DE19900119A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Diagnose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen, bei dem auf einem Träger ein Bindungsprotein aufgebracht wird, auf dem Antikörper eines zu untersuchenden Patienten durch Ankoppeln an das Bindungsprotein immobilisiert und anschließend einer Antigen-Lösung ausgesetzt werden, die für den Patienten allergieauslösende Antigene enthält, wobei der Träger als reflektierender fester Träger ausgebildet ist, auf dem das Bindungsprotein in einer monomolekularen, oberflächenaktiven Schicht aufgebracht wird, und wobei nach einer Inkubationszeit ein durch Immunreaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen verursachter Schichtdickenzuwachs der Protein-Antikörper-Schicht ellipsometrisch festgestellt wird. DOLLAR A Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen, wobei eine Sensorbasis aus einem reflektierenden, festen Träger ausgebildet ist, auf dem matrixförmig in Inseln eine monomolekulare Schicht aus einem oberflächenaktiven Bindungsprotein aufgebracht ist, an das patientenspezifische Antikörper anbindbar sind, die mit in einer Lösung enthaltenen Antigenen reagieren können.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose allergi­ sche Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen, bei dem auf einem Träger ein Bindungsprotein aufgebracht wird, auf dem Antikörper eines zu untersuchenden Patienten durch Ankoppeln an das Bindungsprotein immobilisiert und anschließend einer Antigen-Lösung ausgesetzt werden, die allergieauslösende Antigene enthält.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Dia­ gnose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Im­ munreaktionen.

Aus der EP 0 629 857 A2 ist ein Verfahren zur immunchemi­ schen Bestimmung von Antigenen bekannt. Bei diesem Verfah­ ren wird auf die Oberfläche eines Trägers ein Bindungspro­ tein aufgebracht, auf dem primäre Antikörper immobilisiert sind. Zu bestimmende Antigene werden an die primären Anti­ körper gebunden und so ebenfalls immobilisiert. Die Antige­ ne werden über Bestimmung eine Immunreaktion mit markierten sekundären Antikörpern bestimmt.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist, daß neben den primären Antikörpern markierte sekundäre Antikörper notwendig sind. Die Antigene, welche im vorhergehenden Verfahrensschritt mit den immobilisierten spezifischen Antikörpern einen Kom­ plex eingegangen sind, können in den darauffolgenden Inku­ bationsschritten in einer Rückreaktion sich zum Teil wieder aus dem Komplex lösen und so der Nachweisreaktion entzie­ hen, wodurch u. a. die Sensitivität stark eingeschränkt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Ver­ fahren zu finden, bei dem auf markierte sekundäre Antikör­ per verzichtet werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, daß der Träger als reflektierender fester Träger ausgebildet ist, auf dem das Bindungsprotein in einer monomolekularen, oberflächen­ aktiven Schicht aufgebracht wird, und daß nach einer Inku­ bationszeit ein durch Immunreaktion zwischen dem Antikörper und dem Antigen verursachter Schichtdickenzuwachs der Pro­ tein-Antikörper-Schicht durch ein ellipsometrisches Meßver­ fahren festgestellt wird.

Durch die Verwendung eines reflektierenden festen Trägers ist es möglich, den durch die Immunreaktion verursachten Schichtdickenzuwachs der Protein-Antikörper-Schicht ellip­ sometrisch - also optisch und somit zerstörungsfrei - fest­ zustellen. Durch die ellipsometrische Messung kann gänzlich auf sekundäre Antikörper verzichtet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Bindungsprotein Protein A vermittels der bekannten Langmuir-Blodgett-Technik aufgebracht. Es ist aber auch möglich, als Bindungsprotein beispielsweise Protein G oder andere geeignete Proteine zu verwenden und vermittels glei­ cher Technik aufzubringen.

Durch die Verwendung der Langmuir-Blodgett-Technik ist es möglich, das Bindungsprotein in einer gewünschten monomole­ kularen oberflächenaktiven Schicht aufzubringen. Die mono­ molekulare Schicht gewährleistet, daß minimale Substanzen eingesetzt und nachgewiesen werden können.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird als Träger ein Siliziumplättchen verwendet.

