CN110862969A

CN110862969A - 分泌抗cfp-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用

Info

Publication number: CN110862969A
Application number: CN201911193802.8A
Authority: CN
Inventors: 焦新安; 李昕; 陈祥; 徐正中; 谢宇晴; 王海宁; 夏爱鸿; 顾丹; 潘志明; 孟闯; 殷月兰; 耿士忠; 黄金林
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110862969B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗CFP‑10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用。检测试剂盒中包括支持介质、包被抗原、酶标抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的结核分枝杆菌CFP‑10单克隆抗体，所述结核分枝杆菌CFP‑10单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。本发明试剂盒可减少漏检的感染宿主，灵敏度高，特异性强。同时本试剂盒可以针对多种宿主的结核病进行检测，操作简单易懂，样品检测仅需1 h，具有良好的应用前景。

Description

分泌抗CFP-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗CFP-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTC)感染引起的慢性传染病，在发达国家和发展中国家均有大量人群感染。结核分枝杆菌复合群主要包括：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)等，其中结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是令人类和家畜感染结核病的主要源头。自然界中除了致病的结核分枝杆菌复合群以外还存在着许多非致病性分枝杆菌，另外还有多种致病性的非结核分枝杆菌(Non tuberculosismycobacteria,NTM)、鸟分枝杆菌(M.avium)等，这些细菌不仅会对生物造成直接的危害，还会干扰结核病的检测。目前结核病在许多发达国家已经被控制，但在一些发展中国家仍旧是严重影响人类生命健康的存在。同时，结核病也严重影响牛群的健康，给养殖业造成大量的经济损失。据统计牛结核病所造成的损失大于其它疾病对牛造成损害的总和。同时牛分枝杆菌不仅可以使牛患病，也可以让人患结核病。世界卫生组织在第七次会议中指出：“除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的”。因此结核病的检测就变得尤为重要。

目前实验室检查方法主要有：细菌学检查、分子生物学检查、免疫学检查。细菌学检查是检测结核分枝杆菌，发现传染源的重要手段和途径，可以作为结核病诊断和治疗方案制订的重要依据。世界上很多实验室使用的痰涂片抗酸染色方法是最基本的细菌学检测手段。细菌学方法简单、快速而且便宜，但同时也有不敏感，特异性差，无法辨别死菌和活菌的缺点。分子生物学检查方法是检测结核分枝杆菌的阴阳性的重要方法。免疫学检查又包括结核菌素皮肤试验、γ-干扰素释放实验、血清学试验。在这些检测方法中，免疫学检查方法快速，简便，不需要复杂的大型仪器设备，因此在实验室运用较多。本研究也是属于免疫学检查的范畴。

在免疫学检查中，结核菌素试验的灵敏度高，是目前应用最广的检测结核病的方法，在生物学家进行大量试验之后证实以结核菌素(PPD)为刺激原的IFN-γ释放实验可以作为结核菌素试验的替代检测方法，该方法在世界范围内被推广应用。但该方法所用的抗原在卡介苗(BCG)和环境分枝杆菌中均存在，因此检测结果的假阳性高，检测的准确性不强。

上述检测方法仍然不能满足本领域对分枝杆菌感染的特异性检测的现实需要。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种分泌抗CFP-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用，所述试剂盒可单独用于结核病检测，也可以作为一种补充检测方法与其它方法联合使用，1小时内即可获得检测结果，用于多种物种结核病的检测。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供一种分泌CFP-10抗体的杂交瘤细胞株或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO:C2019191。

该杂交瘤细胞株已经于2019年8月14日在中国典型培养物保藏中心(地址：武汉市武汉大学)注册保藏，保藏号为CCTCC NO:C2019191，分类命名为杂交瘤细胞株8E6。

本发明第二方面提供一种抗CFP-10抗体，由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明第三方面提供一种抗CFP-10抗体，所述抗CFP-10抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示CDR-L1、氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3。

本发明第四方面提供一种多核苷酸，编码所述的抗CFP-10抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明第五方面提供一种构建体，含有所述的多核苷酸。

本发明第六方面提供一种抗体的表达系统，所述表达系统含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。

本发明第七方面提供前述的抗CFP-10抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养前述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。

和/或，由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明第八方面提供前述的抗CFP-10抗体、多核苷酸、构建体或抗体的表达系统在制备结核病检测试剂盒中的用途。

