JPH0627737B2 - 分析要素中での水平分離を利用する不均質免疫検定法 - Google Patents
分析要素中での水平分離を利用する不均質免疫検定法Info
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- JPH0627737B2 JPH0627737B2 JP61168166A JP16816686A JPH0627737B2 JP H0627737 B2 JPH0627737 B2 JP H0627737B2 JP 61168166 A JP61168166 A JP 61168166A JP 16816686 A JP16816686 A JP 16816686A JP H0627737 B2 JPH0627737 B2 JP H0627737B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学、並びに液体中の免疫学的に反応性の
リガンドを測定するための不均質な競合的結合免疫検定
法に関する。本発明は生物学的流体のような水性液体中
の上記のようなリガンドを測定するのに特に有用であ
る。
リガンドを測定するための不均質な競合的結合免疫検定
法に関する。本発明は生物学的流体のような水性液体中
の上記のようなリガンドを測定するのに特に有用であ
る。
自然の免疫学的反応を利用する競合的結合免疫検定法は
臨床化学における分析技術として広範囲に及ぶ用途が見
いだされている。その反応は特異性があるので、その検
定法は、非常に低い濃度で存在しそれで化学技術によっ
ては適切に定量することのできない生物学的被分析物を
定量するのに特に有益である。そのような被分析物（本
明細書においてはリガンドと呼ぶ）としては、例えば、
治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、蛋白質等がある。非
常に低い濃度のリガンドを測定するために幾つかの技術
が案出されてきている。例えば、リガンドを容易に測定
できるようにするために種々の手段によってリガンドを
標識することができる。競合的結合測定法においては、
標識されたリガンドアナログ（本明細書においてはリガ
ンドアナログとして同定される）を、固定量の適切な結
合性物質（本明細書においては受容体と呼ぶ）との反応
にたいして、標識されていないリガンドとの競合で配置
する。未知濃度のリガンドは、結合されたリガンドアナ
ログ又は結合されなかった（即ち、遊離の）リガンドア
ナログのいずれかの測定された信号から測定することが
できる。その反応は次のように進行する： リガンド＋リガンドアナログ＋受容体 ↑↓ リガンド−受容体＋リガンドアナログ−受容体 標準的な標識としては放射性標識、酵素、発色団、発蛍
光団、安定な遊離基、酵素補因子、酵素阻害物質及びア
ロステリックエフェクターがある。
臨床化学における分析技術として広範囲に及ぶ用途が見
いだされている。その反応は特異性があるので、その検
定法は、非常に低い濃度で存在しそれで化学技術によっ
ては適切に定量することのできない生物学的被分析物を
定量するのに特に有益である。そのような被分析物（本
明細書においてはリガンドと呼ぶ）としては、例えば、
治療薬、麻酔薬、酵素、ホルモン、蛋白質等がある。非
常に低い濃度のリガンドを測定するために幾つかの技術
が案出されてきている。例えば、リガンドを容易に測定
できるようにするために種々の手段によってリガンドを
標識することができる。競合的結合測定法においては、
標識されたリガンドアナログ（本明細書においてはリガ
ンドアナログとして同定される）を、固定量の適切な結
合性物質（本明細書においては受容体と呼ぶ）との反応
にたいして、標識されていないリガンドとの競合で配置
する。未知濃度のリガンドは、結合されたリガンドアナ
ログ又は結合されなかった（即ち、遊離の）リガンドア
ナログのいずれかの測定された信号から測定することが
できる。その反応は次のように進行する： リガンド＋リガンドアナログ＋受容体 ↑↓ リガンド−受容体＋リガンドアナログ−受容体 標準的な標識としては放射性標識、酵素、発色団、発蛍
光団、安定な遊離基、酵素補因子、酵素阻害物質及びア
ロステリックエフェクターがある。
測定すべきリガンドの濃度が極めて低いので感度は最も
重要である。最初の非常に敏感な検定法は標識として放
射性同位体を用いた。蛍光標識又は酵素標識はほとんど
の商業的免疫検定法において最近は好まれている。
重要である。最初の非常に敏感な検定法は標識として放
射性同位体を用いた。蛍光標識又は酵素標識はほとんど
の商業的免疫検定法において最近は好まれている。
競合的結合免疫検定法は不均質(heterogeneous)又は均
質(homogeneous)のいずれかとして分類することもでき
る。不均質免疫検定法は結合されたリガンドアナログを
遊離のリガンドアナログから分離することを必要とす
る。結合されたリガンドアナログの特性と遊離のリガン
ドアナログの特性とは有意には異なっていないので、こ
の分離が必要になる。均質免疫検定法は分離工程を必要
とはしない。なぜなら、結合されたリガンドアナログの
特性と遊離のリガンドアナログの特性とはそれらが識別
可能であるように十分に異なっているからである。
質(homogeneous)のいずれかとして分類することもでき
る。不均質免疫検定法は結合されたリガンドアナログを
遊離のリガンドアナログから分離することを必要とす
る。結合されたリガンドアナログの特性と遊離のリガン
ドアナログの特性とは有意には異なっていないので、こ
の分離が必要になる。均質免疫検定法は分離工程を必要
とはしない。なぜなら、結合されたリガンドアナログの
特性と遊離のリガンドアナログの特性とはそれらが識別
可能であるように十分に異なっているからである。
国際特許出願82/2601には、単一層繊維質媒質で実施さ
れる不均質免疫検定法が記載されている。その記載され
た検定法は、その媒質の有限区間中に結合性物質（即
ち、受容体）を沈降させて固定させ、その有限区間をリ
ガンド及び標識指示薬を含有する試料と接触させ、未反
応の標識指示薬を溶剤流でその有限区間から放射状に洗
い出し、そしてその有限区間中に残っている結合された
標識指示薬の量を測定することによって実施される。
れる不均質免疫検定法が記載されている。その記載され
た検定法は、その媒質の有限区間中に結合性物質（即
ち、受容体）を沈降させて固定させ、その有限区間をリ
ガンド及び標識指示薬を含有する試料と接触させ、未反
応の標識指示薬を溶剤流でその有限区間から放射状に洗
い出し、そしてその有限区間中に残っている結合された
標識指示薬の量を測定することによって実施される。
特開昭55-90859号公報には液体の分析又は輸送用粒状構
造物及びそれを用いた分析又は輸送用要素が記載されて
おり、この発明において用いられている粒状構造物から
構成された多孔質層は本発明の拡散性層と同様の構造を
有するものであるが、この公報には、かかる多孔質拡散
性層において、リガンド用の固定された受容体を含ませ
て液体試料中のリガンドと受容体との反応で複合体を形
成せしめると共に、その複合体から非複合化リガンドを
水平分離させて所望の分析を簡便に行わしめることの記
載は認められない。この公報に記載の液を垂直方向に移
動させており、例えば非複合化リガンドを垂直方向に移
動させた場合には、例えば液体試料中のリガンドと受容
体との反応で複合体を形成させようとしても、拡散層に
含まれる受容体と試料中のリガンドの接触時間が短く所
望の反応が十分行われない。
造物及びそれを用いた分析又は輸送用要素が記載されて
おり、この発明において用いられている粒状構造物から
構成された多孔質層は本発明の拡散性層と同様の構造を
有するものであるが、この公報には、かかる多孔質拡散
性層において、リガンド用の固定された受容体を含ませ
て液体試料中のリガンドと受容体との反応で複合体を形
成せしめると共に、その複合体から非複合化リガンドを
水平分離させて所望の分析を簡便に行わしめることの記
載は認められない。この公報に記載の液を垂直方向に移
動させており、例えば非複合化リガンドを垂直方向に移
