JPH0449657B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 特定の被検物質を含有すると思われる被検液
中に前記特定の被検物質が存在するか否かを測定
するための改良された方法であつて、 (a) 反応によりアヴイデインと結合した、肉眼で
認識が可能でかつ実質的に平らな表面を有する
固相支持体を準備する工程と、 (b) 前記固相支持体表面の所定の部分に、前記特
定の被検物質と特異的に反応するビオチニル化
された第１の分子をさらに反応させて結合させ
た固相支持体を形成する工程と、 (c) 前記ビオチニル化された第１の分子を含む固
相支持体の所定の部分に前記被検物質が結合す
るよう、工程(b)で処理、かつ形成された支持体
に特定の被検物質を含有すると思われる被検液
を反応させる工程と、 (d) 工程(c)から得られた前記支持体を、特定の被
検物質に特異的に反応する、検出可能な部分で
標識された第２の分子と反応させ、前記特定の
被検物質、固相支持体上のビオチニル化された
第１の分子および標識された第２の分子を含有
する化学種を形成する工程と、 (e) 第２の分子の標識された部分を検出して、そ
の結果より被検液中に特定の被検物質が存在す
るかしないかを決定する工程とを備える特定の
被検物質を検出するための方法。

２ 検出すべき特定の被検物質がヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン（HCG）である請求項１に記載の
方法。

３ 固相支持体が多孔質体である請求項１に記載
の方法。

４ 固相支持体がフイルタ体である請求項１に記
載の方法。

５ 前記検出可能な部分がβ−ガラクトシダーゼ
である請求項１に記載の方法。

６ 第２の分子の標識された部分が発色試薬との
反応によつて検出される請求項１に記載の方法。

７ (a) 表面がアヴイデインの層で被覆され、前
記アヴイデインの層の所定の部分が、検出され
るべき被検物質に特異的でかつビオチニル化さ
れた第１の分子と反応させられている固相支持
体、および (b) 検出されるべき被検物質に特異的で、検出が
可能な部分で標識された第２の分子を備える、 特定の被検物質を検出するためのキツト。

８ 検出されるべき被検物質がヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン（HCG）である請求項７に記載のキ
ツト。

９ 標識された第２の分子が酵素の部分を含有
し、さらに、標識酵素と反応させられる際、発色
するような発色基質を含有する請求項７に記載の
キツト。

１０ 標識された第２の分子が、検出可能な標識
としてβ−ガラクトシダーゼを含む請求項７に記
載のキツト。

１１ (a) 肉眼で認識が可能でかつ実質的に平ら
な表面を有する固相支持体の少なくとも一部分
をアヴイデインで被覆する工程と、 (b) 工程(a)のアヴイデインで被覆された支持体の
所定の部分にのみ、検出されるべき被検物質に
特異的でかつビオチニル化された第１の分子を
被覆し、その結果、表面に被覆されない部分を
残すとともに、ビオチニル化された分子で被覆
された所定のパターンの領域を形成する工程と
を備える多重指標支持体の製造方法。

１２ 前記工程(a)が、ほぼ平らな支持体の実質的
に１個の表面をアヴイデインで被覆することを備
え、 前記工程(b)が、前記１個の表面上にビオチニル
化された分子を所定のパターンで印刷することを
備える請求項１１に記載の方法。

１３ 前記工程(a)が、紙にアヴイデインを被覆
することを備える請求項１２に記載の方法。

１４ 肉眼で認識が可能でかつ実質的に平らな表
面を有する固相支持体と、 前記表面の少なくとも実質的な部分に施された
アヴイデイン塗膜と、 アヴイデイン塗膜の表面上に所定のパターンの
みで印刷された、所望の被検物質と特異的に反応
するビオチニル化分子とを備える多重指標支持
体。

１５ 固相支持体表面が実質的に完全にアヴイデ
インの被覆されており、かつ前記ビオチニル化分
子のパターンは、該表面の全体より実質的に少な
い部分を占拠している請求項１４に記載の多重指
標支持体。

