KR20160094507A - 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트 및 이를 통한 결핵진단방법 - Google Patents

간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트 및 이를 통한 결핵진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁; 및 상기 AHC 항체와 Fc 절편을 통해 특이적으로 결합하는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체;를 포함하며, 상기 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 CFP-10 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트를 제공한다.
따라서 결핵 환자의 체내에서 분비되는 단백질 중 특정한 단백질인 10kDa 배양여과단백질(CFP-10) 항원을 소량의 임상 샘플에서도 별 다른 전처리 없이 고효율로 정확하게 검출하여 결핵을 조기에 진단할 수 있다.

Description

간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트 및 이를 통한 결핵진단방법{Tuberculosis diagnosis kit using interferometric optical fiber array and diagnostic method using the same}
본 발명은 결핵을 진단할 수 있는 진단키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 결핵 환자의 체내에서 분비되는 특정 단백질을 검출하여 결핵을 임상 진단할 수 있는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트 및 이를 이용한 결핵진단방법에 관한 것이다.
Mycobacterium tuberculosis(이하 'MTB')에 의해 발병하는 결핵은 높은 사망률과 치사율을 일으키는 전세계적 보건 문제이다. 2012년 기준 8,600,000 건의 새로운 결핵환자가 발생하였고 1,300,000 건의 사망이 보고되었다. 세계보건기구는 1993년에 결핵이 세계적인 긴급문제로 선언하였으나, 다제내성 결핵(multi-drug-resistant TB) 및 후천성면역결핍증-결핵 복합감염(HIV-TB coinfection)으로 인해 여전히 창궐하고 있다. 특히 결핵의 유행은 대부분의 개발도상국가인 아프리카 국가 및 동남아시아 국가에서 집중되고 있으며, 이 지역은 의료시설이 미비하여 의료기술 발전의 혜택을 보기가 매우 어렵기 때문에 시간이 많이 소요되고 기반 시설과 숙련된 기술자를 필요로 하는 전통적인 진단방법의 제한을 극복할 수 있는 신속하고 정확한 새로운 진단방법이 매우 필요한 실정이다.
이에 따라 지난 수십 년 간 다양한 진단방법이 개발되었다. 예를 들어, MGIT (mycobacteria growth indicator tube)가 있으며, 가장 최근에는 자동화된 카트리지 타입의 핵산증폭진단법(automated cartridge-type nucleic acid amplification test, NAAT)인 진엑스퍼트(GeneXpert)가 개발되었다. 전자는 결핵균의 대사작용에 의한 산소소모로 인해 억제되어 있던 형광체가 발생시키는 형광세기의 변화를 측정하는 것이고, 후자는 분자비콘(molecular beacon)을 사용한 역전사-중합효소연쇄반응(reverse-transcription-PCR)방법이다. 두 방법 모두 세계보건기구의 승인을 받아 의료용으로 사용되고 있다. 하지만, MTB 배양방법을 사용한 진단방법은 균을 배양하는 데에 보통 2 내지 8주의 시간이 요구되어 진단 기간이 오래 걸리고, DNA를 사용한 방법은 시간을 매우 단축할 수 있으나, 활동성 결핵과 잠복성 결핵을 구별할 수 없다는 것이 난제이다.
이와 같은 문제점들을 극복하기 위해, 다양한 방법들이 개발되었으며, 수정진동자저울 (quartz crystal microbalance, QCM; 비특허문헌 1) 압전-결정 기반 센서 (piezoelectric crystal-based sensors), 반사율계 간섭 분광법(reflectometric interference spectroscopy), 광도파로 바이오센서(waveguide biosensor) 등이다. 간섭계 광학센서를 이용한 바이오센서가 또한 개발되어져 왔다.
그러나 광물결의 상겹칩 정도에 따라 달라지는 패턴을 분석하는 원리로 개발되는 상기 센서는 센서표면의 상태와 물질에 따라 매우 예민하게 반응한다. 따라서 이를 바이오센서에 적용하기 위해서는 선택적인 바이오프루브(bioprobe)를 광파이퍼의 표면에 부착하는 새로운 방법이 매우 필요한 실정이다.
