JP6190132B2 - 遺伝子試料導入用基板及び遺伝子試料導入方法 - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
導入促進ポリマーは、導入促進部位と、細胞親和性部位と、ターゲット結合部位とを含有している。導入促進部位は、遺伝子試料の細胞への導入を促進する部位であり、例えば、導入促進ポリマーの主鎖から枝分かれした細胞膜貫通性又は融合性のポリマー鎖を有している。細胞親和性部位は、細胞との親和性が高い部位であり、例えばリン脂質極性基を有している。また、細胞表面の抗原を特異的に認識する抗体等を細胞親和性部位とすることもできる。ターゲット結合部位は、遺伝子試料及び細胞と直接又は間接に結合する部位であり、アミノ基等と反応する反応性官能基を有している。ターゲット結合部位は、細胞接着性のフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、フィブリノーゲン、オステオスポンジシン、若しくはトロンビン等のタンパク質又はこれらに含まれる細胞接着性のセグメントでもよい。
導入促進ポリマーを固定する基板は、特に限定されない。例えば、ガラス基板、シリコン基板、ダイヤモンド様カーボン基板、若しくはセラミクス基板等の無機性基板、ITO(酸化インジウムスズ)、若しくは金・チタン・クロム等の金属性基板、又は樹脂基板等の有機性基板等を用いることができる。透明な基板は、工学的な観察が容易であり好ましい。これらの基板は、均一な平面を有する基板であってもよく、凸部又は凹部からなるスポットを有している基板であってもよい。基板の表面にスポットを設け、設けられたスポットに導入促進ポリマーを固定することにより、基板上において細胞を操作する位置を明確にすることができ、細胞の取り扱いが容易となる。また、複数のスポットを配列することにより、1つの基板で複数の細胞を取り扱うことも容易となる。中でも、ターゲット細胞の大きさに応じた凹部を有する基板が好ましい。ただし、基板の全面に導入促進ポリマーを固定してもよい。また、凸部又は凹部を設けていない基板においても、導入促進ポリマーを選択的に固定してもよい。
遺伝子試料を導入するターゲット細胞は、特に限定されない。浮遊性の細胞であってもよく、接着性の細胞であってもよい。例えば、間葉系幹細胞、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)等であってもよい。
ターゲット細胞に導入する遺伝子試料は、特に限定されない。例えば、DNA、DNA断片、DNAベクター、染色体、染色体断片、染色体ベクター等を用いることができる。数kbのDNA断片から数Mbの染色体断片、数十Mbの染色体まで細胞に導入することができる。DNAは二本鎖であっても一本鎖であてもよい。遺伝子試料は、遺伝子そのものに限られず、細胞に導入された場合に、何らかの形質を細胞に発現させる物質であればよい。例えば、タンパク質、ペプチド、又はウイルスベクター等であってもよい。
本実施形態の遺伝子試料導入用基板は、以下のようにして使用することができる。まず、遺伝子試料導入用基板に固定された導入促進ポリマーのターゲット結合部位に、第1の認識物質を結合させる。また、遺伝子試料を担持したマイクロセルを準備する。マイクロセルの表面には、第1の認識物質と結合する第2の認識物質と、第2の認識物質とは異なる第3の認識物質を導入する。次に、遺伝子試料を包摂させたマイクロセルを、遺伝子試料導入用基板に播種し、第1の認識物質と第2の認識物質とを結合させ、マイクロセルをターゲット結合部位に結合させる。次に、第3の認識物質と対となる第4の認識物質を有するターゲット細胞を遺伝子試料導入用基板に播種する。これにより、第3の認識物質と第4の認識物質とを結合させて、ターゲット細胞をマイクロセルと結合させる。これにより、基板に固定された導入促進ポリマーのターゲット結合部位に、マイクロセルに担持された遺伝子試料と、ターゲット細胞とが結合される。
−スポットの形成−
基板は、10mm角で厚さが0.21mmのガラス基板を用いた。基板の表面にクロム及びチタンの合金(Cr/Ti)膜及び金膜を順次堆積した後、選択的にエッチングして基板を露出させ、スポットを形成した。具体的には、成膜された金基板上にスピンコーターにより感光レジストをコーティングし、石英ガラス上にクロムコーティングされたフォトマスクを重ねる。クロムコーティングが施されていない箇所(ガラス露出部)は光を透過するため、そのガラス露出部を透過させ露光(紫外線照射)する。次に露光部のレジストを現像液により除去して、薬液を用いたウエットエッチングを行う。最後にアセトンにより残ったレジストを除去することにより、マイクロアレイを作製した。
