JP2010532786A - Ｒｎａ薬剤の両親媒性接合を含む混合ミセルおよびその使用 - Google Patents

Abstract

アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡのようなＲＮＡ干渉薬剤の送達のための改善された薬学的製剤を開示する。製剤はｉＲＮＡ薬剤の両親媒性接合を含む混合ミセルおよび延びた親水性鎖をもつ両親媒性ミセル形成分子を採用する。また、細胞内標的へのｉＲＮＡ薬剤の送達を増加しそして製剤中のｉＲＮＡ薬剤の細胞外ヌクレアーゼ分解を減少するために薬学的製剤を使用する方法を開示する。
【選択図】図３

Description

（関連申請）
この申請はＵＳ仮申請Ｎｏ．６０／９４８，４３３、２００７年７月６日提出の優先権の利益を請求する。

（発明の分野）
本発明は薬学科学、そして特に混合ミセルを採用する製剤、そして特にｓｉＲＮＡｓのようなＲＮＡ薬剤の両親媒性接合を含む混合ミセルの製剤およびこれらの使用の分野に関連する。

（発明の背景）
多くの疾病（例えば、癌、ヘマトポイエチン障害、内分泌障害、免疫障害）は特殊な遺伝子あるいは遺伝子グループの異常な発現あるいは活動からおきる。同様に、疾病は宿主のゲノム内に統合されたウイルスの遺伝子の発現からと同様に蛋白質の突然変異体形からの発現に起因する。これらの異常なあるいは外来の遺伝子を選択的にサイレンスさせることのできる治療上の利点は明白である。

オリゴヌクレオチド化合物は医薬において重要な治療上の応用を有している。オリゴヌクレオチドは特殊な疾病の原因である遺伝子をサイレンスさせるために使用される。遺伝子サイレンシングは翻訳を阻止することによって蛋白質の形成を防止する。重要なことに、遺伝子サイレンシング薬剤は疾病に結びつく蛋白質の機能を阻止する従来の低分子の有機化合物に対する将来有望な代替品である。アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡおよび小阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシングにより対応する蛋白質の生成を防ぐ異なるタイプのオリゴヌクレオチドである。

アンチセンス方法論は細胞間の核酸の蛋白質合成のような正常で必須機能が分裂されるようなｍＲＮＡあるいはＤＮＡに対する比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１３−３０のヌクレオチド）の補足的な分子交雑（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）である。分子交雑はＲＮＡあるいは１本鎖ＤＮＡにオリゴヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対による配列の特定水素結合によってであり、そして標的核酸の配列の転写および／あるいは翻訳で防ぐ。

ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓは有機体で自然に産生される低分子のＲＮＡｓの大きな基であり、少なくともそれらのいくつかは標的遺伝子の発現を制御する。ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓはリポヌクレアーゼダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって約７０のヌクレオチド１本鎖ヘアピン前駆体転写から形成され（Ａｍｂｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３（１０）：８０７−８１８）、それは前駆体を２１−２３のヌクレオチド２本鎖ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓに開裂する。多くの例において、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡは従来知られていない機能を有するＤＮＡ配列の一部から転写される。ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓは蛋白質内に翻訳されず、しかし、むしろ、これらは翻訳をブロックする特定のメッセンジャーＲＮＡｓに結合する。ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓ塩基対はこれらの標的との不正確な翻訳を阻止すると考えられる。

ＲＮＡ干渉あるいは“ＲＮＡｉ”は２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が虫に導入されたとき遺伝子発現をブロックする観察を記述するためにＦｉｒｅと共同研究者によって最初に作られた用語である（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）。短いｄｓＲＮＡが脊椎動物を含む多くの有機体内で特定遺伝子のポスト転写サイレンシングを示し、そして遺伝子機能を研究するために新しい道具を提供した。ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＳＣ）によって、サイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡｓを破壊する配列特定の多成分ヌクレアーゼを媒介される。

ｄｓＲＮＡでの処置は無脊椎動物の有機体の遺伝子機能を分析するための重要な方法となった。例えば、Ｄｚｉｔｏｖｅｖａ ｅｔ ａｌ．はＲＮＡｉが麻酔をされたショウジョウバエの腹部にｄｓＲＮＡを注射することによって大人の成体の蝿にでき、そしてこの方法は中心神経系に発現される遺伝子をまた標的とすることができることを示した（Ｄｚｉｔｏｖｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｒｙ ６（６）：６６５−６７０）。遺伝子導入および内生的な遺伝子はそれぞれのｄｓＲＮＡの内腹部の注射によって大人のショウジョウバエで成功裡にサイレンスされた。さらにＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．は、ｄｓＲＮＡプロセッシングの指示がセンスあるいはアンチセンス標的ＲＮＡがｓｉＲＮＡ蛋白質錯体によって開裂されるかどうか決定する証拠を提供した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５（２）：１８８−２００）。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象の１９９８年の第１報以来（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１）、合成ｓｉＲＮＡｓの使用に基づく診断および治療戦略の発展に関心の波があり、これは潜在力のある新しい級の薬学的薬剤として明らかに見なされるからである（Ｂｕｍｃｒｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：７１１−７１９）。いくつかのＲＮＡｉベースのｉｎ ｖｉｖｏ戦略がウイルス感染（Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：７６９−７７６；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：３４７−３５１）から癌（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１１：７８６−７９２；Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：１４４８−１４５６）そして単純な神経状態（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ４９；Ｔｈａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １０：７８２−７８９，７１４）まで広範囲の状態の処置に対して文献で報告されてきている。

裸のｓｉＲＮＡが静脈内に（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏｉ．ＵＳＡ １００：７７９７−７８０２）、
髄腔内に（Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３２：ｅ４９）、腹腔内に（Ｆｉｌｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３９１９−３９２２）投与されそして適用可能のところでは標的組織内に直接注射によって（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：７７９７−７８０２；Ａｈａｒｉｎｅｊａｄ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：５３７８−５３８４；Ｌｉｎｇｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｂｒａｉｎ １２８：５５０−５５８；Ｐｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）投与されてきた。活性の目に見える水準の、特に水力学的IV注射の場合における肝臓組織において、報告された（Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：７６９−７７６；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：３４７−３５１；Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：７７９７−７８０２；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｐａｎｃｒｅａｓ ３１：３７３−３７９；Ｈａｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：１４８８３−１４８８８；Ｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３４０：２６３−２６７；Ｔｏｍｐｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：８６８２−８６８６）。ｓｉＲＮＡｓのｉｎ ｖｉｖｏ使用に対する一般的な進歩は（Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：６４４−６７０）に最近展望され、新しいＲＮＡｉベースの治療が活発に発展しつつある（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ． ２２：２１１−２１７）。不幸にも、記載された代替のルートの多くの適用性はいくつかの組織、そして直接の注射の場合にのみに限定され、さらに容易に接近できる組織に限定されている（Ａｉｇｎｅｒ（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６（４）：７１６５９）。さらに高い投与量そして繰り返しの投与が活性化のためにしばしば必要である。

裸のｓｉＲＮＡの接近が臨床応用のため追求され続けられる一方、実際の臨床治療へｓｉＲＮＡベースの戦略の適用に現在直面する主なハードルが意図する行為の箇所へｓｉＲＮＡの効果的な送達のために必要である（Ａｉｇｎｅｒ（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６（４）：７１６６９）。より良い安定性を達成するためにｓｉＲＮＡ分子の化学的修飾（コレステリル残基でこれらの修飾を含む）および投与する組織特定標的化がいくつかの注目を惹きつけている（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８；Ｍａｎｏｈａｒａｎ（２００４），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８：５７０−５７９；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−１００７）けれども、主な焦点はｓｉＲＮＡの送達を改善する担体システムの使用にある。Ｂｕｍｃｏｒｔ ｅｔ ａｌ．によって記録されたように、“効果的な送達が臨床でＲＮＡｉの成功的な翻訳のため最も挑戦的な未解決の課題である”（Ｂｕｍｃｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：７１１）。

改善されたｓｉＲＮＡ送達への接近は診査されるウイルスおよび非ウイルスベースの戦略の両方でＤＮＡ送達の既に確立された分野から多くを理解できるように借用している。免疫応答および可能な腫瘍遺伝子を含むＤＮＡベースの治療から既に確認されているウイルスの接近の欠点はｓｉＲＮＡの送達において活力の短い期間および繰り返し投与の必要性により可能性にさらに制約があることである（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：３２２−３３３）。非ウイルスシステムは設計において比較的もっと柔軟性があり製剤するために容易である。繰り返し投与に対する可能性は改善された生物的互換性によりより大きく、そして非ウイルスシステムはｓｉＲＮＡ産生物あるいはｓｉＲＮＡ自身の重複部位に対する両方のＤＮＡコーディングを送達するために使用される。

ポリマーベースのｓｉＲＮＡ送達システム、特にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのものは精力的に研究されてきた（Ａｉｇｎｅｒ（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌ．２００６（４）：７１６５９；Ｐｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２３：１３７−１６４）、および陽イオン性ポリマー、特にＰＥＩがｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ活性の効率を改善するためにいくつかの成功で使用されてきている（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：８６７６−８６８１；Ｌｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：６８２−６９０；Ｕｒｂａｎ−Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：４６１−４６６；Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３９：６８１−６８９）がこのような担体の毒性は問題として残っている。ポリマー性のナノ粒子は可能性のあるｓｉＲＮＡ担体としてまた考えられている（Ｔｏｕｂ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｐｈａｍａｃｏｔｈｅｒ．６０：６０７−６２０）。ポリマーあるいは金属ナノ粒子をベースとするナノ粒子担体システムはｓｉＲＮＡ送達にまた診査されつつある（Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：ｅ１４９；Ｄｅｒｆｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１８（５）：１３９１−６）。

ｓｉＲＮＡの脂質性担体は多数の注意を自然に引き出してきている（Ｓｐａｇｎｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００４），ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）．４３：１３３４８−１３３５６）。リポソームはｓｉＲＮＡ治療のための最も広く診査された非ウイルスシステムであると思われる（Ａｉｇｎｅｒ（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６（４）：７１６５９）。ｓｉＲＮＡのリポソーム製剤は固形腫瘍の処置（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：６９１０−６９１８）、転移癌の処置（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７７２１−７７２６）および動物模型における種々な状態の処置（Ｎｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５：９７８−９８５）において特定の遺伝子のノックダウンを改善するために使用されてきた。幾分かの成功を収めているけれども、細胞浸透ペプチド媒介細胞間送達を含むリポソームベースのｓｉＲＮＡ送達システムで我々自身の経験（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１２：２２９−２３９）は調合剤および数量性に関する問題点と同様に再生産生性の課題に関連付けられた。配位子標的ナノ担体ベースのｓｉＲＮＡ送達システムを調合する最初の試みがまた記載されている（Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２３：１６３１−１６４０）。しかしながら、現在まで試験された戦略はどれも診断的に顕著なシステムに至らなかった。

ｓｉＲＮＡは最近見られる多数の出版された実施例で能力のあるアンチウイルス治療として非常に効果的であることを示されてきている。ウイルス遺伝子の標的に対して示されるｓｉＲＮＡ分子はインフルエンザの動物模型のウイルス力価を桁のオーダーで劇的に減らす（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：８６７６−８６８１；Ｔｏｍｐｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：８６８２−８６８６；Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４９５−５０５（２００５）），呼吸器官のシンシチウムウイルス（ＲＳＶ）（Ｂｉｔｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（１１：５０−５５），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−１００７），Ｃ型肝炎ウイルス（Ｋａｐａｄｉａ（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：２０１４−２０１８；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：２７８３−２７８８）およびＳＡＲＳ コロナウイルス（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：９４４−９５１）。さらに研究は中央神経システム疾患、炎症性疾患、新陳代謝障害、腫瘍、伝染性疾病、そして視覚疾病を含む多くの疾患の処置に対する干渉ＲＮＡ治療薬剤を開発するため現在進展中である。

アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡそしてｓｉＲＮＡの進歩に拘わらず、１つの主要なハードルである技術は細胞中へこれらのオリゴヌクレオチドの細胞内送達である。特に、ｉｎ ｖｉｖｏ投与されたＲＮＡを急速に退化する細胞外そして細胞内の環境の両方に実質的なヌクレアーゼ活性がある。結果として、被験者に投与されるＲＮＡの極く少量割合のみ細胞中の希望する標的に到達する。広範な種々な送達戦略が技術において調査されてきたけれども（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ３：１４５−１４７）、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡそしてｓｉＲＮＡの活性がありそして臨床的に受け入れられる調合剤を作るための多くの重要な課題が未解決で残り、そしてＲＮＡベースの治療薬剤のために簡単で、普遍的でそして容易な供給システムを作る必要性が残っている。

