DE3231994C2

DE3231994C2 -

Info

Publication number: DE3231994C2
Application number: DE3231994A
Authority: DE
Inventors: Ei Mochida; Takashi Tokio/Tokyo Jp Kudo; Toshiyuki Urawa Saitama Jp Sugawara; Minoru Tokio/Tokyo Jp Tsumura
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-08-27
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1987-07-09
Also published as: JPS6161857B2; GB2105462A; CH662426A5; SE8307238L; SE8207486L; SE8207486D0; NL191322B; BR8204980A; US4482636A; JPS5836631A; NL191322C; GB2105462B; SE8307238D0; CA1197666A; FR2512207A1; NL8300089A; DE3231994A1; FR2512207B1; SE435999B; AR231029A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Umsetzen einer ersten immunologisch reaktiven Substanz, die an der Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefäßes gebunden ist, mit einer zweiten immunologisch zur ersten Substanz reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase. Sie betrifft auch Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens.

Immunologische Verfahren, die Antigen-Antikörper-Reaktionen anwenden, um quantitativ sehr geringe Mengen von Substanzen in Körperflüssigkeiten zu bestimmen oder für die Bestimmung der Konzentration von verabreichten Arzneimitteln im Blut oder im Urin eines Organismus sind bekannt. Verschiedene Methoden, die auf verschiedenen Bestimmungsprinzipien beruhen, sind hierfür bekannt und werden praktisch angewendet. Dazu gehört die Radio-Immunoassay (RIA), Enzym-Immunoassay (EIA) und Fluoreszenz-Immunoassay (FIA), die wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und hohen Wirksamkeit zur quantitativen Bestimmung häufig angewendet werden.

Bei der Durchführung dieser Assays wendet man hauptsächlich die sogenannte Sandwich-Methode oder die kompetitive Methode an. Insbesondere die Sandwich- Methode wird in großem Maße angewendet, weil sie einen hohen Grad an analytischer Genauigkeit ermöglicht und leicht durchzuführen ist.

Bei der Sandwich-Methode wird das zu messende Antigen mit einem insolubilisierten entsprechenden Antikörper umgesetzt (erste Reaktion), wodurch sich ein Antigen- Antikörper-Komplex bildet. Dieser Komplex wird mit einem mit einem Markierungsmittel markierten Antikörper umgesetzt, der in der Lage ist, sich mit dem zu bestimmenden Antigen zu kombinieren (markierter Antikörper) (zweite Reaktion). Dann wird der markierte Antikörper in zwei Anteile aufgeteilt; in einen, der sich mit dem Antigen-Antikörper-Komplex kombiniert, und in einen anderen, der sich nicht kombiniert hat und die Aktivität des Markierungsmittels in einem der beiden Anteile wird gemessen. Weiterhin werden gleiche Verfahren für einen Antikörper bekannter Konzentration wiederholt, um dadurch Kalibrierungskurven aufzustellen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird aus den Kalibrierungskurven erhalten. Das Markierungsmittel kann beispielsweise ein Enzym, eine radioaktive oder eine fluoreszierende Substanz sein.

Bei der kompetitiven Methode, die zuerst bei der Radio-Immunoassay angewendet wurde, führt man die Messung wie folgt durch:

Setzt man das zu bestimmende Antigen und eine gegebene Menge des markierten Antigens mit dem dem zu messenden Antigen entsprechenden insolubilisierten Antikörper um, dann kombinieren sich beide Antigene kompetitiv mit dem insolubilisierten Antikörper. Dann wird das markierte Antigen in zwei Anteile geteilt; in einen, der sich mit dem insolubilisierten Antikörper kombiniert hat, und in einen anderen, der sich nicht kombiniert hat und die Aktivität des Markierungsmittels in einem der beiden Anteile wird gemessen. Weiterhin führt man ähnliche Verfahren für ein Antigen bekannter Konzentration durch, um dadurch eine Kalibrierungskurve auszubilden. Die Menge des zu bestimmenden Antigens kann man aus der Kalibrierungskurve erhalten.