비특허문헌 1. Hiatt,L.A. and Cliffel,D.E. (2012). Real-time recognition of Mycobacterium tuberculosis and lipoarabinomannan using the quartz crystal microbalance. Sensors and Actuators B: Chemical 174, 245-252.
본 발명은, 고 민감도 표적 단백질 검출을 위한 간섭계 광섬유 어레이의 센싱 표면 디자인 방법을 제공하고, 이를 기반으로 하여 결핵 환자의 체내에서 분비하는 특정한 단백질 중 10kDa 배양여과단백질(culture filtrate protein; CFP-10)을 환자의 임상 소변 검체내에서 신속하고 정확하게 검출하여 결핵을 진단할 수 있음을 확인 하였으며, 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 표적 단백질 검출을 통한 결핵진단키트 및 이를 이용한 결핵진단방법을 제공하는데 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁; 및 상기 AHC 항체와 Fc 절편을 통해 특이적으로 결합하는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체;를 포함하며, 상기 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 CFP-10 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트를 제공한다.
또한, 상기 CFP-10 항원의 농도는 10 ng/mL 내지 103 ng/mL일 수 있다.
본 발명에 따른 다른 측면에 의하면, 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁에 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체를 고정시키는 단계(제1단계); 검체를 준비하여 상기 제1단계의 광섬유 어레이 팁과 반응시켜 반응물을 생성하는 단계(제2단계); 및 상기 반응물을 정량분석하는 단계(제3단계)를 포함하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법을 제공한다.
또한 검체는 결핵진단을 위해 전처리 후 사용되며, 상기 전처리는 결핵 환자의 소변을 원심분리하여 수득한 상층액을 희석시킬 수 있다.
또한 상기 제1단계에서 광섬유 어레이 팁을 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 용해된 용액에서 진동시켜 반응시킨 후 안정화시켜 고정화할 수 있다.
또한 상기 제2단계에서 광섬유 어레이 팁을 소변 검체와 800 내지 900 초간 결합시키고, 900 내지 1000 초간 해리시킬 수 있다.
본 발명에 따른 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트 및 이를 이용한 결핵진단방법에 의하면, 결핵 환자의 체내에서 분비되는 단백질 중 특정한 단백질인 10kDa 배양여과단백질(CFP-10) 항원을 소량의 임상 샘플에서도 최소한의 전처리 후 고효율로 정확하게 검출하여 결핵을 조기에 진단할 수 있다.
도 1은 CFP-10 항원에 대한 hIgG1 항체 및 CFP-10 항체의 선택성을 비교한 표면 플라즈마 공명 분광분석을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트의 광섬유 어레이 팁의 항체 고정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 CFP-10 항원에 대한 정량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트에 적용된 임상 소변 검체의 AFB 염색 테스트 결과 및 이를 적용한 간섭계 광섬유 어레이 면역 반응 분석에 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 임상 소변 검체의 전처리 과정에 대한 모식도 및 광학분석 결과이다.