１６ ビオチニル化分子のパターンが、読みやす
い記号、数字もしくは文字またはこれらの組合せ
の形で存在する請求項１４または１５に記載の多
重指標支持体。

発明の分野 本発明は、一般的には酵素免疫検定法（EIA）
の技法に関するものであり、より詳しくは、ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）の測定に関す
るものである。

背 景 酵素免疫検定（EIA）法は、既に既述されてい
る、［Guesdon J.，Ternyck，T.，Avrameas，
S.，「免疫酵素学的技法におけるアヴイデイン−
ビオチン間の相互作用の利用」、J.Histochem.
Cytochem.，27：1131−1139，1979］。Guesdon
達は、EIA操作におけるビオチンによつての抗
体、抗原および酵素の標識の効果を試験した。ビ
オチン−アヴイデイン相互作用はよく知られてお
り、かなり徹底して研究されており、かつアヴイ
デインをセフアローズ・クロマトグラフイ・カラ
ムに結合させ、精製すべき蛋白質にビオチンを結
合させ、ビオチニル化蛋白を前記のカラムに結合
させ、該カラムを洗い、ついでカラムから精製さ
れた蛋白−ビオチン結合体蛋白を溶出することに
よる試薬の精製に利用されてきた［Liu，F.，
Zinnecker，M.，Hamaoka，T.およびKatz，D.
H.，Ｊ，Biochemistry，18：690，1979］。

血清中または尿中のHCGの測定は、妊娠初期
の診断、子宮外妊娠の検知、および種々の腫瘍の
監視において興味あるものである［Walsh，P.
R.，Wang，M.，Gittermann，M.L.，Clinical
Immuochemistry（臨床免疫化学）、アメリカ臨床
免疫化学協会1978年発行、Natelson，S.ら編、
第306−328頁］。

種々の検定操作において、ろ紙を、普通は小型
のデイスクの形態で、使用することは周知であ
る。しかし、ろ紙デイスクを用いたHCG検定法
を開発しようとする努力は未だ成功していない。
相当な研究の後に、HCG抗体をデイスクに結合
させ、このデイスクをHCGの含有が疑われる溶
液、たとえば尿と反応させることに基づく方法は
信頼性と感度において劣ることが見出された。さ
らに、デイスクおよびろ紙装置は、既知の技術に
よつては、満足し得るように製造することは不可
能である。本発明は、これらの欠点を克服し、尿
その他の溶液中のHCGの迅速、簡易かつ信頼し
得る酵素免疫検定を可能ならしめるものである。

発明の概要 高感度であり、極めて簡易に実施でき、家庭で
使用し得るキツトに採用可能な絨毛性性腺刺激ホ
ルモン（HCG）の測定法が開発された。本発明
は、この検定を実施する方法およびそのためのキ
ツトまたはシステムを包含する。本発明の概念
は、特異的な抗原の検定に広く応用でき、また抗
原抗体の役割を単に逆にするだけで、同じ概念を
用いて抗体の測定にも適合させることができる。

ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（HCG）の測定
を例にとつた場合の本発明の方法のとりわけ好ま
しい態様は、以下のステツプを備える：固相の形
での支持の全部または一部を化学結合、物理的吸
収またはその他の任意の適当な方法によりアヴイ
デインで被覆し、ビオチニル化抗HCG抗体をそ
の支持体にアヴイデイン−ビオチン連結（カツプ
リング）を介して付加し、このようにして調製さ
れた支持体をHCGの含有が疑われる試料、たと
えば溶液ならびに標識された抗HCG抗体に曝露
する。この結果、その固相の支持体の表面には
HCGおよび検出可能な標識が結合され、この標
識の存在量はHCG基質または標識発色剤の量に
比例し、また標識が放射性であれば、試料中の
HCG濃度としてカウントされる。別法として、
標識種を支持体から分離し、従来法のいずれかに
より検出してもよい。たとえばｂ−ガラクトシダ
ーゼを用いての酵素標識が好ましいアプローチで
はあるが、他の酵素または放射性標識を用いても
よい。