Durch die Verwendung von Silizium als Trägermaterial kann zur ellipsometrischen Bestimmung der Schichtdecke wegen des hohen Brechungsindexes von Silizium eine entsprechend hohe Auflösung erreicht werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird vor Aufbringen des Bindungsproteins der Träger mindestens teilweise mit einer gitterförmigen Abdeckung versehen. Nach Aufbringen des Broteins in voneinander durch das Abdeckgitter getrennten Inseln wird das Abdeckgitter entfernt.

Durch die Verwendung des Abdeckgitters wird auf einfache Weise eine definierte Struktur von Bindungsprotein-Inseln erreicht. Auf den Bindungsprotein- bzw. Protein-A-Inseln können dann die für die Examinierung bzw. Diagnose notwen­ digen spezifischen Antikörper immobilisiert werden.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Immunglobulin-Antikörper verwendet. So wird beispielsweise das im Immunsystem am häufigsten vorkommende Immunglobulin G (IgG) verwendet. Es ist aber beispielsweise auch möglich, Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) zu verwenden. Der Antikör­ per (IgG) besteht - ähnlich einem "Y" - aus drei Bereichen. Die Fab-Regionen, den Armen entsprechend, sind für die im­ munspezifische Reaktionsfähigkeit verantwortlich, während das Fc-Fragment, das Fußende, unspezifisch reagiert. Über das Fc-Fragment ist das IgG an das Bindungsprotein, bei­ spielsweise Protein A, gekoppelt.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung, werden aus Patientenserum separierte isotypische An­ tikörper verwendet. Grundsätzlich können isotypische Anti­ körper jedoch auch aus Blut, Urin oder anderen Körperflüs­ sigkeiten separiert werden.

Die separierten Antikörper werden durch eine Mikropipettie­ rung auf das in separaten Inseln angeordnete Bindungspro­ tein aufgebracht. So können die Inseln des Bindungsproteins einfach durch eine serielle Mikropipettierung oder auch durch eine der Inselmatrix entsprechende rastersynchrone komplette Mikropipettierung bestückt werden.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der Protein-Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln der Träger auf einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch eines Ellipsometers softwaregesteuert durch den Laserstrahl des Ellipsometers gescannt. Das Ergebnis des Scannvorganges wird dann mit Hilfe einer Auswertungssoftware ausgewertet.

Durch die softwaregesteuerte ellipsometrische Messung des Schichtdickenzuwachses kann die ellipsometrische Schicht­ dickenbestimmung zeitsparend weitgehend automatisch und fehlerfrei durchgeführt werden.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird zu einer quantitativen Diagnose ein Massensepara­ tor eingesetzt, der die Substanz der Inseln, auf denen eine Immunreaktion stattgefunden hat, in ihre atomaren Bestand­ teile zerlegt. Die erzielten separierten elementaren Frak­ tionen werden um die bekannten Protein- und Antikörperan­ teile reduziert, so daß die Restsubstanz einen gesuchten, allergieauslösenden Faktor ergibt. Der allergieauslösende Faktor wird mit in einer Allergen-Datenbank gespeicherten Daten verglichen und ausgewertet.

Mit Hilfe eines in das Verfahren integrierten Bearbeitungs­ programmes kann das Separatorergebnis mit Hilfe der Aller­ gen-Datenbank - einer Softwarebibliothek - rekonstruiert und durch Vergleiche und Einschränkungen identifiziert wer­ den. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren quantitativ wesentlich exakter als das vorbekannte Verfahren.

Darüber hinaus läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren zu einem allgemein einsetzbaren Verfahren erweitern.

Die aus der EP 629 857 A 2 bekannte Vorrichtung weist die beschriebenen Nachteile auf und ist nicht für eine optische Messung in einem Ellipsometer geeignet.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen zu schaffen, die ohne markierte sekundäre Antikörper auskommt und für eine zer­ störungsfreie optische Messung geeignet ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem Oberbegriff des Anspruches 23 dadurch gelöst, daß eine Sensorbasis aus ei­ nem reflektierenden festen Träger ausgebildet ist, auf dem matrixförmig in Inseln eine monomolekulare Schicht aus ei­ nem oberflächenaktiven Bindungsprotein aufgebracht ist, an das patientenspezifische Antikörper anbindbar sind, die mit in einer Lösung enthaltenen Antigenen reagieren können, und daß die Immunreaktionen in einem Ellipsometer meßbar sind.

