KR20110026424A - 중합체 캐리어 - Google Patents

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KR20110026424A
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패트릭 에스. 스테이톤
알랜 에스. 호프만
앤서니 제이. 콘버틴
크레이그 엘. 더발
다니엘 베노이트
로버트 오버렐
폴 존슨
안나 갈
매리 프리브
앰버 파스칼
샤르벨 디아브
프리야다르시 데
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유니버시티 오브 워싱톤
페이즈알엑스, 인크.
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Abstract

본원에서는, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 및/또는 다른 치료제를 살아있는 세포에 전달하는 데 적합한 중합체 캐리어가 제공된다.

Description

중합체 캐리어 {POLYMERIC CARRIER}
<상호-참조>
본원은 2008년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제61/052,908호, 2008년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 제61/052,914호, 2008년 8월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/091,294호, 2008년 11월 6일에 출원된 미국 가출원 제61/112,054호, 2008년 12월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/140,779호 및 2009년 4월 21일에 출원된 미국 가출원 제61/171,358호의 이익을 청구하며, 상기 가출원들은 본원에 참고로 도입된다.
<정부 지원 연구에 대한 진술>
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여된 계약 번호 NIH1RO1EB002991 하에 미국 정부 지원으로 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
<배경기술>
특정 경우에는, 살아있는 세포에게 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 제공하는 것이 유익하다. 일부 경우에는, 살아있는 세포로의 이러한 폴리뉴클레오티드의 전달은 치료학적 이점을 제공한다.
<발명의 요약>
본원에는, 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 다른 치료제를 세포에 전달 (즉, 세포내 전달)하기 위한 조성물이 기재된다. 특정 실시양태에서, 이러한 세포내 전달은 시험관내에서 이루어지고, 다른 실시양태에서, 이러한 세포내 전달은 생체내에서 이루어진다. 특정 실시양태에서, 전달을 위한 조성물은 중합체 (중합체 캐리어 포함)를 포함한다. 이러한 중합체 캐리어는 임의로는 미셀, 또한 특히 진정한 미셀 형태로 존재한다. 따라서, 본원에는 하나 이상의 뉴클레오티드 및/또는 다른 치료제와 조합된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)이 기재된다. 이러한 조합물은 임의로는 공유 및/또는 비-공유 상호작용 형태로 존재한다. 이러한 조합물은 임의로 추가의 작용제, 예컨대 조합물을 목적한 세포에 표적화하기 위한 작용제를 추가로 포함한다. 본원에는 또한, 치료 및/또는 진단 목적을 위한 상기와 같은 세포내 전달 조성물의 용도가 기재된다. 이러한 용도는 세포 내에서 유전자 발현의 변경, 예를 들어 세포 내에서 유전자의 녹다운(knock-down) 또는 활성화를 포함한다.
본원에서 특정 실시양태에서는, (i) 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링(assembling)된, 하나 이상의 소수성 부분; 대략 중성의 pH에서 제1 음이온성 종을 포함하는 다수의 단량체 단위를 포함하는 다수의 중합체; 및 (ii) 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 특정 실시양태에서, 중합체는 공중합체, 블록 공중합체 등을 포함한다. pH가 대전가능한 종의 pKa 정도이면, 양쪽 형태의 대전가능한 종의 평형 분포가 존재할 것이다. 음이온성 종의 경우, pH가 음이온성 종의 pKa인 경우, 집단의 약 50％는 음이온성일 것이고 약 50％는 대전되지 않을 것이다. pH가 대전가능한 종의 pKa로부터 더 멀어질수록, 이 평형의 상응하는 이동이 존재할 것인 바, pH 값이 높을수록 음이온 형태가 우세할 것이고, pH 값이 낮을수록 대전되지 않은 형태가 우세할 것이다. 본원에 기재된 실시양태는 임의의 pH 값에서의 공중합체의 형태를 포함한다.
본원에서 특정 실시양태에서는,
a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
i. 하나 이상의 소수성 블록; 및
ii. 대략 중성의 pH에서 다수의 음이온성 종을 포함하는 다수의 단량체 단위
를 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
b. 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드)
를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드)는 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는다.
본원에서 일부 실시양태에서는,
a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
i. 대략 중성의 pH에서 다수의 음이온성 종을 포함하는 하나 이상의 소수성 블록; 및
ii. 대략 중성의 pH에서 친수성인 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록
을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
b. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 중합체 캐리어 (중합체 조성물)가 제공된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 대략 중성의 pH에서 다가양이온성이거나, 대략 중성의 pH에서 다가음이온성이거나, 대략 중성의 pH에서 대전되지 않거나 (예를 들어, 실질적으로 대전되지 않거나), 또는 대략 중성의 pH에서 쯔비터이온성이다. 일부 실시양태에서, 대략 중성의 pH는 약 7 (예를 들어, 약 7.2 내지 약 7.4)의 pH이다.
본원에서 일부 실시양태에서는,
a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
i. 대략 중성의 pH에서 다수의 음이온성 종을 포함하는 하나 이상의 소수성 블록; 및
ii. 대략 중성의 pH에서 다가양이온성인 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록
을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
b. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 중합체 캐리어 (중합체 조성물)가 제공된다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는다. 일부 특정 실시양태에서, 하나 이상의 소수성 블록은 대략 중성의 pH에서 다수의 양이온성 종을 포함한다.
본원에서 특정 실시양태에서는,
a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
i. 대략 중성의 pH에서 다수의 음이온성 종을 포함하는 하나 이상의 소수성 블록; 및
ii. 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록
을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
b. 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는 10개 이상의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 중합체 캐리어 (또는 중합체 조성물)가 제공된다.
특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (중합체 조성물)은 20개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 일부 실시양태에서는,
a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
i. 하나 이상의 소수성 블록; 및
ii. 대략 중성의 pH에서 다수의 음이온성 종
을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
b. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다.
특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서 약 10 nm 내지 약 200 nm의 유체역학 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 하나 이상의 뉴클레오티드는 중합체 캐리어 (또는 그의 구성성분 중합체)에 부착되며, 이러한 부착은 임의의 적합한 방식 (예를 들어, 비-공유 상호작용, 예컨대 정전기 상호작용, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 등; 공유 상호작용; 등; 또는 이들의 조합)으로 달성된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 하나 이상의 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드)이다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 다수의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 다수의 제1 폴리뉴클레오티드 및/또는 다수의 제2 폴리뉴클레오티드, 및 요망되는 한 다수의 추가의 상이한 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현 조정인자이다. 보다 구체적 실시양태에서, 유전자 발현 조정인자는 녹다운 작용제 (예를 들어, 녹다운 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 보다 구체적 실시양태에서, 녹다운 작용제는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, 또는 shRNA이다. 더욱 더 구체적 실시양태에서, 녹다운 작용제는 siRNA이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어는 표적화 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적화 부분은 중합체 캐리어의 쉘 부분에 부착된다. 보다 구체적 실시양태에서, 표적화 부분은 폴리뉴클레오티드에 대한 공유 결합에 의해 쉘 부분에 부착된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어의 중합체는 블록 공중합체, 단일블록 공중합체, 또는 구배(gradient) 중합체이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어는 폴리뉴클레오티드에 부착되지 않은 추가의 중합체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가의 중합체는 희석제 중합체 또는 표적화 부분 캐리어 중합체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 하나 이상의 제2 뉴클레오티드 (예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드)에 부착된 추가의 중합체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 제2 뉴클레오티드 (예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드)는 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드)와 상이하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어는, 중합체 캐리어 내의 코어 부분을 갖는 각각이 (모두) 실질적으로 동일한, 다수의 중합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 막-불안정화성이다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 산성 pH (예를 들어, 엔도솜 pH)에서 막-불안정화성이지만, 대략 중성의 pH에서는 그렇지 않다.
본원에서 특정 실시양태에서는, 미셀, 또한 특히 진정한 미셀인 중합체 캐리어가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 다수의 제1 대전가능한 종을 포함하는 소수성 블록을 갖는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 대략 중성의 pH에서 실질적으로 음이온성이다. 특정 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 산성 pH, 또는 엔도솜 pH에서 실질적으로 대전되지 않는다. 일부 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 약 7 이하, 약 6.8 이하, 약 6.6 이하, 약 6.4 이하, 약 6.2 이하, 약 6 이하, 약 5.8 이하, 또는 약 5.6 이하의 pH에서 실질적으로 대전되지 않는다. 특정 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 약 6 이하의 pH에서 실질적으로 대전되지 않는다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 형태 (예를 들어, 다가양이온, 다가음이온, 중성 또는 쯔비터이온)는 산성 pH (예를 들어, 엔도솜 pH)에서 대략 중성의 pH에서와 같이 실질적으로 동일하다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 π 값이 1 초과인 다수의 소수성 단량체 단위를 추가로 포함하며, 여기서 상기 소수성 단량체 단위는 소수성 블록의 일부이거나 또는 소수성 블록에 추가로 존재한다. 화합물의 π 값은 그의 상대 친수성-친유성 값의 척도이다 (예를 들어, 문헌 [Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45:11-13 (1981)] 참조).
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 중합체 캐리어로 자발적으로 자가-어셈블링된 다수의 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 하나 이상의 중합체를 포함하고, 여기서 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 중합체의 블록이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체 캐리어의 쉘을 형성하거나 중합체 캐리어의 쉘 내에 존재한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 중합체 캐리어의 쉘 내에 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 막-불안정화성의 대전가능한 소수성 블록을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록을 포함하는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어의 쉘은 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 비-펩티드성이다 (즉, 폴리-아미노산이 아니다). 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어의 하나 이상의 뉴클레오티드는 공유 결합, 비-공유 상호작용 또는 이들의 조합에 의해 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록에 부착된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 다가양이온성이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 siRNA 캐리어 블록이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 (예를 들어, siRNA 캐리어 블록)은 PEG화되지 않는다. 보다 구체적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 주쇄는 PEG화되지 않는다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 올리고뉴클레오티드)는 x개의 음이온을 포함하는 다가음이온이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 (예를 들어, siRNA 캐리어 블록)은 약 0.7·x개 이상의 양이온을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어의 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 단독중합체 블록이다. 특정 실시양태에서, 단독중합체 블록은 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트, 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 또는 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은, 예를 들어 (i) 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트 단량체 단위, 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트, 또는 이들의 조합; 및 (ii) 하나 이상의 스페이서 단량체 단위를 포함하는 공중합체이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는, 카르복실산 기, 술폰아미드 기, 술폰산 기, 술핀산 기, 황산 기, 인산 기, 포스핀산 기, 또는 아인산 기인 제1 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어의 중합체는 임의의 블록 (예를 들어, 소수성 블록, 친수성 블록, 쉘 블록, 코어 블록 등) 내에 스페이서 단량체 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 하나 이상의 스페이서 단량체 단위를 포함하는 소수성 블록을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 제1 및 제2 대전가능한 종을 포함하는 소수성 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 본원에 기재된 바와 같고, 제2 대전가능한 종은 양성자화에 따른 양이온성 종이다. 특정 실시양태에서, 제2 대전가능한 종의 pKa는 약 6.5 내지 약 9이다. 일부 실시양태에서, 제2 대전가능한 종은 비시클릭(acyclic) 아민 또는 이민, 시클릭 아민 또는 이민, 또는 질소 함유 헤테로아릴이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 제1 대전가능한 종 및 하나 이상의 제2 대전가능한 종은 단일 단량체 단위 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 제1 대전가능한 단량체 단위 상에서 나타나고, 제2 대전가능한 종은 제2 대전가능한 단량체 단위 상에서 나타난다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 탈양성자화에 따른 음이온성 종이고, 제2 대전가능한 종은 양성자화에 따른 양이온성 종이며, 여기서 음이온성 종 대 양이온성 종의 비율은 대략 중성의 pH에서 약 1:4 내지 약 4:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 단량체 단위 대 제2 대전가능한 단량체 단위의 비율은 약 1:4 내지 약 4:1이다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 단량체 단위는 (C2-C8)알킬아크릴산이다. 일부 실시양태에서, 제2 대전가능한 단량체 단위의 50％ 미만은 pH 약 8에서 양이온성 종으로 대전된다. 특정 실시양태에서, 제2 대전가능한 단량체 단위는 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트, N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 또는 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트이다.
특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 음이온성 종으로 대전된 또는 대전가능한 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 대전가능한 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 양이온성 종으로 대전된 또는 대전가능한 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제1 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 제1 대전가능한 종은 음이온성 종으로 대전되거나 대전가능하다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제2 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 제2 대전가능한 종은 양이온성 종으로 대전되거나 대전가능하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 내에 존재하는 블록 공중합체의 소수성 블록은 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제1 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 제1 대전가능한 종은 음이온성 종으로 대전되거나 대전가능하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 내에 존재하는 블록 공중합체의 소수성 블록은 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제2 대전가능한 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 제2 대전가능한 종은 양이온성 종으로 대전되거나 대전가능하다.
본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어 실시양태의 특정 추가의 또는 별법의 실시양태에서는, 다수의 비-대전가능한 단량체 단위를 포함하는 막-불안정화성의 대전가능한 소수성 블록을 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 일부 경우에, 비-대전가능한 단량체 단위는 소수성 종을 포함한다. 다른 경우에, 제1 및/또는 제2 대전가능한 종은 소수성 종을 포함하거나 이들을 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-대전가능한 단량체 단위는 (C2-C8)알킬-에타크릴레이트, (C2-C8)알킬-메타크릴레이트, 또는 (C2-C8)알킬-아크릴레이트이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서 약 10 nm 내지 약 200 nm의 평균 유체역학 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서 약 20 nm 내지 약 100 nm의 평균 유체역학 직경을 갖는다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서 약 30 nm 내지 약 80 nm의 평균 유체역학 직경을 갖는다.
본원에서 일부 실시양태에서는, 1개 이상, 2개 이상, 5개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 또는 250개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 본원에서 일부 실시양태에서는, 1개 내지 약 250개, 2개 내지 약 250개, 5개 내지 약 250개, 20개 내지 약 250개, 약 25개 내지 약 250개, 약 30개 내지 약 250개, 40개 내지 약 250개, 50개 내지 약 250개, 약 100개 내지 약 250개, 200개 내지 약 250개의 개별 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 본원에서 특정 실시양태에서는, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 방식으로 중합체 캐리어 및/또는 그 안의 중합체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 siRNA이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 소수성 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 수평균 분자량의 비율이 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:1 내지 약 5:1 (또는, 예를 들어, 약 5:4 내지 5:1)인 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 수평균 분자량의 비율은 약 3:2 내지 약 3:1이다. 특정 실시양태에서, 소수성 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 수평균 분자량의 비율은 약 2:1이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 siRNA 캐리어 블록인 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 캐리어 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 7,000 달톤 내지 약 50,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, siRNA 캐리어 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 7,000 달톤 내지 약 20,000 달톤이다. 특정 실시양태에서, siRNA 캐리어 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 10,000 달톤 내지 약 20,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, siRNA 캐리어 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 10,000 달톤이다. 특정 실시양태에서, siRNA 캐리어 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 20,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, 소수성 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 2,000 달톤 내지 약 200,000 달톤, 약 2,000 달톤 내지 약 200,000 달톤, 약 2,000 달톤 내지 약 100,000 달톤, 또는 약 10,000 달톤 내지 약 100,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, 소수성 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤이다. 특정 실시양태에서, 소수성 블록의 수평균 분자량 (Mn)은 약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 100,000 달톤 초과의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 코어 블록을 갖는 다수의 막 불안정화 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 50,000 달톤 초과의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 쉘 블록을 갖는 다수의 막 불안정화 블록 공중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 2 미만, 1.8 미만, 1.6 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 1.3 미만의 다분산 지수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 안정하다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서보다 pH 약 5.8에서 실질적으로 덜 안정하다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어의 90％ 초과는 pH 약 5.8 및 약 18 ㎍/mL의 농도에서 불안정화되고, 중합체 캐리어의 10％ 미만은 pH 약 7.4 및 약 18 ㎍/mL의 농도에서 불안정화된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 50％ 인간 혈청에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 그 이상 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 50％ 이상의 인간 혈장에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 그 이상 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 50％ 마우스 혈청에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 그 이상 동안 안정하다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 50％ 마우스 혈장에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 48시간 이상, 또는 그 이상 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 50％ 인간 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 이상의 인간 혈장에서 2시간 이상 동안, 50％ 마우스 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 마우스 혈장에서 2시간 이상 동안, 또는 이들의 조합으로 안정하다.
본원에서 특정 실시양태에서는, 본원에 기재된 중합체 캐리어를 구성하는 임의의 중합체가 기재된다. 즉, 중합체 서브유닛 (예를 들어, 막-불안정화 블록 공중합체) 또는 개별 중합체 (중합체 캐리어 형태이거나 그렇지 않음)가 또한 본원에 기재된 실시양태이다. 명료하게 하기 위해, 본원에 제공된 각각의 또한 모든 막-불안정화 블록 공중합체는, 개별 중합체로서 또는 본원에 기재된 중합체 캐리어의 중합체 단위/가닥/구성성분으로서, 본원에 기재된 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 특허청구범위에 특정적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은, 본 발명의 원리가 이용된 예시적 실시양태를 기술하는 하기 상세한 설명, 및 하기 첨부된 도면을 참조로 하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1a: RAFT 합성된 중합체의 조성 및 특성의 예시적 예.
도 1b: PEGMA-DMAEMA 공중합체의 조성 및 특성의 예시적 예.
도 2: 블록 공중합체 PRxO729v6의 NMR 분광법의 예시적 예.
도 3: siRNA와 복합체를 형성한 중합체 PRxO729v6의 입도의 동적 광산란 (DLS) 측정의 예시적 예.
도 4: 상이한 전하 비율에서 중합체 PRxO729v6/siRNA 복합체의 겔 이동 분석의 예시적 예.
도 5: 중합체 PRxO729v6의 임계 안정 농도 (CSC)의 예시적 예.
도 6: 유기 용매에서 중합체 PRxO729v6 입자 안정성의 예시적 예.
도 7: 배양된 포유동물 세포에서 siRNA-미셀 복합체의 녹다운 활성의 예시적 예.
도 8: 중합체 미셀 및 그의 siRNA 복합체의 막 불안정화 활성을 나타내는 예시적 예.
도 9: 중합체 PRxO729v6의 투과 전자 현미경검사 (TEM) 분석의 예시적 예.
도 10: 중합체-siRNA 복합체의 세포 유입 및 세포내 분포의 형광 현미경검사의 예시적 예.
도 11: 중합체 구조에 대한 pH의 효과의 예시적 예.
도 12: 배양된 포유동물 세포에서 siRNA-미셀 복합체에 대한 녹다운 데이터의 예시적 요약.
도 13: 갈락토스 말단 관능화된 폴리[DMAEMA]-매크로CTA의 예시적 예.
도 14: [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]의 합성의 예시적 예.
도 15: PEGMA 및 MAA-NHS의 RAFT 공중합의 예시적 예.
도 16: 갈락토스 관능화된 DMAEMA-MAA(NHS) 또는 PEGMA-MAA(NHS) 이블록 공중합체의 예시적 예.
도 17: 접합가능한 siRNA, 펩티드 및 피리딜 디술피드 아민의 구조의 예시적 예.
<발명의 상세한 설명>
본원에서는 살아있는 세포로의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 포함)의 전달에 적합한 중합체 캐리어가 제공된다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 다수의 중합체 단위, 및 임의로는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 생체적합성이고/이거나, 안정하고/하거나 (화학적 및/또는 물리적 안정 포함), 재현가능하게 합성된다. 또한, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 무독성 (예를 들어, 낮은 독성을 나타냄)이고/이거나, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 탑재물을 분해로부터 보호하고/하거나, 천연 프로세스를 통해 (예를 들어, 세포내이입에 의해) 살아있는 세포에 진입하고/하거나, 세포와 접촉된 후 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 탑재물을 살아있는 세포의 세포질로 전달한다. 특정 경우에, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 siRNA 및/또는 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현을 변경시키는 또다른 '뉴클레오티드-기재' 작용제이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 캐리어는 siRNA의 세포 내로의 전달에 유용하다. 특정 경우에, 세포는 시험관내에 있고, 다른 경우에, 세포는 생체내에 있다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의, siRNA를 포함하는 중합체 캐리어가 이를 필요로 하는 개체 (예를 들어, 유전자를 녹다운시키는 것이 필요한 개체, 여기서 유전자는 투여된 siRNA에 의해 녹다운될 수 있음)에게 투여된다. 특정 경우에, 중합체 캐리어는 개체의 특이적으로 표적화된 세포로의 siRNA의 전달에 유용하거나, 또는 이를 위해 특수 설계된다.
구체적으로, 본원에서 특정 실시양태에서는, (i) 중합체 캐리어로 어셈블링된 다수의 블록 공중합체; 및 (ii) 캐리어의 쉘 내에 존재하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 코어-쉘 구조를 갖는 중합체 캐리어가 제공된다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 나노입자이다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 미셀이고, 또한 특히 진정한 미셀이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 a.) 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된, (i.) 하나 이상의 소수성 블록, 및 (ii.) 대략 중성의 pH에서 제1 음이온성 종을 포함하는 다수의 단량체 단위를 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체, 및 b.) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀), 또는 이들의 구성성분 일부는 막-불안정화성이다 (예를 들어, 막 불안정화 블록, 기, 부분 등을 포함한다). 추가의 또는 별법의 실시양태에서, 다수의 블록 공중합체는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어 및 쉘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 친수성 및/또는 대전된 쉘을 포함한다. 추가의 또는 별법의 실시양태에서, 중합체 캐리어는 실질적으로 소수성인 코어 (예를 들어, 코어는 소수성 기, 단량체 단위, 부분, 블록 등을 포함함)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 친수성의 대전된 블록; 및 (2) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 블록 공중합체는 다수의 제1 대전가능한 종 및 다수의 소수성 향상제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 음이온성 대전가능한 종이다 (예를 들어, 특정 pH에서 대전되어 있거나 대전된다). 추가의 실시양태에서, 하나 이상의 블록 공중합체는 제2 대전가능한 종을 포함한다 (즉, 친수성 블록은 하나 초과의 상이한 유형의 음이온성 종을 가질 수 있다). 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어 내에 존재하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 다수의 제1 대전가능한 종을 포함하는 소수성 블록을 갖는 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 대략 중성의 pH에서 실질적으로 음이온성이다. 특정 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 산성 pH, 또는 엔도솜 pH에서 실질적으로 대전되지 않는다. 일부 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 pH 약 7 이하, 약 6.8 이하, 약 6.6 이하, 약 6.4 이하, 약 6.2 이하, 약 6 이하, 약 5.8 이하, 또는 약 5.6 이하에서 실질적으로 대전되지 않는다. 특정 실시양태에서, 다수의 제1 대전가능한 종은 pH 약 6 이하에서 실질적으로 대전되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 제1 및 제2 대전가능한 종을 포함하는 소수성 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 본원에 기재된 바와 같고, 제2 대전가능한 종은 양성자화에 따른 양이온성 종이다. 특정 실시양태에서, 제2 대전가능한 종의 pKa는 약 6.5 내지 약 9, 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 약 6 내지 약 8, 또는 약 6.5 내지 약 8이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 소수성 블록의 일부이거나 소수성 블록에 추가로 존재하는 다수의 소수성 단량체 단위를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 및/또는 그 안의 중합체는 비-펩티드성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 다수의 단일블록 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단일블록 중합체 및/또는 중합체 캐리어 (예를 들어, 단량체 단위, 그의 부분, 종 및/또는 기)는 막-불안정화성이다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 단일블록 중합체는 다수의 음이온성 대전가능한 종, 및 다수의 소수성 종을 포함한다. 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어 내에 존재하지 않는다.
일 실시양태에서, 본원에 제공된 막-불안정화 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 다수의 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 블록 공중합체는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘 및 코어를 형성한다. 특정 실시양태에서, 쉘 및/또는 쉘 블록은 친수성이고/이거나 대전된다. 일부 실시양태에서, 코어 및/또는 코어 블록은 실질적으로 소수성이다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 소수성인 코어는 양전하 및/또는 음전하를 포함한다. 보다 구체적 실시양태에서, 소수성 코어 및/또는 코어 블록은 실질적으로 동일한 수의 양전하 및 음전하를 포함한다 (즉, 코어 및/또는 코어 블록의 전하는 실질적으로 순(net) 중성이다). 일부 실시양태에서, 블록 공중합체 중 하나 이상 또는 모두는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 친수성의 대전된 블록; 및 (2) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 다수의 음이온성 대전가능한 종, 다수의 소수성 부분을 포함하고, 또한 막 불안정화성이다. 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어 또는 블록 공중합체의 코어 블록은 임의로 양이온성 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 또는 블록 공중합체의 코어 블록은 임의로 음이온성 종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 또는 블록 공중합체의 코어 블록은 하나 이상의 양이온성 종 및 하나 이상의 음이온성 종을 포함한다. 미셀은 또한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 미셀의 코어 내에 존재하지 않는다.
일부 경우에, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 블록 공중합체의 소수성 블록 (예를 들어, 코어 블록)의 상호작용을 통해 자가-회합되고/되거나 코어 내에서 이들의 소수성 상호작용을 통해 안정화된 다수의 블록 공중합체로부터 형성된다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 상이한 구조 및 기능을 갖는 2종 이상의 상이한 종의 블록 공중합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 필요로 하는 개체에게 이를 전달하는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체 또는 단일블록 중합체)는 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 (또는 단일블록 중합체의 경우에는 폴리뉴클레오티드 캐리어 부분)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체의 친수성 블록 또는 쉘 블록은 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이거나 이를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 1종 이상의 단량체 단위를 포함한다 (예를 들어, 단독중합체 블록 또는 이종중합체 블록이다). 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 중합체 캐리어의 하나 이상의 블록 공중합체의 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록에 비-공유결합으로 및/또는 공유결합으로 부착된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 특정 실시양태에서, siRNA는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 블록 공중합체에 공유결합으로 부착되어 있다. 일부 특정 실시양태에서, siRNA는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 블록 공중합체에 비-공유결합으로 부착되어 있다. 특정 실시양태에서, siRNA는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 블록 공중합체에 비-공유결합으로 및/또는 공유결합으로 부착되어 있다. 일부 특정 실시양태에서, siRNA는 중합체 캐리어의 쉘의 적어도 일부를 형성한다 (예를 들어, 적어도 일부에 존재한다). 일부 특정 실시양태에서, siRNA는 소수성 블록에 공유결합으로 부착되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 중합체 캐리어는 소수성 블록 및/또는 코어 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 및/또는 쉘 블록의 수평균 분자량의 비율이 약 1:10 내지 약 5:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:1 내지 약 5:1 (또는, 예를 들어, 약 5:4 내지 5:1)인 블록 공중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소수성 블록 및/또는 코어 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 및/또는 쉘 블록의 수평균 분자량의 비율은 약 3:2 내지 약 3:1이다. 특정 실시양태에서, 소수성 블록 및/또는 코어 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 및/또는 쉘 블록의 수평균 분자량의 비율은 약 2:1이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 다수의 막-불안정화 블록 공중합체를 포함한다. 이에 따라, 중합체 캐리어는 또한 본원에서, 적어도 부분적으로 이들이 막-불안정화 블록 공중합체로 구성되기 때문에 막 불안정화성인 것으로 기재된다.
일부 실시양태에서, 막-불안정화 블록 공중합체는 (i) 다수의 소수성 단량체 잔기, (ii) 혈청 생리적 pH에서 음이온성이고 엔도솜 pH에서 실질적으로 중성이거나 대전되지 않는 대전가능한 종을 갖는 다수의 음이온성 단량체 잔기, 및 (iii) 임의로 다수의 양이온성 단량체 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체의 양이온성 종에 대한 음이온성 종의 비율의 변화는 본원에 기재된 중합체 캐리어의 막 불안정화 활성의 변화를 가능하게 한다. 이러한 실시양태의 일부에서, 블록 공중합체에서 음이온성 종 : 양이온성 종의 비율은 혈청 생리적 pH에서 약 4:1 내지 약 1:4의 범위이다. 이러한 실시양태의 일부에서, 블록 공중합체의 소수성 블록에서 양이온성 종에 대한 음이온성 종의 비율의 변화는 본원에 기재된 중합체 캐리어의 막 불안정화 활성의 변화를 가능하게 한다. 이러한 실시양태의 일부에서, 본원에 기재된 블록 공중합체의 소수성 블록에서 음이온성 종 : 양이온성 종의 비율은 혈청 생리적 pH에서 약 1:2 내지 약 3:1, 또는 약 1:1 내지 약 2:1의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 pH-의존적 방식으로 엔도솜 막을 불안정화시킨다. 다양한 실시양태에서, 막-불안정화 블록 공중합체는 중합체 캐리어로 어셈블링될 때 및/또는 어셈블링된 중합체 캐리어 형태에 대해 독립적으로 존재할 때 (예를 들어, 중합체 캐리어가 해리되고/되거나 불안정화될 때) 막을 불안정화시킨다. 일부 실시양태에서, 생리적 pH (예를 들어, 순환 생리적 pH)에서 또는 그 근처에서 중합체 캐리어를 구성하는 중합체는 최소로 막-불안정화성이지만, 감소된 pH (예를 들어, 엔도솜 pH)에 노출시 중합체는 막-불안정화성이다. 특정 경우에, 막-불안정화 상태로의 이러한 전이는 중합체에 혼입된 약한 산성 잔기의 양성자화를 통해 일어나고, 이러한 양성자화는 중합체의 소수성을 증가시킨다. 특정 경우에, 중합체의 증가된 소수성은 중합체 캐리어의 형태 변화를 일으키며, 이는 중합체 캐리어가 막-불안정화성이 되게 한다 (예를 들어, 막의 불안정화를 초래한다). 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어의 막 불안정화의 메카니즘은 다가양이온, 예컨대 PEI 또는 다른 다가양이온의 순수 양성자-스폰지 막 불안정화 메카니즘에 의존하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 하나 이상의 RNAi 작용제, 하나 이상의 RNA, 하나 이상의 DNA, 하나 이상의 cDNA, 하나 이상의 miRNA, 하나 이상의 siRNA, 하나 이상의 shRNA, 하나 이상의 RNAa, 하나 이상의 다이서(dicer) 기질 등, 또는 이들의 조합을 포함한다.
중합체 캐리어.