本发明第九方面，提供一种结核病的cELISA检测试剂盒。所述试剂盒包括：

(1)选自以下任一：

1)支持介质和包被抗原；

2)包被有包被抗原的支持介质；

所述包被抗原为结核分枝杆菌CFP-10蛋白，CFP-10蛋白是人、牛及其他动物结核病病原菌的特异性抗原，提高了试剂盒检测的灵敏度；

(2)酶标抗体；所述酶标抗体为经过标记的前述的抗CFP-10抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明试剂盒中所采用的由杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势。

2)本发明试剂盒中所采用的CFP-10包被抗原由RD1基因编码，RD1只存在于结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌，而在BCG卡介苗中缺失，因此CFP-10作为包被抗原特异性更高。

3)本发明的试剂盒可以直接对结核分枝杆菌样品进行检测，大大缩短了检测周期，1小时内即可检测出结果，提高了动物福利。

4)本发明基于CFP-10蛋白的cELISA试剂盒，可以用于检测多物种结核病检测。

5)配合使用本发明基于的试剂盒，可以检出使用皮试和商品化ELISA试剂盒漏检的感染动物，因而使总体检测水平得到提高。

6)本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高、检测时间短的特点，具有广阔的应用前景。

7)本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，仅需要移液器和酶标仪进行加样和读数。

8)本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在2～8℃条件下保存一年不会影响其敏感性。

附图说明

图1：cELISA灵敏度实验。

图2：cELISA检测试剂盒检测人血清结果。

图3：cELISA检测试剂盒检测兔血清结果。

图4：cELISA检测试剂盒检测牛血清结果。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明发明人经过大量研究，提供了一种杂交瘤细胞株，并进一步涉及通过该杂交瘤细胞株制备获得的抗CFP-10抗体，基于此抗体制备了检测结核病的cELISA检测试剂盒，能够特异性地检测人结核病以及多种动物结核病。

本发明的杂交瘤细胞株或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCCNO:C2019191，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年8月14日。

分类命名为杂交瘤细胞株8E6。

本发明的抗CFP-10抗体，由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

本发明所提供的抗CFP-10抗体，可以由本发明第一方面所提供的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌获得。所述抗CFP-10抗体通常为单克隆抗体。

本发明提供的另一种抗CFP-10抗体，所述抗CFP-10抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3。

CDR(互补决定区，complementarity determining region)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariable region，HVR)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(CDR)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

所述抗CFP-10抗体中，所述抗CFP-10抗体的轻链可变区的氨基酸序列可以包括：

a)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或

b)与SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有a)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.4具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

所述抗CFP-10抗体中，所述抗CFP-10抗体的重链可变区的氨基酸序列包括：

c)如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或

d)与SEQ ID No.8所示的氨基酸序列具有80％以上同源性、且具有c)所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列；具体的，所述d)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ IDNo.8所示的氨基酸序列功能的氨基酸序列。所述d)中的氨基酸序列可与SEQ ID No.8具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。

所述抗CFP-10抗体可为单克隆抗体。

进一步的，所述单克隆抗体为结核分枝杆菌CFP-10单克隆抗体。

所述重链和轻链可通过二硫键连接。

一种实施方式中，所述抗CFP-10抗体，其轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列。

其重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

一种实施方式中，所述轻链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.12或其保守型变异序列，所述重链可变区的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.16或其保守型变异序列。

一种实施方式中，所述单克隆抗体是鼠源性的。

一种实施方式中，所述单克隆抗体亚类为IgG1。

本发明的多核苷酸，可编码前述的抗CFP-10抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

本发明的构建体，含有前述的多核苷酸。

所述构建体可以由所述分离的多核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。

本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。具体可采用的表达载体包括但不限于：pET系列表达载体、pGEX系列表达载体、pcDNA系列表达载体等。

本发明的抗体的表达系统，所述表达系统含有前述的构建体或基因组中整合有外源的前述的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。具体的，可以为例如，酵母、昆虫、植物等的细胞。优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可采用不会产生抗体的哺乳动物宿主细胞系，具体可采用的细胞系包括但不限于：中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)、幼仓鼠的肾脏细胞(BHK,ATCC CCL 10)、幼鼠的塞尔托利细胞(Sertoli cells)、猴的肾脏细胞(COS细胞)、通过SV40(COS-7,ATCC CRL165 1)转化的猴的肾脏CVI细胞、人的胚肾细胞(HEK-293)、猴肾脏细胞(CVI，ATCC CCL-70)、非洲绿猴的肾脏细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)、人的子宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL-2)等。

前述的抗CFP-10抗体的制备方法，可以包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养前述抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体。

合适的表达所述抗体的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

所述抗CFP-10抗体也可以由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤产生，制备方法可以包括如下步骤：采用体内诱生腹水法进行制备。合适的利用杂交瘤体内诱生腹水以提供单克隆抗体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，本领域技术人员可根据经验将杂交瘤细胞对小鼠进行腹腔接种，收集腹水。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