본 발명자는 결핵의 원인균인 Mycobacterium tuberculosis(이하'MTB')가 환자의 체내에서 분비하는 특정한 단백질 중 10kDa 배양여과단백질(culture filtrate protein; 이하 CFP-10)이 결핵의 초기부터 방출되기 때문에 결핵의 조기 진단을 위한 좋은 후보 표질 물질인 것을 확인하고, 상기 CFP-10 항원을 신속하고 정확하게 검출하기 위해 연구하던 중 간섭계 기반 광섬유 에레이(interferometric optical fiber array)를 사용한 검출과정에 있어서 광섬유 어레이 팁의 표면의 디자인을 다각적으로 접근하는 경우에 실제 환자의 임상 검체 중 CFP-10 항원의 양을 정확하게 검출할 수 있는 것을 확인하여 결핵균을 검출할 수 있는 최적의 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트를 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 간섭계 광섬유 어레이(interferometric optical fiber array)를 이용한 결핵진단키트는 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(anti-human Fc capture; 이하'AHC') 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁; 및 상기 AHC 항체와 Fc 절편(fragment)으로 특이적으로 결합하는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체(IgG-type CFP-10 monoclonal antibody);를 포함하며, 상기 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 CFP-10 항원과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
간섭계 광섬유를 이용하는 간섭계 광학센서는 광물결의 상겹침 정도에 따른 달라지는 패턴을 분석하는 원리로 개발되며, 상기 광학센서는 센서 표면의 상태와 물질에 따라 매우 예민하게 반응한다. 상기 간섭계 광섬유를 바이오 센서에 적용하기 위해서 선택적인 바이오프루브(bioprobe)를 광섬유의 표면에 부착해야 하며 이를 바이오-레이어 간섭계 (bio-layer interferometry, BLI)라고 한다. 바이오프루브(bioprobe)가 표면에 고정된 바이오센서는 매우 빠른 분석능을 가질 수 있으며, 시료의 전처리 없이 분석이 가능한 장점을 갖는다.
상기 광섬유 어레이 팁 상에 고정된 AHC 항체는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체의 Fc 절편과 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 CFP-10 항원은 상기 AHC 항체와 직접 결합하는 것이 아니라 간접 결합할 수 있다. 이 경우 광섬유 어레이 팁에 1차 접합된 Fc 포획 항체층이 안정적으로 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체의 Fc 절편을 결합시켜 주고, 항원 결합부위를 반응 가능한 방향으로 배향할 수 있다.
상기 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체는 전체 크기 75-kDa의 IgG-타입 CFP-10 단일클론 항체일 수 있으며, 상기 CFP-10 항원과 반응하여 항원-항체 반응물을 생성할 수 있다.
상기 CFP-10 항원은 MTB 가 체내에 침입하여 환자의 체내에서 분비되는 특정한 단백질인 배양여과단백질(culture filtrate protein) 중 하나인 CFP-10일 수 있다.
상기 CFP-10 항원은 크기가 10 kDa 이하로 신장막을 투과하여 소변을 배출될 수 있다.
상기 CFP-10 항원의 농도는 10 ng/mL 내지 103 ng/mL일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁에 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체를 고정시키는 단계(제1단계); 검체를 준비하여 상기 제1단계의 광섬유 어레이 팁과 반응시켜 반응물을 생성하는 단계(제2단계); 및 상기 반응물을 정량분석하는 단계(제3단계)를 포함하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법을 제공한다.
상기 검체는 결핵 환자의 소변을 원심분리하여 수득한 상층액을 희석킨 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검체는 결핵 환자의 소변을 2800 내지 3000 rpm에서 8 분 내지 10 분간 원심분리하여 수득한 상측액을 0.1 M의 인산염 완충 생리식염수(phosphate buffered saline; 이하 'PBS, pH 7.4) 0.5%(v/v)로 희석시킬 수 있다.
상기 조전을 벗어나는 경우 소변 내의 비표적 물질을 완벽하게 정제하지 못하여 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법의 정확도가 떨어질 수 있다.
상기 제1단계에서 광섬유 어레이 팁을 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 용해된 용액에서 진동시켜 반응시킨 후 안정화시켜 고정할 수 있다.
상기 제1단계에서 광섬유 어레이 팁을 진동하는 경우에 1000 내지 1200 초간 진동시킬 수 있다.
상기 범위를 벗어나면 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체의 Fc 절편과 AHC 항체가 결합하지 못할 수 있다.
상기 광섬유 어레이 팁을 진동시켜 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체를 결합한 이후에 200 내지 300 초간 안정화하여 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체를 광섬유 어레이 팁에 고정시킬 수 있다.
상기 안정화 시간을 벗어나는 경우 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 광섬유 어레이 팁에서 분리되어 간접 결합에 간섭계 측정이 불가능하다.
상기 제2단계에서 광섬유 어레이 팁을 검체와 800 내지 900 초간 결합시키고, 900 내지 1000 초간 해리시킬 수 있다.
