CN115433767A - 一种基于dna四面体的传感芯片、其制备方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于DNA四面体的传感芯片，还提供了其制备方法和装置。所述基于DNA四面体的传感芯片通过在DNA四面体修饰传感芯片的表面进行抗体功能化修饰制得。本发明制备的基于DNA四面体的传感芯片可以通过表面等离激元共振成像技术检测阿尔茨海默病，具有高通量、高灵敏度、芯片可重复使用的优点并且该方法表现出良好的疾病诊断性能。在目前缺乏阿尔茨海默病早期检测手段的情况下，本发明选用基于血液的检测方式，提供了一种用于阿尔茨海默病早期检测、无创检测的小型化设备。

Description

一种基于DNA四面体的传感芯片、其制备方法和装置

技术领域

本发明属于生物工程和医疗器械领域，具体涉及一种基于DNA四面体的传感芯片、其制备方法和装置。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)是最常见的一种神经退行性疾病，主要表现为认知的进行性和不可逆转的衰退。阿尔茨海默病及其他痴呆症作为全球第七大致死疾病，在2019年已经导致160万人失去生命。相比于2000年，每年因该疾病丧生的人数增加了100万。伴随着人口老龄化的发展，AD患者人数与日俱增。然而，AD的精准诊断和有效治疗仍然是难以攻克的难题，如此严峻的形势给社会带来了巨大的经济负担。

随着临床症状逐渐明显，AD的进展被划分为临床前期、轻度认知障碍 (MCI)以及痴呆三个阶段。目前，临床上的诊断方式主要包括对病人及家族病史的考察、神经生理学测试、认知功能评估、磁共振成像、正电子发射断层扫描成像等。这些方法大多只能用于处于痴呆阶段以及出现明显临床症状的MCI阶段的诊断，并且影像学检查往往需要较高的成本，另外腰椎穿刺的采样方式会给患者带来巨大的痛苦。为了获得采样方便、小型化、低成本的早期检测设备，基于血液分析的检测技术得到了广泛的关注。设备本身的灵敏度和特异性以及其临床应用过程中的诊断灵敏度、特异性、准确率等参数都是评价基于血液分析的检测技术的重要指标。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基于DNA 四面体的传感芯片、其制备方法和装置。本发明基于DNA四面体的SPRi 传感芯片通过酰胺化反应偶联多种抗体，能够同时检测多种阿尔茨海默病相关的蛋白类生物标志物，实现痴呆以及轻度认知障碍患者和正常人的血浆样本的有效区分。

在阐述发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“AD”是指：阿尔茨海默病。

术语“Aβ40”是指：β-淀粉样蛋白40。

术语“Aβ42”是指：β-淀粉样蛋白42。

术语“Anti-Aβ42”是指：β-淀粉样蛋白40抗体。

术语“Anti-Aβ42”是指：β-淀粉样蛋白42抗体。

术语“Anti-GFAP”是指：胶质纤维酸性蛋白抗体

术语“Anti-NFL”是指：神经纤维丝轻链蛋白抗体。

术语“Anti-Tau”是指：Tau蛋白抗体。

术语“Anti-p-Tau”是指：磷酸化的Tau蛋白抗体。

术语“Anti-p-Tau181”是指：181位磷酸化的Tau蛋白抗体。

术语“Anti-p-Tau217”是指：217位磷酸化的Tau蛋白抗体。

术语“AUC”是指：曲线下面积。

术语“bp”是指：碱基对。

术语“BSA”是指：牛血清白蛋白。

术语“EDC”是指：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

术语“HAS”是指：人血清白蛋白。

术语“IgG”是指：免疫球蛋白G。

术语“IgM”是指：免疫球蛋白M。

术语“Ladder”是指：梯形条带。

术语“MCI”是指：轻度认知障碍。

术语“NC”是指：健康对照。

术语“NFL”是指：神经纤维丝轻链蛋白。

术语“NHS”是指：氮-羟基琥珀酰亚胺。

术语“PBS”是指：磷酸盐缓冲液。

术语“ROC”是指：受试者工作特性曲线。

术语“SPR”是指：表面等离激元共振。

术语“SPRi”是指：SPR成像。

术语“TM”是指：三羟甲基氨基甲烷-镁离子缓冲溶液。

术语“TRF”是指：转铁蛋白。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基于DNA四面体的传感芯片，所述基于DNA四面体的传感芯片通过将所述DNA四面体与传感芯片的表面结合，并进行抗体功能化修饰而制得；其中：

