FI92881C - Analyyttikonsentraation määritys käyttäen kahta leimausainetta - Google Patents

Description

92881

Analyyttikonsentraation määritys käyttäen kahta leimaus-ainetta

Tekninen kenttä 5 Tämä keksintö koskee menetelmää nesteissä olevien analysoitavien aineiden pitoisuuden määrittämiseksi käyttämällä kahta eri merkkiainetta immuunimääritys- eli im-munometrisin menetelmin sekä myös analyysivälinettä ja -välineistöä.

10 Tausta

On tunnettua määrittää analysoitavan aineen, kuten lääkkeen tai hormonin, pitoisuus nesteessä saattamalla neste kosketukseen reseptorin kanssa, jonka molekyylissä on analysoitavan aineen sitoutumiskohtia, erottamalla si-15 toutunutta analysoitavaa ainetta sisältävä reseptori nesteestä, mittaamalla arvo, joka edustaa sitä osa reseptori-molekyylin käytettävissä olevista sitoutumiskohdista, jonka analysoitavat molekyylit ovat täyttäneet (eli "valtaus-osuus") ja vertaamalla tätä arvoa vastaavaan mitattuun 20 arvoon, joka saadaan liuoksella, jossa analysoitavan aineen pitoisuus on tunnettu.

Kyseisen arvon mittaaminen voidaan saada aikaan takaisintitrausmenetelmällä, jossa sitoutunutta analysoi-, tavaa ainetta sisältävä reseptorimolekyyli saatetaan kos- 25 ketukseen analysoitavan aineen leimatun version kanssa. On myös mahdollista käyttää leimatun analysoitavan aineen sijasta toista leimattua ainetta, jolla on kyky täyttää vain ne reseptorimolekyylillä olevat analysoitavan aineen sitoutumiskohdat, jotka eivät ole itse analysoitavan ai-.30 neen täyttämiä. Näitä kahta järjestelmää kutsutaan kompe-titiivisiksi järjestelmiksi, koska leimattu analysoitava aine tai muu leimattu materiaali kilpailee mitattavan analysoitavan aineen kanssa reseptorimolekyylillä olevien sitoutumiskohtien täyttämisestä. Eräässä toisessa vaihto-35 ehdossa takaisintitrauksessa saatetaan sitoutunutta analy- 92881 2 soitavaa ainetta sisältävä reseptorimolekyyli kosketukseen materiaalin kanssa, jolla on kyky sitoutua sitoutuneeseen analysoitavaan aineeseen tai pelkästään sitoutuneen analysoitavan aineen täyttämiin sitoutumiskohtiin ja joka mate-5 riaali itse on leimattu tai leimataan myöhemmin liittämällä siihen merkkiaine. Tämä järjestelmä tunnetaan ei-kompe-titiivisena järjestelmänä, koska siinä ei esiinny kilpailua sitoutumiskohdista.

Sekä kompetitiivisessa että ei-kompetitiivisessa 10 järjestelmässä takaisintitrausreagenssi (analysoitava aine tai muu materiaali) leimataan merkkiaineella. On käytetty erilaisia merkkiaineita, esimerkiksi radioaktiivisia isotooppeja (radioimmuunimääritys), entsyymejä, kemilumine-soivia aineita ja fluoresoivia merkkiaineita (fluoroimmuu-15 nimääritys), joista viimeksi mainittu on joko tavanomainen fluoresoiva aine, kuten fluoreseiini, tai aine, josta tulee fluoresoiva vain tehtäessä aktivointi ja arviointi aikaerotellun pulssifluoresenssin avulla, kuten europium-tai muu lantanidikelaatti, jolloin fluoresenssin suuruus, 20 joka saadaan pyyhkäisemällä suuri-intensiteettisellä va lonsäteellä, jonka aallonpituus on sopiva, on sitoutunutta analysoitavaa ainetta sisältävän reseptorimolekyylin vastaanottaman leimatun materiaalin määrän mitta.

Tähänastiset tunnetut määritysmenetelmät ovat ol-* 25 leet riippuvaisia joko siitä, että tunnetaan tarkasti kus sakin näytteessä olevan reseptorin kokonaismäärä, tai siitä, että tiedetään reseptorin määrän säilyvän täsmälleen samana näytteestä toiseen, erityisesti tuntemattoman näytteen ja kalibrointitarkoituksiin käytettävien standardi-30 näytteiden välillä. Ne ovat vaatineet myös näytteen kokonaistilavuuden tarkkaa tuntemista. Nämä vaatimukset johtuvat siitä tosiasiasta, että mitattu signaali (esimerkiksi fluoresenssi) edustaa tällaisissa järjestelmissä sitoutuneen leimatun materiaalin kokonaismäärää ja, ellei kaik-35 ki leimattu materiaali ole sitoutunut (jolloin järjestelmä « li 3 92881 ei reagoisi läsnä olevan analysoitavan aineen määrän muutoksiin), tämä kokonaismäärä ei riipu pelkästään resepto-rimolekyylillä olevien sitoutumiskohtien valtausosuudesta vaan myös läsnä olevasta reseptorimolekyylimäärästä. Ly-5 hyesti sanottuna emittoitunut fluoresenssisignaali on tähänastisissa tunnetuissa fluoroimmuunimääritysmenetelmissä aina riippunut monimutkaisella (ja käytännössä tuntemattomalla) tavalla järjestelmässä käytetyn reseptorimolekyy-lin määrästä ja läsnä olevan analysoitavan aineen koko-10 naismäärästä; tämä merkitsee sitä, että sekä käytettävä reseptorimäärä että näytetilavuus täytyy standardisoida huolellisesti, jotta taataan oikeat arviot analysoitavan aineen pitoisuudesta tutkittavassa näytteessä, ja tällainen standardointi on kaikkien tähän a?ti tunnettujen fluo-15 roimmuunimääritysmeneteImien, erityisesti edellä määritel tyjen kompetitiivisten menetelmien, eräs tunnusmerkillinen ja olennainen piirre. On erityisesti korostettava sitä, että tällaisissa menetelmissä itse analysoitavan aineen valtausosuus vasta-aineesta (ja siten emittoitu fluore-20 senssisignaali) riippuu läsnä olevasta reseptorimäärästä; esimerkiksi reseptorimolekyylien lukumäärän suurentaminen tietyssä suhteessa suurentaa myös sen sitomien analysoitavien molekyylien lukumäärää, mutta hyvin erilaisessa . suhteessa, jolloin valtausosuus reseptorista muuttuu mer- * 25 kitsevästi. Reseptoriin sitoutuvan leimatun aineen määrä kasvaa myös, mutta samoin ei-verrannollisella tavalla.

Käytettävän reseptorimäärän standardoinnin välttämättömyys (tähänastisten tunnettujen £luoroimmuunimääri-tysmenetelmien eräs piirre, joka on yhteinen myös analo-.30 gisille määritysmenetelmille, joissa käytetään muita merkkiaineita, kuten radioisotooppeja) ei ole osoitettavissa ainoastaan kokeellisesti vaan ennustettavissa myös teoreettisesti tarkastelemalla reseptorien ja ligandien välisiä vuorovaikutuksia koskevia massavaikutuslakeja. Tätä 35 vaatimusta on lisäksi pitkään pidetty näiden menetelmien « ♦ 92881 4 eräänä vakavana haittapuolena, joka aiheuttaa pahoja ongelmia immuunimääritysjärjestelmien laaduntarkkailussa, erityisesti järjestelmissä, joissa reseptori (vasta-aine) liitetään kiinteään kantajaan ja joissa voi olla teknises-5 ti vaikea varmistaa, että täsmälleen sama määrä reseptoria liitetään kuhunkin näytteeninkubointiseokseen lisättävään kiinteään materiaaliin. Tässä yhteydessä täytyy huomata, että alan ammattimiehet ovat yleisesti seuranneet tai tarkistaneet kiinteisiin kantajiin kytkeytynyttä reseptori-10 määrää leimaamalla itse reseptorin (esimerkiksi radioiso-toopilla) siten kytkeytyneen määrän vakiona pysymisen varmistamiseksi. Lisäksi alan ammattimiehet ovat havainneet myös, että kytkeytyneen reseptorimäärän pienten vaihteluiden suhteen voidaan tehdä osittaisia korjauksia, jos täl-15 laisen reseptorien leimausmenetelmän perusteella tunnetaan poikkeama reseptorin standardimäärästä. Koska analysoitavan aineen valtausosuus vasta-aineen sisältämistä sitoutumiskohdista riippuu monimutkaisella ja käytännössä tuntemattomalla tavalla sekä läsnä olevista reseptori- että 20 analysoitavan aineen määristä, tällaiset approksimatiiviset korjaukset ovat kuitenkin rajoitetusti käyttökelpoisia, ja niitä käytetään harvoin, jos milloinkaan, rutiininomaisesti.