本発明は、抗体の存否の決定および抗体量の測
定のための技法においても利用できる。この場合
には、その特定の抗体に対する抗原をビオチニル
化し、アヴイデインを介して支持体に結合させ、
類似の抗原を標識し、抗体を被測定種とする以外
は同様に反応を行なう。

図面の説明 第１図は、固相の支持体を示し、これは全体ま
たは一部をアヴイデインにより被覆されており、
その上の選別された領域はビオチニル化抗体によ
り被覆されており、ビオチニル化抗体の印刷また
はその他の方法の適用による所定領域に形成され
得るパターンの例が示されている。

好ましい実施例の説明 本検定法における固相の支持体は、この実施例
では、直径約0.7cmのデイスク（ホワツトマン
（商標）541級）である。紙デイスクは、まず、
Ｒ，Axenら（Nature，214：1302，1967）が記
述している操作法に従つて、CNBrにより活性化
される。活性化したデイスクをアヴイデインと４
℃で一夜反応させる。反応後、溶液を除去し、デ
イスクを50mMエタノールアミン（PH＝8.0）で
室温にて２時間処理してブロツクした。次に、デ
イスクを0.1MのNaOAe、0.5MのNaCl緩衝液
（PH＝4.0）および0.1MのNaHCO₃、0.5MのNaCl
緩衝液（PH＝8.3）で交互に３回ずつ十分に洗浄
した。

アフイニテイ精製ウサギ抗HCG抗体のビオチ
ニル化は、抗体とＮ−ヒドロキシスクシンイミジ
ルビオチンとをホウ酸塩緩衝塩溶液（BBS）中
PH＝8.3にて室温で２時間インキユベートして達
成した。次に、過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルビオチンをゲルろ過により除去した。

β−ガラクトシダーゼ連結抗体は、F.T.Liuら
が公表した操作法［J.Biochemistry18：690
（1979）］に従い、アフイニテイ精製マウス抗
HCGモノクロナール抗体をβ−ガラクトシダー
ゼと、架橋試薬Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド（MBS）を介して反
応させて調製した。

免疫検定は、上記のように、検定成分の相互反
応により行なう。

典型的なデイスク−アヴイデイン ビオチン−
Ab−HCG−Ab−β−ガラクトシダーゼ（HCG
EIA）の一例では、デイスクを抗HCG−β−ガ
ラクトシダーゼの凍結乾燥ペレツト１個と共にチ
ヤンバに入れ、尿試料250μによつてペレツト
を溶解させて、デイスクに水分を補給する。デイ
スク−アヴイデイン−ビオチン−抗HCG
（BAD）、抗HCG−β−グルコシターゼおよび尿
試料を同時に室温で10分間インキユベートする。
次に、デイスクを取出し、緩衝液またはぬるま湯
流によりよく洗う。最後に、デイスクを、β−ガ
ラクトシダーゼに対する合成基質であるｏ−ニト
ロフエニル−ガラクトピラノシド（ONPG）と
共にインキユベートする。酵素活性は、尿試料中
に存在するHCGの量と関連している。

上記プロトコールを用いて、用量反応曲線の得
られることが証明されている。定性的検定では、
400mIU／mlのHCGを含有する尿試料を裸眼で容
易に検出できる。このHCG濃度は無月経に終わ
つた予定月経期の約３日後に相当する。

本発明の１つの特徴は、前記の方法およびプロ
トコールをキツトにまで応用したところにあり、
そのキツトは、素人でも自宅で、可能性ある妊娠
の指標としてのHCGの存否を検出するために使
用できるものである。上記プロトコールが示すと
おり、この検知は、月経期がなかつた後の３日目
に早くもなし得るのである。無月経は妊娠を示し
ているものかもしれず、また合併症の可能性を示
しているかもしれず、個人によつては、妊娠の早
期指摘は重要である。検査質技法あるいは熟練を
要しないで使用できるキツトが長く求められてい
た。キツトは、種々の腫瘍をモニタするのに病院
または検査室の内外でも使用し得る。

