PL204235B1 - Sposób wykrywania natywnego N-końcowego proBNP, zastosowanie tego sposobu, zastosowanie zrekombinowanego N-końcowego proBNP, przeciwciała przeciw zrekombinowanemu N-końcowemu proBNP, linie komórkowe i sposoby wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania natywnego N-końcowego proBNP, zastosowanie tego sposobu, zastosowanie zrekombinowanego N-końcowego proBNP, przeciwciała przeciw zrekombinowanemu N-końcowemu proBNP, linie komórkowe i sposoby wytwarzania przeciwciał poliklonalnych i monoklonalnych.

Niewydolność serca jest szeroko rozpowszechnionym zjawiskiem, szczególnie w świecie zachodnim. Przez niewydolność serca rozumie się według Roche Lexikon Medizin (1993, Urban & Schwarzenberg) ostrą lub przewlekłą niezdolność serca, przy obciążeniu lub już w stanie spoczynkowym do dokonania wymaganego dla przemiany materii wyrzutu krwi lub pobrania krwi powracającej z ż y ł (tak zwana niewydolność wsteczna i niewydolność rzutu). Zatem dział anie pompy serca jest sł abe. Przyczyny niewydolności serca są złożone. Między innymi można wymienić zapalne i degeneracyjne zmiany mięśnia sercowego, zaburzenia ukrwienia serca, zawał serca i uszkodzenia. Prowadzi to do zmian w krążeniu obwodowym, zaburzeń oddychania, funkcji nerek i metabolizmu elektrolitów (obrzęki) i do zmniejszonej sprawności mięśni szkieletowych.

Według New York Heart Association (NYHA) niewydolność serca dzieli się na podstawie testu obciążenia serca na tak zwane klasy NYHA: I oznacza zupełny brak objawów przy normalnym wysiłku fizycznym, II oznacza lekkie ograniczenia fizycznej odporności na obciążenie dynamiczne, III oznacza silne ograniczenia fizycznej odporności na obciążenie dynamiczne a IV oznacza, że przy każdej aktywności fizycznej zwiększają się objawy niewydolności, z których większość istnieje w stanie spoczynku.

Aby skutecznie leczyć niewydolność serca za pomocą glikozydów, wazodylatorów, inhibitorów

ACE i/lub β-blokerów należy najpierw dokładnie zdiagnozować występowanie niewydolności serca i możliwie także sklasyfikować ją według jej stopnia ciężkości i dodatkowo monitorować przebieg terapii.

W obecnym stanie techniki omawia się stosowanie szeregu markerów surowicy do wczesnej diagnostyki niewydolności serca, takich jak, na przykład, ANP (N-końcowy przedsionkowy peptyd natriuretyczny) i pro-ANP, CNP (C-peptyd powodujący wydzielanie sodu), adrenomedulina, neuropeptyd Y, endotelina i BNP (mózgowy peptyd natriuretyczny [albo peptyd natriuretyczny typu B]). ANP i proANP zasadniczo nadają się jako markery do rozpoznawania niewydolności serca, mają jednak ograniczoną stabilność lub krótki czas półtrwania we krwi, co utrudnia pomiary diagnostyczne (Clin. Sci. 95(3) (1998), 235-239; Cleland i wsp., Heart 75 (1996), 410-413).

Często cytowanym i ważnym diagnostycznie markerem jest BNP (mózgowy peptyd natriuretyczny). BNP po raz pierwszy zidentyfikowano w mózgach świń. Jest on hormonem serca, który strukturalnie i funkcjonalnie przypomina ANP (przedsionkowy peptyd naturietyczny) (Sudoh i wsp., Nature 332 (1988), 78-81). Ludzki BNP składający się z 32 aminokwasów jest wydzielany głównie przez komory serca i krąży w osoczu krwi człowieka. Użycie BNP jako diagnostycznego markera jest znane, na przykład, z EP-A-0 542 255. BNP posiada wewnątrzcząsteczkowy mostek disiarczkowy i jako odczynnik analityczny przypuszczalnie ze względu na swoją fizjologiczną funkcję jako hormon, który musi być szybko rozłożony, nie jest zbyt stabilny i w związku z tym tylko w ograniczonym stopniu nadaje się do stosowania jako marker diagnostyczny (Masuta i wsp., Clin. Chem. tom 44 Nr 6 Suplement A (1998), 130; Tsuji i wsp., Clin. Chem. 40 (1994), 672).

Cząsteczka prekursora BNP, proBNP, składa się ze 108 aminokwasów, z których opisane uprzednio 32 aminokwasy C-końcowe (77-108), które są określane jako BNP, wywołują faktyczne działanie hormonalne. Uwolnione od prekursora N-końcowe aminokwasy 1-76 są określane jako N-końcowy proBNP. Oprócz BNP (77-108) w osoczu znajduje się także N-końcowy proBNP i dalsze produkty rozkładu (1-76) (Hunt i wsp., Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995), 1175-1183) tak, że N-końcowy proBNP również bierze się pod uwagę jako marker dla niewydolności serca. Nie jest jednoznacznie wyjaśnione, czy cząsteczka prekursora proBNP także jest obecna w osoczu.

Jednak opisano (Hunt i wsp., Peptides, tom 18, Nr 10 (1997) 1475-1481), że można wykryć niski poziom wydzielania proBNP (1-108) w osoczu, ale ze względu na bardzo szybki częściowy rozkład na N-końcu brakuje niektórych aminokwasów. Ta cząsteczka opisywana jest w literaturze jako BNP o wysokim ciężarze cząsteczkowym (High Molecular Weight BNP).

W WO 93/24531 (US 5,786,163) opisano immunologiczny sposób identyfikowania N-końowego proBNP i stosowane w nim przeciwciała. Dla uzyskania przeciwciał są tu stosowane pojedyncze syntetyczne peptydy z sekwencji N-końcowego proBNP. Zasadniczo jest możliwe uzyskanie przeciwciał przez immunizację peptydami, ale na ogół powinowactwo do całej cząsteczki jest za niskie, aby uzyPL 204 235 B1 skać wymaganą czułość w procedurze testowej. Ponadto istnieje niebezpieczeństwo, że przy zastosowaniu peptydów uzyska się przeciwciała, które, na przykład, mogą rozpoznawać C-koniec peptydu i w ten sposób mogą się wią zać tylko do tego fragmentu całej czą steczki. Z tego wynika, że te przeciwciała nie mogą wiązać się z całą cząsteczką lub wiążą ją słabo. W W093/24531 wytwarzane przeciwciała poliklonalne przeciw jedynemu pojedynczemu peptydowi pochodzącemu z N-końca proBNP. Pokazano, że wytworzone przeciwciała wiążą peptyd do immunizacji (aminokwasy 47-64) w teście współzawodnictwa. Nie pokazano jednak, że przeciwciała są w stanie wiązać natywny N-końcowy proBNP jako całą cząsteczkę w próbie. Test typu „kanapkowego opisany w WO 93/24531 może być niemożliwy do przeprowadzenia w próbie, ponieważ nie dysponuje się odpowiednim materiałem standardowym i przeciwciałami przeciw dwóm różnym epitopom.