所述DNA四面体为由DNA链形成的四面体结构，并且，所述DNA 四面体的每条边长的碱基对数为15～30bp，优选为20～30bp，最优选为26 bp。

根据本发明第一方面的基于DNA四面体的传感芯片，其中，

形成所述DNA四面体的DNA链的序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

根据本发明第一方面的基于DNA四面体的传感芯片，其中，

所述传感芯片选自以下一种或多种：表面等离激元共振(SPR)传感芯片、SPR成像(SPRi)传感芯片、化学传感芯片、电化学传感芯片、石英晶体微天平传感芯片、表面增强拉曼传感芯片、微流控芯片、液体芯片、悬浮芯片、电阻/电导/阻抗传感芯片、场效应晶体管传感芯片；和/或

形成所述DNA四面体的各三角形的平面尺寸相同且在基底上均匀分散；

优选地，所述DNA四面体的底部三角形的三个顶点各带一个巯基，顶部延伸出DNA链；

更优选地，所述顶部延伸出DNA链为带有羧基修饰DNA双链；

更优选地，所述顶部延伸出DNA链的碱基对数为10～17bp，进一步优选为13～17bp，最优选为15bp；和/或

更优选地，所述顶部延伸出DNA链的条数为1～4条，进一步优选为 1～3条，最优选为1条。

本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的基于DNA四面体的传感芯片的方法，所述方法包括：

将所述DNA四面体与传感芯片的表面结合，并进行抗体功能化修饰而制得，其中：所述结合优选为巯基键合，所述抗体功能化修饰优选为酰胺化反应修饰；

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备DNA单链混合溶液，经退火处理后制得DNA四面体溶液；

(2)将步骤(1)制备的DNA四面体溶液与传感芯片键合，得到DNA 四面体修饰的传感芯片；和

(3)将步骤(2)制备的DNA四面体修饰的传感芯片进行活化后，加入抗体孵育，洗涤干燥后得到抗体功能化基于DNA四面体的传感芯片。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(1)中还包括：先将 DNA单链制成DNA单链母液，再将所述DNA单链母液与缓冲液混合制得 DNA单链混合溶液；

优选地，所述DNA单链的序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3、SEQID NO.4和SEQ ID NO.5；

优选地，所述缓冲液为TM缓冲液；所述缓冲液的pH值优选为7.5～8.5，更优选为8；和/或

优选地，所述DNA单链混合溶液中所述DNA单链的浓度为0.4～5.0 μmol/L，进一步优选为0.4～2.0μmol/L，最优选为1.0μmol/L。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(1)中，所述退火处理的过程包括升温反应和降温反应；

优选地，所述升温反应的反应温度为95℃；

优选地，所述升温反应的时间为2～10min，更优选为4～9min，进一步优选为8min；

优选地，所述降温反应的时间为大于30s，更优选为大于3min，最优选为8min；和/或

优选地，所述降温反应的反应温度为4℃。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(2)中还包括：将步骤 (1)制备的DNA四面体溶液平铺在传感芯片表面，孵育，使所述DNA 四面体与所述传感芯片键合，清洗，得到DNA四面体修饰的传感芯片；

优选地，所述孵育的时间为10～25h，更优选为10～20h，进一步优选为 12h。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(3)中还包括：将步骤 (2)制备的DNA四面体修饰的传感芯片浸没在活化剂中进行羟基活化，清洗并吹干，加入抗体孵育；

优选地，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)和氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液；

优选地，所述抗体选自以下一种或多种：Anti-Aβ40、Anti-Aβ42、 Anti-NFL、Anti-Tau、Anti-p-Tau、Anti-p-Tau181、Anti-p-Tau217、Anti-GFAP，更优选为Anti-Aβ42、Anti-NFL、Anti-Tau；

优选地，每个样品点滴加所述抗体的体积为0.4～1.0μL，更优选为 0.4～0.5μL，最优选为0.4μL；和/或

优选地，所述孵育的时间为10～25h，更优选为10～20h，进一步优选为 12h。

根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(3)中在孵育后还包括：清洗芯片并封闭其余的活化羧基，洗涤干燥后得所述抗体功能化基于DNA 四面体的传感芯片；

优选地，所述封闭其余的活化羧基所使用的溶液选自以下一种或多种：牛血清白蛋白、脱脂奶粉、乙醇胺，最优选为牛血清白蛋白。

本发明的第三方面提供了一种阿尔茨海默病的检测装置，所述阿尔茨海默病的检测装置包括第一方面所述的基于DNA四面体的传感芯片或根据第二方面所述的方法制备的基于DNA四面体的传感芯片。