특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 나노입자이다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 미셀이다. 또다른 추가의 실시양태에서, 중합체 캐리어는 대략 10 nm 내지 약 200 nm, 약 10 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 30 내지 80 nm의 크기를 갖는 미셀이다. 입도는 겔 투과 크로마토그래피 (GPC), 동적 광산란 (DLS), 전자 현미경검사 기술 (예를 들어, TEM) 및 기타 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 방식으로 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 본원에 기재된 중합체의 자발적 자가-어셈블리에 의해 제조된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체는 (a) 수성 매질로의 수-혼화성 유기 용매 중의 중합체 용액의 희석에 따라, 또는 (b) 직접적으로 수용액 중에 용해시킴으로써 본원에 제공된 중합체 캐리어로 어셈블링된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체는 폴리뉴클레오티드의 부재 하에 본원에 제공된 중합체 캐리어로 어셈블링된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 수용액에서의 희석에 대해 안정하다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 대략 50 내지 대략 100 ㎍/mL, 또는 대략 10 내지 대략 50 ㎍/mL, 10 ㎍/mL 미만, 5 ㎍/mL 미만, 2 ㎍/mL 미만, 0.5 ㎍/mL 미만, 또는 0.1 ㎍/mL 미만의 임계 안정 농도 (예를 들어, 임계 미셀 농도 (CMC))로 대략 중성의 pH에서 희석에 대해 안정하다. 본원에서 사용되는 "미셀의 불안정화"는 미셀을 형성하는 중합체 사슬이 적어도 부분적으로 분해되고/되거나, 구조적으로 변형되고/되거나 (예를 들어, 크기 팽창 및/또는 형상 변화), 무정형 초분자 구조 (예를 들어, 비-미셀성 초분자 구조)를 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 용어 임계 안정 농도 (CSC) 및 임계 미셀 농도 (CMC)는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘 및 코어를 형성하는 다수의 블록 공중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 쉘 및/또는 쉘 블록은 친수성이고/이거나 대전된다 (예를 들어, 양이온성, 다가양이온성, 또는 쯔비터이온성). 특정 실시양태에서, 쉘 및/또는 쉘 블록은 순 양전하를 포함한다. 일부 실시양태에서, 코어 및/또는 코어 블록은 소수성이고/이거나, 소수성 기, 부분, 단량체 단위, 종 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 소수성 코어 및/또는 코어 블록은 다수의 소수성 기, 부분, 단량체 단위, 종 등 및 다수의 대전가능한 종 또는 단량체 단위를 포함한다. 보다 구체적 실시양태에서, 다수의 대전가능한 단량체 단위 또는 종은 다수의 음이온성 대전가능한 단량체 단위 또는 종을 포함한다. 더욱 더 구체적 실시양태에서, 다수의 대전가능한 단량체 단위 또는 종은 다수의 양이온성 및 다수의 음이온성 대전가능한 단량체 단위 또는 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 친수성의 대전된 블록 (예를 들어, 양이온성 또는 다가양이온성), (2) 소수성 블록, 및 (3) 다수의 음이온성 대전가능한 종을 갖고, 막 불안정화성이다 (예를 들어, pH 의존적 방식으로 막 불안정화성이 된다). 특정 실시양태에서, 소수성 코어 및/또는 코어 블록은 소수성 기, 대전가능한 기 또는 이들의 조합을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 스페이서 단량체 단위를 임의로 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 코어를 형성하거나 이에 존재하는 중합체 블록 (예를 들어, 공중합체의 하나 이상의 코어 블록)은 대전가능하다 (예를 들어, 생리적 pH에서 양이온성 종 및/또는 음이온성 종을 함유한다). 본원에서 사용되는 대전가능한 종 및/또는 단량체 단위는 대전된 및 대전되지 않은 상태 둘 다의 종 및 단량체 단위를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 자가-회합하는 다수의 블록 공중합체로부터 형성된다. 특정 경우에, 자가-회합은 블록 공중합체의 소수성 블록의 상호작용을 통해 발생하고, 생성된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하는 소수성 블록의 소수성 상호작용을 통해 안정화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 pH 약 7.4에서 안정하고, pH 약 7.4에서보다 pH 약 5.8에서 실질적으로 덜 안정하다. 일부 경우에, 중합체 캐리어의 90％ 초과는 pH 약 5.8 및 약 10 ㎍/mL의 농도에서 불안정화되고, 중합체 캐리어의 10％ 미만은 pH 약 7.4 및 약 10 ㎍/mL의 농도에서 불안정화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 50％ 인간 혈청에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상 또는 24시간 이상 동안 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전달하는 중합체 캐리어의 활성)을 보유한다. 추가의 또는 별법의 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 50％ 이상의 인간 혈장에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상 또는 24시간 이상 동안 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전달하는 중합체 캐리어의 활성)을 보유한다. 추가의 또는 별법의 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 50％ 마우스 혈청에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상 또는 24시간 이상 동안 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전달하는 중합체 캐리어의 활성)을 보유한다. 또다른 추가의 또는 별법의 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 50％ 이상의 마우스 혈장에서 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상 또는 24시간 이상 동안 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전달하는 중합체 캐리어의 활성)을 보유한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 50％ 인간 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 이상의 인간 혈장에서 2시간 이상 동안, 50％ 마우스 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 이상의 마우스 혈장에서 2시간 이상 동안 또는 이들의 조합으로 활성 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드를 전달하는 중합체 캐리어의 활성)을 보유한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는, 하기의 것 중 하나 이상을 특징으로 한다: (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 수-혼화성 용매 (예컨대, 에탄올이 포함되나 이에 제한되지는 않음)로부터 수성 용매 (예를 들어, 포스페이트-완충 염수, pH 7.4)로 희석시 조직화된 어셈블리 (예를 들어, 미셀)를 형성하는 블록 공중합체의 자발적 자가회합에 의해 형성됨; (2) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 희석 (예를 들어, 임계 안정 농도 또는 임계 미셀 농도 (CMC)를 구성하는, 100 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 2 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL 또는 0.1 ㎍/mL의 중합체 농도로 하강)에 대해 안정함; (3) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 주변 매질 (예를 들어, 0.5 M NaCl)의 높은 이온 세기에 대해 안정함; 및/또는 (4) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸술폭시드 (DMS) 및 디옥산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 유기 용매의 농도가 증가함에 따라 증가하는 불안정성을 가짐. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 상기 언급된 특성 중 둘 이상을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 상기 언급된 특성 중 3개 이상을 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 상기 언급된 특성 모두를 갖는 것을 특징으로 한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 추가로 또는 대안적으로 하기 다른 기준을 특징으로 한다: (1) 개별 블록의 분자량 및 그의 상대적 길이 비율을 감소 또는 증가시켜 형성된 미셀의 크기 및 그의 상대적 안정성을 통제함, 및 (2) 쉘을 형성하는 중합체 양이온성 블록의 크기를 변화시켜 올리고뉴클레오티드 약물의 효과적인 복합체 형성 및/또는 전하 중화를 제공함.
특정 실시양태에서, 본 발명의 미셀은 소수성 소분자, 예컨대 피렌을 미셀의 소수성 코어로 선택적으로 유입한다.
폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어 .
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 이를 필요로 하는 개체에게 전달하는 데 유용하다. 본원에서 특정 실시양태에서는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어가 제공된다. 보다 구체적 실시양태에서, 중합체 캐리어는 2개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 100개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 2 내지 50개의 폴리뉴클레오티드, 5 내지 40개의 폴리뉴클레오티드, 5 내지 30개의 폴리뉴클레오티드, 5 내지 25개의 폴리뉴클레오티드, 20 내지 40개의 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 유전자 발현 조정인자이다. 추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 녹다운 작용제이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 RNAi 작용제, 다이서 기질 또는 siRNA이다. 다른 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 aiRNA (문헌 [Asymmetric RNA duplexes mediate RNA interference in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A Rogoff, Chiang J Li Nature Biotechnology 26, 1379 - 1382 (2008)])이다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어는 코어, 쉘 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자 (예를 들어, 미셀)이고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 미셀의 코어 내에 존재하지 않는다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체 캐리어의 쉘에 혼입된다 (그 안에 존재하고/하거나 그의 일부를 형성한다). 일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)는 중합체 캐리어-형성 멀티-블록 공중합체의 siRNA 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록에 부착된다. 다양한 실시양태에서, 부착은 하나 이상의 공유 결합, 하나 이상의 비-공유 상호작용, 또는 이들의 조합을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, siRNA는 블록 공중합체의 소수성 블록 (예를 들어, 코어 블록)에 공유결합으로 부착된다. 특정 실시양태에서, siRNA는 블록 공중합체의 소수성 블록 (예를 들어, 코어 블록)에 공유결합으로 부착되고, 중합체 캐리어의 쉘의 적어도 일부를 형성한다. 보다 구체적 실시양태에서, siRNA는 블록 공중합체의 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록)이다. 다른 실시양태에서, siRNA는 블록 공중합체의 친수성 블록에, 또는 임의적 중합체 블록에 부착된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)는 본원에 제공된 블록 공중합체에 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 비-공유 회합에 의해 부착된다. (i) 본원에 제공된 중합체 및/또는 중합체의 어셈블리 (예를 들어, 다수의 중합체에 의해 형성된 미셀) 및; (ii) 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 사이의 비-공유 회합은, 정전기적 상호작용 (양이온 기를 갖는 중합체와 음이온 기를 갖는 폴리뉴클레오티드와의 정전기적 상호작용 포함), 소수성 상호작용, 친화 상호작용, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 방식으로 달성된다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 중합체는, 아릴보론산-살리실히드록삼산, 류신 지퍼 또는 다른 펩티드 모티프, 미셀 및 폴리뉴클레오티드 상의 양전하와 음전하 사이의 이온 상호작용, 또는 다른 유형의 비-공유 화학적 친화성 연결과 같은, 서로에 대해 친화성을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 중합체를 제공하는 화학적 부분을 갖도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 이들은 또한 상업적으로 실용가능함). 추가로, 일부 실시양태에서, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드가 본원에 기재된 중합체 또는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)와 회합된다 (예를 들어, 그와 복합체를 형성한다). 일부 실시양태에서, 중합체 또는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 구성성분 (예를 들어, 중합체)에 부착된 (예를 들어, 공유결합으로 부착된) 핵산 작은 홈 결합제 또는 삽입제와 회합된다 (예를 들어, 그와 복합체를 형성한다).
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 하나 이상의 음전하를 포함하고 (예를 들어, 음으로 대전된 주쇄를 포함하고), 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 양이온성 쉘 및/또는 중합체 캐리어의 블록 공중합체의 양이온성 쉘 블록과 회합된다. 특정 실시양태에서, 양이온성 쉘 또는 쉘 블록은 적어도 부분적으로 중합체 캐리어에 부착되거나 그에 존재하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)에 존재하는 음전하를 중화한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 하나 이상의 siRNA, 또는 이들의 조합)는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 다가양이온 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록과 회합물 (예를 들어, 복합체)를 형성한다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)와 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 사이의 회합물 (예를 들어, 복합체)은 임의의 요망되는 전하 비율, 예를 들어 1:1 내지 16:1의 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 형성 블록 공중합체 대 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 형성한다. 특정 실시양태에서, 미셀과 siRNA 사이의 복합체는 2:1, 4:1 또는 8:1의 전하 비율로 형성된다. 다시 말하면, 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어의 쉘에 존재하는 양이온 전하의 수 대 폴리뉴클레오티드에 존재하는 음이온 전하의 수의 비율은 임의의 요망되는 값, 예를 들어 약 1:1 내지 약 16:1, 약 2:1 내지 약 8:1, 약 4:1 내지 약 12:1, 약 2:1, 약 4:1 또는 약 8:1이다. 일부 실시양태에서, siRNA는 미셀 형성 블록 공중합체의 다가양이온성 블록에 의해 전하-중화된다. 예를 들어, 일부 특정 실시양태에서는, 생리적 pH에서 40개의 음전하를 포함하는 20-염기 쌍 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)가 약 7.4의 pKa로 폴리DMAEMA 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 (80개 단량체 단위의 길이, MW=11,680)을 포함하는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)와 회합된다 (예를 들어, 복합체를 형성한다). 이 pH에서, 폴리DMAEMA는 40개의 음전하를 함유하며, 이로써 전하가 실질적으로 순 중성인 폴리뉴클레오티드-폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 회합물 (예를 들어, 복합체)이 형성된다. 특정 경우에, 수많은 과잉 양전하를 회피하는 것은 시험관내 및 생체내 독성을 감소시키는 데 도움이 된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)는 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 양으로 대전된 쉘과 자발적으로 회합된다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 임의의 적합한 화학적 접합 기술에 의해 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 및/또는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 하나 이상의 중합체에 화학적으로 접합된다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제를 함유하는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 다수의 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)를 포함하는 이미 형성된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)와 RNAi 작용제의 접합에 의해 형성된다. 다른 실시양태에서, RNAi 작용제를 함유하는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)와 RNAi 작용제의 접합에 의해 형성되고, 이어서 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 생성된 접합체의 RNAi 작용제를 포함하는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)로의 자가 어셈블리에 의해, 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)가 형성된다. 다양한 실시양태에서, 이러한 중합체 캐리어는 RNAi 작용제에 접합된 것들과 유사한, 동일한 또는 그와 상이한 비-접합 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)를 임의로 추가로 포함한다. 본원에 기재된 중합체 및 중합체 캐리어의 폴리뉴클레오티드 사이의 공유 결합은, 임의로, 비-절단성 또는 절단성이다. 특정 실시양태에서는, 하나 이상의 RNAi 작용제 (예를 들어, 다이서 기질)의 전구체가 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀) 또는 중합체 캐리어의 중합체 단위에 부착된다 (예를 들어, 비-절단성 결합에 의한 미셀). 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 RNAi 작용제가 절단성 결합을 통하여 부착된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어에 이용되는 절단성 결합은, 비제한적 예로, 디술피드 결합 (예를 들어, 세포질의 환원 환경에서 해리되는 디술피드 결합)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어 (그의 구성성분 포함)와 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 사이의 공유 회합은 아민-카르복실 링커, 아민-술프히드릴 링커, 아민-탄수화물 링커, 아민-히드록실 링커, 아민-아민 링커, 카르복실-술프히드릴 링커, 카르복실-탄수화물 링커, 카르복실-히드록실 링커, 카르복실-카르복실 링커, 술프히드릴-탄수화물 링커, 술프히드릴-히드록실 링커, 술프히드릴-술프히드릴 링커, 탄수화물-히드록실 링커, 탄수화물-탄수화물 링커 및 히드록실-히드록실 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 화학적 접합 방법을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서, 접합은 또한 히드라존 및 아세탈 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는 pH-민감성 결합 및 링커로 수행된다. 임의의 다른 적합한 접합 방법이 또한 임의로 이용되며, 예를 들어 많은 다양한 접합 화학이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998] 및 이에 포함된 챕터 참조).
특정 실시양태에서, 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)와 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 접합체 (여기서, 중합체는 단일체(unimer)이거나 또는 본원에 제공된 어셈블링된 중합체 캐리어 내에 존재함)는 하기 두 단계를 포함하는 방법에 따라 제조된다: (1) 1-에틸-3,3-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 (EDAC), 이미다졸, N-히드로숙신이미드 (NHS) 및 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), HOBt (1-히드록시벤조트리아졸), p-니트로페닐클로로포르메이트, 카르보닐디이미다졸 (CDI) 및 N,N'-디숙신이미딜 카르보네이트 (DSC)와 같은 (이에 제한되지는 않음) 임의의 적합한 활성화 시약을 사용한, 올리고뉴클레오티드의 변형가능한 말단 기 (예를 들어, 5'- 또는 3'-히드록실)의 활성화; 및 (2) 올리고뉴클레오티드의 말단으로의 블록 공중합체의 공유결합 연결. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 5'- 또는 3'-말단 변형가능한 기는 블록 공중합체와 접합 전에 다른 관능기에 의해 치환된다. 예를 들어, 히드록실 기 (-OH)는 술프히드릴 기 (-SH), 카르복실 기 (-COOH) 또는 아민 기 (-NH2)를 보유하는 링커로 임의로 치환된다.
또다른 실시양태에서, 하나 이상의 염기 (예를 들어, 5-아미노알킬피리미딘)에 도입된 관능기를 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 임의의 적합한 절차에 따라 활성화제 또는 반응성 이관능성 링커를 사용하여 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)에 접합되며, 여기서 중합체는 단일체이거나 또는 본원에 제공된 어셈블링된 중합체 캐리어 내에 존재한다. 다양한 이러한 활성화제 및 이관능성 링커는 시그마(Sigma), 피어스(Pierce), 인비트로젠(Invitrogen) 등과 같은 공급업체로부터 시판된다.
일부 실시양태에서, 하나의 올리고뉴클레오티드 또는 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 자발적 자가 어셈블리에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어의 자발적 자가 어셈블리는 단일 포트에서 달성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유기 용매 (예를 들어, 에탄올) 중 본원에 기재된 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)의 용액을 수성 매질 (예를 들어, 물 또는 PBS)로 희석하여 자가-어셈블링된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)를 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)와 조합하며, 이에 의해 중합체 및 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어가 자발적으로 형성된다. 다른 실시양태에서, 자발적 자가 어셈블리는 (1) 관심있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 본원에 기재된 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체 또는 단일블록 중합체)와 접촉시켜 중합체-폴리뉴클레오티드 접합체를 형성시키고; (2) 본원에 기재된 중합체 캐리어로의 중합체-폴리뉴클레오티드 접합체의 자가 어셈블리를 수행하기에 적합한 조건으로 중합체-폴리뉴클레오티드 접합체를 처리함으로써 발생한다.
중합체 구조
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 블록 공중합체, 예를 들어 특징적인 블록을 갖는 공중합체 및 구배 공중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 구배 공중합체는 친수성 세그먼트 (이는 본원에 기재된 블록 공중합체의 친수성 블록의 종으로 이해되어야 함) 및 소수성 세그먼트 (이는 본원에 기재된 블록 공중합체의 소수성 블록의 종으로 이해되어야 함)를 갖는 것들이다. 특정 실시양태에서, 친수성 세그먼트는 친수성 블록이고, 소수성 세그먼트는 소수성 블록이다. 일부 실시양태에서, 이들 중합체는 비-펩티드성이다. 다른 실시양태에서, 친수성 세그먼트 및 소수성 세그먼트는 단일블록 구배 공중합체의 상이한 영역이다. 다양한 경우에, "중합체 세그먼트"는 주어진 물리적 특성 (예를 들어, 본원에 기재된 블록의 물리적 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 대전성 등)을 갖는 중합체 부분, 또는 유사한 물리적 특성 (예를 들어, 소수성, 친수성, 대전성 등)을 갖는 하나 이상의 블록을 포함하는 중합체 부분이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록); 및 (2) 코어-형성 중합체 세그먼트의 소수성 상호작용을 통하여 안정화된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 소수성 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 중성 또는 대전되지 않은 (예를 들어, 실질적으로 대전되지 않은) 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록); 및 (2) 코어-형성 중합체 세그먼트의 소수성 상호작용을 통하여 안정화된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 소수성 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 중성 또는 대전되지 않은 친수성 블록은 HPMA와 같은 중성 단량체 잔기의 단량체 단위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 양이온 또는 다가양이온 대전된 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록); (2) 코어 -성형 중합체 세그먼트의 소수성 상호작용을 통하여 안정화된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 소수성 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 친수성 블록은 DMAEMA와 같은 양이온성 잔기의 단량체 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친수성 블록은, 적어도 부분적으로 친수성 블록의 전하를 차폐하는 종을 추가로 포함한다. 이러한 차폐는 입체-기준 차폐를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 음이온 또는 다가음이온 대전된 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록); (2) 코어 -성형 중합체 세그먼트의 소수성 상호작용을 통하여 안정화된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 소수성 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록)을 갖는다. 특정 실시양태에서, 음이온 또는 다가음이온 대전된 친수성 블록은 아크릴산 또는 가수분해된 말레산 무수물과 같은 음이온성 잔기를 갖는 단량체 단위를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 블록 공중합체는 각각 (1) 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 쉘을 형성하는 쯔비터이온 또는 다가쯔비터이온 대전된 친수성 블록 (예를 들어, 쉘 블록); 및 (2) 코어-성형 중합체 세그먼트의 소수성 상호작용을 통하여 안정화된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 소수성 코어를 형성하는 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 친수성 블록의 성질 (예를 들어, 양이온성, 음이온성, 중성 또는 쯔비터이온성)은 산성 pH에서 (예를 들어, 엔도솜 pH에서) 대략 중성의 pH에서와 실질적으로 동일하다. 그 결과, 엔도솜으로의 중합체 캐리어의 유입시, 친수성 블록은 엔도솜에 의한 유입 전 형태와 실질적으로 동일한 형태로 존재한다.
일부 경우에, 친수성 세그먼트는 2개 이상의 기능을 수행할 수 있다: 하나는 미셀 구조의 쉘을 형성하는 것이고, 두번째는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 기재의 치료 분자, 예컨대 siRNA 또는 올리고뉴클레오티드 기재의 진단제, 예컨대 방사성표지, 질량 표지, 형광단, PET 표지, 발색단 등과 같은 검출가능한 작용제로 표지된 siRNA)에 결합하는 것이다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 또한 대전가능한 또는 대전된 종 (예를 들어, 생리적 pH에서의 음이온 및/또는 양이온성 종/단량체 단위)을 포함하고, 이는 막-불안정화성이다 (예를 들어, pH 의존적 방식으로 막 불안정화성이다). 일부 실시양태에서, 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록) 및/또는 중합체 캐리어의 코어는 실질적으로 순 중성이다 (즉, 전체적으로, 양전하 및 음전하가 실질적으로 균형을 이룬다). 일부 실시양태에서, 실질적으로 소수성인 블록 (예를 들어, 코어 블록) 및/또는 중합체 캐리어의 코어는 하나 이상의 대전가능한 종 (예를 들어, 단량체 단위, 부분, 기 등)을 포함한다. 보다 구체적 실시양태에서, 실질적으로 소수성인 블록 및/또는 중합체 캐리어의 코어는 다수의 양이온성 종 및 다수의 음이온성 종을 포함한다. 더욱 더 구체적 실시양태에서, 실질적으로 소수성인 블록 및/또는 중합체 캐리어의 코어는 실질적으로 유사한 수의 양이온성 종 및 음이온성 종을 포함한다 (즉, 소수성 블록 및/또는 코어는 실질적으로 순 중성이다).
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 제1 및 제2 대전가능한 종을 포함하는 소수성 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 본원에 기재된 바와 같고, 제2 대전가능한 종은 양성자화에 따른 양이온성 종이다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 산성 pH (예를 들어, 엔도솜 pH, 약 6.5 미만의 pH, 약 6.0 미만의 pH, 약 5.8 미만의 pH, 약 5.7 미만의 pH 등)에서 대전되지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 대전가능한 종의 pKa는 약 6 내지 약 10, 약 6.5 내지 약 9, 약 6.5 내지 약 8, 약 6.5 내지 약 7.5, 또는 임의의 다른 적합한 pKa이다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 종 중 하나 이상 및 제2 대전가능한 종 중 하나 이상은 단일 단량체 단위 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 제1 대전가능한 단량체 단위 상에서 나타나고, 제2 대전가능한 종은 제2 대전가능한 단량체 단위 상에 존재한다. 특정 실시양태에서, 제1 대전가능한 종은 탈양성자화에 따른 음이온성 종이고, 제2 대전가능한 종은 양성자화에 따른 양이온성 종이며, 음이온성 종 대 양이온성 종의 비율은 대략 중성의 pH에서 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 약 1:2 내지 3:2, 또는 약 1:1이다. 일부 실시양태에서, 제1 대전가능한 단량체 단위 대 제2 대전가능한 단량체 단위의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:6 내지 약 6:1, 약 1:4 내지 약 4:1, 약 1:2 내지 약 2:1, 약 1:2 내지 3:2, 또는 약 1:1이다.
본원에서 사용되는 용어 "공중합체"는 중합체가 2종 이상의 상이한 단량체의 중합의 결과물인 것을 의미한다.
"단일블록 중합체"는 단일 중합 단계의 합성 생성물이다. 용어 단일블록 중합체는 공중합체 (즉, 1종 초과의 유형의 단량체의 중합의 생성물) 및 단독중합체 (즉, 단일 종의 단량체의 중합의 생성물)를 포함한다.
"블록" 공중합체는 구성성분 또는 단량체 단위의 하나 이상의 하위조합을 포함하는 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 구성성분 단위는 하나 이상의 중합가능한 단량체로부터 추가의 공정을 통해 유도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 블록 공중합체는 비-지질성 구성성분 또는 단량체 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 이블록 공중합체이다. 이블록 공중합체는 2개의 블록을 포함하며; 이러한 중합체의 도식적 일반식은 하기와 같이 표시된다: [AaBbCc ...]m - [XxYyZz ...]n (여기서, 각 문자는 구성성분 또는 단량체 단위를 나타내고, 구성성분 단위에 대한 각 아래첨자는 특정 블록에서 그 단위의 몰분율을 나타내고, 3개의 점은 각 블록에 더 많은 구성성분 단위가 존재할 수 있다 (또한 더 적은 구성성분 단위가 존재할 수 있다)는 것을 나타내고, m 및 n은 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량을 나타냄). 상기 도식에 의해 시사되는 바와 같이, 일부 경우에, 각 구성성분 단위의 개수 및 성질은 각 블록에 대해 별도로 제어된다. 도식은 각 블록 내의 구성성분 단위의 개수 또는 상이한 유형의 구성성분 단위의 개수 간의 어떠한 관계를 추론하는 것으로 전혀 의도되지 않고 그렇게 해석되어서도 안된다. 또한, 도식은 특정 블록 내의 구성성분 단위의 임의의 특정 개수 또는 배열을 기술하는 것으로 의도되지 않는다. 각 블록에서, 구성성분 단위는 명시적으로 별도의 언급이 없는 경우 완전 무작위, 교대 무작위, 규칙 교대, 규칙 블록 또는 무작위 블록 배열로 배치될 수 있다. 예를 들어, 완전 무작위 배열은 형태: x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z... 를 가질 수 있다. 예시적 교대 무작위 배열은 형태: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z... 를 가질 수 있고, 예시적 규칙 교대 배열은 형태: x-y-z-x-y-z-x-y-z... 를 가질 수 있다. 예시적 규칙 블록 배열은 일반적 배열: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x... 을 가질 수 있으나, 예시적 무작위 블록 배열은 일반적 배열: ...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-... 을 가질 수 있다. 구배 중합체에서, 하나 이상의 단량체 단위의 함량은 중합체의 α 말단으로부터 ω 말단으로 구배 방식으로 증가하거나 감소한다. 상기 일반적 예 중 어떠한 것에서도, 개별 구성성분 단위 또는 블록의 특정 병치 또는 블록 내의 구성성분 단위의 개수 또는 블록의 개수가 본 발명의 중합체 캐리어를 형성하는 블록 공중합체의 실제 구조와 관계가 있거나 이를 제한하는 것으로 의도되지 않으며 또한 어떠한 방식으로도 이렇게 해석되어서도 안된다.
본원에서 사용되는, 구성성분 단위를 묶는 괄호는 구성성분 단위 그 자체가 블록을 형성한다는 것을 의미하지 않으며, 이렇게 해석되지 않는다. 즉, 꺾쇠 괄호 내의 구성성분 단위는 블록 내의 다른 구성성분 단위와 임의의 방식으로, 즉, 완전 무작위, 교대 무작위, 규칙 교대, 규칙 블록 또는 무작위 블록 배열로 조합될 수 있다. 본원에 기재된 블록 공중합체는 임의로 교대, 구배 또는 무작위 블록 공중합체이다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 덴드리머, 별모양 또는 그라프트 공중합체이다.
특정 실시양태에서, 블록 공중합체는 에틸렌계 불포화 단량체를 포함한다. 용어 "에틸렌계 불포화 단량체"는 본원에서 1개 이상의 탄소 이중 또는 삼중 결합을 갖는 화합물로서 정의된다. 에틸렌계 불포화 단량체의 비제한적 예는, 알킬 (알킬)아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 알킬아크릴아미드, 메타크릴아미드, 아크릴아미드, 스티렌, 알릴아민, 알릴암모늄, 디알릴아민, 디알릴암모늄, N-비닐 포름아미드, 비닐 에테르, 비닐 술포네이트, 아크릴산, 술포베타인, 카르복시베타인, 포스포베타인 또는 말레산 무수물이다.
다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 및/또는 중합체 캐리어를 제공하기에 적합한 임의의 단량체가 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 및 중합체 캐리어의 제조에 사용하기에 적합한 단량체로는, 비제한적 예로, 하나 이상의 하기 단량체가 포함된다: 메틸 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 프로필 메타크릴레이트 (모든 이성질체), 부틸 메타크릴레이트 (모든 이성질체), 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 이소보르닐 메타크릴레이트, 메타크릴산, 벤질 메타크릴레이트, 페닐 메타크릴레이트, 메타크릴로니트릴, 알파-메틸스티렌, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트 (모든 이성질체), 부틸 아크릴레이트 (모든 이성질체), 2-에틸헥실 아크릴레이트, 이소보르닐 아크릴레이트, 아크릴산, 벤질 아크릴레이트, 페닐 아크릴레이트, 아크릴로니트릴, 스티렌, 글리시딜 메타크릴레이트, 2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트 (모든 이성질체), 히드록시부틸 메타크릴레이트 (모든 이성질체), N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-디에틸아미노에틸 메타크릴레이트, 트리에틸렌글리콜 메타크릴레이트, 올리고에틸렌글리콜 메타크릴레이트로부터 선택된 아크릴레이트 및 스티렌, 이타콘산 무수물, 이타콘산, 글리시딜 아크릴레이트, 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시프로필 아크릴레이트 (모든 이성질체), 히드록시부틸 아크릴레이트 (모든 이성질체), N,N-디메틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-디에틸아미노에틸 아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜 아크릴레이트, 메타크릴아미드, N-메틸아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N-tert-부틸메타크릴아미드, N-n-부틸메타크릴아미드, N-메틸올아크릴아미드, N-에틸올아크릴아미드, 비닐 벤조산 (모든 이성질체), 디에틸아미노스티렌 (모든 이성질체), 알파-메틸비닐 벤조산 (모든 이성질체), 디에틸아미노 알파-메틸스티렌 (모든 이성질체), p-비닐벤젠술폰산, p-비닐벤젠 술폰산 나트륨 염, 트리메톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 트리에톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 트리부톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 디메톡시메틸실릴프로필 메타크릴레이트, 디에톡시메틸실릴프로필메타크릴레이트, 디부톡시메틸실릴프로필 메타크릴레이트, 디이소프로폭시메틸실릴프로필 메타크릴레이트, 디메톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 디에톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 디부톡시실릴프로필 메타크릴레이트, 디이소프로폭시실릴프로필 메타크릴레이트, 트리메톡시실릴프로필 아크릴레이트, 트리에톡시실릴프로필 아크릴레이트, 트리부톡시실릴프로필 아크릴레이트, 디메톡시메틸실릴프로필 아크릴레이트, 디에톡시메틸실릴프로필 아크릴레이트, 디부톡시메틸실릴프로필 아크릴레이트, 디이소프로폭시메틸실릴프로필 아크릴레이트, 디메톡시실릴프로필 아크릴레이트, 디에톡시실릴프로필 아크릴레이트, 디부톡시실릴프로필 아크릴레이트, 디이소프로폭시실릴프로필 아크릴레이트, 비닐 아세테이트, 비닐 부티레이트, 비닐 벤조에이트, 비닐 클로라이드, 비닐 플루오라이드, 비닐 브로마이드, 말레산 무수물, N-아릴말레이미드, N-페닐말레이미드, N-알킬말레이미드, N-부틸말레이미드, N-비닐피롤리돈, N-비닐카르바졸, 부타디엔, 이소프렌, 클로로프렌, 에틸렌, 프로필렌, 1,5-헥사디엔, 1,4-헥사디엔, 1,3-부타디엔, 1,4-펜타디엔, 비닐알코올, 비닐아민, N-알킬비닐아민, 알릴아민, N-알킬알릴아민, 디알릴아민, N-알킬디알릴아민, 알킬렌이민, 아크릴산, 알킬아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴산, 알킬메타크릴레이트, 메타크릴아미드, N-알킬아크릴아미드, N-알킬메타크릴아미드, 스티렌, N-이소프로필아크릴아미드, 비닐나프탈렌, 비닐 피리딘, 에틸비닐벤젠, 아미노스티렌, 비닐이미다졸, 비닐피리딘, 비닐바이페닐, 비닐아니솔, 비닐이미다졸릴, 비닐피리디닐, 비닐폴리에틸렌글리콜, 디메틸아미노메틸스티렌, 트리메틸암모늄 에틸 메타크릴레이트, 트리메틸암모늄 에틸 아크릴레이트, 디메틸아미노프로필아크릴아미드, 트리메틸암모늄 에틸아크릴레이트, 트리메틸암모늄 에틸 메타크릴레이트, 트리메틸암모늄 프로필 아크릴아미드, 도데실 아크릴레이트, 옥타데실 아크릴레이트 또는 옥타데실 메타크릴레이트 단량체, 또는 이들의 조합.