まず、スポットを形成した基板にリンカーである3−アミノプロピルトリメトキシシラン(東京化成社製)を固定した。具体的には、3−アミノプロピルトリメトキシシラン179mgを2mlのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させた溶液に浸漬し、60℃で3時間反応させた。
・接触角:
接触角は、以下のようにして測定した。エルマ製ゴニオメータ式接触角測定機G−1型を用いてステージ温度を20℃とした後、基板上に15μlの水滴を置き接触角を測定した。測定は計5回のうち、最大値および最小値を除いた平均値を接触角とした。
スポット部分におけるポリマーのグラフト量は、グラフト前のマイクロアレイの重量とポリマーグラフト重合後のマイクロアレイの重量との差から求めた。
スポット部分に固定したポリマーの分子量(数平均分子量Mn)は、以下のようにして測定した。V501−Clを修飾したマイクロアレイをジフェニルピクリルヒドラジル(DPPH)1.0×10−4Mの溶液に浸漬し、60℃、10h反応させ、吸収強度の減少から、単位面積あたりのV501−Clの固定化量を算出した。その後、マイクロアレイへのポリマーグラフト量をV501−Clの全てが重合開始に関与してとして、分子量を見積もった。
既知の方法(Katoh et al. BMC Biotechnology 2010,10:37)に基づいて、遺伝子試料を包摂し、表面にヒスチジンタグと、ファクターHとウイルスエンベローブタンパク質(VP)を有するマイクロセルVP+を調製した。遺伝子試料には、緑色蛍光タンパク質(GFP)及び抗生物質であるプラストサイジンS耐性をコードする遺伝子を用いた。同様にして、ウイルスエンベローブタンパク質を有していないマイクロセルVP-を調製した。
マイクロセル供与細胞として、CHO4H6.1M株(Katoh et al. BMCBiotechnology 2010, 10:37)を用いた。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本にCHO4H6.1M細胞(合計約1.5×107個)を播種し、コルセミド(0.1μg/ml、ギブコ)を含む培地(20%ウシ胎児血清(Biowest)、F12(和光純薬))中において48時間培養して微小核(ミクロセル)を誘導した。あらかじめ保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(無血清F12培地中に10μg/ml、シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル製遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃、8,000rpm(11,899×g)、1時間の遠心を行った(JLA−10.5ローター、ベックマン)。ミクロセルを無血清培地(F12)24mlに懸濁して回収し、フィルタホルダ(SWINNEX?25、ミリポア)に装着した孔径8μm、5μm、及び3μmのフィルター(ワットマン)を用いて順に濾過して精製した。精製したマイクロセルは室温にて2,000rpmで10分間遠心し、得られたペレットを無血清培地(F12)に再懸濁して規定濃度に調整した。
マイクロセル供与細胞として、CHO(21HAC2)株(Kazuki et al.Gene Theapy 2011, 18:384)を用いた。マイクロセル調製法については、VP+マイクロセルと同様の方法で行った。
プロテインA/G(ThermoSCIENTIFIC社製)のリン酸緩衝液(pH7.2)(1mg/ml)に、基板1を浸漬して、ターゲット結合部にプロテインA/Gを結合させた。次に、抗ヒスチジンIgG(Miltenyi Biotec社製)を10倍希釈した溶液250μlにプロテインA/Gを結合させた基板1を浸漬して、プロテインA/Gに抗ヒスチジンIgGを結合させた。
マイクロセル浮遊液の濃度を1.0×106個/mlとした以外は、実施例1と同様にした。
マイクロセルとしてウイルスエンベローブタンパク質を有していないマイクロセルVP-を用い、マイクロセル浮遊液の濃度を2.8×106個/mlとした以外は、実施例1と同様にした。
マイクロセル浮遊液の濃度を2.8×106個/mlとすると共に、抗ヒスチジン抗体をプロテインA/Gに結合させていない他は、実施例1と同様にした。
基板をMPC−NASポリマーを固定した基板2とした以外は、実施例2と同様にした。
基板をポリマーが固定されていない対照基板とし、マイクロセル浮遊液の濃度を1.4×106個/mlとした以外は、実施例1と同様にした。