具体地，如前所述DNA单链SEQ ID NO.1-5的序列如下：

SEQ ID NO.1：

GCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAG GTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCCTTTTTTTTTTGTA TCCAGTGGCTCA；

SEQ ID NO.2：

SH-CGCGCACCTGAGACCTTCTAATAGGGTTTGCGACAGTCGTTCAACT AGAATGCCCTTTGGGCTGTTCCGGGTGTGGCTCGTCGG(由于核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体无法识别SH-，SEQ IDNO.2以说明书此处记载的进行了5’巯基修饰的序列为准)；

SEQ ID NO.3：

SH-GGCCGAGGACTCCTGCTCCGCTGCGGTTTGGCGAACTGGTCCCGT CTACTTACCGTTTCCGACGAGCCACACCCGGAACAGCCC(由于核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体无法识别SH-，SEQ IDNO.3以说明书此处记载的进行了5’巯基修饰的序列为准)；

SEQ ID NO.4：

SH-GCCGTAATGTGCATGTATCTCCAGGCTTTCCGCAGCGGAGCAGGA GTCCTCGGCCTTTGGGCATTCTAGTTGAACGACTGTCGC(由于核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体无法识别SH-，SEQ IDNO.4以说明书此处记载的进行了5’巯基修饰的序列为准)；

SEQ ID NO.5：HOOC-TGAGCCACTGGATAC(由于核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体无法识别HOOC-，SEQ ID NO.5以说明书此处记载的进行了5’羧基修饰的序列为准)；

其中，SEQ ID NO.1含有109个碱基；SEQ ID NO.2-4各包含84个碱基并且都进行了5’巯基修饰；SEQ ID NO.5包含15个碱基并且进行了5’羧基修饰。

根据一个优选的实施方案，本发明基于DNA四面体的SPRi传感芯片的制备方法包括以下步骤：

(1)DNA四面体的合成：

在DNA四面体合成时，首先要溶解DNA单链制成DNA单链母液，将序列为SEQ IDNO.1-5所示的DNA序列的冻干品在3000-5000rpm的转速下离心30-60s，取出后慢慢打开离心管，向其中加入适量的去离子水溶解得到浓度为100μmol/L的DNA单链母液以备后用。随后配制DNA四面体合成时所用的TM缓冲溶液，取1-3mmol三羟甲基氨基甲烷和2.5-7.5 mmol六水合氯化镁溶解于50-150mL去离子水中，调节溶液pH在7.5-8.5 范围内。接下来，将五条DNA单链母液按照等比例混合稀释在上述配制的 TM缓冲溶液中，稀释比例为80-120倍。随后向上述溶液中加入浓度为60 mmol/L的三(2-氯乙基)磷盐酸盐，稀释比例为16-24倍。将上述溶液充分混匀后制得DNA单链混合溶液。将上述DNA单链混合溶液置于PCR热循环仪中，设置升温反应温度为95℃，反应时间为5-10min；设置降温反应温度为4℃，反应时间为5-10min。充分反应过后获得DNA四面体溶液。

(2)DNA四面体修饰的SPRi传感芯片的制备：

将上述制备的DNA四面体溶液平铺在SPRi镀金芯片的表面，确保 DNA四面体覆盖在整个点样区域内。取洁净的培养皿放入湿润的洁净滤纸，随后将芯片放在4℃的环境中孵育10-20小时，使DNA四面体通过巯基与镀金芯片表面键合。用去离子水清洗2-3次，洗掉多余的DNA四面体，即可获得DNA四面体修饰的SPRi传感芯片的制备。

(3)抗体功能化基于DNA四面体的SPRi传感芯片的制备：

首先需要配制羧基活化剂，活化剂中包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。取4-8mmol的 EDC和1-2mmol的NHS溶解于10-20mL去离子水中，充分混匀后制得活化剂。将上述DNA四面体修饰的SPRi传感芯片浸没在活化剂中进行羧基活化，反应时间为10-30min。充分反应后，用去离子水清洗芯片2-3次，洗掉多余的活化剂。使用氮气吹干芯片，在芯片的点样区域滴加多种抗体，每种抗体滴加三次，每滴体积为0.4-0.5μL，每种抗体各排成一列，最终形成3×3或4×4或5×5的阵列。取底部铺有湿润滤纸的洁净培养皿，将上述芯片置于其中，在4℃的环境中孵育10-20h后，用去离子水洗掉多余的抗体。再将芯片浸没于5％的牛血清白蛋白(BSA)或5％脱脂奶粉或浓度为1mol/L盐酸乙醇胺溶液中2小时，封闭其余的活化羧基。随后芯片经洗涤，干燥后制得抗体功能化基于DNA四面体的SPRi传感芯片。