Dalszym problemem w stanie techniki jest czułość testu. Według testu współzawodnictwa przeprowadzonego w WO 93/24531, w którym peptyd 47-64 współzawodniczy w postaci znakowanej jako znacznik z próbką lub nieznakowanym standardem peptydowym 47-64 o wiązanie się z przeciwciałami poliklonalnymi z surowicy królika, po 48 godzinach inkubacji uzyskuje się bardzo umiarkowane współzawodnictwo, w najlepszym przypadku z dolną granicą wykrywania około 250 fmol/ml. Nie jest to wystarczające ani dla rozróżnienia osób zdrowych i pacjentów z niewydolnością serca ani dla zróżnicowanej klasyfikacji próbek od pacjentów pod kątem stopnia zaawansowania niewydolności serca. Ponadto długie czasy inkubacji testu współzawodnictwa nie są do zaakceptowania do pomiarów rutynowych próbek w zautomatyzowanym laboratorium.

Hunt i wsp. (Clinical Endocrinology 47(1997), 287-296) opisują również test współzawodnictwa do wykrywania N-końcowego proBNP. W tym celu konieczna jest kompleksowa ekstrakcja próbki osocza przed pomiarem, co prowadzi do zniszczenia analizowanego związku i pojawienia się błędnych pomiarów. Stosowana surowica odpornościowa jest wytwarzana analogicznie do WO 93/24531 przez immunizację syntetycznym peptydem. Hunt i wsp. wytwarzają surowicę odpornościową przez immunizację N-końcowymi aminokwasami 1-13 proBNP, a jako standard stosowany jest peptyd o 1-21 aminokwasach. Także w tym teś cie musi być uż yty długi czas inkubacji. Po 24 godzinach inkubacji uzyskuje się dolną granicę wykrywalności 1,3 fmol/ml.

W stanie techniki nie istnieje więc ż aden sposób wykrywania N-koń cowego proBNP, który umożliwia przy krótkich czasach inkubacji wiarygodne i czułe wykrywanie natywnego N-końcowego proBNP.

Celem więc było dostarczenie sposobu wykrywania N-końcowego proBNP w próbce, który unika przedstawionych wad stanu techniki. W szczególności powinna być osiągnięta wysoka czułość testu aby umożliwić różnicowanie próbek osób zdrowych i pacjentów z klas NYHA I - IV.

Cel został osiągnięty sposobem identyfikowania N-końcowego proBNP w próbce, który bardziej szczegółowo jest wyjaśniony w zastrzeżeniach.

Sposób według niniejszego wynalazku jest sposobem wykrywania natywnego N-końcowego proBNP w próbce, który przeprowadza się w formacie „kanapkowym (sandwich) stosując co najmniej dwa przeciwciała, które rozpoznają różne epitopy natywnego N-końcowego proBNP i w tym samym czasie mogą wiązać się z natywnym N-końcowym proBNP, przy czym w sposobie tym stosuje się co najmniej dwa przeciwciała wiążące się w regionie aminokwasów 10-50 N-końcowego proBNP, otrzymywane przez immunizowanie odpowiedniego organizmu zrekombinowanym NTproBNP, w którym występuje region aminokwasów 10-50.

Korzystnie dolna granica wykrywalności N-końcowego proBNP leży poniżej 1 fmol/ml użytej próbki.

Korzystnie na podstawie uzyskanych wartości można dokonać rozróżnienia próbek od zdrowych pacjentów i próbek od pacjentów z niewydolnością serca z klasy NYHA I do IV.

Korzystnie ze względu na uzyskane wartości można dokonać rozróżnienia próbek pacjentów od zdrowych i próbek od pacjentów klasy NYHA I.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie sposobu według wynalazku do rozróżnienia między próbkami od zdrowych pacjentów i próbkami od pacjentów klas NYHA I do IV.

Wynalazek dotyczy również zastosowania zrekombinowanego N-końcowego proBNP jako standardu w sposobie wykrywania N-końcowego proBNP według wynalazku.

W zakres wynalazku wchodzą również przeciwciała przeciw zrekombinowanemu N-końcowemu proBNP wytwarzane przez immunizację odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym techniką rekombinacji, które wiążą się specyficznie w 10 do 50 aminokwasowym regionie N-końcowego proBNP.

PL 204 235 B1

Korzystnie przeciwciała uzyskuje się z linii komórkowych M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14. (DSM ACC 2387) zdeponowanych 26.01.1999 w DSM lub bardziej korzystnie są uzyskane w sposób ekwiwalentny z u ż yciem N-koń cowego proBNP do przeciwciał , które są uzyskane z linii komórkowych M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14 (DSM ACC 2387).

Ponadto wynalazek dotyczy linii komórkowych M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14 (DSM ACC 2387) zdeponowanych 26.01.1999 w DSMZ.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał jak określone powyżej obejmujący etapy immunizacji odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym technikami rekombinacji, izolacji przeciwciał, poszukiwania najbardziej reaktywnych epitopów i oczyszczenia przeciwciał przez immunoadsorpcję na odpowiednich peptydach.

Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania monoklonalnych przeciwciał jak określone powyżej obejmującego etapy immunizacji odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym technikami rekombinacji i wybór klonów pod kątem reaktywności przeciwciał z natywnym N-końcowym proBNP w różnych pulach surowicy pacjentów.

Istotne w sposobie według wynalazku jest, że natywny N-końcowy proBNP jest wykrywany w próbce. To oznacza, ż e przeciwciała muszą być w stanie zidentyfikować i swoiście związać nienaruszoną cząsteczkę i ewentualnie występujący nierozcięty proBNP (1-108) i jeżeli to możliwie również proteolitycznie częściowo nadtrawione fragmenty w próbce. W sposobie wprowadzane są przynajmniej dwa różne przeciwciała, które wiążą różne epitopy N-końcowego proBNP. Epitopy mogą być liniowymi lub być tak zwanymi epitopami konformacyjnymi. Korzystne są epitopy tak zlokalizowane, że oba przeciwciała mogą wiązać się równocześnie i są położone niezbyt daleko od siebie.

Ponieważ sposób według wynalazku nie pozwala na rozróżnienie między N-końcowym proBNP, proBNP i blisko spokrewnionymi peptydami (produkty rozkładu) dalej jako NT-proBNP rozumiane są wszystkie rozpoznawane w procedurze testowej peptydy w szczególności znana sonda N-końcowa proBNP (1-76).

Pod pojęciem „epitop rozumiane jest miejsce wiążące na partnerze immunologicznym wiązania takim jak antygen, do którego wiąże się swoiście przeciwciało. „Epitop jest zazwyczaj określony jednoznacznie przez 6 do 8 aminokwasów. Partner do wiązania odpowiada N-końcowemu proBNP lub jego częściowej sekwencji. Epitop, do którego wiąże się przeciwciało tworzy częściowy obszar na partnerze wiązania. Epitop może być obecny w postaci liniowej lub jako epitop konformacyjny.

