anti-IgA结合珠结合的蛋白质。
在来自IgA肾病患者的样本的所有例子中，确认到很强的尿调制蛋白的条带。即，确认到在从IgA肾病患者的尿中通过抗IgA抗体而免疫沉淀的抗原-IgA复合体中，无一例外地含有尿调制蛋白。
由以上内容示出，在IgA肾病患者的尿中的抗原-IgA复合体中，含有尿调制蛋白，确认到通过利用抗尿调制蛋白抗体和抗IgA抗体的夹层法来诊断IgA肾病是妥当的。
[实施例4]
<肾病的检测>
～基于ELISA法的尿中IgA-尿调制蛋白复合体的检测2、对不同样本组的评价～
除了使用与实施例1的样本组不同的样本组以外，与实施例1同样地利用ELISA法进行尿中IgA-尿调制蛋白复合体的检测。但是，作为复合体量的测定值，不利用显色值，而利用如下制作的标准物质(人IgA-人尿调制蛋白复合体)中的显色值，使用将样本中的复合体量换算为标准物质的浓度的值。
(人IgA-人尿调制蛋白复合体的制作)
将100μl的2mg/ml人IgA(Cortex社制造)/PBS-1(10mM磷酸钾缓冲液、150mM NaCl、pH7.8)和100μl的1mg/ml人TH糖蛋白(Cortex社制造)/PBS-1混合，加入20μl的戊二醛(TAAB LABORATORIESEQUIPMENT LIMITED社制造)溶液(0.5％/PBS-1)，在25℃混合2小时后，用PBS-1透析，以所得物质作为人IgA-人尿调制蛋白复合体标准物质。
针对由包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人(正常人)得到的样本，测定尿中IgA-尿调制蛋白复合体，结果示于图10。
通过对减去了空白的值进行比较，得到了能够显著区别包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人的结果。
另外，针对74例肾病患者和6例健康人进行ROC分析。ROC曲线示于图11。以特异性为100％的方式确定的分界值为0.064，将由该分界值求出74例肾病患者和6例健康人的阳性率的结果示于表5。如表5所示，在74例肾病患者中阳性为67例(90.5％)，在6例健康人中阳性为0例(0％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为90.5％，特异度为100％，诊断效率为91.3％。
[表5]
  肾病患者   健康人
  样本数   74   6
  阳性数   67   0
  阳性率   90.5％   0.0％
<IgA肾病的检测>
接着，对于检测到分界值以上的复合体的样本，利用邻苯三酚红法对尿中的尿蛋白浓度进行定量。将上述得到的复合体检测量的值除以尿蛋白浓度，算出单位尿蛋白量的复合体检测量。结果示于图12。通过比较单位尿蛋白量的复合体检测量，得到能够显著区别31例IgA肾病患者和36例除IgA肾病以外的肾病患者的结果。
另外，对31例IgA肾病患者和36例除IgA肾病以外的肾病患者进行ROC分析，结果得到图13所示的ROC曲线。由ROC曲线求得的分界值为0.13。将由该分界值求出的31例IgA肾病患者和36例除IgA肾病以外的肾病患者的阳性率的结果示于表6。如表6所示，在31例IgA肾病患者中阳性为24例(77.4％)，在36例除IgA肾病以外的肾病患者中阳性为5例(13.9％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为77.4％，特异度为86.1％，诊断效率为82.1％。
尤其是在临床诊断上难以通过鉴别与IgA肾病区分的8例遗传性肾病(Alport)、4例IgA肾病的自然治愈例(燃尽IgA肾病)中，所有例子均判断为阴性，显示出在临床诊断上非常有效。
[表6]
  IgA肾病  除IgA肾病以外的肾病
  样本数   31   36
  阳性数   24   5
  阳性率   77.4％   13.9％
[参考例1]
<肾病的检测>
～基于ELISA法的尿中尿调制蛋白的检测～
利用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(DOJINDO MOLECULARTECHNOLOGIES，Inc)，根据试剂盒附带的手册对抗人TH糖蛋白(Tamm-Horsfall protein)抗体(绵羊，多克隆，Biotrend Chemikalien GmbH社制造)进行过氧化物酶标记(以下，称为“过氧化物酶标记抗人TH糖蛋白抗体”)。
将上述得到的anti-Tamm-Horsfall杯用清洗液(50mMTris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl，0.01％Tween20)清洗3次，以50μl/孔注入用样本稀释液(50％ N102(日本油脂社制造)、50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药社制造))稀释了1,000至10,000倍的尿样本，在室温反应1小时。用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.01％Tween20)清洗3次后，以50μl/孔注入用Can GetSignal2(TOYOBO社制造)稀释1000倍的过氧化物酶标记抗人TH糖蛋白抗体，在室温反应1小时。用清洗液清洗3次后，以100μl/孔注入ELISA用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SIGMA社制造)，在室温反应30分钟。以100μl/孔注入0.5M H2SO4停止反应后，测定OD(450-650nm)。对于包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人进行测定的结果示于图14。
对减去了空白的值进行比较，但结果无法区别包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人。
[参考例2]
<肾病的检测>
～基于ELISA法的尿中IgA的检测～
将抗人免疫球蛋白抗体(山羊，poly anti-Human Ig’s，BIOSOURCE社制造))用50mM Tris/HCl(pH7.5)、0.15M NaCl稀释为10μg/ml的浓度后，以50μl/孔注入PolySorp cup(NUNC社制造)。将杯放入湿润盒中，在4℃包被一晚。包被后，用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.01％Tween20)清洗3次，并以150μl/孔注入封闭液(50％N102(日本油脂社制造)、25mM Tris/HCl(pH7.5)、75mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药社制造))后，在室温封闭2小时或在4℃封闭1天以上(以下，称为“anti-Ig’s杯”)。