動させた場合には、例えば液体試料中のリガンドと受容
体との反応で複合体を形成させようとしても、拡散層に
含まれる受容体と試料中のリガンドの接触時間が短く所
望の反応が十分行われない。
上記した免疫検定法は、遊離標識指示薬を結合標識指示
薬から水平に洗い去るために別個の洗浄工程必要とす
る。結合リガンドアナログと遊離リガンドアナログとを
分離するための分離工程を必要とせず、従って使用及び
オートメーション化が一層簡単な免疫検定法をもつこと
が望ましい。
薬から水平に洗い去るために別個の洗浄工程必要とす
る。結合リガンドアナログと遊離リガンドアナログとを
分離するための分離工程を必要とせず、従って使用及び
オートメーション化が一層簡単な免疫検定法をもつこと
が望ましい。
本発明に従えば、前記した従来の免疫検定法の問題点
は、免疫学的に反応性のリガンド用の固定された受容体
を含む拡散性層を有する乾式分析要素を用いて免疫学的
に反応性のリガンドを含むと思われる液体試料中のリガ
ンドを測定する方法において、 （Ａ）粒子直径が１〜200μｍで、最も近接した隣接粒
子の表面域で相互に付着することで、前記液体試料に本
質的に非膨潤性である凝集性の三次元格子を形成する複
数の粒子を含んでなる粒状構造物から構成されている多
孔質の拡散性層の有限区域内に、標識リガンドアナログ
の存在下に、分配手段で付与速度を調節しながら前記液
体試料を付与して前記拡散性層中で徐々に拡散させて、
前記有限区域内に固定リガンド−受容体複合体を形成せ
しめると共に、前記液体試料の拡散中に前記固定リガン
ド−受容体複合体と非複合化リガンドとを実質的に水平
分離せしめ、そして （Ｂ）前記液体試料付与の完了の少なくとも５秒後に、
前記有限区域の中心で前記固定リガンド−受容体複合体
を測定することを含んでなる免疫学的に反応性のリガン
ドの測定方法によって克服される。
は、免疫学的に反応性のリガンド用の固定された受容体
を含む拡散性層を有する乾式分析要素を用いて免疫学的
に反応性のリガンドを含むと思われる液体試料中のリガ
ンドを測定する方法において、 （Ａ）粒子直径が１〜200μｍで、最も近接した隣接粒
子の表面域で相互に付着することで、前記液体試料に本
質的に非膨潤性である凝集性の三次元格子を形成する複
数の粒子を含んでなる粒状構造物から構成されている多
孔質の拡散性層の有限区域内に、標識リガンドアナログ
の存在下に、分配手段で付与速度を調節しながら前記液
体試料を付与して前記拡散性層中で徐々に拡散させて、
前記有限区域内に固定リガンド−受容体複合体を形成せ
しめると共に、前記液体試料の拡散中に前記固定リガン
ド−受容体複合体と非複合化リガンドとを実質的に水平
分離せしめ、そして （Ｂ）前記液体試料付与の完了の少なくとも５秒後に、
前記有限区域の中心で前記固定リガンド−受容体複合体
を測定することを含んでなる免疫学的に反応性のリガン
ドの測定方法によって克服される。
本発明は免疫学的に反応性の化学種を測定するための特
殊な結合検定法、例えば免疫検定法、である。これらの
測定法においては、測定されるべき種及び相当する標識
種は、固定量の共通の反応体にたいして競合する。測定
されるべき種は本明細書においてリガンドと称され、そ
して標識種はリガンドアナログと称される。リガンド及
びリガンドアナログを特異的に見分けそしてそれらと反
応して複合体を形成する化合物は本明細書において受容
体と称される。
殊な結合検定法、例えば免疫検定法、である。これらの
測定法においては、測定されるべき種及び相当する標識
種は、固定量の共通の反応体にたいして競合する。測定
されるべき種は本明細書においてリガンドと称され、そ
して標識種はリガンドアナログと称される。リガンド及
びリガンドアナログを特異的に見分けそしてそれらと反
応して複合体を形成する化合物は本明細書において受容
体と称される。
本発明は生物学的流体（例えば、全血液、血清、血漿、
尿、髄液、ヒト又は動物の組織の懸濁液、糞便、唾液、
リンパ液等）のような液体中の低濃度の免疫学的に反応
性のリガンドを測定するのに利するように用いることが
できる。リガンドは10−１０Ｍのような低い濃度で、そ
して最も一般的には10−９Ｍ〜10−４Ｍの濃度で測定す
ることができる。
尿、髄液、ヒト又は動物の組織の懸濁液、糞便、唾液、
リンパ液等）のような液体中の低濃度の免疫学的に反応
性のリガンドを測定するのに利するように用いることが
できる。リガンドは10−１０Ｍのような低い濃度で、そ
して最も一般的には10−９Ｍ〜10−４Ｍの濃度で測定す
ることができる。
定性的に又は定量的にのいずれかで上記のように測定す
ることができるリガンドとしては、治療薬（例えば、ジ
フェニルヒダントイン、フェノバルビタール、セオフィ
リン、ジェンタマイシン、キニジン、プロパノロール、
トブラマイシン、リドカイン、プロカインアミド等）、
天然又は合成のステロイド（例えば、コルチゾール、ア
ルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エス
トリオール等）、ホルモン（例えば、甲状腺ホルモン、
ペプチドホルモン、インシュリン等）、蛋白質（例え
ば、アルブミン、IgG、IgM等）、抗原、抗体、及び受容
体と自然に反応するその他の種がある。本発明はセオフ
ィリン、フェノバルビタール又はジフェニルヒダントイ
ンのような治療薬の測定に特に有用である。
ることができるリガンドとしては、治療薬（例えば、ジ
フェニルヒダントイン、フェノバルビタール、セオフィ
リン、ジェンタマイシン、キニジン、プロパノロール、
トブラマイシン、リドカイン、プロカインアミド等）、
天然又は合成のステロイド（例えば、コルチゾール、ア
ルドステロン、テストステロン、プロゲステロン、エス
トリオール等）、ホルモン（例えば、甲状腺ホルモン、
ペプチドホルモン、インシュリン等）、蛋白質（例え
ば、アルブミン、IgG、IgM等）、抗原、抗体、及び受容
体と自然に反応するその他の種がある。本発明はセオフ
ィリン、フェノバルビタール又はジフェニルヒダントイ
ンのような治療薬の測定に特に有用である。
本発明の免疫検定法は、希釈された又は希釈されていな
い試験試料（例えば１〜200μ）を収容するのに適し
た多孔度をもつ最外部の多孔質拡散性層を上部にもって
いる支持体からなる乾式分析要素を用いて成功裏に実施
される。好ましくは、その拡散性層は等方性的に多孔質
であり、その特性は区画を構成している諸粒子の間の相
互連絡された空間によって作られている。等方性的に多
孔質とは、その拡散性層がその付与された流体を放射状
にその層全体に均一に拡散させることを意味する。本明
細書及び特許請求の範囲の文脈においては、実質的な水
平分離とは、得るべき複合化リガンドの意味のある定量
について十分に有意の分離をいう。
い試験試料（例えば１〜200μ）を収容するのに適し
た多孔度をもつ最外部の多孔質拡散性層を上部にもって
いる支持体からなる乾式分析要素を用いて成功裏に実施
される。好ましくは、その拡散性層は等方性的に多孔質
であり、その特性は区画を構成している諸粒子の間の相
互連絡された空間によって作られている。等方性的に多
孔質とは、その拡散性層がその付与された流体を放射状
にその層全体に均一に拡散させることを意味する。本明
細書及び特許請求の範囲の文脈においては、実質的な水
平分離とは、得るべき複合化リガンドの意味のある定量
について十分に有意の分離をいう。
本発明の一実施態様においては、徐々に拡散する態様及
び固定複合体と非複合化リガンドとの実質的な水平分離
を生じる態様で液体試料がその層に付与される限りは、
任意の拡散性層を分析要素に用いることができる。液体
付与についての特定の技術は後記する。
び固定複合体と非複合化リガンドとの実質的な水平分離
を生じる態様で液体試料がその層に付与される限りは、
任意の拡散性層を分析要素に用いることができる。液体
付与についての特定の技術は後記する。
そのような多孔質の拡散性層を作るのに有用な吸収材
は、水、又は全血液又は血清のような生物学的流体に暴
露した時にも不溶性でありそしてそれらの構造保全性を
維持する。有用な要素は紙、多孔質粒状構造物、多孔質
ポリマーフイルム、セルロース、木材、ガラス繊維、