Ze względu na różne swoistości wiązania się obu przeciwciał jest możliwe przeprowadzenie szybszego sposobu wykrywania analizowanych związków zamiast długiego i skomplikowanego przeprowadzania testu ze stanu techniki. Sposób wykrywania według wynalazku można przeprowadzić za pomocą homogennej lub heterogennej procedury testowej. Korzystne jest heterogenne przeprowadzenie testów i szczególnie korzystny jest znany specjaliście sposób typu „kanapkowego

Korzystnie sposób oznaczenia N-końcowego proBNP przeprowadzona się w następujących etapach:

a) zmieszanie próbki z pierwszym przeciwciałem swoistym dla N-końcowego proBNP, które niesie grupę odpowiednią do wiązania się z fazą stałą, lub zmieszanie próbki z pierwszym przeciwciałem swoiste dla pro-BNP, które już jest związane z fazą stała,

b) zmieszanie tego roztworu z drugim przeciwciałem, które rozpoznaje inny epitop proBNP niż pierwsze przeciwciało, i które niesie znacznik

c) wiązanie wytworzonego immunokompleksu do fazy stałej, przy czym faza stała może być już obecna w etapie a)

d) rozdzielenie fazy stałej od płynnej

e) wykrycie znacznika w jednej lub obu fazach.

Przy ilościowym określeniu przeprowadza się ten sam pomiar z określoną ilością N-końcowego proBNP jako standardem i po określeniu próbki jako etap f) przeprowadza się porównanie mierzonych wartości standardu z wartością próbki i określa się jej ilość.

Określenie „przeciwciała oznacza mono lub poliklonalne, chimeryczne lub humanizowane lub inne przeciwciało uzyskane za pomocą modyfikacji genetycznych jak również znane specjaliście fragmenty, takie jak F(ab')2, Fab' lub fragmenty Fab. Musi być tylko zagwarantowana immunologicznie swoista zdolność do wiązania N-końcowego proBNP.

Pierwsze przeciwciało swoiste dla N-końcowego proBNP może być albo związane bezpośrednio z fazą stałą albo wiązanie z fazą stałą zachodzi pośrednio przez specyficzny układ wiązania. Bezpośrednie wiązanie tego przeciwciała do fazy stałej zachodzi według sposobów znanych specjaliście

PL 204 235 B1 na przykład przez absorpcję. O ile wiązanie jest przeprowadzone pośrednio przez swoisty układ wiązania wówczas pierwsze przeciwciało jest koniugatem, który jest złożony z przeciwciała przeciwko N-końcowemu proBNP i partnera reakcji swoistego układu wiązania. Jako swoisty układ wiązanie rozumie się tu dwóch partnerów, którzy potrafią ze sobą swoiście reagować. Zdolność wiązania może wówczas być oparta na reakcji immunologicznej lub też innej reakcji swoistej. Korzystny jako swoisty układ wiązania jest kombinacja biotyny i awidyny lub też biotyny i streptawidyny. Dalsze korzystne kombinacje to biotyna i antybiotyna, hapten i antyhapten, fragment Fc przeciwciała i przeciwciało przeciw temu fragmentowi Fc lub węglowodan i lektyna. Jeden z partnerów reakcji swoistego układu wiązania jest wówczas częścią koniugatu.

Drugi partner reakcji swoistego układu wiązania dla pierwszego partnera wiązania jest warstwą fazy stałej. Korzystnie jest tu stosowana streptawidyna lub awidyna. Wiązanie drugiego partnera reakcji swoistego układu wiązania do nierozpuszczalnego materiału nośnikowego może być podjęte według zwykłych sposobów znanych specjaliście. Przy tym odpowiednie jest zarówno wiązanie kowalencyjne jak i adsorpcyjne.

Jako faza stała odpowiednie są probówki lub płytki mikrotitracyjne z polistyrenu lub podobnego tworzywa sztucznego, które są powleczone na powierzchni wewnętrznej partnerem reakcji swoistego układu wiązania. Dalej odpowiednie i szczególnie korzystne są substancje w formie cząstek, jak na przykład cząstki lateksu, cząstki magnetyczne, materiały stanowiące sita molekularne, drobiny szklane, probówki z tworzywa sztucznego i tym podobne. Jako nośniki mogą być także stosowane porowate warstwowe nośniki, takie jak papier lub nitroceluloza. Szczególnie korzystnie stosowane są kulki magnetyczne, tak zwane perełki, które są pokryte odpowiednim partnerem wiązania ze swoistego układu wiązania opisanym powyżej. Po zakończeniu reakcji testowej te mikrocząstki można oddzielić od fazy ciekłej w celu przeprowadzenia procedury reakcji wykrywania, na przykład, przez sączenie, wirowanie lub w przypadku cząstek magnetycznych przez magnes.

Drugie swoiste przeciwciało rozpoznaje inny epitop N-końcowego proBNP niż pierwsze przeciwciało. Odległość między dwoma epitopami na cząsteczce musi być dostatecznie duża, tak że możliwe jest równoczesne wiązanie obu przeciwciał do N-końcowego proBNP jest możliwe bez ograniczeń, ponieważ inaczej nie może wytworzyć się kompleks typu kanapkowego.

Wykrywanie swoistych reakcji wiązania między przeciwciałami przeciw N-końcowemu proBNP i N-końcowym proBNP można przeprowadzić różnymi sposobami. Na ogół drugie przeciwciało jest znakowane. Zwyczajowo znacznikami są chromogeny, fluorofory, substancje zdolne do chemi- lub elektrochemiluminescencji, radioizotopy, hapteny, markery enzymatyczne lub substancje, które znowu mogą tworzyć swoistą parę wiążącą, jak na przykład biotyna/streptawidyna.

Immunokompleks wykrywa się wówczas przez sygnały, które są wysyłane przez znacznik. Na przykład, drugie przeciwciało może być znakowane haptenem digoksygeniną. Ten hapten jest z kolei wiązany przez kolejne swoiste dla digoksygeniny przeciwciało. Swoiste dla digoksygeniny przeciwciało jest samo znakowane enzymem, jak na przykład peroksydazą. Ostateczne wykrycie uzyskuje się przez zmianę barwy lub ekstynkcji , gdy dodaje się odpowiedni substrat do peroksydazy.

Jako próbki do przeprowadzenia sposobu do wykrywania N-końcowego proBNP mogą być stosowane wszystkie znane specjaliście płyny biologiczne. Korzystnie jako próbki stosowane są płyny ustrojowe, jako pełna krew, surowica krwi, osocze krwi, mocz lub ślina. Szczególnie korzystnie stosowana jest surowica i osocze krwi.

Oprócz tak zwanych testów mokrych z reagentami testowymi w fazie ciekłej, mogą być też stosowane wszystkie zwyczajowe formaty suche, odpowiednie do wykrywania antygenów, haptenów, peptydów, białek, przeciwciał itd. Przy testach suchych lub h paskach testowych, jakie są na przykład opisane w EP-A-0 186 799, na ogół wszystkie składniki testu z wyjątkiem badanej próbki umieszczone są na jednym nośniku. Reakcja wykrywania rozpoczyna się, gdy pasek testowy wchodzi w kontakt z ciekłą próbką .

Sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że niższa granica wykrywania N-końcowego proBNP leży poniżej 1 fmola/ml (co odpowiada 1 pmol/l). Wysoką czułość < 1 fmol/ml według wynalazku osiąga się bez długich okresów inkubacji. Całkowity okres trwania dla testu mikropłytkowego wynosi mniej niż 2 godziny, korzystnie około 15 minut z czulszymi metodami detekcji, takimi jak elektrochemoluminescencja. Praktycznie nie istnieje górna granica wykrywania dotycząca stężenia, które ma być wykryte w tym sposobie detekcji. Technologiczna górna granica jest na ogół określana przez stosowaną metodę pomiaru. Sposobem tym zasadniczo wykrywa się także bardzo wysokie stężenia N-końcowego proBNP.