상기 결합시간을 벗어나는 경우에는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 CFP-10 항원과 충분하게 결합할 수 없으므로 항체-항원 반응물을 생성할 수 없고, 해리 시간을 벗어나는 경우에는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법에서 간섭계 광섬유 어레이의 민감도가 떨어지므로 결핵 진단방법의 정확성이 감소될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<참조예 1> 시약 및 항체 준비
1. 시약 준비
다음 실시예에서 제작할 3가지의 서로 다른 광섬유 어레이 팁[amine-reactive (AR), aminopropylsilane (APS) 및 anti-human IgG Fc capture (AHC)]은 각각 ForteBio, Inc.사 (Menlo Park, CA)로부터 구입하였다. 96 well microtilter plate 아민-반응성 (AR), 아미노프로필실란 (APS), 및 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체는 각각 Thermo Fisher Scientific 사 (Langenselbold, Germany)로부터 구입하였다.
그리고, 사클로로금(III)산 3수화물(HAuCl4·3H2O,99.9%), N-에틸-N′-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC), N-하이드록시숙신이미드(NHS), 갈산 및 프로카테츄산은 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)로 구입하였으며, 금 나노입자는 JL Nano Inc.사 (Busan, Korea)로부터 구입하였다. 인산 완충 생리식염수 스탁 용액 (PBS buffer solution, 10 ×, pH 7.4)은 BD Biosciences사 (San Jose, CA)로부터 구매하였으며, 0.1 M로 희석하여 전체 실험에서 사용하였다.
본 실험에서 사용된 두 종류의 서로 다른 항체는 75-kDa whole IgG-type CFP-10 단일클론 항체 (IgG antiCFP-10 mAb)와 32.6-kDa 금-결합 폴리펩타이드 (GBP)-결합 Fab 절편 CFP-10 항체 (GBP-Fab anti CFP-10 Ab)이며, 충남대학교 의과대학 생화학 실험실로부터 제공되었으며, 두 종류의 항체와 CFP-10 항원은 PBS(0.1 M, pH 7.4)에서 준비되었다.
결핵환자, 비결핵 환자의 소변 임상검체, 인간 면역글로블린 G1은 부산대학교 병원으로부터 제공되었다. 초순수 워터(nanopure H2O;>18.0MΩ)는 Milli-Q water purification 시스템으로 정제하였다.
2. 재조합 CFP-10 항원 및 항체의 준비
재조합 CFP-10 항원은 종래 알려진 방법[Shin,A.R., Shin,S.J., Lee,K.S., Eom,S.H., Lee,S.S., Lee,B.S., Lee,J.S., Cho,S.N., and Kim,H.J. (2008). Improved sensitivity of diagnosis of tuberculosis in patients in Korea via a cocktail enzyme-linked immunosorbent assay containing the abundantly expressed antigens of the K strain of Mycobacterium tuberculosis. Clinical and vaccine immunology 15, 1788-1795]에 따라 대장균 (E. coli)에서 발현시키고 정제되었으며, IgG 항-CFP-10 단일클론 항체는 종래 알려진 방법[Hong,S.C., Lee,J., Shin,H.C., Kim,C.M., Park,J.Y., Koh,K., Kim,H.J., Chang,C.L., and Lee,J. (2011b). Clinical immunosensing of tuberculosis CFP-10 in patient urine by surface plasmon resonance spectroscopy. Sensors and Actuators B: Chemical 160, 1434-1438], GBP-Fab 항-CFP-10 항체는 종래 알려진 방법[Lee,J., Kim,J., Ahmed,S.R., Zhou,H., Kim,J.M., and Lee,J. (2014). Plasmon-Induced Photoluminescence Immunoassay for Tuberculosis Monitoring Using Gold-Nanoparticle-Decorated Graphene. ACS applied materials & interfaces, 6(23), 21380-21388]에 소개된 방법으로 각각 준비되었다.