（合成又は非合成の）繊維質織布及び不織布等から調製
された拡散性層をもつことができる。そのような層を作
るのに有用な材料及び方法は当該技術で周知である。多
孔質の拡散性層は任意の適した繊維質又は非繊維質材料
あるいはそのいずれかの又は両方の混合物から調製する
ことができる。
は、水、又は全血液又は血清のような生物学的流体に暴
露した時にも不溶性でありそしてそれらの構造保全性を
維持する。有用な要素は紙、多孔質粒状構造物、多孔質
ポリマーフイルム、セルロース、木材、ガラス繊維、
（合成又は非合成の）繊維質織布及び不織布等から調製
された拡散性層をもつことができる。そのような層を作
るのに有用な材料及び方法は当該技術で周知である。多
孔質の拡散性層は任意の適した繊維質又は非繊維質材料
あるいはそのいずれかの又は両方の混合物から調製する
ことができる。
有用な拡散性層は米国特許第4,292,272号明細書に記載
されているように、適した結合材と混合されているか又
は織布に織られているかのいずれかの繊維質材料を用い
て調製することができる。他の方法として、そして好ま
しくは、拡散性層は、米国特許第3,992,158号及び第4,2
58,001号明細書に記載されているように、ポリマー配合
物（例えば白化(blush)ポリマー）又は粒状材料、例え
ば結合接着剤と共に又は結合接着剤なしで結合されたビ
ーズから調製される。
されているように、適した結合材と混合されているか又
は織布に織られているかのいずれかの繊維質材料を用い
て調製することができる。他の方法として、そして好ま
しくは、拡散性層は、米国特許第3,992,158号及び第4,2
58,001号明細書に記載されているように、ポリマー配合
物（例えば白化(blush)ポリマー）又は粒状材料、例え
ば結合接着剤と共に又は結合接着剤なしで結合されたビ
ーズから調製される。
種々のタイプの粒状物（その総てが、液体成分中におい
て非膨潤性であり、そして液体成分に対して化学的に不
活性であり、不透過性であることが望ましい）が拡散性
層を形成するのに有用であり、その例としては、例え
ば、顔料（二酸化チタン、硫酸バリウム等）、珪藻土、
コロイド物質、樹脂ビーズ又はガラスビーズ等がある。
一般的には、そのような物質は結合剤に配分される。
て非膨潤性であり、そして液体成分に対して化学的に不
活性であり、不透過性であることが望ましい）が拡散性
層を形成するのに有用であり、その例としては、例え
ば、顔料（二酸化チタン、硫酸バリウム等）、珪藻土、
コロイド物質、樹脂ビーズ又はガラスビーズ等がある。
一般的には、そのような物質は結合剤に配分される。
粒状物質は隣接粒子の表面域で相互に付着する粒子を得
るように処理することができ、この場合にこれらの粒子
は最近接して凝集性の三次元格子を形成し、この格子は
試験すべき液体に本質的に非膨潤性である。
るように処理することができ、この場合にこれらの粒子
は最近接して凝集性の三次元格子を形成し、この格子は
試験すべき液体に本質的に非膨潤性である。
その他の有用な粒状物質の例としては米国特許第4,430,
436号明細書に記載されたポリマー粒子があり、その粒
子は粒子中に含まれた反応性基によって粒子の接触点で
相互に化学結合されている。その他の有用なポリマー粒
子は特開昭57-101760号公報に記載されており、その粒
子は低分子量接着性化合物（例えば、ビフェノール、ジ
カルボン酸、又はアミノ化合物等の反応生成物）との接
触点で相互に化学結合している。
436号明細書に記載されたポリマー粒子があり、その粒
子は粒子中に含まれた反応性基によって粒子の接触点で
相互に化学結合されている。その他の有用なポリマー粒
子は特開昭57-101760号公報に記載されており、その粒
子は低分子量接着性化合物（例えば、ビフェノール、ジ
カルボン酸、又はアミノ化合物等の反応生成物）との接
触点で相互に化学結合している。
特に有用な拡散性層は、有機ポリマー粒子と（前記の）
米国特許第4,258,001号明細書に記載のこれらの粒子用
のポリマー接着剤とによって形成された粒状構造をもつ
ものである。ポリマー接着剤によって粒状構造内の有機
ポリマー粒子の粒状一体性を維持することによって融合
及び空隙中への粒子の流入を阻止し、そして隣接粒子に
接触しているその構造物の粒子表面域での接着剤濃度
は、その接着剤が空隙中に流入して目詰まりさせること
のないことを確実にする。
米国特許第4,258,001号明細書に記載のこれらの粒子用
のポリマー接着剤とによって形成された粒状構造をもつ
ものである。ポリマー接着剤によって粒状構造内の有機
ポリマー粒子の粒状一体性を維持することによって融合
及び空隙中への粒子の流入を阻止し、そして隣接粒子に
接触しているその構造物の粒子表面域での接着剤濃度
は、その接着剤が空隙中に流入して目詰まりさせること
のないことを確実にする。
本発明を実施するのに好ましい拡散性層を調製するのに
用いられる物質は米国特許第4,258,001号明細書にかな
り詳しく記載されている。その記載されている粒状構造
物の厚さは有機ポリマー粒子の大きさに依存して変化す
る。最適の液体拡散性のためには、粒子付着量(particl
e coverage)は一般的には25〜180g/m2の範囲内である。
用いられる物質は米国特許第4,258,001号明細書にかな
り詳しく記載されている。その記載されている粒状構造
物の厚さは有機ポリマー粒子の大きさに依存して変化す
る。最適の液体拡散性のためには、粒子付着量(particl
e coverage)は一般的には25〜180g/m2の範囲内である。
本発明の実施に有用な熱安定性有機ポリマー粒子は一般
的には直径１〜200μｍの範囲内の粒度をもつ球状ビー
ズである。好ましくはそれらは直径２〜50μｍの範囲内
の粒度をもつ。
的には直径１〜200μｍの範囲内の粒度をもつ球状ビー
ズである。好ましくはそれらは直径２〜50μｍの範囲内
の粒度をもつ。
粒子は天然及び合成の両方のポリマーを含めて、必要な
特性をもつ広範囲の有機ポリマーで構成することができ
る。しかしながら、好ましくは、粒子はエチレン性不飽
和重合性モノマー一種以上から形成された一種以上の付
加ポリマー、例えば単一モノマーの付加ホモポリマー又
は二種以上のそのようなモノマーから形成されたコポリ
マー、で構成される。これらのポリマーは種々の標準的
な重合法（例えば、溶液重合法、乳化重合法、分散重合
法、懸濁重合法等）の内の任意の方法によって調製する
ことができる。所望ならば、その粒状ポリマーはその粒
子に種々の相互作用性組成物を結合させるために一個以
上の反応部位を含有することができるが、本発明はその
ように限定されるものではない。
特性をもつ広範囲の有機ポリマーで構成することができ
る。しかしながら、好ましくは、粒子はエチレン性不飽
和重合性モノマー一種以上から形成された一種以上の付
加ポリマー、例えば単一モノマーの付加ホモポリマー又
は二種以上のそのようなモノマーから形成されたコポリ
マー、で構成される。これらのポリマーは種々の標準的
な重合法（例えば、溶液重合法、乳化重合法、分散重合
法、懸濁重合法等）の内の任意の方法によって調製する
ことができる。所望ならば、その粒状ポリマーはその粒
子に種々の相互作用性組成物を結合させるために一個以
上の反応部位を含有することができるが、本発明はその
ように限定されるものではない。
特に有用な付加ポリマーは一種以上の下記のエチレン性
不飽和の重合性モノマーを重合させることによって形成
されたものである： (a)０〜100、好ましくは０〜99重量％のアミノ置換基の
ないビニル芳香族モノマー一種以上、 (b)０〜25重量％のアクリル酸エステル一種以上、 (c)０〜100、好ましくは０〜75重量％のメタクリル酸エ
ステル一種以上、 (d)０〜30重量％のエチレン性不飽和カルボン酸一種以
上、 (e)０〜75重量％のエチレン性不飽和ニトリル一種以
上、 (f)０〜20重量％のアミノ置換ビニル芳香族モノマー一
種以上、 (g)０〜20、好ましくは０〜10重量％の架橋性基含有エ
チレン性不飽和モノマー（ジアミン又はゼラチン硬化剤
で架橋することのできるもの並びに二個以上のエチレン