Esimerkiksi kansainvälisessä WO-hakemusjulkaisussa 25 80/02076 on ehdotettu immuunimääritysten laaduntarkkailun parantamista käyttämällä järjestelmässä kahta erillistä, edullisesti fluoresoivaa, merkkiainetta, joista toinen liitetään kilpailevaan ligandiin (joka määriteltiin edellä) ja toinen reseptorimolekyyliin. Mainitussa julkaisussa 30 mainitaan, että reseptorimolekyylin suorasta leimaamisesta on se etu, että reseptorimolekyyli voidaan detektoida kvantitatiivisesti immuunimääritysmenettelyn aikana riippumatta leimatun (kilpailevan) ligandin kvantitatiivisesta detektoinnista, niin että immuunimääritysmenettelystä voi-35 daan tehdä itsekalibroituva. Mainitun keksinnön edullisen 92881 5 muodon mukaisesti reseptorimolekyylillä oleva fluoresoiva merkkiaine ja leimatulla (kilpailevalla) ligandilla oleva fluoresoiva merkkiaine detektoidaan kvantitatiivisesti niiden ollessa sitoutuneina toisiinsa ja tuntemattomassa 5 näytteessä läsnä olevan analysoitavan aineen määrä määritetään näiden kahden merkkiaineen määrien suhteen funktiona.

WO-hakemusjulkaisussa 80/02076 annetuista tiedoista käy ilmi, että toisen merkkiaineen käyttöä lukuunottamatta 10 kuvatut immuunimääritykset toteutetaan tavanomaisella tavalla. Niin kutsutuissa "kompetitiivisissa immuunimääri-tyksissä” käytetään tavallisesti sellainen määrä reseptoria, joka sitoo 30 - 50 % sekä leimatusta ligandista että leimaamattomista analysoitavista molekyyleistä (leimaamat-15 toman analysoitavan aineen konsentraation lähestyessä nollaa). Niin kutsutuissa "ei-kompetitiivisissa" määrityksissä käytetään tavallisesti vielä suurempia reseptoripitoi-suuksia, jotka sitovat lähes 100 % läsnä olevasta analysoitavasta aineesta. On selvää, ettei kummissakaan näistä 20 olosuhteista leimatun reseptorin ja leimatun takaisintit-rausmarkkerin emittoimien signaalien suhde säily vakiona, jos reseptorin määrä vaihtelee. (Ei-kompetitiivisessa mää-ritysmallissa leimatun reseptorin määrän kaksinkertaistu-·· minen ei esimerkiksi merkitsevästi suurenna sitoutuneen *25 analysoitavan aineen määrää; siksi suhde pienenee noin puoleen. Samanlaiset tarkastelut pätevät WO-hakemusjulkaisussa 80/02076 käsiteltyihin kompetitiivisiin järjestelmiin. ) WO-hakemusjulkaisussa 80/02076 annetut tiedot tar-30 joavat siten vain karkean keinon läsnä olevan reseptorin määrään pienten vaihteluiden korjaamiseksi summittaisesti kuvatun kaltaisissa määritysjärjestelmissä, ja niiden soveltaminen tähän tarkoitukseen on rajoitettua. Lyhyesti sanottuna voidaan osoittaa sekä teoreettisesti että ko-35 keellisesti, ettei näiden kahden merkkiaineen (joilla lei- 6 92681 mätään reseptori ja vastaavasti kilpaileva ligandi) määrien suhde ole yleisesti analysoitavan aineen määrän mitta tavanomaisessa reseptoriin perustuvassa määritys järjestelmässä (kuten immuunimäärityksessä), ja tämän suhteen käyt-5 tö vastemuuttajana johtaa siten yleensä karkeasti virheellisiin analysoitavan aineen mittaustuloksiin. Vaikka W0 80/02076:ssa annetut tiedot tarjoavat (rajoitetusti käyttökelpoisen) menetelmän yksittäisissä näytteeninkubointi-putkissa läsnä olevan reseptorimäärän pienten vaihteluiden 10 seuraamiseen samanaikaisesti (ja approksimatiivisten kor jausten tekemiseksi niiden suhteen), kuten edellä kuvattiin, ne eivät kuitenkaan kuvaa määritysjärjestelmien sellaista mallia ja toimintaa, jossa kahden merkkiaineen mitattu suhde on tarkka ja luotettava mitta näytteessä ole-15 vasta analysoitavan aineen pitoisuudesta.

Lisäksi tulee korostaa, että vaikka - kuten yleensä on asianlaita - reseptorimäärä voidaan standardoida hyvin tarkasti (ts. kussakin inkubointiputkessa oleva reseptori-määrä voidaan pitää vakiona hyvin tarkasti, jolloin W0-20 hakemusjulkaisussa 80/02076 esitetty läsnäolevan reseptorimäärän suhteen tehtävä korjaus ei ole tarpeellinen eikä hyödyllinen), tuloksena oleva immuunimääritysjärjestelmä vaatii normaalisti "kalibrointia" (ts. määritysstandardi-sarjojen, jotka sisältävät tunnetut määrät analysoitavaa 25 ainetta, sisällyttämistä), ja tämä on tavanomaista alalla. Mikäli WO-hakemusjulkaisussa 80/02076 esitetty väite, että reseptorin leimaaminen tekee immuunimäärityksestä "itse-kalibroituvan", pitää paikkansa, se tekee tämän vain siinä rajoitetussa mielessä, että signaalin detektointilaitteis-30 ton (esimerkiksi radioisotooppilaskurin, fluorometrin jne., käytettävästä merkkiaineesta riippuen) tehon lyhytaikaisten vaihteluiden suhteen voidaan samoin tehdä automaattisesti korjaus (koska toisen merkkiaineen detektoin-titehon alenemiseen osoitetaan liittyvän toisen merkkiai-35 neen detektointitehon lasku suunnilleen samassa suhteessa, 92881 7 jolloin suhde pysyy suunnilleen vakiona).

Yhteenvetona voidaan siten todeta, että WO-hakemus-julkaisu 80/02076 tarjoaa enintään keinon tehdä approksimatiivisia korjauksia a. reseptoriin perustuvissa määri-5 tyksissä käytettävän reseptorin määrän pienten vaihteluiden suhteen ja b. merkkiaineen mittauslaitteiston signaalin detektointitehon pienten, lyhytaikaisten vaihteluiden suhteen. Näiden korjausten pätevyys on kyseenalainen ja käyttökelpoisuus rajoitettu, eikä niitä näistä syistä ole 10 otettu käyttöön rutiinimäärityksissä.

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintöni koskee reseptorimäärityksiä, joilla on täysin erilainen ajatus ja malli, kuin WO-hakemusjulkaisussa 80/02076 tarkastelluilla tai kuvatuilla määrityk-15 sillä, ja joissa valtausosuus reseptorista kuvaa todellisella, tarkalla ja luotettavalla tavalla analysoitavan aineen pitoisuutta väliaineessa (riippumatta läsnäolevien reseptorin ja/tai analysoitavan aineen kokonaismääristä). Nämä järjestelmät (joihin ei viitata ja joita ei kuvata 20 WO-hakemusjulkaisussa 80/02076) ovat välttämättömästi ja nimenomaisesti riippuvaisia analysoitavan aineen resepto-rivaltausosuuden mittaamisesta, ts. täyttämättömien (tai täytettyjen) reseptoripaikkojen ja reseptoripaikkojen kokonaismäärän suhteen (tai jonkin olennaisilta osiltaan ‘25 vastaavan suhteen, esimerkiksi täyttämättömien ja täytettyjen paikkojen suhteen) mittaamisesta ja vaativat siten mielellään näiden kahden paikkaryhmän leimaamista erikseen. Olen mm. havainnut, että nämä järjestelmät edellyttävät, että reseptorin ja analysoitavan aineen suhteelli-30 set määrät ja niiden välinen affiniteetti ovat sellaiset, ettei reseptorin lisäämisellä tutkittavaan näytteeseen ole merkitsevää vaikutusta analysoitavan aineen konsentraa-tioon näytteessä.