キツトは、尿中HCGの定性的または半定量的
測定を完了するのに必要なすべての試薬を包含す
る。キツトの基本的構成要素は次のとおりであ
る：(1)アヴイデインで処理された固相の支持体、
典型的にはろ紙、アヴイデインはろ紙に結合され
て、ビオチニル化抗HCG抗体と反応する部位を
与えている。(2)標識抗HCG抗体。(4)洗浄試薬。
および(5)発色試薬。好ましい実施態様として挙げ
た前記の場合はあくまで例示であつて、限定的な
意味を持たないが、その場合の発色試薬はｏ−イ
トロフエニル−ガラクトピラノシト（ONPG）
である。β−ガラクトシド標識HCG抗体種の発
色によつて、裸眼で認め得る色の変化が生じる。
他の色または視覚効果を生じる標識と発色剤との
組合せを適用してもよいが、現在のところは上記
の系が好ましい。緩衝液、塩溶液試薬などを含め
てもよいが、これらは上記の種々の試薬の中に配
合しておくのが好ましい。本発明に従つたキツト
は、典型的には、所定体積の指標腺を持つ容器、
使用説明書および使用者に便利なその他付属品を
包含することになろう。

第１図は、キツト構成要素のごとき、本発明の
原理を具体化する製造物の一例を示している。第
１図にしめされたデバイスは、固相の支持体、ア
ヴイデイン層およびビオチニル化抗体（抗体を検
知すべき場合には抗原）層からなる。これらの層
は互いに完全にぴつたり重なり合つていなくとも
よいことはもちろんであり、基体が多孔質であれ
ば物理的に明確に区別された層でなくても、質的
には上記の構造を持つであろう。基体は多孔性で
あつても非多孔性であつてもい。たとえば、ろ紙
およびポリスチレンのいずれもが極めてよく役立
つ。

諸反応において不活性であり、アヴイデインが
化学反応または物理的付着のいずれかによつて結
合し得るならば、固相材料はいかなるものを用い
てもよい。ろ紙デイスクまたはシートはよく使用
される固相の支持体材料であり、ポリスチレンの
デイスクまたはシートもそうである。

次の成分はビオチニル化抗体（または抗原）で
あり、これは先に述べた例の場合と同様に、全面
にコートされはしない。ビオチニル化抗体（また
は抗原）は、むしろ、アヴイデイン被覆面の選ば
れた領域にのみ、任意に、所望のパターンで、
「印刷」される。ここに、「印刷」なる語は、本発
明の複合指標基体製造のための最もよく知られた
技法を記述するために用いているのであつて、選
ばれた領域に抗体「印刷」できることが、本発明
の非常に重要な一特徴なのである。ろ紙または他
の基体の表面に何らかの信頼すべきパターンを設
けることは、試薬が基体を通つて移行するため
に、従来極めて困難であつた。本発明は、この問
題をすべて取除くものである。ビオチニル化抗体
はアヴイデインと直ちに連結し、それによつて、
アヴイデイン被覆支持体上の、特定の抗体が見出
されるであろう領域を規定する。この連結によつ
て、印刷中または、印刷後、および反応中の抗体
（または抗原）の移行が防止される。かくして、
多重指標基体を発色させるとき、抗体およびそれ
に結合された抗原（あれば）は印刷されたのとち
ようど同じ場所に見出されるであろう。印刷は、
紙にインクで印刷するのと同様にして、すなわ
ち、アヴイデイン被覆支持体にビオチニル化抗体
を塗布した活字またはパターンを持つその他の手
段を適用することによつて実施し得る。これによ
り、いくつかの異なる抗体を有し得る多重指標支
持体を極めて効率的に大量生産できる。基体は、
抗体（または抗原）により形成されたしるしとと
もにインクまたは他の材料により形成されたしる
しをも包含し得る。たとえば、第１図において、
上の列および中央の列は、それぞれ、正方形およ
び円形の領域を示し、その中には、ビオチニル化
抗体が印刷された他の何らかのしるしが付いてい
る。下の列は、文字の形に印刷されたビオチニル
化抗体を示している。任意の記号、形状または文
字数字からなるしるしを使用し得ることは明白で
ある。