Bei der Durchführung dieser Reaktionen ist es vorteilhaft, die Innenwandoberfläche eines Gefäßes als Träger für eine reaktive Substanz, wie den zu insolubilisierenden Antikörper, zu verwenden. Häufig wird beispielsweise ein Kunststoff-Reagenzglas verwendet, weil es sowohl als Träger für die Insolubilisierung als auch als Reaktionsgefäß dient und leicht gehandhabt werden kann. Die Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefäßes ist jedoch insofern unvorteilhaft, als dessen Oberfläche, an welcher sich ein Antikörper oder eine andere reaktive Substanz fixieren kann, kleiner ist als im Falle von anderen Trägern, wie Kunststoffkugeln, Filterpapier oder Zelluloseteilchen, und sie kann deshalb nur eine geringere Menge einer reaktiven Substanz tragen. Infolgedessen verlängert sich bei den üblichen Verfahren, bei denen ein Reagenzglas oder ein anderes Reaktionsgefäß, das an seiner Innenwand eine insolubilisierte reaktive Substanz trägt, aufrecht und still gehalten oder bei dem der Inhalt absatzweise gerührt wird, die Reaktionszeit.

Aus der DE-OS 21 60 276 ist ein Verfahren und eine Einrichtung zum Messen der Koagulationszeit von Blut bekannt. Dabei wird Blut in einem unter einem Winkel zur Waagerechten sich befindlichen durchsichtigen Glas eingefüllt und das Glas wird in Drehung versetzt, wobei das Auftreten von Koagulationsvorgängen in dem Augenblick festgestellt werden kann, in dem geronnenes Blut an der Wand des Glases wahrgenommen wird. Das Reagenzglas wird in der Schräglage mit einer Geschwindigkeit zwischen 0,5 und 10 Umdrehungen je Minute und bevorzugt mit 1,5 Umdrehungen je Minute gedreht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Umsetzen einer ersten immunologisch reaktiven Substanz, die an der Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefäßes gebunden ist, mit einer zweiten immunologisch zur ersten Substanz reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase zur Verfügung zu stellen, das mit geringen Mengen an immunologisch reaktiven Substanzen auskommt und gleichzeitig eine hohe Empfindlichkeit aufweist.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst.

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Stand der Technik erhaltenen Kalibrierungskurve,

Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, die anzeigt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionszeit verkürzt werden kann,

Fig. 3 ist eine grafische Darstellung und zeigt eine Standardkurve für die AFP-Assay des Beispiels 1,

Fig. 4 ist eine grafische Darstellung und zeigt die Standardkurve für die CEA-Assay in Beispiel 2,

Fig. 5 ist eine Ansicht einer geeigneten Vorrichtung,

Fig. 6 ist eine Ansicht und zeigt das Kraftübertragungssystem für die Vorrichtung von Fig. 5,

Fig. 7 zeigt eine weitere Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, und

Fig. 8 und 9 sind teilvergrößerte Ansichten und zeigen, wie die Reaktionsgefäße in der Vorrichtung gemäß Fig. 7 angebracht sind.

In der nachfolgenden Beschreibung ist das Reaktionsgefäß ein Reagenzglas, die Substanz, die an der Innenwandoberfläche des Reagenzglases getragen wird, ein Antikörper und die Substanz in der flüssigen Phase ein Antigen. Diese Kombination wird jedoch nur zur Vereinfachung der Beschreibung angewendet und bedeutet nicht, daß die Erfindung auf eine solche Kombination beschränkt ist.

Substanzen in Körperflüssigkeiten liegen gewöhnlich in sehr geringen Mengen vor und die Körperflüssigkeiten per se sind häufig nur in geringen Volumina verfügbar. Jedes Verfahren zur Messung solcher Substanzen erfordert deshalb einen hohen Grad an analytischer Empfindlichkeit für die nur in sehr geringen Mengen verfügbaren Proben. Deshalb hat man üblicherweise den Antikörper an die Innenwandoberfläche eines Reagenzglases nur in der Nähe des Bodens fixiert, z. B. in einer Fläche, die eine Höhe von bis zu 1 cm vom Boden des Rohres einnahm.

Demgegenüber ermöglicht die vorliegende Erfindung das Fixieren eines Antikörpers auf einer größeren Fläche, einschließlich des oberen Teils des Reagenzglases, weil die Probe, selbst wenn sie auch nur in einem kleinen Volumen zur Verfügung steht, in dem Reaktionsgefäß einen guten Kontakt mit dem Antikörper erhält, wenn man das Reaktionsgefäß in geneigter Stellung, wie vorher erwähnt, rotiert. Darüber hinaus bedeutet das Drehen bzw. Rotieren des Reagenzglases auch ein Umrühren des Inhaltes und dadurch wird die Messung mit hoher Sensibilität in einer kürzeren Zeit ermöglicht.

