MX2010012236A - Portador polimerico. - Google Patents

Portador polimerico.

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Anna Gall
Patrick S Stayton
Allan S Hoffman
Anthony J Convertine
Craig L Duvall
Danielle Benoit
Robert Overell
Mary Prieve
Amber Paschal
Charbel Diab
Priyadarsi De
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Abstract

Se proporcionan en la presente portadores poliméricos adecuados para el suministro de polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) y/u otros agentes terapéuticos a una célula viva.

Description

PORTADOR POLIMÉRICO REFERENCIA CRUZADA Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos ¡Núm. 61/052,908, presentada el 13 de mayo de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/052; 914, presentada el 13 de mayo de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/091,294, presentada el 2!2 de agosto de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Uñidos Núm. 61/112,054, presentada el 6 de noviembre de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/140,779, presentada el 24 de diciembre de ¿008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos i Núm. 61/171,358, presentada el 21 de abril de 2009, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia. ! DECLARACIÓN DE INVESTIGACIÓN PATROCINADA POR i EL GOBIERNO FEDERAL ¡ Esta invención se creó con el apoyo del gobierno federal de conformidad con el Contrato :Núm.
NIH1RO1EB002991 , adjudicado por los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN En ciertos casos, es conveniente suministrar polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a las células vivas. En algunos casos, el suministro de estos polinucleótidos a una célula viva aporta un beneficio terapéutico .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se describen aquí composiciones para introducir en una célula al menos un nucleótido y/u otro agente o principio activo terapéutico (es decir, suministro intracelular) . En ciertas modalidades, este suministro intracelular es in vitro y en otras modalidades es in vivo. En ciertas modalidades, las composiciones para suministro comprenden polímeros, que incluyen vehículos o portadores poliméricos. Como opción, estos portadores poliméricos se presentan en forma de micelas y en particular, auténticas micelas. Así, se describen aquí portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) en combinación con al menos un nucleótido y/u otro agente o principio activo terapéutico. Estas combinaciones, opcionalmente , se encuentran en forma de interacciones covalentes y/o no covalentes. Como opción, estas combinaciones también incluyen agentes adicionales, por ejemplo, agentes para dirigir las combinaciones a una célula deseada. También se describen aquí, usos de estas composiciones de suministro intracelular con fines terapéuticos y/o de diagnóstico. Estos usos incluyen la alteración de la expresión genética en la célula, · por ejemplo, el silenciamiento (knock-down) o la activación de un gen en la célula.
En ciertas modalidades se proporciona en la presente un portador polimérico que comprende: (i)! una J pluralidad de polímeros ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los polímeros comprenden: al menos una porción hidrofóbica; una pluralidad de unidades monoméricas que contienen una primera especie aniónica; a un pH aproximado al neutro; y (ii) al menos un nucleótido: (por ejemplo, al menos un polinucleótido) . En ciertas i modalidades, los polímeros incluyen copolíméros, copolímeros de bloque o lo similar. Cuando el pH ¡ está i aproximadamente al valor pKa de una especie susceptible de adquirir carga, existirá una distribución de equilibrio de las especies susceptibles de adquirir carga, en ambas formas. En el caso de las especies aniónicas, aproximadamente 50% de la población será aniónica y aproximadamente 50% estará sin carga cuando el pH esté al valor pKa de la especie aniónica. Mientras el pH esté más lejos del valor pKa de las especies susceptibles de adquirir carga, habrá un desplazamiento correspondiente en este equilibrio, de manera que a valores de pH más altos, la forma aniónica predominará y a valores de pH más bajos, predominará la forma sin carga. Las modalidades descritas aquí incluyen la forma de los copolímeros a cualquier valor de pH.
En ciertas modalidades, se proporciona aquí un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden : i. al menos un bloque hidrofóbico ; ii. una pluralidad de unidades monoméricas que contienen una pluralidad de especies aniónicas a un pH aproximado al neutro; y b. al menos un nucleótido (por ejemplo1, al menos un polinucleótido) .
En modalidades específicas, el o los nucleótidos (por ejemplo, al menos un polinucleótido) no están presentes en la parte central del portador polimérico.
En algunas modalidades se proporciona un portador polimérico (composición polimérica) que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros comprenden: i. al menos un bloque hidrofóbico, el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de especies aniónicas a un pH aproximado al neutro; ii. un bloque portador de polinucleótido, el bloque portador de polinucleótido es hidrofílico a un pH aproximado al neutro; b. al menos un polinucleótido.