（発明の概要）
本発明は、放射状に延びる親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）がＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の少なくとも一部を取り囲むあるいはマスクをする層を形成しそしてそれによってヌクレアーゼによってＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の消化を立体的に防ぎそして減少することによりｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増大するように、ＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の両親媒性接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および放射状に延びる親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有するミセルを形成する両親媒性分子の両方を含むある種の混合ミセルが産生されるという認識に一部分依存している。ある実施態様においては、本発明は親水性層がＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を実質的に取り囲みあるいはマスクをするに十分な厚みと密度を有し、そしてそれによってこれらをヌクレアーゼによる消化から実質的に保護する混合ミセルを提供する。結果として、本発明は、実質的に細胞外のヌクレアーゼによる減少した消化および実質的に血液、髄液あるいは局部の細胞外ミクロ環境中の増加したＲＮＡの半減期で、細胞中の治療標的にＲＮＡを送達するために改善された方法を提供する。さらに、このような混合ミセルの表面は希望する標的細胞にｉＲＮＡ含有ミセルを標的とする部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）で修飾されそして／あるいは強化した細胞間浸透力を提供する。

このように、１つの観点で、本発明は（１）（ａ）複数の両親媒性ｉＲＮＡ接合であって、それぞれが親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含みそして親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のそれぞれがｉＲＮＡ薬剤のｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み；（ｂ）複数のミセル形成両親媒性分子であって、それぞれが親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含みそして親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のそれぞれが混合ミセルの中心から放射状に延びる少なくとも１つの親水性鎖を含む混合ミセル；（２）薬学的に受容可能な担体を含む薬学的製剤を提供する。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖が前記混合ミセルの中心から放射状に延びる親水性層を形成し；そして両親媒性ｉＲＮＡ接合がｉＲＮＡ（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の少なくとも一部が親水性層内にある混合ミセルに位置づけられる。

薬学的製剤のある実施態様においては、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の一部が親水性層を超えて外側へ放射状に延びない。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖が２００と５００Å（２０と５０ｎｍ）の間の平均主鎖長を有する。他の実施態様においては、複数の親水性鎖が１００と１，０００Å（１０と１００ｎｍ）の間、そして５０と２，０００Å（５と２００ｎｍ）の間の平均主鎖長を有する。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖が１，５００と５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有する。他の実施態様においては、複数の親水性鎖が５００と１５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間、そして１，０００と１０，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有する。

上述の何れかのある実施態様においては、ミセル形成両親媒性分子の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は長鎖の脂肪酸、リン脂質、脂質および糖脂質のラジカルから選ばれる。

上述の何れかのある実施態様においては、両親媒性ｉＲＮＡ接合の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はコレステロール、長鎖の脂肪酸、脂質、リン脂質および糖脂質のラジカルから選ばれる。

上述の何れかのある実施態様においては、脂肪酸はブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸およびこれらの不飽和の異性体から選ばれる。

上述の何れかのある実施態様においては、リン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびスフィンゴミエリンから選ばれる。

上述の何れかのある実施態様においては、糖脂質はガラクト脂質、硫脂質、セレブロシドおよびガングリオシドから選ばれる。

上述の何れかのある実施態様においては、ミセル形成両親媒性分子の親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はＰＥＧ、ＰＥＩ、ポリビニールピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニールアルコール、ポリオキサゾリン、ポリモルホリン、キトサンおよび水溶性ペプチドのラジカルから選ばれる。

上述のある実施態様においては、親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は１，５００と５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有するＰＥＧラジカルである。他の実施態様においては、ＰＥＧラジカルは５００と１５，０００の間および１，０００と１０，０００の間の平均分子量を有する。

他の観点で、本発明は、細胞内標的へのｉＲＮＡ薬剤の送達が薬学的に受容可能な担体中のｉＲＮＡ薬剤の送達に関して増加されるように、ここに記載する薬学的製剤の１つにおいてｉＲＮＡ薬剤を製剤しそして細胞外に薬学的製剤を投与することによって、細胞内の標的にｉＲＮＡ薬剤の送達を増加する方法を提供する。

他の観点で、本発明は、ｉＲＮＡ薬剤の細胞外のヌクレアーゼ退化が薬学的受容可能な担体でｉＲＮＡ薬剤の退化に関して減少されるように、ここに記載される薬学的製剤の１つにおいてｉＲＮＡ薬剤を製剤することによって細胞外ヌクレアーゼ退化を減少しそして細胞外に薬学的製剤を投与する方法を提供する。

本発明の１つあるいはそれ以上の実施態様の詳細は付帯する図面および以下の説明で明らかにする。本発明の他の特徴、目的、優位性は説明および図面そして特許請求項から明らかになる。

（図面の簡単な説明）
本発明に従って作られるｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥミセルの寸法分布を示すグラフである。 Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色で染色されたＭＣＦ７（人の乳腺癌）細胞の落射蛍光顕微鏡写真である。図２Ａおよび２Ｂ：ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２−ＰＥミセルに２時間曝露された細胞。図２Ｃおよび２Ｄ：非処理細胞。図２Ａおよび２Ｃ：紫外線チャネル。図２Ｂおよび２Ｄ：赤チャネル。 Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥミセルで２時間培養した後、ＭＣＦ７細胞（Ａ）および４ＴＩ細胞（Ｂ）でＥｘ５５４、Ｅｍ５７０で測定された細胞付随Ｃｙ３蛍光を示すグラフである；ｎ＝３。 Ｃｏｌ−ＳｉＲＮＡおよびＣｈｏｌ−ＳｉＲＮＡ−ＰＥＧ−ＰＥミセルでＣ１６６−ＧＦＰマウス内皮細胞の培養の後ＧＦＰ産生の減少を示すグラフである（同じｓｉＲＮＡ量）。 ｓｉＲＮＡ−コレステロール合成のための図解を図示する。図５Ａ：メルカプチルコレステロールの調合剤。図５Ｂ：メルカプチルコレステロールおよびＳＰＤＰによるｓｉＲＮＡの接合。 Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡ−コレステロール合成の図解を図示する。

（詳細な説明）
１．序論
本発明は、放射状に延びる親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）がＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の少なくとも一部を取り囲むあるいはマスクをする層を形成しそしてそれによってヌクレアーゼによってＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の消化を立体的に防ぎそして減少することによりｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を増大するように、ＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の両親媒性接合および放射状に延びる親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有するミセルを形成する両親媒性分子の両方を含むある種の混合ミセルが産生されるという認識に部分的に依存する。ある実施態様においては、本発明は親水性層がＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を実質的に取り囲みあるいはマスクをするに十分な厚みと密度を有し、そしてそれによってこれらをヌクレアーゼによる消化から実質的に保護する混合ミセルを提供する。結果として、本発明は、実質的に細胞外のヌクレアーゼによる減少した消化および血液、髄液あるいは局部の細胞外ミクロ環境中のＲＮＡの実質的に増加した半減期で、細胞中の治療標的にＲＮＡを送達するための改善された方法を提供する。

２．参照および定義
ここに参照される特許および科学文献は当業者に利用されうる知識を確立する。ここに引用される発行された米国特許、認められた申請、出版された外国申請および参照文献は、それぞれが明確にそして個々に参照によって組み入れられるように、同じ範囲で参照によって組み入れられる。

ここに使用される用語“ＲＮＡ薬剤”は非修飾リボ核酸（ＲＮＡ）、修飾ＲＮＡあるいはヌクレオシド代用体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）を意味する。

ＲＮＡ剤に関してここで使用される用語“修飾される”は１つあるいはそれ以上の次の変化によって自然に起きるリボ核酸と化学構造に相違のある分子を意味する；ホスホジエステル主鎖の１つあるいはそれ以上の原子の添加、削除あるいは置換（例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオアートあるいはペプチド核酸結合と置換）；およびリポース単位の１つあるいはそれ以上の原子の添加、削除あるいは置換（例えば、リボースユニットをデオキシリポースユニットに置換）；ヌクレオシド塩基ユニットの１つあるいはそれ以上の原子の添加、削除あるいは置換（例えば、塩基ユニットをここに記述するような塩基類似体と置換）。“修飾ＲＮＡ”として参照される一方、この用語は技術的にＲＮＡｓでない分子を含む（例えば、リポースは置換されているから）。

ここで使用されるように、用語“ヌクレオシド代理体”は、リボリン酸塩主鎖は分子交雑がリボリン酸塩主鎖でみられるものと実質的に類似であるような正しい螺旋関係で塩基を示すために非リボリン酸構造と置き換えられている自然に起きるリボ核酸と異なる分子を意味する（例えば、リボリン酸塩主鎖の非電荷模擬体）。

ここで使用されるように、用語“ｉＲＮＡ薬剤”は標的遺伝子、望ましくは内生的あるいは病原体標的ＲＮＡの発現を下方に制御できるＲＮＡ薬剤あるいは下方に制御できるＲＮＡ薬剤に開裂されるＲＮＡ薬剤を意味する。ｉＲＮＡ薬剤はアンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを含む。理論を超えることを希望しないが、ｉＲＮＡ薬剤は標的ｍＲＮＡの後転写開裂（時にはＲＮＡｉとして技術的に参照される）あるいは前転写あるいは前翻訳機構を含む１つあるいはそれ以上の機構によって動作する。ｉＲＮＡは１本鎖あるいは１本鎖以上を含む（例えば、２本鎖のｉＲＮＡ薬剤）。もしｉＲＮＡ薬剤が１本鎖であるならば、それが１つあるいはそれ以上のリン酸塩基あるいは１つあるいはそれ以上のリン酸塩基の類似体を含む５’修飾を含むことが特に望まれる。

ここで使用されるように、用語“両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）”は親水性および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の両方が含まれ、そして“両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）”と同義語である。両親媒性分子は適当な温度および濃度で水溶液に分散するときミセルを形成することができる。

ここで使用されるように、用語“臨界ミセル濃度”および略語“ＣＭＣ”はミセルが水溶液中から自発的に形成し始める両親媒性化合物の濃度を意味する。“低い”臨界ミセル濃度は１０^−５Ｍ以下である。

ここで使用されるように、用語“分子主鎖長”は結合角度に関係なく、分子中の原子の最も長い連続する鎖を構成する原子間の結合長の合計に関する。かくして、単なる例として、イソブタンの分子主鎖長は３つのＣ−Ｃ結合および２つのＣ−Ｈ結合の結合長の合計である（これは、３×１．４３Å（０．１４３ｎｍ）＋２×１．０９Å（０．１０９ｎｍ））。この計算は両方の結合角そして分子が二次構造（例えば、球状の構造）を想定できる事実を無視しているので、ｉｎ ｓｉｔｕ分子の物理的長を過剰見積している。しかしながら、ｓｉＲＮＡ薬剤および両親媒性鎖の相対的寸法を比較のために本発明の目的に対して有益な概算である。

ここで使用されるように、用語“減少する”は統計的有意義を達成する（これはｐ＜０．１）方法および試料寸法によって決定されるように、参照量から少なくとも５％だけ減少することを意味している。

ここで使用されるように、用語“増大する”は統計的有意義を達成する方法および試料寸法によって決定されるように、参照量から少なくとも５％だけ増大することを意味している。

ここで使用されるように、変数に対する数値の範囲の列挙は本発明がその範囲内でどのような変数にも等しい値で実行されることを伝えることを意図している。かくして、本来不連続である変数に対して、変数は範囲の終点を含む数値の範囲でどのような整数値に対しても等しい。同様に、本来連続である変数に対して、変数は範囲の終点を含む数値の範囲内でどのような真値にも等しい。例として、制約なく、０と２の間の値を有すると記載される変数は、もし変数が本来不連続であるならば０、１あるいは２の値をとり、そしてもし変数が本来連続であるならば０．０、０．１、０．０１、０．００１、．．．．、０．９、０．９９、０．９９９あるいは≧０そして≦２のどのような他の真値もとる。

ここで使用されるように、特に指定されないならば、単語“あるいは”は“および／あるいは”の包括的意味に使用されそして“どちらか一方／あるいは”の排他的意味に使用されない。