前述的抗CFP-10抗体、多核苷酸、构建体或抗体的表达系统可用于制备结核病检测试剂盒。

本发明的结核病的cELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)选自以下任一：

1)支持介质和包被抗原；

2)包被有包被抗原的支持介质；

所述包被抗原为结核分枝杆菌CFP-10蛋白；

(2)酶标抗体；

所述酶标抗体为经过标记的前述抗CFP-10抗体；

本发明所述试剂盒中，所述包被抗原与所述酶标抗体能发生抗原抗体结合作用。

一种实施方式中，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗CFP-10抗体。

所述抗CFP-10抗体可为单克隆抗体。

辣根过氧化物酶标记单克隆抗体的方法采用常规。

一种实施方式中，所述捕获抗原，为前述的CFP-10蛋白。

所述试剂盒中，所述支持介质可以事先包被有包被抗原，也可以只提供空白支持介质与包被抗原，在检测前由操作者自行采用常规方法在支持介质上包被包被抗原。

进一步地，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：

1)洗涤液；

2)底物显色液；

3)稀释液；

4)封闭液；

5)阳性对照；

6)阴性对照；

7)终止液。

上述试剂均为ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最优的选择是试剂盒中同时包括底物显示液、终止液和洗涤液。

所述底物液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用底物显示液，如TMB底物显示液。

所述洗涤液可为ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如PBST等。可以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。

所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如脱脂奶粉、FBS、BSA或酪蛋白等。

进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他ELISA检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。

所述阴性对照为健康兔血清。

所述阳性对照的组分与进行检测的样本组的各组分相同，但由实验兔制备的结核分枝杆菌免疫兔血清。

所述终止液可为ELISA检测试剂盒中常用的通用终止液，如2M H₂SO₄终止液。

通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。

使用该试剂盒能对人和牛结核病及其他动物结核病进行高效率检测。

本发明进一步基于上述cELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的结核病的cELISA检测试剂盒，用于检测人结核病以及动物结核病，从而进行机体免疫状态评价及疾病检测方面的研究。

利用本发明的试剂盒血清样品的检测方法包括下列步骤：

(1)包被抗原包被支持介质(例如酶标板)；

(2)制备检测样品血清；

(3)血清中CFP-10抗体的检测。

1)取上述包被抗体包被的支持介质(酶标板)，将50μL血清和50μL酶标抗体混合加入酶标板，轻弹酶标板或用微量振荡器振荡，使反应板中的溶液混匀；

2)贴上封板膜，37℃孵育0.5h；

3)用洗液洗涤每个板孔，每次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在最后一次甩掉后，在干净的滤纸上或吸水纸上用力扣板拍打几次，尽量除去残留的洗液。在加入下一个试剂前，避免孔壁变干；

4)洗板后，每孔中加入100μL底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色7min；

5)按加入底物显色液的顺序和间隔，在每孔中加入50μL终止液；

6)15min内在酶标仪上测定OD₄₅₀。

前述cELISA检测试剂盒可用于结核分枝杆菌感染检测。所述检测为诊断目的的检测。

其中，所述非诊断目的包括流行病学分析和研究、离体组织检测、表位鉴定研究以及定性和定量检验结核分枝杆菌抗原特异的CFP-10蛋白。

实施例1杂交瘤细胞株的获取以及单克隆抗体的制备

保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株的获得。

1.重组菌BL21(DE3)-pET-30a(+)-cfp10的表达及融合蛋白纯化

合成一对引物：

Primer 1:5’-AATGGATCCATGGCAGAGATGAAGACC-3’(BamH I)(SEQ ID NO：17)；Primer 2:5’-ATTAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGA-3’(HindⅢ)(SEQ ID NO：18)。循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火50s，72℃延伸1min，25个循环；72℃10min。以结核分枝杆菌H37Rv为模板扩增CFP-10基因。

连接、转化、质粒提取、电泳鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pET-30a(+)-cfp10；重组菌命名为BL21(DE3)-pET-30a(+)-cfp10。之后对重组菌进行扩大培养，表达纯化rHis-CFP-10。

2.动物免疫

具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的重组rHis-CFP-10蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔两周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7d后采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行尾静脉加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。

3.细胞融合

具体步骤如下：尾静脉加强免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。无菌取免疫鼠脾脏细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG作用下融合，用ICR小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。5d后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HT培养基进行培养，定期观察，换液和检测。