Tabelle 1 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefäßes und der relativen Menge der zum Benetzen des den Antikörper tragenden Teils des Reaktionsgefäßes erforderlichen Probe, wenn die fixierte Fläche des Antikörpers in dem Gefäß konstant ist. Tabelle 2 zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefäßes und der Kontaktfläche zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Gefäßes, wenn die Menge der Probe konstant ist.

Tabelle 1

Tabelle 2

Es gilt die allgemeine Regel, daß zwei Reaktanten um so wirksamer umgesetzt werden können, je größer deren Kontaktfläche ist. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, nimmt das benötigte Probenvolumen zum Benetzen der konstanten Kontaktfläche mit einer Verminderung des Neigungswinkels des Reaktionsgefäßes in Richtung der horizontalen Lage ab. Infolgedessen ist es wünschenswert, das Reaktionsgefäß so nahe als möglich in die horizontale Stellung zu bringen, unter der Voraussetzung, daß die umzusetzende Flüssigkeit nicht ausfließt. Selbst wenn die Neigung des Reaktionsgefäßes schon fast horizontal ist, z. B. etwa 5° oberhalb der horizontalen Lage, besteht nicht die Gefahr, daß die Probe den Boden des Gefäßes nicht berührt, sofern das Volumen der Probe nicht außerordentlich klein ist. Obwohl keine obere Grenze hinsichtlich des Neigungswinkels des Reaktionsgefäßes besteht, soll diese Neigung doch vorzugsweise unterhalb 45° und insbesondere bei 10 bis 20° liegen, um das Probenvolumen einzusparen und die analytische Empfindlichkeit zu erhöhen.

Man rotiert das in geneigter Lage befindliche Reaktionsgefäß mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm und insbesondere 25 bis 55 Upm. Übersteigt die Rotationsgeschwindigkeit 100 Upm, dann fließt die Probe nicht mehr längs der Rohrwandung, sondern rotiert in dem Gefäß und dadurch wird der volle Kontakt der Probe mit dem Antikörper gestört. Bei einer Rotationsgeschwindigkeit von weniger als 10 Upm wird dagegen die Rührwirkung, die durch die Rotation des Gefäßes bewirkt wird, erheblich vermindert.

Das erfindungsgemäße Reaktionsverfahren hat folgende Vorteile:

(1) Durch das kontinuierliche Drehen des Reaktionsgefäßes wird ein ausreichendes Rühren der Reaktionsmischung ermöglicht und die Reaktionseffizienz verbessert und ebenso auch die Empfindlichkeit und die Genauigkeit der Assay erhöht.

(2) Um in einem Assay-System eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen, hat man bisher höhere Volumina der Proben verwendet. Bei der vorliegenden Erfindung reicht es dagegen aus, Probevolumina zu verwenden, die nur ungefähr ½ bis ¹/₁₀ der bisher verwendeten Volumina ausmachen, wie dies in Tabelle 1 gezeigt wird. Dies hat die gleiche Wirkung, als ob man bei den üblichen Verfahren mit Probenvolumina arbeitet, die 2- bis 10mal so groß wie die bisher verwendeten sind.

(3) Wenn bei den üblichen Verfahren das Volumen der Probe klein ist, wird der Gradient der Kalibrierungskurve kleiner und dadurch wird die Genauigkeit der mittels dieser Methode erzielten Messung vermindert. Erfindungsgemäß kann jedoch die Kontaktfläche zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Reaktionsgefäßes um das 1,5- bis 4fache gegenüber dem bisherigen erhöht werden, selbst wenn man nur ein kleines Probenvolumen anwendet, wie dies in Tabelle 2 gezeigt wird. Da der Antikörper an die vergrößerte Fläche gebunden werden kann, ist es möglich, ein Assay-System mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erhalten. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse eines Assays für α -Phytoprotein (AFP) unter Verwendung der gleichen Reagentien und der gleichen Probenvolumina. Die Versuche wurden bei jeder Konzentration jeweils 5mal wiederholt, und zwar sowohl mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wie auch mit dem üblichen Verfahren. Fig. 1 zeigt die Kalibrierungskurve, bezogen auf die Ergebnisse der Tabelle 3. Es ist festzuhalten, daß die erfindungsgemäß erhaltene Kalibrierungskurve einen höheren Gradienten hat als die nach dem üblichen Verfahren erhaltene und daß die erfindungsgemäße Methode eine höhere Genauigkeit ermöglicht. Diese Assays für AFP wurden in einem Reaktionsgefäß, das in einem Winkel von 10° geneigt war und mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm rotierte, erzielt.