性不飽和の重合性基をもつものを含む）一種以上、 (h)０〜20重量％の第三アミノアルキルアクリレート又
はメタクリレート一種以上、 (i)０〜100、好ましくは０〜75重量％の重合性Ｎ−複素
環式ビニルモノマー一種以上、及び (j)０〜20重量％のアクリルアミド又はメタクリルアミ
ド一種以上。
不飽和の重合性モノマーを重合させることによって形成
されたものである： (a)０〜100、好ましくは０〜99重量％のアミノ置換基の
ないビニル芳香族モノマー一種以上、 (b)０〜25重量％のアクリル酸エステル一種以上、 (c)０〜100、好ましくは０〜75重量％のメタクリル酸エ
ステル一種以上、 (d)０〜30重量％のエチレン性不飽和カルボン酸一種以
上、 (e)０〜75重量％のエチレン性不飽和ニトリル一種以
上、 (f)０〜20重量％のアミノ置換ビニル芳香族モノマー一
種以上、 (g)０〜20、好ましくは０〜10重量％の架橋性基含有エ
チレン性不飽和モノマー（ジアミン又はゼラチン硬化剤
で架橋することのできるもの並びに二個以上のエチレン
性不飽和の重合性基をもつものを含む）一種以上、 (h)０〜20重量％の第三アミノアルキルアクリレート又
はメタクリレート一種以上、 (i)０〜100、好ましくは０〜75重量％の重合性Ｎ−複素
環式ビニルモノマー一種以上、及び (j)０〜20重量％のアクリルアミド又はメタクリルアミ
ド一種以上。
特に有用な付加ポリマーとしては米国特許第4,258,001
号明細書の第１表に列記されているものがある。［ ］
括弧内の数字はポリマーの調製に用いたモノマーブレン
ド中の諸モノマーの重量比である。ポリ（ビニルトルエ
ン−ｃｏ−ｐ−ｔ−ブチルスチレン−ｃｏ−メタクリル
酸）[61：37：２］、ポリ（スチレン−ｃｏ−アクリル
酸ｎ−ブチル）[75：25]及びポリスチレンが好ましいポ
リマーである。その有機ポリマー粒子は、所望ならば、
当業界で公知のようにその他の付加物を含有することが
できる。
号明細書の第１表に列記されているものがある。［ ］
括弧内の数字はポリマーの調製に用いたモノマーブレン
ド中の諸モノマーの重量比である。ポリ（ビニルトルエ
ン−ｃｏ−ｐ−ｔ−ブチルスチレン−ｃｏ−メタクリル
酸）[61：37：２］、ポリ（スチレン−ｃｏ−アクリル
酸ｎ−ブチル）[75：25]及びポリスチレンが好ましいポ
リマーである。その有機ポリマー粒子は、所望ならば、
当業界で公知のようにその他の付加物を含有することが
できる。
本発明で有用なポリマー接着剤は有機ポリマー粒子を相
互に結合させて拡散性層中に凝集性の三次元格子を提供
する。この接着剤の詳細は前記の米国特許第4,258,001
号明細書に記載されている。一般的には、その接着剤は
その粒子中に含まれている特殊なポリマーとは異なる有
機ポリマーで構成されているが、実際に一般的にその接
着剤は粒子のポリマー組成物中に存在するあるものと同
一又は類似の多くの繰り返し単位を含むポリマーであ
る。
互に結合させて拡散性層中に凝集性の三次元格子を提供
する。この接着剤の詳細は前記の米国特許第4,258,001
号明細書に記載されている。一般的には、その接着剤は
その粒子中に含まれている特殊なポリマーとは異なる有
機ポリマーで構成されているが、実際に一般的にその接
着剤は粒子のポリマー組成物中に存在するあるものと同
一又は類似の多くの繰り返し単位を含むポリマーであ
る。
好ましくは、接着剤は一種以上のエチレン性不飽和の重
合性モノマーから形成された一種以上の付加ポリマー、
例えば二種以上のそのようなモノマーから形成された付
加コポリマー、で構成される。接着剤は種々の標準的な
重合法のいずれかによって調製することができる。
合性モノマーから形成された一種以上の付加ポリマー、
例えば二種以上のそのようなモノマーから形成された付
加コポリマー、で構成される。接着剤は種々の標準的な
重合法のいずれかによって調製することができる。
一般的には、粒状構造物中に含まれる接着剤の量は、最
適の接着及び液体拡散時間を提供するためには粒子の重
量に基づいて１０％未満、好ましくは２〜６％、一層好
ましくは３〜４％である。
適の接着及び液体拡散時間を提供するためには粒子の重
量に基づいて１０％未満、好ましくは２〜６％、一層好
ましくは３〜４％である。
接着剤として用いられる特に有用な付加ポリマーは下記
のブレンドから選ばれたエチレン性不飽和の重合性モノ
マーのブレンドを重合させることによって形成される。
のブレンドから選ばれたエチレン性不飽和の重合性モノ
マーのブレンドを重合させることによって形成される。
Ａ．前記したアミノ置換基のないビニル芳香族モノマー
一種以上１〜35好ましくは10〜30重量％及びアクリル酸
アルキル又はメタクリル酸アルキル一種以上65〜99好ま
しくは70〜90重量％を含有するブレンド、 Ｂ．アミノ置換基のないビニル芳香族モノマー、アクリ
ル酸エステル、メタクリル酸エステル又は架橋性基含有
エチレン性不飽和の重合性モノマー一種以上20〜95好ま
しくは50〜95重量％、及び活性水素をもつエチレン性不
飽和の重合性モノマー又はその塩一種以上５〜80好まし
くは５〜50重量％を含有するブレンド、 Ｃ．１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニル−２−ピロリ
ドン、ビニルベンジルアルコール、アクリル酸エチル、
アクリルアミド又はメタクリルアミドからなる群から選
ばれたエチレン性不飽和モノマー一種以上15〜100重量
％、及び架橋性基を含有するエチレン性不飽和の重合性
モノマー一種以上０〜85重量％を含有するブレンド、 Ｄ．アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステル一種
以上60〜98好ましくは90〜98重量％、及び一種以上の、
陰イオン部分（例えば、カルボキシ、スルフィノ、スル
ホ、ホスホノ等、又はそれらのアルカリ金属塩又はアン
モニウム塩）一個以上を含有するエチレン性不飽和の重
合性モノマー一種以上２〜40好ましくは２〜10重量％を
含有するブレンド。
一種以上１〜35好ましくは10〜30重量％及びアクリル酸
アルキル又はメタクリル酸アルキル一種以上65〜99好ま
しくは70〜90重量％を含有するブレンド、 Ｂ．アミノ置換基のないビニル芳香族モノマー、アクリ
ル酸エステル、メタクリル酸エステル又は架橋性基含有
エチレン性不飽和の重合性モノマー一種以上20〜95好ま
しくは50〜95重量％、及び活性水素をもつエチレン性不
飽和の重合性モノマー又はその塩一種以上５〜80好まし
くは５〜50重量％を含有するブレンド、 Ｃ．１−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニル−２−ピロリ
ドン、ビニルベンジルアルコール、アクリル酸エチル、
アクリルアミド又はメタクリルアミドからなる群から選
ばれたエチレン性不飽和モノマー一種以上15〜100重量
％、及び架橋性基を含有するエチレン性不飽和の重合性
モノマー一種以上０〜85重量％を含有するブレンド、 Ｄ．アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステル一種
以上60〜98好ましくは90〜98重量％、及び一種以上の、
陰イオン部分（例えば、カルボキシ、スルフィノ、スル
ホ、ホスホノ等、又はそれらのアルカリ金属塩又はアン
モニウム塩）一個以上を含有するエチレン性不飽和の重
合性モノマー一種以上２〜40好ましくは２〜10重量％を
含有するブレンド。
特に有用な付加ポリマーは米国特許第4,258,001号及び
第4,283,491号明細書の第２表に列記されている。
［ ］括弧内の数字はポリマーの調製に用いたモノマー
ブレンド中の諸モノマーの重量比である。ポリ（アクリ
ル酸メチル−ｃｏ−メタクリル酸２−アセトアセトキシ
エチル−ｃｏ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸）［88：７：５］、ポリ（Ｎ−ビニル−２
−ピロリドン）、及びポリ（アクリル酸ｎ−ブチル−ｃ