4.间接ELISA检测方法的建立

采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆。方阵试验确定检测抗原rHis-CFP-10蛋白的包被浓度。检测抗原包被缓冲液横向梯度稀释，每孔50μL包被ELISA板，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔50μL，正常小鼠血清同样倍数稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗第三次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h，PBST洗涤后，TMB显色，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。

5.筛选阳性克隆

采用建好的间接ELISA方法检测杂交瘤细胞分泌的抗体情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞培养上清加入预先包被好的ELISA板中，50μL/孔，以SP2/0细胞上清作为阴性对照，免疫多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；PBST洗涤3次；加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体，50μL/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，TMB显色10min，显示终止后酶标仪测定OD₄₅₀读数。被测孔OD₄₅₀读数大于阴性对照两倍以上判定为阳性。将筛选到的1株阳性克隆命名为阳性细胞克隆8E6。

6.阳性杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆8E6进行2～3次的亚克隆并进行保藏。阳性细胞克隆8E6对应保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株。

7.腹水的制备

采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10～12周龄健康的BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3～0.5mL/只，7～10d后，分别腹腔接种经PBS稀释的培养至对数生长期的杂交瘤细胞8E6，5×10⁵个细胞/只；7d后收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接ELISA测定抗体效价，分装，-70℃保存。保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株(对应杂交瘤细胞8E6)分泌产生的单克隆抗体记作单克隆抗体8E6。

8.抗体的纯化标记

将制备的8E6腹水使用Protein G亲和层析方法进行纯化，并将单克隆抗体8E6进行辣根过氧化物酶标记。

将纯化的单克隆抗体8E6采用标准辣根过氧化物酶标记法进行标记，获得辣根过氧化物酶标记CFP-10单克隆抗体HRP-8E6。(1)称取HRP 25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。(2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕色流出液。如体积大于5mL,则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1MpH 9.5碳酸缓冲液0.25mL，继续搅拌3h。(5)加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2h。(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。(7)3000rpm离心0.5h，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH 7.4的PBS中。(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH 7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心0.5h去除沉淀，上清液即为酶结合物HRP-8E6分装后，冰冻保存。

本发明的单克隆抗体8E6也可以使用本领域公知的其他方法进行标记。

9.单克隆抗体特性检测

①单克隆抗体亚类的鉴定

按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的ELISA法。在已包被rHis-CFP-10抗原的酶标板内分别加入细胞培养上清50μL/孔，37℃1h，PBST洗涤3次，每次5min分别加入1:1000稀释的羊抗鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM亚类抗体50μL/孔，37℃0.5h，每株单克隆抗体加每种亚类两孔，PBST洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的羊抗鼠酶标二抗50μL/孔，37℃15min，PBST洗涤3次；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色10～15min，2M H₂SO₄50μL/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其他孔者所加亚类抗体为单克隆抗体亚类。

结果显示，单克隆抗体8E6亚类为IgG1。

经鉴定，结果表明，单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

EDITTY。

单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

YTS。

单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

QQYSKLPRT。

单克隆抗体8E6的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

NSSLSASLGDRVTISCRASEDITTYLNWYQQKPDGSVKFLIYYTSGLHSGVPSRFSGS GSGADYSLTISNLEPEDIASYYSQQYSKLPRTFGGGPKLEIKRA

亦即单克隆抗体8E6的轻链可变区含有102个氨基酸。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区1(CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：

GYTFTSYI。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区2(CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：

IYPYNDGT。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区3(CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，具体为：

SRDGYYGY。

单克隆抗体8E6的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为：

QVQLQQPGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTSYIMHWVKQKPGQGLEWIGYIYPYN DGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCSRDGYYGYWGQGTTLTVSS。亦即单克隆抗体8E6的重链含有115个氨基酸。

对应地，单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区1(CDR1)的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，具体为：

GAGGACATTACCACTTAT。

单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区2(CDR2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，具体为：

TACACATCAG。

单克隆抗体8E6的轻链可变区互补决定区3(CDR3)的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：

CAGCAGTATAGTAAGCTTCCTCGGACG。

单克隆抗体8E6的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，具体为：

AATTCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTGAGGACATTAC CACTTATTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAAGTGTTAAATTCCTGATCTATTACACATCAGGGTTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGGCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAACCTGGAACCTGAAGATATTGCCAGTTACTACAGTCAGCAGTATAGTAAGCTTCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCCCCAAGCTGGAAATCAAACGGGCT。

亦即单克隆抗体8E6的轻链的核苷酸含有306个碱基。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区1(CDR1)核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

GGATACACATTCACTAGCTATATT。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区2(CDR2)核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：