<실시예 1> 항원-항체 선택성 검사
센싱에 앞서 준비된 CFP-10 항원-항체의 특이적 결합반응에 대한 선택성 검사를 표면 플라즈마 공명(surface plasma resonance; 이하 SPR; SPR-micro; K-Mac Inc., Daejeon, Korea) 분광 분석 실험을 통해 진행하였다. 이때, 인간 면역글로블린 G1 (hIgG1)이 CFP-10 IgG 항체에 대한 비교 물질로 사용 되었다. 즉, 2 μg/mL의 hIgG1을 5 μL/min의 유속으로 SPR 칩의 표면이 안정화 될 때까지, 마이크로 플루이딕 채널을 통해 주입시켰다. SPR 피크 이동이 안정화된 후, PBS 용액을 주입하여 결합되지 않은 항체들을 SPR 칩에서 씻어내어 주고, 100 ng/mL와 300 ng/mL의 CFP-10 항원을 각각 같은 유속으로 채널에 주입하고 50초 동안 SPR 피크 이동을 관찰하였다.
그 결과, 도 1과 같이 두 가지 항원 농도에서 모두 항-CFP-10 항체를 고정시킨 경우가 hIgG1 항체를 고정시킨 칩에 비해서 4배 이상 높은 신호 이동이 일어나는 것을 관찰하였으며, 이를 통해 CFP-10 항원에 대한 항-CFP-10 항체의 선택성을 확인하였다.
<실시예 2> 결핵진단키트 제작 및 성능 분석
광섬유 어레이 센서 팁 표면의 항체 결합은 적절한 배향성, 고집적 결합 등을 염두해 두고, 도 2와 같이 세 가지의 방향으로 접근하였으며, 각각 BLI (Biolayer interferometry) 어세이 I, II, 그리고 III으로 각각 명명하였다.
1. BLI 어세이 I 제작
IgG 항-CFP-10 단일클론 항체를 바이오 센서 팁에 직접 결합시키기 위해, AR 바이오센서 팁을 사용하고, EDC/NHS 방법을 적용하였다. 우선, AR 바이오센서 팁은 0.1 M PBS 완충액 (pH 7.4)에서 300초간 담구어 예비 젖음(pre-wet) 단계를 거쳐 신호를 안정화 시키고, 200 mM의 EDC를 50 mM의 NHS 용액에 섞어준 EDC/NHS 용액에서 300초가 반응시켜 주었다. 그후, 100 mg/mL의 IgG 항-CFP-10 단일클론 항체를 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 (pH 4)에 섞어준 항체 용액에서 900 초간 센서 팁을 진동시켜 주었다. 반응하지 못하고 표면에 남아있는 아민기는 1 M 에탄올아민에 300 초간 팁을 반응시켜 주어 퀸칭시킨 후 항체가 고정된 센서 팁은 300 초간 PBS 완충액 (pH 7.4)에서 씻어내어 주었다. 최종적으로, 순차적으로 희석된 세 가지 농도의 CFP-10 항원 (10-1, 102 및 105 pg/mL)을 각각 900 초간 반응시켜 주었다.
2. BLI 어세이 II 제작
APS 센서 팁은 0.1 M PBS 완충액 (pH 7.4)에서 300초간 담구어 예비 젖음(pre-wet) 단계를 거쳐 신호를 안정화 시키고, GBP-Fab 항-CFP-10 항체를 센서 팁에 결합시키기 전에 25 nm 직경 크기의 금나노입자를 먼저 APS 센서 팁에 고정화 시켰다. 이때, 25 nm 금나노입자는 300 초간 APS 센서 팁과 반응시켜 정전기적 인력에 의하여 고정화 시키고, 60 μg/mL의 GBP-Fab 항-CFP-10 항체를 300초간 반응시켜 고정화 하였다. 항체가 고정된 센서 팁은 PBS buffer (pH 7.4)으로 씻어내어 주고, 최종적으로, 순차적으로 희석된 네 가지 농도의 CFP-10 항원 (103, 104, 105 및 106 pg/mL)을 각각 300 초간 반응시켜 주었다.