Tämän keksinnön mukaisesti tarjoan siten käytettä-35 väksi menetelmän tuntemattomassa nestemäisessä näytteessä ^2881 8 olevan analysoitavan aineen pitoisuuden määrittämiseksi, jossa menetelmässä saatetaan näyte kosketukseen reseptorin kanssa, jonka molekyylillä on sitoutumiskohtia analysoitavaa ainetta varten ja joka on leimattu ensimmäisellä 5 merkkiaineella, jolloin analysoitava aine täyttää osan reseptorimolekyyIillä olevista sitoutumiskohdista, takai-sintitrataan reseptori, jonka sitoutumiskohdat on osittain täytetty, takaisintitrausmenetelmällä, jossa käytetään järjestelmää, joka sisältää toisen merkkiaineen, joka on 10 erilainen kuin ensimmäinen, mitataan näiden kahden merkkiaineen antamien kahden signaalin suhteelliset voimakkuudet, jolloin saadaan arvo, joka edustaa analysoitavan aineen valtausosuutta reseptorimolekyylillä olevista sitoutumiskohdista, ja verrataan tätä arvoa yhteen tai useam-15 paan vastaavaan arvoon, jotka saadaan saunalla tavalla käyttämällä yhtä tai useampaa nestemäistä standardinäytet-tä, joissa analysoitavan aineen pitoisuus on tunnettu. Menetelmälle on tunnusomaista, että sekä nestemäiset tutkittavat että standardinäytteet saatetaan kukin kosketuk-20 seen niin pienen määrän kanssa reseptoria, että ottaen huomioon reseptorin affiniteettivakio analysoitavan aineen suhteen vain merkityksetön osa analysoitavasta aineesta sitoutuu reseptoriin.

Kuten viittaan merkityksettömään osaan analysoita-25 vasta aineesta, tarkoitan niin pientä osaa, että virheet, joita aiheuttaa analysoitavan aineen alkupitoisuuden muuttumisen salliminen, ovat yhtä pieniä tai pienempiä kuin virheet, joita väistämättä tuovat mukanaan muualle mit-tausmenettelyyn rajoitukset näytteen ja reagenssin käsit-30 telyn, signaalinen mittauksen ja standardoinnin tarkkuudessa, lämpötilavaihtelut ja vastaavat tekijät. Yleisesti ottaen tällaisten virheiden suuruus (yhteensä) on korkeintaan 10 %, ja tutkittavissa näytteissä olevan analysoitavan aineen kokonaismäärästä korkeintaan 5 %:n sitominen 35 aiheuttaisi siksi todennäköisesti sen, että tästä nimen-• * 92881 9 omaisesta lähteestä tulevat näytteiden väliset mittausvirheet vaikuttavat mitättömästi kokonaisvirheeseen. Tämä raja voidaan kuitenkin joskus ylittää ilman haittoja. Ihannetapauksessa on kuitenkin edullista minimoida mit-5 tausvirhe pienentämällä reseptoriin sidotun analysoitavan aineen määrä 1-2 %:ksi kokonaismäärästä (tai pienemmäksi) .

Olen havainnut, että sillä edellytyksellä, että vain merkityksetön osa analysoitavasta aineesta tulee si-10 dotuksi, valtausosuus, F, reseptorimolekyylin sitoutumiskohdista riippuu analysoitavan aineen pitoisuudesta näytteestä seuraavan yhtälön mukaisesti (termodynaamisen tasapainon vallitessa): F = l+tf[A] 15 jossa [A] on analysoitavan aineen pitoisuus näytteessä ja K on reseptorin affiniteettivakio analysoitavan aineen suhteen ja vakio tietyssä lämpötilassa.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua merkkiainetyyppiä, esimerkiksi ra-20 dioaktiivisia isotooppeja (esimerkiksi radioaktiivista jodia), kemiluminesoivia aineita, fluoresoivia merkkiaineita ja entsyymejä. Nämä voidaan liittää reseptorimo-lekyyliin ja takaisintitrausreagenssiin tavanomaisin menetelmin. Kumpikin merkkiaine on tavallisesti samaa tyyppiä, 25 vaikkakin eri aineita. Merkkiaineet detektoidaan kvantitatiivisesti niiden luonteelle sopivalla tavalla, esimerkiksi laskemalla radioaktiivisen merkkiaineen radioaktiivisuus tai pyyhkäisemällä fluoresoiva merkkiaine valonsä-dekimpulla, tarvittaessa aktivoinnin jälkeen. On edullista 30 käyttää fluoresoivia tai potentiaalisesti fluoresoivia merkkiaineita. On mahdollista eksitoida kaksi fluoresoivaa merkkiainetta samanaikaisesti pyyhkäisemällä yhdellä va-lonsädekimpulla, jolla on sopiva aallonpituus, ja mitata ^2881 10 syntyneiden kahden fluoresenssisignaalin suhteelliset voimakkuudet. Tämä suhde edustaa suoraan valtausosuutta reseptorin sitoutumiskohdista ja on edellä mainitulla ehdolla riippumaton läsnä olevan reseptorin tarkasta määrästä 5 ja siitä, kuinka suuri osa kokonaismäärästä käytetään määritykseen, joka tehdään pyyhkäisemällä valonsädekimpulla. Niinpä ei ole enää olemassa tarvetta käyttää muuttumattomia tai tarkasti tunnettuja määriä reseptoria, sekä resep-toritiheyden substraatin pinnalla tarvitse olla yhtenäi-10 nen.

Keksinnön erään toisen puolen mukaisesti muodostetaan leimattuja tuotteita välituotteiksi keksinnön mukaisessa menetelmässä, jotka mainitut leimatut tuotteet ovat reseptorimolekyylejä, jotka on leimattu ensimmäisellä, 15 edullisesti fluoresoivalla merkkiaineella ja joilla on sitoutumiskohtia, joista osa on analysoitavien molekyylien täyttämiä, joka osa kuvaa täysin analysoitavan aineen pitoisuutta näytteessä, jonka kanssa reseptorimolekyylit on saatettu kosketukseen, koska käytetään vain hyvin pientä 20 määrää reseptoria suhteessa analysoitavaan aineeseen ja materiaalia, joka on sidottu joko suorasti tai epäsuorasti täytettyihin sitoutumiskohtiin tai täyttämättömiin sitoutumiskohtiin ja leimattu toisella, edullisesti fluoresoi-; valla merkkiaineella, joka on eri aine kuin ensimmäinen 25 merkkiaine.

Erään lisäpuolenaan keksintöni tarjoaa välineistön käytettäväksi menetelmässä nestemäisessä näytteessä olevan analysoitavan aineen pitoisuuden määrittämiseksi, joka välineistö sisältää kiinteän substraatin, johon on kiinni-30 tetty reseptorimolekyylejä, jotka on leimattu ensimmäisellä, edullisesti fluoresoivalla merkkiaineella ja joilla on sitoutumiskohtia analysoitavaa ainetta varten, ja jolla substraatilla oleva reseptorimäärä valitaan nestenäytteen koon mukaan, niin että vain merkityksetön osa näytteessä 35 olevasta analysoitavasta aineesta sitoutuu reseptoriin, 92881 11 yhtä tai useampaa standardiliuosta, jotka sisältävät tunnettuina pitoisuuksina analysoitavaa ainetta, sekä takai-sintitrausreagenssia, joka on leimattu toisella, edullisesti fluoresoivalla merkkiaineella, joka on eri aine kuin 5 ensimmäinen merkkiaine ja jolla on kyky sitoutua suoraan tai epäsuorasti joko sitoutuneeseen analysoitavaan aineen tai sitoutuneen analysoitavan aineen täyttämiin sitoutumiskohtiin tai sitoutumiskohtiin,jotka eivät ole sitoutuneet analysoitavan aineen täyttämiä.

10 Uutena analyysivälineenä tarjoan lisäksi käyttöön laajennetun kiinteän substraatin, kuten levyn tai sauvan, johon on kiinnitetty useissa, toisistaan erillään olevissa kohdissa useita er reseptoreja, joista kullakin on sitoutumiskohtia analysoitavaa ainetta varten, jolloin kussakin 15 kohdassa olevalla reseptorilla on sitoutumiskohtia, jotka ovat spesifisiä analysoitavalle aineelle, joka on eri aine kuin analysoitava aine, jolle yhdessä tai useammassa muussa kohdassa olevalla reseptorilla on sitoutumiskohtia, ja kukin reseptori on leimattu merkkiaineella, jolloin kussa-20 kin erillään olevassa kohdassa olevan reseptorin määrä on sellainen, että kun sitä altistetaan analysoitavaa ainetta sisältävälle näytteelle, sitoutumiskohtien valtausosuus on oleellisesti riippumaton käytetystä reseptorin määrästä. Liitteenä olevassa piirroksessa 25 kuvio 1 valaisee kaavamaisesti keksinnön mukaista kompetitiivista tai ei-kompetitiivista järjestelmää, ja kuvio 2 on perspektiivikuva keksinnön mukaisesta analyysivälineestä.