ｏ−スチレン−ｃｏ−２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸、ナトリウム塩）［75：20：５］が
好ましい接着剤ポリマーである。
第4,283,491号明細書の第２表に列記されている。
［ ］括弧内の数字はポリマーの調製に用いたモノマー
ブレンド中の諸モノマーの重量比である。ポリ（アクリ
ル酸メチル−ｃｏ−メタクリル酸２−アセトアセトキシ
エチル−ｃｏ−２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸）［88：７：５］、ポリ（Ｎ−ビニル−２
−ピロリドン）、及びポリ（アクリル酸ｎ−ブチル−ｃ
ｏ−スチレン−ｃｏ−２−アクリルアミド−２−メチル
プロパンスルホン酸、ナトリウム塩）［75：20：５］が
好ましい接着剤ポリマーである。
前記した粒子及び接着剤をもつ粒状構造物を調製するの
に種々の方法を用いることができる。有用な方法の特定
の詳細は米国特許第4,258,001号明細書に記載されてい
る。
に種々の方法を用いることができる。有用な方法の特定
の詳細は米国特許第4,258,001号明細書に記載されてい
る。
本発明の一実施態様においては、その要素拡散性層は、
粒子が２〜20好ましくは４〜12μｍの範囲の粒度をもつ
という臨界的特色をもつ前記の粒状構造物で構成されて
いる。この大きさの粒子を用いると、適切な毛管作用及
び液体試料保持時間が得られ、このことは特定の結合反
応を生じさせそして複合されなかったリガンドを拡散性
層中で複合されたリガンドから水平に移動し去らせる。
垂直分離（即ち、層から層へ）は有意の程度には生じな
い。
粒子が２〜20好ましくは４〜12μｍの範囲の粒度をもつ
という臨界的特色をもつ前記の粒状構造物で構成されて
いる。この大きさの粒子を用いると、適切な毛管作用及
び液体試料保持時間が得られ、このことは特定の結合反
応を生じさせそして複合されなかったリガンドを拡散性
層中で複合されたリガンドから水平に移動し去らせる。
垂直分離（即ち、層から層へ）は有意の程度には生じな
い。
本発明で有用な要素の拡散性層は適した支持体上に支持
される。そのような支持体は寸法的に安定で、好ましく
は非孔質で透明な（即ち、放射線透過性の）任意の適し
た物質であることができ、これは200〜900ｎｍの波長の
電磁線を透過させる。特定の要素についての選択範囲の
支持体は意図された検出方式（反射、透過又は蛍光分光
分析法）に適合すべきである。有用な支持体物質として
はポリスチレン、ポリエステル［例えば、ポリ（エチレ
ンテレフタレート）］、ポリカーボネート、セルロース
エステル（例えば酢酸セルロース）等がある。
される。そのような支持体は寸法的に安定で、好ましく
は非孔質で透明な（即ち、放射線透過性の）任意の適し
た物質であることができ、これは200〜900ｎｍの波長の
電磁線を透過させる。特定の要素についての選択範囲の
支持体は意図された検出方式（反射、透過又は蛍光分光
分析法）に適合すべきである。有用な支持体物質として
はポリスチレン、ポリエステル［例えば、ポリ（エチレ
ンテレフタレート）］、ポリカーボネート、セルロース
エステル（例えば酢酸セルロース）等がある。
好ましくは、その要素は又、指示薬組成物を含有する試
薬層を含む。場合によっては存在してもよいその他の
層、例えば下塗り層、放射線遮断層等、を所望によって
含むことができる。その要素の総ての層が相互に流体接
触となっており、このことは、流体及びその流体中の試
薬及び非複合化反応生成物が隣接層の重ね合わされた区
域相互の間を通過することができることを意味する。し
かしながら、拡散の間は、非複合化リガンドアナログの
主要移動は垂直よりはむしろ水平である。
薬層を含む。場合によっては存在してもよいその他の
層、例えば下塗り層、放射線遮断層等、を所望によって
含むことができる。その要素の総ての層が相互に流体接
触となっており、このことは、流体及びその流体中の試
薬及び非複合化反応生成物が隣接層の重ね合わされた区
域相互の間を通過することができることを意味する。し
かしながら、拡散の間は、非複合化リガンドアナログの
主要移動は垂直よりはむしろ水平である。
その要素の試薬層は一般的には、一種以上の合成又は天
然結合剤、例えばゼラチン、又はその他の天然産コロイ
ド、ホモポリマー及びコポリマー、例えばポリ（アクリ
ルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−
ｃｏ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び類似コポリマ
ー、中に分散した一種以上の試薬からなる指示薬組成物
を含有する。
然結合剤、例えばゼラチン、又はその他の天然産コロイ
ド、ホモポリマー及びコポリマー、例えばポリ（アクリ
ルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド−
ｃｏ−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）及び類似コポリマ
ー、中に分散した一種以上の試薬からなる指示薬組成物
を含有する。
その要素の拡散性層は、測定時に測定されるべきリガン
ド用の受容体を含有することができる。もしリガンドが
抗原であるならば、受容体はその抗原に対して特異的な
抗体であり、その抗体はその抗原と反応して複合体を形
成する。もしリガンドが抗体であるならば、受容体は適
切な抗原である。本発明の好ましい実施態様において
は、リガンドは治療薬（例えば、セオフィリン、フェノ
バルビタール又はジフェニルヒダントイン）であり、そ
して受容体はその治療薬のための抗体である。受容体は
一般的には商業的に入手でき、あるいはそれらは公知の
出発材料及び方法を用いて調製することができる。一般
的には、適切な受容体例えば抗体は、適した動物にリガ
ンドを接種して適切なプロトコール(protocol)に従って
抗体を生じさせ、そしてその発生した抗体をその動物か
ら取り出すことによって製造される。これらの技術は当
業界で周知である。
ド用の受容体を含有することができる。もしリガンドが
抗原であるならば、受容体はその抗原に対して特異的な
抗体であり、その抗体はその抗原と反応して複合体を形
成する。もしリガンドが抗体であるならば、受容体は適
切な抗原である。本発明の好ましい実施態様において
は、リガンドは治療薬（例えば、セオフィリン、フェノ
バルビタール又はジフェニルヒダントイン）であり、そ
して受容体はその治療薬のための抗体である。受容体は
一般的には商業的に入手でき、あるいはそれらは公知の
出発材料及び方法を用いて調製することができる。一般
的には、適切な受容体例えば抗体は、適した動物にリガ
ンドを接種して適切なプロトコール(protocol)に従って
抗体を生じさせ、そしてその発生した抗体をその動物か
ら取り出すことによって製造される。これらの技術は当
業界で周知である。
その受容体は適した方法で拡散性層中に固定することが
できる。例えば、受容体はガラスビーズ、ポリマービー
ズ又はその他の粒子、樹脂等のような担体に固定するこ
とができる。有用な担体の一例は微生物、例えばスタフ
ィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)で
ある。他の方法としては、ビーズ化された拡散性層は担
体として役立つことができ、それで受容体は追加の担体
なしで拡散性層に固定される。その固定された受容体は
一般的にはその拡散性区域において10−６〜１ｇ／m2の
量である。
できる。例えば、受容体はガラスビーズ、ポリマービー
ズ又はその他の粒子、樹脂等のような担体に固定するこ
とができる。有用な担体の一例は微生物、例えばスタフ
ィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)で
ある。他の方法としては、ビーズ化された拡散性層は担
体として役立つことができ、それで受容体は追加の担体
なしで拡散性層に固定される。その固定された受容体は
一般的にはその拡散性区域において10−６〜１ｇ／m2の
量である。
受容体は固定された形態で拡散性層に加えることがで
き、あるいはリガンドアナログを拡散性層に付与する時