Tabelle 3

(4) Die Reaktionszeit kann erheblich verkürzt werden. Tabelle 4 zeigt einen Vergleich der Assay-Zeiten, die zur Erzielung gleicher analytischer Empfindlichkeiten und Genauigkeiten benötigt werden, d. h. Kalibrierungskurven mit gleichen Gradienten und unter Verwendung der gleichen Reagentien bei einem Assay für AFP. Das Reaktionsgefäß war mit einem Winkel von 20° geneigt und wurde mit 40 Upm rotiert. Die so erhaltenen Standardkurven werden in Fig. 2 gezeigt. Es ist festzustellen, daß die Verminderung der Assay-Zeit so groß war, daß die Reaktion, die bei der biherigen Methode bisher insgesamt 12 Stunden benötigte, beim erfindungsgemäßen Verfahren in 1 Stunde durchgeführt werden konnte. Dagegen ergibt eine verkürzte Reaktionszeit bei einer üblichen Standardmethode eine Standardkurve mit einem sehr kleinen Gradienten, wie in C in Fig. 2 gezeigt wird, und wobei sich dann ein Assay nicht durchführen läßt.

Tabelle 4

Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reaktionsgefäß kann beispielsweise ein Reagenzglas, eine optische Zelle oder eine Probenküvette sein, in welcher eine immunologisch reaktive Substanz an der Innenwandung fixiert ist und mit einer geringen Menge der darin befindlichen zweiten immunologisch zur ersten Substanz reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase umgesetzt wird. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäß ein kreisförmiger oder ein mit einem polygonalen Boden versehener Zylinder aus Glas oder Kunststoff mit einem Innendurchmesser von 25 mm. Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise angewendet werden (a) zum Umsetzen eines an der Innenwandung des Reaktionsgefäßes fixierten Antikörpers mit einem Antigen in einer flüssigen Phase, und zwar beispielsweise auch im Falle einer EIA mittels der Sandwich-Methode, (b) zum Umsetzen eines markierten Antikörpers mit dem Antikörper-Antigen-Komplex, der durch die in (a) erfolgte Reaktion gebildet wurde, unter Ausbildung eines Komplexes aus dem zu bestimmenden insolubilisierten Antikörper-Antigen und dem markierten Antikörper oder (c) zum Umsetzen eines Enzymsubstrats mit dem Komplex gemäß (b), unter Durchführung einer Enzymreaktion. Im Falle einer kompetitiven Reaktion kann man das erfindungsgemäße Verfahren verwenden, wenn man das zu messende Antigen und das markierte Antigen mit dem insolubilisierten Antikörper umsetzte. Selbstverständlich gibt es zahlreiche weitere Verwendungen für das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung, die für den Fachmann offensichtlich sind.

Um das Reaktionsgefäß zur Durchführung der Erfindung so zu neigen und zu rotieren, kann man alle Mittel und Vorrichtungen verwenden, solange diese das Gefäß im vorgeschriebenen Winkel halten und mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit rotieren. Für diesen Zweck ist es aber vorteilhaft, eine speziell entwickelte Vorrichtung zu verwenden, mittels der man das Verfahren einfach und gut durchführen kann.

Die Vorrichtung zum Rotieren eines Reaktionsgefäßes in einer geneigten Stellung umfaßt eine oder mehrere laterale Reihen von in gleichmäßigem Abstand befindlichen Haltern, die von der Außenoberfläche eines Rahmens herausragen, Mittel zum Rotieren des Halters in der gleichen Richtung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit, und Mittel, um den Rahmen in eine solche Position zu bringen, daß die Halter mit einem vorbestimmten Winkel zur horizontalen Lage nach oben geneigt sind.