ATTTATCCTTACAATGATGGTACT。

单克隆抗体8E6的重链可变区互补决定区3(CDR2)核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：

TCAAGAGATGGTTACTACGGCTAC。

单克隆抗体8E6的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，具体为：

CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGACCTGTCCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATATTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTTATCCTTACAATGATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTTCAAGAGA TGGTTACTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA。亦即，单克隆抗体8E6的重链的核苷酸含有345个碱基。

②单克隆抗体腹水效价的检测

使用包被缓冲液将检测抗原稀释至2μg/mL，每孔50μL包被ELISA板条，4℃过夜；PBST洗涤3次，每孔加入200μL封闭液，4℃过夜；将单克隆抗体腹水倍比稀释，每孔50μL，同样倍比稀释SP2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔50μL，37℃孵育1.5h；PBST洗涤后，TMB显示，酶联检测仪测定OD₄₅₀的值，以P/N值≥2.1为判定标准，测定单克隆抗体腹水效价。

结果显示，单克隆抗体8E6的效价均达到1:10240000。

③单克隆抗体特异性的鉴定

分别培养BL21(DE3)-pET-30a(+)-cfp10、BL21(DE3)、BL21、BL21(DE3)-pET-30a(+)、BL21-pGEX-6P-1、BCG、H37Rv细菌，离心收集菌体，沉淀用PBS悬浮，超声波裂解后离心取上清。剪取一定大小的硝酸纤维素膜(NC)，用去离子水浸透，晾干，各取菌液5μL点于NC膜上，37℃干燥30min，用含5％的脱脂奶封闭，4℃过夜；PBST洗涤3次，3-5min/次；再浸入工作浓度的McAb溶液中，37℃孵育2h，PBST洗涤3次；转入工作浓度的羊抗鼠HRP-IgG酶标抗体溶液中，37℃孵育1h，PBST洗涤3次；以DAB显色液显色。同时设阳性血清作为对照。

在Dot-ELISA试验中，单克隆抗体8E6只与BL21(DE3)-pET-30a(+)-cfp10和H37Rv反应，与其余细菌没有反应。

实施例2竞争ELISA方法的建立

1最佳抗原包被浓度、酶标抗体浓度使用浓度的确定

按照正交矩阵方法进行滴定试验，包被抗原浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0μg/ml，酶标抗体的稀释倍数分别为1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000。4℃过夜包被，100μL/孔。用1×洗涤液洗涤3次，加入含2％BSA的PBST，300μL/孔，37℃封闭2h，洗涤后加入1:10稀释的阳性血清和阴性血清，50μL/孔，同时加入工作浓度的酶标抗体，其稀释倍数分别为1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000。37℃作用0.5h，洗涤后加入TMB显色液，100μL/孔，室温作用7min，加入2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，于酶标仪450nm波长下测定OD值，计算P/N值，以阴性血清OD值达到并接近1.0，P/N值较大的所在孔的抗原浓度和血清稀释度作为最佳抗原包被浓度和酶标抗体使用浓度。

比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定rHis-CFP-10蛋白最佳包被抗原浓度为0.75μg/mL，酶标抗体最佳稀释倍数为1:8000。

2最佳阴、阳性血清使用浓度的确定

包被抗原浓度为0.75μg/mL，将阴性血清和阳性血清分别按照1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍比稀释，酶标抗体1:8000进行稀释，并设立PBS孔作为空白对照。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，测定出最适的血清稀释倍数为1:20。

3酶标板抗原包被条件及稳定性确定

3.1抗原包被条件的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释到0.75μg/mL包被酶标板，分别置4℃14h、4℃16h、4℃18h、4℃20h、4℃22h、4℃24h、37℃2h。PBST洗涤后37℃封闭2h，洗涤后加入50μL的1:20稀释的阳性血清和阴性血清和50μL的1:8000稀释的酶标抗体，进行ELISA测定。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定抗原最佳包被条件为4℃18h。

3.2封闭液的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至0.75μg/mL包被酶标板，以含1.0％BSA、2.0％BSA、5.0％FBS、10.0％FBS、2.0％脱脂奶粉、5.0％脱脂奶粉37℃封闭2h，PBST洗涤后加入50μL的1:20稀释的阳性血清和阴性血清和50μL的1:8000稀释的酶标抗体，进行ELISA测定。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定最佳封闭液为含2.0％脱脂奶粉的PBS。

3.3显色时间的确定

0.1mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至0.75μg/mL包被酶标板，以含2.0％脱脂奶粉的PBS 37℃封闭2h，PBST洗涤后加入50μL的1:20稀释的阳性血清和阴性血清和50μL的1:8000稀释的酶标抗体，加入显色液后37℃显色3min、5min、7min、10min、12min、15min，进行ELISA测定。比较各组阴、阳性血清抑制率和P/N值，确定最佳显色时间为含37℃7min。