Viitatakseni kuvioon 1 kaaviossa näkyy leimattu 30 reseptori 1, josta on esimerkkinä ensimmäinen analysoitavan aineen vastainen vasta-aine, joka on leimattu ensimmäisellä fuoroforilla (ei kuviossa). Reseptori 1 sisältää molekyylillään sitoutumiskohtia 2, joista jotkut ovat analysoitavien molekyylien 3 täyttämiä. Ei-kompetitiivisessa 35 järjestelmässä A sitoutuneet analysoitavat molekyylit 3 92881 12 sidotaan puolestaan leimattuun materiaaliin, josta on esimerkkinä toinen analysoitavan aineen vastainen vasta-aine 4, joka on leimattu toisella fluoroforilla (ei kuviossa). Kompetitiivisessa järjestelmässä B ensimmäisen analysoi-5 tavan aineen vastaisen vasta-aineen 1 sitoutumiskohdat 2, jotka eivät ole analysoitavan aineen 3 täyttämiä, ovat leimatun reagenssin, josta on esimerkkinä anti-idiotyyp-pinen vasta-aine 5, joka myös on leimattu toisella fluoroforilla (ei kuviossa), valtaamia. Koko järjestelmä tutki-10 taan pyyhkäisemällä lasersädekimpulla 6, ja ensimmäinen fluorofori emittoi a-fotoneja 7 ja toinen fluorofori β-fotoneja 8, jotka eroavat α-fotoneista jonkin ominaisuuden tai vaikutuksen suhteen. Sekä a- että β-fotonisignaaleihin vaikuttaa samalla tavalla läsnä olevan ensimmäisen analy-15 soitavan aineen vastaisen vasta-aineen kokonaismäärä tai pintatiheys sillä edellytyksellä, että sitoutumiskohtien valtausosuus on muuttumaton, mutta muutokset analysoitavan aineen valtausosuudessa sitoutumiskohdista vaikuttavat ainoastaan α-fotonisignaaliin, joka kasvaa valtausosuuden 20 kasvaessa ei-kompetitiivisessa järjestelmässä, mutta heik-kenee valtausosuuden kasvaessa kompetitiivisessa järjestelmässä. Niinpä näiden kahden signaalin suhde riippuu valtausosuudesta, mutta ei analysoitavan aineen vastaisen ensimmäisen vasta-aineen kokonaismäärästä.

25 Keksintöäni voidaan käyttää minkä tahansa analysoi tavan aineen arviointiin, jolle tunnetaan tai voidaan valmistaa reseptori, jolla on molekyylisään sopivia sitoutumiskohtia. Sitä voidaan erityisesti käyttää piko- tai na-nomolaarisuusalueella olevien pitoisuuksien samoin kuin 30 mikromolaarisuusalueella olevien suurempien pitoisuuksien tarkkaan arviointiin, esimerkiksi alueella 10"9 - 10"5 mol/1. Analysoitaviin aineisiin, joita voidaan arvioida tällä tavalla, kuuluvat hormonit, kuten tyroidi- tai steroidihormonit, esimerkiksi kortisoli, vitamiinit, proteii-35 nit ja proteiinihormonit, kuten insuliini, gonadotropii- n 92881 13 nit, virukset, lääkkeet, myrkyt ja muut ihmis- tai eläin-elimistönesteen, kuten veren, seerumin, syljen, virtsan tms. normaalit tai epänormaalit komponentit. Esimerkkejä tällaisista analysoitavista aineista luetellaan edellä 5 mainitussa julkaisussa W0 80/02076, ja niiden pitoisuuksia voidaan mitata tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Elintarvikkeiden sisältämiä pieninä pitoisuuksina esiintyviä epäpuhtauksia, kuten myrkkyjä, vieraita proteiineja tms., ja vedessä ja muissa nestemäisissä väliaineissa ole-10 via biologisia epäpuhtauksia voidaan myös arvioida. Tutkittava analysoitava aine voi olla näytteessä tasapainossa johonkin sitovaan aineeseen, kuten endogeeniseen sitovaan proteiiniin, reversiibelisti sitoutuneen saman analysoitavan aineen kanssa, jolloin tämän keksinnön mukaisella 15 menetelmällä mitataan vapaan analysoitavan aineen pitoisuus. Vaihtoehtoisesti näyte voi olla vapaa reversiibelisti sitoutuneesta analysoitavasta aineesta, ja tällä keksinnöllä saattaa olla suurempi merkitys tällaisissa mittauksissa, koska reversiibelisti sitoutunutta analysoita-20 vaa ainetta ei ole käytettävissä dissosioitumaan ja siten puskuroimaan muutoksia analysoitavan aineen pitoisuudessa, joita aiheuttaa sitoutuminen reseptorimolekyyliin.

Käytettävä reseptori on reseptori, jolla on mole-. kyylissään sitoutumiskohtia tutkittavaa analysoitavaa ”25 ainetta varten. Näiden sitoutumiskohtien lukumäärän molekyyliä kohden tulisi olla suurin piirtein vakio, ja siten niiden tulisi olla kemiallisia sitoutumiskohtia mieluummin kuin fysikaalisia adsorptiokohtia. Niiden tulisi myös olla kohtia, joihin sitoutuu yksinomaan analysoitavaa ainetta 30 ennemmin kuin tutkittavien näytteiden mitä tahansa muuta aineosaa, ja sitoutumiskohdat ovat siten edullisesti spesifisiä analysoitavan aineen suhteen. Vasta-aineet, esimerkiksi monoklonaaliset vasta-aineet, ovat erityisen edullisia reseptorimolekyylejä, mutta yksittäisten analy-35 soitavien aineiden suhteen spesifiset entsyymit ovat muita 92881 14 esimerkkejä reseptorimolekyyleistä, joita voidaan käyttää. Vasta-aineita monille erilaisille analysoitaville aineille tunnetaan tai kuvataan kirjallisuudessa tai on saatavana kaupallisesti, ja muille hormoneille spesifisiä muita vas-5 ta-aineita jne. voidaan valmistaa tunnetuin menetelmin, jotka eivät ole osana tätä keksintöä. Mittaustarkkuuden maksimoimiseksi valitaan edullisesti reseptori, jonka af-finiteettivakio analysoitavan aineen suhteen on sellainen, että 25 - 75 % reseptorimolekyylin sitoutumiskohdista tu-10 lee analysoitavan aineen täyttämiksi, kun tätä on odotettuna pitoisuutena tutkittavassa näytteessä, ts. reseptorin affiniteettivakio on 1/3 - 3 kertaa analysoitavan aineen odotetun pitoisuuden käänteisluku. Reseptorin affiniteet-tivakioita voidaan määrittää tavanomaisella Scatchard-ana-15 lyysillä [Ann. N. Y. Sei. 51 (1949) 660].

Immuunifluorometristä eli fluoroimmuunimääritystä varten leimattavat yksiköt, olivatpa nämä sitten vasta-aineita (analysoitavan aineen vastaisia tai anti-idiotyyp-pisiä), entsyymejä, analysoitavia aineita tms., voidaan 20 leimata joko tavanomaisilla fluoresoivilla materiaaleilla, kuten fluoreseiinilla, tai materiaaleilla, joita voidaan käyttää aikaerotellussa pulssifluoresenssissa, kuten euro-piumin ja muiden lantanidien kelaateilla (katso esimerkiksi S. Dakubu et ai., "High sensitivity pulsed-light time-25 resolved fluoroimmunoassay" teoksessa Practical Immunoassay, toim. W. Butt, Marcel Dekker Inc, 1984, s. 71 -101), ja kummankin tyyppiset materiaalit kuuluvat termin "fluoresoiva merkkiaine" piiriin. Menetelmät yksiköiden leimaamiseksi fluoresoivilla merkkiaineilla siten, että 30 saadaan asianmukainen (riittävän korkea) ominaisaktiivi-suus (leimattujen molekyylien suhde molekyylien tai sitoutumiskohtien kokonaismäärään), ovat alalla tunnettuja, ja niitä kuvataan kirjallisuudessa, esimerkiksi teoksessa Alternative Immunoassays, toim. W. P. Collins, John Wiley 35 & Sons Ltd. 1985, erityisesti luvussa 13, ja siinä maini-

II

92881 15 tuissa viitteissä, kuten Soini, E. ja Hemmilä, I., Fluoro-immunoassay: present status and key problems, Clin. Chem. 25 (1979) 353 - 361. EP-hakemusjulkaisut 2 963 ja 64 484, GB-patenttijulkaisu 1 560 402 ja kansainvälinen WO-hake-5 musjulkaisu 86/01064, jossa olen yhtenä tekijänä, ja sen tekstissä ja tutkimusraportissa mainitut viitteet sekä myös edellämainittu WO-hakemusjulkaisu 80/02076 ovat lisä-esimerkkejä aiheeseen liittyvästä kirjallisuudesta. Tällaisia menetelmiä voidaan käyttää reseptorimolekyylien 10 leimaamiseen käytettäväksi tämän keksinnön yhteydessä. On myös mahdollista tehdä leimaus sisällyttämällä fluoresoiva yksikkö sopivaan materiaaliin yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla. Kuten edellä mainittiin, leimaaminen radioisotoop-pi- ja muilla merkkiaineilla kuuluu myös keksinnön pii-15 riin.