일부 실시양태에서, 이들 단량체의 관능화된 버전이 임의로 사용된다. 본원에서 사용되는, 관능화된 단량체는 마스킹된 또는 마스킹되지 않은 관능기, 예를 들어 중합 후 다른 부분이 부착될 수 있는 기를 포함하는 단량체이다. 이러한 기의 비제한적 예는 일급 아미노 기, 카르복실, 티올, 히드록실, 아지드 및 시아노 기이다. 여러 적합한 마스킹 기가 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991. P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994] 참조).
본원에 기재된 중합체는 임의의 적합한 방식으로 제조된다. 본원에 제공된 중합체의 제조에서 사용되는 적합한 합성 방법에는, 비제한적 예로, 양이온, 음이온 및 자유 라디칼 중합이 포함된다. 일부 경우에, 양이온 방법이 사용되는 경우, 단량체를 촉매로 처리하여 중합을 개시한다. 임의로, 하나 이상의 단량체를 사용하여 공중합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 이러한 촉매는, 예를 들어 양성자산 (브뢴스테드 산) 또는 루이스 산을 포함하는 개시제이며, 루이스산의 사용의 경우에 일부 촉진제, 예컨대 물 또는 알코올이 또한 임의로 사용된다. 일부 실시양태에서, 촉매는, 비제한적 예로, 요오드화수소, 과염소산, 황산, 인산, 불화수소, 클로로술폰산, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 삼염화알루미늄, 알킬 염화알루미늄, 삼불화붕소 착물, 사염화주석, 오염화안티몬, 염화아연, 사염화티타늄, 오염화인, 인 옥시클로라이드 또는 크롬 옥시클로라이드이다. 특정 실시양태에서, 중합체 합성은 임의의 적합한 용매에서 또는 용매 없이 수행된다. 적합한 용매에는 펜탄, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 디메틸 포름아미드 (DMF)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 중합체 합성은, 예를 들어 약 -50℃ 내지 약 100℃, 또는 약 0℃ 내지 약 70℃를 포함하는 임의의 적합한 반응 온도에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 중합체는 자유 라디칼 중합에 의해 제조된다. 자유 라디칼 중합 공정이 사용되는 경우, (i) 단량체, (ii) 임의로 공단량체 및 (iii) 임의의 자유 라디칼 공급원이 자유 라디칼 중합 공정을 촉발하기 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 일부 단량체는 고온에서 가열시 자가개시될 수 있기 때문에 자유 라디칼의 공급원은 임의적이다. 특정 경우에, 중합 혼합물의 형성 후, 혼합물을 중합 조건으로 처리한다. 중합 조건은 본원에서 논의된 바와 같이 하나 이상의 단량체가 하나 이상의 중합체를 형성하도록 유발하는 조건이다. 이러한 조건은 임의로 임의의 적합한 수준으로 달라지며, 비제한적 예로, 온도, 압력, 대기, 중합 혼합물에서 사용되는 출발 구성성분의 비율 및 반응 시간을 포함한다. 중합은, 예를 들어 용해, 분산, 현탁, 유화 또는 벌크를 포함하는 임의의 적합한 방식으로 수행된다.
일부 실시양태에서는, 개시제가 반응 혼합물에 존재한다. 본원에 기재된 중합 공정에서 유용한 경우 임의의 적합한 개시제가 임의로 사용된다. 이러한 개시제에는, 비제한적 예로, 하나 이상의 알킬 퍼옥시드, 치환된 알킬 퍼옥시드, 아릴 퍼옥시드, 치환된 아릴 퍼옥시드, 아실 퍼옥시드, 알킬 히드로퍼옥시드, 치환된 알킬 히드로퍼옥시드, 아릴 히드로퍼옥시드, 치환된 아릴 히드로퍼옥시드, 헤테로알킬 퍼옥시드, 치환된 헤테로알킬 퍼옥시드, 헤테로알킬 히드로퍼옥시드, 치환된 헤테로알킬 히드로퍼옥시드, 헤테로아릴 퍼옥시드, 치환된 헤테로아릴 퍼옥시드, 헤테로아릴 히드로퍼옥시드, 치환된 헤테로아릴 히드로퍼옥시드, 알킬 퍼에스테르, 치환된 알킬 퍼에스테르, 아릴 퍼에스테르, 치환된 아릴 퍼에스테르 또는 아조 화합물이 포함된다. 특정 실시양태에서, 벤조일퍼옥시드 (BPO) 및/또는 AIBN이 개시제로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 중합 공정은 원자 이동 라디칼 중합 (ATRP), 니트록시드-매개 리빙 자유 라디칼 중합 (NMP), 개환 중합 (ROP), 퇴행 이동 (DT) 또는 가역적 부가 쪼개짐 이동 (RAFT)과 같은 (이에 제한되지는 않음) 임의의 적합한 방식으로 리빙 방식으로 수행된다. 통상적인 및/또는 리빙/제어 중합 방법을 이용하여, 블록, 그라프트, 별모양 및 구배 공중합체와 같은 (이에 제한되지는 않음) 다양한 중합체 구조가 제조될 수 있으며, 이에 의해 단량체 단위는 사슬에 걸쳐 구배 방식으로 또는 통계적으로 분포되거나, 또는 블록 서열 또는 펜던트 그라프트에서 단독중합된다. 다른 실시양태에서, 중합체는 크산테이트의 가역적 부가-쪼개짐 사슬 이동을 통한 거대분자 설계 (MADIX)에 의해 합성된다 (문헌 [Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, No. 18, 1497-1503 (2001)]).
특정 실시양태에서, 가역적 부가-쪼개짐 사슬 이동 또는 RAFT가 본 발명의 에틸렌계 주쇄 중합체의 합성에서 사용된다. RAFT는 리빙 중합 공정이다. RAFT는 자유 라디칼 퇴행 사슬 이동 공정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체의 제조를 위한 RAFT 절차는 가역적 사슬 이동 메카니즘에 의해 중합을 매개하기 위해 티오카르보닐티오 화합물, 예컨대 디티오에스테르, 디티오카르바메이트, 트리티오카르보네이트 및 크산테이트 (이에 제한되지는 않음)를 사용한다. 특정 경우에, 상기 화합물 중 임의의 화합물의 C=S 기와 중합체 라디칼의 반응은 안정화된 라디칼 중간체의 형성을 초래한다. 전형적으로, 이들 안정화된 라디칼 중간체는 표준 라디칼 중합의 전형적인 종결 반응을 거치지 않으며, 오히려 단량체와 재개시 또는 전파가 가능한 라디칼을 재도입하여 공정에서 C=S 결합을 재형성한다. 대부분의 경우에, C=S 결합으로의 첨가, 이어서 다음 라디칼의 쪼개짐의 이러한 주기는 모든 단량체가 소모되거나 반응이 켄칭될 때까지 계속된다. 일반적으로, 임의의 특정 시간에 활성 라디칼의 저농도는 정상적 종결 반응을 제한한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)에서 사용되는 블록 공중합체는 낮은 다분산 지수 (PDI) 또는 사슬 길이의 차이를 갖는다. 다분산 지수 (PDI)는 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 중합체 사슬의 중량평균 분자량을 그의 수평균 분자량으로 나눔으로써 결정될 수 있다. 수평균 분자량은 사슬의 개수로 나눈 개별 사슬 분자량의 합이다. 중량평균 분자량은 분자량을 그 분자량을 갖는 분자의 개수로 나눈 것의 제곱에 비례한다. 중량평균 분자량이 항상 수평균 분자량보다 더 크기 때문에, 다분산도는 항상 1 이상이다. 숫자가 점점 더 가까워져서 동일하게 될수록, 즉 다분산도가 1의 값에 접근할수록, 중합체는 모든 사슬이 정확히 동일한 개수의 구성성분 단위를 갖는 단순분산에 더 가깝게 된다. 1에 접근하는 다분산도 값은 라디칼 리빙 중합을 이용하여 달성가능하다. 크기 배제 크로마토그래피, 동적 광산란, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 크로마토그래피 및 전기분무 질량 크로마토그래피 (이에 제한되지는 않음)와 같은 다분산도의 측정 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 블록 공중합체는 2.0 미만, 또는 1.5 미만, 또는 1.4 미만, 또는 1.3 미만, 또는 1.2 미만의 다분산 지수 (PDI)를 갖는다.
본원에 기재된 중합 공정은 임의로 임의의 적합한 용매 또는 이들의 혼합물에서 수행된다. 적합한 용매로는 물, 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올), 테트라히드로푸란 (THF), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 아세톤, 아세토니트릴, 헥사메틸포스포라미드, 아세트산, 포름산, 헥산, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔, 디옥산, 메틸렌 클로라이드, 에테르 (예를 들어, 디에틸 에테르), 클로로포름 및 에틸 아세테이트가 포함된다. 한 측면에서, 용매로는 물, 및 물과 DMF와 같은 수-혼화성 유기 용매의 혼합물이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에서 사용되는 폴리(DMAEMA) 및 다른 중합체 물질 (예를 들어, BMA, DMAEMA 및 PAA의 공중합체 또는 공중합체 블록)은 임의의 적합한 방식으로 제조된다. 일 실시양태에서, 폴리(DMAEMA)는 RAFT CTA, ECT 및 라디칼 개시제의 존재 하에 DMAEMA의 중합에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서는, 제2 블록이 BMA, DMAEMA 및 PAA를 함유한 일련의 이블록 공중합체의 제조에서 블록, 폴리(DMAEMA) 매크로CTA가 사용된다. 다른 특정 실시양태에서, 자가-어셈블리시 중합체의 ω 말단이 미셀 또는 중합체 캐리어의 친수성 세그먼트 상에 노출되도록 이블록 중합체 상의 블록의 배향이 반전된다. 다양한 실시양태에서, 이는 수많은 합성 방법을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 달성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 블록 공중합체의 합성은 PAA/BMA/DMAEMA 코어-형성 소수성 블록의 제조와 함께 시작되고, 생성된 PAA/BMA/DMAEMA 매크로CTA의 제2 RAFT 중합 단계로의 처리에 의해 제2 합성 단계에서 쉘-형성 친수성 대전된 블록이 첨가된다. 별법의 접근법은 PAA/BMA/DMAEMA 매크로CTA를 환원시켜 티올 말단을 형성시킨 후, 예비형성된 친수성의 대전된 중합체를 형성된 티올에 공유결합으로 부착시키는 것을 포함한다. 이 합성 접근법은 미셀의 표면에 노출된 중합체 사슬의 ω-말단 상의 반응성 기의 도입 방법을 제공하며, 그러므로 미셀로의 화학적 접합에 대한 별법의 접근법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 별도의 중합 공정에 의해 제조된 여러 중합체 블록의 화학적 접합에 의해 합성된다.
대전된 종 및 소수성 코어
특정 실시양태에서, 소수성 블록은 1종 이상의 대전가능한 종을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 대전가능한 종은 양이온성 종으로 대전가능하다. 대전가능한 종을 포함하는 본원에 기재된 중합체 캐리어는, 각각의 대전가능한 종이 각각 개별적으로 대전 상태 또는 대전되지 않은 상태로 중합체 캐리어 내에 존재하는 중합체 캐리어를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 중합체 캐리어가 제1 대전가능한 종의 집단, 제2 대전가능한 종의 집단 및/또는 임의의 추가의 대전가능한 종의 집단을 포함하는 경우, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 제1, 제2 및 임의의 추가의 대전가능한 종의 집단 각각이 각각 개별적으로 완전히 대전된 상태, 부분적으로 대전된 상태 또는 완전히 대전되지 않은 상태로 중합체 캐리어 내에 존재하는 중합체 캐리어를 포함한다.
일부 실시양태에서, 음이온성 대전가능한 종은 선택된 중합 공정에서 보호된 종 (예를 들어, 에스테르)으로서 또는 유리 산으로서 임의로 존재하는 임의의 유기산 또는 무기산 잔기이다. 일부 실시양태에서, 음이온성 대전가능한 종은 하기 기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 약산이다: 보론산, 술폰아미드, 포스폰산, 아르손산, 포스핀산, 포스페이트, 카르복실산, 크산텐, 테트라졸 또는 이들의 유도체 (예를 들어, 에스테르). 특정 실시양태에서는, 말레산 무수물과 같은 단량체 (문헌 [Scott M. Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S. Hoffman, and Patrick S. Stayton pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery. Biomacromolecules 2006, 7, 2407-2414])를 말레산 무수물 단량체 단위의 중합후 가수분해에 의한 제1 대전가능한 종의 도입을 위해 사용한다. 특정 실시양태에서, 정상 생리적 pH에서 음이온성인 대전가능한 종은 카르복실산, 예컨대 2-프로필 아크릴산, 또는 보다 정확하게는, 이로부터 유도된 구성성분 단위, 2-프로필프로피온산, -CH2C((CH2)2CH3)(COOH) (PAA) (이에 제한되지는 않음)이다.
일부 실시양태에서, 대전가능한 종은 양이온성이다. 특정 실시양태에서, 대전가능한 종은 생리적 pH에서 양이온성이다. 특정 실시양태에서, 생리적 pH에서 양이온인 종은 질소 종, 예컨대 암모늄, -NRR'R", 구아니디늄 (-NRC(=NR'H)+NR"R'", 당업자에게 공지된 일반형 포함) (여기서 R 기는 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 아릴이거나, 또는 동일한 또는 인접한 질소 원자에 결합된 2개의 R 기는 또한 서로 결합되어 헤테로시클릭 종, 예컨대 피롤, 이미다졸, 또는 인돌 (이에 제한되지는 않음)을 형성할 수 있음) (이에 제한되지는 않음)이다. 일부 실시양태에서, 막 분열의 두가지 메카니즘, 즉 (a) 다가양이온 (예컨대 DMAEMA) 및 (b) 소수성화된 다가음이온 (예컨대 프로필아크릴산)의 조합을 함께 행하는 것은 중합체에 의해 제공된 막 불안정화의 효능에 부가적 또는 상승작용적 효과를 갖는다.
일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 다수의 소수성 종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 블록 공중합체는 소수성 단량체 단위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 소수성 단량체 단위는 비닐 치환된 방향족 또는 헤테로방향족 화합물이다. 추가의 특정 실시양태에서, 소수성 단량체는 알킬 (알킬)아크릴레이트이다. 특정 실시양태에서, 소수성 단량체는 스티렌 유도체이다.
일부 실시양태에서, 중합체는 음이온 및 양이온성 대전가능한 종이 동일한 단량체 단위에 존재하는 쯔비터이온성 단량체 단위 포함한다.
일부 경우에, 블록 공중합체는 당업계에 공지된 화학, 예를 들어 "클릭(click)" 화학을 통한 추가의 관능기의 중합후 도입에 사용될 수 있는 반응성 기를 보유하는 단량체를 포함한다 ("클릭" 반응의 예에 대해, 문헌 [Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17] 참조). 특정 실시양태에서, 반응성 기는 N-히드로숙신이미드 (NHS) 에스테르, HOBt (1-히드록시벤조트리아졸) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 기 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 활성화된 기이다.
특정 경우에, 하기 구조를 갖는 중합체가 본원에 제공된다:
α-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-Dz]a-ω [구조식 1]
α-[Bx-Py-Dz]a-[Ds-Xt]b-ω [구조식 2]
여기서, x, y, z, s 및 t는 중합체 블록 내의 개별 단량체 단위 D (DMAEMA), B (BMA), P (PAA) 및 친수성 중성 단량체 (X)의 몰％ 조성 (일반적으로, 0 내지 50％)이고, a 및 b는 블록의 분자량이고, [Ds-Xt]는 친수성 블록이고, α 및 ω는 중합체의 반대편 말단을 나타낸다. 특정 실시양태에서, x는 50％이고 y는 25％이고 z는 25％이다. 특정 실시양태에서, x는 60％이고 y는 20％이고 z는 20％이다. 특정 실시양태에서, x는 70％이고 y는 15％이고 z는 15％이다. 특정 실시양태에서, x는 50％이고 y는 25％이고 z는 25％이다. 특정 실시양태에서, x는 33％이고 y는 33％이고 z는 33％이다. 특정 실시양태에서, x는 50％이고 y는 20％이고 z는 30％이다. 특정 실시양태에서, x는 20％이고 y는 40％이고 z는 40％이다. 특정 실시양태에서, x는 30％이고 y는 40％이고 z는 30％이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 약 2,000 Da 내지 약 30,000 Da, 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da, 또는 약 7,000 Da 내지 약 15,000 Da의 친수성 블록을 포함한다. 특정 실시양태에서, 친수성 블록은 약 7,000 Da, 8,000 Da, 9,000 Da, 10,000 Da, 11,000 Da, 12,000 Da, 13,000 Da, 14,000 Da 또는 15,000 Da를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 약 2,000 Da 내지 약 50,000 Da, 10,000 Da 내지 약 50,000 Da, 약 15,000 Da 내지 약 35,000 Da, 또는 약 20,000 Da 내지 약 30,000 Da의 소수성 블록을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 12,500 Da의 친수성 블록 및 25,000 Da의 소수성 블록 (1:2의 길이 비율)을 갖는 중합체가 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)를 형성한다. 일부 특정 실시양태에서는, 10,000 Da의 친수성 블록 및 30,000 Da의 소수성 블록 (1:3의 길이 비율)을 갖는 중합체가 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)를 형성한다. 일부 특정 실시양태에서는, 10,000 Da의 친수성 블록 및 25,000 Da의 소수성 블록 (1:2.5의 길이 비율)을 갖는 중합체가 대략 45 nm (동적 광산란 측정 또는 전자 현미경검사에 의해 측정됨)의 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)를 형성한다. 일부 특정 실시양태에서, 미셀은 80 또는 130 nm (동적 광산란 측정 또는 전자 현미경검사에 의해 측정됨)이다. 전형적으로, 코어를 형성하는 소수성 블록인 -[Bx-Py-Dz]에 대하여, 미셀 쉘을 형성하는 [Ds-Xt]의 분자량 (또는 길이)이 증가함에 따라, 미셀의 크기가 증가한다. 일부 경우에, 쉘을 형성하는 중합체 양이온성 블록인 [Ds-Xt]의 크기는 올리고뉴클레오티드 약물과의 효과적인 복합체 형성/전하 중화를 제공하는 데 있어서 중요한다. 예를 들어, 특정 경우에, 대략 20개 염기 쌍 (즉, 40개 음이온 전하)의 siRNA에 대해, 양이온성 블록은 효과적인 결합을 제공하기에 적합한 길이를 갖는다 (예를 들어, 40개의 양이온 전하). 7.4의 pKa 값을 갖는 80개 DMAEMA 단량체 (MW = 11,680)를 함유하는 쉘 블록에 대해, 블록은 pH 7.4에서 40개의 양이온 전하를 함유한다. 일부 경우에, 안정한 중합체-siRNA 접합체 (예를 들어, 복합체)는 유사한 개수의 반대 전하들 사이의 정전기 상호작용에 의해 형성된다. 특정 경우에, 수많은 과잉 양전하를 회피하는 것은 유의한 시험관내 및 생체내 독성을 방지하는 데 도움이 된다.
특정 실시양태에서, 블록 공중합체의 소수성 블록은 다수의 양이온성 대전가능한 종, 예를 들어 디메틸아미노에틸메타크릴레이트 (DMAEMA)를 포함한다. 이 경우, 일부 실시양태에서, 이러한 중합체 세그먼트의 구조는 하기 구조식 3으로 표시된다:
Q1-[BMAx-PAAy-DMAEMAz]-Q2 [구조식 3]
여기서, x, y 및 z는 개별 단량체 단위의 몰％ 조성 (일반적으로, 0 내지 50％)이고, 상기 명칭에서 Q1 및 Q2는 다른 중합체 블록 또는 말단 기 관능기를 나타낸다. 특정 경우에, 개별 단량체 단위는 개별 및 상승적 기능을 수행한다. 예를 들어, 약 6.7의 pKa 값을 갖는, 음이온성 종 및 소수성 종 둘 다를 포함하는 폴리프로필 아크릴산은 약 6.7 초과의 pH에서 친수성이고 약 6.7 미만의 pH에서 점점 더 소수성이며, 여기서 카르복실레이트는 양성자화된다. 특정 경우에, 국소 환경의 소수성의 증가 (예를 들어, 블록 내의 우세하게 소수성인 단량체 단위 BMA의 몰％의 증가에 의한 것)는 PAA pKa를 상승시키고, 더 높은 pH에서 PAA의 양성자화를 초래하며, 즉 PAA 함유 블록은 더 높은 pH에서 더욱 막 불안정화성이 되며, 그러므로, 생리적 pH 약 7.4 미만의 pH에서 더 작은 산성 변화에 대해 더 반응성이 된다. 일부 경우에, PAA의 양성자화는 소수성의 큰 증가 및 막 불안정화 특성을 갖는 형태로의 후속적 형태 변화를 초래한다. 상기 기재된 중합체 블록 내의 제3 단량체 단위는 양이온성 종, 예를 들어 DMAEMA이며, 이는 일부 경우에 하기의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 기능을 수행한다. PAA의 음이온성 종에 대한 등가 몰량에서 매치되는 경우, 이는 상기 구조에서 Q1 또는 Q2가 친수성 단독중합체 블록, 예를 들어 폴리-DMAEMA인 미셀 구조의 소수성 코어의 안정성에 기여할 수 있는 정전기 상호작용의 형성을 위한 전위 및 전하 중화를 생성한다.
블록 배열
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 생리적 pH (예를 들어, 순환 인간 혈장의 pH)에서 또는 그 근처에서 양이온성이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 다가양이온을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, siRNA)은 x개의 음이온을 포함하는 다가음이온이고, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 약 0.6·x, 약 0.7·x, 약 0.8·x, 약 0.9·x, 약 1.0·x, 약 1.1·x개, 또는 그 초과의 양이온을 포함한다. 특정 실시양태에서, 핵산 (예를 들어, siRNA)은 x개의 음이온을 포함하는 다가음이온이고, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 약 0.7·x개 이상의 양이온을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 양이온성 종은 질소 종, 예컨대 암모늄, -NRR'R", 구아니디늄 (-NRC(=NR'H)+NR"R'", 당업자에게 공지된 일반형 포함) (여기서 R 기는 독립적으로 수소, 알킬, 시클로알킬 또는 아릴이거나, 또는 동일한 또는 인접한 질소 원자에 결합된 2개의 R 기는 또한 서로 결합되어 헤테로시클릭 종, 예컨대 피롤, 이미다졸, 또는 인돌 (이에 제한되지는 않음)을 형성할 수 있음) (이에 제한되지는 않음)이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 핵산 결합 폴리아미드, 삽입물(intercalator) 또는 이중나선- 또는 삼중나선-형성 올리고뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 블록 공중합체의 α-말단 블록 또는 ω-말단 블록일 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 약 10,000 달톤 내지 약 20,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 소수성 블록은 약 2,000 달톤 내지 약 50,000 달톤 또는 약 10,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는다.
특정 실시양태에서, 블록 공중합체 (예를 들어, 이블록 공중합체)는 하기 화학식 I을 갖는다.
<화학식 I>
Figure pct00001
일부 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C), (4C-10C)헤테로아릴 및 아릴(6C-10C)아릴로 이루어진 군에서 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y0, Y1 및 Y2는 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-, -(4C-10C)헤테로아릴- 및 -(6C-10C)아릴-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -(4C-10C)헤테로아릴- 및 -(6C-10C)아릴-로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
Y0 내지 Y4 및 R1 내지 R5로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q0은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화되는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 (또는 대전되지 않은) 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기); 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기 (예를 들어, 반응성 기를 포함하는 잔기, 예를 들어 아지드, 알킨, 숙신이미드 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 등); 또는 수소로 이루어진 군에서 선택된 잔기이고;
Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 양으로 대전되는 잔기 (예를 들어, 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴, 피리딜 등); 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화되는 잔기 (예를 들어, 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등); 생리적 pH에서 실질적으로 중성인 잔기 (예를 들어, 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등); 또는 생리적 pH에서 적어도 부분적으로 쯔비터이온성인 잔기 (예를 들어, 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 잔기)이고;
Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화되는 잔기이고;
m은 약 0 내지 1.0 미만 (예를 들어, 0 내지 약 0.49)이고;
n은 0 초과 내지 약 1.0 (예를 들어, 약 0.51 내지 약 1.0)이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고;
q는 약 0.1 내지 약 0.9 (예를 들어, 약 0.2 내지 약 0.5)이고; 여기서
r은 0 내지 약 0.8 (예를 들어, 0 내지 약 0.6)이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
일부 실시양태에서, p 및 q로 표시되는 단량체 잔기의 개수 또는 비율은 서로의 약 30％, 서로의 약 20％, 서로의 약 10％ 등 이내에 있다. 특정 실시양태에서, p는 q와 실질적으로 동일하다. 특정 실시양태에서, "적어도 부분적으로 대전된"은 일반적으로 미량보다 많은 양의 대전된 종을 포함하며, 예를 들어 잔기의 20％ 이상이 대전된, 잔기의 30％ 이상이 대전된, 잔기의 40％ 이상이 대전된, 잔기의 50％ 이상이 대전된, 잔기의 60％ 이상이 대전된, 잔기의 70％ 이상이 대전된 것 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 (또는 대전되지 않은) 잔기이다. 일부 실시양태에서, "실질적으로 대전되지 않은"은 예를 들어, 5％ 미만이 대전된, 3％ 미만이 대전된, 1％ 미만이 대전된 것 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q0 또는 Q1 중 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 음이온성인 잔기이고, Q0 또는 Q1 중 다른 하나는 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 적어도 부분적으로 양이온성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다. 특정 실시양태에서, m은 >0이고, n은 >0이고, Q1은 생리적 pH에서 친수성이고 실질적으로 중성인 잔기이고, Q0은 접합가능한 또는 관능화가능한 잔기인 잔기이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 하기 화학식 II의 블록 공중합체를 포함한다.
<화학식 II>
Figure pct00002
일부 실시양태에서:
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬, C(O)NR6(1C-10C), (4C-10C)헤테로아릴 및 (6C-10C)아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬-, -S(2C-10C)알킬-, -C(O)NR6(2C-10C)알킬-, -(4C-10C)헤테로아릴- 및 -(6C-10C)아릴-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-10C)알킬, (4C-10C)헤테로아릴 및 (6C-10C)아릴로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
Y0 내지 Y4 및 R1 내지 R5로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 수소, -CN, 알킬, 알키닐, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Q1 및 Q2는 아미노, 알킬아미노, 암모늄, 알킬암모늄, 구아니딘, 이미다졸릴 및 피리딜을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 생리적 pH에서 양으로 대전되는 잔기이고;
Q3은 카르복실, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트 및 포스페이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 생리적 pH에서 음으로 대전되나 더 낮은 pH에서 양성자화되는 잔기이고;
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 하기 화학식 III의 블록 공중합체 (예를 들어, 정상 생리적 pH에서)를 포함한다.
<화학식 III>
Figure pct00003
특정 실시양태에서, 지시된 바와 같이 치환된 A0, A1, A2, A3 및 A4는 화학식 III의 중합체의 구성성분 단위 (본원에서 "단량체 단위" 및 "단량체 잔기"와 상호교환가능하게 사용됨)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학식 III의 A 기를 구성하는 단량체 단위는 적절한 조건 하에 중합가능하게 상용성이 있다. 특정 경우에, 에틸렌계 주쇄 또는 구성성분 단위, -(C-C)m- 중합체 (여기서, 각 C는 H 및/또는 임의의 다른 적합한 기로 이치환됨)는 탄소-탄소 이중 결합 (>C=C<)을 함유하는 단량체를 사용하여 중합된다. 특정 실시양태에서, 각 A 기 (예를 들어, 각 A0, A1, A2, A3 및 A4)는 -C-C- (즉, 에틸렌계 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -C(O)(C)aC(O)O- (즉, 폴리무수물 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -O(C)aC(O)- (즉, 폴리에스테르 단량체 단위 또는 중합체 주쇄), -O(C)bO- (즉, 폴리알킬렌 글리콜 단량체 단위 또는 중합체 주쇄) 등 (여기서, 각 C는 H 및/또는 상기 기재된 바와 같은 R12 및/또는 R13을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 적합한 기로 이치환됨)일 수 있다 (즉, 이들로부터 독립적으로 선택될 수 있다). 특정 실시양태에서, 용어 "a"는 1 내지 4의 정수이고, "b"는 2 내지 4의 정수이다. 특정 경우에, 화학식 III의 주쇄에 부착된 각 "Y" 및 "R" 기 (즉, Y0, Y1, Y2, Y3, Y4, R1, R2, R3, R4, R5 중 임의의 하나)는 특정 단량체 단위의 임의의 "C" (임의의 (C)a 또는 (C)b 포함)에 결합된다. 특정 실시양태에서, 특정 단량체 단위의 Y 및 R 둘 다 동일한 "C"에 부착된다. 특정 구체적 실시양태에서, 특정 단량체 단위의 Y 및 R 둘 다 동일한 "C"에 부착되며, 존재하는 경우 "C"는 단량체 단위의 카르보닐 기에 대해 알파이다.
특정 실시양태에서, R1 내지 R11은 수소, 알킬 (예를 들어, 1C-5C 알킬), 시클로알킬 (예를 들어, 3C-6C 시클로알킬) 또는 페닐에서 독립적으로 선택되며, R1 내지 R11 중 임의의 것은 하나 이상의 불소, 시클로알킬 또는 페닐로 임의로 치환되고, 이는 임의로 하나 이상의 알킬 기로 추가로 치환될 수 있다.
특정 구체적 실시양태에서, Y0 및 Y4는 수소, 알킬 (예를 들어, 1C-10C 알킬), 시클로알킬 (예를 들어, 3C-6C 시클로알킬), O-알킬 (예를 들어, O-(2C-10C)알킬, -C(O)O-알킬 (예를 들어, -C(O)O-(2C-10C)알킬) 또는 페닐에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소로 임의로 치환된다.
일부 실시양태에서, Y1 및 Y2는 공유 결합, 알킬, 본원에서 바람직하게는 (1C-10C)알킬, -C(O)O-알킬, 본원에서 바람직하게는 -C(O)O-(2C-10C)알킬, -OC(O)알킬, 본원에서 바람직하게는 -OC(O)-(2C-10C)알킬, O-알킬, 본원에서 바람직하게는 -O(2C-10C)알킬 및 -S-알킬, 본원에서 바람직하게는 -S-(2C-10C)알킬에서 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, Y3은 공유 결합, 알킬, 본원에서 바람직하게는 (1C-5C)알킬 및 페닐에서 선택된다.