3. BLI 어세이 III 제작
AHC 바이오센서 팁을 0.1 M PBS 완충액 (pH 7.4)에서 600초간 담구어 예비 젖음(pre-wetting) 단계를 거쳐 신호를 안정화 시키고, 100 mg/mL의 IgG 항-CFP-10 단일클론 항체를 900초간 반응시켜 주었다. 최종적으로, 순차적으로 희석된 세 가지 농도의 CFP-10 항원 (10, 102 및 103 pg/mL)을 각각 900 초간 반응시켜 주었다.
4. 재조합 CFP-10 항원을 이용한 정량분석
앞서 제작된 세 가지의 진단키트를 간섭계 광섬유 어레이 시스템 (ForteBio Octet Red 96 system; ForteBio, Inc., Menlo Park, CA)에 적용시켜 재조합 CFP-10 항원을 정량분석하였다. 이때, 제조자가 제공하는 최적화된 프로토콜을 일부분 변경하여 적용하였으며, 모든 반응은 96 well microplate에서 진행하였고, 각각의 반응 평형, 샘플 로딩, 결합, 해리 반응은 PBS 용액에 분산된 샘플 200 μL를 1000 rpm으로 팁을 진동하여 반응시켜 주었다.
도 3과 같이 BLI 어세이 I에서 순차적으로 희석된 CFP-10 항원을 10-1, 102 및 105 pg/mL의 농도로 적용시켰을 때에는 모든 농도에서 구분하기 어려운 정도의 신호 변화값이 나왔다 (도 3의 (A)와 (B)). 그리고, BLI 어세이 II에서는 1 - 103 ng/mL 범위에서 CFP-10 항체를 순차적으로 희석하여 반응시켰을 때 102 ng/mL까지는 신호 변화가 나오지 않다가, 103 ng/mL에서 상대적으로 명확하게 구분 가능한 신호 변화값이 관찰되었고, 이때 상 변화(phase shift) 값은 약 0.1447 nm 정도로 확인되었다 (도 3의 (C)와 (D)). 마지막으로, BLI 어세이 III에서는 10, 102과 103 ng/mL농도의 CFP-10 항원을 반응시켰을 때 BLI 어세이 II와 일부 비슷한 경향을 띄었는데, 모든 농도에서 항원반응에 의한 신호값이 구분 가능한 범위에서 나왔으며, 10 ng/mL을 반응시켰을 때 완만하게 신호값이 증가하다가 102과 103 ng/mL 농도에서 급격하게 신호값이 증가하는 경향을 확인하였다 (도 3의 (E)와 (F)).
따라서, BLI 어세이 III에서는 1차 접합된 Fc 캡처 항체층이 안정적으로 whole IgG 타입 항체의 Fc 절편을 결합시켜 주고, 항원 결합부위를 반응가능한 방향으로 배향해 주는 것이 잘 일어나서 간섭계 어레이에서 가장 민감한 최적의 디자인으로 판단되었다. 한편, BLI 어세이 I에서는 센서 칩 표면에서 반응 가능한 방향으로 배향된 항체 배열 수율이 낮은 것으로 보이며, BLI 어세이 II에서는 항체 배향성 및 집적도 이외에 금나노입자에 의한 불가피한 광산란 현상에 의해 신호 민감도의 향상이나 증강이 관찰되지 않은 것으로 판단된다.
<실시예 3> 임상 소변 검체를 이용한 CFP-10 항원 검출
결핵 환자의 임상 소변 검체 내에 존재하는 표적항원의 검출이 가능한 지를 알아보기 위하여, 실시예 2에서 제작한 진단키트인 BLI 어세이 III에서 결핵 환자 소변 검체 내에 존재하는 CFP-10 항원을 검출하는 실험을 수행하였다.