これらの多重指標基体は、臨床検査室あるいは
研究所で使用でき、また消費者用のキツトに含め
てもよい。いくつかの異なる抗体（または抗原）、
また、活性の異なる複数の抗体を、基体上に印刷
して、かかる多重指標基体１片で、いくつかの診
断テストを１度で実施したり、特定の抗原または
抗体について判定量的結果を得るようにすること
もできる。

考 察 （高純度であり、かつ便利な寸法のものを入手
できる）ろ紙のような繊維条基体にHCGを結合
させた方法およびキツトを提供しようとする努力
は成功しなかつた。かかるアプローチは実行不可
能だと思われていたといつてもよいほど、この方
法を２つの問題が妨げていた。第１に、感度の低
いことが重大であつた。第２、に、再現性の乏し
いことがより一層深刻な問題であつた。相当な努
力と問題の考察との後、本発明者達は、それらの
問題がろ紙への試薬の結合と関係があると確信す
るに至つた。問題が何かは基本的にははつきりし
ていない。抗原をろ紙またはそれと同等の多孔性
要素に結合させることは比較的容易であるので、
それらしいと考えられる問題がなかつた。はつき
りしたデータによつて証明されていない可能な１
つの説明としてにすぎないが、抗体が紙に結合す
るときに何らかのタイプの立体障害が生じて、そ
のために抗体処理ろ紙の完全な、定量的な、再現
性ある反応が阻害されると考えられる。いずれに
しても、実際に起こる分子レベルの現象にかかわ
りなく、結果としては乏しい感度、そして狭い検
定範囲ということになつた。この免疫検定範囲を
追及するのは有益とは思われなかつた。加うる
に、異なる免疫検定のために固相抗体を個々に連
結し、取扱い、保存することが必要なため、時間
と費用がかさんで手が出させないと考えられた。

問題を考察し、代替方法を種々評価し、かつ実
験を行なつて、本発明者達は上記の技法を開発し
たのであつて、該技法は、簡単で、信頼性と再現
性のある、実用可能で、感度の高い方法であつ
て、尿中HCG測定に直ちに応用でき、他の抗体
−抗原型反応にも広く応用できることが判明し
た。先に指摘したとおり、上記した抗体結合では
なくてビオチン−アヴイデイン連結を介して逆に
抗原を紙に結合させることにより、同じ操作を抗
体の存在の検知のために利用してもよい。このよ
うに、抗原、抗体なる用語は、本明細書および特
許請求の範囲においては、実質的に逆にして、以
上でおよび以下で使用する特定の用語の完全に均
等な逆を表わすことができるものである。

本発明を一般的に適用できることが確められて
いる。たとえば、アヴイデイン被覆基体をビオチ
ニル化抗DNP−IgGで被覆し、このアヴイデイ
ン−ビオチニル化抗DNP−IgG被覆基体を次に
DNP₄₉−BSAと反応させ、最後に抗DNP−β−
ガラクトシダーゼと反応させた。DNP₄₉−BSA
の存在が最後の反応における基体の被覆域上での
発色によつて判定された。結果は、常法により
420nmでの色の吸光度を読取ることにより、定量
的に求めることができる。

他の一実施例では、基体のアヴイデイン被覆部
をビオチニル化ブタクサアレルゲンで被覆し、次
に、抗ブタクサアレルゲンIgEを含有するヒト血
清およびヤギ抗ヒトIgE−β−ガラクトシダーゼ
と同時にインキユベートした。抗ブタクサIgEの
存在は、前記のとおりに被覆した領域での発色に
より決定し、上記のとおり測定法によつて測定す
ることができる。

本発明の好ましい実施例および用途を示すこと
によつて本発明の概念を例示したが、これは、記
載した特定の試薬、標識、発色剤または用途に限
定されるものでないことは了解されるであろう。