本发明制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片通过偶联多种阿尔茨海默病相关蛋白类生物标志物的抗体，可以实现对阿尔茨海默病相关蛋白类生物标志物的同时检测，具有高通量、低成本、高灵敏度的特点。本发明的应用范围不限于此，基于DNA四面体的SPRi传感芯片可以进行化学分子、抗体、抗原、多肽、核酸、核酸适配体等受体功能化修饰，可用于疾病的诊断、预后、疗效预测、疗效跟踪等的多指标同时检测分析。

本发明的基于DNA四面体的SPRi传感芯片，在DNA四面体修饰镀金芯片表面通过酰胺化反应进行抗体功能化修饰。本发明制备的基于DNA 四面体的SPRi传感芯片可以通过表面等离激元共振成像技术检测阿尔茨海默病，具有高通量、高灵敏度、芯片可重复使用的优点并且该方法表现出良好的疾病诊断性能。在目前缺乏阿尔茨海默病早期检测手段的情况下，本发明选用基于血液的检测方式，提供了一种用于阿尔茨海默病早期检测、无创检测的小型化设备。

本发明的基于DNA四面体的传感芯片可以具有但不限于以下有益效果：

1、本发明成功制备了基于DNA四面体的SPRi传感芯片，并且通过多个靶点的抗体功能化修饰该芯片，功能化后的芯片可以应用于三种阿尔茨海默病蛋白类生物标志物的同时检测。

2、本发明合成了一种与抗体尺寸相近的DNA四面体结构，在保证空间最大利用率的同时为偶联在DNA四面体顶部的抗体与生物标志物结合时提供了足够的空间，使抗体的活性位点充分暴露，便于抗体与生物标志物的结合；另外，DNA四面体结构顶部延伸出一条包含15个碱基的DNA 链，为连接在其顶端的抗体提供了一定的灵活性，为抗原和抗体的结合提供便利。上述方案是提高芯片检测灵敏度做出的努力。

3、在基于DNA四面体的SPRi传感芯片可以同时偶联3-5种抗体，这意味着可以对多种疾病相关的生物标志物提供同时检测，与单一指标的检测方式相比，诊断的准确性将会被提高。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了实施例1中所述DNA四面体结构示意图。

图2示出了实施例1中所述DNA四面体的琼脂糖凝胶电泳表征结果。

图3示出了实施例1中DNA四面体的原子力显微镜表征结果。

图4示出了实施例1中基于DNA四面体的SPRi传感芯片偶联抗体时在基于SPR信号响应曲线。

图5示出了试验例1中芯片制备及生物标志物检测过程中的SPR信号变化。

图6示出了试验例3中偶联了抗体的点样区与被BSA封闭的非点样区之间的SPR信号差异。

图7示出了试验例3中偶联Aβ42、NFL、Tau蛋白抗体的基于DNA四面体的SPRi传感芯片与血浆中常见蛋白IgG、IgM、BSA和TRF结合的 SPR信号；其中，图7(a)示出了偶联Aβ42蛋白抗体的基于DNA四面体的SPRi传感芯片与血浆中常见蛋白IgG、IgM、BSA和TRF结合的SPR信号；图7(b)示出了偶联NFL蛋白抗体的基于DNA四面体的SPRi传感芯片与血浆中常见蛋白IgG、IgM、BSA和TRF结合的SPR信号；图7 (c)示出了偶联Tau蛋白抗体的基于DNA四面体的SPRi传感芯片与血浆中常见蛋白IgG、IgM、BSA和TRF结合的SPR信号。

图8示出了试验例4中Tau蛋白在稀释血浆中浓度与SPR信号的线性相应关系。

图9示出了试验例5中AD、MCI以及NC组临床血浆样本的Aβ42、 NFL以及Tau蛋白受试者工作特性曲线(ROC)和曲线下面积(AUC)分析结果。

图10示出了基于DNA四面体的SPRi传感芯片制备及检测过程示意图；其中，图10(a)示出了基于DNA四面体的SPRi传感芯片的制备过程；图10(b)示出了传感芯片在SPRi系统中检测生物标志物的原理。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