の測定の直前又はその間に拡散性層に固定することがで
きる。好ましくは、受容体は要素の製造中に拡散性層に
固定される。
き、あるいはリガンドアナログを拡散性層に付与する時
の測定の直前又はその間に拡散性層に固定することがで
きる。好ましくは、受容体は要素の製造中に拡散性層に
固定される。
本発明の検定法は、リガンドに結合してリガンドアナロ
グを形成することのできる適した任意の標識を用いて実
施することができる。有用な標識としては放射性標識、
発蛍光体、酵素、酵素阻害物質、アロステリックエフェ
クター、酵素補因子及びその他の公知の酵素モジュレー
ターがある。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びアルカリ性ホスファターゼのような酵素は好まし
い標識である。
グを形成することのできる適した任意の標識を用いて実
施することができる。有用な標識としては放射性標識、
発蛍光体、酵素、酵素阻害物質、アロステリックエフェ
クター、酵素補因子及びその他の公知の酵素モジュレー
ターがある。グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びアルカリ性ホスファターゼのような酵素は好まし
い標識である。
酵素標識を用いるときには、その酵素の基質は好ましく
は要素中に、例えば試薬層中に存在する。他の方法とし
ては、液体試料の前に又は液体試料と同時に、又は結合
反応の完了後にその基質を要素に加えることができる。
所定の標識について適している基質を決定することは臨
床化学における当業者の熟練の範囲内である。その基質
は酵素標識によって直接に作用される物質であることが
でき、あるいは標識の酵素反応を伴う一連の反応に伴な
われる物質であることができる。酵素標識がペルオキシ
ダーゼであるならば、基質は過酸化水素である。一例と
して、グルコースを用いる時には、基質は一般的には試
薬層中に少なくとも0.01モル／m2、好ましくは0.01〜薬
２．５モル／m2の量で存在する。測定法で用いられる酵
素標識の量に対する特定の基質の量をどのように調整す
るかは当業者の知っているところである。
は要素中に、例えば試薬層中に存在する。他の方法とし
ては、液体試料の前に又は液体試料と同時に、又は結合
反応の完了後にその基質を要素に加えることができる。
所定の標識について適している基質を決定することは臨
床化学における当業者の熟練の範囲内である。その基質
は酵素標識によって直接に作用される物質であることが
でき、あるいは標識の酵素反応を伴う一連の反応に伴な
われる物質であることができる。酵素標識がペルオキシ
ダーゼであるならば、基質は過酸化水素である。一例と
して、グルコースを用いる時には、基質は一般的には試
薬層中に少なくとも0.01モル／m2、好ましくは0.01〜薬
２．５モル／m2の量で存在する。測定法で用いられる酵
素標識の量に対する特定の基質の量をどのように調整す
るかは当業者の知っているところである。
ある種の標識例えば酵素、酵素補因子、蛍光化合物又は
酵素モジュレーターを用いる時には、標識の反応結果と
して検知可能な種を提供する試薬一種以上を含む指示薬
組成物を試薬層が含有する。好ましくは、指示薬組成物
は酵素で標識されたリガンドアナログと基質との酵素反
応の結果として比色的に検知可能な種を提供する比色指
示薬組成物である。指示薬組成物は酵素反応で検知可能
な染料を作る単一化合物でも、あるいは染料を作る試薬
の組合せでもよい。例えば、基質としてグルコースを用
いそして酵素標識としてグルコースオキシダーゼを用い
る時には、比色指示薬組成物は、反応して発色染料を提
供するカラーカプラー及び被酸化性化合物を含有するこ
とができる。他の方法としては、その組成物は、グルコ
ースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化させ
る時に作られる過酸化水素の形成の結果として検知可能
な染料を発生させるロイコ染料及びペルオキシダーゼ又
はその他の適した過酸化性化合物を含有することができ
る。有用なロイコ染料は当業者で公知であり、その例と
しては米国特許第4,089,747号明細書及びヨーロッパ特
許公開第162,685号明細書に記載されているものがあ
る。比色指示薬組成物及びそれの種々の成分の特定量は
当業者の熟練の範囲内である。
酵素モジュレーターを用いる時には、標識の反応結果と
して検知可能な種を提供する試薬一種以上を含む指示薬
組成物を試薬層が含有する。好ましくは、指示薬組成物
は酵素で標識されたリガンドアナログと基質との酵素反
応の結果として比色的に検知可能な種を提供する比色指
示薬組成物である。指示薬組成物は酵素反応で検知可能
な染料を作る単一化合物でも、あるいは染料を作る試薬
の組合せでもよい。例えば、基質としてグルコースを用
いそして酵素標識としてグルコースオキシダーゼを用い
る時には、比色指示薬組成物は、反応して発色染料を提
供するカラーカプラー及び被酸化性化合物を含有するこ
とができる。他の方法としては、その組成物は、グルコ
ースオキシダーゼがグルコースをグルコン酸に転化させ
る時に作られる過酸化水素の形成の結果として検知可能
な染料を発生させるロイコ染料及びペルオキシダーゼ又
はその他の適した過酸化性化合物を含有することができ
る。有用なロイコ染料は当業者で公知であり、その例と
しては米国特許第4,089,747号明細書及びヨーロッパ特
許公開第162,685号明細書に記載されているものがあ
る。比色指示薬組成物及びそれの種々の成分の特定量は
当業者の熟練の範囲内である。
その要素の諸層はその他の種々の望ましいがしかし必須
ではない成分（表面活性剤、増粘剤、緩衝液、硬化剤、
酸化防止剤、カプラー溶剤、及び当業界で公知のその他
の物質を含む）を含有することができる。これらの成分
の量も当業者の熟練の範囲内である。
ではない成分（表面活性剤、増粘剤、緩衝液、硬化剤、
酸化防止剤、カプラー溶剤、及び当業界で公知のその他
の物質を含む）を含有することができる。これらの成分
の量も当業者の熟練の範囲内である。
本発明の実施に有用なリガンドアナログは公知の出発材
料及び方法を用いて調製することができ、あるいは商業
的に入手することができる。一般的には、アナログのリ
ガンド部分は共有結合によって標識（例えば、酵素部分
又は発蛍光体）に結合される。
料及び方法を用いて調製することができ、あるいは商業
的に入手することができる。一般的には、アナログのリ
ガンド部分は共有結合によって標識（例えば、酵素部分
又は発蛍光体）に結合される。
本発明の免疫検定法は手動でも自動化されていてもよ
い。一般的には、液体中のリガンドの量は、要素を供給
ロール、チップパケット又はその他の源から取りそして
拡散性層の有限域を液体試料（例えば、１〜200μ）
と物理的に接触させことによって決定される。その接触
する有限域は一般的にはせいぜい約100mm2である。
い。一般的には、液体中のリガンドの量は、要素を供給
ロール、チップパケット又はその他の源から取りそして
拡散性層の有限域を液体試料（例えば、１〜200μ）
と物理的に接触させことによって決定される。その接触
する有限域は一般的にはせいぜい約100mm2である。
拡散性層に２〜20μｍの粒子を用いて前記の本発明を実
施する一方法においては、拡散性層に液体試料を付与す
る技術は臨界的ではない。
施する一方法においては、拡散性層に液体試料を付与す
る技術は臨界的ではない。
しかしながら、本発明を実施する他の方法においては、
試料の接触は、リガンドと受容体との間の複合並びに複
合化リガンドと非複合化リガンドとの実質的な水平分離
が、液体の導入の間に生じるように液体試料の拡散が十
分に遅いような態様で成就されなければならない。この
接触は、ピペット又は試験試料を分配するのに適したそ
の他の分配手段を用いて手動で又は機械で実施される。
液体試料は水平分離を生じさせるために多数の方法で要
素の拡散性層に付与することができる。例えば、比較的
多量の（例えば、100μまでの）液体試料はピペッ
ト、毛細管又はその他の手段を用いて連続法で徐々に
（例えば、少なくとも５秒間にわたって）付与すること