Reagenssit, jotka soveltuvat käytettäviksi takai-sintitrausmenetelmässä, jossa käytetään joko kompetitii-vista järjestelmää, esimerkiksi anti-idiotyyppisen vasta-aineen tai leimatun analysoitavan aineen yhteydessä, tai 20 ei-kompetitiivista järjestelmää, esimerkiksi analysoitavan aineen vastaisen vasta-aineen yhteydessä, ovat myös joko alalla tunnettuja tai voidaan valmistaa tavanomaisin menetelmin. Itse reagenssit voidaan leimata merkkiaineella, . edullisesti fuoresoivalla merkkiaineella, joka myös on ‘25 tunnettua tai tavanomaista tyyppiä, käyttämällä tunnettuja tai tavanomaisia menetelmiä ennen käyttöä, tai ne voidaan saattaa reagoimaan in situ toisen reagenssin kanssa joka puolestaan on leimattu tällaisella merkkiaineella. Niiden ei tarvitse erota takaisintitrausreagensseista, joita käy-30 tetään tavanomaisissa immuunimääritysmenetelmissä, joissa käytetään leimaamattomia reseptorimolekyylejä, ellei se ole välttämätöntä esimerkiksi sen takaamiseksi, että kun käytetään kahta fluoresoivaa merkkiainetta, nämä emittoivat signaaleja, jotka voidaan erottaa toisistaan saman-35 aikaisessa pyyhkäisyssä valonsädekimpulla, jos käytetään 92881 16 tällaista menetelmää. Takaisintitraus voidaan tehdä sen jälkeen, kun sitoutumaton analysoitava aine on poistettu kosketuksesta reseptorimolekyylien kanssa (kaksivaiheinen määritys) tai, sillä edellytyksellä että näytteen tilavuus 5 tunnetaan, sitoutumattoman analysoitavan aineen ollessa kosketuksessa reseptorimolekyylien kanssa (yksivaiheinen määritys).

Käytettyjen kahden merkkiaineen emittoimat signaalit voivat olla signaaleja, jotka voidaan erottaa erilai-10 silla vaihtoehtoisilla tavoilla, esimerkiksi emittoitujen fotonien aallonpituuden perusteella, fluoresenssin sammu-misajan perusteella aikaerotellun pulssifluoresenssin ollessa kyseessä (kummallakin tai toisella merkkiaineella esiintyy tällainen sammuminen) tai polarisaatiolla. Eri-15 laisten merkkiainejärjestelmien aallonpituuksia, sammumis-aikamalleja ja muita ominaisuuksia kuvataan kirjallisuudessa tai voidaan määrittää tunnetuin menetelmin. Kahden merkkiaineen tulisi antaa signaaleja, jotka ovat kyllin erilaisia, jotta ne voidaan erottaa mittauslaitteella. 20 Erilaisten fluoresoivien merkkiaineiden tietyissä olosuhteissa emittoimien fluoresenssisignaalien ominaisuudet ovat jo tunnettuja tai niitä kuvataan kirjallisuudessa, ja muiden signaalien ominaisuudet voidaan määrittää tavanomaisin menetelmin. Niinpä sopivan merkkiaineparin valinta 25 kuuluu alan ammattimiesten taitoihin.

Vaikka on periaatteessa mahdollista mitata signaalien suhde liuoksessa, tämä vaatisi kaiken leimatun takai-sintitrausreagenssin, joka ei ole sitoutunut leimattu re-septorimolekyyli - sitoutunut analysoitava aine - järjes-30 telmään, täydellistä poistamista esimerkiksi käyttämällä immuuniadsorbenttia, ennen kuin mittaus voitaisiin tehdä, ja tällainen poistovaihe on hankala. Siksi pidän edullisempana, että leimatut reseptorimolekyylit sidotaan yksi-molekyylikerrokseksi kiinteään substraattiin ja erotetaan 35 jäljelle jääneestä sitoutumattomasta analysoitavasta ai- 92881 17 neesta ja jäljelle jääneestä sitoutumattomasta leimatusta takaisintitrausreagenssista, joita on läsnä yhdessä tai useammassa nesteessä, jossa määritys tehdään, ennen kuin mitataan signaalien suhde. Soveltuvia substraatteja ovat 5 lasista, muoveista tms. valmistetut substraatit, ja menetelmät reseptorimolekyylien, kuten vasta-aineiden, sitomiseksi tällaisiin pintoihin ovat tunnettuja, ja niitä voidaan käyttää tämän keksinnön tarkoituksiin (katso esimerkiksi US-patenttijulkaisut 4 399 217, 4 381 291, 10 4 357 311, 4 343 312 ja 4 260 679).

Aiheeseen liittyvän lisäkeksinnön mukaisesti on mahdollista sitoa valikoima erilaisia leimattuja resepto-rimolekyylejä toisistaan erillään oleviin kohtiin yhdelle laajennetulle kiinteälle substraatille, kuten levylle tai 15 sauvalle, joka on esimerkiksi inerttiä muovimateriaalia, kuten polystyreeniä, jolloin kuhunkin eri paikkaan sijoitetaan reseptorimolekyylejä, joilla on sitoutumiskohtia yhtä tiettyä analysoitavaa ainetta varten, niin että eri paikat sitovat eri analysoitavia aineita. Tällaista moni-20 paikkaista välinettä voidaan sitten käyttää yhdessä nes-tenäytteessä olevien useiden analysoitavien aineiden pitoisuuksien arviointiin, jolloin käytetään erillisiä leimattuja takaisintitrausreagensseja kullekin eri analysoi-tavalle aineelle, niin että pystytään erottamaan kukin t · 25 merkkiainepari ja määrittämään signaalien voimakkuuksien suhde. Tästä on erityistä etua, kun neste, kuten elimis-töneste, sisältää tai saattaa sisältää useita erilaisia kiinnostuksen kohteena olevia aineosia ja tulee tietää kunkin pitoisuus. (Vaikka leimattujen reseptorimolekyylien 30 käyttö helpottaa tällaisen monipaikkaisen välineen valmistusta, koska reseptorimolekyylien määrän ei tarvitse olla vakio paikasta toiseen ja välineestä toiseen, olisi myös mahdollista valmistaa tällainen levy käyttämällä leimaa-mattomia reseptorimolekyylejä sillä edellytyksellä, että 35 reseptorimolekyylimäärä kussakin paikassa voitaisiin sei- • 92881 18 vittää tarkasti muilla keinoilla ja/tai säätää tarkasti, niin että se on vakio välineestä toiseen.) Tällaista analyysivälinettä valaistaan liitteenä olevan piirroksen kuviossa 2. Viitataksemme mainittuun 5 kuvioon, suorakaiteen muotoinen tai muussa kätevässä muodossa oleva levy 20 valmistetaan polystyreenistä tai muusta inertistä materiaalista. Siihen muodostetaan lukuisia syvennyksiä eli kuoppia 21, joista kukin vastaa kooltaan mikrohelmeä 22, joka samoin on valmistettu polystyreenistä 10 tai muusta inertistä materiaalista ja jonka sopiva läpimitta on korkeintaan noin 1 mm. Näitä helmiä on ennalta liotettu tavanomaisella tavalla liuoksissa, jotka sisältävät reseptoria, kuten vasta-ainetta, reseptorin kerrostamiseksi helmen pinnalle, jolloin eri helmiä liotetaan 15 eri liuoksissa, jotka sisältävät eri reseptoreja, ja eri reseptorin valitaan tutkittavien analysoitavien aineiden mukaan ja leimataan mahdollisesti sopivalla merkkiaineella. Mikrohelmet 22 kiinnitetään syvennyksiin 21 sopivalla inertillä liimalla, kuten tavanomaisella kaupallisesti 20 saatavissa olevalla polystyreenille tarkoitetulla liimalla.