试剂：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)、人血清白蛋白(HAS)、人血清免疫球蛋白G (IgG)、人转铁蛋白(TRF)、琼脂糖购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；三 (2-羧乙基)磷盐酸盐(TCEP)购自陶术生物科技有限公司；氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自阿拉丁试剂有限公司；六水合氯化镁和镀金芯片购自华力德科技有限公司；DNA 引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；β-淀粉样蛋白1-42抗体(Anti-Aβ42)、68kDa神经纤维丝轻链蛋白抗体(Anti-NFL)、68kDa神经纤维丝轻链蛋白(NFL)、人免疫球蛋白M(IgM)购自艾博抗贸易有限公司；β- 淀粉样蛋白1-42(Aβ42)购自国平药业有限公司；Tau蛋白抗体(Anti-Tau) 和Tau蛋白购自义翘神州生物技术有限公司。

仪器：

实时动态扫描探针显微系统(型号：Fast scan Bruker，厂家：布鲁克科技有限公司，德国)，电泳仪(型号：DYY-6C，厂家：北京市六一仪器厂，中国)凝胶成像分析仪(型号：G:BOX Chemi XL1.4，厂家：伯乐生命医学产品有限公司，美国)PCR热循环仪(型号：VeritiFAST，厂家：朗基科学仪器有限公司，美国)和高通量生物分子相互作用仪(型号：PlexArrayTMHT，厂家：普勒克斯生物科技有限公司，美国)。

实施例1

本实施例用于说明本发明基于DNA四面体的SPRi传感线片的制备方法，包括如下步骤：

(1)DNA四面体的合成

本发明的DNA单链的序列为SEQ ID NO.1-5所示的DNA序列。

在DNA四面体合成时，首先要溶解DNA单链制成DNA单链母液，序列为SEQ ID NO.1-5所示的DNA序列的冻干品在4000rpm的转速下离心 30s，取出后慢慢打开离心管，向其中加入适量的去离子水溶解得到浓度为100μmol/L的DNA单链母液以备后用。随后配制DNA四面体合成时所用的 TM缓冲溶液，取2mmol三羟甲基氨基甲烷和5mmol六水合氯化镁溶解于100mL去离子水中，调节溶液pH为8。接下来，将五条DNA单链母液按照体积比为1：1：1：1：1的比例混合稀释在上述配制的TM缓冲溶液中，各 DNA单链的最终浓度均为1.0μmol/L。随后向上述溶液中加入浓度为60 mmol/L的三(2-氯乙基)磷盐酸盐，三(2-氯乙基)磷盐酸盐的最终浓度为 3mmol/L。将上述溶液充分混匀后制得DNA单链混合溶液。将上述DNA单链混合溶液置于PCR热循环仪中，设置升温反应温度为95℃，反应时间为8 min；设置降温反应温度为4℃，反应时间为8min。充分反应过后获得DNA 四面体溶液。

图1为本发明中DNA四面体的结构示意图。该结构长约10nm，高约6 nm，底部三角形的三个顶点各带有一个巯基，DNA四面体顶部延伸出一条 15个碱基对(bp)的DNA链结构的顶端带有一个羧基，可用于偶联抗体。

图2为本发明所制备的DNA四面体的琼脂糖凝胶电泳表结果。图片从左到右分别为梯形条带(Ladder)、仅包含A链、仅包含A、B链、仅包含A、 B、C链、仅包含A、B、C、D链和包含A、B、C、D、L链(DNA四面体) 的条带。DNA四面体由于具有最多的bp，所以在琼脂糖凝胶中的移动速度最慢，位于条带的最上方。另外，图片中DNA四面体的条带位于150-200bp 的范围内，与DNA四面体的理论碱基对数170bp相符。上述结果支持DNA 四面体成功制备的结论。

图3为本发明所制备的DNA四面体的原子力显微镜表征结果。图片展示了所制备的DNA四面体三角形的平面结构，该结构形态大小基本一致且在基底上均匀分散。上述结果支持DNA四面体成功制备的结论。

(2)DNA四面体修饰的SPRi传感芯片的制备：

将上述制备的DNA四面体溶液平铺在SPRi镀金芯片的表面，确保DNA 四面体覆盖在整个点样区域内。取洁净的培养皿放入湿润的洁净滤纸，随后将芯片放在4℃的环境中孵育12小时，使DNA四面体通过巯基与镀金芯片表面键合。用去离子水清洗3次，洗掉多余的DNA四面体，即可获得DNA 四面体修饰的SPRi传感芯片的制备。