マイクロセル浮遊液の濃度を2.8×106個/mlとすると共に、抗ヒスチジン抗体をプロテインA/Gに結合させていない他は、比較例1と同様にした。
マイクロセル浮遊液の濃度を1.4×106個/mlとすると共に、ポリ(MPC−NAS−PEGMEMA)を固定した基板1のターゲット固定化部位を1mMに調整した2−アミノエタノール(pH7.2リン酸緩衝液)と反応させてブロッキングした他は、実施例1と同様にした。
Claims (10)
- 基板の上に固定された導入促進ポリマーを備え、
前記導入促進ポリマーは、導入促進部位と、細胞親和性部位と、遺伝子試料及び前記遺伝子試料を導入するターゲット細胞と結合するターゲット結合部位とを有し、
導入促進部位は、末端が疎水性のアルキル基となったポリオキシアルキレングリコールアルキルエーテルを有し、
細胞親和性部位は、リン脂質極性基を有する部位であり、
ターゲット結合部位は、アミノ基、カルボキシル基又は水酸基と反応させることができる反応性官能基を有する部位である、遺伝子試料導入用基板。 - 前記ターゲット結合部位は、N−アクリロイルオキシスクシンイミドに由来する、モノマー単位を有する部位である、請求項1又は2に記載の遺伝子試料導入用基板。
- 前記細胞親和性部位は、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来する、モノマー単位を有する部位である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板。
- 前記導入促進ポリマーは、前記導入促進部位、細胞親和性部位及びターゲット結合部位以外に、親水性部位及び疎水性部位の少なくとも一方を含んでいる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板。
- 前記基板の表面には、周期的な凹凸構造が形成されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板。
- 前記ターゲット結合部位には、第1の認識物質が結合しており、
前記第1の認識物質は、前記遺伝子試料を包摂したマイクロセルの表面に存在する第2の認識物質と特異的に結合し、
前記ターゲット細胞は、前記マイクロセルの表面に存在する第3の認識物質と特異的に結合する第4の認識物質を有している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板。 - 前記ターゲット結合部位には、第1の認識物質が結合しており、
前記第1の認識物質は、前記ターゲット細胞の表面に存在する第5の認識物質と特異的に結合し、
前記ターゲット細胞は、前記遺伝子試料を包摂したマイクロセルの表面に存在する第3の認識物質と特異的に結合する第4の認識物質を有している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板を準備する工程と、
前記ターゲット結合部位に第1の認識物質を結合させる工程と、
前記第1の認識物質により特異的に結合する第2の認識物質と、第3の認識物質とを表面に有するマイクロセルに包摂された遺伝子試料を準備する工程と、
前記マイクロセルを前記遺伝子試料導入用基板に播種することにより、前記第1の認識物質と前記第2の認識物質とを結合させて、前記マイクロセルを前記ターゲット結合部位に結合させる工程と、
前記第3の認識物質を特異的に結合する第4の認識物質を有するターゲット細胞を前記遺伝子試料導入用基板に播種して、前記第3の認識物質と前記第4の認識物質とを結合させて前記ターゲット細胞を前記ターゲット結合部位に結合させる工程とを備えている、細胞への遺伝子試料導入方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子試料導入用基板を準備する工程と、
前記ターゲット結合部位に第1の認識物質を結合させる工程と、
前記第1の認識物質と特異的に結合する第2の認識物質と、第3の認識物質とを有するターゲット細胞を、前記基板に播種することにより、前記第1の認識物質と前記第2の認識物質とを結合させて、前記ターゲット細胞を前記ターゲット結合部位に結合させる工程と、
前記遺伝子試料を包摂し、前記第3の認識物質と特異的に結合する第4の認識物質を有するマイクロセルを準備する工程と、
前記マイクロセルを前記遺伝子試料導入用基板に播種して、前記第3の認識物質と前記第4の認識物質とを結合させて、前記マイクロセルを前記ターゲット結合部位に結合させる工程とを備えている、細胞への遺伝子試料導入方法。
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