PL 204 235 B1

Dalszą zaletą sposobu według wynalazku jest dobre rozróżnienie próbek od pacjentów z niewydolnością i bez niewydolności serca na podstawie uzyskanych wartości pomiarowych. Sposób wykrywania jest tak czuły, że może być nawet przeprowadzone różnicowanie między pacjentami bez choroby wieńcowej i pacjentami z tylko słabo wyrażoną lub powoli ustalającą się niewydolnością serca klas NYHA I i II. Takie wczesne wykrycie zaczynającej się niedomogi serca może wpłynąć na decyzję o rozpoczęciu wczesnej terapii lekami i w ten sposób znacząco przedłużyć czas przeżycia pacjenta.

Jako N-końcowy proBNP rozumie się część N-końcową, która składa się z aminokwasów 1-76 odciętą od cząsteczki prekursora o wielkości 108 aminokwasów. Jako N-końcowy proBNP rozumie się też jego części, które mogą występować we krwi jako produkty reakcji degradacji tych cząsteczek.

W stanie techniki dotychczas nie jest znany ż aden rekombinowany N-końcowy proBNP, ponieważ jego wytworzenie nie jest łatwe, prawdopodobnie ze względu na krótką sekwencję aminokwasów. Chemiczna synteza peptydu o długości większej niż 30 aminokwasów nie jest żadną alternatywą dla syntezy rekombinowanej w organizmie gospodarza ze względu na pojawiające się błędne sekwencje i szybko spadają c ą wydajność na cykl syntezy.

Dla diagnostycznego sposobu wykrywania potrzebny jest jednak standard lub materiał kontrolny, za pomocą którego z jednej strony można określić ilości analizowanego związku i z drugiej strony można sprawdzić funkcjonalność testu. Jeśli ma być wykonane oznaczenie ilościowe, musi być przeprowadzona ilościowa kalibracja z użyciem serii standardowej. Taka kalibracja jest jednak użyteczna tylko w przypadku, gdy materiał stosowany w teście jako standard wykazuje te same lub podobne zachowanie do analizowanego związku w teście immunologicznym. Istotne przy tym jest, że standard ma dostatecznie duże strukturalne i w szczególności immunologiczne podobieństwo do analizowanego związku, tak że wiązanie standardu z wykrywanym przeciwciałem przypomina wiązanie z natywną cząsteczką w próbce.

Taki standardowy materiał dla sposobu wykrywania N-końcowego proBNP nie jest dostępny w stanie techniki. Opisane był y tylko krótkie syntetyczne peptydy. Według wynalazku po raz pierwszy było możliwe uzyskanie sekwencji DNA kodującego N-końcowy proBNP za pomocą syntezy genów i następnie ekspresja N-końcowego proBNP w E. coli. Sposób procedury jest wyjaśniony w przykładzie 1.

Wynalazek dotyczy też zastosowania zrekombinowanego N-końcowego proBNP jako standardu w sposobie wykrywania N-końcowego proBNP w próbce z przynajmniej dwoma przeciwciałami, które rozpoznają różne epitopy proBNP, według wynalazku.

Według stanu techniki w celu immunizacji dotychczas stosowano wyłącznie syntetyczne krótkie peptydy wywodzące się od N-końcowego proBNP. Wadą immunizacji peptydem jest to, że na ogół uzyskuje się przeciwciała o bardzo niskim powinowactwie lub otrzymane przeciwciała reagują tylko z liniowymi epitopami i natywnie złożony antygen nie może być w próbce związany (zobacz przykład 3).

Dlatego do wytwarzania przeciwciał ważne jest zastosowanie immunogenu o wystarczająco dużym podobieństwie do analizowanego związku, który ma być wykryty. Tylko w ten sposób można zagwarantować, że przeciwciało zwiąże się z wysokim powinowactwem z natywnym związkiem analizowanym w próbce.

Przeciwciała według wynalazku rozpoznają epitopy w N-końcowej części N-końcowego proBNP o wielkoś ci 76 aminokwasów w regionie aminokwasów 10 do 50 korzystnie 10 do 38. Jest celowe, gdy epitopy rozpoznawane przez przeciwciała są tak zlokalizowane, że także N-końcowy proBNP, który w próbce jest już na koń cach nadtrawiony proteolitycznie, nadal zawiera te epitopy. W ten sposób stabilność analizowanego związku w próbce ma raczej drugorzędne znaczenie. Epitopy w korzystnych regionach N-końcowego proBNP mogą występować w postaci liniowej lub jako epitopy konformacyjne.

Przeciwciała monoklonalne zostały wytworzone są przez linie komórkowe MAK M 10.1.11 lub MAK M 13.4.14 zdeponowane 26.01.1999 w DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunscheig, Niemcy). Przeciwciała wytwarzane przez te dwie linie komórkowe są typu IgG. Linie komórkowe M 10.1.11 i M 13.4.14 również wchodzą w zakres wynalazku.

Zakresem wynalazku objęte są również przeciwciała, które podobnie do przeciwciał z linii komórkowych M 10.1.11 i M 13.4.14 są wytwarzane w ekwiwalentny sposób i odpowiednie do swoistego wiązania się z N-końcowym proBNP. Pod pojęciem przeciwciała „wytwarzane w ekwiwalentny sposób rozumie się, że przeciwciała są otrzymywane przez immunizację zrekombinowanym N-końcowym proBNP.

Wytwarzanie poliklonalnych przeciwciał według wynalazku przeprowadza się w następujących etapach: immunizacja odpowiedniego organizmu, jak na przykład, owcy N-końcowym proBNP uzyskanym technikami rekombinacji, izolacja przeciwciał, przeszukiwanie reaktywnych epitopów

PL 204 235 B1 i oczyszczenia przeciwciał przez immunosorpcję na odpowiednich peptydach. Taki sposób jest opisany w przykładzie 2.

Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał według wynalazku przeprowadza się w następujących etapach: immunizacja odpowiedniego organizmu, na przykład, myszy, uzyskanym technikami rekombinacji N-końcowym proBNP i wybór klonów pod kątem reaktywności przeciwciał z natywnym N-końcowym proBNP w różnych pulach surowic pacjentów. Taki sposób jest opisany w przykładzie 3.