３．ｉＲＮＡ薬剤の両親媒性接合を含むミセル
ミセルはコロイド溶液と呼ばれるものを形成する水溶媒に分散される両親媒性分子の集合体である。混合ミセルは１つの型の両親媒性分子よりも多くを含むミセルである。通常、ミセルは脂肪酸（例えば、ステアリン酸ナトリウムおよびリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）から形成される。水溶液において、ミセルは周囲の溶媒と接触する外側表面で親水性“頭”領域を形成しそして溶媒から隔離されたミセルの内部に覆い隠された疎水性“尾”領域を形成する。ミセルは通常球形であるが、しかしこれらが流体であるので流体力を受けるとき形が崩れる。楕円そして円筒のような他の型がその構成分子の分子幾何学配置および両親媒性分子濃度、温度、ｐＨそしてイオン強度に依存してまた可能である。

本発明は、一部分、両親媒性接合の一部としてｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含む混合ミセルが産生され、そしてミセルを形成する他の両親媒性分子が親水性層を形成する放射状に延びる親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有し、そしてこのようにｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が親水性層内で少なくともこれらの表面の一部と前記混合ミセル内に位置付けられるという認識に依存している。親水性層内のｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のこの位置付けはこれらを物理的に分子から遮蔽し、そしてこれによりミセルの局所的ミクロ環境のヌクレアーゼによりｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の分解を減少する。

親水性層内に、あるいは少なくとも一部分その内に位置付けられるｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のために、親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）あるいはミセル形成両親媒性分子の頭領域はｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を少なくとも一部取り囲むあるいはマスクする親水性層を形成するために十分な距離を放射状に外側へ延びねばならない。このように、親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）としてカルボキシル基のみを有する単純で修飾前の脂肪酸（例えば、ステアリン酸、パルミチン酸）は本発明に有益ではない。同様に低分子の親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を有する最も単純で修飾前のリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ））は本発明に有益ではない。むしろ有益なミセル形成両親媒性分子は前記ミセルの中心から放射状に延びる少なくとも１つの親水性鎖を含む。これらの親水性鎖は親水性層を形成するためにそれ自身放射状に一列に並ぶ。

親水性鎖の例は次のものを含むがしかし制限されない親水性ポリマーを含む：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニールピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニールアルコール、ポリオキサゾリン、ポリモルホリン、キトサンおよび水溶性ペプチド。これらの親水性ポリマーは繰り返されるポリマーユニットの数によって決定される長さを変え、そして繰り返されるユニットの数（例えば、４４のエチレングリコールユニットを有するＰＥＧ）、ｇ／ｍｏｌｅの分子量（例えば、２，０００ｇ／ｍｏｌｅを有するＰＥＧ）、あるいは分子主鎖の長さ（例えば、２００Å（２０ｎｍ）を有するＰＥＧ）によって記述される。

技術として良く知られた標準化学物質を使用して、低分子の頭領域のミセル形成分子は親水性鎖を添加することによって本発明に有益なミセル形成両親媒性分子を産生するために修飾される。例えば、脂肪酸あるいはリン脂質の頭領域は親水性鎖とエステル化あるいは他の共有結合反応によって共有結合的に結合される。このように、例えば、ＰＥＧのような親水性鎖はステアリル−ＰＥＧのような両親媒性分子を形成するためにステアリン酸のような脂肪酸と、あるいはＰＥ−ＰＥＧのような両親媒性分子を形成するためにＰＥのようなリン脂質とエステルを形成する。

上述のように、本発明を有益とするために、親水性鎖は少なくとも部分的にｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を取り囲むかあるいはマスクするために十分な距離を外側へ放射状に延びなければならない。従って、親水性鎖に要求されるあるいは望まれる長さはｉＲＮＡ薬剤の寸法の関数である。かくして、もしｉＲＮＡ薬剤がミセルの中心からより大きい距離を放射状に外側へ延びるならば、ミセル形成両親媒性分子を使用する混合ミセルをより大きい距離を外側へまた延びる親水性鎖で形成することが望ましい。

２本鎖、２１−２３のｂｐｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むｓｉＲＮＡｓおよびｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓの両方に対して、分子主鎖長（リボリン酸塩主鎖に沿って測定された）は約１９２−２１０Å（１９．２−２１．０ｎｍ）（これは分子当り９．１５Å（０．９１５ｎｍ）×２１−２３のヌクレオチド）である。もしこのようにｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）がこの５’あるいは３’末端の１つによって疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に接合されるならば、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の反対の末端は混合ミセルの疎水性コアから約１９２−２１０Å（１９．２−２１．０ｎｍ）だけ外側へ放射状に突き出ると期待される。もしｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）がある長さの連結体（ｌｉｎｋｅｒ）によってｉＲＮＡ接合の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に取り付けられるならば、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）は混合ミセルの疎水性コアからさらに突き出る。それ故、ｓｉＲＮＡあるいはｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）であるｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）に対して、親水性層は最小で全ての側面においてｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を取り囲むあるいはマスクをするために、分子主鎖長において約１９２−２１０Å（１９．２−２１．０ｎｍ）でなければならない。もし連結体がｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）をさらに突き出させるならば、同等の親水性鎖が使用されねばならない。しかしながら、ＲＮＡ薬剤はこれらの末端からエキソヌクレアーゼによって消化されるので、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を超えて延びる親水性鎖の末端およびｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の末端は親水性層内に完全にマスクされるか埋め込まれるように、親水層に対してさらに延びることが望ましい。かくして、例えば、２００−２，０００Å（２０．０−２００．０ｎｍ）の分子主鎖長を有する親水性鎖が本発明に採用される。他方、低分子の親水性鎖（例えば、５０−２００Å（５．０−２０．０ｎｍ）は、もしｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）が効果的な長さを短くするコイル状構造を適用し、もし部分的にｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の取り囲みがヌクレアーゼによって消化を減少するために適切であり、あるいはもしヌクレアーゼから極く一部分の保護が要求されるのであれば、採用される。

典型的に、１本鎖、１３−３０のヌクレオチドｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を含むアンチセンスＲＮＡｓは分子主鎖長（リボリン酸塩主鎖に沿って測定された）が約１１９−２７５Å（１１．９−２７．５ｎｍ）（これはヌクレオチド当り９．１５Å（０．９１５ｎｍ）×１３−３０のヌクレオチド）である。それ故、アンチセンスＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）であるｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）に対して、特定のアンチセンスＲＮＡ長に依存して、親水性層は全ての側面でｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を取り囲みあるいはマスクするために最小で分子主鎖長において約１１９−２７５Å（１１．９−２７．５ｎｍ）でなければならない。このように、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）とｉＲＮＡ接合の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）間の連結体の存在は親水性層でより長い鎖を要求し、そしてより長い鎖（例えば、３００−２，０００Å（３０．０−２００．０ｎｍ）あるいはより短い鎖（例えば、５０−２００Å（５．０−２０．０ｎｍ）が上記を明らかにする理由として望まれる。

かくして、１つの観点で、本発明は（１）（ａ）複数の両親媒性ｉＲＮＡ接合であって、各々は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、そして親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の各々はｉＲＮＡ薬剤のｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み；（ｂ）複数のミセル形成両親媒性分子であって、各々は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、そして親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の各々は混合ミセルの中心から放射状に延びる少なくとも１つの親水性鎖を含む混合ミセル；（２）薬学的に受容可能な担体を含むｉＲＮＡ薬剤の薬学的製剤を提供する。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖が前記混合ミセルの中心から放射状に延びる親水性層を形成し；そして両親媒性ｉＲＮＡ接合がｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の少なくとも一部が親水性層内にあるように混合ミセルに位置付けられる。

薬学的製剤のある実施態様においては、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の一部は親水性層を超えて外側へ放射状に延びない。

他の観点で、本発明は、ここに記載する薬学的製剤の１つにおいてｉＲＮＡ薬剤を製剤することによってそして細胞外に薬学的製剤を投与することによって細胞内標的にｉＲＮＡ薬剤の送達を増大する方法を提供し、細胞内標的へｉＲＮＡ薬剤の送達が薬学的受容可能な担体中のｉＲＮＡ薬剤の送達に関して増大されるようにする。ある実施態様においては、細胞内標的に送達されるｉＲＮＡの平均量は少なくとも１０％だけ増大され、ある実施態様においては、１０％−５０％増大され、ある実施態様においては、５０％−１００％増大され、そしてある実施態様においては、２倍以上に増大される。

他の観点で、本発明は、ここに記載する薬学的製剤の１つにおいてｉＲＮＡ薬剤を製剤することによってそして細胞外に薬学的製剤を投与することによって細胞外ヌクレアーゼ退化を減少する方法を提供し、薬学的製剤での細胞外ヌクレアーゼの退化が薬学的受容できる担体中のｉＲＮＡ薬剤の退化に関して減少される。ある実施態様においては、投与の１時間内にヌクレアーゼによって退化されるｉＲＮＡの量は少なくとも１０％まで減少され、ある実施態様においては、１０％−５０％減少され、ある実施態様においては、５０％−１００％減少され、そしてある実施態様においては、２倍以上減少される。

４．疎水性および親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）
広範囲の様々なモノマーが本発明に使用されるポリマー性親水性鎖と同様なポリマー性疎水性コア（ｃｏｒｅｓ）を構築するために使用される。例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ （２００７）、“ミセルナノ担体：薬学的展望”、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２４（１）：１−１６を参照。例えば、そして制限なく、酸化プロピレン、アスパラギン酸、β−ベンゾイル−Ｌ−アスパラギン酸塩、γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン、カプロラクトン、Ｄ，Ｌ−乳酸、スペルミンおよび多くの他のものが標準化学薬品を使用する疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を形成するために使用される。これらのモノマーのいくつかはミセルの疎水性コアを産生するために使用される疎水性ポリマー性ブロックを形成し、一方、他の化合物（例えば、リジン、スペルミン）は疎水性静電気錯体を形成するために正反対の電荷の疎水性物質を結合する親水性ポリマー性ブロックを形成し、そして錯体はミセルのコアを形成する。ポリ（オルソエステル）のブロックコポリマーおよびＰＥＧはおおよそ１０^−４ ｇ／ＬのＣＭＣをもつ４０−７０ｎｍのミセルを形成しそして凍結乾燥される。疎水性コアを形成する末尾の組成もつモノメトキシ−ＰＥＧ、ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリル酸塩）およびポリ（２−（ジエチルアミノ）エチルメタクリル酸塩）を構成するミセル形成ＡＢＣ型トリブロックコポリマーはまた使用されそしてコア内に合体される低い溶解性化合物の放出を緩やかに許す。ポリラクトン−ＰＥＧ２重および３重ブロックコポリマーは２０ｎｍのミセルを形成するポリ（２−エチル−２−オキサゾリン−ブロック−ポリ（ε−カプロラクトン）と同様なミセル形成ポリマーとして使用される。パルミトイルのような疎水性基でグラフト接合されたキトサンは薬学的ミセルを調合するために使用されそして高い生体適合性である。薬学的ミセルを調合することのできる他の材料はＰＥＧのコポリマーおよび蠍のようなポリマーでそしていくらか星のようでコア−貝殻の構成のようなマクロ分子を含む。

リン脂質の残基はまた疎水性コア形成部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）として成功裡に使用される。親水性ポリマー鎖（例えば、ＰＥＧ）をキャップする疎水性ブロックのような脂質部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の使用は、ミセルのコアのポリマー鎖間の疎水性相互反応における増加に相当寄与する２つの極めて疎水性の脂肪酸アシルの存在による従来の親水性ポリマーミセルと比較するとき粒子安定性のために付加的な優位性を提供する。脂質の水溶性ポリマーとの種々な接合は市販で利用できるかあるいは容易に合成される。ジアシル−脂質―ＰＥＧ接合はリポソームに対するポリマー性表面装飾体として制御される薬品送達の箇所に導入されてきた。しかしながら、ジアシル−脂質―ＰＥＧ分子はそれ自身大きい親水性（ＰＥＧ）の部分および大変短いが疎水性ジアシル−脂質部分（ｍｏｉｅｔｙ）をもつ特徴的な両親媒性ポリマーを現す。他のＰＥＧ含有親水性ブロックコポリマーと同様に、ジアシル−脂質−ＰＥＧ接合は水溶液環境でミセルを形成する。一連のＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）接合はＰＥおよびメトキシ−ＰＥＧ琥珀酸塩のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２ｋＤａ、５ｋＤａおよび１２ｋＤａの分子量）を使用して合成されてきた。ＰＥＧ−ＰＥ接合の全ての変形は７−３５ｎｍの寸法をもつミセルを形成する。個々のポリマー性鎖への解離は約１μｇ／ｍＬのポリマー濃度まで、この濃度はマイクロモルＣＭＣ値に相当し、従来の洗浄剤の値よりも少なくとも１００倍低い濃度までＰＥＧ（５ｋＤａ）の連続的希釈試料のクロマトグラフに従って発見されなかった。１５ｋＤａ異常のＰＥＧブロックの寸法で、ＰＥＧ−ＰＥミセルの安定性は減少し始める。洗滌剤あるいは水混合可能な除去方法による脂質ベースのミセルの調合は全く同様な直径の粒子の形成となる。通常、このようなミセルは球形でそして均一寸法の分布を有する。他の重要な問題点はＰＥＧ_２０００−ＰＥおよびＰＥＧ_５０００−ＰＥミセルは血漿中で４８時間培養した後でさえミセルに対する寸法の特徴を残しており、これはＰＥＧ−ＰＥミセルの元のままの状態が非経口投与で生物的流体の組成によって直ちに影響されないことである。