Dadurch, daß die Sensorbasis aus einem reflektierenden Trä­ ger ausgebildet ist, auf den Inseln eines oberflächenakti­ ven Bindungsproteins, an das patientenspezifische Antikör­ per, die mit in einer Lösung enthaltenen Antigenen reagie­ ren können, anbindbar sind, ist es möglich, die Vorrichtung bzw. den Träger in einem Ellipsometer auszuwerten, so daß die Immunreaktionen in einem Ellipsometer meßbar sind.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der reflektierende Träger aus Silizium ausgebildet.

Durch die Verwendung von Silizium wird zur ellipsometri­ schen Bestimmung der Schichtdicke wegen des hohen Bre­ chungsindexes von Silizium eine hohe Auflösung erreicht.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung wird Protein A (PrA) als Bindungsprotein verwendet. Als Antikörper werden Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) des zu untersuchenden Patienten verwendet. Durch den Fc- Rezeptor des Proteins A wird das IgG mit seiner Fc-Region an das Protein A gebunden.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefüg­ ten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielsweise veranschaulicht sind.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 Eine schematische Draufsicht auf einen Träger in vergrößerter Darstellung,

Fig. 2 eine Draufsicht auf den Träger von Fig. 1 mit einer schematischen Darstellung einer in einer Reihe angeordneten Mikropipetten,

Fig. 3 eine nichtmaßstäbliche prinzipielle Darstellung einer Seitenansicht eines Trägers,

Fig. 4 eine schematische Seitenansicht eines in eine Wanne eingelegten Trägers und

Fig. 5 ein vereinfachtes Fließbild eines Verfahrens zum Nachweis von Antigen.

Eine Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome besteht im wesentlichen aus einer Sensorbasis 1, an die patienten­ spezifische Allergene 2 anbindbar sind.

Die Sensorbasis 1 besteht im wesentlichen aus einem Träger 3, einem Bindungsprotein 4 und aus patientenspezifischen Antikörpern 5.

Der Träger 3 ist als ein rechteckiges Siliziumplättchen ausgebildet, auf dem mit Hilfe der Langmuir-Blodgett- Technik (Beschichtung von monomolekularen Filmen oberflä­ chenaktiver Stoffe durch ein spezielles Tauchverfahren) ei­ ne monomolekulare Schicht eines Bindungsproteins 4 angeord­ net ist. Als Bindungsprotein 4 wird Protein A (PrA) verwen­ det. Es ist beispielsweise aber auch möglich, Protein G als Bindungsprotein zu verwenden. Das Bindungsprotein 4 ist ma­ trixförmig in Inseln 8 auf dem Si-Plättchen angeordnet. Da­ bei weist der Träger 3 einen freigelassenen Rand 6 auf. Der freigelassene Rand 6 dient einerseits als Angriffsfläche für Halterungen und andererseits gegebenenfalls als Refe­ renzfläche für die Brechungsindexermittlung des Trägers 3. Die Inseln 8 sind mit patientenspezifischen Antikörpern 5 bestückt. Unterschiedliche Inseln 8 weisen dabei Antikörper 5 von jeweils unterschiedlicher Spezifität auf. Als Anti­ körper 5 werden aus Patientenserum separierte, isotypische Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) verwendet. Es ist aber beispielsweise auch möglich, Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) zu verwenden.