일부 실시양태에서, Z-는 존재하거나 부재한다. R1 및/또는 R4가 수소인 특정 실시양태에서, Z-는 OH-이다. 특정 실시양태에서, Z-는 임의의 반대이온 (예를 들어, 하나 이상의 반대이온), 바람직하게는 생체적합성 반대이온, 예컨대, 비제한적 예로, 클로라이드, 무기 또는 유기 포스페이트, 술페이트, 술포네이트, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 발레레이트, 카프로에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 라우레이트, 미리스테이트, 팔메이트, 스테아레이트, 팔미톨레이트, 올레에이트, 리놀레이트, 아라키데이트, 가돌레에이트, 박시네이트, 락테이트, 글리콜레이트, 살리실레이트, 데스아미노페닐알라닌, 데스아미노세린, 데스아미노트레오닌, ε-히드록시카프로에이트, 3-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티레이트 또는 3-히드록시발레레이트이다. 일부 실시양태에서, 각 Y, R 및 임의의 불소가 선택된 주쇄의 탄소에 공유결합으로 결합된 경우, 완전히 치환되지 않은 임의의 탄소는 적절한 개수의 수소 원자로 완성된다. 숫자 m, n, p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성성분 단위의 몰분율을 나타내고, v 및 w는 각 블록의 분자량을 제공한다.
특정 실시양태에서,
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-, -C-C-, -C(O)(CR12R13)aC(O)O-, -O(CR12R13)aC(O)- 및 -O(CR12R13)bO-로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12 및 R13은 수소, (1C-5C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, (5C-10C)아릴, (4C-10C)헤테로아릴로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬 및 페닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-5C)알킬 및 페닐로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서,
Y0 내지 Y4 및 R1 내지 R5로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
Z는 하나 이상의 생리적으로 허용되는 반대이온이고,
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 1 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 1 내지 약 50 kDa, 또는 약 5 내지 약 50 kDa이다.
특정 실시양태에서,
A0, A1, A2, A3 및 A4는 -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- 및 -O(C)bO-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; 여기서,
a는 1 내지 4이고;
b는 2 내지 4이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 및 R11은 수소, (1C-5C)알킬, (3C-6C)시클로알킬 및 페닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 원자로 임의로 치환될 수 있고;
Y0 및 Y4는 수소, (1C-10C)알킬, (3C-6C)시클로알킬, O-(1C-10C)알킬, -C(O)O(1C-10C)알킬 및 페닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며, 이들 중 임의의 것은 1개 이상의 불소 기로 임의로 치환되고;
Y1 및 Y2는 공유 결합, -(1C-10C)알킬-, -C(O)O(2C-10C)알킬-, -OC(O)(1C-10C)알킬-, -O(2C-10C)알킬- 및 -S(2C-10C)알킬-로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고;
Y3은 공유 결합, (1C-5C)알킬 및 페닐로 이루어진 군에서 선택되고;
여기서, Y0 내지 Y4 및 R1 내지 R5로 완전히 치환되지 않은 A1 내지 A4의 4가 탄소 원자는 적절한 개수의 수소 원자로 완성되고;
Z는 생리적으로 허용되는 반대이온이고,
m은 0 내지 약 0.49이고;
n은 약 0.51 내지 약 1.0이고; 여기서
m + n = 1이고,
p는 약 0.2 내지 약 0.5이고;
q는 약 0.2 내지 약 0.5이고; 여기서
p는 q와 실질적으로 동일하고;
r은 0 내지 약 0.6이고; 여기서
p + q + r = 1이고,
v는 약 5 내지 약 25 kDa이고;
w는 약 5 내지 약 25 kDa이다.
일부 실시양태에서,
A1은 -C-C-이고;
Y1은 -C(O)OCH2CH2-이고;
R6은 수소이고;
R7 및 R8은 각각 -CH3이고;
R2는 -CH3이다.
일부 실시양태에서,
A2는 -C-C-이고;
Y2는 -C(O)OCH2CH2-이고;
R9는 수소이고;
R10 및 R11은 각각 -CH3이고;
R3은 -CH3이다.
일부 실시양태에서,
A3은 -C-C-이고;
R4는 CH3CH2CH2-이고;
Y3은 공유 결합이고;
Z-는 생리적으로 허용되는 음이온이다.
일부 실시양태에서,
A4는 -C-C-이고;
R5는 수소 및 -CH3으로 이루어진 군에서 선택되고;
Y4는 -C(O)O(CH2)3CH3이다.
일부 실시양태에서,
A0은 C-C-이고;
R1은 수소 및 (1C-3C)알킬로 이루어진 군에서 선택되고;
Y0은 -C(O)O(1C-3C)알킬로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시양태에서, m은 0이다.
일부 실시양태에서, r은 0이다.
일부 실시양태에서, m 및 r은 둘 다 0이다.
본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생리적 pH에서 양이온성이거나 양으로 대전되는 구성성분 단위 (예를 들어, 특정 친수성 구성성분 단위 포함)는 하나 이상의 아미노 기, 알킬아미노 기, 구아니딘 기, 이미다졸릴 기, 피리딜 기 등, 또는 그의 양성자화된, 알킬화된 또는 다르게 대전된 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 양이온성인 구성성분 단위는, 비제한적 예로, 디알킬아미노알킬메타크릴레이트 (예를 들어, DMAEMA)의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생리적 pH에서 음이온성이거나 음으로 대전되는 구성성분 단위 (예를 들어, 특정 친수성 구성성분 단위 포함)는, 비제한적 예로, 카르복실레이트, 술폰아미드, 보로네이트, 포스포네이트, 포스페이트 등을 포함하는 하나 이상의 산 기 또는 그의 짝염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 음이온성이거나 음으로 대전되는 구성성분 단위는, 비제한적 예로, 아크릴산, 알킬 아크릴산 (예를 들어, 메틸 아크릴산, 에틸 아크릴산, 프로필 아크릴산 등) 등의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 생리적 pH에서 중성인 친수성 구성성분 단위는 하나 이상의 친수성 기, 예를 들어 히드록시, 폴리옥실화된 알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 티올 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 중성인 친수성 구성성분 단위는, 비제한적 예로, PEG화된 아크릴산, PEG화된 메타크릴산, 히드록시알킬아크릴산, 히드록시알킬알크아크릴산 (예를 들어, HPMA) 등의 단량체 잔기를 포함한다. 본원에 기재된 다양한 실시양태에서, 생리적 pH에서 쯔비터이온성인 친수성 구성성분 단위는 생리적 pH에서 음이온성이거나 음으로 대전된 기 및 생리적 pH에서 양이온성이거나 양으로 대전된 기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 정상 생리적 pH에서 쯔비터이온성인 친수성 구성성분 단위는, 비제한적 예로, 제US 7,300,990호 (이는 이러한 개시내용에 대해 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 것과 같은 생리적 pH에서 포스페이트 기 및 암모늄 기를 포함하는 단량체 잔기 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체는 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄 (예를 들어, 단량체 잔기의 펜던트 기)를 포함하는 하나 이상의 구성성분 단위를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄는 당업계에 공지된 화학, 예를 들어 "클릭" 화학을 통한 추가의 관능기의 중합후 도입을 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 반응성 기를 보유하는 기이다 ("클릭" 반응의 예에 대해, 문헌 [Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17] 참조). 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 접합가능한 또는 관능화가능한 측쇄는 하나 이상의 임의의 적합한 활성화된 기, 예컨대 N-히드로숙신이미드 (NHS) 에스테르, HOBt (1-히드록시벤조트리아졸) 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 피리딜 디술피드 기 등 (이에 제한되지는 않음)을 포함한다.
제공된 특정 실시양태에서, 블록 공중합체는 하기 화학식 IV1의 화학식을 갖는 (정상 생리적 pH 또는 대략 중성의 pH에서) 이블록 공중합체이다.
<화학식 IV1>
Figure pct00004
특정 경우에, 화합물 IV1의 구성성분 단위는 왼쪽 꺾쇠 괄호 및 오른쪽 둥근 호 내에 나타낸 바와 같고, 이는 하기 단량체로부터 유도된다:
Figure pct00005
문자 p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성성분 단위의 몰분율을 나타낸다. 문자 v 및 w는 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량 (수평균)을 나타낸다.
제공된 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물이다.
<화학식 IV2>
Figure pct00006
상기 논의된 바와 같이, 문자 p, q 및 r은 그의 블록 내의 각 구성성분 단위의 몰분율을 나타낸다. 문자 v 및 w는 이블록 공중합체에서 각 블록의 분자량 (수평균)을 나타낸다.
일부 실시양태에서는, 하기 중합체가 본원에 제공된다:
Figure pct00007
.
일부 실시양태에서, B는 부틸 메타크릴레이트 잔기이고; P는 프로필 아크릴산 잔기이고; D 및 DMAEMA는 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 잔기이고; PEGMA는 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 잔기 (예를 들어, 1 내지 20개의 에틸렌 옥시드 단위 (예컨대 화합물 IV2에 예시됨), 또는 4 내지 5개의 에틸렌 옥시드 단위, 또는 7 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위를 가짐)이고; MAA(NHS)는 메틸아크릴산-N-히드록시 숙신이미드 잔기이고; HPMA는 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 잔기이고; PDSM은 피리딜 디술피드 메타크릴레이트 잔기이다. 특정 실시양태에서, 용어 m, n, p, q, r, w 및 v는 본원에 기재된 바와 같다. 특정 실시양태에서, w는 v의 약 0.1배 내지 약 5배, 또는 약 1배 내지 약 5배이다.
화학식 IV1 내지 IV9의 화합물은 중합체의 제1 블록을 구성하는 다양한 구성성분 단위(들)을 포함하는 본원에 기재된 중합체의 예이다. 일부 실시양태에서, 제1 블록의 구성성분 단위(들)은 제1 블록이 중성 (예를 들어, PEGMA), 양이온성 (예를 들어, DMAEMA), 음이온성 (예를 들어, PEGMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨) 또는 아크릴산), 양쪽성 (예를 들어, DMAEMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨) 또는 쯔비터이온성 (예를 들어, 폴리[2-메타크릴로일옥시-2'-트리메틸암모늄에틸 포스페이트])인 구성성분 단위이거나 이를 포함하는 중합체를 제조하기 위해 화학적으로 처리되거나 변경된다. 일부 실시양태에서, 제1 블록 내에 피리딜 디술피드 관능기를 포함하는 중합체, 예를 들어 [PEGMA-PDSM]-[B-P-D]는 중합체-siRNA 접합체를 형성하기 위해 티올화된 siRNA와 반응될 수 있고 임의로 반응된다.
특정 실시양태에서, 화학식 IV3의 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 P7 부류의 중합체이고, 표 1에 기재된 바와 같은 분자량, 다분산도 및 단량체 조성을 갖는다.
P7 중합체의 종에 대한 분자량, 다분산도 및 단량체 조성
중합체 부류 P7
"v" 블록의 Mna 9100
"w" 블록의 Mna 11300
PDI 1.45
"w" 블록의 BMA 잔기의 이론적 ％ 40
"w" 블록의 PAA 잔기의 이론적 ％ 30
"w" 블록의 DMAEMA 잔기의 이론적 ％ 30
"w" 블록의 BMA 잔기의 실험적 ％b 48
"w" 블록의 PAA 잔기의 실험적 ％b 29
"w" 블록의 DMAEMA 잔기의 실험적 ％b 23
a 비스코텍(Viscotek) GPCmax VE2001 및 굴절계 VE3580 (비스코텍(Viscotek), 미국 텍사스주 휴스턴)에 직렬로 연결된 SEC 토소(Tosoh) TSK-GEL R-3000 및 R-4000 컬럼 (토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 미국 펜실베니아주 몽고메리빌)에 의해 측정하였다. 0.1 중량％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하였다. 일련의 폴리(메틸 메타크릴레이트) 표준물을 사용하여 합성된 공중합체의 분자량을 측정하였다.
b 1H NMR 분광법 (CDCL3 중 3 중량％; 브루커(Bruker) DRX 499)에 의해 측정하였다.
일부 특정 실시양태에서, 화학식 IV3의 중합체는 표 2에 따른 P7 부류의 중합체이다.
Figure pct00008
특정 실시양태에서, 화학식 IV3의 화합물은 PRxO729v6으로 불리는 P7 부류의 중합체이다. PRxO729v6은 본원에서 또한 다양한 우선권 출원에서 P7v6과 상호교환가능하게 사용된다.
스페이서 블록
일부 실시양태에서, 본 발명의 블록 공중합체는 하나 이상의 임의적 블록을 포함한다. 이들 블록은 스페이서 블록일 수 있다.
제공된 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 블록 공중합체는 스페이서 블록을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 스페이서 블록은 소수성 블록과 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 사이의 친수성 블록이다.
친수성 세그먼트/블록의 차폐
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 하나 이상의 차폐제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록/세그먼트는 PEG 치환된 단량체 단위를 포함한다 (예를 들어, PEG는 측쇄이고 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 주쇄를 구성하지 않는다). 일부 경우에, 본원에 기재된 중합체 캐리어에서 사용되는 하나 이상의 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)는 대략 1,000 내지 대략 30,000의 분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 사슬 또는 블록을 포함한다. 일부 실시양태에서, PEG는 중합체 말단 기, 또는 본원에 제공된 중합체 캐리어의 중합체에 존재하는 하나 이상의 펜던트 변형가능한 기에 접합된다. 일부 실시양태에서, PEG 잔기는 본원에 제공된 중합체 캐리어의 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)의 친수성 세그먼트 또는 블록 (예를 들어, 쉘 블록) 내의 변형가능한 기에 접합된다. 특정 실시양태에서, 2 내지 20개의 에틸렌 옥시드 단위의 PEG 잔기를 포함하는 단량체는 공중합되어, 본원에 제공된 중합체 캐리어를 형성하는 중합체의 친수성 부분을 형성한다.
일부 경우에, 차폐제는 혈장에서 효소적 소화에 대한 치료제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 등)의 안정성을 향상시킨다. 일부 경우에, 차폐제는 본원에 기재된 중합체 캐리어 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 부착된 블록 공중합체)의 독성을 감소시킨다. 일부 경우에, 차폐제는 중합체 캐리어에 유리한 표면 특성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 차폐제는 다수의 중성 친수성 단량체 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 차폐 중합체는 중합체의 말단 기를 통해 막 불안정화 블록 공중합체에 공유결합으로 커플링된다. 일부 실시양태에서, 차폐제는 중합체의 하나 이상의 단량체 잔기에 부착된 공유결합으로 커플링된 펜던트 부분이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어 내의 다수의 단량체 잔기는 관능기를 통해 폴리에틸렌 글리콜 올리고머 또는 중합체에 공유결합으로 커플링된 펜던트 차폐 종 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 올리고머 (예를 들어, 20개 이하의 반복 단위를 가짐) 또는 중합체 (예를 들어, 20개 초과의 반복 단위를 가짐))을 포함한다. 일부 경우에, 블록 공중합체는 공중합체의 막 불안정화 블록의 알파 말단 또는 오메가 말단에 공유결합으로 커플링된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 올리고머 또는 중합체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록/세그먼트는 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록/세그먼트 상의 전하 (예를 들어, 양이온 전하)를 적어도 부분적으로 차폐하는 작용을 하는 단량체 단위를 포함한다. 특정 실시양태에서는, 차폐가 적어도 부분적으로 발생하고, 이는 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록/세그먼트를 적어도 부분적으로 구성하는 단량체 단위 상의 펜던트 부분을 형성한다. 이러한 차폐는 임의로 이 세그먼트 내의 과잉 전하로부터의 세포 독성을 저하시킨다.
중합체 캐리어의 중합체로의 폴리뉴클레오티드 부착
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)는 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 하나 이상의 다수의 중합체에 (예를 들어, 공유 또는 비-공유결합으로) 부착된다. 이러한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 기술 (예를 들어, 화학적 접합 기술)에 의해 중합체(들)에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체 캐리어의 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 또는 중합체의 세그먼트에 부착된다. 특정 구체적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 중합체의 알파 말단 (즉, 중합이 개시된 말단)에 또는 그 근처에 또는 오메가 말단 (즉, 중합이 종결된 말단)에 또는 그 근처에 부착된다. 일부 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체의 알파 말단에서 접합가능 부분과 폴리뉴클레오티드의 접합에 의해 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 중합체에 부착된다. 특정 구체적 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체의 오메가 말단에서 접합가능한 부분과 폴리뉴클레오티드의 접합에 의해 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 중합체에 부착된다. 다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 연결 부분 (예를 들어, 공유 결합 또는 화학적 부분)을 통해 중합체에 부착된 중합체의 알파 말단에서 접합가능 부분과 폴리뉴클레오티드의 접합에 의해 본원에 기재된 임의의 중합체 캐리어의 중합체에 부착된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 중합체의 단량체 단위에 부착된 펜던트 기에 접합된다. 다양한 실시양태에서, 연결 부분은 임의로 비-절단성 또는 절단성이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어의 중합체에 폴리뉴클레오티드를 부착시키는 절단성 결합은, 비제한적 예로, 디술피드 결합 (예를 들어, 세포질의 환원 환경에서 해리되는 디술피드 결합)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 부분은 절단성이고/이거나 엔도솜 조건에서 절단가능한 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 부분은 절단성이고/이거나 특정 효소 (예를 들어, 포스파타제, 또는 프로테아제)에 의해 절단가능한 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 연결 부분은 절단성이고/이거나 세포내 파라미터 (예를 들어, pH, 산화환원 전위)의 변화에 따라 절단가능한 결합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 (예를 들어, 중합체의 알파 또는 오메가 말단 접합가능 기)와 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 사이의 공유 회합은, 아민-카르복실 링커, 아민-알데히드 링커, 아민 -케톤 링커, 아민-탄수화물 링커, 아민 -히드록실 링커, 아민-아민 링커, 카르복실-술프히드릴 링커, 카르복실-탄수화물 링커, 카르복실-히드록실 링커, 카르복실-카르복실 링커, 술프히드릴-탄수화물 링커, 술프히드릴-히드록실 링커, 술프히드릴-술프히드릴 링커, 탄수화물-히드록실 링커, 탄수화물-탄수화물 링커 및 히드록실-히드록실 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 적합한 화학적 접합 방법을 통해 달성된다. 일부 실시양태에서는, 이관능성 가교 시약을 사용하여 본원에 기재된 중합체 캐리어의 중합체와 폴리뉴클레오티드의 적절한 접합가능 기 사이의 공유결합 접합을 달성한다. 일부 실시양태에서, 부착은 또한 히드라존 및 아세탈 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는 pH-민감성 결합 및 링커로 수행된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 말단 리보스 잔기의 2' 및 3'-히드록실과 보론산의 에스테르의 형성을 통하여 중합체의 알파 또는 오메가 말단에 혼입된 보론산 관능기 (예를 들어, 페닐보론산 잔기)에 공유결합으로 연결된다. 임의의 다른 적합한 접합/부착 방법이 또한 임의로 사용되고, 예를 들어 많은 다양한 접합 화학이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998] 및 이에 포함된 챕터 참조). 또한 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 이온성 (즉, 음이온-양이온성) 상호작용을 통해 중합체에 폴리뉴클레오티드를 복합체화함으로써 중합체 캐리어의 중합체에 또는 그의 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록 (예를 들어, 양이온으로 대전된 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록)에 부착된다.
표적화.
특정 경우에, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 개체의 세포로의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 전달에 유용하고, 이는 선택된 세포 유형에 대해 특이적으로 표적화될 수 있다. 특정 경우에, 중합체 캐리어 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 중합체 캐리어)의 세포 유입의 효율은 중합체 캐리어의 표면 내로 또는 그 위로 표적화 부분을 도입함으로써 향상된다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 표적화제를 포함하는 중합체 캐리어가 본원에 제공된다. "표적화 부분" ("표적화제"와 상호교환가능하게 사용됨)은 세포 (예를 들어, 선택된 세포)의 표면을 인식한다. 특정 실시양태에서, 표적화제는 세포 (예를 들어, 선택된 세포)의 표면에 결합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 부분은 세포 표면 항원을 인식하거나, 또는 표적 세포의 표면 상의 수용체에 결합한다. 적합한 표적화 부분으로는, 비제한적 예로, 항체, 항체형 분자 또는 펩티드, 예컨대 인테그린-결합 펩티드, 예컨대 RGD-함유 펩티드, 또는 소분자, 예컨대 비타민, 예를 들어 폴레이트, 당, 예컨대 락토스 및 갈락토스, 또는 다른 소분자가 포함된다. 세포 표면 항원으로는 세포 표면 분자, 예컨대 세포 표면 상의 단백질, 당, 지질 또는 다른 항원이 포함된다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 항원은 내재화된다. 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)의 표적화 부분에 의해 표적화된 세포 표면 항원의 예로는 트랜스페린 수용체 유형 1 및 2, EGF 수용체, HER2/Neu, VEGF 수용체, 인테그린, NGF, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69, 및 아시알로당단백질 수용체를 들 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
다양한 실시양태에서, 표적화 부분은 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)의 한쪽 말단에 또는 단량체 단위의 측쇄에 부착되거나, 또는 중합체 블록에 혼입된다. 중합체로의 표적화 부분의 부착은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 아민-카르복실 링커, 아민-술프히드릴 링커, 아민-탄수화물 링커, 아민-히드록실 링커, 아민-아민 링커, 카르복실-술프히드릴 링커, 카르복실-탄수화물 링커, 카르복실-히드록실 링커, 카르복실-카르복실 링커, 술프히드릴-탄수화물 링커, 술프히드릴-히드록실 링커, 술프히드릴-술프히드릴 링커, 탄수화물-히드록실 링커, 탄수화물-탄수화물 링커 및 히드록실-히드록실 링커를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 접합 화학 접근법 중 임의의 하나에 의해 달성된다. 특정 실시양태에서는, "클릭" 화학을 이용하여 본원에 제공된 중합체 캐리어를 형성하는 블록 공중합체에 표적화 리간드를 부착시킨다 ("클릭" 반응의 예에 대해, 문헌 [Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta 2007, 40, 7-17] 참조). 많은 다양한 접합 화학이 임의로 이용된다 (예를 들어, 문헌 [Bioconjugation, Aslam and Dent, Eds, Macmillan, 1998] 및 이에 포함된 챕터 참조). 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 단량체에 부착되고, 그 후 생성된 화합물이 본원에 기재된 중합체 캐리어에서 사용되는 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)의 중합 합성에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적화 부분은 제1 블록 공중합체의 블록 또는 제2 블록 공중합체의 블록 (예를 들어, 여기서 제1 블록 공중합체는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 siRNA에 부착됨)에 부착된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 블록 공중합체에 결합된 siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 부착된다. 특정 실시양태에서, 표적화제는 센스 또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 부착된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어를 형성하는 블록 공중합체는 생체적합성이다. 본원에서 사용되는 "생체적합성"은 중합체 또는 그의 생체내 분해 생성물이 살아있는 조직에 유해하지 않거나 적어도 최소로 및/또는 복구가능하게 유해하고/하거나; 살아있는 조직에서 면역학적 반응을 유발하지 않거나 적어도 최소로 및 제어가능하게 유발하는 것을 특징으로 하는, 중합체의 특성을 지칭한다. 염에 관하여, 양이온성 종 및 음이온성 종 둘 다 생체적합성인 것이 본원에서 바람직하다. 본원에서 사용되는 "생리적으로 허용되는"은 생체적합성과 상호교환가능하다. 일부 경우에, 중합체 캐리어 및 그에 사용되는 중합체 (예를 들어, 블록 공중합체)는 양이온성 지질과 비교하여 낮은 독성을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는, 반복된 생체내 투여에 따른 캐리어의 면역원성 감소; 전달 비히클의 다중 요소를 어셈블링하는 데 보다 적은 단계가 필요하여 보다 낮은 물품 비용 제공; 및 예를 들어 생물리학 검정 특성 (예를 들어 HPLC, GPC, DLS 및 TEM 포함)에서 5％ 미만, 10％ 미만, 또는 20％ 미만의 배치-대-배치 변동성으로 생성물의 반복된 배치를 제조하는 능력에 의해 판단되는, 제조의 재현성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 폴리뉴클레오티드 전달을 위한 다른 기술에 비해 우수한 상업적인 실행가능성을 갖는다.
세포 유입.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어는 세포내이입에 의해 세포로 전달된다. 세포내 소포 및 엔도솜은 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용된다. 세포질로의 성공적인 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 전달은 일반적으로 엔도솜 탈출을 위한 메카니즘을 갖는다. 특정 경우에, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어는 세포내이입시 엔도솜 구획에서 보다 낮은 pH에 대해 민감하다. 특정 경우에, 세포내이입은 중합체 캐리어의 음이온으로 대전가능한 종 (예를 들어, 프로필 아크릴산 단위)의 양성자화 또는 전하 중화를 촉발하여, 중합체 캐리어의 형태 전이를 초래한다. 특정 경우에, 이러한 형태 전이는 엔도솜으로부터 세포질로의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)의 방출을 매개하는 더 소수성인 막 불안정화 형태를 제공한다. siRNA를 포함하는 상기 중합체 캐리어에서, 세포질로의 siRNA의 전달은 그의 mRNA 녹다운 효과가 발생될 수 있게 한다. 다른 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어에서, 세포질로의 전달은 그의 요망되는 작용이 발생될 수 있게 한다.
폴리뉴클레오티드.
본원에 기재된 중합체 캐리어는 폴리뉴클레오티드를 필요로 하는 대상체에게 이를 전달하는 데 유용하다. 폴리뉴클레오티드는 다수의 뉴클레오티드, 예를 들어, 200개 초과의 뉴클레오티드를 갖는 핵산 중합체이다. 일 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 발현 벡터이다. 또다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간에서 내인성 유전자 서열을 재조합하고 보정하기 위해 설계된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어에 제공된 폴리뉴클레오티드는 유전자 발현 조정인자이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어에 제공된 폴리뉴클레오티드는 녹다운 작용제 (예를 들어, 녹다운 올리고뉴클레오티드, 예컨대 siRNA)이다. 본원에서 이용되는 폴리뉴클레오티드는 또한 임의로 메신저 RNA (mRNA) 및 RNA 또는 DNA 디코이(decoy) (예를 들어, 이는 그의 세포내 표적에 대한 내인성 핵산 서열의 결합에 대해 경쟁함) 또는 핵산 압타머 (예를 들어, 이는 세포내 고분자에 결합됨)를 포함한다.
포유동물 발현 벡터는 프로모터가 cDNA의 발현을 유도하도록 프로모터 영역에 기능적으로 연결된 상보적 DNA 서열 ("cDNA" 또는 미니유전자)을 포함한다. 특정 경우에, 포유동물 발현 벡터는 또한 cDNA의 3' 말단에서 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 프로모터 영역은 RNA 합성 (즉, 전사)을 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 분자에 의해 인식되는 뉴클레오티드 세그먼트이고, 또한 다른 전사 조절 요소, 예컨대 인핸서를 포함할 수 있다. 포유동물 발현 벡터 내의 연결된 유전자의 발현을 매개하기 위해 임의의 개수의 전사 조절 서열이 사용될 수 있다. 프로모터에는 레트로바이러스 프로모터, 다른 바이러스 프로모터, 예컨대 HSV 또는 CMV로부터 유래된 프로모터, 및 내인성 세포 유전자로부터의 프로모터가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 발현 벡터는 또한 전형적으로 박테리아에서 플라스미드로서 전파를 가능하게 하기 위해 이. 콜라이(E. Coli)로부터의 복제 원점을 갖는다.
배양물에 또는 생체내에서 포유동물 세포에 포유동물 발현 벡터를 도입할 수 있는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 본 발명의 중합체 캐리어를 사용하여 포유동물 세포로 형질감염된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 중합체 캐리어는, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 세포 또는 개체로 전달하는 데 사용된다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어의 다가양이온성 블록은 포유동물 발현 벡터 DNA에 결합하고, DNA와 중합체 캐리어의 복합체를 형성한다. 특정 경우에, 다가양이온은 포유동물 발현 벡터 DNA에 결합하고 이와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 복합체를 포함하는 중합체 캐리어는 전하 중화된다 (예를 들어, 중합체 캐리어의 쉘 또는 중합체 캐리어의 중합체의 쉘 블록 및 폴리뉴클레오티드가 실질적으로 전하 중화된다). 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라, 다가양이온성 블록의 길이는 폴리뉴클레오티드에 전하 중화를 제공하기 위해 임의로 조절된다. 일부 경우에, 전하-중화는 제제로의 양이온 및/또는 다가양이온의 첨가에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 중합체 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 200+mer)를 포함하는 중합체 캐리어는 그 후 필요에 따라 적절한 완충액에서 희석되고, 배양물 중 세포에 직접적으로 첨가된다. 생성된 세포에서 형질감염된 유전자 또는 cDNA의 발현은 표시자 유전자, 예컨대 루시페라제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 또는 GFP를 조정하는 발현 카세트를 포유동물 발현 벡터에 포함시킴으로써 용이하게 측정될 수 있다. 이들 유전자는 용이하게 이용가능하고, 리포터 검정은 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 유전자 치료요법에 사용된다. 유전자 치료요법에 의한 질병 및 질환의 치료는 일반적으로 새로운 유전 정보의 세포로의 이동을 수반한다. "유전자 치료요법 벡터"는 전달되는 새로운 유전 물질을 포함하며, 이는 임의로 포유동물 발현 벡터에 존재한다. 중합체 캐리어의 사용은 유전자 대체, 유전자 발현의 억제, 유전자 수정 또는 유전자 증대를 위한 DNA 서열의 전달, 또는 면역 반응의 조정과 같은 일부 다른 요망되는 효과를 갖는 유전자의 도입을 포함한다. 유전자 발현의 억제는 임의의 적합한 방식으로, 예컨대, 비제한적 예로, shRNA 또는 다른 RNAi 작용제를 발현하는 세포 내 유전자 카세트의 발현에 의해 달성된다.
일부 실시양태에서, 비-코어 다가양이온성 블록을 갖는 중합체 캐리어는 유전자 치료요법 벡터와 혼합되어, 중합체 캐리어에 결합하게 된다. 그 후, 적합한 부형제 (하기 참조) 중 중합체 캐리어-유전자 치료요법 벡터 복합체는 정맥내, 관절내, 경막내, 두개내, 흡입, 피하 또는 안내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 경로에 의해 살아있는 대상체에게 투여된다.
용도 ( GeneRx )
폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어는 수많은 질환을 치료하는 데 유용하다. 본원에 제공된 중합체 캐리어-유전자 치료요법 벡터로의 치료에 적합한 이러한 질환의 비제한적 목록은, 혈우병 A 및 B; 낭성 섬유종; 고콜레스테롤혈증; 혈색소병증, 예컨대 지중해 빈혈 및 겸상적혈구성 빈혈; 암; 염증성 질환 및 리소좀 저장 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
표적 유전자 족 및 질환.