1. 소변 검체의 준비
본 실험에서는 3명의 비결핵, 6명의 결핵환자 소변 검체를 분석하였으며, 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 검체 분석에 앞서 모든 소변 검체는 객담항산균 도말검사(이하, AFB 염색 분석)를 수행하였고, 그 후 간단한 전처리 과정(도 5 참조)을 통해 비표적 물질들을 정제하였다. 즉, 각 소변 검체의 10 mL를 튜브에 담고, 3000 rpm에서 10분간 저속으로 원심분리를 해 준 다음, 상층액을 분리시켰으며, 그후 상층액을 0.1 M PBS (pH 7.4)로 0.5 %(v/v)이 되도록 희석시켜 소변 검체를 준비하였다.
2. 임상 소변 검체를 이용한 CFP-10 항원 검출
AHC 바이오센서 팁을 0.1 M PBS 완충액 (pH 7.4)으로 300초간 담구어 예비 젖음(pre-wet) 단계를 거친 후, 100 mg/mL의 IgG 항-CFP-10 단일클론 항체를 1200 초간 반응시켜 준 후, 300 초간 안정화 시켰다. 그리고 나서, 앞서 전처리된 임상 소변 검체 샘플을 넣어 주고, 900초간 결합 반응을 시키고, 1000초간 해리 반응을 시켰다.
도 4는 적용된 임상 소변 검체의 AFB 염색 테스트 결과(A) 및 이를 적용한 간섭계 광섬유 어레이 면역 분석(B)에 대한 결과로서, 도 4(B)에 따르면 정상인의 소변 검체 분석에서 나온 평균 신호 변화값은 0.1955 ± 0.0332 nm이고, 이는 간단한 방법으로 전처리를 하였음에도 남아있는 비표적 생체물질들에 의한 신호라고 판단되며, 이 신호값 수준이 양성 신호값에 대한 기준이 될 수 있다. 그리고, 결핵 환자 샘플에서 신호변화값은 AFB 단계가 1 에서 3으로 갈수록 급격하게 증가하는 경향을 확인하였고, 이러한 선형적 증가는 AFB 단계가 높을수록 더 많은 결핵균이 검체 내에 포함되어져 있기 때문에, 균에서 분비되는 CFP-10 항원이 더 많이 존재하기 때문인 것으로 판단된다.
따라서, 결핵 환자의 소변 검체를 통한 임상샘플의 간섭계 광섬유 어레이 BLI 어세이 III를 이용한 결핵진단 결과는 AFB 염색 검사 결과와 일치하였다.
이상으로 본 발명에 따른 간섭계 광섬유 어레이 BLI 어세이 III를 이용한 결핵진단키트 및 이를 이용한 결핵진단방법에 따르면, 간섭계 분석을 이용한 새로운 결핵진단키트 및 결핵임상진단법을 제공할 수 있으며, 특히 상기 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트는 임상샘플의 양이 매우 소량일 때에도 분석이 가능하며, 전처리가 필요 없는 비표지 및 고효율의 결핵 진단 방법으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 한정된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁; 및
    상기 AHC 항체와 Fc 절편을 통해 특이적으로 결합하는 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체;를 포함하며,
    상기 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 CFP-10 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CFP-10 항원의 농도는 10 ng/mL 내지 103 ng/mL인 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단키트.
  3. 일단에 항인면역글로불린 Fc 절편 포획(AHC) 항체가 고정된 광섬유 어레이 팁에 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체를 고정시키는 단계(제1단계);
    검체를 준비하여 상기 제1단계의 광섬유 어레이 팁과 반응시켜 반응물을 생성하는 단계(제2단계); 및
    상기 반응물을 정량분석하는 단계(제3단계)를 포함하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 검체는 결핵 환자의 소변을 원심분리하여 수득한 상층액을 희석시킨 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 제1단계에서 광섬유 어레이 팁을 IgG 타입 항 CFP-10 단일클론 항체가 용해된 용액에서 진동시켜 반응시킨 후 안정화시켜 고정하는 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 제2단계에서 광섬유 어레이 팁을 검체와 800 내지 900 초간 결합시키고, 900 내지 1000 초간 해리시키는 것을 특징으로 하는 간섭계 광섬유 어레이를 이용한 결핵진단방법.
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