En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido es policatiónico a un pH aproximado al neutro, es polianiónico a un pH aproximado al neutro, está sin carga (por ejemplo, prácticamente sin carga) a un pH aproximado al neutro o es zwiteriónico a un pH aproximado al neutro. En algunas modalidades, un pH aproximado al neutro es un pH de aproximadamente 7 (por ejemplo, aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.4).
En algunas modalidades, se proporciona en la presente un portador polimérico (composición polimérica) que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros comprenden: i . al menos un bloque hidrofóbico, el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de especies aniónicas a un pH aproximado al neutro; ii. un bloque portador de polinucleótido, el bloque portador de polinucleótido es policatiónico a un pH aproximado al neutro; b. al menos un polinucleótido.
En modalida.des específicas, el polinucleótido no está en la parte central del portador polimérico. En algunas modalidades específicas, el o los bloques hidrofóbicos contienen una pluralidad de especies catiónicas a un pH aproximado al neutro.
En ciertas modalidades se proporciona en la presente, un portador polimérico (o composición polimérica) que comprende : a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden : i. al menos un bloque hidrofóbico, el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de especies aniónicas a un pH aproximado al neutro; ii. un bloque portador de polinucleótido; b. al menos diez polinucleótidos, los polinucleótidos no están en la parte central del portador polimérico .
En modalidades específicas, el portador polimérico (una composición polimérica) comprende al menos veinte polinucleótidos .
En algunas modalidades de la presenté ,! se proporciona un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que ' son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden : i. al menos un bloque hidrofóbico; I ii. una pluralidad de especies aniónicas a un pH aproximado al neutro; y b. al menos un polinucleótido .
En modalidades específicas, el portador polimérico tiene un diámetro hidrodinámico > de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm en medio acuoso con un pH aproximado de 7.4.
En algunas modalidades, el o los nucleótidos de cualquier portador polimérico descrito aquí, está unido al portador polimérico (o a un componente polimérico del mismo) , en donde esta unión se logra de cualquier forma que sea adecuada (por ejemplo, interacciones no covalentes, como interacciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas , interacciones hidrofílicas , o lo similar; interacciones covalentes o lo similar; o combinaciones de las mismas) . En ciertas modalidades, al menos un nucleótido de cualquiera de los portadores poliméricos descritos aquí es un polinucleótido (por ejemplo, un primer polinucleótido) . En algunas modalidades, el portador polimérico comprende una pluralidad de polinucleótidos (por ejemplo, una pluralidad de primeros polinucleótidos y/ó una pluralidad de segundos polinucleótidos, y tantos polinucleótidos diferentes adicionales como se quiera) . En modalidades específicas, el polinucleótido es un modulador de la expresión génica. En modalidades más específicas, los moduladores de expresión génica incluyen agentes de silenciamiento génico ( knockdown agents) (por ejemplo, un oligonucleótido de silenciamiento génico) . En modalidades más específicas, el agente de silenciamiento génico es AR si, un oligonucleótido antisentido, un ARNmi o un ARNsh. En modalidades aun más específicas, el agente de silenciamiento génico es ARNsi.
En algunas modalidades, cualquier portador polimérico descrito aquí comprende una entidad dirigida. En modalidades específicas, la entidad dirigida está unida a la porción de envoltura del portador polimérico 1 En modalidades más específicas, la entidad dirigida está unida a la porción de envoltura mediante enlace covalente con un polinucleótido .
En ciertas modalidades, el polímero de cualquier portador polimérico descrito aquí, es un copolímero de bloque, copolímero monobloque o un polímero gradiente. En algunas modalidades, cualquier portador polimérico descrito aquí también comprende un polímero adicional que no está unido a un polinucleótido. En algunas modalidades, el polímero adicional es un polímero diluyente o un polímero portador de una entidad dirigida. En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico descrito aquí también comprende un polímero adicional que está unido al menos a un segundo nucleótido (por ejemplo, un segundo polinucleótido) . En ciertas modalidades, el o los segundos nucleótidos (por ejemplo, el segundo polinucleótido) son diferentes de los nucleótidos (por ejemplo, un primer polinucleótido) .
En algunas modalidades, cualquier portador polimérico descrito aquí comprende una pluralidad de polímeros, todos y cada uno de los que tienen una porción central en el portador polimérico son, en esencia, idénticos .
En ciertas modalidades, un portador polimérico descrito aquí es un desestabilizante de membrana. En modalidades específicas, el portador polimérico es desestabilizante de membrana a pH ácido (por ejemplo, pH endosómico) , pero no a un pH aproximado al neutro.