Die Vorrichtung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher beschrieben. Fig. 5 zeigt eine Ausführungsform einer geeigneten Vorrichtung. In gleichem Abstand befindliche längliche Halter 1 ragen aus einer Außenoberfläche eines Rahmens 2 und tragen die darauf befindlichen Reaktionsgefäße A. Die Halter 1 rotieren in der gleichen Richtung mittels eines Motors 3 durch ein Kraftübertragungssystem, das anschließend unter Bezugnahme auf Fig. 6 erläutert wird. Die Rotationsgeschwindigkeit des Halters kann in einem Bereich von 10 bis 100 Upm mittels der Einstellvorrichtung 7 gewählt werden. Der Rahmen 2 wird mittels einer Schraube 5 an einer stationären Basis 4 so befestigt, daß die Halter 1, die von dessen Außenoberfläche herausragen, nach oben in einem Winkel zwischen 0 und 90° zur horizontalen Lage geneigt sind. Über die Halter 1 kann man Hüllen mit einem gewünschten Durchmesser ziehen, um die Entfernung zwischen zwei benachbarten Haltern 1 so einzustellen, daß die Halter 1 in der Lage sind, Reaktionsgefäße mit dem gewünschten Durchmesser darauf zu rotieren.

Fig. 6 zeigt die Vorrichtung gemäß Fig. 5 von der Rückseite der Halter 1 und zeigt das Kraftübertragungssystem dafür. Die Drehung des Motors 3 wird durch einen Geschwindigkeitsverminderer 6 auf ein vorbestimmtes Niveau vermindert und mittels eines Kegelrades 8 auf eines der Zahnräder 9, die zu den Haltern 1 koaxial ausgerichtet sind, übertragen. Die Rotation des koaxialen Zahnrades 9 wird auf die anliegenden koaxialen Zahnräder 9 von einem zu dem anderen durch Zwischenzahnräder 10, die die Rotationsrichtung regulieren, übertragen, so daß alle Halter 1 in der gleichen Richtung rotieren. Falls ein großer vertikaler Abstand zwischen zwei anliegenden Reihen der Halter 1 benötigt wird, ist es erforderlich, die Entfernung zwischen den Reihen der Zwischenzahnräder 10 auf der Rückseite des Rahmens 2 zu vergrößern und eine Kette zwischen einem der Zwischenzahnräder in einer Reihe und einem der Zwischenzahnräder in einer anderen Reihe vorzusehen.

Die Erfindung kann man auch in einer anderen Vorrichtung durchführen, die eine Fördervorrichtung, wie ein Förderband, hat und auf dessen Förderoberfläche frei rotierbare Rollen montiert sind, bei der Mittel zum Antreiben der Fördervorrichtung in eine Richtung mit einer vorbeschriebenen Geschwindigkeit vorgesehen sind, ein bewegtes Band vorgesehen ist, um die Reaktionsgefäße in einer vorbestimmten Richtung mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit zu rotieren, während sie die auf den Rollen montierten Reaktionsgefäße berühren, und Mittel zum Halten der Reaktionsgefäße in einer geneigten Position in einem vorbestimmten Winkel gegenüber der Horizontalen, wobei die Öffnungen der Reaktionsgefäße angehoben sind.

Diese Vorrichtung wird näher unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. Fig. 7 zeigt eine zur Durchführung der Erfindung geeignete Vorrichtung B und Fig. 8 und 9 sind teilvergrößerte Ansichten, in welchen die Art, in welcher die Reaktionsgefäße in der Vorrichtung gemäß Fig. 7 gehalten werden, gezeigt wird. Eine Förderkette 101 hat eine Förderoberfläche, auf welcher frei rotierende Rollen 117 montiert sind. Reaktionsgefäße A werden von diesen Rollen 117 getragen. Die Kette 101 wird mittels eines Motors 106 über einen Geschwindigkeitsverminderer 105, Zahnräder 104 und Wellen 103 sowie Kettenzahnräder 102 angetrieben, wodurch das Reaktionsgefäß allmählich in eine Richtung gedreht wird. Die Zeit für die Bewegung der Rollen in eine Richtung zu einer angrenzenden Rollenposition kann im gewünschten Maße mittels der Kontrollvorrichtung 107 gewählt werden und beträgt vorzugsweise 0,5 bis 5 Minuten.