１，５００と８，０００Ｄａの間のＰＶＰブロック寸法をもつ両親媒性ＰＶＰ−脂質接合はまた調合されてきて、それは水溶液環境で容易にミセルを形成する。形成されるミセルのＣＭＣ値および寸法はＰＶＰブロックの長さに依存しそして１０^−４と１０^−６Ｍの間そして５と２０ｎｍの間でそれぞれ変わる。同様な脂質化されたポリマー、オレイン酸で置換されたポリビニールから調合されるミセルはまた使用される。

ある実施態様においては、両親媒性ミセル形成分子はＰＥＧ−ＰＥコポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は酸化エチレンのオリゴマーあるいはポリマーである。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）はしばしば微生物膜の主脂質組成である。これは中性あるいは双性イオン性リン脂質（少なくともｐＨ２から７の範囲）である。動物組織において、ホスファチジルエタノールアミンはジアシル、アルキルアシルおよびアルケニルアシル形式で存在する傾向にある。 一般的に、動物のホスファチジルエタノールアミンは他の双性リン脂質、ホスファチジルコリンよりもアラキドンおよびドコサヘキサン酸塩の高い割合を含む傾向がある。これらのポリ不飽和の組成は位置ｓｎ−２に位置ｓｎ−１で最も豊富な飽和脂肪酸とともに濃縮される。

上記のように、薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖が前記混合ミセルの中心から放射状に延びる親水性層を形成し；そして両親媒性ｉＲＮＡ接合はｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の少なくとも一部が親水性層内にあるように混合ミセル中に位置付けされる。他の実施態様においては、ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の部分は親水性層を超えて外側へ放射状に延びない。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖は２００と５００Å（２０．０と５０．０ｎｍ）の間の平均主鎖長を有する。他の実施態様においては、複数の親水性鎖は１００と１，０００Å（１０．０と１００．０ｎｍ）の間、そして５０と２，０００Å（５．０と２００．０ｎｍ）の間の平均主鎖長を有する。

薬学的製剤のある実施態様においては、複数の親水性鎖は１，５００と５，０００の間の平均分子量を有する。他の実施態様においては、複数の親水性鎖は５００と１５，０００の間、そして１，０００と１０，０００の間の平均分子量を有する。

前述のいずれかのある実施態様においては、ミセル形成両親媒性分子の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は長鎖の脂肪酸、リン脂質、脂質および糖脂質のラジカルから選ばれる。

前述のいずれかのある実施態様においては、両親媒性ｉＲＮＡ接合の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はコレステロール、長鎖の脂肪酸、リン脂質、脂質および糖脂質のラジカルから選ばれる。

前述のある実施態様においては、脂肪酸はブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸およびこれらの不飽和の異性体から選ばれる。

前述のある実施態様においては、リン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびスフィンゴミエリンから選ばれる。

前述のある実施態様においては、糖脂質はガラクト脂質、硫脂質、セレブロシドおよびガングリオシドから選ばれる。

前述のいずれかのある実施態様においては、ミセル形成両親媒性分子の親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はＰＥＧ、ＰＥＩ、ポリビニールピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニールアルコール、ポリオキサゾリン、ポリモルホリン、キトサンおよび水溶性ペプチドのラジカルから選ばれる。

前述のある実施態様においては、親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は１，５００と５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有するＰＥＧラジカルである。他の実施態様においては、ＰＥＧラジカルは５００と１５，０００の間および１，０００と１０，０００の間の平均分子量を有する。

ある実施態様においては、ｓｉＲＮＡはコレステロール、他の脂質あるいはリン脂質のような脂質性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に接合される。

ある望ましい実施態様においては、送達システムはＰＥＧ−ＰＥおよびｓｉＲＮＡ−脂質接合を含む混合ミセルである。

５．２本鎖ｉＲＮＡ薬剤および部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）
ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏ−ＲＮＡを含む２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによってｍＲＮＡの配列特定のサイレンシングを目指す。プロセスは動物および他の脊椎動物を含む広いさまざまな生物で起きる。

ｄｓＲＮＡの２１−２３番の断片は、例えば、ＲＮＡ退化を起こすことによって、ＲＮＡサイレンシング配列特定媒介体である。理論を超えることを望むのではなく、単に断片の特定長である分子の信号はＲＮＡｉを媒介するこれらの２１−２３番の断片補充細胞因子に存在することである。

相補性あるいは標的鎖と相同の程度はアンチセンス鎖において最も極限的である。完全な相補性は、特にアンチセンス鎖において、しばしば望まれるけれども、ある実施態様は、特にアンチセンス鎖において、１つあるいはそれ以上であるが望ましくは６、５、４、３、２、あるいはより少ない不整合（標的ＲＮＡに関して）を含む。不整合は、特にアンチセンス鎖において、末端領域において最も耐性があり、そしてもし存在するならば望ましくは１つの末端領域あるいは複数の末端領域、例えば５’および／あるいは３’の末端の６、５、４あるいは３のヌクレオチド内の領域にある。センス鎖は分子の全ての２本鎖特性を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的である必要がある。

ここで討論したように、ｉＲＮＡ薬剤はしばしば修飾される。ｉＲＮＡ薬剤の１本鎖領域はヌクレオシド代用体をしばしば修飾されるかあるいは含む、例えば不対領域あるいはヘアピン構造の領域、例えば２つの相補的領域を連結する領域が修飾あるいはヌクレオシド代用体を有する。ｉＲＮＡ薬剤の５’あるいは３’の末端の１つあるいはそれ以上を安定化し、例えばエキソヌクレアーゼに対して、あるいはＲＩＳＣ内に挿入するためにアンチセンスＲＮＡ薬剤を有効に働かせるための修飾はまた有効である。修飾は、ホスホラミダイトとして由来しそしてＲＮＡ合成の間多重のカップリングを許す他のＤＭＴ−保護ヒドロキシル基を有するＣ３（あるいはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノ連結体、チオール連結体、カルボキシル連結体、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、塩基性、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特定ビオチンあるいはフルオレセイン試薬を含む。

実施例の修飾は次を含む：
（ａ）主鎖修飾、例えば主鎖リンの修飾であって、リンを硫黄あるいはアルキルまたはアリル、例えばＭｅおよびジチオン酸塩（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）で置換されたリンでの置き換えを含む；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するために使用される；
（ｂ）２’−Ｏアルキル、例えば２’−ＯＭｅ、３’−Ｏアルキル、例えば３’−ＯＭｅ（末端および／あるいは中間位置で）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するため、あるいはアンチセンス鎖にセンスの結合を強化するために使用され、あるいは３’修飾はＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためセンス鎖の５’末端で使用される；
（ｃ）２’−５’連結（２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅで、およびＰ＝ＯあるいはＰ＝Ｓで）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するため、あるいはアンチセンス鎖にセンスの結合を禁止するために使用され、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用される；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅをもつＬリボース、Ｌアラビノース）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するためあるいはアンチセンス鎖にセンスの結合を禁止するために使用され、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用される；
（ｅ）修飾された糖（例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡの）、ヘキソース核酸（ＨＮＡの）およびシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡの）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するためあるいはアンチセンス鎖にセンスの結合を禁止するために使用され、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用される；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾されたピリミジン、Ｎ−２修飾されたプリン、Ｎ−７修飾されたプリン、Ｎ−６修飾されたプリン）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するためあるいはアンチセンス鎖にセンスの結合を強化するために使用される；
（ｇ）陽イオン基および双性基（望ましくは末端で）；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進するために使用される；
（ｈ）接合基（望ましくは末端の位置で）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、葉酸、ペプチド、および炭水化物；これらの修飾はヌクレアーゼ抵抗を促進し分子を標的にするため使用され、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の５’末端で使用される。

多重不斉修飾はセンスおよびアンチセンス配列のいずれかあるいは両方に導入される。配列は少なくとも２，４，６，８あるいはそれ以上の修飾を有し，そして配列のモノマーの全てあるいは実質的に全てが修飾される。

６．配位子−接合、担体および標的化
本発明の薬学的組成物を標的にするために細胞型を特定し、薬学的組成物の半減期（例えば、一般的な循環、脳脊椎あるいはリンパ隙において）を増加し、薬学的組成物の生物学的利用能を増大し、そして／あるいは薬学的組成物の細胞穿孔／取り出しを増加するために、薬学的組成物はさらに配位子、担体、（ａ）ｉＲＮＡ薬剤に結合される、（ｂ）分離疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいは両親媒性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合されそして混合ミセルに含まれる、および／あるいは（ｃ）親水性層の親水性鎖に結合される標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む。ある望ましい実施態様おいては、配位子、担体あるいは標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）は、溶媒あるいは細胞外マイクロ環境に曝露されそして受容可能なように、親水性層の親水性鎖に、そして望ましくは、親水性鎖の末端に結合される。例えば、親水性鎖の末端チップは、制限なしに、ＰＥＧおよび他の溶解性ブロック形成ポリマーと一緒に使用されるｐ−ニトロフェニール（ｐＮＰ）カルボニル基を含む種々の既知の化学薬品によって活性化される。

かくして、ｉＲＮＡ薬剤、両親媒性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および／あるいは親水性鎖は配位子接合モノマーサブユニットを任意に含む。担体（また、ある実施態様では“連結体”として参照される）は環式あるいは非環式部分（ｍｏｉｅｔｙ）でありそして２つの“主鎖結点”（例えば、ヒドロキシル基）および配位子を含む。配位子はつなぎの鎖（例えば、１つあるいはそれ以上の原子の非環式鎖；あるいは核酸塩基、例えば、１つあるいはそれ以上の化学修飾を任意に有する自然に起きる核酸塩基、例えば、通常でない塩基；あるいは一般的な塩基）によって直接的に担体に取り付けられる（例えば、接合される）かあるいは間接的に担体に取り付けられる（例えば、接合される）。１つの実施態様においては、担体はヒドロキシプロリノールである。

ｉＲＮＡ薬剤に結合されたとき、配位子−接合モノマーサブユニットはｉＲＮＡ分子の５’あるいは３’末端サブユニットである。代わりに、配位子−接合モノマーサブユニットは内部の位置を占める。１つ以上の配位子−接合モノマーサブユニットがｉＲＮＡ薬剤に存在する。例えば、脂溶性部分（ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、コレステロールがキャリアに繋ぎ鎖で繋がれる配位子−接合モノマーサブユニットの包接のための望ましい位置はセンス鎖の３’末端、５’末端、あるいは内部の位置である。

ある実施態様においては、配位子は組み込まれるｉＲＮＡ薬剤の分布、標的あるいは寿命を変える。ある実施態様においては、配位子は選ばれた標的、例えば、分子細胞、細胞型、区画、例えば、細胞あるいは器官の区画、組織、器官、身体の領域に対して、例えば、配位子のような欠落した種と比較して、強調された親和性を提供する。

配位子は輸送、分子交雑、特異性を改善し、そして結果として生じる自然のあるいは修飾されたオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗、あるいはここに記載されるいろいろなモノマーおよび／あるいは自然のあるいは修飾されたリボヌクレオチドの組み合わせからなるポリマー性分子を改善する。

一般的に配位子は、治療の修飾体、例えば、強化摂取；診断上の化合物あるいはリポーター基、例えば、分布を調査するための；架橋結合薬剤；部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を授与するヌクレアーゼ抵抗；そして自然あるいは異常な核塩基を含む。一般的な例は親油性物、脂質、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルピン、例えば、サルササポゲニン、フリーデニン、エピフリーデラノール誘導リトコール酸）、ビタミン（例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール）、炭水化物、蛋白質、蛋白質結合薬剤、インテグリン、標的分子、ポリ陽イオン体、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド擬似体を含む。