Bardziej szczegółowo wynalazek jest wyjaśniony w następujących przykładach.:

P r z y k ł a d 1

Sposób wytwarzania zrekombinowanego N-końcowego proBNP (1-76)

1. Klonowanie zrekombinowanego N-końcowego proBNP

Sekwencję nukleotydową N-końcowego proBNP (sekwencja aminokwasów 1-76) wytworzono przez syntezę genów. W celu uzyskania optymalnej ekspresji genu w E. coli sekwencję DNA dopasowano do najczęściej stosowanych u E. coli kodonów. Sekwencje oligonukleotydów, stosowane do wytwarzania genu są następujące:

Pro5' (Sekw. Id. Nr 1)

5'CCGGATCCCACCCGCTG3'

Pro1hum (Sekw. Id. Nr 2)

5'CGGGATCCCACCCGCTGGGTTCCCCGGGTTCCGCTTCCGACCTGGAAACCTCCG

GTCTGCAGGAACAGCGTAACCACCT3'

Pro2hum (Sekw. Id. Nr 3)

5'CGGTTCCAGGGAGGTCTGTTCAACCTGCAGTTCGGACAGTTTACCCTGCAGGTG

GTTACGCTGTTCCTGC3'

Pro3hum (Sekw. Id. Nr 4)

5'CAGACCTCCCTGGAACCGCTGCAGGAATCCCCGCGTCCGACCGGTGTTTGGAAA

TCCCGTGAAGTTGCTAC3'

Pro4hum (Sekw. Id. Nr 5)

5'CCCAAGCTTAACGCGGAGCACGCAGGGTGTACAGAACCATTTTACGGTGACCAC

GGATACCTTCGGTAGCAACTTCACGGGATTTCC3'

Pro3' (Sekw. Id. Nr 6)

5'CCCAAGCTTAACGCGGAGC3'

Gen wytworzono stosując te startery w PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Zamplifikowany gen wklonowano do odpowiedniego wektora jak, na przykład, wektor pUC19 i zsekwencjonowano. W celu wklonowania genu do wektora ekspresyjnego pQE8 n z wektora pUC19 enzymami restrykcyjnymi BamHI i Hindlll wycięto gen, zligowano z wektorem pQE8, umożliwiając ekspresję białek z N-koń cowym znacznikiem histydynowym i transformowano nim E. coli M15 [pREP4].

2. Ekspresja N-końcowego proBNP w E. coli

W celu ekspresji genu w E. coli cał onocną hodowlą zrekombinowanego klonu E. coli zaszczepiono 1/60 w bulionie Lurii (z 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny) i indukowano 1 mM IPTG (izopropylotiogalaktozyd; końcowe stężenie 1 mM) przy OD550 1. Po indukcji hodowle inkubowano dalej przez 4 godziny w 37°C. Hodowle odwirowano i osad komórkowy zebrano w 50 mM fosforanie sodu jako buforze, pH 8,0; 360 mM NaCl. Po rozbiciu zawiesiny komórek ultradźwiękami, zawiesinę odwirowano i supernatant naniesiono na kolumnę Ni-NTA (nitrylotrioctan). Po etapie płukania 50 mM buforu fosforanu sodu, pH 8,0; 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu wyeluowano oznakowany znacznikiem histydynowym N-końcowy proBNP za pomocą 50 mM buforu fosforanu sodu, pH 8,0; 300 mM NaCl, 300 mM imidazolu. Wyeluowane frakcje połączono i dializowano wobec 50 mM Tris pH 8,0. W celu oddzielenia zanieczyszczeń dzializat naniesiono na kolumnę z Q-Sepharose. Masę oczyszczonego N-końcowego proBNP określono za pomocą MALDI-TOF.

P r z y k ł a d 2

Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych przeciw N-końcowemu pro-BNP

1. Immunizacja

Owce immunizowano zrekombinowanym N-końcowym pro-BNP (1-76) w całkowitym adiuwancie Freunda. Dawka wynosiła 0,1 mg na zwierzę. Immunizację powtarzano przez 10 miesięcy w odstępach 4 tygodni. 6 tygodni po pierwszej immunizacji i potem jeden raz co miesiąc pobierano próbki surowicy i badano pod kątem czułości i miana.

PL 204 235 B1

2. Oczyszczanie przeciwciał poliklonalnych z surowicy owcy

Z surowej surowicy owcy immunizowanej zrekombinowanym N-końcowym pro-BNP usunięto składniki lipidowe przez odlipidowienie aerosilem (1,5%). Następnie immunoglobuliny strącono siarczanem ammonu (2M). Później siarczanem amonu (2M) strącano immunoglobuliny. Rozpuszczony osad dializowano wobec 15 mM KPO4, 50 mM NaCl pH 7,0 i poddano chromatografii naDEAE Sepharose. Frakcja IgG PAK<rek.NT-pro-BNP>S-IgG(DE) była obecna w eluacie.

3. Sekwencyjna chromatografia powinowactwa w sposobie wytwarzania poliklonalnych przeciwciał swoistych wobec NT-pro-BNP

W celu oczyszczenia przeciwciał poliklonalnych swoistych w stosunku do NT-proBNP skierowanych przeciwko aminokwasom 1-21, PAK<rek. NT-pro-BNP>M-IgG(IS.1-21), zastosowano biotynylowany na C-końcu peptyd HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi (1-21-Bi, Sekw. Id. Nr 7). Macierz powinowactwa wytworzono przez załadowanie 10 ml powleczonych streptawidyną cząstek polimeru metakrylonu (Boehringer Mannheim, Numer referencyjny 1529188) z 1 mg peptydu (1-21-Bi).

Załadowano do kolumny 10 ml macierzy powinowactwa i zrównoważono ją 50 mM KPO4, 150 mM NaCl pH 7,5 (PBS). Dla pierwszego etapu sekwencyjnej chromatografii powinowactwa z kolumną związano 850 mg PAK<NT-pro-BNP>S-IgG(DE). Eluat zachowano do drugiego etapu (patrz poniżej). Kolumnę płukano PBS i 20 mM KPO4, 500 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% kwas Na-deosycholowy pH 7,5. IgG swoiście związane z macierzą powinowactwa eluowano za pomocą ImmunoPure® Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce, Produkt Nr 21013). Macierz powinowactwa regenerowano 1 M kwasem propionowym i przechowywano w PBS/NaN3.

W podobny sposób jak opisano powyżej zastosowano peptyd Bi-ELQVEQTSL (Bi-30-38 Sekw. Id. Nr 8) do wytwarzania macierzy powinowactwa do oczyszczenia immunoglobulin swoistych wobec NT-pro-BNP skierowanych przeciw aminokwasom 30-38. PAK<rek.NT-pro-BNP>M-IgG(IS,30-38) i zebrano z eluatu pierwszego oczyszczania za pomocą powinowactwa.

4. Biotynylacja PAK<NT-pro-BNP>S-IgG(IS,1-21)

Przeciwciała oczyszczone za pomocą powinowactwa dializowano wobec buforu do biotynylacji (100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 8,0) i następnie roztwór doprowadzono do stężenia białka 1 mg/ml. Ester N-hydroksysukcynymidowy kwasu D-biotynoilo-aminokapronowego rozpuszczono w DMSO i dodano do roztworu przeciwciał w stosunku molowym 1:7,5. Reakcję zatrzymano przez dodanie L-lizyny i nadmiarowy odczynnik do znakowania usunięto przez dializę.

5. Digoksygenylacja PAK<NT-pro-BNP>S-IgG(IS,30-38)

Oczyszczone za pomocą powinowactwa przeciwciała dializowano wobec buforu do digoksygenylacji (100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 7,6) i następnie roztwór doprowadzono do stężenia białek 1 mg/ml. Ester N-hydroksysukcynymidowy digoksygeniny-3-CME rozpuszczono w DMSO i dodano do roztworu przeciwciał w stosunku molowym 1:5. Reakcję zatrzymano przez dodanie L-lizyny i nadmiarowy odczynnik do znakowania usunięto przez dializę.

