RU2530560C2 - Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител - Google Patents
Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител Download PDFInfo
- Publication number
- RU2530560C2 RU2530560C2 RU2012127078/15A RU2012127078A RU2530560C2 RU 2530560 C2 RU2530560 C2 RU 2530560C2 RU 2012127078/15 A RU2012127078/15 A RU 2012127078/15A RU 2012127078 A RU2012127078 A RU 2012127078A RU 2530560 C2 RU2530560 C2 RU 2530560C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- conjugate
- control zone
- binding
- immunochromatographic
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой способ получения межмолекулярных конъюгатов с коллоидным золотом, используемым в иммунохроматографическом анализе. В иммунохроматографических тест-системах наряду с аналитической зоной, предназначенной для связывания анализируемого соединения, как правило, используется контрольная зона, предназначенная для связывания соединения, конъюгированного с меткой. Нанесение контрольной зоны необходимо для того, чтобы контролировать функциональную активность реагента, конъюгированного с меткой. Если окрашивания контрольной зоны не наблюдается, результат теста признается недействительным. Однако в случае применения иммунохроматографии для определения антител в крови с меткой конъюгируется соединение, предназначенное для связывания антител - далее обозначаемое как ССвАт (соединение, связывающее антитела). При этом концентрация антител в пробе зачастую превышает концентрацию ССвАт, поэтому концентрация свободных молекул ССвАт оказывается очень низкой и исчезновение контрольной зоны в этом случае не свидетельствует о нарушении активности конъюгата. Для решения данной проблемы в настоящем изобретении предлагается добавлять к конъюгату антивидовые антитела против антител, сорбированных в контрольной зоне. В этом случае контрольная зона исчезает только в случае потери активности ССвАт. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях значительно ниже связывающей способности конъюгата, чтобы не мешать взаимодействию конъюгата с антителами пробы, вследствие чего не наблюдается значительного снижения чувствительности анализа. 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой метод получения межмолекулярных конъюгатов, которые используются в качестве маркера при иммунохроматографическом определении антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов (серодиагностике). Применительно к серодиагностике общая схема иммунохроматографии заключается в следующем: проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иная метка), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Обычно в качестве такого компонента используют антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов организма, для которого проводится серодиагностика), белок A из Staphylococcus aureus, белок G из Streptococcus spp. или иной реагент для связывания антител - далее обозначаемый как ССвАт (соединение, связывающее антитела). Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице (ССвАт), связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом (Рис.1).
Количество ССвАт, связанного с поверхностью метки, лимитировано сорбционной емкостью поверхности метки. В качестве метки наиболее часто используется коллоидное золото, а в качестве метода иммобилизации - простая физическая адсорбция белка на поверхности с последующим отделением неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием. В этом случае концентрация ССвАт в конечном объеме реакционной среды в порах мембран иммунохроматографического теста не превышает 0,1 мг/мл. Концентрация антител в сыворотке крови чаще всего превышает 5 мг/мл. При таком избытке антител концентрация свободного ССвАт быстро уменьшается при контакте с пробой, поэтому интенсивность окраски контрольной зоны значительно снижается, а в некоторых случаях исчезает полностью (Рис.2), вследствие чего можно сделать неверный вывод о непригодности теста. Некоторые производители по этой причине используют в тест-системах смесь из двух конъюгатов, один из которых (конъюгированный с ССвАт) предназначен для связывания в аналитической зоне и не взаимодействует с контрольной зоной, а второй взаимодействует только с контрольной зоной. Например, такой подход использован иммунохроматографических системах серодиагностики Salmonella typhi «Enterocheck-WB» фирмы "Zephyr Biomedicals" (Индия).
(http://www.tulipgroup.com/Zephyr_New/html/pack_inserts/Enterochek%20WB.pdf).
Однако в этом случае в контрольной и аналитической зоне связываются разные реагенты, и наличие или отсутствие окраски контрольной зоны не свидетельствует о потере или сохранении активности ССвАт. Нами предлагается иной подход, основанный на добавлении в конъюгат, полученный после адсорбции ССвАт на частицы коллоидного золота и отделения неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием, антивидовых антител против антител, сорбированных в контрольной зоне теста. Антивидовые антитела добавляются в концентрациях, существенно ниже связывающей способности конъюгата, поэтому данная добавка не приводит к существенному уменьшению чувствительности тест-системы, а контрольная зона образуется только при сохранении функциональной активности ССвАт, что повышает достоверность анализа.
Предложенный подход был реализован заявителями на примере серодиагностики бруцеллеза коров с использованием в качестве антигена липополисахарида (ЛПС) Brucella abortus, в качестве ССвАт - рекомбинантного белка G, к которому добавляли козьи антитела против антител мыши, а в контрольной зоне сорбированы моноклональные мышиные антитела. Рекомбинантный белок G был использован нами, т.к. он обладает наибольшим сродством к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, однако для серодиагностики можно также использовать белок А, антивидовые антитела и другие реагенты для связывания антител. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.