配位子は自然に生ずる物質（例えば、人の血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、あるいはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサンイ、イヌリン、シクロデキストリンあるいはヒアルロン酸）；アミノ酸、あるいは脂質を含む。配位子はまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸のような再結合物あるいは合成分子を含む。このようなポリマーの例はポリリジン（ＰＬＬ）のようなポリアミノ酸、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、およびスチレンマレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニールエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニールアルコール、（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、あるいはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例はポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド擬似体、ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、例えば、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩あるいはαヘリカルペプチドを含む。

配位子はまた標的グループ、例えば、細胞あるいは組織、例えば、レクチン、糖蛋白質、脂質あるいは蛋白質、例えば、腎臓細胞のような特定細胞型に結合する抗体を含む。標的グループはチロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖蛋白質、表面活性蛋白質Ａ、ムチン炭化水素、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレストロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、あるいはＲＧＤペプチドあるいはＲＧＤペプチド擬似体。

他の配位子の例は染料、挿入薬剤（例えば、アクリジン）、架橋結合体（例えば、ソラレン、ミトマイシンＣ）、ポリフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、ポリ環状芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクリアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレストロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロングリセロール（例えば、それらのエステルおよびエーテル、例えば、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０アルキル；例えば、１，３−ｂｉｓ−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、１，３−ｂｉｓ−Ｏ（オクタデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシルグループ、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシルグループ、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コラン酸、ジメトキシトリチルあるいはヘノキサジン）およびペプチド接合（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカラプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］_２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性物質標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール接合、テトラ−アザ大環状のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニール、ＨＲＰあるいはＡＰを含む。

例えば、染料は画像薬剤として作用するために本発明の薬学的製剤に接合される。このような画像薬剤は標的細胞に本発明のｉＲＮＡの摂取の検知および本発明の薬学的製剤の薬学動態学の研究に対して有益である。このような画像薬剤は、例えば、親水性層の親水性鎖にキレート基を接合し、そしてγあるいはＮＭＲ画像に対しキレート基に重金属（例えば、^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ）をキレートにすることによって作成される。ここに記述するように、蛍光染料（例えば、Ｃｙ３）は薬学的製剤に接合される。かくして、他の観点で、本発明は本発明の混合ミセルの摂取、局所化、そして／あるいは薬学動態学の検知するあるいは画像化のための方法および製品を提供する。

配位子は蛋白質、例えば、糖蛋白質あるいはペピチド、例えば、共配位子あるいは抗体あるいは抗体に特定の親和性を有する分子、例えば、癌細胞、内皮細胞あるいは骨細胞のような特定細胞型に結合する抗体である。配位子はまたホルモンおよびホルモン受容体を含む。これらはまた脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、あるいは多価フコースのような非ペプチド種を含む。配位子は、例えば、リポポリサッカライド、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化剤、あるいはＮＦ−κＢである。

配位子は物質、例えば、ｉＲＮＡの細胞への摂取、例えば、細胞の細胞骨格を分離することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維および／あるいは中間の線維を分離することによって増加する薬剤である。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランキュリンＡ、ファロイジン、スウインホリドＡ、インダノシン、あるいはマイオセルビンである。

配位子は細胞中へのｉＲＮＡ摂取を、例えば、炎症性応答を活性化することによって増加する。例示的な配位子は効果が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、あるいはγインターフェロンのようなものである。

１つの観点で、配位子は脂質あるいは脂質塩基分子である。このような脂質あるいは脂質塩基の分子は血清蛋白質、例えば、人の血清アルブミン（ＨＳＡ）を望ましくは結合する。ＨＳＡ結合配位子は標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織へ接合の分布をさせる。例えば、標的組織は肝臓の実質細胞を含む肝臓である。ＨＳＡを結合する他の分子はまた配位子として利用される。例えば、ネプロキシンあるいはアスピリンが使用される。脂質あるいは脂質塩基配位子は（ａ）接合の退化への抵抗を増加し、（ｂ）標的細胞あるいは標的膜への標的化あるいは輸送を増加し（ｃ）血清蛋白質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用される。

他の観点で、配位子は部分（ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、標的細胞、例えば、増殖細胞によって摂取されるビタミンである。これらは希望しない細胞増殖、例えば、マリグナントあるいは非マリグナント型、例えば、癌細胞によって特徴づけられる障害を処置するために特に有用である。例示的ビタミンはビタミンＡ、ＥおよびＫである。他の例示的ビタミンはビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールあるいは他のビタミンあるいは癌細胞によって摂取される栄養剤を含む。また、ＨＳＡおよび低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）が含まれる。

他の観点で、配位子は細胞透過あるいは細胞侵入薬剤である。例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００８），Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０（４−５）：５４８−５８は薬学的ナノ担体のＴａｔ ペプチド−修飾細胞内送達を開示している。ある実施態様においては、薬剤は両親媒性である。例示的薬剤はＴＡＴ、アンテノペジア、ペネトラチン、アルギニンオリゴマー（例えば、Ｒ８あるいはＲ９）のようなペプチドを含む。もし薬剤がペプチドであれば、ペプチジル擬似体あるいはインバートマーのように修飾されるか、あるいは非ペプチドあるいはペプチド結合あるいはＤ−アミノ酸を含む。ヘリカル状薬剤は、ある実施態様においては、親油性および疎油性相を有するαヘリカル状薬剤である。

増殖細胞に濃縮されたマーカーを標的とするペプチドが使用される。例えば、ペプチドおよびペプチド擬似体を含むＲＧＤは癌細胞、Ｉ_Ｖ９_３インテグリンを特に現す細胞を標的とする。かくして、人は合成ＲＧＤと同様にＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチドを使用することができた。さらに、人はＩ_Ｖ９_３インテグリン配位子を標的とする他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を使用する。通常、このような配位子は増殖細胞および血管新生を制御するために使用される。この型の接合はＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、あるいは癌遺伝子、例えば、ここに記載する癌遺伝子を標的とする薬学的組成物を含む。

糖、例えば、ガラクトースおよび／あるいはその擬似体を組み込む標的薬剤はまた有用である。これらの薬剤は、特に、肝臓の実質細胞を標的とする。例えば、標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）は１つあるいは２つあるいは３つのガラクトース部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）を、互いに約１５Å（１．５ｎｍ）間隔をおいて含む。標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）は代わりとしてガラクトースにカップリングするグルコースであるラクトース（例えば、３つのラクトース部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ））である。標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）はまたＮ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンである。マンノースあるいはマンノース−６−リン酸塩標的部分（ｍｏｉｅｔｙ）はマクロファージ標的のため使用される。

配位子はペプチドあるいはペプチド擬似体である。ペプチド擬似体（またオリゴペプチド擬似体を参照）は天然のペプチドと同様な定義された３次元構造中に保持されることのできる分子である。ペプチドおよびペプチド擬似体の本発明の薬学的化合物への結合は細胞の認識および吸収を強化することによるように組成の薬学動力学的分布に影響する。ペプチドおよびペプチド擬似体部分（ｍｏｉｅｔｙ）は５−５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５あるいは５０のアミノ酸長さである。ペプチドおよびペプチド擬似体は、例えば、細胞透過ペプチド、陽イオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、あるいは疎水性ペプチドド（例えば、第１級のＴｙｒ、ＴｒｐあるいはＰｈｅを含む）である。ペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）はデンドリマーペプチド、制約されたペプチドあるいは交差結合されたペプチドである。

ＲＧＤペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）は内皮腫瘍細胞あるいは胸癌腫瘍細胞のような腫瘍細胞を標的とするために使用される（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６２：５１３９−４３）。ＲＧＤペプチドは肺、腎臓、脾臓あるいは肝臓を含む他の広範囲の組織の腫瘍に標的化することを容易にする（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７）。ある実施態様においては、ＲＧＤペプチドは腎臓に薬学的組成の標的化を容易にする。ＲＧＤペプチドは直線あるいは環状であり、そして修飾される、例えば、特定の組織への標的化を容易にするためにグリコシル化あるいはメチル化される。例えば、グリコシル化されたＲＧＤペプチドはα_Ｖβ_３を発現する腫瘍細胞に薬学的組成を送達する（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：３２６−３３６）。

“細胞透過ペプチド”は微生物細胞（例えば、バクテリアあるいは菌細胞）あるいはヒト細胞（例えば、人間細胞）のような細胞を透過できる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、α−ヘリカル直線ペプチド（例えば、ＬＬ−３７あるいはセロピンＰ１）、二硫化物結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシンあるいはバクテネシン）、あるいは単に１つあるいは２つの抑制アミノ酸を含むペプチド（例えば、ＰＲ−３９あるいはインドリシジン）である。細胞透過ペプチドはまた核局所化信号（ＮＳＬ））を含む。例えば、細胞透過ペプチドはＳＶ４０大型Ｔ抗原のＨＩＶ−１ｇｐ４１およびＮＬＳの融合成育圏から誘導されるＭＰＧのような偶両親媒性ペプチドである（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４）。

ある実施態様においては、配位子はアミン、例えば、ジエメルアミノを置換する。ある実施態様においては、置換アミンは、例えば、四級化、例えば、プロトン化あるいはアルキル化によって陽イオン化される。ある実施態様においては、置換アミンは比較的疎水性鎖、例えば、アルキレン鎖の末端位置にある。

ある実施態様においては、配位子は次のトリテルペンの１つである。

ある実施態様においては、配位子はコレステロールあるいは他の脂質あるいはリン脂質である。

ｉＲＮＡ薬剤は：インターフェロン応答を誘発するに十分に長く（リボヌクレアーゼダイサーによって開裂され（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６）そしてＲＩＳＣ（ＲＮＩｉ−誘導サイレンシング錯体）を侵入する分子；そしてインターフェロン応答を誘発しない十分に短い（ダイサーによって開裂されないそして／あるいはＲＩＳＣを侵入する）分子、例えば、ＲＩＳＣに侵入できる寸法の分子、例えば、ダイサー開裂産生物に似ている分子を含む。インターフェロン応答を誘発しない十分に短い分子はここでｓＲＮＡ薬剤あるいは短いｉＲＮＡ薬剤で末端とされる。ここで使用される“ｓＲＮＡ薬剤あるいは短いｉＲＮＡ薬剤”は、例えば、人細胞に有害なインターフェロン応答を誘発しない十分に短い２本鎖あるいは１本鎖、例えば、６０より少ないがしかし望ましくは５０、４０あるいは３０のヌクレオチド対の２重構造の領域を有するｉＲＮＡ薬剤に関する。ｓＲＮＡ薬剤あるいはその開裂産生物は、例えば、標的ＲＮＡ、望ましくは内性的あるいは病原性標的ＲＮＡに関して、ＲＮＡｉを誘導することによって標的遺伝子を下方に制御する。

ｓＲＮＡ薬剤の各鎖は長さで３０、２５、２４、２３、２２、２１、あるいは２０のヌクレオチドに等しいかあるいはこれより小さい。鎖は望ましくは長さで少なくとも１９のヌクレオチドである。例えば、各領域は長さで２１と２５のヌクレオチドの間である。望ましいｓＲＮＡ薬剤は１７、１８、１９、２０、２１、２２，２３、２４あるいは２５のヌクレオチド対、および１つあるいはそれ以上の張り出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）、望ましくは２−３のヌクレオチドの１つあるいは２つの３’張り出しを有する。