En modalidades específicas, se proporciona aquí un portador polimérico que es una micela y en particular una micela auténtica. 1 En ciertas modalidades, cualquiera de j los portadores poliméricos proporcionados en la presente comprende polímeros que tienen un bloque hidrofóbico, en donde el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga En j algunas modalidades, la pluralidad de primeras especies i susceptibles de adquirir carga son prácticamente anióñicas a un pH aproximado al neutro. En ciertas modalidades, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adqúirir carga están prácticamente sin carga a pH ácido o a pH endosómico. En algunas modalidades, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga están prácticamente sin carga a un pH de aproximadamente 7 o menor, aproximadamente 6.8 o menor, aproximadamente 6.6 o I menor, aproximadamente 6.4 o menor, aproximadamente 6.2 o menor, aproximadamente 6 o menor, aproximadamente 5'.8 o menor, aproximadamente 5.6 o menor. En modalidades específicas, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga están prácticamente! sin carga a un pH de aproximadamente 6 o menor. En modalidades i específicas, la forma del bloque portador de polinucleótido (por ejemplo, policatiónico, polianiónico, neutro o zwiteriónico) es a pH ácido (por ejemplo, pH endosómico) prácticamente idéntica que la que tiene a un pH aproximado al neutro.
En algunas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados en la presente, también comprenden una pluralidad de unidades monoméricas hidrofobicas que tienen un valor p >1, las unidades monoméricas hidrofobicas son parte del bloque hidrofóbico o son adicionales al bloque hidrofóbico. El valor p de un compuesto es una medida de su valor hidrofílico-lipofilico relativo (véase, por ejemplo, Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" Am. J. Pharm. Educ. 45 : 11-13 (1981) ) .
En ciertas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados en la presente, comprenden una pluralidad de polímeros que se han autoensamblado de manera espontánea formando el portador polimérico. En algunas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados aquí comprenden uno o más polímeros en donde el o los nucleótidos (por ejemplo, un polinucleótido) son un bloque del polímero. En algunas modalidades, el polinucleótido forma la envoltura; del portador polimérico o está presente en ella. En ciertas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados aquí contienen al menos un polinucleótido en la envoltura del portador polimérico. En algunas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados aquí comprenden un bloque hidrofóbico susceptible de adquirir carga, desestabilizante¡ de membrana . i En algunas modalidades, cualquiera de ! los I portadores poliméricos proporcionados aquí comprend al menos un polímero que comprende un bloque portador de polinucleótido. En ciertas modalidades, la envoltura del portador polimérico comprende al bloque portador de polinucleótido. En algunas modalidades, la envoltura del portador polimérico comprende el bloque portador de i polinucleótido. En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido es no peptídico (es decir, no és un poliaminoácido) . En ciertas modalidades, el o ¡ los nucleótidos de un portador polimérico proporcionado en la presente, está unido al bloque portador de polinucleótido mediante un enlace covalente, una interacción no covalénte, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido de cualquier portador polimérico descrito aquí, es policatiónico . En ciertas modalidades, el bloque portador de polinucleótido es un bloque portador de AR si. En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido (por ejemplo, bloque portador de AR si) no está PEGilado. En modalidades más específicas, la cadena principal del bloque portador de polinucleótido no está PEGilada. En ciertas modalidades, el o los nucleótidos (por ejemplo, polinucleótido, incluido un oligonucleótido) es un polianión que contiene x aniones y en donde, el bloque portador de polinucleótido (por ejemplo, bloque portador de ARNsi) contiene aproximadamente 0.1-x cationes o más. En ciertas modalidades, el bloque portador de polinucleótido de cualquier portador polimérico descrito aquí es un bloque homopolimérico . En modalidades específicas, el bloque homopolimérico es poli-N, N-di ((- j C6) alquil-amino (Cy-C6) alquil-etacrilato, poli-N, N-di C6) alquil-amino (C1-C8) alquil-metacrilato o poli-N, N-di (Cx-C6) alquil-amino (C^-C8) alquil-acrilato. En algunas modalidades, un bloque portador de polinucleótido es un copolímero que comprende, por ejemplo, (i) al menos una unidad monomérica N, N-di {C1-C6) alquil-amino (C^CJ alquil-etacrilato, al menos un N, N-di (Cx-C6) alquil-amino (Cx-C6) alquil-metacrilato, al menos un N,N-di (Cj-C8) alquil-amino (C1-C8) alquil-acrilato, o una combinación de los mismos; y (ii) al menos una unidad monomérica espadadora .