Die Reaktionsgefäße werden mittels des Gurtes 109, der gegen die Gefäße mittels der Anpreßrollen 108 gedrückt wird, rotiert. Der Gurt 109 wird mittels eines Motors 114 über einen Geschwindigkeitsverminderer 113, Zahnräder 112, Wellen 111 und Riemenscheiben 110 angetrieben. Die Geschwindigkeit des Gurtes kann mittels einer Kontrollvorrichtung 115 so eingestellt werden, daß die Reaktionsgefäße mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm rotieren.

Die Vorrichtung wird beispielsweise auf einer Trägerplatte 116 so montiert, daß die Reaktionsgefäße ihre Achse in einem Winkel zwischen 0 und 90° zur Horizontalen, wobei die Öffnungen angehoben sind, zu liegen kommen.

Die Vorrichtung kann verwendet werden, um die Reaktionsgefäße eines nach dem anderen automatisch zu befördern, während sie sich kontinuierlich drehen und deren Inhalt kontinuierlich gerührt wird. Infolgedessen ist es beispielsweise möglich, eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen, von denen jedes eine Flüssigprobe enthält, eines nach dem anderen auf dem Förderband an einer Ausgangsstellung aufzulegen, die Reaktion in dem Reaktionsgefäß durchzuführen, während dieses rotiert und automatisch weiterbewegt wird, und dann die Ergebnisse der Reaktion an einer vorbestimmten Position automatisch, beispielsweise mittels eines Spektrofotometers, zu untersuchen. Deshalb ist die erfindungsgemäße Vorrichtung besonders für die Automatisierung eines Assay- Systems geeignet.

Beispiel 1 Assay für AFP (a) Zubereitung des Reaktionsreagenzglases

2 ml eines monoklonalen Anti-AFP-Antikörpers (A) (1mg/ml) wurden in jeweils ein Polystyrol-Reagenzglas mit einem Durchmesser von 12 mm und einer Höhe von 100 mm gegeben und die Inkubierung wurde 20 Minuten bei 50°C durchgeführt. Dann wurde jedes Reagenzglas mit einer 0,05M Phosphat-Puffersalzlösung (PBS) mit dem pH-Wert 6,4 gewaschen, wodurch man ein mit dem Antikörper (A) sensibilisiertes Reagenzglas erhielt. Ein anderer monoklonaler Antikörper (B) mit einem von (A) unterschiedlichen Klon wurde mit Meerrettichperoxidase markiert, wobei die Methode von Nakane et al, beschrieben in J. Histochem. Cytochem., 22, 1084 (1974), angewendet wurde. Der Antikörper wurde mit PBS 49 : 1 verdünnt und 1 ml des verdünnten Antikörpers wurde in jedes Polystyrol-Reagenzglas, das mit dem Antikörper (A) sensibilisiert war, gegeben. Nachdem die Reagenzgläser lyophilisiert worden waren, wurden sie dicht verschlossen und lagen nunmehr als Reagenzgläser für die AFP-Assay vor.

(b) Assay für AFP

Die gemäß (a) bereiteten Reagenzgläser für die AFP- Assay wurden mit 0,9 ml PBS gefüllt. In jedes Reagenzglas wurden 0,1 ml einer Standard-AFP-Lösung eingefüllt, die erhalten worden war, indem man AFP mit normalem Humanserum verdünnte, so daß sie 1, 10, 100 oder 1000 ng AFP pro ml enthielten. Die Reagenzgläser wurden auf die Halter in der Vorrichtung gemäß Fig. 5 gelegt und waren zur Horizontalen in einem Winkel von 20° geneigt. Die Reaktion wurde 30 Minuten durchgeführt, während die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotierten. Nach der Umsetzung wurden die Reagenzgläser mit einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 0,005% Tween® 20 (nachfolgend als Waschmittel bezeichnet) gewaschen. In jedes Reagenzglas wurden dann 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 50 mg/dl 5-Aminosalicylsäure und 0,01% Wasserstoffperoxid, gegeben. Die Reagenzgläser wurden wiederum auf die Halter mit einer Neigung nach oben in einem Winkel von 20° zur Horizontalen gelegt und die Umsetzung wurde 30 Minuten durchgeführt, während welcher die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotierten.