Пример
Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали набор mdi Easypack («Advanced Microdevices», Индия), включающий рабочие мембраны CNPH90 с размером пор 15 мкм, подложку под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца FR1(0.6), конечную адсорбирующую мембрану АР045 и ламинирующую защитную пленку на клейкой основе МТ-1.
Иммобилизация белка G на частицах коллоидного золота. Белок G диализовали против 1,000-кратного объема 10 мМ карбонатного буфера, рН 9.0. К коллоидному золоту (D520=1,0) добавляли 0,1 М K2CO3 до достижения pH 9, а затем - белок G в концентрации 8 мкг/мл. Смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре и перемешивании, после чего добавляли 10%-ный водный раствор БСА до конечной концентрации 0,25%.
Частицы коллоидного золота отделяли от неиммобилизовавшегося белка 30-минутным центрифугированием при 6.000 g, ресуспендируя осадок в 50 мМ K-фосфатном буфере, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (PBS), содержащем 0,25% БСА.
Нанесение реагентов на иммунохроматографические мембраны. Конъюгат коллоидного золота с белком G наносили на стекловолоконную мембрану (PT-R5, «Advanced Microdevices», Индия) в разведении, соответствующем D520=10,0, в объеме 11 мкл на 1 см полосы с помощью диспенсера IsoFlow фирмы «Imagene Technology» (США). В первом случае (немодифицированная методика) на мембрану наносился только конъюгат с белком G, во втором случае (модифицированная методика) конъюгат с белком G предварительно смешивался с козьими антителами против иммуноглобулинов мыши («Arista Biologicals Inc.» (США)) в концентрации 10 мкг/мл.
Для формирования аналитической зоны использовали препарат ЛПС, выделенный из бактерий Brucella abortus (Национальный центр биотехнологии, Астана, Казахстан). На 1 см полосы наносили 2 мкл препарата ЛПС (1,0 мг/мл в дистиллированной воде).
Для формирования контрольной зоны в первом случае использовали кроличьи антитела против иммуноглобулинов крупного рогатого скота производства фирмы «Имтек» (Россия), на 1 см полосы наносили 2 мкл антител (0, 5 мг/мл в PBS); во втором случае - мышиные моноклональные антитела (Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия)).
Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Тест-полоску в вертикальном положении погружали на 5 мин в анализируемую сыворотку крови, затем извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и через 5 мин визуально контролировали результат иммунохроматографического анализа.
Как видно из рис.3, предложенная схема позволяет увеличить интенсивность контрольной зоны тест-системы. При этом, так как добавленная к коллоидному конъюгату концентрация антивидовых антител значительно ниже концентрации белка G в конъюгате, потери интенсивности окраски аналитической зоны иммунохроматографического теста не наблюдается.
Рис.1. Принцип иммунохроматографического определения специфических антител.
Рис.2. Связывание конъюгата коллоидного золота и белка G в контрольной зоне тест-полоски А. в буферном растворе, не содержащем антител, и Б. в сыворотке крови.
Рис.3. Тестирование иммунохроматографических систем, изготовленных А. по традиционной методике и Б. по методике, предложенной заявителями (с использованием конъюгата коллоидного золота с рекомбинантным белком G и антивидовыми антителами) на сыворотке коровы, больной бруцеллезом.