P r z y k ł a d 3

Wytwarzanie i badanie przesiewowe przeciwciał monoklonalnych przeciw NT-pro-BNP (1-76)

1. Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych przeciw NT-pro-BNP (1-76)

Myszy Balb/c 8-12 tygodniowe poddaje się dootrzewnowej immunizacji 100 μg zrekombinowanego antygenu N-końcowego proBNP z całkowitym adiuwantem Freunda. Po 6 tygodniach przeprowadzono 3 dalsze immunizacje w odstępach 4 tygodni. Tydzień po ostatniej immunizacji pobrano krew i oznaczono miano przeciwciał w surowicy badanych zwierząt. Ze śledziony dodatnio reagujących myszy uzyskano limfocyty B, które poddano fuzji ze stałą linią szpiczaka. Fuzja zachodzi według znanej procedury Koehlera i Millsteina (Nature 256, 1975, str. 495-497). Wytworzone tu pierwotne hodowle z komórek hybrydowych klonowano w zwykły sposób, na przykład, przy zastosowaniu dostępnego w handlu sortera komórek lub przez „metodą rozcieńczeń granicznych. Obrabiane były tylko hodowle klonów, które reagowały dodatnio w odpowiedniej procedurze testowej na przykład immunooznaczeniu enzymatycznym (ELISA) ze zrekombinowanym N-końcowym proBNP i rozpoznawały naturalny N-koniec proBNP w surowicach pacjentów (patrz punkt 2). W ten sposób uzyskuje się szereg linii komórkowych hybrydom, które produkują monoklonalne przeciwciała według wynalazku.

Aby uzyskać płyn puchlinowy wstrzyknięto 5 x 10⁶ komórek hybrydomy dootrzewnowo myszom Balb/c, które były uprzednio traktowane 1-2 razy 0,5 ml Pristan. Po 2-3 tygodniach z przestrzeni brzusznej myszy uzyskać płyn puchlinowy. Z niego można w zwykły sposób izolować przeciwciała. Te monoklonalne przeciwciała są swoiste w stosunku do ludzkiego N-końcowego proBNP. Są one

PL 204 235 B1 dalej określane jako MAK M 10.1.11 lub MAK M 13.4.14. Te oba monoklonalne przeciwciała należą do podklasy IgGl kappa.

Za pomocą tej metody można było wyizolować zarówno linię komórkową hybrydoma klonu M10.1.11 jak i M13.4.14., które zdeponowano wu DSMZ, jak wzmiankowano powyżej.

2. Test przesiewowy na przeciwciała przeciw peptydom pro-BNP w surowicy i zrekombinowanemu NT-pro-BNP.

Aby wykazać obecność i swoistość przeciwciał w stosunku do NT-proBNP w surowicy immunizowanych myszy, w supernatancie hodowli komórek hybrydowych lub w płynie puchlinowym, oceniano klony zgodnie z następującymi zasadami testów:

a) Reaktywność ze zrekombinowanym N-końcowym proBNP.

Płytki mikrotitracyjne (Nunc. Maxisorb) są związane z 2,5 μg/ml zrekombinowanego białka NT-proBNP jako antygenem w buforze do ładowania (Boehringer, 0,2 M węglan sodu/kwaśny węglan sodu, pH 9,3-9,5, Nr katalogu 728 559) 100 μg/studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Ładowanie zachodzi w buforze PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem - Phosphate Buffered Saline, Oxid, Kod-BR 14a) i 1% Byco C przez 30 minut. Następnie płucze się buforem do płukania (0,9 roztwór chlorku sodu, 0,05% Tween 20). Inkubacja próbek przeciwciał odbywa się przy 100 μg/studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy wytrząsaniu. Dalej ponownie płucze się dwukrotnie roztworem do płukania. Następnie zachodzi dalsza inkubacja z koniugatem przeciwciała do wykrywania PAK<M-FcY>S-Fab-Peroksydaza (Boehringer Mannheim nr Katalogu 1500 686), 100 mU/ml, 100 μl/studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Po dalszym etapie płukania buforem do płukania aktywność peroksydazy określa się w zwykły sposób (na przykład z ABTS®) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, odczytywana jest różnica w ekstynkcji w mE, przy 405 nm za pomocą czytnika do ELISA.

b) Reaktywność z N-terminalnym peptydami proBNP W tym przypadku stosowane są naładowane streptawidyną płytki mikrotitracyjne z koniugatami NT-pro-BNP-peptyd-biotyna sekwencji 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 39-50, 50-63 lub 64-73 jako antygenem, 250 ng/ml w buforze PBS (Phosphate Buffered Saline, Oxid, Kod-BR 14a) z 0,5% Byco C, 100 μg/studzienkę, wiązano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze wytrząsaniem. Następnie płukano buforem do płukania (roztwór 0,9% chlorku sodu, 0,05%Tween 20). Inkubację próbki przeciwciała i reakcję wykrywania przeprowadzono jak opisano pod a). Ze względu na reaktywność z pewnymi peptydami NT-proBNP można określić położenie epitopu.

c) Reaktywność z natywnym N-końcowym proBNP w próbkach pacjentów

Płytki mikrotitracyjne (Nunc. Maxisorb) są związane z 5 Ug/ml PAK<ludzki pro-BNP>S-IgG (IS,(1-21) lub (30-38)S-IgG w buforze do załadowania (Boehringer, 0,2 M węglan sodu/kwaśny węglan sodu, pH 9,3-9,5, nr katalogu 728 559) 100 μg /studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Ładowanie zachodzi w buforze PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Phosphate Buffered Salinę, Oxid, Kod-BR 14a) i 1% Byco C przez 30 minut. Następnie płucze się buforem do płukania (0,9 roztwór chlorku sodu, 0,05% Tween 20). Inkubację z natywnym antygenem w surowicy pacjenta rozcieńczonej w buforze PBS przeprowadza się przy 100 μg/studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze wytrząsaniem. Po ponownym etapie płukania przeprowadza się inkubację przeciwciał z próbką przy 100 μl/studzienkę, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Następnie ponownie płucze się dwa razy roztworem do płukania i zachodzi dalsza inkubacja z koniugatem przeciwciała do wykrywania PAK<M-FcY>S-Fab-Peroksydaza (Boehringer Mannheim Nr Katalogu 1500 686), 100 mU/ml, 100 ul/studzienkę w temperaturze pokojowej ze wytrząsaniem. Po dalszym etapie płukania buforem do płukania aktywność peroksydazy określa się w zwykły sposób (na przykład z ABTS®), przez 30 minut w temperaturze pokojowej, odczytywana jest różnica w ekstynkcji w mE, przy 405 nm za pomocą czytnika do ELISA.

3. Wyniki. Wzór reakcji przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych przeciw N-końcowemu proBNP

a) Reaktywność MAK (c = 5 μg/ml) z immunizacji peptydami N-końcowego proBNP

PL 204 235 B1

T a b e l a 1

MAK	Immu- nogen	Reaktywność z peptydami pro-BNP	Rek. proBNP	Natywny pro-BNP
		1-10	8-18	1-21	16-30	30-38	39-50	50-63	64-76
5.2.27	1-10	1,42	0,04	1,48	0,05	0,03	0,04	0,04	0,04	1,16	0,30
2.1.4	16-30	0,04	0,04	0,04	1,86	0,04	0,04	0,04	0,04	0,1	0,02
1.2.6	39-50	0,04	0,04	0,03	0,04	0,03	1,23	0,03	0,04	0,44	0,06

Przeciwciała monoklonalne, które uzyskano z immunizacji różnymi peptydami reagują bardzo silnie z odpowiednimi peptydami. Reaktywność ze zrekombinowanym N-końcowym proBNP daje się stwierdzić tylko dla dwóch przeciwciał monoklonalnych, podczas gdy z natywnym N-końcowym proBNP w puli pacjentów nie zachodzi ż adna reakcja (tabela 1)

b) Reaktywność przeciwciał monoklonalnych (MAK) z immunizacji zrekombinowanym N-końcowym proBNP.