将anti-Ig’s杯用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.01％Tween20)清洗3次，并以50μl/孔注入用样本稀释液(50％N102(日本油脂社制造)、50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2％Block Ace(大日本住友制药社制造))稀释了1,000倍的尿样本，在室温反应1小时。用清洗液(50mM Tris/HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.01％Tween20)清洗3次后，以50μl/孔注入用Can Get Signal2(TOYOBO社制造)稀释了1000倍的HRP标记抗人IgA抗体(Zymed社制造)，在室温反应1小时。用清洗液清洗3次后，以100μl/孔注入ELISA用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统(SIGMA社制造)，在室温反应30分钟。以100μl/孔注入0.5MH2SO4停止反应后，测定OD(450-650nm)。对于包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人进行测定的结果示于图15。
通过对减去了空白的值进行比较，虽然与测定尿调制蛋白-IgA复合体的情况相比稍差，但得到了能够显著区别包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者和6例健康人的结果。
另外，针对74例肾病患者和6例健康人进行ROC分析。ROC曲线示于图16。以特异度为100％的方式确定的分界值为0.418，将由该分界值求出74例肾病患者和6例健康人的阳性率的结果示于表7。如表5所示，在74例肾病患者中阳性为64例(86.5％)，在6例健康人中阳性为0例(0％)，能够显著地区别两者。此时的灵敏度为86.5％，特异度为100％，诊断效率为87.5％。
[表7]
  肾病患者   健康人
  样本数   74   6
  阳性数   64   0
  阳性率   86.5％   0.0％
<IgA肾病的检测>
接着，对于包括32例IgA肾病患者在内的74例肾病患者，利用邻苯三酚红法对尿中的尿蛋白浓度进行定量。将上述得到的IgA检测量的值除以尿蛋白浓度，算出单位尿蛋白量的IgA检测量。结果示于图17。另外，针对32例IgA肾病患者和42例除IgA肾病以外的肾病患者进行ROC分析，结果得到图18所示的ROC曲线。通过比较单位尿蛋白量的IgA检测量，难以显著区别32例IgA肾病患者和42例除IgA肾病以外的肾病患者。
由上述内容可知，通过检测尿中存在的人IgA和人尿调制蛋白的复合体，能够识别健康人(正常人)和肾病患者。
另外，通过测定尿中存在的人IgA和人尿调制蛋白的复合体的单位尿蛋白浓度的检测量，能够识别IgA肾病和除此之外的肾病。
另一方面，在单独测定尿中存在的人尿调制蛋白的情况下，无法识别健康人(正常人)和肾病患者，在单独测定尿中存在的人IgA的情况下，能够识别健康人(正常人)和肾病患者，但无法通过测定单位尿蛋白浓度的检测量来识别IgA肾病和除此之外的肾病。

Claims (17)

1.一种IgA肾病的检查方法，其包括：
复合体检测工序，从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体。
2.如权利要求1所述的检查方法，其中，所述复合体检测工序包括：使所述试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触。
3.如权利要求1或权利要求2所述的检查方法，其中，其进一步包括如下工序：
获得所述复合体检测工序中检测的复合体的检测量相对于来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量的比率。
4.如权利要求3所述的检查方法，其中，其进一步包括：
判断工序，基于所述比率来判断是否为IgA肾病。
5.一种肾病的检查方法，其包括：
复合体检测工序，从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体。
6.如权利要求5所述的检查方法，其中，所述复合体检测工序包括：使所述试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触。
7.如权利要求5或权利要求6所述的检查方法，其中，其进一步包括如下工序：基于所述复合体的检测量来判断是否为肾病。
8.一种IgA肾病的检查方法，其包括以下工序：
复合体检测工序，从来自待测者的尿的试样中检测人尿调制蛋白和人IgA的复合体；
第1判断工序，基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量、或来自待测者的尿的试样中的尿蛋白质量来判断是否为肾病；
第2判断工序，基于所述复合体检测工序中检测的所述复合体的检测量相对于所述试样中的尿蛋白质量的比率来判断所述肾病是否为IgA肾病。
9.如权利要求1～权利要求8中任一项所述的检查方法，其中，所述复合体检测工序为使用针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体的免疫化学方法。
10.如权利要求9所述的检查方法，其中，所述免疫化学方法为夹层法。
11.一种人尿调制蛋白和人IgA的复合体的检测方法，其包括如下工序：使来自待测者的尿的试样与针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体接触。
12.如权利要求11所述的检测方法，其中，利用所述针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体，通过免疫化学方法检测所述复合体。
13.如权利要求12所述的检测方法，其中，所述免疫化学方法为夹层法。
14.如权利要求11～权利要求13中任一项所述的检测方法，其中，所述待测者为正在发作肾病的人、疑似正在发作肾病的人、或有可能发作肾病的人。
15.如权利要求14所述的检测方法，其中，所述肾病为IgA肾病。
16.一种肾病的检查试剂盒，其至少包含针对人尿调制蛋白的抗体和针对人IgA的抗体。
17.如权利要求15所述的检查试剂盒，其中，所述肾病为IgA肾病。
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