4cELISA灵敏度实验

基于自身抑制率实验原理，使用8E6与HRP-8E6进行竞争，计算cELISA的灵敏度。

8E6用pH 7.2PBS系列稀释为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μg/mL，分别加入到预先包被的酶标板孔中，每孔50μL，每个稀释度做3个重复，每孔加入50μL1:4000稀释的酶标抗体，同时设定阴性、阳性和空白对照；酶标板置于37℃反应1h，PBST洗涤3次，甩干，每孔加入100μL TMB显色液，室温显色7min，每孔加入50μL终止液，10min内在酶标仪上读取OD₄₅₀值。

其中抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

表1计算的抑制率绘制成图1，从结果看，cELISA的最低检出限为1.56μg/mL。

表1 cELISA灵敏度实验结果

实施例3快速检测结核病的cELISA试剂盒的组装

检测结核病的cELISA试剂盒的组装步骤如下：

1辣根过氧化物酶标记CFP-10蛋白单克隆抗体(记为HRP-8E6)的制备：

将纯化的单克隆抗体8E6采用标准辣根过氧化物酶标记法进行标记，获得辣根过氧化物酶标记CFP-10单克隆抗体HRP-8E6。

2试剂盒组装

将酶标板、包被抗原、辣根过氧化物酶标记CFP-10单克隆抗体HRP-8E6(由保藏号为CCTCC NO:C2019191杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体经辣根过氧化物酶标记)等组份按每个试剂盒数量装载瓶数放入试剂盒塑料支架，包装组装成试剂盒，将说明书放入试剂盒，贴好外标签和侧标签。

进一步的，试剂盒中依据需要组装入：洗涤液(20×)、底物显色液、稀释液、封闭液、阴性对照、阳性对照和终止液中的一种或多种。

试剂盒中，酶标板、包被抗原(CFP-10蛋白)也可采用包被结核分枝杆菌包被抗原的酶标板替代。

包被包被抗原的酶标板的制备方法：

①96孔酶标板中加入0.75μg/mL的包被抗原，100μL/孔，4℃过夜包被；

②弃包被液，使用PBST洗板3次，1min/次,并将洗好的板子拍干；

③加入2％BSA的PBS封闭液，300μL/孔，在37℃孵育2h；

④弃封闭液，使用PBST洗板3次，常温干燥2h，加干燥剂将96孔酶标板一起放于密封袋中，抽真空密封，置4℃保存。

3试剂盒使用说明

①加样。用PBS对样品和酶标抗体HRP-8E6分别以1:10和1:4000进行稀释。取已包被的ELISA板(包被rHis-CFP-10抗原的酶标板)，将50μL稀释后的样品和50μL酶标抗体混合加入，放于37℃水浴锅中孵育0.5h。

②显色。用PBST洗涤7遍，洗涤时要轻柔，防止跳孔。100μL孔加入TMB单组份显色液，37℃水浴锅中显色7min。

③终止。50μL/孔加入终止液终止，在15min内放于酶标仪中读取OD₄₅₀，保存数据以便后续分析。

表2本发明所涉及试剂盒的组份

实施例4快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测人血清样品

1.实验材料

使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒。

2.人血清样品的获取

从医院获取1个结核病人和3个健康人血清，采用痰涂片抗酸染色方法进行检测确定结核病患者。

3.人血清样品的检测

①在上述包被包被抗原的96孔酶标板中加入下列试剂：每个血清样品取50μL与50μL酶标抗体HRP-8E6混和加入，将96孔滤膜板置于37℃、5％CO₂培养箱培养0.5h。

②用PBST洗涤7遍，洗涤时要轻柔，防止跳孔。100μL/孔加入TMB单组份显色液，37℃水浴锅中显色7min。

其中抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果如图2所示。在检测人样品时，结核样品的竞争ELISA抑制率大于45％，健康样品的竞争ELISA抑制率小于40％，结果表明本发明的试剂盒可用于对人血清样品进行直接检测，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例5快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测兔血清样品

1.实验材料

使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集10份结核阳性兔血清样品和10份结核阴性兔血清样品，其中结核阳性兔均为结核分枝杆菌免疫兔，阴性兔为健康兔。使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

由图3所示结果可见，结核兔血清样品的竞争ELISA抑制率大于45％，健康兔血清样品的竞争ELISA抑制率小于40％，结果表明本发明的试剂盒可用于对兔血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例6快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测羊血清样品