ができる。他の方法としては、試料は小部分に別けて、
例えば、一連の二滴以上の液滴（例えば、０．１〜１μ
）としてある時間（例えば、少なくとも５秒間）にわ
たって付与することができる。この実施態様において
は、リガンド−受容体の複合及び水平分離の両方が拡散
の間に生じるように試料を十分に遅く付与することが臨
界的である。
試料の接触は、リガンドと受容体との間の複合並びに複
合化リガンドと非複合化リガンドとの実質的な水平分離
が、液体の導入の間に生じるように液体試料の拡散が十
分に遅いような態様で成就されなければならない。この
接触は、ピペット又は試験試料を分配するのに適したそ
の他の分配手段を用いて手動で又は機械で実施される。
液体試料は水平分離を生じさせるために多数の方法で要
素の拡散性層に付与することができる。例えば、比較的
多量の（例えば、100μまでの）液体試料はピペッ
ト、毛細管又はその他の手段を用いて連続法で徐々に
（例えば、少なくとも５秒間にわたって）付与すること
ができる。他の方法としては、試料は小部分に別けて、
例えば、一連の二滴以上の液滴（例えば、０．１〜１μ
）としてある時間（例えば、少なくとも５秒間）にわ
たって付与することができる。この実施態様において
は、リガンド−受容体の複合及び水平分離の両方が拡散
の間に生じるように試料を十分に遅く付与することが臨
界的である。
垂直分離は本発明のいずれの実施態様においても有意の
程度には生じない。分離は要素への試料の付与が完了し
たら５〜180秒後に本質的に完了する。
程度には生じない。分離は要素への試料の付与が完了し
たら５〜180秒後に本質的に完了する。
もしリガンドアナログが製造中に要素中に混入されてい
ないならば、要素との接触と同時に又はその前にリガン
ドアナログを試験試料と混合することができる。
ないならば、要素との接触と同時に又はその前にリガン
ドアナログを試験試料と混合することができる。
いずれかの実施態様で試料を付与した後、その要素を何
等かのコンディショニング（例えば、インキュベーショ
ン、加熱等）に暴露する。そのことは試験結果の取得を
速めるかあるいは又容易にするのに望ましいであろう。
本発明の実施においては洗浄工程は用いる必要がない。
等かのコンディショニング（例えば、インキュベーショ
ン、加熱等）に暴露する。そのことは試験結果の取得を
速めるかあるいは又容易にするのに望ましいであろう。
本発明の実施においては洗浄工程は用いる必要がない。
リガンドの量は、複合したリガンドアナログを直接に検
知するか又は酵素標識と基質との酵素反応の結果として
形成された検知可能な種を検知するのに適した装置にそ
の要素を通すことによって測定される。例えば、その種
は一般的に公知の方法を用いて、適した放射線測定装
置、蛍光測定装置又は分光光度装置で検知することがで
きる。酵素反応においては、生成染料は、試験試料と接
触した有限域の中心で反射密度、透過密度又は蛍光を測
定することによって求められる。測定される面積は一般
的には直径３〜５mmである。ほとんどの複合したリガン
ドはこの有限域にある。液体試料中のリガンドの量はそ
の有限域の中心で測定された標識の量に反比例する。一
般的には、標識の測定は試料の接触及び拡散の５〜180
秒後に実施される。
知するか又は酵素標識と基質との酵素反応の結果として
形成された検知可能な種を検知するのに適した装置にそ
の要素を通すことによって測定される。例えば、その種
は一般的に公知の方法を用いて、適した放射線測定装
置、蛍光測定装置又は分光光度装置で検知することがで
きる。酵素反応においては、生成染料は、試験試料と接
触した有限域の中心で反射密度、透過密度又は蛍光を測
定することによって求められる。測定される面積は一般
的には直径３〜５mmである。ほとんどの複合したリガン
ドはこの有限域にある。液体試料中のリガンドの量はそ
の有限域の中心で測定された標識の量に反比例する。一
般的には、標識の測定は試料の接触及び拡散の５〜180
秒後に実施される。
以下の諸実施例によって本発明を更に具体的に説明す
る。
る。
本明細書及び特許請求の範囲の文脈で用いる時には、
Ｉ．Ｕ．は、酵素について標準的なpH及び温度条件下で
毎分１μモルの基質の転化を触媒するのに必要な酵素活
性量を１Ｉ．Ｕ．であるとして定義した酵素活性につい
ての国際単位である。
Ｉ．Ｕ．は、酵素について標準的なpH及び温度条件下で
毎分１μモルの基質の転化を触媒するのに必要な酵素活
性量を１Ｉ．Ｕ．であるとして定義した酵素活性につい
ての国際単位である。
実施例１ セオフィリンの測定 セオフィリン(theophylline)の測定のための、次の構成
及び成分をもつ分析要素を調製した。拡散性層は５〜20
μｍのビーズを含有している。従って、その層は多孔性
となって試料の拡散が遅くなり、そのために本発明の利
益が達成される。
及び成分をもつ分析要素を調製した。拡散性層は５〜20
μｍのビーズを含有している。従って、その層は多孔性
となって試料の拡散が遅くなり、そのために本発明の利
益が達成される。
濃度が１〜128μｇ／ｍで変化する一連の血清系セオ
フィリン標準物を調製した。各々の標準物の１０μア
リコートを、標準物の希釈が１：４０でありそしてアナ
ログの濃度が４×10−８Ｍであるように、セオフィリン
−グルコースオキシダーゼアナログ及び希釈剤（０．０
１Ｍ燐酸カリウムバッファー、pH７．０、０．１５Ｍ
ＮａＣ及び０．１％ウサギガンマグロブリンを含有す
る）と混合した。その試料の生成溶液を次いで、各々の
溶液の一滴１０μを用いてその要素の拡散性層の有限
域に点滴した。３７℃で試料の点滴の後２〜３分間のイ
ンキュベーションの後、その反射密度を、商業的に入手
できる改良型反射計で670nmでその有限域の中心で測定
した。透過密度値を求めるためにWilliams-Clapperのト
ランスフォーム(J.Optical soc.Am.,43：595,1953)を用
いた。その結果を下記の第１表に挙げる。そのデーター
から分るように、染料形成速度は被分析物の濃度に反比
例した。
フィリン標準物を調製した。各々の標準物の１０μア
リコートを、標準物の希釈が１：４０でありそしてアナ
ログの濃度が４×10−８Ｍであるように、セオフィリン
−グルコースオキシダーゼアナログ及び希釈剤（０．０
１Ｍ燐酸カリウムバッファー、pH７．０、０．１５Ｍ
ＮａＣ及び０．１％ウサギガンマグロブリンを含有す
る）と混合した。その試料の生成溶液を次いで、各々の
溶液の一滴１０μを用いてその要素の拡散性層の有限
域に点滴した。３７℃で試料の点滴の後２〜３分間のイ
ンキュベーションの後、その反射密度を、商業的に入手
できる改良型反射計で670nmでその有限域の中心で測定
した。透過密度値を求めるためにWilliams-Clapperのト
ランスフォーム(J.Optical soc.Am.,43：595,1953)を用
いた。その結果を下記の第１表に挙げる。そのデーター
から分るように、染料形成速度は被分析物の濃度に反比
例した。
実施例２及び３ フェノバルビタール及びジフェニルヒ
ダントインの測定 フェノバルビタール及びジフェニルヒダントインの定量
分析のための必要な試薬を含有している分析要素を実施
例１に従って調製した。これらの実施例における評価法
は次の点を除いて実施例１で記載した方法と同じであっ
た。即ち、フェノバルビタールの検定においては、希釈
係数は１：７５でありそしてフェノバルビタール−酵素
アナログ濃度は３×10−８Ｍであり、またジフェニルヒ
ダントイン検定においては、希釈係数は１：２５であり
そしてジフェニルヒダントイン−酵素アナログ濃度は３
×10−８Ｍであった点で異なっていた。フェノバルビタ
ールについての測定結果を下記の第２表に挙げる。ジフ
ェニルヒダントインについての測定結果を下記の第３表
に挙げる。両実施例において、染料形成速度はリガンド
濃度に反比例した。
ダントインの測定 フェノバルビタール及びジフェニルヒダントインの定量
分析のための必要な試薬を含有している分析要素を実施
例１に従って調製した。これらの実施例における評価法
は次の点を除いて実施例１で記載した方法と同じであっ