Auf den Träger 3 bzw. das Si-Plättchen wird ein Abdeckgit­ ter 9 aus einem wachsartigen Material aufgebracht. Mit Hil­ fe der Langmuir-Blodgett-Technik werden durch Tauchen die von dem Abdeckgitter 9 freigelassenen Zwischenräume monomo­ lekular mit Protein A beschichtet, so daß durch das Abdeck­ gitter 9 voneinander getrennte Inseln 8 aus PrA entstehen. Die aus Patientenserum separierten Antikörper (IgG) 5 wer­ den mit Hilfe von in einer Reihe angeordneten Mikropipetten 10 auf die Inseln 8 aufgebracht. Die Sensorbasis 1 wird je­ weils mit der Anzahl einer Rastersequenz (entspricht einer Reihe im Trägerraster, beispielsweise vier Inseln 8)an Mi­ kropipetten 10 bestückt, wobei die Mikropipetten 10 sequen­ tiell über die Sensorbasis 1 bzw. den Träger 3 gezogen wer­ den, während der Träger 3 jeweils eine Matrixbreite 7 wei­ tergeschoben wird. Bei beispielsweise vier in einer Reihe angeordneten Inseln 8 entspricht die Matrixbreite 7 der vierfachen Inselbreite 11.

Nach einer anderen Ausführungsform wird ein dem Trägerra­ ster entsprechendes Mikropipettierraster hergestellt, was beispielsweise durch Mikroätzung von Si-Plättchen entspre­ chender Dicke unter Ausnutzung seiner Kristallstruktur mög­ lich ist. Mit Hilfe des Mikropipettierrasters wird eine ra­ stersynchrone Komplettbestückung ermöglicht.

Nach einer gewissen Einwirkzeit, die den Antikörpern 5 die Anbindung an die (PrA-) Inseln 8 ermöglicht, werden die In­ seln 8 durch eine Spülung von überschüssigen Antikörpern befreit. Anschließend wird das Abdeckgitter 9 von dem Trä­ ger entfernt.

Zur Diagnose allergischer Symptome wird die nunmehr als Biosensor wirkende Sensorbasis 1 in einer Wanne 12 einer Antigen- bzw. Allergen-Lösung 13 mit patientenspezifischen Antigenen bzw. Allergenen 2 ausgesetzt. Der bei Anbindung (Immunreaktion) der Antigene bzw. Allergene 2 an die Anti­ körper 5 zu erwartende Schichtdickenzuwachs wird dann mit einem nicht dargestellten Ellipsometer nachgewiesen. Hierzu wird zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der Protein- Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln 8 der Träger 3 auf einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch des Ellipsometers software­ gesteuert durch den Laserstrahl des Ellipsometers gescannt. Das Ergebnis des Scannvorganges wird dann mit Hilfe einer Auswertungssoftware ausgewertet.

Mit Hilfe eines nicht dargestellten Massenseparators wird die Substanz der Inseln 8, auf denen eine Immunreaktion stattgefunden hat, in ihre atomaren Bestandteile zerlegt. Die erzielten, separierten elementaren Fraktionen werden um die bekannten Bindungsprotein- und Antikörperanteile redu­ ziert. Die Restsubstanz ist der gesuchte allergieauslösende Faktor, der in einer Allergen-Datenbank bzw. Software- Bibliothek ausgewertet wird. Diese Allergen-Datenbank ist eine Sammlung aller bekannten Allergene mit der Verteilung ihrer elementaren Bestandteile, ihrer biochemischen Struk­ tur sowie molekularen Strukturelementen und aller für die Auswertung notwendigen Bedingungen. Weiterhin wird mit ei­ nem integrierten Bearbeitungsprogramm das Separatorergebnis mit Hilfe der Allergen-Datenbank rekonstruiert und durch Vergleiche und Einschränkungen identifiziert.

Claims (29)

