JPS60500731A - ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの検出 発明の分野 本発明は、一般的には酵素免疫検定法（ＥＩＡ）の技法に関するものであり、よ り詳しくは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（　＋−Ｉ　Ｃ　Ｇ　）の測定に関覆 るものである。

背景 酵素免疫検定（ＥＩＡ）法は、既に記述され一Ｃいる、［　（３　ｕｅｓｄｏｎ 　Ｊ　、　、　Ｔ　ｅｒｎｙｃｋ，　Ｔ　、　、△ｖｒａｍｅａｓ，　Ｓ　、、 　ｒ免疫酵素学的技法におけるアヴイデインービオチン間の相互作用の利用Ｊ　 、Ｊ　、　Ｈ　ｉｓｔｏｃｈｅｍ，　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、２　７　：　１　１ 　３１−１１３９．１９７９］．Ｇｕｅｓｄｏｎ達は、ＦＩＡ操作におけるビオ チンによっての抗体、抗原および酵素の標識の効果を試験した。ビＡチンーアヴ イデイン相Ｎ作用はよく知られでおり、かなり徹底して研究されでａ３リ、かつ アライブインをセファローズ・クロマトグラフィ・カラムに結合させ、精製すべ き蛋白質にビオチンを結合させ、ビオチニル化蛋白を前記のカラムに結合させ、 該カラムを洗い、ついでカラムから精製ざれた蛋白−ビオチニル化蛋白を溶出１ ることによる試薬の精製に利用されてきた［１−口３。

Ｆ．、Ｚｉｎｎｅｃｋｅｒ，　Ｍ．、Ｈａｍａｏｋａ，　Ｔ．およびＫ　ａｔｚ ，　ｎＨ，、Ｊ，　３ｉｏｃｌ）ｅｍｉｓｔｒｙ，　１　８　：　６９０，１９ ７９］。

血清中または尿中のＨＣＧの測定は、妊娠初期の診断、子宮外妊娠の検知、およ び種々の肝癌の監視において興味あるものである［Ｗａｌｓｈ，　Ｐ．　Ｒ．、 Ｗａｎｑ　、　Ｍ．、Ｇｉｔｔｅｒｍａｎｎ　、　Ｍ、　Ｌ、、Ｃｌ１ｎｉｃａ ｌ　ｌ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（臨床免疫化学）、アメリカ臨床免疫化 学協会１９７８年発行、Ｎ　ａｔｅｌｓｏｎ、、Ｓ、ら編、第３０６−３２８頁 ］。

種々の検定操作において、ろ紙を、普通は小型のディスクの形態で、使用するこ とは周知である。しかし、ろ紙ディスクを用いた１１ＣＧ検定法を開発しようと する努力は未だ成功していない。相当な研究の後に、ｌ−Ｉ　ＣＧ抗体をディス クに結合させ、このディスクをト１ｃＧの含有が疑われる溶液、ｌことえば尿と 反応させることに基づく方法は信頼性と感度にａ３いて劣ることが見出された。

さらに、ディスクおよびろ紙装置は、既知の技術によっては、満足し得るように 製造することは不可能である。本発明は、これらの欠点を克服し、尿その他の溶 液中の）−Ｉ　ＣＧの迅速、簡易かつ信頼し・得る酵素免疫検定を可能ならしめ るものである。

発明の概要 高感ｒ！ｌｌｔであり、極めて簡易に実施でき、家庭で使用し得るキラ１〜に採 用可能な絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）の測定法が開発された。本発明は、 この検定を実施する方発明の概念は、特異的な抗原の検定に広く応用でき、また 抗原抗体の役割を単に逆にするだけで、同じ概念を用いて抗体の測定にも適合さ せることができる。