た。即ち、フェノバルビタールの検定においては、希釈
係数は１：７５でありそしてフェノバルビタール−酵素
アナログ濃度は３×10−８Ｍであり、またジフェニルヒ
ダントイン検定においては、希釈係数は１：２５であり
そしてジフェニルヒダントイン−酵素アナログ濃度は３
×10−８Ｍであった点で異なっていた。フェノバルビタ
ールについての測定結果を下記の第２表に挙げる。ジフ
ェニルヒダントインについての測定結果を下記の第３表
に挙げる。両実施例において、染料形成速度はリガンド
濃度に反比例した。
〔発明の効果〕 本発明は結合リガンド及び遊離リガンドの水平分離を得
るのに別個の洗浄工程を必要としない簡単な免疫検定法
である。本発明の検定法は高度に自動化された分析機で
用いることのできる乾式分析要素を利用する。これらの
要素においては、結合されたリガンドと遊離のリガンド
との放射状分離即ち水平分離が試料の拡散の間に生じ
る。それ故に、別個の洗浄工程は必要ではない。その測
定法は簡単で、迅速でそして好都合である。最小量の試
料の調製が必要であり、それでその測定は、試料が要素
と接触した後の３分間のように短時間で完了する。
るのに別個の洗浄工程を必要としない簡単な免疫検定法
である。本発明の検定法は高度に自動化された分析機で
用いることのできる乾式分析要素を利用する。これらの
要素においては、結合されたリガンドと遊離のリガンド
との放射状分離即ち水平分離が試料の拡散の間に生じ
る。それ故に、別個の洗浄工程は必要ではない。その測
定法は簡単で、迅速でそして好都合である。最小量の試
料の調製が必要であり、それでその測定は、試料が要素
と接触した後の３分間のように短時間で完了する。
前記した利益は液体試料を拡散性層の有限域中に遅く拡
散させることによって成就される。この遅い拡散は、有
限域内での固定リガンド−受容体複合体の形成に対し
て、並びに固定複合体からの非複合化リガンドの実質的
な水平分離に対して適切な時間を与える。
散させることによって成就される。この遅い拡散は、有
限域内での固定リガンド−受容体複合体の形成に対し
て、並びに固定複合体からの非複合化リガンドの実質的
な水平分離に対して適切な時間を与える。
上記のことが達成できる幾つかの方法がある。例えば、
その方法は、２〜20μｍの粒度をもちそして隣接粒子の
各々の表面域で相互に結合されている多数の粒子を含む
粒状構造からなる（この場合に諸隣接粒子が最近接して
凝集性の三次元格子を形成し、この格子は水性液体に本
質的に非膨潤性である）多孔質拡散性層をもつ要素で実
施することができる。
その方法は、２〜20μｍの粒度をもちそして隣接粒子の
各々の表面域で相互に結合されている多数の粒子を含む
粒状構造からなる（この場合に諸隣接粒子が最近接して
凝集性の三次元格子を形成し、この格子は水性液体に本
質的に非膨潤性である）多孔質拡散性層をもつ要素で実
施することができる。
他の実施例においては、遅い拡散及び結合リガンドと遊
離リガンドとの分離は、要素を液体試料と徐々に接触さ
せることによって達成される。このことは、リガンドと
受容体との複合化が試料の拡散の間に生じることを保証
する。その接触技術は前記に一層詳しく記載されてい
る。
離リガンドとの分離は、要素を液体試料と徐々に接触さ
せることによって達成される。このことは、リガンドと
受容体との複合化が試料の拡散の間に生じることを保証
する。その接触技術は前記に一層詳しく記載されてい
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カール ジョン サンフォード アメリカ合衆国， ニューヨーク 14612, ロチェスター， パールソン レーン 147 (72)発明者 グレン マーシャル ダッペン アメリカ合衆国， ニューヨーク 14580, ウェブスター， マジェスティック ウ ェイ 1215 (72)発明者 アレン ロイド サンバーグ アメリカ合衆国， ニューヨーク 14534, ピッツフォード， オールド ストーン フィールド ウェイ 77 (72)発明者 マイケル ウィリアム サンドバーグ アメリカ合衆国， ニューヨーク 14526, ペンフィールド， ハイリッジ ドライ ブ 77 (72)発明者 スーザン ジーン ダニエルソン アメリカ合衆国， ニューヨーク 14609, ロチェスター， アパートメント ケ ー， ラクロア コート ドライブ ９ (56)参考文献 特開 昭59−166866（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−90859（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−102388（ＪＰ，Ａ) 米国特許4517288（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】免疫学的に反応性のリガンド用の固定され
た受容体を含む拡散性層を有する乾式分析要素を用いて
免疫学的に反応性のリガンドを含むと思われる液体試料
中のリガンドを測定する方法において、 （Ａ）粒子直径が１〜200μｍで、最も近接した隣接粒
子の表面域で相互に付着することで、前記液体試料に本
質的に非膨潤性である凝集性の三次元格子を形成する複
数の粒子を含んでなる粒状構造物から構成されている多
孔質の拡散性層の有限区域内に、標識リガンドアナログ
の存在下に、分配手段で付与速度を調節しながら前記液
体試料を付与して前記拡散性層中で徐々に拡散させて、
前記有限区域内に固定リガンド−受容体複合体を形成せ
しめると共に、前記液体試料の拡散中に前記固定リガン
ド−受容体複合体と非複合化リガンドとを実質的に水平
分離せしめ、そして （Ｂ）前記液体試料付与の完了の少なくとも５秒後に、
前記有限区域の中心で前記固定リガンド−受容体複合体
を測定することを含んでなる免疫学的に反応性のリガン
ドの測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/757,111 US4670381A (en) | 1985-07-19 | 1985-07-19 | Heterogeneous immunoassay utilizing horizontal separation in an analytical element |
| US757111 | 1985-07-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6285866A JPS6285866A (ja) | 1987-04-20 |
| JPH0627737B2 true JPH0627737B2 (ja) | 1994-04-13 |
Family
ID=25046398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61168166A Expired - Lifetime JPH0627737B2 (ja) | 1985-07-19 | 1986-07-18 | 分析要素中での水平分離を利用する不均質免疫検定法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670381A (ja) |
| EP (1) | EP0209378B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0627737B2 (ja) |
| CA (1) | CA1271706A (ja) |
| DE (1) | DE3674495D1 (ja) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4806311A (en) * | 1985-08-28 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Multizone analytical element having labeled reagent concentration zone |
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