(3)抗体功能化基于DNA四面体的SPRi传感芯片的制备：

首先需要配制羧基活化剂，活化剂中包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。取6mmol的EDC和 1.5mmol的NHS溶解于15mL去离子水中，充分混匀后制得活化剂。将上述DNA四面体修饰的SPRi传感芯片浸没在活化剂中进行羧基活化，反应时间为15min。充分反应后，用去离子水清洗芯片3次，洗掉多余的活化剂。使用氮气吹干芯片，在芯片的点样区域滴加多种抗体，本实施例所使用的抗体为：Anti-Aβ42、Anti-NFL、Anti-Tau，每种抗体滴加三次，每滴体积为0.4 μL，每种抗体各排成一列，最终形成3×3的阵列。取底部铺有湿润滤纸的洁净培养皿，将上述芯片置于其中，在4℃的环境中孵育12h后，用去离子水洗掉多余的抗体。再将芯片浸没于5％的牛血清白蛋白(BSA)中2小时，封闭其余的活化羧基。随后芯片经洗涤，干燥后制得抗体功能化基于DNA四面体的SPRi传感芯片。

图4为基于DNA四面体的SPRi传感芯片偶联抗体时在基于SPR信号响应曲线。随着抗体的注入，SPR信号逐渐增加并最终稳定在数值，该曲线可以说明采用上述方法制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片可以实现抗体偶联。

试验例1

本试验例用于测试基于DNA四面体的SPRi传感芯片制备过程中相关试剂在芯片表面的结合情况以及抗体功能化芯片结合生物标志物的情况。

(1)将制备的DNA四面体修饰在镀金芯片表面，洗涤并使用氮气吹干芯片，加盖后制得DNA四面体修饰的SPRi传感芯片。

(2)将步骤(1)中制得的芯片安装在SPRi仪器上，进行测定。

(3)选择无酶PBS作为缓冲液获得稳定的SPR基线信号。

(4)依次注入按实施例1中的方法配制的羧基活化剂、BSA封闭剂以及 1000倍稀释的抗体稀释液和100倍稀释的蛋白质稀释液，设置流速0.2μL/s，结合时间900s，解离时间300s。

图5显示，抗体偶联和生物标志物检测的关键过程中SPR信号均有所增加并且最终稳定在某一数值，上述曲线变化再次说明抗体与芯片的偶联以及抗体功能化的芯片可以实现对相应抗原的检测。

试验例2

本试验例用于测试基于DNA四面体的SPRi传感芯片与生物标志物结合的亲和力，具体步骤如下：

(1)将实施例1方法制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片安装在 SPRi仪器上，进行测定，在检测区域选取相关的监测点，即样品点(根据软件呈现芯片点样区域的真实视野，从视野中可以看到先前滴加偶联抗体的区域，称为样品点，每个样品点仅包含偶联了抗体的区域)和非样品点(非样品点仅包含未偶联抗体的区域)，设置流动相的流速为2μL/s。

(2)选择无酶PBS作为缓冲液获得稳定的SPR基线信号。

(3)依次注入浓度分别为0.64nM、1.29nM、2.58nM、5.15nM和10.31 nM的Aβ42，结合时间设置为300s，解离时间设置为300s，每个浓度间通入1：500(体积比)稀释的磷酸溶液进行重生。

(4)依次注入浓度分别为2.96nM、5.92nM、11.84nM、23.68nM和 47.36nM的NFL，结合时间设置为300s，解离时间设置为300s，每个浓度间通入1：500(体积比)稀释的磷酸溶液进行重生。

(5)依次注入浓度分别为1.03nM、2.06nM、4.13nM、8.26nM和16.51 nM的Tau，结合时间设置为300s，解离时间设置为300s，每个浓度间通入 1：500(体积比)稀释的磷酸溶液进行重生。

上述实验的SPR曲线经拟合，得到Aβ42、NFL、Tau蛋白的平衡解离常数K_D值分别为1.68×10^-8mol/L、7.28×10^-9mol/L、1.22×10^-9mol/L。

试验例3

本试验例用于说明基于DNA四面体的SPRi传感芯片在血浆环境中检测阿尔茨海默病相关生物标志物时的特异性识别能力，具体步骤如下：

(1)将实施例1方法制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片安装在 SPRi仪器上，进行测定，在检测区域选取相关的监测点，即样品点(根据软件呈现芯片点样区域的真实视野，从视野中可以看到先前滴加偶联抗体的区域，称为样品点，每个样品点仅包含偶联了抗体的区域)和非样品点(非样品点仅包含未偶联抗体的区域)，设置流动相的流速为2μL/s。

(2)选择无酶PBS作为缓冲液获得稳定的SPR基线信号。

(3)依次注入浓度为3.2μg/mL的Aβ42、NFL、Tau蛋白、IgG、IgM、 HAS和TRF，结合时间设置为300s，解离时间设置为300s，每个样品间通入1：500(体积比)稀释的磷酸溶液进行重生。