ＲＮＡを標的とする相同および標的遺伝子を下方に制御する能力に加えて、ｉＲＮＡ薬剤は１つあるいはそれ以上の次の性質を有する。
（１）もし１本鎖であれば、それは１つあるいはそれ以上のリン酸塩基ある
いはそれは１つあるいはそれ以上のリン酸塩基の同類を含む５’修飾を有する。
（２）修飾に拘わらず、大変大きい数あるいは全てのヌクレオシドに対して
さえ、それは標的の制御を十分落とす、例えば、標的ＲＮＡの開裂によって、相同の標的ＲＮＡで正しい塩基対および二重構造を形成することができるように、適当な３次元枠組みに塩基（あるいは装飾された塩基）を提供するアンチセンス鎖を有する。
（３）修飾に拘わらず、大変大きい数あるいは全てのヌクレオシドに対して
さえ、それは、例えば、ＲＮＡ分子の全体の構造、化学および物理的性質を処理する“ＲＮＡのような”性質を、独占的でなくあるいは部分的でさえリボヌクレオチド塩基含有量であったとしても、なお有する。例えば、ｉＲＮＡ薬剤は、例えば、ヌクレオチド糖の全てが、例えば、２’ヒドロオキシルの位置に２’フルオロを含むセンスおよび／あるいはアンチセンス鎖を含む。このデオキシリボヌクレオチド含有薬剤はなおＲＮＡのような性質を発現することをなお期待される。理論を期待するのではなく、陰電性フッ素はリポースのＣ２’の位置に結合するとき軸方位が望ましい。このフッ素の螺旋状の優先性は、言い替えれば、Ｃ_３・−ｅｎｄｏ皺を採用するために糖に力を掛ける。これはＲＮＡ分子で観察される同じ皺モードであり。そしてＲＮＡ特性Ａ−ファミリー型ヘリックスに上昇を与える。さらに、フッ素は良い水素結合受容体であるので、ＲＮＡ構造を安定化させるために知られている水分子との同じ水素結合相互反応に関与する。（通常、２’糖位置で修飾部分（ｍｏｉｅｔｙ）はデオキシリボヌクレオチドのＨ部分（ｍｏｉｅｔｙ）よりボヌクレオチドのＯＨ部分（ｍｏｉｅｔｙ）のもっと特性であるＨ結合に侵入できることが望まれる）。例えば、ある実施態様においては、ｉＲＮＡ薬剤は：その糖の全てあるいは少なくとも５０、７５、８０、８５、９０あるいは９５％でＣ_３・−ｅｎｄｏ皺を示し；ＲＮＡ特性Ａ−ファミリー型ヘリックスに上昇を与える十分な糖の量でＣ_３・−ｅｎｄｏ皺を示し；Ｃ_３・−ｅｎｄｏ皺構造でない２０、１０、５、４，３、２あるいは１の糖よりも多くを有さない。これらの制約はアンチセンス鎖において望まれる。
（４）修飾の性質に拘わらず、そしてＲＮＡ薬剤は特に張り出しあるいは１本鎖領域でデオキシヌクレオチドあるいは修飾デオキシヌクレオチドを含んでいるけれども、ＤＮＡ分子あるいは分子中にヌクレオチドの５０、６０あるいは７０％よりも多く、あるいは二重領域中にヌクレオチドの５０、６０あるいは７０％よりも多くが２’位置でデオキシリボヌクレオチドあるいは修飾デオキシリボヌクレオチドであるいずれの分子もＲＮＡ薬剤の定義から排除されることが望まれる。

ここで使用される“１本鎖ｉＲＮＡ薬剤”は１本分子で創り上げられるｉＲＮＡ薬剤である。それは内部鎖対によって形成される二重領域を含む、例えば、ヘアピンあるいは平鍋の取っ手構造であるかあるいはこれを含む。１本鎖ｉＲＮＡ薬剤は望ましくは標的分子に関連を持つアンチセンスである。望ましい実施態様のｉＲＮＡ薬剤は５’リン酸化であり、あるいは５’最初の末端でホスホリル同類を含む。５’−リン酸塩修飾はＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと交換可能なものを含む。適切な修飾は：５’モノリン酸塩 （（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５）；５’−ジリン酸塩 （（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリリン酸塩 （（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシン キャップ（７−メチル化あるいは非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−５’）；５’アデノシン キャップ（Ａｐｐｐ）、および修飾あるいは非修飾ヌクレオチド キャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸塩（ホスホロチオアート）；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’モノジチオリン酸塩（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’− ホスホロチオアート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；モノリン酸塩、ジリン酸塩、トリリン酸塩を置き換えた酸素／イオウのいずれかの追加的組み合わせ（例えば、５’−α−チオトリリン酸塩、５’−γ−チオトリリン酸塩等）、５’−リンアミノ酸塩（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルリン酸塩（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルリン酸塩（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）を含む。（これらの修飾は２本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖と共にまた使用される。）

１本鎖ｉＲＮＡ薬剤はそれがＲＩＳＣを侵入しそして標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介開裂に関与するに十分長くあるべきである。１本鎖ｉＲＮＡ薬剤は少なくとも１４そしてもっと望ましくは、少なくとも長さで１５、２０、２５、３０、３５，４０あるいは５０のヌクレオチドである。それは長さで２００、１００あるいは６０のヌクレオチドより望ましくは小さい。

ヘアピンｉＲＮＡ薬剤は１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４あるいは２５のヌクレオチド対に等しいかあるいは少なくともこの数である二重領域を有する。二重領域は望ましくは長さで２００、１００あるいは５０に等しいかあるいは小さい。二重領域の好ましい範囲は長さで１５−３０、１７−２３そして１９−２１のヌクレオチド対である。ヘアピンは望ましくは１本鎖張り出し末端非対領域、望ましくは３’そして望ましくはヘアピンのアンチセンス側を有する。望ましい張り出しは長さで２−３のヌクレオチドである。

ここで使用される“２本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ薬剤”は鎖を繋ぐ分子交雑が２重構造の領域を形成する１つ以上、そして望ましくは２つの鎖を含むｉＲＮＡ薬剤である。

２本鎖ｉＲＮＡ薬剤のアンチセンス鎖は長さで１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、３０、４０あるいは６０のヌクレオチドに等しいかあるいは少なくともこの値であるべきである。それは長さで２００、１００あるいは５０のヌクレオチドに等しいかあるいは小さくあるべきである。望ましい範囲は長さで１７−２５、１９−２３、そして１９−２１のヌクレオチドである。

２本鎖ｉＲＮＡ薬剤のセンス鎖の部分は長さで１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、３０、４０あるいは６０のヌクレオチドに等しいかあるいは少なくともこの値であるべきである。それは長さで２００、１００あるいは５０のヌクレオチドに等しいかあるいは小さくあるべきである。望ましい範囲は長さで１７−２５、１９−２３、そして１９−２１のヌクレオチドである。

２本鎖ｉＲＮＡ薬剤の２本鎖部分は長さで１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、３０、４０あるいは６０のヌクレオチド対に等しいかあるいは少なくともこの値であるべきである。それは長さで２００、１００あるいは５０のヌクレオチド対に等しいかあるいは小さくあるべきである。望ましい範囲は長さで１７−２５、１９−２３、そして１９−２１のヌクレオチド対である。

多くの実施態様においては、ｉＲＮＡはそれが内性の分子によって、例えば、ダイサーによって、より低分子のｄｓ ｉＲＮＡ薬剤、例えば、ｓＲＮＡｓ薬剤を産生するために開裂されるに十分に大きい。

センスおよびアンチセンス鎖はｄｓ ｉＲＮＡ薬剤が分子の一端あるいは両単で１本鎖あるいは非対領域を含むように選ばれる。かくして、ｄｓ ｉＲＮＡ薬剤は張り出し、例えば１つあるいは２つの５’あるいは３’張り出しであるが望ましくは２−３のヌクレオチドの３’張り出しを含むために望ましい対であるセンスおよびアンチセンス鎖を含む。最も多くの実施態様は３’張り出しを有する。望ましｓＲＮＡ薬剤は、各端で長さで１あるいは望ましくは２のあるいは３のヌクレオチドの１本鎖の張り出し、望ましくは３’張り出しを有する。張り出しは他より長い１本の鎖の結果であるかあるいは同じ長さの２本鎖が捻れている結果である。５’端は望ましくはホスホリル化されている。

２重領域に対する望ましい長さは１５と３０の間、もっと望ましくは長さで１８、１９、２０、２１、２２および２３のヌクレオチド、例えば、ｓＲＮＡ薬剤では上記で検討した範囲である。ｓＲＮＡ薬剤は長さおよび構造において長いｄｓＲＮＡｓから自然のダイサー処理産生物に似ている。ｓＲＮＡ薬剤の２本の鎖が結合している実施態様、例えば、共有結合がまた含まれる。ヘアピンあるいは要求される２本鎖領域、および望ましくは３’張り出しを提供する他の１本鎖構造はまた本発明の内である。

ｄｓ ｉＲＮＡ薬剤およびｓＲＮＡ薬剤を含むここに記載された分離されたｉＲＮＡは標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのサイレンシング、例えば、蛋白質をコード化する遺伝子の転写を媒介する。好都合に、このようなｍＲＮＡはまたサイレンスされるｍＲＮＡとして参照される。このような遺伝子はまた標的遺伝子として参照される。通常、サイレンス化されるＲＮＡは内皮性遺伝子あるいは病原性遺伝子である。付け加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡｓ、例えば、ｔＲＮＡｓおよびウイルスのＲＮＡｓはまた標的化される。

ここで使用されるように、語句“媒介ＲＮＡｉ”は配列特定様式、標的ＲＮＡでサイレンスに能力があるとして参照される。理論を超えて希望するのではなく、サイレンシングはＲＮＡｉ機序あるいは作用およびガイドＲＮＡ、例えば、２１から２３のヌクレオチドのｓＲＮＡ薬剤を使用する。

ここで使用されるように、“特定の分子交雑が可能な”および“相補的な”は安定でそして特定な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子間におきる相補性の十分な程度を示すために使用される用語である。特定の結合が望まれる条件、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ検定あるいは治療上の処置の場合、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ検定の場合における生理学的条件で検定が行われる条件で、特定の結合はオリゴマー化合物の非特定結合を非標的配列に対して避けるために相補性の十分な程度を要求する。非標的配列は典型的に少なくとも５のヌクレオチドだけ異なる。

１つの実施態様においては、ｉＲＮＡ薬剤は、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して、ｉＲＮＡ薬剤が標的ｍＲＮＡによってコード化された蛋白質の産生物をサイレンスするように“十分に相補的”である。他の実施態様においては、ｉＲＮＡ薬剤は標的ＲＮＡに“正確に相補的で”（サブユニットを含むＲＲＭＳを除く）あり、例えば、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ薬剤が正確な相補性の領域でＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対の排他的に作られる交雑を望ましくは形成するためにアニールする。“十分に相補的”標的ＲＮＡは標的ＲＮＡに対して正確に相補的である内部領域（例えば、少なくとも１０のヌクレオチド）を含む。さらに、ある実施態様においては、ｉＲＮＡ薬剤は１本のヌクレオチド差を特に区分する。この場合において、ｉＲＮＡ薬剤は、もし正確な相補性が１本のヌクレオチド差の領域（例えば、７のヌクレオチド内で）で発見されるならばＲＮＡｉのみを媒介する。

ここで使用されるように、用語“ヌクレオチド”は望ましくは１００、２００、３００あるいは４００のヌクレオチド以下の長さの核酸分子（ＲＮＡあるいはＤＮＡ）に関する。

ここで議論されるＲＮＡは修飾されたＲＮＡと同様に違ったやり方の非修飾ＲＮＡを、例えば、有効性およびヌクレオシド代用体のポリマーを改善するために含む。非修飾ＲＮＡは核酸の組成、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）が自然に起きる、望ましくは人間の身体で自然に起きる同じかあるいは必須的に同じである分子に関する。技術は修飾ＲＮＡｓとしてＲＮＡｓを、希にあるいは異常な自然に起きること参照してきた、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３―２１９６を参照。このような希なあるいは異常なＲＮＡｓはしばしば用語の修飾ＲＮＡｓ（明らかにこれらは典型的に後転写的修飾の結果であるため）はここで使用されるように用語 非修飾ＲＮＡ内である。

（参照文献）
（一般参照文献）
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは固体相合成である。例えば、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編“オリゴヌクレオチド合成、実際の接近方法”ＩＲＬプレス １９８４；Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編“オリゴ゛ヌクレオチドおよび類似体、実際の接近” ＩＲＬプレス １９９１（特に第１章、オリゴデオキシリボヌクレオチド合成、第２章、オリゴリボヌクレオチド合成、第３章、２’−Ｏ−メチルオリゴリボ゛ヌクレオチド−ｓ：合成および応用。第４章、ホスホロアートオリゴリボ゛ヌクレチド、第５章、オリゴ゛ヌクレオチドホスホジチオアートの合成；第６章、オリゴ−２’−デオキソリボヌクレオシドメチルリン酸塩の合成、および第７章、修飾塩基を含むオリゴ゛デオキシヌクレオチドを参照。他の実用的な有用な合成手順、薬剤、ブロッキング基および反応条件はＭａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４あるいはそこに参照される参照文献に記述される。ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ０１／７５１６４、あるいはＷＯ０２／４４３２１はここで利用される。