ヒ［〜絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ＞の測定を例にとった場合の本発明の方 法のとりわけ好ましい態様は、以下のステップを備える：固相の形での支持体の 全部または一部を化学結合、物理的吸収またはその他の任意の適当な方法により アライブインで被覆し、ビオチニル化抗１−Ｉ　ＣＧ抗体をその支持体にアヴイ デンービオチン連結くカップリング）を介して付加し、このようにして調製され た支持体をＨＣＧの含有が疑われる試料、たとえば溶液ならびに標識された抗Ｈ ＣＧ抗体に曝露する。この結果、その固相の支持体の表面には日ＣＧおよび検出 可能な標識が結合され、この標識の存在量はＨＣＧ基質または標識発色剤の量に 比例し、また標識が放射性であれば、試料中のトＩ　ＣＧ　’ａ　石どじでカウ ントされる。別法として、標識種を支持体から分離し、従来法のいずれかにより 検出してしよい。たとえばＢ−ガラク１〜シダーゼを用いての酵素標識が好まし いアプローチではあるが、他の酵素または放射性標識を用い（しよい。

本発明は、抗体の存否の決定および抗体量の測定のための技法においても利用で きる。この場合には、その特定の抗体に対重る抗原をビオチニル化し、アライブ インを介して支持体に結合させ、類似の抗原を標識し、抗体を被測定種とする以 外は同様に反応を行なう。

図面の説明 第１図は、同相の支持体を示し、これは全体または一部を７ヴイデインにより被 覆されており、その上の選別された領域はビオチニル化抗体により被覆されてお り、とオチ二ル化抗体の印刷またはその他の方法の適用による所定領域に形成さ れ得るパターンの例が示されている。

好ましい実施例の説明 本検定法における同相の支持体は、この実施例では、直径約Ｑ、７ｃｍの紙ディ スク（ホワットマン〈商標）５４１級）である。紙ディスクは、まず、Ｒ，Ａｘ ｅｎら＜　Ｎ　ａｔｕｒｅ、２１４：１３０２，１９６７）が記述している操作 法に従って、ＣＮＢｒにより活性化される。活性化したディスクをアライブイン と４℃で一夜反応させる。反応後、溶液を除去し、ディスクを５０ｍＭエタノー ルアミン（ｐＨ＝８．０）で室温にて２時間処理してブロックした。次に、ディ スクを０．１ＭのＮａ　ＯＡｃ　、　０．５ＭのＮａＣＩｕ緩衝液（ｐＨ＝４． ０）および０．１ＭのＮａ＋−（ＣＯ２，０゜５ＭのＮａＣｕ緩衝液（１１Ｈ− ８，３）Ｔ−交互に３回ずつ十分に洗浄した。。

アフィニティ精製つ＋ツギ抗１−Ｉ　ＣＧ抗体のビオチニル化は、抗体とＮ−ヒ ドロキシスクシンイミジルビオチンとをホウ酸塩緩衝塩溶液（ＢＢＳ）中ｐＨ＝ ８．３にで室温で２時間インキュベートして達成した。次に、過剰のＮ−ヒドロ だ。

β−ガラクトシターゼ連結抗体は、Ｆ、Ｔ、ｌｉｕらが公表した操作法［Ｊ、　 Ｂ・ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：　６９０　＜　１９７９）コに従い、ア フィニティ精製マウス抗ＨＣＧモノクロナール抗体をβ−カラクトシダーゼと、 架橋試ｉ１Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ ）を介して反応させて調製した。

免疫検定は、下記のように、検定成分の相互反応により行なう。

典型的なディスク−アライブイン　ビオチン−Ａｂ　−１−ＩＣＧ−Ａｂ−β− ガラクトシダーゼ（ＨＣＧ　Ｅｌ△）の−例では、ディスクを抗１−Ｉ　ＣＧ− β−カラクトシグーＵの凍結乾燥ペレット１個と共にチトンバに入れ、尿試料２ ５０μ込によってペレットを溶解さけて、ディスクに水分を補給する。ディスク ーアヴイデインービオチンー抗ｔ−Ｉ　ＣＧ（ＢＡＤ）　、抗１−Ｉ　ＣＧ−β −グルコシターＵおよび尿試料を同時に室温で１０分間インキ］べ−［・する。

次に、デーｒスクを取出し、緩衝液またはぬるｊ、湯流によりよく洗う。

最後に、ディスクを、β−ガラク１−シダーゼに対づる合成基質である０−ニト ロフェニル−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と共にインキユベートする。酵素 活性は、尿試料中に存在づ−るＨ　ＣＧの量と関連している。