Claims (1)
- Способ получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического определения специфических антител, основанный на адсорбционном формировании комплексов между частицами коллоидного золота и соединением, специфически связывающим антитела, с последующим отделением неадсорбированных молекул с помощью осаждения частиц коллоидного золота центрифугированием, отличающийся тем, что к полученному комплексу частиц коллоидного золота и соединения, специфически связывающего антитела, перед проведением иммунохроматографического определения добавляют антивидовые антитела против антител, иммобилизованных в иммунохроматографической тест-системе, благодаря чему часть адсорбированных на частице коллоидного золота молекул, специфически связывающих антитела, сохраняет способность взаимодействовать с определяемыми антителами в пробе, а часть блокируется добавленными антителами.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012127078/15A RU2530560C2 (ru) | 2012-06-28 | 2012-06-28 | Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012127078/15A RU2530560C2 (ru) | 2012-06-28 | 2012-06-28 | Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012127078A RU2012127078A (ru) | 2014-01-20 |
RU2530560C2 true RU2530560C2 (ru) | 2014-10-10 |
Family
ID=49944590
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012127078/15A RU2530560C2 (ru) | 2012-06-28 | 2012-06-28 | Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2530560C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2761003C1 (ru) * | 2020-09-02 | 2021-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения конъюгатов коллоидного золота с иммуноглобулинами при изготовлении иммунохроматографических тест-систем |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115166238A (zh) * | 2022-08-02 | 2022-10-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6265176B1 (en) * | 1985-10-29 | 2001-07-24 | Cordis Corporation | Dot immunoassay on plastic sheets |
RU2296995C2 (ru) * | 2003-06-20 | 2007-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах |
RU77687U1 (ru) * | 2008-06-24 | 2008-10-27 | Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (ФГУП Гос НИИ БП) | Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов |
RU2360252C1 (ru) * | 2008-04-09 | 2009-06-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" ("РосНИПЧИ "Микроб") | Диагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа |
RU2497126C2 (ru) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "РЭД" | Способ снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений |
-
2012
- 2012-06-28 RU RU2012127078/15A patent/RU2530560C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6265176B1 (en) * | 1985-10-29 | 2001-07-24 | Cordis Corporation | Dot immunoassay on plastic sheets |
RU2296995C2 (ru) * | 2003-06-20 | 2007-04-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ многопрофильного иммунохимического выявления антигенов в жидких образцах |
RU2360252C1 (ru) * | 2008-04-09 | 2009-06-27 | Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" ("РосНИПЧИ "Микроб") | Диагностикум и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа |
RU77687U1 (ru) * | 2008-06-24 | 2008-10-27 | Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (ФГУП Гос НИИ БП) | Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов |
RU2497126C2 (ru) * | 2011-12-30 | 2013-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "РЭД" | Способ снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIENZ K, EGGER D, PASAMONTES L. Electron microscopic immunocytochemistry. Silver enhancement of colloidal gold marker allows double labeling with the same primary antibody. J. Histochem. Cytochem. 1986 Oct; 34(10), P. 1337-1342 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2761003C1 (ru) * | 2020-09-02 | 2021-12-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения конъюгатов коллоидного золота с иммуноглобулинами при изготовлении иммунохроматографических тест-систем |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012127078A (ru) | 2014-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102065387B1 (ko) | 측방 유동 및 관련된 면역검정에서의 신호 증폭 | |
CN101441210B (zh) | 纳米磁性粒子层析试纸检测方法 | |
JP6247741B2 (ja) | 検体不添加サンプルを操作不適サンプルと判定できるイムノクロマトグラフィーに基づく検出方法及びこれに用いるテストストリップ | |
US20120070822A1 (en) | Method for signal amplification during lateral-flow analysis | |
WO2007069673A1 (ja) | 多剤耐性ブドウ球菌のイムノクロマトグラフィー検出法および診断キット | |
JP6533206B2 (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエ検出用免疫クロマト分析装置 | |
WO2013147307A1 (ja) | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップおよびイムノクロマトグラフィーを利用した検出方法 | |
US20150010918A1 (en) | Immunochromatographic assay with minimal reagent manipulation | |
WO2007138964A1 (ja) | 免疫測定用ラテックス組成物 | |
RU2530560C2 (ru) | Метод получения межмолекулярных конъюгатов для иммунохроматографического опредеелния специфических антител | |
WO2014055995A1 (en) | Multi-analyte assay | |
JP6399632B2 (ja) | 赤血球含有サンプル中の対象物を検出するためのイムノクロマトグラフィー用テストストリップ、および該テストストリップを使用するイムノクロマトグラフィー | |
RU2532352C2 (ru) | Способ проведения иммунохроматографического анализа для серодиагностики | |
RU2395092C2 (ru) | Способ определения антител к возбудителю туберкулеза | |
Sotnikov et al. | Immunochromatographic assay for serodiagnosis of tuberculosis using an antigen–colloidal gold conjugate | |
RU2523393C1 (ru) | Тест-полоска для высокочувствительного иммунохроматографического анализа | |
RU2545909C2 (ru) | Способ иммунохроматографического определения специфических антител | |
CN107209179B (zh) | 用于检测含红细胞的样品中的对象物的免疫色谱用测试条、及使用该测试条的免疫色谱 | |
CN101871939A (zh) | 检测试剂盒及其应用方法 | |
JP2017133951A (ja) | 検体中の特定の細菌を検出する方法 | |
JP6676387B2 (ja) | 特定の細菌を検出するイムノクロマト方法及びそれに用いるキット | |
EP3885767A1 (en) | Test piece for immunochromatography and immunochromatographic detection kit | |
JP2004521325A (ja) | 標識されたレクチンを使用する炭水化物のための貫流膜アッセイ | |
Rudolf et al. | Differences in usability of rabbit IgG and chicken IgY after clean-up and impact on gold labelling properties | |
KR101311736B1 (ko) | 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 사용한 면역분석법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160629 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20170725 |