（リン酸塩グループ参照文献）
ホスホン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号５，５０８，２７０に記載される。アルキルホスホン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号４，４６９，８６３に記載される。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号５，２５６，７７５あるいはＵＳ特許番号５，３６６，８７８に記載される。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号５，０２３，２４３に記載される。臭化リン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号５，１３０，３０２およびＵＳ特許番号５，１７７，１９８、に記載される。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデイトオリゴリボヌクレオチドの調合はＵＳ特許番号５，４７６，９５２に記載される。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホン酸塩オリゴリボヌクレオチドの調合はＡｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１、６６，２７８９−２８０１に記載される。硫黄架橋ヌクレオチドの調合はＳｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載される。

（糖グループ参照文献）
２’修飾に対する修飾はＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４およびこの中の全ての引用文献に発見される。リボースへの特定修飾は次の参照文献に発見される：２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１），２’−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０−１９３８），“ＬＮＡ”（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１―３１０）。

（リン酸塩グループ参照文献の取替）
例えば交互のＭＭＩおよびＰＯあるいはＰＳ結合を有する混合主鎖化合物と同様に、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシド、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシドとしてまたここで認識され、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドおよびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオチドとしてまたここで認識され、アミド−３結合オリゴリボヌクレオシドおよびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシドとしてまたここで認識され、アミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしてまたここで認識されるメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシドはＵＳ特許番号５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７およびＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４およびＰＣＴ／ＵＳ／９２／０４３０５（それぞれＷＯ９２／２０８２２および９２／２０８２３として公表されている）で記載されるように調合される。ホルマールおよびチオホルマール結合オリゴリボヌクレオシドはＵＳ特許番号５，２６４，５６２および５，２６４，５６４に記載されるように調製される。酸化エチレン結合オリゴリボヌクレオシドはＵＳ特許番号５，２２３，６１８に記載されるように調製される。シロキサン置換はＣｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載される。炭酸塩置換はＴｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ １９７１，１９３３に記載される。カルボキシメチル置換はＥｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載される。カルバミ酸塩置換はＳｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載される。

シクロブチル糖代理体化合物はＵＳ特許番号５，３５９，０４４に記載されるように調合される。ピロリジン糖代理体はＵＳ特許番号５，５１９，１３４に記載されるように調合される。モルホリノ糖代理体はＵＳ特許番号５，１４２，０４７および５，２３５，０３３そして他の関連特許開示に記載されるように調合される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体よくを知られておりそしてペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する種々の手順：合成、性質および可能な応用、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３のいずれかに従って調合される。これらはＵＳ特許番号５，５３９，０８３に従って調合される。

（末端修飾参照文献）
末端修飾はＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）およびここの参照文献に記載される。

（塩基参照文献）
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトはＵＳ特許番号５，４５９，２５５に記載されるように調合される。３−デアゾプリンヌクレオシドアミダイトはＵＳ特許番号５，４５７，１９１に記載されるように調合される。５，６置換ピリミジンヌクレオシドはＵＳ特許番号５，６１４，６１７に記載されるように調合される。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトはＵＳ特許番号５，４８４，９０８に記載されるように調合される。追加的な参照文献は塩基修飾についての上記の節に記載される。

７．送達モジュール
本発明の薬学的組成はモジュラー錯体を特徴づける送達薬剤に錯体化される。錯体は（ａ）凝縮薬剤（例えば、引き付け可能な薬剤、例えば、核酸を結合する、例えば、イオンあるいは静電気的相互作用によって）；（ｂ）細胞融合を引き起こす薬剤（例えば、融合可能なおよび／あるいは細胞膜、例えば、エンドソーム膜を通して輸送されるに可能な薬剤）；および（ｃ）標的グループ（例えば、細胞あるいは組織標的薬剤、例えば、レクチン、糖脂質、脂質あるいは蛋白質、例えば、腎臓細胞のような特定細胞型に結合する抗体の１つあるいはそれ以上（望ましくは２つあるいは３つ、さらに望ましくは３つの全て）に結合される担体薬剤を含む。

かくして、ここに記述される薬学的組成はモジュラー錯体に結合される（ｌｉｎｋｅｄ）、例えば、結合される（ｃｏｕｐｌｅｄ）あるいは結合される（ｂｏｕｎｄ）。薬学的組成は錯体の凝縮薬剤と反応し、そして錯体はｉＲＮＡ
薬剤を細胞へ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏで、送達するために使用される。例えば、錯体はｉＲＮＡ薬剤をそれを必要とする被験者へ送達するため、例えば、ｉＲＮＡ薬剤を障害、例えば、腎臓の疾病あるいは障害のようなここに記載される障害を有する被験者へ送達するために使用される。

細胞融合を引き起こす薬剤および凝縮薬剤は異なる薬剤であるかあるいは１つのそして同じ薬剤である。例えば、ポリアミノ鎖、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は細胞融合を引き起こす薬剤そして／あるいは凝縮薬剤である。

送達薬剤はモジュラー薬剤である。例えば、錯体は次の１つあるいはそれ以上（望ましくは２つあるいはそれ以上、さらに望ましくは３つの全て）に結合される担体薬剤を含む：
（ａ）凝縮薬剤（例えば、引き付け可能な薬剤、例えば、核酸を結合する、例えば、イオン性相互反応によって）、
（ｂ）細胞融合を引き起こす薬剤（例えば、細胞融合を引き起こすことが可能なおよび／あるいは細胞膜、例えば、エンドソーム膜を通して輸送されるのに可能な薬剤）および
（ｃ）標的グループ、例えば、細胞あるいは組織標的薬剤、例えば、レクチン、糖蛋白質、脂質、例えば腎臓細胞のような特定細胞型に結合する抗体。標的グループはチロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖蛋白質、表面活性蛋白質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グルコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレストロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン、あるいはＲＧＤペプチドあるいはＲＧＤペプチド擬似体である。

７．１担体薬剤
ここで記載されるモジュラー錯体の担体薬剤は凝縮薬剤、細胞融合を引き起こす薬剤および標的グループの１つあるいはそれ以上の取り付のための基板である。担体薬剤は望ましくは内性の酵素活性を欠いている。標的は望ましくは生物学的分子、望ましくはマイクロ分子である。ポリマー性生物学的担体が望ましい。担体分子は生物分解性であることが望ましい。

担体薬剤は蛋白質（例えば、人の血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）あるいはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸）；あるいは脂質のような自然に発生する物質である。担体分子はまた合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸のような再結合物あるいは合成分子である。合成ポリマーの実施例はポリリジン（ＰＬＬ）、アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、およびスチレンマレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコシド）コポリマー、ジビニールエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニールアルコール、（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーあるいはポリホスファジンのようなポリアミノ酸を含む。他の有用な担体分子は日常の方法によって確認される。

担体薬剤は（ａ）少なくとも寸法で１Ｄａである；（ｂ）少なくとも５の電荷基、望ましくは５と５０００間の電荷基を有し；（ｃ）担体薬剤と細胞融合を引き起こす薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在し；（ｅ）担体薬剤と標的薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在することのうちの１つあるいはそれ以上によって特徴づけられる。

７．２ 細胞融合薬剤
ここに記載するモジュラー錯体の細胞融合薬剤は、例えば、ｐＨ環境に依存する電荷の変化に応答する薬剤である。エンドソームのｐＨに出会うと、それは物理的変化、例えば、エンドソーム膜の透過性を混乱しあるいは増加する浸透性の変化を引き起こす。ある実施態様においては、細胞融合を引き起こす薬剤は、生理学上の範囲よりも低いｐＨで、電荷を変化する、例えば、陽子化する。例えば、細胞融合を引き起こす薬剤はｐＨ４．５−６．５で陽子化する。細胞融合を引き起こす薬剤は、錯体が摂取され、例えば、エンドサイトーシス経由で、細胞によって、それにより細胞中のｉＲＮＡ薬剤の細胞濃度を増加した後、ｉＲＮＡ薬剤を細胞の細胞質内に放出する。

ある実施態様においては、細胞融合薬剤は部分（ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、アミノ基を有し、これは特定のｐＨ範囲に曝らされるとき、変化、例えば、電荷において、例えば、陽子化を受ける。ある実施態様においては、細胞融合薬剤の電荷の変化は変化、例えば、小胞、例えば、細胞内小胞、例えば、エンドサームにおける浸透圧の変化を誘発する。例えば、細胞融合薬剤はエンドサームのｐＨ環境に曝されるとエンドサーム膜の多孔性を実質的に十分に増加する（多分、破壊する）溶解度あるいは浸透圧の変化を引き起こす。

細胞融合薬剤はポリアミノ鎖、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなポリマーである。ＰＥＩは線状で、側鎖があり、合成あるいは天然である。ＰＥＩは、例えば、アルキル置換ＰＥＩあるいは脂質置換ＰＥＩである。

ある実施態様においては、膜融合薬剤はヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチンあるいはポリアセタール物質、例えば、陽イオン性ポリアセタールである。ある実施態様においては、細胞融合薬剤はαヘリカル構造である。膜融合薬剤は膜分裂的な薬剤、例えば、メリチンである。

細胞融合薬剤は１つあるいはそれ以上の次の特徴を有する：（ａ）少なくとも寸法で１Ｄａである；（ｂ）少なくとも１０の電荷基、望ましくは１０と５０００の電荷基、さらに望ましくは５０と１０００の電荷基を有し；（ｃ）細胞融合薬剤と凝縮薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在し；（ｅ）細胞融合薬剤と標的薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在する。

他の適切な細胞融合薬剤は熟練した技工によって試験されそして同定される。例えば、ｐＨ環境に依存して変化する電荷に応答する化合物の効能は日常的な方法、例えば、細胞検定によって検査される。例えば検査化合物は細胞と組み合わされるかあるいは接触され、そして細胞は試験化合物を、例えば、貧食によって摂取されるようにする。エンドソーム調合剤はそれから接触細胞から作られ、そしてエンドソーム調合剤は制御細胞からのエンドソーム調合剤と比較される。接触細胞対制御細胞からのエンドサーム分割の変化、例えば、減少は試験化合物が細胞融合薬剤として機能することを示す。代わりとして、接触細胞および制御細胞は、細胞のエンドサーム母集団の差異を決定するために顕微鏡、例えば、光学あるいは電子顕微鏡によって評価される。試験化合物は標識化される。他の型の検定において、ここに記載されるモジュラー錯体は１つあるいはそれ以上の試験あるいは推測細胞融合薬剤を使用して構成される。モジュラー錯体はｉＲＮＡの代わりに標識化された核酸を使用して構成される。例えば、ｐＨ環境に依存する電荷の変化に応答する細胞融合薬剤の効能は、一旦、モジュラー錯体が細胞によって摂取されると、例えば、上述のようにエンドサーム調合剤の調合あるいは顕微鏡技術によって評価される。２つの段階の検定が行われ、ここでは第１の検定は、例えば、ｐＨ環境に依存する電荷の変化に応答する試験化合物のみの効能を評価し；そして第２の検定は、例えば、ｐＨ環境に依存する電荷の変化に応答する試験化合物を含むモジュラー錯体の効能を評価する。

７．３ 凝縮薬剤
ここに記載するモジュラー錯体の凝縮薬剤は、（ａ）凝縮する、例えば、薬学的組成の寸法あるいは電荷を縮小するそして／あるいは（ｂ）薬学的組成を保護する、例えば、退化に対してｉＲＮＡ薬剤を保護する本発明の薬学的組成と反応する（例えば、引き付ける、保持する、あるいは結合する）。濃縮薬剤は部分（ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、親水性鎖あるいはｉＲＮＡ薬剤と、例えば、イオン性相互反応によって反応する電荷部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む。凝縮薬剤は望ましくは電荷ポリマー、例えば、ポリ陽イオン性鎖である。凝縮薬剤はポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド擬似体、ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩あるいはαヘリカルペプチドを含む。

凝縮薬剤は次の特徴を有する：（ａ）少なくとも寸法で１Ｄａ；（ｂ）少なくとも２の電荷基、望ましくは２と１００の間の電荷基；（ｃ）凝縮薬剤と担体薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在し；（ｄ）凝縮薬剤と細胞融合薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在し；（ｅ）凝縮薬剤と標的薬剤の比は少なくとも１：１で錯体に存在する。