1. Verfahren zur Diagnose allergischer Symptome durch Nach­ weis von in vitro Immunreaktionen, bei dem auf einem Träger ein Bindungsprotein aufgebracht wird auf dem Antikörper eines zu untersuchenden Patienten durch Ankoppeln an das Bindungsprotein immobilisiert und anschließend einer Antigen-Lösung ausgesetzt werden, die allergieauslösende Antigene enthält, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Träger (3) als reflektierender, fester Träger ausgebildet ist, auf dem das Bindungsprotein (4) in ei­ ner monomolekularen, oberflächenaktiven Schicht aufgebracht wird, und daß nach einer Inkubationszeit ein durch Immunreakti­ on zwischen dem Antikörper (5) und dem Antigen (2) verursachter Schichtdickenzuwachs der Protein-Antikörper-Schicht durch ein ellipsometrisches Meßverfahren festgestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protein A als Bindungsprotein (9) aufgebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Protein G als Bindungsprotein (4) aufgebracht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Bindungsprotein (4) vermittels der Lang­ muir-Blodgett-Technik aufgebracht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als Träger (3) ein Silizium-Plättchen verwen­ det wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß vor Aufbringen des Bindungsproteins (4) der Träger (3) mindestens teilweise mit einem Abdeckgitter (9) ver­ sehen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach Aufbringen des Bindungsproteins (4) in voneinander durch das Abdeckgitter (9) getrennten Inseln (8), das Abdeckgitter (9) entfernt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Abdeckgitter (9) aus einem wachsartigen Material herge­ stellt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als patientenspezifische Antikörper (5) Im­ munglobulin-Antikörper verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Im­ munglobulin-G-Antikörper (IgG) verwendet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Im­ munglobulin-E-Antikörper (IgE) verwendet werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als patientenspezifische Antikörper (5) aus Patientenserum separierte, isotypische Antikörper verwendet werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die separierten Antikörper durch Mikropipettierung auf das in separaten Inseln (8) angeordnete oberflächenaktive Bindungspro­ tein (4) aufgebracht werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß nach erfolgter Anbindung der Antikörper (5) an das Bindungspro­ tein (4) die Inseln (8) durch Spülung von überschüssigen Anti­ körpern befreit werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Schichtdickenzuwachses der Protein- Antikörper-Schicht der einzelnen Inseln (8) der Träger (3) auf einem Zwei-Koordinaten-Meßtisch eines Ellipsometers softwaregesteuert durch einen Laserstrahl des Ellipsometers gescannt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Ergebnis des Scannvorganges mit Hilfe einer Auswer­ tungssoftware ausgewertet wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß zu einer quantitativen Diagnose ein Massenseparator eingesetzt wird, der die Substanz der In­ seln (8), auf denen eine Immunreaktion stattgefunden hat, in ihre atomaren Bestandteile zerlegt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die erzielten separierten elementaren Fraktionen um die bekannten Protein- und Antikörperanteile reduziert werden, so daß die Restsubstanz einen gesuchten allergieauslösenden Faktor ergibt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß der allergieauslösende Faktor mit in einer Allergen- Datenbank gespeicherten Daten verglichen und ausgewertet wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Allergen-Datenbank eine Sammlung bekannter Allerge­ ne mit der Verteilung ihrer elementaren Bestandteile ent­ hält.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Allergen-Datenbank die biochemische Struktur sowie molekulare Strukturelemente der Allergene enthält.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Restsubstanz mit Hilfe der Aller­ gen-Datenbank rekonstruiert und durch Vergleiche und Ein­ schränkungen identifiziert wird.

23. Vorrichtung zur Diagnose allergischer Symptome durch Nachweis von in vitro Immunreaktionen, dadurch gekennzeich­ net, daß eine Sensorbasis (1) aus einem reflektierenden, festen Träger (3) ausgebildet ist, auf dem matrixförmig in Inseln (8) eine monomolekulare Schicht aus einem oberflä­ chenaktiven Bindungsprotein (4) aufgebracht ist, an das pa­ tientenspezifische Antikörper (5) anbindbar sind, die mit in einer Antigen-Lösung (13) enthaltenen Antigenen (2) rea­ gieren können.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der reflektierende Träger (3) aus Silizium ausgebildet ist.

25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Bindungsprotein (4) aus Protein A (PrA) besteht.

26. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Bindungsprotein aus Protein G (PrG) be­ steht.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 26, da­ durch gekennzeichnet, daß die Antikörper (5) Immunglobulin- Antikörper sind.

28. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper (5) Immunglobulin-G-Antikörper (IgG) des zu untersuchenden Patienten sind.

29. Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper (5) Immunglobulin-E-Antikörper (IgE) des zu untersuchenden Patienten sind.