본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, siRNA를 포함하는 것들)를 사용하여 임의로 치료되는 질병으로는, 병원성 질환, 암, 염증성 질병, 효소 결핍, 선천성 대사 이상, 감염, 자가면역 질병, 심혈관 질병, 신경계 신경변성 질병, 신경근 질병, 혈액 질환 및 응고 질환이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, siRNA의 비제한적 예는, PTP1B, 이중 특이성 포스파타제 (DSP), c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 PIGF를 감소시키거나, 그의 발현을 하향 조절하거나, 또는 이들로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 콜레스테롤, 아포지단백질 b 및/또는 LDL 콜레스테롤의 높은 혈장 수준과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 질환, 예를 들어 고콜레스테롤혈증에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체의 치료에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 치료는 폴리뉴클레오티드 작용제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 작용제)를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 작용제는 이러한 상태를 촉진하는 유전자 또는 유전자 생성물을 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킨다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 작용제는 저밀도 지단백질 (LDLR) 수준 및 기능의 조절에 관여하는 프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9) 유전자를 침묵시키며, 그러므로 이러한 폴리뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어는 원치않는 PCSK9 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 콜레스테롤, 아포지단백질 b 및/또는 LDL 콜레스테롤의 높은 혈장 수준과 관련된 및/또는 이에 의해 유발된 질환, 예를 들어 고콜레스테롤혈증을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 PCSK9를 발현하는 세포로 PCSK9-침묵 폴리뉴클레오티드 작용제 (예를 들어, siRNA)를 전달한다. 일부 실시양태에서, 세포는 간 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 미셀)는 원치않는 세포 증식 (예를 들어, 악성 또는 비악성 세포 증식)에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체의 치료에서 유용하다. 치료는 폴리뉴클레오티드 작용제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 작용제) (여기서, 폴리뉴클레오티드는 원치않는 세포 증식을 촉진하는 유전자를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있거나 이와 상동성이다)를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고; 치료 유효량의 중합체 캐리어를 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 유전자는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 유전자, 포스파타제, 키나제, 예를 들어 단백질 티로신, 세린 또는 트레오닌 키나제 유전자, 어댑터 단백질 유전자, G 단백질 상과 분자를 코딩하는 유전자 또는 전사 인자를 코딩하는 유전자이나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 중합체 캐리어는 폐, 췌장, 간, 신장, 난소, 근육, 피부, 유방, 결장, 위 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 조직 또는 기관에서 발현되는 유전자를 침묵시키는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 하기 유전자 중 하나 이상을 침묵시킨다: PDGF 베타 유전자 (그러므로, 원치않는 PDGF 베타 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 고환암 및 폐암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); Erb-B 유전자 (예를 들어, Erb-B-2 또는 Erb-B-3) (그러므로, 원치않는 Erb-B 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암 또는 폐암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); Src 유전자 (그러므로, 원치않는 Src 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 결장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); CRK 유전자 (그러므로, 원치않는 CRK 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 결장암 및 폐암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); GRB2 유전자 (그러므로, 원치않는 GRB2 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 편평 세포 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); RAS 유전자 (그러므로, 원치않는 RAS 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 췌장암, 결장암 및 폐암, 및 만성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); MEKK 유전자 (그러므로, 원치않는 MEKK 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 편평 세포 암종, 흑색종 또는 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); JNK 유전자 (그러므로, 원치않는 JNK 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 췌장암 또는 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); RAF 유전자 (그러므로, 원치않는 RAF 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암 또는 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); Erk1/2 유전자 (그러므로, 원치않는 Erk1/2 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); PCNA(p21) 유전자 (그러므로, 원치않는 PCNA 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); MYB 유전자 (그러므로, 원치않는 MYB 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 결장암 또는 만성 골수성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); c-MYC 유전자 (그러므로, 원치않는 c-MYC 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 버킷 림프종 또는 신경모세포종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); JUN 유전자 (그러므로, 원치않는 JUN 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 난소암, 전립선암 또는 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); FOS 유전자 (그러므로, 원치않는 FOS 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 피부암 또는 전립선암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); BCL-2 유전자 (그러므로, 원치않는 BCL-2 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암 또는 전립선암 또는 비-호지킨 림프종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 사이클린 D 유전자 (그러므로, 원치않는 사이클린 D 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 식도암 및 결장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); VEGF 유전자 (그러므로, 원치않는 VEGF 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 식도암 및 결장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); EGFR 유전자 (그러므로, 원치않는 EGFR 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 사이클린 A 유전자 (그러므로, 원치않는 사이클린 A 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암 및 자궁경부암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 사이클린 E 유전자 (그러므로, 원치않는 사이클린 E 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 폐암 및 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); WNT-1 유전자 (그러므로, 원치않는 WNT-1 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 기저 세포 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 베타-카테닌 유전자 (그러므로, 원치않는 베타-카테닌 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 선암종 또는 간세포 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); c-MET 유전자 (그러므로, 원치않는 c-MET 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 간세포 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); PKC 유전자 (그러므로, 원치않는 PKC 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); NFKB 유전자 (그러므로, 원치않는 NFKB 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); STAT3 유전자 (그러므로, 원치않는 STAT3 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 전립선암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 서비빈 유전자 (그러므로, 원치않는 서비빈 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 자궁경부암 또는 췌장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); Her2/Neu 유전자 (그러므로, 원치않는 Her2/Neu 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 토포이소머라제 I 유전자 (그러므로, 원치않는 토포이소머라제 I 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 난소암 및 결장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 토포이소머라제 II 알파 유전자 (그러므로, 원치않는 토포이소머라제 II 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암 및 결장암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음).
다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 하기 유전자 중 하나에서 돌연변이를 침묵시킨다: p73 유전자 (그러므로, 원치않는 p73 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 결장직장 선암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); p21(WAF1/CIP1) 유전자 (그러므로, 원치않는 p21(WAF1/CIP1) 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 간암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); p27(KIP1) 유전자 (그러므로, 원치않는 p27(KIP1) 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 간암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); PPM1D 유전자 (그러므로, 원치않는 PPM1D 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); RAS 유전자 (그러므로, 원치않는 RAS 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유방암을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 카베올린 I 유전자 (그러므로, 원치않는 카베올린 I 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 식도 편평 세포 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); MIB I 유전자 (그러므로, 원치않는 MIB I 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 남성 유방 암종 (MBC)을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); MTAI 유전자 (그러므로, 원치않는 MTAI 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 난소 암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); M68 유전자 (그러므로, 원치않는 M68 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 식도, 위, 결장 및 직장의 인간 선암종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음).
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 종양 억제 유전자에서 돌연변이를 침묵시키므로, 화학요법제와 조합하여 세포자멸(apoptotic) 활성을 촉진시키는 방법으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 억제 유전자는 하기 종양 억제 유전자 중 하나 이상에서 선택된다: p53 종양 억제 유전자, p53 족 구성원 DN-p63, pRb 종양 억제 유전자, APC1 종양 억제 유전자, BRCA1 종양 억제 유전자, PTEN 종양 억제 유전자.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 하기 융합 유전자 중 하나를 침묵시킨다: mLL 융합 유전자, 예를 들어 mLL-AF9 (그러므로, 원치않는 mLL 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 급성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); BCR/ABL 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 BCR/ABL 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 급성 및 만성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); TEL/AML1 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 TEL/AML1 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 아동 급성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); EWS/FLI1 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 EWS/FLI1 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 유잉 육종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); TLS/FUS1 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 TLS/FUS1 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 점액성 지방육종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); PAX3/FKHR 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 PAX3/FKHR 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 점액성 지방육종을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); AML1/ETO 융합 유전자 (그러므로, 원치않는 AML1/ETO 융합 유전자 발현을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 급성 백혈병을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음).
본원의 일부 측면에서, 중합체 캐리어는 혈관형성 억제에 의해 이익을 얻을 수 있는 질병 또는 질환, 예를 들어 암 또는 망막 변성에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체, 예를 들어 인간의 치료를 위한 치료제를 제공한다. 치료는 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고 (여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 작용제는 혈관형성을 매개하는 유전자 (예를 들어, VEGF-R1, VEGF-R2, 또는 이들 수용체의 경로에 대한 신호전달 단백질을 코딩하는 유전자)와 상동성이 있고/있거나 이를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있음); 치료 유효량의 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 상기 중합체 캐리어를 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 하기 유전자 중 하나를 침묵시킨다: 알파 v-인테그린 유전자 (그러므로, 원치않는 알파 V 인테그린을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 뇌 종양 또는 상피 기원의 종양을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); Flt-1 수용체 유전자 (그러므로, 원치않는 Flt-1 수용체를 특징으로 하는 질환, 예를 들어 암 및 류마티스성 관절염을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음); 튜불린 유전자 (그러므로, 원치않는 튜불린을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 암 및 망막 혈관신생을 갖거나 이에 대한 위험이 있는 대상체의 치료를 위해 사용될 수 있음).
일부 측면에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어는 바이러스에 감염된 대상체 또는 바이러스 감염과 관련된 질환 또는 질병에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체의 치료 방법과 관련된다. 방법은 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고 (여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 작용제는 바이러스 기능, 예를 들어 진입 또는 성장을 매개하는 세포 유전자 또는 바이러스 유전자와 상동성이 있고/있거나 이를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있음); 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드 작용제를 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어는 인간 유두종 바이러스 (HPV)에 감염된 대상체 또는 HPV에 의해 매개되는 질환, 예를 들어 자궁경부암에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체의 치료에서 유용하다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 HPV 유전자의 발현을 침묵시키는 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, HPV 유전자는 E2, E6 또는 E7의 군에서 선택된다.
다른 실시양태에서, HPV 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 감염된 환자 또는 HIV에 의해 매개되는 질환, 예를 들어 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, HIV 유전자의 발현이 감소된다. 다른 실시양태에서, HIV 유전자는 CCR5, Gag 또는 Rev이다. 일부 실시양태에서, HIV 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자는 CD4 또는 Tsg101이다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 B형 간염 바이러스 (HBV)에 감염된 환자 또는 HBV에 의해 매개되는 질환, 예를 들어 간경변증 및 간세포 암종에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일 실시양태에서, HBV 유전자의 발현이 감소된다. 다른 실시양태에서, 표적화된 HBV 유전자는 HBV 코어 단백질의 꼬리 영역, 프리-크레지어스(pre-cregious) (pre-c) 영역 또는 크레지어스(cregious) (c) 영역의 군 중 하나를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 표적화된 HBV-RNA 서열은 폴리(A) 꼬리를 포함한다. 일부 실시양태에서, HBV 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 하기 바이러스에서 선택된 바이러스에 감염된 환자 또는 상기 바이러스에 의해 매개되는 질환에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다: A형 간염 바이러스 (HAV); C형 간염 바이러스 (HCV); D형, E형, F형, G형 또는 H형 간염을 포함하는 간염 바이러스 균주의 군의 임의의 바이러스; 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV); 헤르페스 거대세포바이러스 (CMV); 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 (EBV); 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 (KSHV); JC 바이러스 (JCV); 믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자를 유발하는 바이러스), 리노바이러스 (예를 들어, 감기를 유발하는 바이러스) 또는 코로나바이러스 (예를 들어, 감기를 유발하는 바이러스); 세인트 루이스 뇌염 플라비바이러스; 진드기-매개 뇌염 플라비바이러스; 머레이 계곡 뇌염 플라비바이러스; 뎅기 플라비바이러스; 원숭이 바이러스 40 (SV40); 뇌심근염 바이러스 (EMCV); 홍역 바이러스 (MV); 수두 대상포진 바이러스 (VZV); 아데노바이러스 (예를 들어, 기도 감염을 유발하는 바이러스); 폴리오바이러스; 또는 폭스바이러스 (예를 들어, 천연두를 유발하는 폭스바이러스). 일부 실시양태에서, 이들 바이러스의 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 단순 헤르페스 바이러스 (HSV)에 감염된 환자 또는 HSV에 의해 매개되는 질환, 예를 들어 음부 포진 및 입술 포진 뿐만 아니라 생명-위협 또는 시력-손상 질병 (예를 들어, 주로 면역기능저하된 환자에서)에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, HSV 유전자의 발현이 감소된다. 다른 실시양태에서, 표적화된 HSV 유전자는 DNA 폴리머라제 또는 헬리카제-프리마제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, HSV 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 웨스트 나일 바이러스에 감염된 환자 또는 웨스트 나일 바이러스에 의해 매개되는 질환에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 웨스트 나일 바이러스 유전자의 발현이 감소된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 웨스트 나일 바이러스 유전자는 E, NS3 또는 NS5를 포함하는 군에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 웨스트 나일 바이러스 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 인간 T 세포 림프친화성 바이러스 (HTLV)에 감염된 환자 또는 이 바이러스와 관련된 질병 또는 질환, 예를 들어 백혈병 또는 골수병증의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, HTLV 유전자의 발현이 감소된다. 일부 실시양태에서, HTLV1 유전자는 Tax 전사 활성인자이다. 일부 실시양태에서, HTLV 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 측면에서, 중합체 캐리어는 병원체, 예를 들어 박테리아, 아메바, 기생충 또는 진균 병원체에 감염된 대상체의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 치료 방법은 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고 (여기서, 상기 올리고뉴클레오티드는 병원체 유전자 또는 병원체의 성장에 관여하는 유전자와 상동성이 있고/있거나 이를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있음); 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드 작용제를 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 표적 유전자는 병원체의 성장, 세포벽 합성, 단백질 합성, 전사, 에너지 대사, 예를 들어 크레브스 회로 또는 독소 생성에 관여하는 유전자에서 선택될 수 있다.
그러므로, 일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 말라리아를 유발하는 열원충에 감염된 환자의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 열원충 유전자의 발현이 감소된다. 다른 실시양태에서, 유전자는 정단 막 항원 1 (AMA1)이다. 일부 실시양태에서, 열원충 복제에 필요한 인간 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 중합체 캐리어는 마이코박테륨 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)에 감염된 환자, 또는 이들 병원체 중 임의의 것과 관련된 질병 또는 질환의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 박테리아의 복제에 필요한 인간 유전자 및/또는 박테리아 유전자의 발현이 감소된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어에 의해 치료되는 질병은 특정 조직, 예를 들어 폐, 피부, 간, 유방, 신장, 췌장, CNS 등에 존재하거나 전신적일 수 있다. 특정 측면에서, 올리고뉴클레오티드는 대사성 질병 또는 질환, 예를 들어 당뇨, 비만 등을 매개하거나 이에 관여되는 유전자를 침묵시킨다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 폐 질병 또는 질환, 예를 들어 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭성 섬유증 또는 폐암을 매개하거나 이에 관여되는 유전자를 침묵시킨다.
본원의 일부 측면에서, 중합체 캐리어는 원치않는 면역 반응을 특징으로 하는 질병 또는 질환, 예를 들어 염증성 질병 또는 질환 또는 자가면역 질병 또는 질환에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체, 예를 들어 인간의 치료 방법에서 유용하고/하거나 이에 관련된 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 방법은 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고 (여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 작용제는 원치않는 면역 반응을 매개하는 유전자와 상동성이 있고/있거나 이를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있음); 상기 올리고뉴클레오티드 작용제를 대상체, 예를 들어 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 질환은 허혈 또는 재관류 손상, 예를 들어 급성 심근 경색, 불안정한 협심증, 심폐 우회술, 수술적 시술, 예를 들어 혈관성형술, 예를 들어 경피 경혈관 관상동맥 혈관성형술, 이식된 기관 또는 조직, 예를 들어 이식된 심장 또는 혈관 조직에 대한 반응; 또는 혈전용해와 관련된 허혈 또는 재관류 손상이다. 다른 실시양태에서, 질병 또는 질환은 재발협착증, 예를 들어 수술적 시술, 예를 들어 혈관성형술, 예를 들어 경피 경혈관 관상동맥 혈관성형술과 관련된 재발협착증이다. 다른 실시양태에서, 질병 또는 질환은 염증성 장질환, 예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염이다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 질환은 감염 또는 손상과 관련된 염증이다. 다른 실시양태에서, 질병 또는 질환은 천식, 알레르기, 루푸스, 다발성 경화증, 당뇨, 예를 들어 II형 당뇨, 관절염 (예를 들어, 류마티스성 또는 건선성)이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 인테그린 또는 그의 공동-리간드, 예를 들어 VLA4, VCAM, ICAM을 침묵시킨다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 셀렉틴 또는 그의 공동-리간드, 예를 들어 P-셀렉틴, E-셀렉틴 (ELAM), I-셀렉틴, P-셀렉틴 당단백질-1 (PSGL-1)을 침묵시킨다. 특정 실시양태에서 올리고뉴클레오티드 작용제는 보체 시스템의 구성성분, 예를 들어 C3, C5, C3aR, C5aR, C3 컨버타제 및 C5 컨버타제를 침묵시킨다. 일부 실시양태에서 올리고뉴클레오티드 작용제는 케모카인 또는 그의 수용체, 예를 들어 TNFI, TNFJ, IL-1I, IL-1J, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYA11 및 CCR3을 침묵시킨다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 GCSF, Gro1, Gro2, Gro3, PF4, MIG, 프로-혈소판 염기성 단백질 (PPBP), MIP-1I, MIP-1J, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, CMBKR1, CMBKR2, CMBKR3, CMBKR5, AIF-1 또는 I-309를 침묵시킨다.
일부 측면에서, 중합체 캐리어는 신경계 질병 또는 질환에 대한 위험이 있거나 이에 걸린 대상체, 예를 들어 인간의 치료에서 유용한 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 방법은 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하는 중합체 캐리어를 제공하고 (여기서, 상기 올리고뉴클레오티드는 신경계 질병 또는 질환을 매개하는 유전자와 상동성이 있고/있거나 이를 (예를 들어, 절단에 의해) 침묵시킬 수 있음); 치료 유효량의 상기 올리고뉴클레오티드 작용제를 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질병 또는 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병이다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 아밀로이드-족 유전자, 예를 들어 APP; 프레세닐린 유전자, 예를 들어 PSEN1 및 PSEN2, 또는 I-시누클레인을 침묵시킨다. 다른 실시양태에서, 질병 또는 질환은 신경변성 트리뉴클레오티드 반복부 질환, 예를 들어 헌팅톤병, 치상적핵 담창구시상하부 위축증 또는 척수소뇌성 실조증, 예를 들어 SCA1, SCA2, SCA3 (마카도-조셉병), SCA7 또는 SCA8이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 HD, DRPLA, SCA1, SCA2, MJD1, CACNL1A4, SCA7 또는 SCA8을 침묵시킨다.
특정 측면에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 1개 초과의 유전자를 절단시키거나 침묵시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함한다. 이들 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 작용제는 1개 초과의 유전자에서 발견된 서열, 예를 들어 이들 유전자 간에 보존된 서열과 충분한 상동성을 갖는 것으로 선택된다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 이러한 서열로 표적화된 올리고뉴클레오티드 작용제는 유전자의 전체 콜렉션을 효과적으로 침묵시킨다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 2종 이상의 올리고뉴클레오티드 작용제를 포함하며, 여기서 올리고뉴클레오티드 작용제는 동일한 질병 또는 상이한 질병의 상이한 유전자를 침묵시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 포함함)는 표적화된 질환 상태에 대한 또다른 치료제와 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 포함함)는 염증성 질환, 예컨대 RA 또는 건선에 대하여 효과적인 치료제와 함께 투여된다. 이와 관련하여 조합적으로 유용하고 효과적인 작용제의 예로는, 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID), 메토트렉세이트, 금 화합물, D-페니실라민, 항말라리아, 술파살라진, 글루코코르티코이드 및 다른 TNF-α 중화제, 예컨대 인플릭시맙 및 엔트라셉트가 포함된다. 특정 경우에, 비-올리고뉴클레오티드는 미셀의 코어 내에서 캡슐화된다.
조합 치료 또는 예방 방법이 고려되는 경우, 본원에 기재된 작용제는 조합물의 특정 성질에 의해 제한되도록 의도되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 작용제는 임의로 화학적 하이브리드 뿐만 아니라 단순한 혼합물로서 조합되어 투여된다. 또한, 조합 치료는 임의로 개별적으로 또는 동시에 투여된다.
본원에서 사용되는 용어 "제약 조합물", "추가의 치료요법의 투여", "추가의 치료제 투여" 등은, 하나 초과의 활성 성분의 혼합 또는 조합으로부터 유래하는 제약 치료요법을 지칭하고, 이는 활성 성분의 고정 및 비-고정 조합 둘 다를 포함한다. 용어 "고정 조합"은 본원에 기재된 1종 이상의 작용제 및 1종 이상의 공동작용제가 둘 다 단일 제제 또는 투여 형태로 환자에게 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합"은 본원에 기재된 1종 이상의 작용제 및 1종 이상의 공동작용제가 별도의 제제로서 동시에, 공동으로 또는 가변적인 시간 간격 제한으로 순차적으로 환자에게 투여되는 것을 의미하며, 여기서 상기 투여는 환자의 신체에 2종 이상의 작용제의 효과적 수준을 제공한다. 일부 경우에, 공동작용제를 한번에 또는 일정 시간 동안 투여하고, 그 후 작용제를 한번에 또는 일정 시간에 걸쳐 투여한다. 다른 경우에, 공동작용제를 일정 시간 동안 투여하고, 그 후 공동작용제 및 작용제 둘 다의 투여를 포함하는 치료요법을 투여한다. 또다른 실시양태에서는, 작용제를 한번에 또는 일정 시간에 걸쳐 투여하고, 그 후 공동작용제를 한번에 또는 일정 시간에 걸쳐 투여한다. 이들은 칵테일(cocktail) 치료요법, 예를 들어, 3종 이상의 활성 성분의 투여에도 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "공동-투여" 또는 "조합 투여" 및 이들의 문법상 동의어는 선택된 치료제를 단일 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것을 의미하며, 이들은 상기 작용제가 동일한 또는 상이한 투여 경로로 또는 동일한 또는 상이한 시점에 투여되는 치료 요법을 포함하도록 의도된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제는 기타 작용제와 공동-투여될 것이다. 이들 용어는 2종 이상의 작용제를 동물에게 투여하여 모든 작용제 및/또는 이들의 대사물이 동시에 동물 내에 존재하도록 하는 것을 포함한다. 이들은 별도의 조성물의 동시 투여, 별도의 조성물의 상이한 시점에서의 투여 및/또는 두 작용제 모두가 존재하는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제 및 기타 작용제(들)은 단일 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 작용제 및 기타 작용제(들)은 조성물에서 혼합된다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량", "치료 유효량"은 요망되는 결과를 달성하는, 예를 들어 치료되는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기 위해 투여되는 충분한 양의 1종 이상의 작용제를 지칭한다. 특정 경우에, 그 결과는 질병의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화이거나, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 요망되는 변경이다. 특정 경우에, 그 결과는 특정 결과, 예를 들어 치료되는 질병 또는 질환 또는 그와 관련된 증상의 감소를 제공하는 표적화 유전자의 충분한 녹다운이다. 특정 경우에, 치료 용도를 위한 "유효량"은 본원에 기재된 바와 같은 작용제를 포함하는 조성물이 질병에 있어서 임상적으로 유의한 감소를 제공하는 데 필요한 양이다. 임의의 개별적 경우에 적절한 "유효"량은 임의의 적합한 기술, 예컨대 투여량-상승 연구를 이용하여 결정한다.
본원에서 사용되는 용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은, 생물학적 작용의 요망되는 부위로의 작용제 또는 조성물의 전달을 가능하게 하는 데 사용될 수 있는 방법을 지칭한다. 이들 방법은 경구 경로, 십이지장내 경로, 비경구 주사 (정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 혈관내 또는 주입 포함), 경피, 국소 및 직장 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current ed.; Pergamon]; 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences (current edition), Mack Publishing Co., Easton, Pa.]에서 논의된 바와 같이, 당업자는 본원에 기재된 작용제 및 방법과 함께 이용할 수 있는 투여 기술에 대해 익숙하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 비경구 주사 (예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 혈관내 또는 주입)에 의해 투여된다.
제제화.
중합체 캐리어 - 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 조성물은 제약 조성물을 형성하도록 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 안정화제, 완충액 등과 함께 또는 이들 없이 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 중합체 캐리어는 경구 투여를 위한 정제, 캡슐제 또는 엘릭시르(elixir)로서, 직장 투여를 위한 좌제로서, 주사 투여를 위한 멸균 용액, 현탁액; 및 임의의 기타 적합한 조성물로서 제제화되거나 사용된다.
본원에 기재된 조성물의 제약상 허용되는 제제가 제공된다. 이들 제제에는 상기 화합물의 염, 예를 들어 산 부가염, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 아세트산, 및 벤젠 술폰산의 염이 포함된다. 약리학적 조성물 또는 제제는 세포 또는 환자 (예를 들어, 인간 포함)에게 투여, 예를 들어 전신 투여하기에 적합한 형태의 조성물 또는 제제를 지칭한다. 적합한 형태는 부분적으로, 용도 또는 유입 경로, 예를 들어 경구, 경피 또는 주사에 따라 달라진다. 따라서, 중합체 캐리어가 폴리뉴클레오티드를 포함하고 이를 전달하는 특정 실시양태에서, 제제는 중합체 캐리어 및 보다 구체적으로 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)가 폴리뉴클레오티드가 무손상된 및/또는 기능성인 표적 세포에 도달하는 것을 막지 않는 형태로 존재한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 혈류 내로 주사된 약리학적 조성물은 가용성이고/이거나 분산성이다. 더욱이, 본원에 기재된 제약 조성물은, 바람직하게는 비-독성이다. 본원에 기재된 중합체 캐리어가 치료학적 이점을 위해 투여되는 일부 실시양태에서는, 치료 유효량의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어가 투여된다. 예시적인 실시양태에서, 치료 유효량은 중합체 캐리어가 개체의 kg 당 약 10 mg 이하의 siRNA를 제공하기에 충분한 양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어를 포함하는 제약 조성물은 전신 투여된다. 본원에서 사용되는 "전신 투여"는 혈류 내 약물의 생체내 전신 흡수 또는 축적 후, 전신 전반에 걸쳐 분포되는 것을 의미한다. 전신 흡수를 제공하는 투여 경로는 정맥내, 피하, 복강내, 흡입, 경구, 폐내 및 근육내를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 - 중합체 캐리어 조성물은 국소 투여된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 저장 또는 투여를 위해 제조되고, 이는 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중 제약상 유효량의 올리고뉴클레오티드-중합체 캐리어 조성물을 포함한다. 임의의 허용되는 담체 또는 희석제가 임의로 본원에서 사용된다. 특정 담체 및 희석제는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro Ed., 1985]에 기재되어 있다. 예를 들어, 보존제, 안정화제, 염료 및 향미제가 임의로 첨가된다. 이들에는 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 또한, 항산화제 및 현탁화제가 임의로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 담체"는 무독성의 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제제화 보조제를 의미한다. 제약상 허용되는 담체로서 임의로 사용되는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스, 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유; 홍화유; 참기름; 올리브유; 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 세제, 예컨대 트윈(Tween) 80; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원-비함유 물; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 및 포스페이트 완충액 용액이며, 뿐만 아니라 다른 무독성 상용성 윤활제, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트 및 스테아르산마그네슘, 뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조제자의 판단에 따라 조성물 내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제약 조성물은 인간 및/또는 동물에게, 경구로, 직장으로, 비경구로, 수조내로, 질내로, 비내로, 복강내로, 국소로 (산제, 크림, 연고 또는 점적제로서), 피하로, 협측으로, 또는 구강 또는 코 분무제로서 투여된다.
다양한 실시양태에서, 경구 투여를 위한 액체 투여형에는 제약상 허용되는 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르가 포함된다. 활성 성분 (즉, 본 발명의 미셀-올리고뉴클레오티드 복합체) 이외에, 액체 투여형은 임의로 불활성 희석제 또는 부형제, 예컨대 비제한적 예로서, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 추가로 함유한다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 임의로 아쥬반트, 예컨대 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제 및 방향제를 또한 포함한다.
일부 실시양태에서, 주사가능한 제제, 예를 들어 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액은 임의의 적합한 방식에 따라, 예를 들어 분산제, 습윤제 및/또는 현탁화제를 사용하여 제제화된다. 멸균 주사가능한 제제는 임의로 무독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중 멸균 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼이다 (예를 들어, 1,3-부탄디올 중 용액으로서). 임의로 사용되는 허용되는 비히클 및 용매는 특히 물, 링거 용액 (U.S.P.) 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 용매 또는 현탁화 매질로서 멸균 지방유가 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 완하성 지방유가 임의로 사용된다. 추가 실시양태에서, 지방산, 예컨대 올레산이 주사가능한 제제에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 중합체 캐리어 입자는 1％ (w/v) 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 및 0.1％ (v/v) 트윈 80을 포함하는 담체 유체에 현탁된다.
일부 실시양태에서, 주사가능한 제형은 예를 들어, 박테리아-거름 필터를 통해 여과함으로써, 또는 임의로 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매질에 용해되거나 분산되는 멸균 고체 조성물의 형태의 멸균화제를 도입함으로써 멸균된다.
특정 실시양태에서, 직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 좌제이다. 좌제는 주변 온도에서 고체이나 체온에서 액체이므로 직장 또는 질강에서 용융하여 중합체 캐리어 마이크로입자를 방출시키는 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌제 왁스와 중합체 캐리어-올리고뉴클레오티드 복합체를 혼합함으로써 임의로 제조된다.
경구 투여를 위한 적합한 고체 투여형에는 비제한적 예로서, 캡슐, 정제, 환제, 산제 및 과립제가 포함된다. 이러한 고체 투여형에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 중합체 캐리어는 하나 이상의 불활성 제약상 허용되는 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, b) 결합제, 예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스 및 아카시아, c) 보습제, 예컨대 글리세롤, d) 붕해제, 예컨대, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨, e) 용해 지연제, 예컨대 파라핀, f) 흡수 가속화제, 예컨대 사급 암모늄 화합물, g) 습윤제, 예컨대, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡착제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 i) 윤활제, 예컨대 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우에, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물이 또한 임의로 부형제, 예컨대 락토스 또는 젖당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용한 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용된다.
일부 실시양태에서, 정제, 당제, 캡슐, 환제 및 과립제의 고체 투여형은 코팅 및 쉘, 예컨대 장용성 코팅 및 다른 적합한 코팅으로 제조된다. 이는 임의로 불투명화제를 함유한다. 특정 실시양태에서, 이는 활성 성분(들)을 장관의 특정 부분에서만 또는 우선적으로, 임의로, 지연 방식으로 방출하는 조성물이다. 적합한 봉입 조성물의 예로는, 비제한적 예로서, 중합체성 물질 및 왁스를 들 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물이 임의로 부형제, 예컨대 락토스 또는 젖당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용한 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용된다.
본 발명의 제약 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여형에는 비제한적 예로서, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 산제, 용액, 분무제, 흡입제 또는 패치가 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어는 멸균 조건 하에 제약상 허용되는 담체 및 (임의로) 하나 이상의 보존제, 하나 이상의 완충제 또는 이들의 조합 (예를 들어, 필요에 따라)과 혼합된다. 안과용 제형, 점이제 및 점안제가 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 고려된다.
본원에 제공된 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 임의로, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어 이외에, 부형제, 예컨대 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물을 함유한다.
산제 및 분무제는 임의로, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)를 포함하는 중합체 캐리어 이외에, 부형제, 예컨대 락토스, 탈크, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 분무제는 또한 통상적인 분사제, 예컨대 클로로플루오로탄화수소를 함유한다.
경피 패치는 체내로의 화합물의 제어된 전달을 제공하는 추가 장점을 갖는다. 이러한 투여형은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 마이크로입자 또는 나노입자를 적절한 매질에 용해시키거나 분산시킴으로써 제조된다. 피부를 통과하는 화합물의 흐름을 증가시키기 위해 흡수 증진제가 임의로 사용된다. 속도는 속도 제어 막을 제공함으로써 또는 중합체 캐리어-올리고뉴클레오티드 복합체를 중합체 매트릭스 또는 겔에 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 중합체 캐리어(들)은 부형제에 의해 통상적으로 수행되는 일부 특성 (예를 들어, 기계적 특성, 열 특성 등)을 제공하므로, 제제에 필요한 이러한 부형제의 양을 감소시킨다.
연구 시약으로서의 용도.
본원에 제공된 중합체 캐리어는 또한 임의로 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드의 포유동물 세포로의 도입을 위한 연구 시약 또는 키트로서 사용된다. 포유동물 발현 벡터와 같은 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드의 포유동물 세포로의 시험관내 도입 (형질감염)을 위한 기존의 방법은 인산칼슘 형질감염 (문헌 [Graham and Vander Eb. (1973) Virol. 52:456-467]), DEAE-덱스트란 형질감염 (문헌 [Lopata, M. A. et al., (1984) Nuclo Acids Res. 12:5707]) 및 전기천공 (문헌 [Potter, H. et al. (1984) PNAS 81:7161])에 의해서, 또한 리포펙타민 (ref.)과 같은 시판되는 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 독성의 문제를 안고 있고, 본원에 기재된 바와 같이 덜 독성이면서 효율적인 형질감염 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 본원에 제공된 중합체 캐리어를 사용하여 전달될 수 있는 다른 올리고- 또는 폴리-뉴클레오티드는 단백질을 코딩하는 RNA; 리보자임, 압타머, 녹다운 작용제 및 디코이를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공된 중합체 캐리어는 세포 배양물 또는 생체내에서 RNAi 작용제의 전달을 위한 연구 시약으로서 특히 유용할 수 있다.