他の適切な凝縮薬剤は熟練技工によって、例えば、親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいはｉＲＮＡ薬剤と反応する試験薬剤の効能を評価することによって試験されそして同定される。親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいはｉＲＮＡ薬剤と反応する、例えば、ｉＲＮＡを凝縮するあるいは保護する試験薬剤の効能は日常の技術によって評価される。１つの検定において、試験薬剤は核酸と接触されそして接触核酸の寸法および／あるいは電荷は分子量および／あるいは電荷の変化を検出するための適切な技術によって評価される。それぞれの技術は非変性ゲル電気泳動法、免疫学的方法、例えば、免疫沈澱法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ法そして同等の方法を含む。試験薬剤は、もしそれが接触親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいは核酸の質量および／あるいは電荷（望ましくは両方）を制御薬剤と比較して電荷を変化するならば、凝縮薬剤として同定される。２つの段階の検定が行われ、ここでは第１の検定は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいは核酸と反応する、例えば、これらに結合する、例えば、これらの荷電および／あるいは質量を濃縮する試験化合物のみの効能を評価し；そして第２の検定は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）あるいは核酸と反応する、例えば、結合する、例えば、電荷および／あるいは質量を濃縮する試験化合物を含むモジュラー錯体の効能を評価する。

（送達システム調合の方法）
ここに記載される送達システム、例えば、混合ミセルは両親媒性ミセル形成分子およびｉＲＮＡ接合を一緒に、例えば、緩衝液に共懸濁することによって調合される。両親媒性ミセル形成分子およびｉＲＮＡ接合は種々の比、例えば、１：１のモル比で一緒に懸濁される。ある望ましい実施態様においては、ミセルはＰＥＧ−ＰＥをｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌのような接合ｓｉＲＮＡと１：１のモル比を懸濁することによって調合される。

望ましい調合は約７．４のｐＨを有するＨＢＳ緩衝液のような約７のｐＨを有する緩衝液を含む。

７．４ 第２の治療用接合
本発明の薬学的組成は第２の治療用薬剤とカップル、例えば、共有的にカップルされる。例えば、特殊な障害を処置するために使用されるｉＲＮＡ薬剤は第２の治療用薬剤、例えば、ｉＲＮＡ薬剤以外の他の薬剤にカップルされる。代わりとして、第２の治療用薬剤は、混合ミセルの親水性相の親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に、あるいは混合ミセルの疎水性コアに含まれ、あるいはもしそれが疎水性であればミセルの疎水性コアに溶解する疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）に、カップルされる。第２の治療用薬剤は同じ障害の処置に対応するものである。例えば、望ましない細胞増殖、例えば、癌によって特徴づけられる障害を処置する場合において、ｉＲＮＡ薬剤あるいは親水性鎖は抗癌効果を有する第２の薬剤にカップルされる。例えば、
免疫システム、例えば、ＣｐＧ特色を刺激するあるいはもっと一般的にトル様受容体を活性化しそして／あるいはγインターフェロンの産生を増加する第２の治療用薬剤である。

本発明はさらにさらなる制約を構成されない次の実施例によって示される。

（実施例）
（ｓｉＲＮＡ送達のためのＰＥＧ−ＰＥミセル）
ｓｉＲＮＡの効果的な細胞内送達はこの治療活動に必須である。しかしながら、生来のｓｉＲＮＡは要求される高い細胞内浸透を常には示さない。種々のｓｉＲＮＡ誘導体が、ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌのような活性を強化するために、提案されてきている。ポリマー性ミセルは細胞によってその摂取を強化するためにｓｉＲＮＡの高い負荷でもって調合された。このようなミセルを作るために、ｓｉＲＮＡ−ＣｈｏｌおよびＰＥＧ−ＰＥ接合を含む混合ミセルシステムが使用され、大変低いＣＭＣ値そして種々の両親媒性と安定な混合ミセルを形成する能力を示した。コレステリル修飾ｓｉＲＮＡはＰＥＧ−ＰＥと安定な混合ミセルを形成し、約６×１０^−６ＭのＣＭＣ値（図１参照）、約１０ｎｍの平均寸法および狭い寸法分布（図２参照）を有した。混合ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥミセルに対するＣＭＣ値は、ｓｉＲＮＡ−ＣｈｏｌのｓｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）がＣｙ３染料と付加的に修飾されるとき、同じを維持する。ＭＣＦ７あるいは４Ｔ１癌細胞で培養されたとき、高いｓｉＲＮＡ負荷（約５０％）をもちそしてＣｙ３染料で蛍光標識された混合ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥミセルは培養後丁度２時間で効果的な細胞の摂取を示し（図２、３参照）そして細胞内にｓｉＲＮＡを送達するために便利な手段を提供する（図２、３参照）。

ミセルのｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌのサイレンシング性質の予備的な実験は、細胞内の摂取に加えて、ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＰＥミセルは標的遺伝子の顕著なサイレンシングを高めることができそしてｐＧＦＰ導入細胞内のＧＦＰ産生を減らすことができた（図４参照）。この実験に使用された第１世代のｓｉＲＮＡ送達システムはその高い効果を作るために顕著に最適化される。

（ＰＥＧ−ＰＥおよびＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡから混合ミセルの調合剤）
ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ遺伝子をサイレンシングする）の市販の調合剤は（ＡｍｂｉｏｎからＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標）ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）ｓｉＲＮＡｃａｔ＃ＡＭ４６２６）を利用できる。混合ポリマー性ミセルは共懸濁ＰＥＧ−ＰＥおよびＣｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡの少量の分画はＣｙ３染料で蛍光標識される）によって、ＨＢＳ緩衝、ｐＨ７．４の異なるモル比で調合される。Ｃｙ３でｓｉＲＮＡの標識化は追跡目的に使用される。

ｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌの合成。２本鎖ｓｉＲＮＡはセンス鎖の５’端および３’端の両方で誘導体化される。蛍光をおびた種々の官能基（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５４９−５６１；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｖ．１３：８３−１０５）あるいは放射性（Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３）、同様に細胞の摂取を促進する基および膜を通す輸送（例えば、コレステロール、リトコール酸、ラウリル酸あるいは長いアルキル鎖）はこの位置（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８、Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：４９７５−４９７７）で接合される。修飾コレステロール修飾ｓｉＲＮＡｓはｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：４９７５−４９７７）およびｉｎ ｖｉｖｏ（Ｓｏｕｔｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）の両方でポリ陽イオン性試薬の添加なしで効果的であると証明されている。ピューロマイシンのようなペンダント基（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５４９−５６１）、ビオチン（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １０：５４９−５６１）、反転ヌクレオシド（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−１００７；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１００２−１００７；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１：１３４９−１３５６）、アリル残基（Ａｍａｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５）あるいはアミノアルカン（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７０５−２７１６）は成果の構造のサイレンシング活性の顕著な損失なしにｓｉＲＮＡ分子の３’末端に結合された。３’−アミノ−活性化オリゴヌクレオチドは出版された手順（Ｂａｎｄｇａｒ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２９：１３０４−１３０５）に従ってジスルフィド結合によってメルカプチルコレステロールに接合された。例えば、メルカプチルコレステロールは無水トリフルオロ酢酸およびポリマー支援水硫化物を使用してアルコールからチオールの直接合成によって、穏やかな条件で調合される。図５Ａを参照。３’−アミノ−ｓｉＲＮＡはヘテロ機能スペーサーＮ−サクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１６：１２３−１２９）を使用してメルカプチルコレステロールに接合される。図５Ｂ参照。

ｓｉＲＮＡ−Ｓ−Ｓ−Ｃｈｏｌの特性化は、（１）接合収率評価のためのＵＶ解析（λ＝２６０ｎｍ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３７５：５１１−５１６）；（２）ヌクレアーゼ攻撃に対する安定性の点検（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １１６：１２３−１２９）：これはいずれの２つのリボヌクレオチドの間のホスホジエステル結合をも開裂するので、ＲＮａｓｅ保護検定を使用する；（３）グルタチオン溶液および引き続く電気泳動による解析で培養による模擬細胞内条件でジスルフィド結合の開裂性の評価；（４）電気泳動で血清の安定性を評価。

Ｃｙ３でｓｉＲＮＡ−Ｃｈｏｌの標識化．要求されるとき、コレステロールおよびＣｙ３は同じｓｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合される。コレステロール−ｓｉＲＮＡは高い、反応性ホスホジエステル中間生成物を産生する水溶性カーボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を使用して５’末端で利用できるリン酸塩基上に接合される；エチレンジアミンとのさらなる反応は末端アミノ活性基を提供する。活性カルボキシル誘導Ｃｙ３Ｂ ＮＨＳエステルはＣｙ３蛍光的に標識化されたミセルを得るために５’−ＮＨ_２−３’−コレステロール−ｓｉＲＮＡと接合される。図６参照。

Claims (14)

1. ｉＲＮＡ薬剤の薬学的製剤であって次を含む：
   （１） 次を含む混合ミセル
   （ａ）複数の両親媒性ｉＲＮＡ接合であって、前記接合の各々は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、ここで前記親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の各々は前記ｉＲＮＡ薬剤のｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含む；
   （ｂ）複数のミセル形成両親媒性分子であって、前記両親媒性分子の各々は親水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）および疎水性部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含み、ここで前記親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）の各々は前記ミセルの中心から放射状に延びる少なくとも１つの親水性鎖を含む；および
   （２） 薬学的に受容可能な担体
2. 請求項１の薬学的製剤であって：
   ここで、前記複数の親水性鎖は前記混合ミセルの中心から放射状に延びる親水性層を形成する；そして
   ここで、前記両親媒性ｉＲＮＡ接合は少なくとも前記ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の一部は前記親水性層内にあるように前記混合ミセルに位置付けられる。
3. 請求項２の薬学的製剤であって：
   ここで前記ｉＲＮＡ部分（ｍｏｉｅｔｙ）の表面の一部は前記親水性層を超えて外側へ放射状に延びない。
4. 請求項２の薬学的製剤であって：
   ここで前記複数の親水性鎖は２０と５０ｎｍの間の平均主鎖長を有する。
5. 請求項２の薬学的製剤であって：
   ここで前記複数の親水性鎖は１，５００と５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有する。
6. 請求項１から請求項５のいずれか１項の薬学的製剤であって：
   ここで前記ミセル形成両親媒性分子の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は長鎖の脂肪酸、リン脂質、脂質および糖脂質のラジカルを含む群から選ばれる。
7. 請求項１から請求項６のいずれか１項の薬学的製剤であって：
   ここで前記両親媒性ｉＲＮＡ接続の疎水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はコレステロール、長鎖の脂肪酸、脂質、リン脂質および糖脂質のラジカルを含む群から選ばれる。
8. 請求項６あるいは請求項７のいずれか１項の薬学的製剤であって：
   ここで前記脂肪酸はブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸、エイコサン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸およびこれらの不飽和の異性体を含む群から選ばれる。
9. 請求項６あるいは請求項７のいずれか１項の薬学的製剤であって：
   ここで前記リン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびスフィンゴミエリンを含む群から選ばれる。
10. 請求項６あるいは請求項７のいずれか１項の薬学的製剤であって：
    ここで前記糖脂質はガラクト脂質、硫脂質、セレブロシドおよびガングリオシドを含む群から選ばれる。
11. 請求項１から請求項１０のいずれか１項の薬学的製剤であって：
    ここで前記ミセル形成両親媒性分子の親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）はＰＥＧ、ＰＥＩ、ポリビニールピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニールアルコール、ポリオキサゾリン、ポリモルホリン、キトサンおよび水溶性ペプチドのラジカルを含む群から選ばれる。
12. 請求項１１の薬学的製剤であって：
    ここで前記親水性部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）は１，５００と５，０００ｇ／ｍｏｌｅの間の平均分子量を有するＰＥＧラジカルである。
13. 細胞内標的にｉＲＮＡ薬剤の送達を増加する方法であって次を含む：
    請求項１から請求項１２のいずれか１項の薬学的製剤の前記ｉＲＮＡ薬剤を製剤する；および
    前記薬学的製剤を細胞外に投与する；
    ここで前記細胞内標的へ前記薬学的組成の前記ｉＲＮＡ薬剤の送達は前記薬学的に受容可能な担体の前記ｉＲＮＡの送達に関して増加される。
14. ｉＲＮＡ薬剤の細胞外ヌクレアーゼ退化を減少する方法であって次を含む：
    請求項１から請求項１２のいずれか１項の薬学的製剤の前記ｉＲＮＡ薬剤を製剤する；および
    前記薬学的製剤を細胞外に投与する；
    それによって前記薬学的組成の前記ｉＲＮＡ薬剤の細胞外ヌクレアーゼ退化は前記薬学的に受容可能な担体の前記ｉＲＮＡ薬剤の分解に関して減少される。

Images