1.实验材料

使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集1份结核阳性羊血清样品和1份结核阴性羊血清样品，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果可见，结核羊血清样品的竞争ELISA抑制率大于45％，健康羊血清样品的竞争ELISA抑制率小于40％，结果表明本发明的试剂盒可用于对羊血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例7快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测鹿血清样品

1.实验材料

使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集1份结核阳性鹿血清样品和1份结核阴性鹿血清样品，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果表明，结核鹿血清样品的竞争ELISA抑制率大于45％，健康鹿血清样品的竞争ELISA抑制率小于40％，本发明的试剂盒可用于对鹿血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例8快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测牛血清样品

1.实验材料

参照本发明实施例3中的方法来制备cELISA检测试剂盒。

2.cELISA检测试剂盒检测

采集某牛场11头结核阳性奶牛血清样品和17头结核阴性牛血清样品，其中结核阳性牛为皮试和

试剂盒检测为阳性，结核阴性牛为皮试和

试剂盒检测为阴性。使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。

其中，抑制率(％)＝(P-S)/P×100％，其中P为PBS，S为待测样品；

结果如图4所示，结核阳性牛血清样品的竞争ELISA抑制率大于45％，健康牛血清样品的竞争ELISA抑制率小于40％，结果表明本发明的试剂盒可用于对牛血清样品进行直接检测，具有明显的区分度，本发明的试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。

实施例9快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与

牛结核γ-干扰素ELISA检测试剂盒的比较

1.实验材料

使用实施例3中制备的CFP-10的cELISA检测试剂盒。

ELISA试剂盒(Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kitfor Cattle)购自ThermoFisher公司。

本试验检测了临床奶牛的血清样品，并且与市售

ELISA试剂盒进行对比，以进一步确认快速检测结核病的cELISA检测试剂盒的检测效果。快速检测结核病的cELISA检测试剂盒检测血清样品的结果判定同实施例8所述，结果如表4所示。

表3.快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与

ELISA试剂盒结果比较(单位：头)

“+”代表阳性，“－”代表阴性

共检测28头结核疑似牛，以

ELISA试剂盒检验结果作为参考，以该试剂盒检测为阳性的奶牛判定为牛结核阳性，该试剂盒检测为阴性的奶牛判定为牛结核阴性。将两种试剂盒检测出来共同阳性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阳性牛数+cELISA检测试剂盒检测出的阳性牛数)/2]计算出阳性符合率；将两种试剂盒检测出来共同阴性牛数/[(ELISA试剂盒检测出的阴性牛数+cELISA检测试剂盒检测出的阴性牛数)/2]计算出阴性符合率。将(两种试剂盒共同检测出的阳性牛数+共同检测出的阴性牛数)/(总共检测牛数)，计算出总符合率。

经统计学分析，快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与

ELISA试剂盒结果的阳性符合率为76.19％，阴性符合率为85.71％，总符合率为82.14％，具有良好的检测效果。同时也证明可以使用cELISA检测试剂盒与皮试和商品化ELISA试剂盒联合使用，降低感染动物的漏检率。显示cELISA检测试剂盒在牛结核病检测中具有较好的检测价值。

实施例10快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒的比较

1.实验材料

使用实施例3中制备的CFP-10的cELISA检测试剂盒。

牛结核病抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

2.牛结核病抗体试剂盒检测

选择某结核阳性牛场3头PPD检测阳性奶牛和4头PPD检测阴性奶牛，采用牛结核病抗体试剂盒进行检验，按照试剂盒使用说明书操作并判定结果。

3.cELISA检测试剂盒检测

选择某结核阳性牛场3头PPD检测阳性奶牛和4头PPD检测阴性奶牛，使用实施例3中制备的cELISA检测试剂盒使用步骤进行牛结核病检测。将检验结果与牛结核病抗体试剂盒结果进行比较与分析。结果如表3所示。

表4.快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与牛结核病抗体试剂盒结果比较(单位：头)

“+”代表阳性，“－”代表阴性

经统计学分析，快速检测结核病的cELISA检测试剂盒与牛结核病抗体检测试剂盒结果的阳性符合率为80.00％，阴性符合率为88.89％，总符合率为85.71％，其中有一头PPD检测为阳性的牛，牛结核病抗体检测试剂盒检测为阴性而cELISA检测试剂盒检测为阳性。显示cELISA检测试剂盒在牛结核病检测中具有良好的检测价值。