上記プロトコールを用いて、用量反応曲線の得られることが証明されている。定 性的検定では、４００ｍ　ＩＵ／ｍ見のＨＣＧを含有する尿試料を裸眼で容易に 検出できる。

このＨＣＧ！度は無月経に終わった予定月経期の約３日後に相当する。

本発明の１つの特徴は、前記の方法およびプロトコールをキットにまで応用した ところにあり、そのキットは、素人でも自宅で、可能性ある妊娠の指標としての ＨＣＧの存否を検出するために使用できるものである。上記プロトコールが示す とおり、この検知は、月経期がなかった後の３日日に早くもなし得るのである。

無月経は妊娠を示しているものかもしれず、また合併症の可能性を示しているか もしれず、個人によっては、妊娠の早期指摘は重要である。

検査室技法あるいは熟練を要しないで使用できるキットが長くめられていた。キ ットは、種々の肝癌をモニタづるのに病院または検査室の内外でも使用し得る。

キットは、尿中１−Ｉ　ＣＧの定性的または半定量的測定を完了するのに必要な すべての試薬を包含する。キラ１−の基本的構成要素は次のとおりでめる：（１ ）アライブインで処理された固相の支持体、典型的にはろ紙、アライブイン（ユ ろ紙に結合されて、ビオチニル化抗１−Ｉ　ＣＧ抗体と反応する部位を与えてい る。（２）標識抗ＨＣＧ抗体。（４）洗浄試薬。おにび（５）発色試薬。好まし い実施態様として挙げＩζ前記の場合はあくまで例示であって、限定的な意味を 持たないが、その場合の発色試薬は０−ニトロフェニル−ガラクトピラノ゛シト （ＯＮＰＧ）である。β−ガラクトシド標ｍ　ｌ−Ｉ　ＣＧ抗体種の発色によっ て、裸眼で認め得る色の変化が生じる。他の色または視覚効果を生じる［ｆｆｉ と発色剤との組合せを適用しても、よいが、現在のところは上記の系が好ましい 。緩衝液、塩溶液試薬などを含めてもよいが、これらは上記の種々の試薬の中に 配合してａ３　＜のが好ましい。本発明に従ったキットは、典型的には、所定体 積の指標線を持つ容器、使用説明書および使用菌に便利なその他付属品を包含す ることになろう。

第１図は、キット構成要素のごとき、本発明の原理を具体化する製造物の一例を 示している。第１図に示されたデバイスは、同相の支持体、アヴーｒディン層Ｊ ３よびビオチニル化抗体〈抗体を検知すべき場合には抗原〉層からなる、。

これらの層は互いに完全にぴったり重なり合っていなくともよいことはもちろん であり、基体が多孔質であれば物理的に明確に区別された層でなくても、質的に は上記の構造を持つであろう。基体は多孔性であっ−Ｃも非多孔性であってもい 。たとえば、ろ組およびポリスチレンのいずれもが極めてよく役立つ。

諸反応において不活性であり、アライブインが化学反応または物理的イ」着のい ずれかによって結合し冑る４ｆらば、固相材料はいかなるものを用いてもよい。

ろ紙ｊインクまたはシー１−はよ（使用される同相の支持体祠ネミ１であり、ポ リスチレンのディスクまたはシー１−もそうである。

次の成分はごオチニル化抗体（または抗原）であり、これは先に）小べた例の場 合と同様に、全面にコートされはしない。ビオチニル化抗体（または抗原）は、 むしろ、アライブイン被覆面の選ばれた領域にのみ、任意に、所望のパターンで 、「印刷コされる。ここに、「印刷」なる３Ｂは、本発明の複合指標基体製造の ための最もよく知られた技法を記述するために用いているのであって、選ばれた 領域に抗体を１印刷」できることが、本発明の非常に重要な一特徴なのである。