图6展示的是偶联Tau蛋白抗体的区域(样品点)和未偶联抗体而被封闭剂占位的区域(非样品点)结合Tau蛋白时SPR信号的显著差异，说明本发明所制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片的样品点区域检测生物标志物时表现出良好的特异性。

图7(a)显示了Anti-Aβ42偶联的样品点区域在检测Aβ42及血浆中含量较为丰富的IgG、IgM、HAS和TRF时，表现出对Aβ42良好的特异性。类似地，图7(b)和(c)说明Anti-NFL以及Anti-Tau表现出对其相应靶蛋白良好的特异性。基于DNA四面体的SPRi传感芯片用于检测阿尔茨海默病相关生物标志物时几乎不会受到IgG、IgM、HAS和TRF的干扰，说明该芯片在血浆环境中检测生物标志物时表现出良好的特异性。

试验例4

本试验例用于测试基于DNA四面体的SPRi传感芯片检测生物标志物的线性曲线，具体操作步骤如下：

(1)将实施例1方法制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片安装在 SPRi仪器上，进行测定，在检测区域选取相关的监测点，即样品点(根据软件呈现芯片点样区域的真实视野，从视野中可以看到先前滴加偶联抗体的区域，称为样品点，每个样品点仅包含偶联了抗体的区域)，设置流动相的流速为2μL/s。

(2)选择无酶PBS作为缓冲液获得稳定的SPR基线信号。

(3)依次注入由稀释血浆配制而成的浓度为1nmol/L、10nmol/L、20 nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、100nmol/L的Tau蛋白，结合时间设置为300 s，解离时间设置为300s，每个浓度间通入1：500(体积比)稀释的磷酸溶液进行重生。

图8显示了稀释血浆中Tau蛋白浓度与SPR信号之间的线性依赖关系，在1-100nmol/L的范围内，可以通过检测到的SPR信号定量Tau蛋白的浓度。

试验例5

本试验例用于说明基于DNA四面体的SPRi传感芯片检测阿尔茨海默病患者(包括AD和MCI)以及健康对照组血浆稀释液的信号差异，具体步骤如下：

(1)将实施例1方法制备的基于DNA四面体的SPRi传感芯片安装在 SPRi仪器上，进行测定，在检测区域选取相关的监测点，即样品点(根据软件呈现芯片点样区域的真实视野，从视野中可以看到先前滴加偶联抗体的区域，称为样品点，每个样品点仅包含偶联了抗体的区域)，设置流动相的流速为2μL/s。

(2)选择无酶PBS作为缓冲液获得稳定的SPR基线信号。

(3)依次注入不同患者(包括AD和MCI)以及健康对照组血浆稀释液(1：500)，结合时间设置为300s，解离时间设置为300s，每个样品间通入 20mmol/L的氢氧化钠进行重生。

根据对不同样本的SPR信号检测结果的分析，绘制了AD、MCI以及NC 组临床血浆样本的Aβ42、NFL以及Tau蛋白受试者工作特性曲线(ROC)并获得了曲线下面积(AUC)，如图9所示。在区分AD和NC组时，同时引入 Aβ42、NFL以及Tau蛋白的多靶点检测方法可以实现100％的诊断灵敏度和 93.3％诊断特异性[95％置信区间(0.918～1.000)]，曲线下面积达到0.973；对于人们密切关注的MCI和NC组的区分，多靶点的检测方法可以实现53.3％的诊断灵敏度和100％的诊断特异性[95％置信区间(0.641～0.959)]，曲线下面积达到0.800。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

序列表

<110> 国家纳米科学中心

<120> 一种基于DNA四面体的传感芯片、其制备方法和系统

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctggagat acatgcacat tacggctttc cctattagaa ggtctcaggt gcgcgtttcg 60

gtaagtagac gggaccagtt cgcctttttt ttttgtatcc agtggctca 109

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcgcacctg agaccttcta atagggtttg cgacagtcgt tcaactagaa tgccctttgg 60

gctgttccgg gtgtggctcg tcgg 84

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggccgaggac tcctgctccg ctgcggtttg gcgaactggt cccgtctact taccgtttcc 60

gacgagccac acccggaaca gccc 84

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccgtaatgt gcatgtatct ccaggctttc cgcagcggag caggagtcct cggcctttgg 60

gcattctagt tgaacgactg tcgc 84

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagccactg gatac 15

Claims (10)