综上所述，本发明的发明人建立以结核分枝杆菌CFP-10蛋白为包被抗原，辣根过氧化物酶标记的CFP-10单克隆抗体HRP-8E6为酶标抗体的cELISA检测试剂盒可以检测人及动物结核病，其操作简便，耗时短，适合人和动物的大规模临床检测。

将研制的cELISA试剂盒与商品化ELISA试剂盒进行比较，具有很高的符合率，通过与皮试和商品化ELISA试剂盒联合使用，可以降低感染动物的漏检率，使总体检测水平得到提高。与商品化抗体试剂盒比较，符合率较高，具有较高的特异性和灵敏度，有广泛的应用前景。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 分泌抗CFP-10抗体的杂交瘤细胞株、其抗体及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Asp Ile Thr Thr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Thr Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg Thr

1 5

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asn Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys

1 5 10 15

Arg Ala Ser Glu Asp Ile Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys

20 25 30

Pro Asp Gly Ser Val Lys Phe Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Gly Leu His

35 40 45

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr

50 55 60

Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Tyr

65 70 75 80

Ser Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Pro Lys

85 90 95

Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ile

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ser Arg Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr

1 5

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr

1 5 10 15

Ala Thr

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Thr Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly

1 5 10

<210> 11

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ala Gly Cys

1 5 10 15

Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Gly

20 25

<210> 12

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ala Ala Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly

1 5 10 15

Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Gly

20 25 30

Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr Thr Gly Cys

35 40 45

Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala

50 55 60

Thr Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala

65 70 75 80

Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Ala

85 90 95

Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Thr Ala

100 105 110

Ala Ala Thr Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Thr Thr Ala

115 120 125

Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Ala Cys

130 135 140

Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala

145 150 155 160

Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly

165 170 175

Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Ala Thr

180 185 190

Thr Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala

195 200 205

Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala

210 215 220

Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys

225 230 235 240

Ala Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Thr Ala

245 250 255

Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Gly Thr Thr

260 265 270

Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly

275 280 285

Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly

290 295 300

Cys Thr

305

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggatacacat tcactagcta tatt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atttatcctt acaatgatgg tact 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcaagagatg gttactacgg ctac 24

<210> 16

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caggtccaac tgcagcagcc tggacctgtc ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatatta tgcactgggt gaagcagaag 120

cctgggcagg gccttgagtg gattggatat atttatcctt acaatgatgg tactaagtac 180

aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgttc aagagatggt 300

tactacggct actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aatggatcca tggcagagat gaagacc 27

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

attaagcttt cagaagccca tttgcga 27

Claims

1.一种分泌抗CFP-10抗体的杂交瘤细胞株或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO:C2019191。

2.一种抗CFP-10抗体，由保藏号为CCTCC NO:C2019191的杂交瘤细胞株或其传代细胞株产生。

3.一种抗CFP-10抗体，所述抗CFP-10抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的CDR-L1、氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的CDR-L2、氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的CDR-L3，所述重链可变区的CDR包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的CDR-H1、氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的CDR-H2、氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的CDR-H3。

4.如权利要求3所述的抗CFP-10抗体，其特征在于，所述抗CFP-10抗体为单克隆抗体；和/或，所述抗CFP-10抗体的轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；

和/或，所述抗CFP-10抗体的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列。

5.一种多核苷酸，编码如权利要求3-4任一权利要求所述的抗CFP-10抗体的重链可变区和/或轻链可变区或全长氨基酸。

6.一种构建体，含有如权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种抗体的表达系统，所述表达系统含有如权利要求6所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。

8.如权利要求2-4任一权利要求所述的抗CFP-10抗体的制备方法，包括如下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如权利要求7所述的抗体的表达系统，从而表达出所述的抗体，纯化分离出所述的抗体；

9.如权利要求2所述的抗CFP-10抗体、权利要求3-4任一项所述的抗CFP-10抗体、权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的构建体或权利要求7所述的抗体的表达系统在制备结核病的检测试剂中的用途。

10.一种用于检测结核病的cELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)选自以下任一：

1)支持介质和包被抗原；

2)包被有包被抗原的支持介质；

所述包被抗原为结核分枝杆菌CFP-10蛋白，CFP-10蛋白对人、牛及其他动物结核病的病原菌具有良好的特异性，提高了试剂盒检测的灵敏度；

(2)酶标抗体；所述酶标抗体为经过标记的权利要求2或权利要求3-4任一所述的抗CFP-10抗体。

11.根据权利要求10所述的结核病的cELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

a.所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的抗CFP-10抗体；

b.所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：1)底物显色液；2)稀释液；3)洗涤液；4)封闭液；5)阴性对照；6)阳性对照；7)终止液；

c.使用该试剂盒能对人和牛结核病及其他动物结核病进行高效率检测。