ろ紙または他の基体の表面に何らかの信頼すべきパターンを設りることは、試薬 が基体を通って移行するＩζめに、従来極めて困難であった。本発明は、この問 題をすべて取除くものである。ビオチニル化抗体はアライブインと直ちに連結し 、それによって、アライブイン被覆支持体上の、特定の抗体が見出されるであろ う領域を規定する。この連結によって、印刷中または、印刷後、おにび反応中の 抗体くまたは抗原）の移行が防止される。かくして、多重指標基体を発色させる とき、抗体およびそれに結合された抗原くあれば）は印刷されたのとちょうど同 じ場所に見出されるであろう。ＥｌＵ罷口よ、紙にインクで印刷（−るのと同様 にして、すなわち、アライブイン被覆支持体にビオチニル化抗体を塗布した活字 またはパターンを持つその他の手段を適用覆ることによって実施しくりる。これ により、い（つかの異なる抗体を有し得る多重指標支持体を極めて効率的に大量 生産−Ｃきる。基体は、抗体（または抗原）にＪ二り形成されたしるしとともに インクまたは他の材料により形成されたしるしをも包含し得る。たとえば、第１ 図にＡ′３いて、十の列おＪ、び中火の列は、それぞれ、正方形および円形の領 域を示し、その中には、ビオチニル化抗体が印刷された他の何らかのしるしが（ −１いている。下の列は、文字の形に印刷されたビオチニル化抗体を示している 。任意の記号、形状または文字数字からなるしるしを使用し得ることは明白であ る。

これらの多重指標基体は、臨床検査室あるいは研究所で使用でき、また消費当用 のキットに含めてもよい。いくつかの異なる抗体（または抗原）、また、粘付の ｂ”ｔなる複数の抗体を、基体上に印刷して、かかる多重指標基体１片で、いく つかの診断ブス１〜を１度で実施しｉｔす、特定の抗原または抗体について半定 量的結果を１ｑるようにすること−もできる。

考察 （高純度であり、かつ便利４１寸法のものを人手てきる）ろ紙のような繊維条基 体に日ＣＧを結合させた方法おＪ、びキットを提供しようとする努力は成功しな ん１っだ。かかるアブローヂは実行不可能だと思われていたといってもよいほど 、この方法を２つの問題が妨げていた。第１（Ｊ、感度の低いことが重大事であ った。第２に、再現性の乏しいことがより一層深刻な問題であった。相当な努力 と問題の考察との後、本発明者達は、それらの問題がろ紙への試薬の結合と関係 があると確信するに至った。問題が何かは基本的にははっきりしていない。抗原 をろ紙またはそれど同等の多孔性要素に結合させることは比較的容易であるので 、それらしいと考えられる問題がなかった。はっきりしたデータによって証明さ れていない可能な１つの説明としでにすぎないが、抗体が紙に結合するときに何 らかのタイプの立体障害が生じて、そのために抗体処理ろ紙の完全な、定量的な 、再現性ある反応が阻害されると考えられる。いずれにしても、実際に起こる分 子レベルの現象にかかわりなく、結果としては乏しい感度、そして狭い検定範囲 ということになった。この免疫検定範囲を追及するのは有益とは思われなかった 。加うるに、異なる免疫検定のために同相抗体を個々に連結し、取扱い、保存づ ることが必要なため、時間と費用がかさんで手が出させないと名えられた。

問題を考察し・、代替方法を種々評価し、かつ実験を行なつ−（、本発明名達は 上記の技法を開発したのであって、該技法は、簡単で、信頼性と再現性のある、 実用可能で、感度の高い方法Ｃあって、尿中１−Ｉ　ＣＧの測定に直ちに応用で き、他の抗体−抗原型反応にｂ広く応用−Ｃぎることが判明した。先に指摘した とａ３す、上記した抗体結合−ＣはなくてビＡチンーアヴイディン連結を介して 逆に抗原を紙に結合させることにより、同じ操作を抗体の存在の検知のために利 用してもＪ、い。このように、抗原、抗体なる用品は、本明細書および特許請求 の範囲においては、実質的に逆にしな逆を表わづことができるものである。