특정 정의
본원에 관해, 명시적으로 별도의 언급이 없는 경우 단수형의 사용은 복수형을 포함하고 역도 또한 같은 것으로 이해된다. 즉, "a" 및 "the"는 단어 변형에 상관없이 하나 이상의 대상을 지칭한다. 예를 들어, "중합체" 또는 "뉴클레오티드"는 하나의 중합체 또는 뉴클레오티드 또는 다수의 중합체들 또는 뉴클레오티드들을 지칭할 수 있다. 같은 이유로, "중합체들" 및 "뉴클레오티드들"은 다시 이러한 의도가 아니라고 명시적으로 언급되지 않는 한 또는 문맥상 명백하지 않는 한, 하나의 중합체 또는 하나의 뉴클레오티드 뿐만 아니라 다수의 중합체들 또는 뉴클레오티드들을 지칭할 것이다.
본원에서 사용되는 2개의 부분 또는 화합물은 비제한적 예로서 하나 이상의 공유 결합, 하나 이상의 비-공유결합 상호작용 (예를 들어, 이온 결합, 정전기력, 반데르 발스 상호작용, 이들의 조합 등) 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 상호작용에 의해 함께 유지되는 경우 "부착된" 또는 "회합된" (이들 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨) 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 기재된 중합체 캐리어는 중합체가 해리되거나 불안정화되지 않는 경우 "안정한" 것이다. 특정 경우에, 안정한 중합체 캐리어는 pH 7.4의 수용액에서 초기에 형성된 동일한 siRNA 및 블록 공중합체를 포함하는 중합체 캐리어의 유체역학 입도의 60％, 50％, 40％, 30％, 20％ 또는 10％ 내에 포함되는 유체역학 입도를 갖는 것이다. 일부 경우에, 안정한 중합체 캐리어는 pH 7.4의 수용액에서 초기에 동일한 siRNA 및 블록 공중합체를 포함하는 중합체 캐리어의 어셈블리의 농도의 60％, 50％, 40％, 30％, 20％ 또는 10％ 내에 포함되는 어셈블리의 농도를 갖는 것이다.
본원에서 사용되는 "대전가능한 종", "대전가능한 기" 또는 "대전가능한 단량체 단위"는 대전된 또는 대전되지 않은 상태의 종, 기 또는 단량체 단위이다. 특정 경우에, "대전가능한 단량체 단위"는 친전자체 (예를 들어, 양성자 (H+), 예를 들어 pH 의존적 방식으로)의 첨가 또는 제거에 의해 대전된 상태 (음이온으로 또는 양이온으로 대전된 상태)로 전환될 수 있는 것이다. 용어 "대전가능한 종", "대전가능한 기" 또는 "대전가능한 단량체 단위" 중 임의의 용어의 사용은 별도의 언급이 없는 경우 "대전가능한 종", "대전가능한 기" 또는 "대전가능한 단량체 단위" 중 임의의 다른 용어의 개시를 포함한다. "음이온으로 대전되거나 대전가능한" 또는 "음이온성 종으로 대전되거나 대전가능한" "대전가능한 종"은 음이온으로 대전된 상태 또는 대전되지 않은 상태의 종 또는 기이며, 여기서 대전되지 않은 상태는 예를 들어 친전자체, 예컨대 양성자 (H+)의 제거에 의해 음이온으로 대전된 상태로 전환될 수 있는 것이다. 특정 실시양태에서, 대전가능한 종은 대략 중성의 pH에서 음이온으로 대전되는 종이다. 중합체 상의 모든 대전가능한 종이 대전가능한 종의 pKa (산 해리 상수) 근처의 pH에서 음이온인 것이 아니라 음이온성 및 비음이온성 종의 평형이 공존할 것이라는 것이 강조되어야 한다. "양이온으로 대전되거나 대전가능한" 또는 "양이온성 종으로 대전되거나 대전가능한" "대전가능한 종"은 양이온으로 대전된 상태 또는 대전되지 않은 상태의 종 또는 기이며, 여기서 대전되지 않은 상태는 예를 들어 친전자체, 예컨대 양성자 (H+)의 첨가에 의해 양이온으로 대전된 상태로 전환될 수 있는 것이다. 특정 실시양태에서, 대전가능한 종은 대략 중성의 pH에서 양이온으로 대전되는 종이다. 중합체 상의 모든 대전된 양이온성 종이 대전된 양이온성 종의 pKa (산 해리 상수) 근처의 pH에서 양이온인 것이 아니라 양이온성 및 비양이온성 종의 평형이 공존할 것이라는 것이 강조되어야 한다. 본원에 기재된 "대전가능한 단량체 단위"는 "대전가능한 단량체 잔기"와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 "중화된 전하"는 ±10 내지 ±30 mV의 제타 전위를 갖는 입자, 및/또는 음전하로 대전가능한 대전가능한 종 (예를 들어, 탈양성자화에 따라 음이온이 되는 산성 종)의 제1 수 (z) 및 양전하로 대전가능한 대전가능한 종 (예를 들어, 양성자화에 따라 양이온이 되는 염기성 종)의 제2 수 (0.5·z)의 존재를 의미한다.
올리고뉴클레오티드 유전자 발현 조정인자: 본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드 유전자 발현 조정인자"는 안티센스 메카니즘을 포함하나 이에 제한되지는 않는 메카니즘에 의해, 또는 (i) 전사 불활성화; (ii) mRNA 분해 또는 격리; (iii) 전사 억제 또는 감쇠 또는 (iv) 번역 억제 또는 감쇠를 포함할 수 있는 RNA 간섭 (RNAi)-매개 경로를 거쳐 살아있는 세포에서 유전자 발현의 선택적 조정을 유도할 수 있는 올리고뉴클레오티드 작용제이다. 올리고뉴클레오티드 유전자 발현 조정인자에는 조절 RNA (실제로 임의의 조절 RNA 포함), 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, siRNA, RNAi, shRNA, aiRNA, 다이서 기질, 아프타머 및 그의 임의의 유사체 또는 전구체 (이에 제한되지는 않음)가 포함된다.
올리고뉴클레오티드 녹다운 작용제: 본원에서 사용되는 "올리고뉴클레오티드 녹다운 작용제"는 서열-특이적 방식으로 세포내 핵산을 표적화하고 결합함으로써 유전자 발현을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드 종이다. 올리고뉴클레오티드 녹다운 작용제의 비제한적 예로는 siRNA, miRNA, shRNA, 다이서 기질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 디코이 DNA 또는 RNA, 항원 올리고뉴클레오티드 및 그의 임의의 유사체 및 전구체를 들 수 있다.
억제: 본원에서 사용되는 용어 "억제," "침묵" 및 "감쇠"는 녹다운 작용제의 부재 하에 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현과 비교하여 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 측정가능한 감소를 지칭한다. 표적 mRNA 또는 상응하는 단백질의 발현의 감소 또는 "녹다운"은 당업계에 널리 공지된 기술, 예컨대 정량 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) 증폭, RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 블럿팅 및 혼성화, 및 마이크로어레이(microarray)에 의한 유전자 발현 모니터링을 이용하여 mRNA 수준을 측정함으로써; 및 단백질의 경우 당업계에 널리 공지된 기술, 예컨대 SDS-PAGE, 항체 결합, 웨스턴 블럿 분석, 면역침강, 방사능면역검정 또는 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 형광 활성화된 세포 분석 및 면역세포화학에 의해 측정함으로써 평가될 수 있다.
뉴클레오티드: 본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 사슬에 혼입된 또는 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합을 통해 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드) 사슬에 혼입된 또는 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 실시양태에서, "뉴클레오티드"는 개별 핵산 잔기 (예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 특정 실시양태에서, "하나 이상의 뉴클레오티드"는 존재하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 지칭하고; 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드는 분리된 뉴클레오티드이거나, 서로 비-공유결합으로 부착되거나, 또는 서로 공유결합으로 부착된다. 이와 같이, 특정 경우에, "하나 이상의 뉴클레오티드"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 뉴클레오티드 단량체 단위를 포함하는 중합체이다.
본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 7 내지 200개의 뉴클레오티드 단량체 단위를 포함하는 중합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "올리고뉴클레오티드"는 단일 및/또는 이중 가닥 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 또한, 용어 "뉴클레오티드", "핵산," "DNA," "RNA" 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉 펩티드 핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA), 포스포노-PNA, 모르폴리노 핵산 또는 변형된 포스페이트 기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포네이트, 5'-N-포스포라미다이트 결합)를 갖는 핵산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 변형된 주쇄를 갖는 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드는 천연 공급원으로부터 정제되거나, 재조합 발현 시스템을 사용하여 제조되고 임의로 정제되거나, 화학적으로 합성될 수 있으며, 그 이외에도 가능하다. 본원에서 사용되는 "뉴클레오시드"는 단당류 및 염기를 포함하는 화합물을 기술하는 용어이다. 단당류에는 오탄당 및 육탄당 단당류가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 단당류에는 또한 단당류 모방체, 및 히드록실 기를 할로겐, 메톡시, 수소 또는 아미노 기로 치환함으로써 또는 추가 히드록실 기의 에스테르화에 의해 변형된 단당류가 포함된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오시드 포스페이트 (예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신 및 데옥시시티딘 포스페이트)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기에는 다양한 핵산에서 자연적으로 발생하는 임의의 염기, 뿐만 아니라 이러한 천연 염기를 모방하거나 이를 닮은 다른 변형이 포함된다. 변형된 또는 유도체화된 염기의 비제한적 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산, 위부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, 2-아미노아데닌, 피롤로피리미딘 및 2,6-디아미노퓨린을 들 수 있다. 뉴클레오시드 염기에는 또한 광범위 핵염기, 예컨대 디플루오로톨릴, 니트로인돌릴, 니트로피롤릴 또는 니트로이미다졸릴이 포함된다. 또한, 뉴클레오티드는 라벨을 보유하거나 무염기 (즉 염기 결핍) 단량체를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 핵산 서열은 별도의 표시가 없는 경우 5' → 3' 방향으로 표시된다. 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기 쌍을 통해 수소 결합을 통한 서열-특이적 방식으로 다른 뉴클레오티드에 결합할 수 있다. 이러한 염기 쌍은 서로 상보적이라고 불린다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다.
특정 경우에, 본원에 기재된 중합체 캐리어 (또는 중합체 물질/조성물)는 중합체 캐리어로 어셈블링되는 다수의 공중합체, 및 임의로는 하나 이상의 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 정상 생리적 pH는 포유동물의 우세한 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 정상적인 세포의 사이토졸 등의 pH를 지칭한다. 특정 경우에, 정상 생리적 pH는 예를 들어, 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 포함하는 대략 중성의 pH이다. 본원에서 사용되는 용어 중성 pH, 생리학적 pH 및 생리적 pH는 동의어이고 상호교환가능하다.
RNA 간섭 (RNAi): 본원에서 사용되는 용어 "RNA 간섭" 또는 "RNAi"는 표적 RNA에 대해 실질적으로 상보적인 부분을 또한 포함하는, 적어도 부분적으로 이중 가닥인 RNA에 의해 매개되는 유전자 발현의 서열-특이적 억제 및/또는 표적 mRNA 및 단백질 수준의 감소를 지칭한다.
RNAi 작용제: 본원에서 사용되는 용어 "RNAi 작용제"는 RNAi 메카니즘을 통해 유전자 발현의 억제를 매개할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, siRNA, 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 비대칭 간섭 RNA (aiRNA), 다이서 기질 및 그의 전구체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
짧은 간섭 RNA (siRNA): 본원에서 사용되는 용어 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 길이가 대략 15 내지 50개 염기 쌍인 뉴클레오티드 이중나선을 포함하고 임의로 0 내지 2개의 단일 가닥 오버행(overhang)을 추가로 포함하는 RNAi 작용제를 지칭한다. siRNA의 한 가닥은 상보적 방식으로 표적 RNA와 혼성화하는 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, siRNA 및 표적 RNA의 표적화된 부분 간의 하나 이상의 미스매치(mismatch)가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, siRNA는 표적 전사체의 분해를 유발함으로써 유전자 발현의 억제를 매개한다.
짧은 헤어핀 RNA (shRNA): 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)는 이중 가닥 (이중나선) 구조 및 하나 이상의 단일 가닥 부분을 형성하기 위해 서로 혼성화되거나 혼성화될 수 있는 2개 이상의 상보적 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 유전자 발현 억제: 본원에서 사용되는 어구 "유전자 발현 억제"는 유전자의 발현 생성물의 양의 임의의 측정가능한 감소를 유발시키는 것을 의미한다. 발현 생성물은 유전자로부터 전사된 RNA (예를 들어, mRNA) 및/또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 발현의 수준은 mRNA 또는 단백질의 측정을 위한 표준 기술을 이용하여 측정될 수 있다.
다이서 기질: "다이서 기질"은 세포에서 RNase III 족 구성원 다이서에 대한 기질인 대략 25개 초과의 염기 쌍 이중나선 RNA이다. 다이서 기질은 절단되어, mRNA 녹다운에 의해 유전자 침묵을 초래하는 RNA 간섭 효과를 유발하는 대략 21개 염기 쌍 이중나선 작은 간섭 RNA (siRNA)를 생성한다.
치료제: 본원에서 사용되는 어구 "치료제"는 대상체, 기관, 조직 또는 세포에 투여시 치료학적 효과를 갖고/갖거나 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 발휘하는 임의의 작용제를 지칭한다.
치료 유효량: 본원에서 사용되는 용어 치료제의 "치료 유효량"은 질병, 질환 및/또는 상태를 앓고 있거나 이에 대해 감수성인 대상체에게 투여시 질병, 질환 및/또는 상태의 증상(들)의 치료, 진단, 예방 및/또는 발병개시의 지연에 충분한 양을 의미한다.
나노입자: 본원에서 사용되는 용어 "나노입자"는 1000 나노미터 (nm) 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 지칭한다. 일반적으로, 나노입자는 진핵 세포에 의해 유입되기에 충분히 작은 치수를 가져야 한다. 전형적으로, 나노입자는 200 nm 이하의 최장 직선 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 100 nm 이하의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 더 작은 나노입자, 예를 들어 약 10 nm 내지 약 200 nm, 약 20 nm 내지 약 100 nm, 또는 50 nm 이하, 예를 들어 5 nm 내지 30 nm의 직경을 갖는 나노입자가 사용된다.
본원에서 사용되는 "미셀"은 코어 및 친수성 쉘을 포함하는 입자를 포함하며, 여기서 코어는 적어도 부분적으로, 우세하게 또는 실질적으로 소수성 상호작용을 통해 함께 유지된다. 특정 경우에, 본원에서 사용되는 "미셀"은 2개 이상의 도메인, 즉 내부 도메인 또는 코어, 및 외부 도메인 또는 쉘을 포함하는 다중-구성성분 나노입자이다. 코어는 적어도 부분적으로, 우세하게 또는 실질적으로 소수성 상호작용에 의해 함께 유지되고, 미셀의 중심에 존재한다. 본원에서 사용되는 "미셀의 쉘"은 미셀의 비-코어 부분으로 정의된다.
음이온성 단량체: 본원에서 사용되는 "음이온성 단량체" 또는 "음이온성 단량체 단위"는 음이온으로 대전된 상태 또는 대전되지 않은 상태로 존재하는 기를 보유하는 단량체 또는 단량체 단위이며, 여기서 대전되지 않은 상태는 예를 들어 친전자체 (예를 들어, 양성자 (H+), 예를 들어 pH 의존적 방식으로)의 제거시 음이온으로 대전될 수 있는 것이다. 특정 경우에, 기는 대략 생리적 pH에서 실질적으로 음으로 대전되나, 약한 산성 pH에서 양성자화되어 실질적으로 중성이 된다. 이러한 기의 비제한적 예로는 카르복실 기, 바르비투르산 및 그의 유도체, 크산틴 및 그의 유도체, 보론산, 포스핀산, 포스폰산, 술핀산, 포스페이트 및 술폰아미드를 들 수 있다.
음이온성 종: 본원에서 사용되는 "음이온성 종"은 대략 중성의 (예를 들어, 약 7, 예컨대 약 7.2 내지 약 7.4) 또는 생리적 pH에서 음으로 대전된 상태로 존재하나, 약한 산성 pH에서 양성자화되어 실질적으로 중성이 되는 기, 잔기 또는 분자이다.
청구항에 명시적으로 인용되지 않은 이론에 의해 얽매이지 않고, 막 불안정화 중합체는 세포막 구조 (예를 들어, 엔도솜 막)의 변화 (예를 들어, 투과성 변화)를 직접적으로 또는 간접적으로 유발하여, 중합체 캐리어 (또는 그의 구성요소 중합체)와 관련하여 또는 이와 독립적으로 작용제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)가 이러한 막 구조를 통해 통과하게 (예를 들어, 세포로 진입하거나 세포 소포 (예를 들어, 엔도솜)로부터 배출되게) 할 수 있다. 막 불안정화 중합체는 막 붕괴성 중합체일 수 있다 (그러나 반드시 막 붕괴성 중합체는 아니다). 막 붕괴성 중합체는 세포 소포의 용해 또는 세포막의 붕괴를 직접적으로 또는 간접적으로 유발할 수 있다 (예를 들어, 세포막의 집단의 실질적 분획에 대해 관찰된 바와 같음).
일반적으로, 중합체 캐리어의 막 불안정화 또는 막 붕괴성 특성은 다양한 수단에 의해 평가될 수 있다. 한 비제한적 접근법에서, 세포막 구조의 변화는 세포막 (예를 들어, 엔도솜 막)으로부터 작용제 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드)의 방출을 (직접적으로 또는 간접적으로) 측정하는 검정에서 평가에 의해 (예를 들어, 이러한 막의 외부 환경에서 이러한 작용제의 존재 또는 부재 또는 이러한 작용제의 활성의 측정에 의해) 관찰될 수 있다. 다른 비제한적 접근법은 예를 들어, 관심있는 세포막에 대한 대용 검정으로서 적혈구 용해 (용혈)의 측정을 포함한다. 이러한 검정은 단일 pH 값에서 또는 일정 범위의 pH 값에 걸쳐 수행될 수 있다.
소수성 종: 본원에서 사용되는 "소수성 종" (본원에서 "소수성-향상 부분"과 상호교환가능하게 사용됨)은 분자, 예컨대 단량체 또는 중합체에 공유결합으로 부착시 분자의 소수성을 증가시키거나 소수성 향상 부분으로서 작용하는 부분, 예컨대 치환체, 잔기 또는 기이다.
용어 "소수성"은 비극성 용매와 물 간의 화합물의 이동의 자유 에너지에 의해 측정된 화합물의 물리적 특성을 기술하는 전문어이다 (문헌 [Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6:1302-1307]). 화합물의 소수성은 그의 logP 값, 즉 2종의 비혼화성 용매, 예를 들어 옥탄올 및 물의 혼합물의 2개의 상 중 화합물 농도의 비율로서 정의되는 분배 계수 (P)의 로그에 의해 측정될 수 있다. 소수성 측정의 실험 방법, 뿐만 아니라 logP 값의 컴퓨터-보조 계산 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 소수성 종에는 지방족, 헤테로지방족, 아릴 및 헤테로아릴 기가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
지방족 또는 지방족 기: 본원에서 사용되는 용어 "지방족" 또는 "지방족 기"는 직쇄 (즉, 비분지된), 분지형 또는 시클릭 (융합된, 가교 및 스피로-융합된 폴리시클릭 포함)일 수 있고 완전 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있으나 방향족이 아닌 탄화수소 부분을 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 지방족 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유한다.
헤테로원자: 용어 "헤테로원자"는 수소 또는 탄소가 아닌 원자, 예컨대 산소, 황, 질소, 인, 붕소, 비소, 셀레늄 또는 규소 원자를 의미한다.
아릴 또는 아릴 기: 본원에서 사용되는 용어 "아릴" 또는 "아릴 기"는 총 5 내지 14개의 고리 구성원을 갖는 모노시클릭, 바이시클릭 및 트리시클릭 고리계를 지칭하며, 여기서 고리계 내의 하나 이상의 고리는 방향족이고, 고리계 내의 각 고리는 3 내지 7개의 고리 구성원을 함유한다.
헤테로알킬: 용어 "헤테로알킬"은 주쇄 탄소 원자 중 하나 이상이 헤테로원자로 대체된 알킬 기를 의미한다.
헤테로아릴: 용어 "헤테로아릴"은 고리 구성원 중 하나 이상이 헤테로원자인 아릴 기를 의미한다.
하기 실시예는 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어선 안된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌은 그 공개문헌이 인용된 정보에 대해 본원에 참고로 도입된다.
<실시예>
본 발명의 기재 전반에 걸쳐, 단량체 또는 이러한 단량체의 중합으로부터 유도된 단량체 잔기를 기술하기 위해 다양한 공지된 두문자어 및 약어가 사용된다. 제한 없이, 별도의 표시가 없는 경우: "BMA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "B")는 부틸 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "DMAEMA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "D")는 N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "Gal"은 갈락토스 또는 갈락토스 잔기 (임의로 히드록실-보호 부분 (예를 들어, 아세틸) 포함) 또는 PEG화된 그의 유도체 (하기 기재된 바와 같음)를 지칭하고; HPMA는 2-히드록시프로필 메타크릴레이트 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "MAA"는 메틸아크릴산 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "MAA(NHS)"는 메타크릴산의 N-히드록실-숙신이미드 에스테르 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "PAA" (또는 동의 줄임 표기로서 문자 "P")는 2-프로필아크릴산 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 나타내고; "PEGMA"는 PEG화된 메타크릴계 단량체, CH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2 또는 이로부터 유도된 단량체 잔기를 지칭한다. 각 경우에, 임의의 이러한 지칭은 단량체 (그의 모든 염 또는 이온성 유사체 포함) 또는 단량체의 중합으로부터 유도된 단량체 잔기 (그의 모든 염 또는 이온성 유사체 포함)를 나타내고, 특정 표시 형태는 문맥상 당업자에게 명백하다.
실시예 1: 공중합체의 제조
하기 일반식의 이블록 중합체 및 공중합체를 제조하였다:
Figure pct00009
여기서, [A1-A2]는 단량체 A1 및 A2의 잔기로 구성된 제1 블록 공중합체이고,
[B1-B2-B3]은 단량체 B1, B2, B3의 잔기로 구성된 제2 블록 공중합체이고,
x, y, z는 단량체 잔기의 중합체 조성 (몰％)이고,
n은 분자량이다.
예시적 이블록 공중합체:
Figure pct00010
여기서,
B는 부틸 메타크릴레이트이고,
P는 프로필 아크릴산이고,
D 및 DMAEMA는 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트이고,
PEGMA는 폴리에틸렌글리콜 메타크릴레이트 (여기서, 예를 들어 w = 4 내지 5개 또는 7 내지 8개의 에틸렌 옥시드 단위)이고,
MAA(NHS)는 메틸아크릴산-N-히드록시 숙신이미드이고,
HPMA는 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드이고,
PDSM은 피리딜 디술피드 메타크릴레이트이다.
이들 중합체는, 중합체 또는 공중합체의 제1 블록의 조성이, 제1 블록이 중성 (예를 들어, PEGMA), 양이온성 (예를 들어, DMAEMA), 음이온성 (예를 들어, PEGMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨)), 양쪽성 (DMAEMA-NHS (여기서, NHS는 산으로 가수분해됨)) 또는 쯔비터이온성 (예를 들어, 폴리[2-메타크릴로일옥시-2'-트리메틸암모늄에틸 포스페이트])인 중합체를 제조하기 위해 화학적으로 처리되거나 달라지는 구조를 나타낸다. 또한, [PEGMA-PDSM]-[B-P-D] 중합체는 중합체-siRNA 접합체를 형성하기 위해 티올화된 siRNA와 반응될 수 있는 제1 블록 내 피리딜 디술피드 관능기를 함유한다.
실시예 1.1: RAFT 중합을 이용한 블록 공중합체의 합성.
A. RAFT 사슬 이동제.
후속 RAFT 중합에서 사용되는 사슬 이동제 (CTA)인 4-시아노-4-(에틸술파닐티오카르보닐) 술파닐펜탄산 (ECT)의 합성을 문헌 [Moad et al., Polymer, 2005, 46(19): 8458-68]에 의한 절차로부터 변형시켰다. 간단히, 에탄 티올 (4.72 g, 76 mmol)을 0℃에서 디에틸 에테르 (150 mL) 중 수소화나트륨 (오일 중 60％) (3.15 g, 79 mmol)의 교반된 현탁액에 10분에 걸쳐 첨가하였다. 그 후, 용액을 10분 동안 교반한 후 이황화탄소 (6.0 g, 79 mmol)를 첨가하였다. 조 나트륨 S-에틸 트리티오카르보네이트 (7.85 g, 0.049 mol)를 여과에 의해 수집하고, 디에틸 에테르 (100 mL)에서 현탁하고, 요오드 (6.3 g, 0.025 mol)와 반응시켰다. 1시간 후, 용액을 여과하고, 수성 티오황산나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 그 후, 조 비스(에틸술파닐티오카르보닐) 디술피드를 회전식 증발에 의해 단리하였다. 에틸 아세테이트 (50 mL) 중 비스(에틸술파닐티오카르보닐) 디술피드 (1.37 g, 0.005 mol) 및 4,4'-아조비스(4-시아노펜탄산) (2.10 g, 0.0075 mol)의 용액을 환류에서 18시간 동안 가열하였다. 용매의 회전식 증발 후, 조 4-시아노-4-(에틸술파닐티오카르보닐) 술파닐-펜탄산 (ECT)을, 정지상으로서 실리카 겔 및 용리액으로서 50:50 에틸 아세테이트 헥산을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리하였다.
B. 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트) 매크로 사슬 이동제 (폴리DMAEMA 매크로CTA).
라디칼 개시제로서 ECT 및 2,2'-아조비스(4-메톡시-2.4-디메틸 발레로니트릴) (V-70) (와코 케미칼스(Wako chemicals))을 사용하여 30℃에서 질소 분위기 하에 18시간 동안 DMF에서 DMAEMA의 RAFT 중합을 수행하였다. 초기 단량체 대 CTA 비율 ([CTA]0/[M]0)은 100％ 전환에서 이론적인 Mn이 10,000 (g/mol)이 되도록 하는 것이었다. 초기 CTA 대 개시제 비율 ([CTA]0/[I]0)은 10 대 1이었다. 생성된 폴리DMAEMA 매크로 사슬 이동제를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 생성된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다.
C. 폴리(DMAMEA) 매크로CTA로부터의 DMAEMA, PAA 및 BMA의 블록 공중합.
N,N-디메틸포름아미드에 용해된 폴리(DMAEMA) 매크로CTA에 원하는 화학량론적 양의 DMAEMA, PAA 및 BMA를 첨가하였다 (용매에 대한 25 중량％ 단량체 및 매크로CTA). 모든 중합에서, [M]0/[CTA]0 및 [CTA]0/[I]0는 각각 250:1 및 10:1이었다. V70의 첨가 후, 용액을 질소로 30분 동안 퍼징하고, 30℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 생성된 이블록 공중합체를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 그 후, 침전된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여, 폴리메틸 메타크릴레이트 표준물에 대한 DMF 중 폴리(DMAEMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체 샘플 둘 다의 분자량 및 다분산도 (PDI, Mw/Mn)를 측정하였다 (비스코텍 GPCmax VE2001 및 굴절계 VE3580 (비스코텍, 미국 텍사스주 휴스턴)에 직렬로 연결된 SEC 토소 TSK-GEL R-3000 및 R-4000 컬럼 (토소 바이오사이언스, 미국 펜실베니아주 몽고메리빌)). 1.0 중량％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하였다. 도 1a는 일부 RAFT 합성된 중합체의 분자량, 조성 및 블록 비율을 요약한다.
실시예 1.2. 폴리(PEGMA) 매크로CTA로부터의 DMAEMA, PAA 및 BMA의 제2 블록 (B1-B2-B3) 공중합의 제조.
N,N-디메틸포름아미드에 용해된 폴리(PEGMA) 매크로CTA에 원하는 화학량론적 양의 DMAEMA, PAA 및 BMA를 첨가하였다 (용매에 대한 25 중량％ 단량체 및 매크로CTA). 모든 중합에서, [M]0/[CTA]0 및 [CTA]0/[I]0는 각각 250:1 및 10:1이었다. AIBN의 첨가 후, 용액을 질소로 30분 동안 퍼징하고, 68℃에서 6 내지 12시간 동안 반응시켰다. 생성된 이블록 공중합체를 침전에 의해 50:50 v:v 디에틸 에테르/펜탄으로 단리하였다. 그 후, 침전된 중합체를 아세톤에 재용해시키고, 후속적으로 펜탄 (x3)으로 침전시키고, 밤새 진공에서 건조시켰다. 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 이용하여, 비스코텍 GPCmax VE2001 및 굴절계 VE3580 (비스코텍, 미국 텍사스주 휴스턴)을 이용하여 DMF 중 폴리(PEGMA) 매크로CTA 및 이블록 공중합체 샘플 둘 다의 분자량 및 다분산도 (PDI, Mw/Mn)를 측정하였다. 1.0 중량％ LiBr을 함유하는 HPLC-등급 DMF를 이동상으로서 사용하였다. CDCl3 중 NMR 분광법을 이용하여, 중합체 구조를 확인하고 제2 블록의 조성을 계산하였다.
실시예 1.3. PEGMA-DMAEMA 공중합체의 제조 및 특성화.
실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 유사한 절차를 이용하여 중합체 합성을 수행하였다. 개별 단량체의 상이한 공급비를 사용하여 제1 블록 내의 PEGM 및 DMAEMA의 비율을 변화시켜 도 1b에 기재된 공중합체를 제조하였다.
실시예 1.4. PEGMA-MAA(NHS) 공중합체의 제조 및 특성화.
제1 블록 공중합체의 원하는 조성을 얻기 위한 단량체 공급비를 사용하여 실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 같이 중합체 합성을 수행하였다. 일부 경우에, 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율이 70:30인 [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체를 제조하였다. NHS 함유 중합체를 수성 완충액 (포스페이트 또는 바이카르보네이트)에서 7.4 내지 8.5의 pH에서 1 내지 4시간 동안 실온 또는 37℃에서 인큐베이션하여, 가수분해된 (산성) 형태를 제조할 수 있었다.
실시예 1.5. DMAEMA-MAA(NHS) 공중합체의 제조 및 특성화.
제1 블록 공중합체의 원하는 조성을 얻기 위한 단량체 공급비를 사용하여 실시예 1.1 및 1.2에 기재된 바와 같이 중합체 합성을 수행하였다. 특정 경우에, 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율이 70:30인 [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체를 제조하였다. NHS 함유 중합체를 수성 완충액 (포스페이트 또는 바이카르보네이트)에서 7.4 내지 8.5의 pH에서 1 내지 4시간 동안 실온 또는 37℃에서 인큐베이션하여, 가수분해된 (산성) 형태를 제조할 수 있었다.