1.一种基于DNA四面体的传感芯片，其特征在于，所述基于DNA四面体的传感芯片通过将所述DNA四面体与传感芯片的表面结合，并进行抗体功能化修饰而制得；其中：

所述DNA四面体为由DNA链形成的四面体结构，并且，所述DNA四面体的每条边长的碱基对数为10～30bp，优选为20～30bp，最优选为26bp。

2.根据权利要求1所述的基于DNA四面体的传感芯片，其特征在于：

形成所述DNA四面体的DNA链的序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。

3.根据权利要求1或2所述的基于DNA四面体的传感芯片，其特征在于：

所述传感芯片选自以下一种或多种：表面等离激元共振(SPR)传感芯片、SPR成像(SPRi)传感芯片、化学传感芯片、电化学传感芯片、石英晶体微天平传感芯片、表面增强拉曼传感芯片、微流控芯片、液体芯片、悬浮芯片、电阻/电导/阻抗传感芯片、场效应晶体管传感芯片；和/或

形成所述DNA四面体的各三角形的平面尺寸相同且在基底上均匀分散；

优选地，所述DNA四面体的底部三角形的三个顶点各带一个巯基，顶部延伸出DNA链；

更优选地，所述顶部延伸出DNA链为带有羧基修饰DNA双链；

更优选地，所述顶部延伸出DNA链的碱基对数为10～17bp，进一步优选为15～17bp，最优选为15bp；和/或

更优选地，所述顶部延伸出DNA链的条数为1～4条，进一步优选为1～3条，最优选为1条。

4.制备权利要求1至3中任一项所述的基于DNA四面体的传感芯片的方法，其特征在于，所述方法包括：

将所述DNA四面体与传感芯片的表面结合，并进行抗体功能化修饰而制得，其中：所述结合优选为巯基键合，所述抗体功能化修饰优选为酰胺化反应修饰；

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备DNA单链混合溶液，经退火处理后制得DNA四面体溶液；

(2)将步骤(1)制备的DNA四面体溶液与传感芯片键合，得到DNA四面体修饰的传感芯片；和

(3)将步骤(2)制备的DNA四面体修饰的传感芯片进行活化后，加入抗体孵育，洗涤干燥后得到抗体功能化基于DNA四面体的传感芯片。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中还包括：先将DNA单链制成DNA单链母液，再将所述DNA单链母液与缓冲液混合制得DNA单链混合溶液；

优选地，所述DNA单链的序列包括：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5；

优选地，所述缓冲液为TM缓冲液，所述缓冲液的pH值优选为7.5～8.5，更优选为8；和/或

优选地，所述DNA单链混合溶液中所述DNA单链的浓度为0.4～5.0μmol/L，进一步优选为0.4～2.0μmol/L，最优选为1.0μmol/L。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述退火处理的过程包括升温反应和降温反应；

优选地，所述升温反应的反应温度为95℃；

优选地，所述升温反应的时间为2～10min，更优选为4～9min，进一步优选为8min；

优选地，所述降温反应的时间为大于30s，更优选为大于3min，最优选为8min；和/或

优选地，所述降温反应的反应温度为4℃。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中还包括：将步骤(1)制备的DNA四面体溶液平铺在传感芯片表面，孵育，使所述DNA四面体与所述传感芯片键合，清洗，得到DNA四面体修饰的传感芯片；

优选地，所述孵育的时间为10～25h，更优选为10～20h，进一步优选为12h。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中还包括：将步骤(2)制备的DNA四面体修饰的传感芯片浸没在活化剂中进行羟基活化，清洗并吹干，加入抗体孵育；

优选地，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和氮-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液；

优选地，所述抗体选自以下一种或多种：Anti-Aβ40、Anti-Aβ42、Anti-NFL、Anti-Tau、Anti-p-Tau、Anti-p-Tau181、Anti-p-Tau217、Anti-GFAP，更优选为Anti-Aβ42、Anti-NFL、Anti-Tau；

优选地，每个样品点滴加所述抗体的体积为0.4～1.0μL，更优选为0.4～0.5μL，最优选为0.4μL；和/或

优选地，所述孵育的时间为10～25h，更优选为10～20h，进一步优选为12h。

9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中在孵育后还包括：清洗芯片并封闭其余的活化羧基，洗涤干燥后得所述抗体功能化基于DNA四面体的传感芯片；

优选地，所述封闭其余的活化羧基所使用的溶液选自以下一种或多种：牛血清白蛋白、脱脂奶粉、乙醇胺，最优选为牛血清白蛋白。

10.一种阿尔茨海默病的检测装置，其特征在于，所述阿尔茨海默病的检测装置包括权利要求1至3中任一项所述的基于DNA四面体的传感芯片或根据权利要求4至9中任一项所述的方法制备的基于DNA四面体的传感芯片。

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