T a b e l a 2

MAK	Reaktywność z peptydami pro-BNP	Rek. proBNP	Natywny pro-BNP
	1-10	8-18	1-21	16-30	30-38	39-50	50-63	64-76
10.1.1 1	0,04	0,97	1,03	0,04	0,04	0,06	0,04	0,04	1,61	1,70
10.3.1 9	0,04	0,04	0,04	0,04	0,04	0,05	0,04	0,03	1,24	0,91
10.3.3 0	0,04	0,04	0,03	0,04	0,04	0,06	0,04	0,03	1,43	0,79
13.4.1 4	0,04	0,04	0,04	0,04	0,04	0,05	0,03	0,04	1,65	1,83
13.1.1 8	0,04	0,04	0,03	0,04	1,14	0,03	0,04	0,04	1,47	0,56
13.2.2 2	0,04	0,04	0,04	0,04	0,04	0,03	0,04	0,04	1,82	1,61

Monoklonalne przeciwciała otrzymane z immunizacji zrekombinowanym N-końcowym proBNP reagują tylko częściowo z peptydami, ale bardzo silnie ze zrekombinowanym N-końcowym proBNP lub z natywnym N-końcowym proBNP w puli pacjentów. Brak reakcji pojedynczych monoklonalnych przeciwciał z peptydami wskazuje na rozpoznanie tak zwanego epitopu konformacyjnego (patrz tabela 2).

c) Reaktywność PAK z immunizacji zrekombinowanym N-końcowym proBNP

T a b e l a 3

PAK	Immuno- sorpcja	Reaktywność z peptydami pro-BNP	Rek. proBNP	Natywny pro-BNP
		1-10	8-18	1-21	16-30	30-38	39-50	50-63	64-76
S-9212	bez	0,13	1,81	1,98	1,16	2,99	0,83	1,22	0,06	0,89	-
S-9212	1-21	0,99	2,99	2,99	1,00	0,20	0,13	0,20	0,15	1,98	1,41
S-9212	30-38	0,08	0,07	0,07	0,07	2,99	0,06	0,17	0,06	2,99	1,41

Uzyskane PAK wykazały najsilniejszą reakcję z peptydami 1-21 i 30-38. Z tego powodu wybrano te epitopy i z ich pomocą immunoabsorbowano PAK. PAK immunoabsorbowany z peptydem 1-21 wykazuje najsilniejszą reakcję z regionem 8-20 i wyraźnie słabiej z sekwencją N-końcową 1-10. Tak immunoabsorbowane PAK reagują bardzo silnie ze zrekombinowanym N-końcowym proBNP i w formacie kanapkowym PAK/PAK z natywną próbką (zobacz tabela 3).

P r z y k ł a d 4

Wysoce czułe immunooznaczenie do określania NT-pro-BNP

Za pomocą uzyskanych w przykładzie 2 i 3 przeciwciał możliwe było ustalenie wysoce czułego immunooznaczenia. Na ogół odpowiednie są wszystkie formaty testowe, stosujące 2 przeciwciała z rozpoznawaniem różnych epitopów. Jako przykład opisana będzie tak zwana ELISA typu kanapkowego.

PL 204 235 B1

Jako fazę stałą zastosowano pokrytą streptawidyną płytkę mikrotitracyjną (MTP). 10 μΐ nietraktowanej próbki lub kalibratora (związku do kalibracji) pipetowano razem ze 100 μl buforu zawierającego oba swoiste w stosunku do epitopu przeciwciała, do studzienek płytki i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jako przeciwciało zastosowano 1 μg/ml biotynylowanego PAK<rek.NTpro-BNP>S-IgG(IS,1-21) i 0,5 μg/ml digoksygenowanego PAK<rek.NT-pro-BNP>S-IgG(IS.30-38). Następnie płyn odsysano i płukano trzykrotnie 350 μl buforu do płukania. Następnie dodano 100 μl roztworu koniugatu i ponownie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jako koniugat stosuje się koniugat przeciwciało-anty-digoksyna-POD w stężeniu 100 mlU/ml. Następnie odsysa się roztwór koniugatu i płucze 3 razy 350 μl buforu do płukania. Na koniec do studzienek pipetuje się roztwór substratu ABTS® substrat i mierzy przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po osiągnięciu 30 minutowej reakcji substratu dokonuje się bezpośredniego pomiaru płytki mikrotitracyjnej w czytniku MTP przy długości fali 405 nm w stosunku do długości referencyjnej 495 nm.

W celu oceny czułości sporządzono krzywą wzorcową i określono dokładność standardu zerowego (n = 21). Jako kalibrator stosowano ludzkie osocze EDTA, do którego dodawano rekombinowany N-końcowy proBNP w wymaganym stężeniu. Jako standard zerowy stosowano osocze bydlęce. Wyniki przedstawiono w tabeli 4.

T a b e l a 4

	Ekstynkcja (wartość średnia)	Odchylenie standartowe (n = 21)
Kalibrator a: 0 fmol/ml	131 mE	5,7 mE
Kalibrator b: 5,04 fmol/ml	268 mE
Kalibrator c: 19,9 fmol/ml	746 mE
Kalibrator d: 50,5 fmol/ml	1500 mE
Kalibrator e: 100,9 fmol/ml	2401 mE

Ze względu na nachylenie krzywej kalibracyjnej 22,5 mE x ml/fmol i SD 5,7 mE uzyskuje się zgodne z wzorem Kaisera następującą granicę oznaczenia:

UNG = 3 SD(standard zerowy)/nachylenie krzywej kalibracyjnej = 3x 5,7/22,5 = 0,76 fmol/ml.

P r z y k ł a d 5

Określenie stabilności próbki N-końcowego proBNP

Za pomocą opisanego w przykładzie 4 kanapkowego-ELISA zmierzono stabilność analityczną N-końcowego proBNP. W tym celu pobrano krew od 4 pacjentów klasy NYHA II-III do probówek zawierających EDTA i przechowano 3 dni w temperaturze pokojowej. Codziennie pobierano próbkę i mierzono stężenie N-końcowego proBNP. Próba referencyjna jak i próbki do określania stabilności w osoczu z EDTA były natychmiast schładzane do 4-8°C i odwirowano je w ciągu 15 minut. Osocza z EDTA przechowywano w 4°C i w temperaturze pokojowej i mierzono w różnych okresach 24-godzinnego czasu obciążenia. Wyniki przedstawiono w tabeli 5.