실시예 2. siRNA 약물 전달을 위한 HPMA-PDS(RNA) 공중합체 접합체의 제조 및 특성화.
A. 피리딜 디술피드 메타크릴레이트 단량체 (PDSMA)의 합성.
알드리티올-2(Aldrithiol-2)™ (5 g, 22.59 mmol)를 메탄올 40 mL 및 AcOH 1.8 mL에 용해시켰다. 30분에 걸쳐 메탄올 20 mL 중 2-아미노에탄티올.HCl (1.28 g, 11.30 mmol)의 용액으로서 용액을 첨가하였다. 반응물을 N2 하에 48시간 동안 R.T.에서 교반하였다. 용매의 증발 후, 잔류 오일을 디에틸 에테르 40 mL로 2회 세척하였다. 조 화합물을 메탄올 10 mL에 용해시키고, 생성물을 디에틸 에테르 50 mL로 2회 침전시켜, 원하는 화합물 1을 약한 황색 고체로서 얻었다. 수율: 95％.
피리딘 디티오에틸아민 (6.7 g, 30.07 mmol) 및 트리에틸아민 (4.23 mL, 30.37 mmol)을 DMF (25 mL) 및 피리딘 (25 mL)에 용해시키고, 메타크릴로일 클로라이드 (3.33 mL, 33.08 mmol)를 0℃에서 주사기를 통해 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 R.T.에서 교반하였다. 반응 후, 반응물을 포화 NaHCO3 (350 mL)에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (350 mL)에 의해 추출하였다. 합한 유기층을 10％ HCl (100 mL, 1회) 및 순수한 물 (100 mL, 2회)에 의해 추가로 세척하고, MaSO4에 의해 건조시켰다. 순수한 생성물을 컬럼 크로마토그래피 (EA/Hex : 1/10 내지 2/1)에 의해 황색 시럽으로서 정제하였다. Rf = 0.28 (EA/Hex = 1/1). 수율: 55％.
B. HPMA-PDSMA 공중합체 합성.
자유 라디칼 개시제로서 2,2'-아조-비스-이소부티릴니트릴 (AIBN)을 사용하여 DMF (50 중량％ 단량체:용매)에서 68℃에서 질소 분위기 하에 8시간 동안 N-(2-히드록시프로필) 메타크릴아미드 (HPMA) 및 피리딜 디술피드 메타크릴레이트의 RAFT 중합 (전형적으로 70:30 단량체 비율로)을 수행하였다. CTA 대 AIBN의 몰비는 10 대 1이었고, 100％ 전환에서 25,000 g/mol의 분자량이 달성되도록 단량체 대 CTA 비율을 설정하였다. 폴리(HPMA-PDS) 매크로-CTA를 메탄올로부터 디에틸 에테르로 반복적 침전에 의해 단리하였다.
매크로-CTA를 진공 하에 24시간 동안 건조시킨 후, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA), 프로필아크릴산 (PAA) 및 부틸 메타크릴레이트 (BMA)의 블록 공중합을 위해 사용하였다. N,N-디메틸포름아미드에 용해된 HPMA-PDS 매크로CTA에 등몰량의 DMAEMA, PAA 및 BMA ([M]0/[CTA]0 = 250)를 첨가하였다 (용매에 대한 25 중량％ 단량체 및 매크로CTA). 10 대 1의 CTA 대 개시제 비율로 라디칼 개시제 AIBN을 첨가하였다. 질소 분위기 하에 8시간 동안 68℃에서 중합을 진행시켰다. 그 후, 생성된 이블록 중합체를 50:50 디에틸 에테르/펜탄으로 4회 침전 (침전 사이에 에탄올에 재용해시킴)에 의해 단리하였다. 그 후, 생성물을 디에틸 에테르로 1회 세척하고, 밤새 진공에서 건조시켰다.
C. HPMA-PDSMA 공중합체로의 siRNA 접합.
디술피드 변형된 5'-센스 가닥을 갖는 이중나선 RNA로서 시판되는 (애질런트(Agilent), 미국 콜로라도주 볼더) 티올화된 siRNA를 얻었다. 동결건조된 화합물을 물에 용해시켜 접합을 위한 유리 티올 형태를 제조하고, 아가로스 겔 내에 고정된 디술피드 환원제 TCEP로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 환원된 RNA (400 μM)를 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)를 함유하는 포스페이트 완충액 (pH 7)에서 피리딜 디술피드-관능화된 중합체와 24시간 동안 반응시켰다.
RNA 티올과 피리딜 디술피드 중합체의 반응은 2-피리딘티온을 생성시켰으며, 이를 분광광도법으로 측정하여 접합 효율을 특성화할 수 있었다. 디술피드 교환을 추가로 확인하기 위해, 접합체를 SDS-PAGE 16.5％ 트리신 겔 상에서 실행하였다. 병행하여, 환원 환경에서 중합체로부터 RNA의 방출을 입증하기 위해 접합 반응의 분취액을 SDS-PAGE 전에 고정된 TCEP로 처리하였다. 접합 반응을 1, 2 및 5의 중합체/RNA 화학량론에서 수행하였다. 접합 효율을 측정하기 위해 2-피리딘티온 방출에 대한 343 nm에서의 UV 분광광도법 흡광도 측정치를 사용하였다.
실시예 3: 세포 표적화제를 갖는 중합체의 합성: 프로파르길 폴레이트와 아지도-말단의 중합체의 클릭 반응.
관심있는 특정 수용체 (예를 들어, 폴레이트)를 함유하는 특정 조직/세포의 활성 표적화에 대한 잠재성을 갖는 생물학적 리간드 (예를 들어, 폴레이트)와 접합된 블록 공중합체 미셀을 제조하기 위해 제어 라디칼 중합 및 아지드-알킨 클릭 화학의 조합을 이용하였다. 아지도 사슬 이동제 (CTA)를 사용한 것을 제외하고 실시예 1에 기재된 바와 같이, 가역적 부가-쪼개짐 사슬 이동 (RAFT) 중합에 의해 블록 공중합체를 합성하였다. 그 후, 중합체의 아지도 종결부를 표적화제 (예를 들어, 폴레이트)의 알킨 유도체와 반응시켜, 표적화제를 함유하는 중합체를 제조하였다.
RAFT 작용제의 합성.
RAFT 사슬 이동제 (CTA) 2-도데실술파닐티오카르보닐술파닐-2-메틸-프로피온산 3-아지도프로필 에스테르 (C12-CTAN3)를 하기와 같이 제조하였다:
3-아지도프로판올의 합성. 3-클로로-1-프로판올 (5.0 g, 53 mmol, 1.0 당량) 및 나트륨 아지드 (8.59 g, 132 mmol, 2.5 당량)를 DMF (26.5 mL)에서 100℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 에틸 에테르 (200 mL)에 붓고, 포화 수성 NaCl 용액 (500 mL)으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 상등액을 농축시켜, 생성물 (5.1 g, 95％ 수율)을 수득하였다.
2-도데실술파닐티오카르보닐술파닐-2-메틸프로피온산 클로라이드 (DMP-Cl)의 합성. 2-도데실술파닐티오카르보닐술파닐-2-메틸-프로피온산 (DMP, 노베온(Noveon) >95％) (1.0 g, 2.7 mmol, 1.0 당량)을 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 메틸렌 클로라이드 (15 mL)에 용해시키고, 용액을 대략 0℃로 냉각하였다. 옥살릴 클로라이드 (0.417 g, 3.3 mmol, 1.2 당량)를 질소 분위기 하에 천천히 첨가하고, 용액을 실온에 도달하게 하고, 총 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 감압 하에 농축시켜, 산 클로라이드 생성물 (1.0 g, 99％ 수율)을 수득하였다.
2-도데실술파닐티오카르보닐술파닐-2-메틸프로피온산 3-아지도프로필 에스테르의 합성. 3-아지도프로판올 (265 mg, 2.62 mmol, 1.0 당량)을 50 mL 둥근 바닥 플라스크에서 메틸렌 클로라이드 (5 mL)에 용해시키고, 용액을 대략 0℃로 냉각하였다. 메틸렌 클로라이드 (5 mL) 중 트리에틸아민 (0.73 mL)의 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 메틸렌 클로라이드 (5 mL) 중 DMP-Cl (1.0 g, 2.6 mmol)의 용액을 적가하고, 용액을 3시간 동안 교반하면서 실온에 도달하게 하였다. 용액을 감압 하에 농축시키고, 에틸 에테르 (100 mL)로 희석하고, 포화 수성 중탄산나트륨 용액 (50 mL), 물 (50 mL) 및 포화 NaCl 용액 (50 mL)으로 순서대로 세척하였다. 유기층을 분리하고, MgSO4 (1.0 g) 상에서 건조시키고, 여과하였다. 상등액을 감압 하에 농축시켜, 생성물 (1.05 g, 90％ 수율)을 잔류 오일로서 수득하였다.
프로파르길 폴레이트의 합성.
엽산 (1.0 g, 0.0022 mol)을 DMF (10 mL)에 용해시키고, 물/얼음 조에서 냉각하였다. N-히드록시숙신이미드 (260 mg, 0.0025 mol) 및 EDC (440 mg, 0.0025 mol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 빙조에서 30분 동안 교반하여, 백색 침전물을 얻었다. DMF (5.0 mL) 중 프로파르길아민 (124 mg, 2.25 mmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고, 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)에 붓고, 30분 동안 교반하여, 침전물을 형성시켰다. 오렌지-황색 침전물을 여과하고, 아세톤으로 세척하고, 진공 하에 6시간 동안 건조시켜, 생성물 1.01 g (93％ 수율)을 수득하였다.
프로파르길 폴레이트와 아지도-말단의 중합체의 클릭 반응.
아지도-말단의 중합체를 하기 실시예 절차에 의해 프로파르길 폴레이트와 반응시켰다. DMF (7 mL) 중 N3-α-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-Dz]a-ω (0.0800 mmol) 및 펜타메틸디에틸렌트리아민 (PMDETA, 알드리히(Aldrich), 99％) (8.7 mg, 0.050 mmol)의 용액을 60분 동안 질소로 퍼징하고, 질소 분위기 하에 CuBr (7.2 mg, 0.050 mmol) 및 프로파르길 폴레이트 (42 mg, 0.088 mmol)를 함유하는, 자석 교반 막대가 장착된 바이알로 주사기를 통해 이동시켰다. 반응 혼합물을 26℃에서 22시간 동안 산소의 부재 하에 교반하였다. 반응 혼합물을 공기에 노출시키고, 용액을 중성 알루미나의 컬럼을 통해 통과시켰다. DMF를 진공 하에 제거하고, 생성물을 헥산으로 침전시켰다. 생성된 폴레이트-말단의 블록 공중합체 폴레이트-α-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-Dz]a-ω를 THF에 용해시키고, 과량의 프로파르길 폴레이트를 제거하기 위해 여과하였다. THF를 제거한 후, 중합체를 탈이온수 (DI)에 용해시키고, 1000 Da의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 막을 사용하여 6시간 동안 투석하였다. 중합체를 동결건조에 의해 단리하였다.
실시예 4: 블록 공중합체 PRxO729v6 (또는 P7v6으로서 공지됨)의 NMR 분광법 (도 2).
본 실시예는 NMR 분광법을 이용하여, 중합체 PRxO729v6이 수용액에서 미셀형 구조를 형성한다는 증거를 제공한다.
25℃에서 중수소화 클로로포름 (CDCl3) 및 중수소화 물 (D2O)에서 브루커 AV301 상에서 1H NMR 스펙트럼을 기록하였다. 중수소 락(lock) (CDCl3, D2O)을 사용하였고, 테트라메틸실란 (CDCl3의 경우) 및 3-(트리메틸실릴)프로피온-2,2,3,3-d4 산, 나트륨 염 (D2O의 경우)으로부터 화학적 이동 (ppm)을 측정하였다. 중합체 농도는 6 mg/mL였다.
예로서 수성 완충액 중 중합체 PRxO729v6을 사용한 합성된 중합체의 NMR 분광법은 본 발명의 이블록 중합체가 수용액에서 미셀을 형성한다는 증거를 제공하였다. 미셀의 형성은 코어 세그먼트를 형성하는 양성자의 이동을 제한하고 용매와 코어의 양성자 간의 중수소 교환을 방해하는 차폐된 점성 내부 코어의 형성을 초래하였다. 이는 상응하는 양성자의 1H NMR 신호의 유의한 억제 또는 소멸에 의해 반영되었다. 본 발명자들은 용액 NMR 분광법의 이러한 고유 특성을 사용하여, 미셀의 코어의 소수성 블록이 효과적으로 차폐된다는 것을 나타내었다. 수성 매질에서 미셀이 형성된 경우, 소수성 공중합체 블록의 양성자로 인한 신호의 소멸이 발생하여야 한다.
도 2는 CDCl3 (유기 용매) 및 D2O (수성 용매) 중 중합체 PRxO729v6의 1H NMR 실험을 나타낸다. 실온에서 CDCl3 중 중합체의 1H NMR 스펙트럼 (도 2a)은 모든 중합체 양성자로 인한 신호를 나타내며, 이는 중합체 사슬이 CDCl3 중에 분산된 (응집되지 않은) 상태로 남아있고 그의 움직임을 보존하여 그의 양성자가 용매와 교환될 수 있다는 것을 나타내었다. 이는 유기 용매 중 PRxO729v6으로부터 차폐된 코어를 갖는 안정한 미셀이 형성되지 않았다는 것을 나타내었다. 도 2b는 D2O 중 PRxO729v6의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 소수성 블록 (BMA, PAA, DMAEMA)의 양성자를 나타내는 신호가 스펙트럼에서 소멸되었다. 이는 수용액 중 PRxO729v6으로부터 차폐된 코어를 갖는 안정한 미셀이 형성되었음을 나타내었다. 더욱이, 동일한 스펙트럼에서, DMAEMA의 2개의 메틸 기의 양성자의 공명으로 인한 신호 (2.28 ppm)는 유의하게 억제되었으며, 이는 쉘을 구성하는 오직 제1 폴리 DMAEMA 블록, 즉, 주로 DMAEMA의 대전된 기가 물에 노출되었다는 것을 암시한다. 단순한 계산은 CDCl3에서의 신호 (5600)로부터 공제된 소수성 블록의 PAA, DMAEMA의 적분된 백분율 (2900)이 D2O에서의 동일한 신호 (2811)에 대한 근사한 값을 제공한다는 것을 나타내며, 이 결론과 일치하였다.
함께 고려하여, 1H NMR 실험의 결과는 중합체 PRxO729v6이 질서있는 코어-쉘 구조를 갖는 미셀을 형성하였다는 것을 나타내었으며, 여기서 제1 블록 폴리DMAEMA는 소수성 단위 (BMA) 및 반대 전하의 정전기 안정화 단위 (PAA, DMAEMA)로 구성된 코어를 둘러싸는 수화된 외부 쉘을 형성하였다.
실시예 5: siRNA와 복합체를 형성한 중합체 PRxO729v6의 입도의 동적 광산란 (DLS) 측정 (도 3).
하기 실시예는 중합체 PRxO729v6이 크기 45 nm의 균일한 입자 단독 또는 siRNA에 결합한 후 크기 47 nm의 입자를 형성한다는 것을 나타내었다.
맬번(Malvern) 제타사이저(Zetasizer) 나노 ZS를 이용하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 중합체 단독 또는 중합체/siRNA 복합체의 입도를 측정하였다. 동결건조된 중합체를 100％ 에탄올 중에 10 내지 50 mg/mL로 용해시키고, 이어서 포스페이트 완충액 (pH 7.4)로 10배 희석하였다. PRxO729v6 단독의 경우 1 mg/mL 또는 1 μM GAPDH-특이적 21량체-siRNA (암비온(Ambion))와 복합체를 형성한 PRxO729v6의 경우 0.7 mg/mL에서 포스페이트 완충된 염수 (pH 7.4) (PBS)에서 4:1의 이론적인 전하 비율 (중합체 상의 양전하:siRNA 상의 음전하)에서 중합체를 측정하였다. PRxO729v6 단독 (45 nm) 및 siRNA와 복합체를 형성한 PRxO729v6 (47 nm) (도 3)은 거의 균일한 분포 (PDI <0.1)로 유사한 입도를 나타내었다.
실시예 6: 상이한 전하 비율에서 중합체 PRxO729v6 / siRNA 복합체의 겔 이동 분석 (도 4).
하기 실시예는 중합체 PRxO729v6이 다양한 전하 비율로 siRNA에 결합하여 감소된 전기영동 이동도를 갖는 복합체를 제공한다는 것을 나타내었다.
중합체 siRNA 결합을 겔 전기영동에 의해 분석하였으며 (도 4), 이는 4:1 이상의 중합체/siRNA 전하 비율에서 중합체로의 완전한 siRNA 결합이 발생하였다는 것을 나타내었다.
실시예 7. 중합체 PRxO729v6의 임계 미셀 농도 (CMC) (도 5).
하기 실시예는 중합체 PRxO729v6에 의해 형성된 미셀이 100배 희석에 대해 안정하다는 것을 나타내었다.
중합체 PRxO729v6을 1 mg/mL ± 0.5 M NaCl의 농도에서 PBS 완충액 (pH 7.4)에 용해시켰다. PBS ± 0.5 M NaCl로 1 mg/mL 내지 1.6 ㎍/mL의 일련의 희석물의 5배 범위에 걸쳐 입도를 동적 광산란에 의해 측정하였다. 도 5는 약 45 nm의 입도가 약 10 ㎍/mL의 농도까지 안정하다는 것을 나타낸다. 중합체 PRxO729v6은 약 5 ㎍/mL (CMC) 미만에서 불안정한 것으로 나타났으며, 이 경우 개별 중합체 사슬이 해리하고 비-특이적 응집물을 형성하였다.
실시예 8. 유기 용매 중 중합체 PRxO729v6 입자 안정성 (도 6).
본 실시예는 중합체 PRxO729v6의 미셀 구조가 유기 용매에서 해리되었다는 것을 나타내며, 이는 미셀 코어의 소수성 성질과 일치하였다.
중합체 PRxO729v6을 다양한 유기 용매에서 1 mg/mL의 농도로 용해시키고, 동적 광산란에 의해 입도를 측정하였다. 도 6은 디메틸포름아미드 (DMF)의 증가하는 농도가 응집된 사슬로의 미셀 해리를 제공하였다는 것을 나타낸다.
실시예 9: 배양된 포유동물 세포에서 siRNA-미셀 복합체의 녹다운 활성 (도 7 및 도 12).
PRxO729v6:siRNA 복합체에 의한 처리 24시간 후 특정 유전자 발현을 측정함으로써 96-웰 포맷에서 siRNA/중합체 PRxO729v6 복합체의 녹다운 (KD) 활성을 검정하였다. 중합체 및 GAPDH 표적화 siRNA 또는 음성 대조군 siRNA (암비온)를 25 ㎕로 혼합하여, 다양한 전하 비율 및 최종 형질감염 농도보다 5배 높은 농도를 얻었으며, 10％ FBS를 함유하는 통상적인 매질 100 ㎕ 중 HeLa 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 복합체를 형성하게 하였다. 최종 siRNA 농도를 100, 50, 25 및 12.5 nM에서 평가하였다. 중합체를 4:1, 2:1 또는 1:1 전하 비율로 또는 18, 9, 4.5 및 2.2 ㎍/mL의 고정된 중합체 농도로 첨가하여, 어떤 조건이 최고 KD 활성을 초래하는가를 결정하였다. 전하 비율에 대해 (도 7a), 복합체를 더 높은 농도에서 제조하고, 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포에 첨가하기 직전에 그래프에 나타낸 농도보다 5배 높은 농도로 연속 희석하였다. 고정된 중합체 농도에 대해 (도 7b), siRNA 및 중합체를 그래프에 나타낸 농도보다 5배 높은 농도에서 복합체를 형성시키고, 30분 동안 인큐베이션한 후, 도 7에 나타낸 최종 농도에 대해 세포에 첨가하였다. 도 7c는 음성 대조군이다. 총 RNA를 처리후 24시간에 단리하고, 2개의 내부 표준화 유전자인 RPL13A 및 HPRT에 대한 GAPDH 발현을 정량 PCR에 의해 측정하였다. 도 7 및 도 12a 및 도 12b의 결과는 시험된 모든 siRNA 농도에서 9 ㎍/mL 이상의 PRxO729v6으로 얻은 >60％ KD 활성 (음영)을 나타낸다. 이 농도는 입도 분석으로부터의 안정한 미셀 형성과 일치하였다. 더 낮은 농도 (4.5 ㎍/mL의 고정된 중합체 농도)에서의 복합체 형성과 비교하여 높은 농도 및 일련의 희석된 농도 (4:1 전하 비율)에서 복합체를 제조한 경우에만 4.5 ㎍/mL PRxO729v6/12.5 nM siRNA로 높은 KD 활성이 관찰되었다. 또한, 4.5 ㎍/mL PRxO729v6과의 100 nM siRNA만이 높은 KD 활성을 나타내었고, 더 낮은 siRNA 농도에서는 나타내지 않았다. 요약해서, PRxO729v6 미셀은 약 10 ㎍/mL로의 희석에 대해 안정하였고, 약 5 ㎍/mL 미만에서 KD 활성이 손실되었으며, 이는 양호한 KD 활성을 위해 안정한 미셀이 필요하다는 것을 나타내었다.
실시예 10: 배양된 포유동물 세포에서 다이서 기질 GAPDH siRNA - 중합체 복합체의 녹다운 활성.
중합체:GAPDH 다이서 siRNA 복합체에 의한 처리 24시간 후 GAPDH 유전자 발현을 측정함으로써 96-웰 포맷에서 GAPDH 특이적 다이서 기질 siRNA/중합체 복합체의 녹다운 (KD) 활성을 검정하였다. GAPDH 다이서 siRNA 서열은
센스 가닥:
Figure pct00011
,
안티센스 가닥:
Figure pct00012
이었다. 중합체 및 GAPDH 표적화 siRNA 또는 음성 대조군 siRNA (IDT)를 25 ㎕로 혼합하여, 다양한 전하 비율 및 최종 형질감염 농도보다 5배 높은 농도를 얻었으며, 10％ FBS를 함유하는 통상적인 매질 100 ㎕ 중 HeLa 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 복합체를 형성하게 하였다. 최종 siRNA 농도를 100, 50, 25 및 12.5 nM에서 검사하였다. 중합체를 4:1, 2:1 또는 1:1 전하 비율로 또는 40, 20, 10 및 5 ㎍/mL의 고정된 중합체 농도로 첨가하여, 어떤 조건이 최고 KD 활성을 초래하는가를 결정하였다. 총 RNA를 처리후 24시간에 단리하고, 2개의 내부 표준화 유전자인 RPL13A 및 HPRT에 대한 GAPDH 발현을 정량 PCR에 의해 측정하였다. 결과는 시험된 모든 siRNA 농도에서 10 ㎍/mL 이상의 농도의 중합체로 얻은 >60％ KD 활성을 나타내었다. 이 중합체 농도는 입도 분석으로부터의 안정한 미셀 형성과 일치하였다.
실시예 11: 배양된 포유동물 세포에서 ApoB100 siRNA - 중합체 복합체의 녹다운 활성.
중합체:ApoB siRNA 복합체에 의한 처리 24시간 후 ApoB100 유전자 발현을 측정함으로써 96-웰 포맷에서 중합체와 복합체를 형성한 ApoB100 특이적 siRNA 또는 다이서 기질 siRNA의 녹다운 (KD) 활성을 검정하였다. ApoB100 siRNA 서열은
센스 가닥:
Figure pct00013
,
안티센스 가닥:
Figure pct00014
이었다. ApoB100 다이서 기질 siRNA 서열은
센스 가닥:
Figure pct00015
,
안티센스 가닥:
Figure pct00016
이었다. 중합체 및 ApoB 표적화 siRNA 또는 음성 대조군 siRNA (IDT)를 25 ㎕로 혼합하여, 다양한 전하 비율 및 최종 형질감염 농도보다 5배 높은 농도를 얻었으며, 10％ FBS를 함유하는 통상적인 매질 100 ㎕ 중 HepG2 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 복합체를 형성하게 하였다. 최종 siRNA 농도를 100, 50, 25 및 12.5 nM에서 검사하였다. 중합체를 4:1, 2:1 또는 1:1 전하 비율로 또는 40, 20, 10 및 5 ㎍/mL의 고정된 중합체 농도로 첨가하여, 어떤 조건이 최고 KD 활성을 초래하는가를 결정하였다. 총 RNA를 처리후 24시간에 단리하고, 2개의 내부 표준화 유전자인 RPL13A 및 HPRT에 대한 ApoB100 발현을 정량 PCR에 의해 측정하였다. 결과는 시험된 모든 siRNA 농도에서 10 ㎍/mL 이상의 농도의 중합체로 얻은 >60％ KD 활성을 나타내었다. 이 중합체 농도는 입도 분석으로부터의 안정한 미셀 형성과 일치하였다.
실시예 12: 마우스 모델에서 ApoB100 siRNA - 중합체 복합체의 녹다운 활성.
마우스 모델에서 간 조직에서의 ApoB100 발현 및 혈청 콜레스테롤 수준을 측정함으로써 ApoB100 특이적 siRNA/중합체 복합체의 녹다운 활성을 측정하였다. Balb/C 마우스에게 1:1, 2:1 또는 4:1 전하 비율 (중합체:siRNA)로 중합체와 복합체를 형성한 ApoB 특이적 siRNA 1, 2 또는 5 mg/kg 또는 염수 대조물을 정맥내로 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 최종 투여 후 48시간에, 마우스를 희생시키고, 혈액 및 간 샘플을 단리하였다. 혈청 중 콜레스테롤 수준을 측정하였다. 간으로부터 총 RNA를 단리하고, 2개의 내부 표준화 유전자인 HPRT 및 GAPDH에 대한 ApoB100 발현을 정량 PCR에 의해 측정하였다.
실시예 13. 배양된 포유동물 세포에서 ApoB100 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 - 중합체 복합체의 녹다운 활성.
중합체:ApoB 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 복합체에 의한 처리 24시간 후 ApoB100 유전자 발현을 측정함으로써 96-웰 포맷에서 중합체와 복합체를 형성한 ApoB100 특이적 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드의 녹다운 (KD) 능력을 검정하였다. 마우스 ApoB에 대해 특이적인 2개의 ApoB100 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기와 같았다:
Figure pct00017
, 코딩 영역의 위치 541 및
Figure pct00018
, 코딩 영역의 위치 531.
중합체 및 ApoB 표적화 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 음성 대조군 DNA 올리고뉴클레오티드 (스크램블 서열)를 25 ㎕로 혼합하여, 다양한 전하 비율 및 최종 형질감염 농도보다 5배 높은 농도를 얻었으며, 10％ FBS를 함유하는 통상적인 매질 100 ㎕ 중 HepG2 세포에 첨가하기 전에 30분 동안 복합체를 형성하게 하였다. 최종 올리고뉴클레오티드 농도를 100, 50, 25 및 12.5 nM에서 검사하였다. 중합체를 4:1, 2:1 또는 1:1 전하 비율로 또는 40, 20, 10 및 5 ㎍/mL의 고정된 중합체 농도로 첨가하여, 어떤 조건이 최고 KD 활성을 초래하는가를 결정하였다. 총 RNA를 처리후 24시간에 단리하고, 2개의 내부 표준화 유전자인 RPL13A 및 HPRT에 대한 ApoB100 발현을 정량 PCR에 의해 측정하였다.
실시예 14: 중합체 미셀 및 그의 siRNA 복합체의 막 불안정화 활성의 확인 (도 8).
중합체 단독 또는 PRxO729v6:siRNA 복합체를 인간 적혈구 (RBC)의 제제로 적정하고, 헤모글로빈 방출 (540 nm에서 흡광도 판독)에 의해 막용해 활성을 측정함으로써 pH 반응성 막 불안정화 활성을 검정하였다. 엔도솜 pH 환경을 모방하기 위해 3개의 상이한 pH 조건을 사용하였다 (세포외 pH = 7.4, 초기 엔도솜 = 6.6, 후기 엔도솜 = 5.8). EDTA를 함유하는 배큐테이너(vaccutainer)에 수집된 전혈로부터 원심분리에 의해 인간 적혈구 (RBC)를 단리하였다. RBC를 생리식염수에서 3회 세척하고, 특정 pH (5.8, 6.6 또는 7.4)에서 PBS 중 2％ RBC의 최종 농도로 만들었다. 도시된 바와 같이 임계 미셀 농도 (CMC) 바로 위 및 바로 아래 농도에서 PRxO729v6 단독 또는 PRxO729v6/siRNA 복합체를 시험하였다 (도 5). 중합체/siRNA 복합체에 대해, 25 nM siRNA를 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1 전하 비율 (중합체 단독의 경우와 동일한 중합체 농도)로 PRxO729v6에 첨가하였다. 20X 최종 검정된 농도에서 30분 동안 중합체 단독 또는 중합체-siRNA 복합체의 용액을 형성시키고, 각 RBC 제제로 희석하였다. PRxO729v6 중합체 스톡의 2개의 상이한 제제를 제조후 9일 및 15일 (제조일로부터 4℃에서 저장함)에 활성의 안정성에 대해 비교하였다. 중합체 단독 또는 중합체/siRNA 복합체와 함께 RBC를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 원심분리하여, 무손상 RBC를 제거하였다. 상등액을 큐벳으로 이동시키고, 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. 용혈률 (％)를 샘플 A540/1％ 트리톤(Triton) X-100 처리된 RBC의 A540 (100％ 용해에 대한 대조물)로서 표시하였다. 결과는 PRxO729v6 단독 (도 8a) 또는 PRxO729v6/siRNA 복합체 (도 8b)가 pH 7.4에서 비용혈성이고, 엔도솜과 관련된 더 낮은 pH 값에서 및 중합체의 더 높은 농도에서 점점 더 보다 용혈성이 되었다는 것을 나타내었다.
실시예 15: 중합체 PRxO729v6의 투과 전자 현미경검사 (TEM) 분석 (도 9).
본 실시예는 전자 분광법을 이용하여 중합체 PRxO729v6이 구형 미셀형 입자를 형성한다는 증거를 제공한다.
PBS 중 중합체 PRxO729v6의 0.5 mg/mL 용액을 탄소 코팅된 구리 격자에 30분 동안 적용하였다. 격자를 카노브스키 용액에서 고정시키고, 카코딜레이트 완충액에서 1회 및 이어서 물에서 8회 세척하였다. 격자를 우라닐 아세테이트의 6％ 용액으로 15분 동안 염색한 후, 분석까지 건조시켰다. 투과 전자 현미경검사 (TEM)을 JEOL 현미경에서 수행하였다. 도 9는 동적 광산란에 의해 용액에서 측정된 것에 대해 미셀 코어의 기대 치수와 유사한 근사 치수를 갖는 구형 입자를 나타내는, 중합체 PRxO729v6의 전형적인 전자 현미경사진을 나타낸다.
실시예 16. 중합체-siRNA 복합체의 세포 유입 및 세포내 분포의 형광 현미경검사 (도 10).
본 실시예는 중합체 PRxO729v6이 지질-기재 형질감염 시약보다 형광-표지된 siRNA의 보다 효율적인 세포내 유입 및 엔도솜 방출을 매개할 수 있다는 것을 나타내었다.