本発明を一般的に適用できることが確め１うれている。たとえば、アヴイディン 被覆基体をビオチニル化抗ＤＮＰ−ＩｇＧで被覆し、このアヴイディンービオチ ニル化抗ＤＮＰ−■ｇＧ被覆基体を次にＤＮＰ４９−ＢＳＡと反応させ、最後に 抗ＤＮＰ−β−ガラクトシダーゼと反応さゼた。ＤＮＰ４９　ＢＳＡの存在が最 後の反応における基体の被覆域上での発色によって判定された。結果は、常法に より４２Ｑｎｍでの色の吸光度を読取ることにより、定量的にめることができる 。

他の一実施例では、基体の７ヴイデイン被覆部をビＡヂニル化ブタクサアレルゲ ンで被覆し、次に、抗ブタクサアレルゲンＩｇＥを含有するヒト血清およびヤギ 抗ヒｔ−１ｇＦ−β−ガラクトシダーゼと同時にインキュへ−１〜した。

抗ブタクリ−１ｑＥの存在は、前記のとおりに被覆しＩＪ領領域の発色により決 定し、上記のとおり測定法によって測定することができる。

本発明の好ましい実施ＶＡおよび用途を承りことによって本発明の掩念を例示し たが、これは、記載した特定の試薬、標識、発色剤または用途に限定されるもの でないことは了解されるであろう。