Käytettäessä tällaista leimattuja mikrohelmiä sisältävää välinettä levyllä 20 olevat mikrohelmet 22 saatetaan kosketukseen yhtä tai useampaa tutkittavaa analy-25 soitavaa ainetta sisältävän näytteen kanssa ja sitten sopivien takaisintitrausreagenssien kanssa, jotka sisältävät sopivia merkkiaineita, minkä jälkeen arvioidaan kyseisten kahden merkkiaineen signaalien suhteelliset voimakkuudet. Eri helmille ja takaisintitrausreagensseille valitaan eri 30 merkkiaineet, jotta pystytään erottamaan yhden helmen antamat lukemat toisen antamista, tai vaihtoehtoisesti kullekin helmelle tehdään erillinen pyyhkäisymittaus; viimeksi mainittua vaihtoehtoa helpotta fluoresoivien tai fluo-rogeenisten merkkiaineiden käyttö.

35 Tällainen väline voidaan muodostaa lukuisilla muil- 92681 19 la tavoilla. Voitaisiin esimerkiksi jättää pois helmet 22 ja lisätä reseptorit suoraan syvennyksiin 21 liuoksina ja mahdollisesti poistaa liuottimet, jolloin jäljelle jää kiinteitä kerroksia. Voitaisiin myös luopua helmistä ja 5 syvennyksistä ja sijoittaa reseptorit painomenetelmällä levyn pinnalle sopivalla tavalla. Levy voitaisiin myös korvata sauvalla tai muulla alustalla. Erilaisten reseptorien lukumäärä voi olla niin pieni kuin 2 tai huomattavasti suurempi, esimerkiksi 4, 10 tai enemmän, ja samaa 10 reseptoria sisältävien eri paikkojen lukumäärä voisi olla yksi tai suurempi, jolloin useiden samaa reseptoria sisältävien paikkojen käyttö tarjoaa keinon tarkistaa yhden paikan antamat tulokset.

Laitteet, joilla pystytään mittaamaan kiinteällä 15 substraatilla, kuten levyllä, olevista materiaaleista tulevia sykäyksittäisiä fluoresenssisignaaleja, ovat tunnettuja, esimerkiksi laitteet, joita toimittaa CyberFluor Inc., Toronto, Ontario, Kanada, samoin kuin laitteet signaalien mittaamiseksi liuoksesta. Ellei käytettävissä ole 20 laitteita suhteen mittaamiseksi suoraan yhdessä vaiheessa, on mahdollista, vaikkakin vähemmän edullista, mitata kyseiset kaksi signaalia erikseen ja muodostaa suhde mainittujen mittausten perusteella asianmukaisia suojatoimenpiteitä käyttäen. Edellä mainitussa WO-hakemusjulkaisussa I · 25 80/02076 kuvataan muita mittauslaitteita, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä. Pyyhkäisevä valonsä-dekimppu on edullisesti voimakas monokromaattinen tai olennaisilta osiltaan monokromaattinen sädekimppu, erityisesti lasersädekimppu. Aallonpituudet, joita käytetään 30 fluoresenssin eksitointiin käyttämällä pyyhkäisevää valon-sädekimppua, tulisi valita fluoresoivien merkkiaineiden luonteen mukaan tunnettujen periaatteiden mukaisesti, ja on selvästi edullista, että molemmat signaalit voidaan eksitoida ja todella eksitoidaan samalla aallonpituudella. 35 Pulssifluoresenssi, jossa tehdään aikaerottelu, on edul- . 92881 20 linen menetelmä ainakin yhden merkkiaineen kohdalla, koska se mahdollistaa taustahäiriöiden seulomisen pois helpommin, mutta se ei ole olennainen osa keksinnöstäni. Jos käytetään muun tyyppisiä merkkiaineita, käytetään myös 5 sopivia tavanomaisia laskenta- tai määritysvälineitä ja -menetelmiä mainittujen sijasta.

Koska tämä keksintö toteutetaan käyttämällä vasta-aineita tai muita reseptorimolekyylejä, joiden määrä on niin pieni ja joilla on sellainen affiniteettivakio tut-10 kittavan analysoitavan aineen suhteen, että vain merkityksetön osa (tavallisesti alle 5 %, edullisesti alle 1 %) näytteessä olevan analysoitavan aineen kokonaismäärästä sitoutuu reseptorimolekyyleihin, on tarpeetonta käyttää tilavuudeltaan tunnettua näytettä konsentraation mittaa-15 miseen tai näytteitä, joiden tilavuus on vakio, kalibroin-tikokeisiin, eikä tällaista tilavuutta tarvitse mitata tarkasti tai ollenkaan sillä edellytyksellä, että se on riittävän suuri suhteessa reseptorimäärään, jotta vain merkityksetön osa analysoitavasta aineesta sitoutuu resep-20 toriin. Välinettä voidaan siten käyttää koettimena erilaisten analysoitavien aineiden pitoisuuksien seuraamiseen suurissa nestemäärissä, kuten teollisissa prosesseissa esiintyvissä nesteissä.

Eräs lisäetu on se, että käytettäessä fluoresoivia 25 merkkiaineita ja tehtäessä pyyhkäisy valonsädekimpulla valonsädekimpun ei tarvitse kattaa koko reseptorimolekyy-lejä sisältävää kohtaa vaan voidaan tutkia vain osa tästä kohdasta, koska sitoutuneen analysoitavan aineen ja resep-torimolekyylien kokonaismääriä ei tarvitse tutkia.

30 Käytettäessä takaisintitrauksessa kompetitiivista järjestelmää leimatun anti-idiotyyppisen vasta-aineen tai muun leimatun takaisintitrausreagenssin ei myöskään tarvitse täyttää kaikkia sitoutumiskohtia, jotka ovat jääneet täyttymättä analysoitavalla aineella, sillä edellytyksel-35 lä, että reagenssi täyttää niistä osan, joka säilyy vakio-

II

92881 21 na mittauksissa, joissa käytetään nestenäytettä, jossa analysoitavan aineen pitoisuus on tuntematon, ja standardeja, joissa analysoitavan aineen pitoisuus tunnetaan. Tällöin käytetään yleensä vakiona pysyviä (suhteellisen 5 suuria) anti-idiotyyppisen vasta-aineen tai muun leimatun takaisintitrausreagenssin pitoisuuksia, jotka saatetaan kosketukseen hyvin pienten määrien kanssa reseptorimole-kyyli - sitoutunut analysoitava aine -järjestelmää, tai vakiotilavuuksia samoin kuin vakiopitoisuuksia. Samanlai-10 set huomautukset pätevät sitoutuneen analysoitavan aineen ja analysoitavan aineen täyttämien sitoutumiskohtien reaktioihin ei-kompetitiivisessa takaisintitrausjärjestelmässä.

Keksinnön mukaiset välineet voidaan pakata käytet-15 täviksi kaupallisesti sairaaloissa tms. analysoitavien aineiden mittaamiseen sopivan fluoresenssinmittauslaitteen avulla kokoamalla ne välineistön muotoon, joka koostuu kiinteällä substraatilla olevista leimatuista reseptorimo-lekyyleistä, analysoitavaa ainetta sisältävistä standar-20 diliuoksista ja leimatuista takaisintitrausreagensseista.

Välineistön käyttö mahdollistaa mittausten tekemisen rutiininomaisesti sopivilla laitteilla.

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin esimerkein.

25 Esimerkki 1

Kuvaus menetelmien perusperiaatteista määritettäessä tyroksiini (T4) käyttämällä radioisotoopilla (131I) leimattua antityroksiinivasta-ainetta ja radioisotoopilla ( I) leimattua tyroksiinia ja reagenssipitoisuuksien va-30 litsemisesta siten, että saadaan pätevä merkkiainesuhtei-siin perustuva immuunimääritysmenetelmä.

(Antityroksiinivasta-ainetta on saatavissa helposti kaupallisesti, ja sitä on myös valmistettu the Department of Molecular Endocrinologyssa, the Middlesex Hospital 35 Medical School, Mortimer Street, Lontoo, sekä tavanomaisin 92881 22 immunisointimenetelmin (in vivo) että in vitro monoklonaa-listen vasta-aineiden valmistusmenetelmin.) Tässä esimerkissä käytetty antityroksiinivasta-aine on T4-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine, joka valmistettiin valitsemal-5 la joukosta vasta-aineita, joita tuotettiin immunisoimalla hiiriä käyttämällä naudan tyroglobuliinia immunogeeninä, Sen sitoutumisvakio on suuruusluokkaa 109 1/M, ja sen si-toutumisominaisuudet eivät muuten ole poikkeukselliset. Se leimattiin 13lI:lla käyttämällä tavanomaista kloramiini-T-10 menetelmää, jota käytetään yleisesti jodilla leimattujen vasta-aineiden ja muiden proteiinien valmistukseen. Se kytkettiin sitten kaupallisesti saatavissa olevaan mikro-kiteiseen selluloosaan [Sigma-Cell Type 20] käyttämällä tavanomaista menetelmää [Clinica Chemica Acta 118 (1982) 15 129 - 134].