T a b e l a 5

Czas obciążenia	Odzysk(%)
EDTA-krew pełna. Temp. pokojowa 24 godz.	98,8
48 godz.	98,0
72 godz.	100,5
EDTA-osocze. 4°C 2 godz.	97,5
4 godz.	98,5
6 godz.	102,0
24 godz.	103,0
EDTA-osocze. Temp. pokojowa 2 godz.	103,0
4 godz.	104,8
6 godz.	102,0
24 godz.	96,0

PL 204 235 B1

Te dane dowodzą, że N-końcowy proBNP w badanym czasie jest całkowicie stabilny i może być stosowany jako rutynowy parametr. Ten wynik jest sprzeczny z opisanymi w literaturze (Hunt i wsp., Clinical Endocrinology, 47, 287 (1977)) i potwierdza założenie, że przez wybór i projekt tego formatu testu z 2 swoistymi przeciwciałami, których epitopy nie leżą na zewnętrznych końcach analizowanego związku, można wpłynąć na stabilność analizowanego związku.

P r z y k ł a d 6

Określenie czułości diagnostycznej oznaczenia N-końcowego proBNP

W celu określenia czułości diagnostycznej zastosowano ponownie test opisany w przykładzie 4. W tym celu dokonano pomiaru u 114 osób zdrowych i 235 pacjentów z klasyfikacją NYHA między I i IV. Normalnie jest szczególnie istotne rozróżnienie osób zdrowych od pacjentów Klasy I NYHA.

Za pomocą tego wysoce czułego oznaczenia u 110 zdrowych dawców krwi uzyskano wartość mediany 6,6 fmol/ml NT-proBNP z odchyleniem standartowym 7,3 fmol/ml. Najniższą wartość ustalono na 0,2 fmol/ml. Wskazuje to wyraźnie, że czułość <1,0 fmol/ml jest konieczna aby dokładnie wykryć obszar referencyjny. Za pomocą tego rozdziału ustalono że górna granica strefy normalnej (97,5 procentyl) wynosi 26,6 fmol/ml.

Przy przyjęciu obszaru referencyjnego 0-26,6 fmol/ml stwierdzono wśród 233 pacjentów z klasyfikacją NYHA I-IV tylko 16 pacjentów z wartością w zakresie normy. Odpowiada to czułości klinicznej 93,3%. Jeśli rozpatruje się tylko pacjentów z klasyfikacją NYHA I, z 37 pacjentów 30 określono jako dodatnich, co odpowiada czułości 81,1%.

Wynik ten potwierdza, że przez to wysoce czułe oznaczenie N-końcowego proBNP możliwe jest wyraźne odróżnienie pacjentów z niewydolnością serca NYHA klasy I od zdrowej grupy normalnej. To nie mogło być osiągnięte za pomocą oznaczeń, które były dotychczas dostępne w stanie techniki (Dagubatti i wsp. Cardiovascular Research 36 (1977), 246.

PL 204 235 B1

Lista sekwencji <110> Roche Diagnoscics GmbH <12O> Sposób wykrywania N-końcowego proBNP <130> 51810AWO-SZ <140>

<141>

<160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Ξ. coli <400> 1 t t ccggacccca cccgctg 17 <210> 2

<211> 79 <212> DNA <213> E. coli
<400> 2
-t		tcccc tt	ttcc	cc -feccg
cgggatccca	ccccctgggt	tccccgggtt	ccgcrzccga	cctggaaacc cccggtctgc 60
aggaacagcg	EaaccaccL			79
33	cc-t

<210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> E. coli <400> 3 tt t t tt t tt t tt ŁŁct^CCŁ t cggttccagg gaggtctgtc caacctgcag ttcggacagz ccaccctcca ggtggttacg 60 ctgttcctgc 70 <210> 4 <211> 71 <212> DNA <213> E. coli <400> 4 i , a.

tece tgg get gc&agaatcc cegeg tccoa c cggtatttci 4 fc cagacctcse cggaaccgoc ęcaggaatcc ccgcgcccga coggtgttcg gaaatcccgt 60

PL 204 235 B1 gttgcto-c gaagcogctac 71 <210> 5 <211> 87 <212> DNA <213> E. coli <400> 5 gct-te. c 9 t + -fettAcggtgcL -t cccaagctta acgcggagca cgcagggcgc scagaaccat cctacggręa ccacggatac 60 cttcggtagc aacttcacgg gatrtcc 87 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> E. coli <400> 6 cł-t cccaagctta acgcggagc

Claims (12)

1. Sposób wykrywania natywnego N-koń cowego proBNP w próbce, który przeprowadza się w formacie kanapkowym (sandwich) stosują c co najmniej dwa przeciwciała, które rozpoznają róż ne epitopy natywnego N-końcowego proBNP i w tym samym czasie mogą wiązać się z natywnym N-końcowym proBNP, znamienny tym, że stosuje się co najmniej dwa przeciwciała wiążące się w regionie aminokwasów 10-50 N-koń cowego proBNP, otrzymywane przez immunizowanie odpowiedniego organizmu zrekombinowanym NTproBNP, w którym występuje region aminokwasów 10-50.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dolna granica wykrywalności N-końcowego proBNP leży poniżej 1 fmol/ml użytej próbki.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że na podstawie uzyskanych wartości można dokonać rozróżnienia próbek od zdrowych pacjentów i próbek od pacjentów z niewydolnością serca z klasy NYHA I do IV.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ze względu na uzyskane wartości można dokonać rozróżnienia próbek od pacjentów zdrowych i próbek od pacjentów klasy NYHA I.

5. Zastosowanie sposobu określonego w zastrz. 1-4 do rozróżnienia między próbkami od zdrowych pacjentów i próbkami od pacjentów klas NYHA I do IV.

6. Zastosowanie zrekombinowanego N-koń cowego proBNP jako standardu w sposobie wykrywania N-końcowego proBNP określonym w zastrz. 1-4.

7. Przeciwciał a przeciw zrekombinowanemu N-koń cowemu proBNP wytwarzane przez immunizację odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym techniką rekombinacji, znamienne tym, że wiążą się specyficznie w 10 do 50- aminokwasowym regionie N-końcowego proBNP.

8. Przeciwciał a wedł ug zastrz. 7 uzyskiwalne z linii komórkowych M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14. (DSM ACC 2387) zdeponowanych 26.01.1999 w DSMZ.

9. Przeciwciała według zastrz. 8, znamienne tym, ż e są uzyskane w sposób ekwiwalentny z użyciem N-końcowego proBNP do przeciwciał, które są uzyskane z linii komórkowych M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14 (DSM ACC 2387).

10. Linie komórkowe M 10.1.11 (DSM ACC 2386) lub M 13.4.14 (DSM ACC 2387) zdeponowane 26.01.1999 w DSMZ.

PL 204 235 B1

11. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał jak określone w zastrz. 7 albo 9, znamienny tym, że obejmuje etapy immunizacji odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym technikami rekombinacji, izolacji przeciwciał, poszukiwania najbardziej reaktywnych epitopów i oczyszczenia przeciwciał przez immunoadsorpcję na odpowiednich peptydach.

12. Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał jak określone w zastrz. 7 do 9, znamienny tym, że obejmuje etapy immunizacji odpowiedniego organizmu N-końcowym proBNP uzyskanym technikami rekombinacji i, wybór klonów pod kątem reaktywności przeciwciał z natywnym N-końcowym proBNP w różnych pulach surowicy pacjentów.