国際謂食報告 第１頁の続き ０発　明　者　リー、チオドール・ティー０発　明　者　チャン、シュンーホ アメリカ合衆国、９２１２１　カリフォルニア州、サン・ディエゴ　イースター 、ウェイ、９６６３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（１−１０Ｇ＞を含有すると思われる液を標 識された抗ＨＣＧ抗体と反応させて、ＨＣＧ結合抗体の存在を測定することによ り、ＨＣＧを測定するにあたって、 （ａ　）　固相の支持体をアライブインで被覆して、その表面にビオヂン結合部 位を設けること、（ｂ）　抗ＨＣＧ抗体をビオチニル化すること、＜Ｃ＞　ビオ チニル化抗ＨＣＧ抗体をアライブイン被覆支持体と反応させること、 （ｄ　）　抗１−Ｉ　ＣＧ抗体を検知可能な指示薬と反応させること、 （ｅ）　工程（Ｃ）のビオチニル化抗体および工程（ｄ　）の連結抗体をＨＣＧ を含有すると思われる被検液と反応さけること、ならびに （ｆ）　ｌ」ｃＧを介して支持体に結合された指示薬連結抗体を測定して、被検 液中にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンが存在するかしないかを示すこと、を特徴と する、改良されたＨＣＧ測定測定法。 ２、　同相の支持体をアライブインで処理して、ビオチンを該多孔質体に結合し 得るところのアライブイン結合部位を該多孔質体の表面に設けること、抗ＨＣＧ 抗体をビオチニル化すること、ＨＣＧを含むと思われる液をＨＣＧに結合づ−る 指標試薬ならびに前記ビオチニル化抗ＨＣＧ抗体と反応させること、ビオチニル 化抗ＨＣＧ抗体を前記支持体と反応させて、ＨＣＧをアヴイディンービオヂン連 結を介して、多孔質体に結合させ、指標試薬の指標部を利用して前記多孔質体表 面におけるＨＣＧ存在の有無を測定することを特徴とする、ＨＣＧ　（ヒト絨毛 性性腺刺激ホルモン）検知法における改良。 ３、　＜ａ）　同相の支持体をアライブインと反応させて、ビオチニル化された 分子を該フィルタ体に結合させるための、ビオチンと結合し得る部位を該フィル タ体の表面に設けること、 （ｂ）　特定の抗原に対する抗体をビオチニル化し−Ｃ、フィルタ体表面のアラ イブイン部位と結合し得る分子を準備すること、 （ｃ）　工程（ｂ　）の分子種を工？ｌｉ！（ａ）のアヴイデーｆン処理支持体 と反応させて、該分子種を該フィルタ体に結合させること、 ＜ｄ　＞　前記特定の抗原に対する抗体を検知可能な部分により標識すること、 （ｅ）　前記特定の抗原を含有すると思われる被検液を工程（Ｃ）で得た処理支 持体および工程（ｄ　）で得た試薬と反応させて、特定の抗原、支持体上のビオ チニル化抗体、および標識抗体からなる結合動程を形成すること、ならびに（ｆ ）抗体の標識された部分を検定して被検液中に前記特定の抗原が存在するか否か を決定すること、を特徴とずる、特定の抗原を含有すると思われる被検液中の該 特定の抗原の存否を検定するための改良された方法。 ４、　検定すべき特定の抗原がヒト絨毛性性腺刺激ホルモンであることを特徴と する請求の範囲第３項記載の方法。 ５、　検知可能な部分がβ−ガラクトシターゼであることを特徴とする請求の範 囲第３項記載の方法。 ６、　（ａ）　ビオチニル化された抗ＨＣＧ抗体と連結し・１ｒするアライブイ ン結合部位を表面にｈするアライブイン処理支持体に結合されたビオチニル化抗 １−Ｉ　ＣＧ抗体、（１））　標識された抗ＨＣＧ抗体および（ｃ）Ｉ識された 抗１−（ＣＧ抗体と反応して、ｌ−Ｉ　ＣＧの存否を視覚的に表示できる顕色試 薬を包含することを特徴どづ−る、尿中のトＩ　ＣＧ　（ヒト絨毛性性刺激ホル モン）の存否の検定に用いるためのキラ１〜。 ７、　標識された抗ＨＣＧ抗体かβ−ガラクｌ−シダーぜ庖検知可能な４ｇ識と して含有する口とを特徴とする請求の範囲第６項記載のキット。 ８、　（ａ）　固体の支持体の少なくとも一部を７ヴイデインで被覆すること、 Ｊ３よび（ｂ）工程（ａ　）のアライブイン被覆支持体の所定部分のみをビオチ ニル化した抗体または抗原で被覆して、基質の一部を未被覆の状態で残し、それ によってビオチニル化抗体または抗原被覆支持体の所定の領域パターンを形成す ることを特徴とする、多重指示薬支持体の製造法。 ９、　工程（ａ＞か、人体にＪ５いて平板条の支持体の実質的に一面のみを７ヴ イデインで被覆することからなり、工程（ｂ）が当該片面にビオチニル化抗体ま ｌζは抗原の所定パターンを印刷することからなることを特徴とする請求の範囲 第８項記載の方法。 １０、　工程（ａ　）がろ紙をアライブインで被覆することからなることを特徴 とする請求の範囲第９項記載の方法。 １１、　表面を持つ固相の支持体、該表面の少なくとも実質的な部分に施された アライブイン被覆、ｉＪ、−３よびアヴイデイン被覆表面十に所定のパターンで のみ印刷され７ＪビΔブニル化抗体または抗原をηｈえる製造物。 １２、　支持体表面が実質的に完全にアライブインで・被覆されており、ビオチ ニル化抗体または抗原が該表面の全部より実質的に少ない部分庖占拠しているこ とを特徴どＪ？、）、請求の範囲第１１項記載の製造物１． １３、　ビオチニル化された抗体または抗原が読みヤ）すい記号、数字よた【、 １文字あるいはこれらの１１合ぜの形で存在することを特徴とする請求の範囲第 １１項または第１２項記載の製造物。 １４、　抗原活性種を測定するにあたっ−この、（ａ　）　同相の支持体をアラ イブインで被覆づる二［稈、（１〕）　該アライブイン支持体表面にビオチニル 化抗原または抗体を所定のパターンで印刷する工程、（Ｃ）　ビオチニル化抗体 または抗原被覆面を抗原活性種の含有が疑われる溶液および標識部分と反応させ る工程、Ｊ′３よび （ｄ　）　標識部分を￥？Ｌ色試薬と反応させる工程。 １５、　（ａ）　アヴイデイン層で被覆され、該アヴイディン宕上に検知づべき 抗原に対するビオチニル化抗体を反応させた同相の支持体、お」：び （ｂ）　検知可能な部分により標識された、検知すべき抗原に対づる抗体を備え ることを特徴とする、抗原検知用キラｌ〜。 １６、　標識された抗体が酵素部分を含み、さらに（ａ　）標識酵素と反応した とき発色性基質を包含づることを特徴とする請求