HeLa 세포를 Lab-Tek II 챔버 내의 커버글라스 상에 플레이팅하였다. 밤새 인큐베이션 후, 중합체-siRNA 4:1 전하 비율에서 100 nM FAM-siRNA/리포펙타민 2000 또는 100 nM FAM-siRNA로 세포를 형질감염시켰다. 5X 농도에서 30분 동안 PBS (pH 7.4)에서 복합체를 형성시키고, 최종 1X 농도에 대해 세포에 첨가하고, 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 DAPI로 10분 동안 염색한 후 (핵의 시각화를 위함), 3.7％ 포름알데히드-1X PBS에서 5분 동안 고정시키고, PBS로 세척하였다. 샘플을 자이스(Zeiss) 액시오버트(Axiovert) 형광 현미경으로 영상화하였다. 도 10b는 리포펙타민 (도 10a)과 비교하여 중합체-siRNA의 세포 유입 및 세포내 분포의 형광 현미경검사를 나타낸다. 리포펙타민-siRNA 복합체의 미립자 염색은 엔도솜 위치를 제안한 반면, 중합체-siRNA 복합체의 미만성 세포질 염색은 이것이 엔도솜으로부터 세포질로 방출되었음을 나타내었다.
실시예 17. 중합체 PRxO729v6 미셀로의 소수성 소분자의 유입.
본 실시예는 소수성 소분자가 중합체 PRxO729v6의 우세하게 소수성인 미셀 코어에 의해 흡수된다는 것을 나타내었다.
siRNA를 갖는 또는 갖지 않는 중합체 미셀의 형성을 피렌 (C16H10, MW = 202)을 사용한 형광 프로브 기술에 의해 확인하였으며, 여기서 미셀 코어로의 피렌의 분배는 피렌 스펙트럼의 2개의 방출 최대치의 비율을 사용하여 결정하였다. 6 x 10-7 M의 불변 피렌 농도로 395 nm의 고정된 여기 파장을 사용하여 300 내지 360 nm에서 중합체 미셀 용액 중 피렌의 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 100 nM siRNA를 갖는 또는 갖지 않는 중합체는 0.001％ 내지 20％ (w/w)로 다양하였다. 바리안(Varian) 형광 분광광도계를 이용하여 스펙트럼 데이터를 획득하였다. 모든 형광 실험을 25℃에서 수행하였다. 중합체 농도의 함수로서 강도 비율 I336/I333을 플롯팅하여 임계 미셀 농도 (CMC)를 결정하였다. CMC 값은 대략 2 ㎍/mL로 계산되었다.
유사하게, 모델 소분자 약물, 디피리다몰 (2-{[9-(비스(2-히드록시에틸)아미노)-2,7-비스(1-피페리딜)-3,5,8,10-테트라아자바이시클로[4.4.0]데카-2,4,7,9,11-펜타엔-4-일]-(2-히드록시에틸)아미노}에탄올; C24H40N8O4, MW = 505)을 하기와 같이 PRxO729v6의 미셀 코어에 혼입하였다. 중합체 (1.0 mg) 및 디피리다몰 (DIP) (0.2 mg)을 THF (0.5 mL)에 용해시켰다. 탈이온수 (10 mL)를 적가하고, 용액을 50℃에서 6시간 동안 교반하여, 미셀의 소수성 코어에 약물을 혼입하였다. 용액 (2.5 mL)을 나누고, 25 및 37℃에서 UV-vis 분광법에 의해 415 nm에서 디피리다몰의 흡광도를 측정하였다. 공중합체의 부재 하에 탈이온수 중 디피리다몰 흡광도의 시간-의존적 감소를 측정함으로써 대조 측정을 또한 수행하였다. 각 시점에 대한 25 및 37℃ 둘 다에서의 흡광도를 측정하고, 용액에서 관찰된 값으로부터 상기 값을 공제하였다.
실시예 18. 중합체 구조에 대한 pH의 효과 (도 11).
본 실시예는 pH를 7.4로부터 4.7로 낮추는 경우 중합체 PRxO729v6.2의 미셀 구조가 해리된다는 것을 나타내었다.
0.5 mg/mL 내지 0.004 mg/mL의 5배 일련의 희석에서 PBS 중 pH 4.7까지의 일련의 산성 pH 값 및 pH 7.4에서 동적 광산란에 의해 중합체 PRxO729v6.2의 입도를 측정하였다. 도 11a는 pH 7.4에서 중합체가 응집물을 생성하는 형태로 해리하기 시작하는 4 ㎍/mL까지의 희석에 대해 안정하다는 것을 나타낸다. 도 11b는 pH 4.7까지의 점점 더 산성인 pH 값에서 미셀 구조로부터의 중합체 해리가 향상되고 (즉, 더 높은 중합체 농도에서 발생함), 1 내지 8 nm 크기의 중합체 단량체의 증가하는 수준을 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 19: 공중합체로의 표적화 리간드 및 폴리뉴클레오티드의 접합 방법
하기 실시예는 이블록 공중합체로의 표적화 리간드 (예를 들어, 갈락토스) 또는 폴리뉴클레오티드 치료제 (예를 들어, siRNA)의 접합 방법을 나타낸다. (1) 가역적 부가 쪼개짐 사슬 이동 (RAFT) (문헌 [Chiefari et al. Macromolecules. 1998;31(16):5559-5562])을 이용하여 중합체를 제조하여, R-기 치환체로서 갈락토스를 갖는 사슬 이동제를 사용하여 갈락토스 말단-관능화된 이블록 공중합체를 형성시켰다. (2) 메틸아크릴산-N-히드록시 숙신이미드 (MAA(NHS))를 함유하는 공중합체로서 이블록 공중합체의 제1 블록을 제조하였다 (여기서, 갈락토스-PEG-아민은 NHS 기에 접합되거나, 아미노-디술피드 siRNA는 NHS에 접합되거나, 또는 피리딜 디술피드 아민은 NHS 기와 반응하여, 피리딜 디술피드를 형성하며, 이는 후속적으로 티올화된 RNA와 반응하여 중합체-RNA 접합체를 형성함).
실시예 19.1: 갈락토스-PEG-아민 및 갈락토스-CTA의 제조.
반응식 1은 갈락토스-PEG-아민 (화합물 3) 및 갈락토스-CTA (사슬 이동제) (화합물 4)에 대한 합성 반응식을 예시한다.
화합물 1: 펜타아세테이트 갈락토스 (10 g, 25.6 mmol) 및 2-[2-(2-클로로에톡시)에톡시]에탄올 (5.6 mL, 38.4 mmol)을 건조 CH2Cl2 (64 mL)에 용해시키고, 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. BF3.OEt2 (9.5 mL, 76.8 mmol)를 빙조에서 이전 혼합물에 1시간에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 실온 (RT)에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 후, CH2Cl2 30 mL를 첨가하여 반응물을 희석하였다. 유기층을 포화 NaHCO3( aq )로 중화시키고, 염수로 세척한 후, MgSO4에 의해 건조시켰다. CH2Cl2를 감압 하에 제거하여, 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 최종 생성물 1을 약한 황색 오일로서 얻었다. 수율: 55％ TLC (I2 및 p-아니스알데히드): EA/Hex :1/1 (Rf: β = 0.33; α = 0.32; 미반응 S.M 0.30).
화합물 2: 화합물 1 (1.46 g, 2.9 mmol)을 건조 DMF (35 mL)에 용해시키고, NaN3 (1.5 g, 23.2 mmol)을 RT에서 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 85 내지 90℃로 가열하였다. 반응 후, EA (15 mL)를 용액에 첨가하고, 물 (50 mL)을 사용하여 유기층을 5회 세척하였다. 유기층을 MgSO4에 의해 건조시키고, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물 2를 무색 오일로서 얻었다. 수율: 80％, TLC (I2 및 p-아니스알데히드): EA/Hex :1/1 (Rf: 0.33).
화합물 3: 화합물 2 (1.034 g, 2.05 mmol)를 MeOH (24 mL)에 용해시키고, 10분 동안 N2로 버블링한 후, Pd/C (10％) (90 mg) 및 TFA (80 ㎕)를 이전 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 다시 30분 동안 H2로 버블링한 후, 반응물을 추가의 3시간 동안 RT에서 H2 하에 교반하였다. 셀라이트에 의해 Pd/C를 제거하고, MeOH를 증발시켜, 화합물 3을 점성 겔로서 얻었다. 화합물 3을 추가 정제 없이 사용할 수 있었다. 수율: 95％. TLC (p-아니스알데히드): MeOH/CH2Cl2 : 1/4 (Rf: 0.05).
화합물 4: ECT (0.5 g, 1.9 mmol), NHS (0.33 g, 2.85 mmol) 및 DCC (0.45 g, 2.19 mmol)를 0℃에서 CHCl3 (15 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 계속 교반하였다. CHCl3 (10 mL) 중 화합물 3 (1.13 g, 1.9 mmol) 및 TEA (0.28 mL, 2.00 mmol)를 0℃에서 이전 반응물에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 계속 교반하였다. CH3Cl을 감압 하에 제거하고, 조 생성물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여, 화합물 4를 황색 겔로서 얻었다. 수율 (35％). TLC : MeOH/CH2Cl2 : 1/9 (Rf : 0.75).
<반응식 1: 갈락토스-PEG-아민 (cpd 3) 및 갈락토스-CTA (cpd 4)의 합성>
Figure pct00019
실시예 19.2: [DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]의 합성
A. DMAEMA 매크로CTA의 합성.
중합: 20 mL 유리 바이알 (격막 캡을 가짐)에, 33.5 mg ECT (RAFT CTA), 2.1 mg AIBN (메탄올로부터 2회 재결정함), 3.0 g DMAEMA (알드리히, 98％, 억제제를 제거하기 위해 사용 직전에 작은 알루미나 컬럼을 통해 통과시킴) 및 3.0 g DMF (억제제 없이 고순도)를 첨가하였다. 유리 바이알을 격막 캡으로 폐쇄하고, 30분 동안 건조 질소로 퍼징하였다 (교반 하에 빙조에서 수행함). 반응 바이알을 70℃에서 예비가열된 반응 블록에 위치시켰다. 반응 혼합물을 2시간 40분 동안 교반하였다. 격막 캡을 개방하고, 혼합물을 2 내지 3분 동안 빙조에서 바이알에서 교반하여, 중합 반응을 중지시켰다.
정제: 아세톤 3 mL를 반응 혼합물에 첨가하였다. 300 mL 비이커에 헥산 240 mL 및 에테르 60 mL (80/20 (v/v))를 첨가하고, 교반 하에 반응 혼합물을 비이커에 적가하였다. 초기에, 이는 오일을 생성하였으며, 혼탁 용액을 회전 침강시켜 이를 수집하였다; 수율 = 1.35 g (45％). 아세톤 용액으로부터 헥산/에테르 (80/20 (v/v)) 혼합된 용매에서 수회 침전을 수행하였다 (예를 들어, 6회). 최종적으로, 중합체를 진공 하에 8시간 동안 RT에서 건조시켰다; 수율
Figure pct00020
1 g.
요약: (Mn,이론 = 45％ 전환에서 11,000 g/mol).
Figure pct00021
DMF = 3.0 g; N2 퍼징: 30분; 70℃에서 2시간 45분 동안 중합 수행.
B. DMAEMA 매크로CTA로부터 [BMA-PAA-DMAEMA]의 합성
달리 명시하지 않는 한 모든 화학물질 및 시약을 시그마-알드리히 캄파니(Sigma-Aldrich Company)로부터 구매하였다. 부틸 메타크릴레이트 (BMA) (99％), 2-(디메틸아미노) 에틸 메타크릴레이트 (DMAEMA) (98％)를 염기성 알루미나의 컬럼 (150 메쉬)을 통해 통과시켜, 중합 억제제를 제거하였다. 억제제를 함유하지 않는 2-프로필 아크릴산 (PAA) (>99％)을 구매하고, 받은 채로 사용하였다. 아조비스이소부티로니트릴 (AIBN) (99％)을 메탄올로부터 재결정화하고, 진공 하에 건조시켰다. DMAEMA 매크로CTA를 합성하고, 상기 기재된 바와 같이 정제하였다 (Mn~10000; PDI~1.3; > 98％). N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (99.99％) (EMD로부터 구매함)는 시약 등급이었고, 받은 채로 사용하였다. 헥산, 펜탄 및 에테르를 EMD로부터 구매하였으며, 중합체 정제를 위해 받은 채로 사용하였다.
중합: BMA (2.1 g, 14.7 mmol), PAA (0.8389 g, 7.5 mmol), DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmol), 매크로CTA (0.8 g, 0.0816 mmol), AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmol; CTA:AIBN 10:1) 및 DMF (5.34 mL)를 질소 하에 밀봉된 바이알에 첨가하였다. 사용된 CTA:단량체 비율은 1:360이었다 (50％ 전환 가정). 단량체 농도는 3 M이었다. 그 후, 혼합물로 30분 동안 질소를 버블링하여 혼합물을 탈기시킨 후, 히터 블록 (온도계: 67℃; 디스플레이: 70-71; 교반 속도 300-400 rpm)에 위치시켰다. 6시간 동안 반응시킨 후, 바이알을 얼음에 위치시키고 혼합물을 공기에 노출시켜 중지시켰다.
정제: 아세톤/DMF 1:1로부터 헥산/에테르 75/25로 중합체 정제를 수행하였다 (3회). 생성된 중합체를 진공 하에 18시간 이상 동안 건조시켰다. NMR 스펙트럼은 고순도의 중합체를 나타내었다. 비닐 기는 관찰되지 않았다. 중합체를 에탄올로부터 4일 동안 이중 탈이온수에 대해 투석한 후, 동결건조시켰다. 하기 조건을 이용하여 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 중합체를 분석하였다: 용매: DMF/LiBr 1％. 유속: 0.75 mL/분. 주입 부피: 100 ㎕.
컬럼 온도: 60℃. 폴리(스티렌)을 사용하여 검출기를 보정하였다. 생성된 중합체의 GPC 분석: Mn = 40889 g/mol. PDI = 1.43. dn/dc = 0.049967.
실시예 19.3. gal-[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]의 합성
실시예 19.2에 기재된 바와 같이 합성을 수행하였다. 먼저, 사슬 이동제로서 ECT 대신에 갈락토스-CTA (실시예 19.1, cpd 4)를 사용한 것을 제외하고 갈락토스-DMAEMA 매크로-CTA를 제조하였다 (실시예 19.2.A.). 이는 말단 관능화된 갈락토스를 갖는 폴리DMAEMA의 합성을 제공하였다 (도 13). 그 후, 실시예 19.2.B.에 기재된 바와 같이 갈락토스-[DMAEMA]-매크로-CTA를 사용하여 제2 블록 [BMA-PAA-DMAEMA]를 합성하였다. 합성 후, 100 mM 중탄산나트륨 완충액 (pH 8.5)에서 2시간 동안 인큐베이션, 이어서 투석 및 동결건조에 의해 갈락토스 상의 아세틸 보호기를 제거하였다. NMR 분광법을 이용하여, 중합체 상의 탈보호된 갈락토스의 존재를 확인하였다.
실시예 19.4. [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 및 DMAEMA-MMA(NHS)-[B-P-D] 이블록 공중합체의 제조 및 특성화.
도 14에는 [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체 (여기서, 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율은 70:30임)의 합성을 요약하고, 도 15에는 [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 중합체 (여기서, 제1 블록 내의 단량체의 공중합체 비율은 70:30임)의 특성화를 요약한다.
실시예 19.5. [PEGMA-MAA(Gal)]-[B-P-D] 중합체를 제조하기 위한 PEGMA-MAA(NHS)로의 갈락토스-PEG-아민의 접합.
도 16은 갈락토스 관능화된 DMAEMA-MAA(NHS) 또는 PEGMA-MAA(NHS) 이블록 공중합체의 제조를 예시한다. 중합체 [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] 또는 [PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]를 DMF에 1 내지 20 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 실시예 19.1에 기재된 바와 같이 제조된 갈락토스-PEG-아민 (cpd 3)을 1 내지 2 당량의 트리에틸아민으로 중화시키고, 5 대 1의 아민 대 중합체 비율로 반응 혼합물에 첨가하였다. 35℃에서 6 내지 12시간 동안 반응을 수행한 후, 동등한 부피의 아세톤을 첨가하고, 1일 동안 탈이온수에 대해 투석하고, 동결건조시켰다.
실시예 19.6. [PEGMA-MAA(RNA)]-[B-P-D] 중합체를 제조하기 위한 PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]로의 siRNA의 접합
도 17a 및 17b는 NHS 함유 중합체에 접합될 수 있는 2개의 변형된 siRNA의 구조를 나타낸다. siRNA를 애질런트 (미국 콜로라도주 볼더)로부터 얻었다. 도 17c는 티올화된 RNA (도 17b)의 접합을 위한 디술피드 반응성 기를 제공하기 위해 NHS 함유 중합체를 유도체화하기 위해 사용된 피리딜 디술피드 아민의 구조를 나타낸다.
아미노-디술피드-siRNA와 NHS 함유 중합체의 반응. 35℃에서 4 내지 8시간 동안 유기 용매 (예를 들어, DMF 또는 DMSO 또는 혼합된 용매 DMSO/완충액 (pH 7.8))로 구성된 표준 조건 하에 반응을 수행한 후, 동등한 부피의 아세톤을 첨가하고, 1일 동안 탈이온수에 대해 투석하고, 동결건조시켰다.
피리딜-디술피드-아민과 NHS 함유 중합체의 반응 및 티올화된 siRNA와의 반응. NHS 함유 중합체와 피리딜 디술피드 아민의 반응을 수행하였다. 후속적으로, 동결건조된 중합체를 에탄올에 50 mg/mL로 용해시키고, 중탄산나트륨 완충액 (pH 8)에서 10배 희석하였다. 티올화된 siRNA (도 16b)를 35℃에서 4 내지 8시간 동안 중합체 NHS 기에 대해 2 내지 5 몰 과량으로 반응시킨 후, 포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 대해 투석하였다.
실시예 21.7. 피리딜-디술피드 변형된 중합체로의 치료학적 펩티드의 접합.
실시예 21.6에 기재된 피리딜-디술피드 변형된 중합체인 PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]를 또한 치료학적 펩티드 (도 17d)로의 접합을 위해 사용할 수 있었다. 펩티드를 합성하고, 접합을 위해 준비하고, 하기 기재된 바와 같이 접합 반응을 수행하여, [PEGMA-MAA(펩티드)]-[B-P-D] 중합체를 제조하였다.
펩티드 형질도입 도메인 펩티드 트랜스포틴 (또한 안테나페디아 펩티드 (Antp) 서열이라고 공지됨)과의 융합을 이용하여, 카르복시-말단 시스테인 잔기를 함유하는 Bak-BH3 펩티드 (Antp-BH3)의 세포 내재화 형태를 합성하였다 (
Figure pct00022
). 접합을 위한 유리 티올을 확실하게 하기 위해, 펩티드를 물에서 재구성하고, 아가로스 겔 내에 고정된 디술피드 환원제 TCEP로 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 환원된 펩티드 (400 μM)를, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 함유하는 포스페이트 완충액 (pH 7)에서 피리딜 디술피드 말단-관능화된 중합체와 24시간 동안 반응시켰다.
펩티드 시스테인과 피리딜 디술피드 중합체 말단 기의 반응은 2-피리딘티온을 생성시켰으며, 이를 분광광도법으로 측정하여 접합 효율을 특성화할 수 있었다. 디술피드 교환을 추가로 확인하기 위해, 접합체를 SDS-PAGE 16.5％ 트리신 겔 상에서 실행하였다. 병행하여, 환원 환경에서 중합체로부터 펩티드의 방출을 입증하기 위해 접합 반응의 분취액을 SDS-PAGE 전에 고정된 TCEP로 처리하였다.
접합 반응을 1, 2 및 5의 중합체/펩티드 화학량론에서 수행하였다. 2-피리딘티온 방출에 대한 343 nm에서의 UV 분광광도법 흡광도 측정치는 접합 효율을 나타내었다. 펩티드-중합체 접합체를 추가로 특성화하기 위해 SDS PAGE 겔을 사용하였다. 1의 중합체/펩티드 몰비에서, 검출가능한 양의 펩티드는 말단 시스테인을 통한 디술피드 가교를 통해 이량체를 형성하였다. 그러나, 피리딜 디술피드로의 티올 반응이 유리하였고, 유리 펩티드 밴드는 2 이상의 중합체/펩티드 비율에서 더이상 가시적이 아니었다. 접합체를 환원제 TCEP로 처리함으로써, 이들 샘플에서 펩티드 밴드의 출현에 의해 표시되는 바와 같이, 중합체-펩티드 디술피드 결합을 절단하는 것이 가능하였다.

Claims (78)

  1. a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링(assembling)된,
    i. 하나 이상의 소수성 블록; 및
    ii. 대략 중성의 pH에서 제1 음이온성 종을 포함하는 다수의 단량체 단위
    를 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
    b. 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 중합체 캐리어.
  2. 제1항에 있어서, 제1 음이온성 종이 약 5.0 내지 약 6.5의 pH에서 실질적으로 중성이거나 대전되지 않은 중합체 캐리어.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드인 중합체 캐리어.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 유전자 발현 조정인자인 중합체 캐리어.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 녹다운(knockdown) 작용제인 중합체 캐리어.
  6. 제5항에 있어서, 녹다운 작용제가 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 다이서(dicer) 기질, miRNA, aiRNA 또는 shRNA인 중합체 캐리어.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 부분을 추가로 포함하는 중합체 캐리어.
  8. 제7항에 있어서, 표적화 부분이 중합체 캐리어의 쉘 부분에 부착되어 있는 중합체 캐리어.
  9. 제8항에 있어서, 표적화 부분이 중합체에 대한 공유 결합에 의해 쉘 부분에 부착되어 있는 중합체 캐리어.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 구배(gradient) 중합체인 중합체 캐리어.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체가 2 미만, 1.8 미만, 1.5 미만, 1.4 미만, 또는 1.3 미만의 다분산 지수를 갖는 중합체 캐리어.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 중합체가 미셀로 어셈블링된 중합체 캐리어.
  13. 제1항에 있어서, 막 불안정화성인 중합체 캐리어.
  14. 제1항에 있어서, 소수성 블록이 다수의 제1 대전가능한 종을 포함하는 중합체 캐리어.
  15. 제14항에 있어서, 다수의 제1 대전가능한 종이 엔도솜 pH에서 실질적으로 대전되지 않은 중합체 캐리어.
  16. 제14항에 있어서, 다수의 제1 대전가능한 종이 약 6 이하의 pH에서 실질적으로 대전되지 않은 중합체 캐리어.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 블록의 일부이거나 소수성 블록에 추가로 존재하는 다수의 소수성 단량체 단위를 추가로 포함하는 중합체 캐리어.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 중합체가 중합체 캐리어로 자발적으로 자가-어셈블링된 중합체 캐리어.
  19. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 중합체의 블록인 중합체 캐리어.
  20. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체 캐리어의 쉘이 폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어.
  21. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다수의 중합체가 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록을 포함하는 중합체 캐리어.
  22. 제21항에 있어서, 중합체 캐리어의 쉘이 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록을 포함하는 중합체 캐리어.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 공유 결합, 비-공유 상호작용, 또는 이들의 조합에 의해 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록에 부착되어 있는 중합체 캐리어.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 대략 중성의 pH 및/또는 대략 엔도솜 pH에서 대전되지 않은 중합체 캐리어.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 대략 중성의 pH 및/또는 대략 엔도솜 pH에서 다가음이온성인 중합체 캐리어.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 대략 중성의 pH 및/또는 대략 엔도솜 pH에서 쯔비터이온성인 중합체 캐리어.
  27. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 대략 중성의 pH 및/또는 대략 엔도솜 pH에서 다가양이온성인 중합체 캐리어.
  28. 제27항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 x개의 음이온을 포함하는 다가음이온이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록은 약 0.7ㆍx개 이상의 양이온을 포함하는 중합체 캐리어.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 단독중합체 블록인 중합체 캐리어.
  30. 제29항에 있어서, 단독중합체 블록이 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트, 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 또는 폴리-N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트인 중합체 캐리어.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 (i) 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트 단량체 단위, 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 하나 이상의 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트, 또는 이들의 조합; 및 (ii) 하나 이상의 스페이서 단량체 단위를 포함하는 중합체 캐리어.
  32. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 음이온성 종이 카르복실산 기, 술폰아미드 기, 보론산 기, 술폰산 기, 술핀산 기, 황산 기, 인산 기, 포스핀산 기, 또는 아인산 기, 또는 이들의 접합체 염기인 중합체 캐리어.
  33. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 블록이 하나 이상의 스페이서 단량체 단위를 추가로 포함하는 중합체 캐리어.
  34. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 블록이 제2 대전가능한 종을 추가로 포함하는 중합체 캐리어.
  35. 제34항에 있어서, 제2 대전가능한 종이 양성자화에 따른 양이온성 종인 중합체 캐리어.
  36. 제35항에 있어서, 양이온성 종의 pKa가 약 6.5 내지 약 9인 중합체 캐리어.
  37. 제36항에 있어서, 제2 대전가능한 종이 비시클릭(acyclic) 아민 또는 이민, 시클릭 아민 또는 이민, 또는 질소 함유 헤테로아릴인 중합체 캐리어.
  38. 제34항에 있어서, 하나 이상의 제1 대전가능한 종 및 하나 이상의 제2 대전가능한 종이 단일 단량체 단위 상에 존재하는 중합체 캐리어.
  39. 제34항에 있어서, 제1 대전가능한 종이 제1 대전가능한 단량체 단위 상에서 나타나고, 제2 대전가능한 종이 제2 대전가능한 단량체 단위 상에 있는 중합체 캐리어.
  40. 제34항에 있어서, 제1 대전가능한 종이 탈양성자화에 따른 음이온성 종이고, 제2 대전가능한 종이 양성자화에 따른 양이온성 종이며, 여기서 음이온성 종 대 양이온성 종의 비율은 대략 중성의 pH에서 약 1:4 내지 약 4:1인 중합체 캐리어.
  41. 제39항에 있어서, 제1 대전가능한 단량체 단위 대 제2 대전가능한 단량체 단위의 비율이 약 1:4 내지 약 4:1인 중합체 캐리어.
  42. 제39항에 있어서, 제1 대전가능한 단량체 단위가 (C2-C8)알킬아크릴산인 중합체 캐리어.
  43. 제39항에 있어서, 제2 대전가능한 단량체 단위의 50％ 미만이 pH 약 8에서 양이온성 종으로 대전되는 중합체 캐리어.
  44. 제39항에 있어서, 제2 대전가능한 단량체 단위가 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-에타크릴레이트, N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-메타크릴레이트, 또는 N,N-디(C1-C6)알킬-아미노(C1-C6)알킬-아크릴레이트인 중합체 캐리어.
  45. 제1항에 있어서, 소수성 블록이 하나 이상의 비-대전가능한 단량체 단위를 포함하는 중합체 캐리어.
  46. 제45항에 있어서, 비-대전가능한 단량체 단위가 (C2-C8)알킬-에타크릴레이트, (C2-C8)알킬-메타크릴레이트, 또는 (C2-C8)알킬-아크릴레이트인 중합체 캐리어.
  47. 제1항에 있어서, 중합체가 스페이서 블록을 추가로 포함하는 중합체 캐리어.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서의 평균 유체역학 직경이 약 10 nm 내지 약 200 nm인 중합체 캐리어.
  49. 제48항에 있어서, pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서의 평균 유체역학 직경이 약 20 nm 내지 약 100 nm인 중합체 캐리어.
  50. 제49항에 있어서, pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서의 평균 유체역학 직경이 약 30 nm 내지 약 80 nm인 중합체 캐리어.
  51. 제5항에 있어서, 녹다운 작용제가 siRNA인 중합체 캐리어.
  52. 제51항에 있어서, 1 내지 5개의 siRNA를 포함하는 중합체 캐리어.
  53. 제51항에 있어서, 5 내지 10개의 siRNA를 포함하는 중합체 캐리어.
  54. 제51항에 있어서, 10 내지 100개의 siRNA를 포함하는 중합체 캐리어.
  55. 제20항에 있어서, 소수성 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 수평균 분자량의 비율이 약 1:1 내지 약 5:1인 중합체 캐리어.
  56. 제20항에 있어서, 소수성 블록의 수평균 분자량 대 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록의 수평균 분자량의 비율이 약 2:1인 중합체 캐리어.
  57. 제20항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 siRNA 캐리어 블록인 중합체 캐리어.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 약 7,000 달톤 내지 약 40,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  59. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 약 10,000 달톤 내지 약 20,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  60. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록이 약 10,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  61. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA 캐리어 블록이 약 20,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  62. 제1항에 있어서, 소수성 블록이 약 10,000 달톤 내지 약 100,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  63. 제62항에 있어서, 소수성 블록이 약 20,000 달톤 내지 약 50,000 달톤의 수평균 분자량 (Mn)을 갖는 중합체 캐리어.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, pH 약 7.4에서 안정한 중합체 캐리어.
  65. 제65항에 있어서, pH 약 7.4에서보다 pH 약 5.8에서 실질적으로 덜 안정한 중합체 캐리어.
  66. 제65항에 있어서, 중합체 캐리어가 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 중합체 캐리어의 90％ 초과가 pH 약 5.8 및 약 18 ㎍/mL의 농도에서 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 능력을 상실하고, 중합체 캐리어의 10％ 미만이 pH 약 7.4 및 약 18 ㎍/mL의 농도에서 폴리뉴클레오티드를 세포로 전달하는 능력을 상실하는 중합체 캐리어.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 50％ 인간 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 이상의 인간 혈장에서 2시간 이상 동안, 50％ 마우스 혈청에서 2시간 이상 동안, 50％ 마우스 혈장에서 2시간 이상 동안, 또는 이들의 조합으로 안정한 중합체 캐리어.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 2종 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제1 대전가능한 종을 포함하며, 여기서 각각의 제1 대전가능한 종은 음이온성 종으로 대전되거나 대전가능한 중합체 캐리어.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제2 대전가능한 종을 포함하며, 여기서 각각의 제2 대전가능한 종은 양이온성 종으로 대전되거나 대전가능한 중합체 캐리어.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 블록이 5개 초과, 20개 초과, 50개 초과, 또는 100개 초과의 제1 대전가능한 종을 포함하며, 여기서 각각의 제1 대전가능한 종은 음이온성 종으로 대전되거나 대전가능한 중합체 캐리어.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 블록이 공중합체 블록인 중합체 캐리어.
  73. a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
    i. 대략 중성의 pH에서 음이온성인 다수의 종을 포함하는 하나 이상의 소수성 블록; 및
    ii. 대략 중성의 pH에서 다가양이온성인 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록
    을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
    b. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 중합체 캐리어.
  74. 제73항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는 중합체 캐리어.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 하나 이상의 소수성 블록이 대략 중성의 pH에서 다수의 양이온성 종을 포함하는 중합체 캐리어.
  76. a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
    i. 대략 중성의 pH에서 음이온성인 다수의 종을 포함하는 하나 이상의 소수성 블록; 및
    ii. 폴리뉴클레오티드 캐리어 블록
    을 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
    b. 중합체 캐리어의 코어 내에 존재하지 않는 10개 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 중합체 캐리어.
  77. 제76항에 있어서, 20개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 중합체 캐리어.
  78. a. 코어 및 쉘을 포함하는 중합체 캐리어로 어셈블링된,
    i. 하나 이상의 소수성 블록; 및
    ii. 대략 중성의 pH에서 음이온성인 다수의 종을 포함하는 다수의 단량체 단위
    를 포함하는 블록 공중합체인 다수의 중합체; 및
    b. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드
    를 포함하며, pH 약 7.4에서 수성 매질 중에서의 유체역학 직경이 약 10 nm 내지 약 200 nm인 중합체 캐리어.
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