Zur Beendigung der Umsetzung wurden 50 µl 2% Natriumazid zugegeben. Die Absorption der Reaktionsmischung wurde bei einer Wellenlänge von 500 nm spektrofotometrisch bestimmt. Die erhaltene Kalibrierungskurve wird in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 2 Assay für CEA (a) Zubereitung der Reaktions-Reagenzgläser

In jedes Polystyrol-Reagenzglas (Durchmesser 8 mm, Höhe 100 mm) wurden 2 ml monoklonaler Anti-karzinoembryotisches- Antigen (CEA)-Antikörper (A′) (1 mg/ml) gegeben und 20 Minuten bei 56°C inkubiert. Dann wurde das Reagenzglas mit PBS gewaschen, wobei man mit dem CEA-Antikörper (A′) sensibilisierte Reagenzgläser erhielt.

Ein anderer monoklonaler Antikörper (B′) mit einem vom Antikörper (A′) unterschiedlichen Klon wurde nach dem in (a) in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit HRPO markiert. Der Antikörper wurde mit PBS auf das 50fache Volumen verdünnt und 1 ml des verdünnten Antikörpers wurde in jeweils 1 Reagenzglas, das mit dem CEA-Antikörper (A′) sensibilisiert war, gegeben. Nach dem Lyophilisieren der Reagenzgläser wurden diese dicht verschlossen, unter Erhalt von Reagenzgläsern für die CEA-Assay.

(b) Assay für CEA

Die gemäß (a) zubereiteten Reagenzgläser wurden jeweils mit 0,9 ml PBS und 0,1 ml einer Standard-CEA- Lösung, hergestellt durch Verdünnen von CEA mit normalem Humanserum, so daß sie 1, 3, 10, 30 oder 100 ng CEA pro ml enthielten, gefüllt. Die Reagenzgläser wurden auf ein Förderband gemäß Fig. 7 gelegt, wobei sie in einem Winkel von 10° zur Horizontalen aufwärts geneigt waren. Die Umsetzung wurde 20 Minuten durchgeführt und während dieser Zeit rotierten die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm. Dann wurde jedes Reagenzglas mit dem Waschmittel gewaschen und mit 2 ml einer Enzymsubstratlösung, enthaltend 100 mg/dl o-Phenylendiamin und eine 0,3%ige wäßrige Lösung von Wasserstoffperoxid, gefüllt. Die Reagenzgläser wurden wiederum auf das Förderband mit einer Neigung nach oben von 10° zur Horizontalen gelegt. Die Umsetzung wurde 20 Minuten durchgeführt, während welcher die Reagenzgläser mit einer Geschwindigkeit von 30 Upm rotierten. Dann wurden 0,5 ml 4N Salzsäure zur Beendigung der Umsetzung zugegeben. Die Absorption der Reaktionsprodukte wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm spektrofotometrisch bestimmt. Die erhaltene Kalibrierungskurve wird in Fig. 4 gezeigt.

Claims

1. Verfahren zum Umsetzen einer ersten immunologisch reaktiven Substanz, die an der Innenwandoberfläche eines Reaktionsgefäßes gebunden ist, mit einer zweiten immunologisch zur ersten Substanz reaktiven Substanz in einer flüssigen Phase, bei dem man eine Flüssigkeit, enthaltend die zweite immunologisch reaktive Substanz, in das Reaktionsgefäß, welches die erste reaktive Substanz an der Innenwandoberfläche gebunden enthält, eingibt, dadurch gekennzeichnet daß man mit einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm rotiert, während es in einem Winkel zwischen 5 und 45° zur Horizontalen geneigt ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß in einem Winkel zwischen 10 und 20° zur Horizontalen geneigt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rotationsgeschwindigkeit zwischen 25 und 55 Upm liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß ein mit einem kreisförmigen oder polygonalen Boden versehener Zylinder ist und aus Glas oder Kunststoff besteht und einen Innendurchmesser von 5 bis 20 mm hat.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Fördervorrichtung (101) mit einer Förderoberfläche, auf welcher frei rotierbare Rollen (117) montiert sind, Mittel (102, 103, 104, 105, 106) zum Antreiben der Fördervorrichtung in einer Richtung mit einer Geschwindigkeit in einem vorgeschriebenen Bereich, einem Gurt (109), der mit den auf den Rollen (117) befindlichen Reaktionsgefäßen in Kontakt ist und sich so bewegt, daß das Reaktionsgefäß sich in einer vorbestimmten Geschwindigkeit in einer vorbestimmten Richtung bewegt und Mittel (116), um das Reaktionsgefäß in einer aufwärts geneigten Richtung in einem vorbestimmten Winkel zur Horizontalen zu halten.