I-leimatun tyroksiinin, jolla on suun ominaisak-tiivisuus, toimitti Amersham International, Amersham, Berks.

Seerumissa (1 ml) oleva T4 erotettiin käyttämällä 20 kaupallisesti saatavissa olevaa anioninvaihtohartsia (Bio-

Rad AGlx2, 400 - 600 mesh, kolonnina) ja eluoitiin 70-%:isella etikkahapolla pesun jälkeen [katso Endocrinology 117 (1985) 1 890]. Saantokokeet (joissa käytettiin tutkittavaan seerumiin alussa lisättyjä mitättömän pieniä määriä 25 I-leimattua T4:ää) osoittivat, että kokonaissaannot oli vat suuruusluokkaa 70 *. Kukin tutkittavaa seerumia sisältävä eluaatti liuotettiin uudelleen tavanomaiseen Hepes-puskuriin (50 ml), jolloin saatiin T4-liuoksia, joiden laskettiin olevan pitoisuusalueella 0,5 - 1,5 ng/ml (ts. 30 suuruusluokkaa 10"9mol/l). T4-standardiliuokset valmistet tiin laimentamalla sopivalla tavalla T4-varastoliuosta Hepes-puskurilla, niin että saatiin T4-pitoisuusalue 0 -10 ng/ml.

Ensimmäisessä koesarjassa inkuboitiin erilaisia 35 määriä kiinteälle faasille sidottua 131I-leimattua vasta- 92881 23 ainetta 1 ml:n kanssa T4-pitoisia standardiliuoksia, joihin oli lisätty hyvin pieniä määriä 125I-leimattua T4:ää ja joissa T4-kokonaispitoisuus oli 0,1 ng/ml, inkubointiaiko-jen vaihdellessa 10 minuutista 8 tuntiin. Inkuboinnin jäl-5 keen kiinteällä faasilla oleva vasta-aine erotettiin sent-rifugoimalla, pestiin ja laskettiin adsorboitunut I-lei-mattu T4 käyttämällä kaksikanavaista gammalaskuria ja tavanomaisia laskentamenetelmiä itse l25I:n aktiivisuuden erottamiseksi. Piirrettiin käyrät, jotka esittävät vasta-10 aineen adsorboimaa 125I-aktiivisuutta inkubointiajän ja leimatun vasta-aineen määrän funktiona. Näiden tulosten perusteella valittiin sellainen vasta-ainemäärä ja inkuboin-tiaika, että noin 5 % inkubointiseoksessa olevan T4:n kokonaismäärästä (ts. noin 5 pg, jolloin tuloksena on noin 15 1 000 125I-pulssia/min) adsorboituu laskelman mukaan vasta- aineelle (ts. vasta-ainemäärä, jonka tuloksena oli noin 200 131I-I-pulssia/min, ja kokonaisinkubointiaika 4 tuntia). Varmistettiin, että näissä olosuhteissa: a. käytetyn vasta-ainemäärän kaksinkertaistaminen tai puolittaminen ei 20 muuttanut merkitsevästi (ts. yli 2 %:lla) suhdetta 125I/131I; b. käytetyn standardiliuoksen tilavuuden suurentaminen ei vaikuttanut suhteeseen 125I/131I.

Käyttämällä tätä standardimäärää vasta-ainetta tehtiin määrityksen kalibrointi seuraavasti. Standardimäärää 25 vasta-ainetta inkuboitiin 1 ml:n annosten kanssa edellä kuvattuja T4-standardiliuoksia 4 tuntia. Kiinteällä faasilla oleva vasta-aine erotettiin sitten kussakin tapauksessa sentrifugoimalla, pestiin nopeasti puskurilla ja inkuboitiin uudelleen 3 ml:n kanssa 125I-leimattua T4:ää 30 sisältävää standardiliuosta, jonka T4-pitoisuus oli noin 1 ng/ml, vielä 4 tuntia. Kiinteällä faasilla oleva vasta-aine eristettiin taas kussakin tapauksessa sentrifugoimalla, pestiin huolellisesti neljästi kaiken jäljellä olevan 125I-leimattua T4:ää sisältävän liuoksen poistamiseksi ja 35 mitattiin 125I/131I-suhde, joka vastaa kutakin mitattua T4- 92881 24 standardipitoisuutta. Koska tässä sarjassa on käytetty vakiomäärää vasta-ainetta (noin 200 131I-pulssia/min), 131I-pulssimäärä oli suurin piirtein vakio kussakin tapauksessa; 125I-pulssimäärä vaihteli kuitenkin noin arvosta 5 2 000 min"1 standardin T4-pitoisuuden ollessa nolla suun nilleen arvoon 200 min'1 standardin T4-pitoisuuden ollessa 10 ng/ml (ts. 125I/131I-suhde vaihteli alueella 10:1 - 1:1). Lisäkoesarjalla varmistettiin jälleen, että a. kiinteällä faasilla olevan vasta-aineen määrä vaihtelu kertoimella 5 10 ei vaikuttanut annos-vastekäyrän muotoon eikä sijaintiin ja b. vastaavat T4-standardiliuosten tilavuusmuutokset eivät myöskään vaikuttaneet käyrään. Nämä tulokset osoittivat, että järjestelmä on riippumaton näytteen tilavuudesta ja vasta-ainepitoisuudesta. Tämä järjestelmää käy-15 tettiin sitten edellä kuvatulla tavalla saatujen T4-uut-teiden tutkimiseen verraten tuntemattomille näytteille saatuja 125I/131I-suhteiden arvoja standardikäyrään tavanomaisella tavalla, ja verrattiin tuloksia tavanomaisella T4-määritysmenettelyllä saatuihin tuloksiin. Tulokset 20 olivat hyvin vertailukelpoisia; ne olivat yleensä yhtäpitäviä 5 %:n tarkkuudella, ja erot olivat harvoin yli 10 %.

Esimerkki 2

Kaksoisfluoresenssi-T4-määritysmenetelmän kehittäminen 25 Esimerkki 1 valaisee reittiä, joka valittiin päte vän "kahden merkkiaineen suhteeseen perustuvan" kompeti-tiivisen immuunimääritysmenetelmän kehittämiseksi. T4:n leimaamiseen käytetyn 125I:n korvaaminen fluoreseiinimerk-kiaineella ja anti-T4-vasta-aineen leimaamisen käytetyn 30 131I:n korvaaminen rodamiinimerkkiaineella on mahdollistanut analogisen kahden fluoresenssin suhteeseen perustuvan immuunimääritysmenetelmän kehittämisen. Vasta-aineen ja T4:n leimaaminen näillä fluoresoivilla merkkiaineilla tehtiin tavanomaisin menetelmin (A. Johnston ja R. Thorpe, Im-35 munochemistry in Practice, Blackwell Scientific Pub 1982).

92881 25

Jotta helpotettaisiin oikeiden reagenssipitoisuuksien valitsemista, tehtiin kuitenkin tiettyjä kokeita käyttämällä kaksinkertaisesti leimattua (ts. 131I:llä ja rodamiinilla leimattua) vasta-ainetta ja kaksinkertaisesti leimattua 5 (ts. I25I:lla ja fluoreseiinilla leimattua) T4:ää. Lisäksi vasta-aine kerrostettiin (adsorboimalla) pienille polysty-reenikiekoille, eikä sidottu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla kovalenttisesti mikroselluloosaan, käyttämällä tunnettua menetelmää polystyreenin päällystämiseksi. Tässä 10 esimerkissä määritettiin tuntemattomissa näytteissä oleva T4-pitoisuus rodamiinin ja fluoreseiinin fluoresenssien suhteesta käyttämällä Perkin Elmer Type LF-5 -luminenssis-pektrometriä (fluorimetriä) fluoresenssisignaalien peräkkäiseen mittaamiseen. Saatuja tuloksia verrattiin taas 15 esimerkissä 1 kuvattujen isotooppisuhdemittausten perusteella saatuihin tuloksiin ja tavanomaisella T4-määritys-menettelyllä saatuihin tuloksiin, ja tuloksena oli jälleen tyydyttävä yhtäpitävyys.

Esimerkki 3 20 Kaksoisfluoresenssi-T4-määritysmenetelmän, jossa käytetään aikaeroteltua pulssitluoresenssia, kehittäminen

Sen sijaan että T4 ja anti-T4-vasta-aine olisi leimattu esimerkissä 2 kuvatulla tavalla fluoreseiinilla ja rodamiinilla, ne leimattiin terbiumin ja vastaavasti euro-25 piumin kelaateilla EDTAn (etyleenidiamiinitetraetikkaha- pon) kanssa, jotka kytkettiin tunnetulla tavalla vasta-aineeseen. Signaalien suhde mitattiin tunnetulla pulssi-valofluoresenssimenetelmällä käyttämällä tunnettua aika-erottelufluorimetriä ja tuntemattomalle näytteelle saatuja 30 tuloksia verrattiin standardiliuoksista saatuun kalibroin- tikäyrään. Tuloksena oli jälleen tyydyttävä yhtäpitävyys muilla menetelmillä saatujen tulosten kanssa.

Esimerkki 4 Välineistö, joka on tarkoitettu RSH:n (tyrotropii-35 nin) määrittämiseen keksinnön mukaisesti, koostuu seuraa- « 92881 26 vista komponenteista: (a) Monoklonaalinen anti-TSH-vasta-aine, joka on kaupallisesti saatavissa the Department of Endocrinologys-ta, the Middlesex Hospital Medical School, Mortimer 5 Street, Lontoo, immobilisoidaan kiinteälle levylle ja leimataan fluoreseiinilla.

(b) Standardiliuokset sisältävät 0,2, 1,0, 5,0, 20,0 ja 100 μky/mol TSHsta.

(c) Takaisintitrausreagenssi on samoin kaupallises-10 ti saatavissa oleva monoklonaalinen anti-TSH-vasta-aine, joka tällä kertaa leimataan europium(III):n kelaatilla kupari(II)trifluoriasetyyliasetonin ja formaldehydin kanssa tavalla, jota ehdotetaan WO-hakemusjulkaisussa 86/01604. Ensimmäinen vasta-aine on pysyvästi fluoresoiva, 15 ja toinen voidaan määrittää aikaerottelupulssifluoresens-silla.

Tällaista välineistöä voidaan käyttää TSH:n määrittämiseen käyttämällä edellä esimerkeissä 1-3 kuvatun kaltaista menettelyä; 20 anti-THS-vasta-aineen määrä ja THSsta sisältävän näytteen koko valitaan siten suhteessa toisiinsa, että korkeintaan noin 5 % näytteessä olevasta TSHssta sitoutuu levyllä olevaan anti-TSH-vasta-aineeseen. Takaisintitrauk-sessa käytetään ei-kompetitiivista järjestelmää kompeti-25 tiivisen sijasta, mutta se on periaatteessa samanlainen.

«

Claims (12)

1. 92881 27 Patenttivaatimukset s
2. 1. Menetelmä tuntemattomassa nestemäisessä näytteessä olevan analysoitavan aineen pitoisuuden määrittä- 5 miseksi, jossa menetelmässä saatetaan näyte kosketukseen reseptorin kanssa, jonka molekyylillä on sitoutumiskohtia analysoitavaa ainetta varten ja joka on leimattu ensimmäisellä merkkiaineella, jolloin analysoitava aine täyttää osan reseptorimolekyylillä olevista sitoutumiskohdista, 10 takaisintitrataan reseptori, jonka sitoutumiskohdat on osittain täytetty, takaisintitrausmenetelmällä, jossa käytetään järjestelmää, joka sisältää toisen merkkiaineen, joka on erilainen kuin ensimmäinen, mitataan näiden kahden merkkiaineen antamien kahden signaalin suhteelliset voi-15 makkuudet, jolloin saadaan arvo, joka edustaa analysoitavan aineen valtausosuutta reseptorimolekyylillä olevista sitoutumiskohdista, ja verrataan tätä arvoa yhteen tai useampaan vastaavaan arvoon, jotka saadaan samalla tavalla käyttämällä yhtä tai useampaa nestemäistä standardinäytet-20 tä, joissa analysoitavan aineen pitoisuus on tunnettu, joka menetelmä on tunnettu siitä, että sekä nestemäiset tutkittavat että standardinäytteet saatetaan kukin kosketukseen niin pienen määrän kanssa reseptoria, • että ottaen huomioon reseptorin affiniteettivakio analy- :25 soitavan aineen suhteen vain merkityksetön osa analysoitavasta aineesta sitoutuu reseptoriin.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaineet ovat fluoresoivia merkkiaineita.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että takaisintitrausmenetelmässä käytetään kompetitiivista järjestelmää, joka sisältää ta-kaisintitrausreagenssin, joka on merkkiaineella leimattu analysoitava aine tai toinen aine, jolla on kyky sitoutua 35 vain täyttymättömin reseptorimolekyylillä olevin analysoi- 28 92bb'l tavan aineen sitoutumiskohtiin ja joka on leimattu merkkiaineella.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että takaisintitrausmenetelmässä 5 käytetään ei-kompetitiivista järjestelmää, joka sisältää takaisintitrausreagenssin, jolla on kyky sitoutua sitoutuneeseen analysoitavaan aineeseen tai ainoastaan sitoutuneen analysoitavan aineen täyttämiin reseptorimolekyy-lillä oleviin sitoutumiskohtiin ja joka on jo leimattu tai 10 leimataan myöhemmin merkkiaineella.
6. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkityksetön osa on vähemmän kuin 2 % läsnä olevan analysoitavan aineen kokonaismäärästä.
7. 6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-5 mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että reseptori on analysoitavan aineen vasta-aine.
8. 7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitava aine 20 on hormoni.
9. 8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analysoitavaa ainetta sisältävä näyte ei sisällä sitovaan aineeseen re- . versiibelisti sitoutunutta analysoitavaa ainetta. 2*5 9. Minkä tahansa· patenttivaatimuksen 2-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että merkkiaineet ovat eri lantanidikelaatteja, joista tulee fluoresoivia vain aktivoitaessa, ja fluoresenssi mitataan aikaerotellulla pulssifluoresenssilla, jossa tehdään pyyhkäisy suuri-in-30 tensiteettisellä valonsädekimpulla.
10. 10. Analyysiväline analysoitavien aineiden kvantitatiiviseksi määrittämiseksi nestemäisestä näytteestä, tunnettu siitä, että se sisältää laajennetun kiinteän substraatin, johon on kiinnitetty useissa toisistaan 35 erillään olevissa kohdissa useita eri reseptoreja, joista • · 92881 29 kullakin on analysoitavan aineen sitoutumiskohtia, jolloin kussakin kohdassa olevalla reseptorilla on sitoutumiskohtia, jotka ovat spesifisiä analysoitavalle aineelle, joka on eri aine kuin analysoitava aine, jolle yhdessä tai 5 useammassa muussa kohdassa olevalla reseptorilla on sitoutumiskohtia, ja kukin reseptori on leimattu merkkiaineella, jolloin kussakin erillään olevassa kohdassa olevan reseptorin määrä on sellainen, että kun sitä altistetaan analysoitavaa ainetta sisältävälle näytteelle, sitoutumis-10 kohtien valtausosuus on oleellisesti riippumaton käytetystä reseptorin määrästä.
11. 11. Välineistö käytettäväksi menetelmässä nestemäisessä näytteessä olevan analysoitavan aineen pitoisuuden määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se si- 15 sältää kiinteän substraatin, johon on kiinnitetty resepto-rimolekyylejä, jotka on leimattu ensimmäisellä, edullisesti fluoresoivalla merkkiaineella ja joilla on sitoutumiskohtia analysoitavaa ainetta varten, ja jolla substraatilla oleva reseptorimäärä valitaan nestenäytteen koon mu-20 kaan, niin että vain merkityksetön osa näytteessä olevasta analysoitavasta aineesta sitoutuu reseptoriin, yhtä tai useampaa standardiliuosta, jotka sisältävät tunnettuina pitoisuuksina analysoitavaa ainetta, sekä takaisintitraus-reagenssia, joka on leimattu toisella, edullisesti fluo- ♦ · -25 resoivalla merkkiaineella, joka on eri aine kuin ensimmäinen merkkiaine ja jolla on kyky sitoutua suoraan tai epäsuorasti joko sitoutuneeseen analysoitavaan aineen tai sitoutuneen analysoitavan aineen täyttämiin sitoutumiskohtiin tai sitoutumiskohtiin, jotka eivät ole sitoutuneen 30 analysoitavan aineen täyttämiä.
12. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen välineistö, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen analyysivälineen. 30 92681