En algunas modalidades, un portador polimérico proporcionado aquí comprende una primera especie susceptible de adquirir carga que es un grupo ácido carboxílico, un grupo sulfonamida, un grupo ácido i sulfónico, un grupo ácido sulfínico, un grupo ácido sulfúrico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfónico o un grupo ácido fosforoso. En ciertas modalidades, un polímero de cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, comprende una unidad monomérica espaciadora en cualquier bloque (por ejemplo, un bloque hidrofóbico, un bloque hidrofílico, un bloque de la envoltura, un bloque de la parte central, o lo similar) . En algunas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente comprende un bloque hidrofóbico que contiene al menos una unidad monomérica espaciadora .
En ciertas modalidades, un portador polimérico proporcionado aquí comprende un bloque hidrofóbico que contiene una primera y una segunda especie susceptible de adquirir carga. En algunas modalidades, la primera especie susceptible de adquirir carga es tal como se describe aquí y la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al protonarse . En modalidades específicas, el pKa de la segunda especie susceptible de adquirir carga es aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 9. En algunas modalidades, la segunda especie susceptible de adquirir carga es una amina o imina acíclica, una amina o imina cíclica o un heteroarilo que contiene nitrógeno. En ciertas modalidades, al menos una de las primeras especies susceptibles de adquirir carga y al menos una de las segundas especies susceptibles de adquirir carga están presentes en una sola unidad monomérica. En algunas modalidades, la primera especie susceptible de adqüirir carga se encuentra en una primera unidad monomérica I susceptible de adquirir carga y la segunda especie i susceptible de adquirir carga está en una segunda unidad j monomérica susceptible de adquirir carga. En ciertas modalidades la primera especie susceptible de adquirir carga es una especie aniónica al desprotonarse, la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al desprotonarse, en donde la relación entre especie aniónica y especie catiónica está entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, a un pH aproximado neutro. En algunas modalidades, la relación entre la primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga y la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga está entre aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1. En ciertas modalidades, la primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga es un acido (C2-C8) alquilacrílico . En algunas modalidades, menos de 50% i de la segunda unidad monomérica susceptible de adqüirir carga, se carga y se convierte en una especie catiónica, a un pH aproximado de 8. En ciertas modalidades, la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga es ! N,N- 1 di {C1-Ce} alquil-amino (^-C^ alquil -etacrilato, N, N-di (Ca- C6) alquil-amino C6) alquil-amino (Ci-Cj alquil-acrilato .
En ciertas modalidades, el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies susceptibles de adquirir carga que tienen carga o son susceptibles de adquirir carga y convertirse en especies aniónicas. En algunas modalidades, el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 especies susceptibles de adquirir carga que tienen carga o , son susceptibles de adquirir carga y convertirse en especies catiónicas. En ciertas modalidades, el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies susceptibles de adquirir carga. En modalidades específicas, cada primera especie susceptible de adquirir carga, tiene carga o es susceptible de adquirir carga y convertirse en especie aniónica. En ciertas modalidades, el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 segundas especies susceptibles de adquirir carga. En modalidades específicas, cada segunda especie susceptible de adquirir carga, tiene carga o es susceptible de adquirir carga y convertirse en especie catiónica. En ciertas modalidades, el bloque hidrofóbico de los copolímeros de bloque presente en el portador polimérico proporcionado en la presente, comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies susceptibles de adquirir carga. En modalidades específicas, cada primera especie susceptible de adquirir carga, tiene carga o es susceptible de adquirir carga y convertirse en especie aniónica. En algunas modalidades, el bloque hidrofóbico de los copolímeros de bloque presente en el portador polimérico proporcionado en la presente, comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 segundas especies susceptibles de adquirir carga < En I modalidades específicas, cada segunda especie susceptible de adquirir carga, tiene carga o es susceptible de adquirir carga y convertirse en especie catiónica.
En ciertas modalidades alternas de cualquier modalidad de portador polimérico descrito aquí, se proporciona un portador polimérico que comprende un bloque hidrofóbico susceptible de adquirir carga ; y desestabilizante de membrana, que comprende una pluralidad de unidades monoméricas no susceptibles de adquirir carga. En algunos casos, la unidad monomérica no susceptible de adquirir carga contiene las especies hidrofóbicas . En otros casos, la primera y/o la segunda especie susceptible de adquirir carga comprende o también comprende las especies hidrofóbicas . En algunas modalidades, la unidad monomérica no susceptible de adquirir carga es (C2-C8) alquil-etacrilato, (C2-C8) alquil-metacrilato o (C2-C8) alquil- acrilato.
En algunas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, en medio acuoso y a un pH aproximado de 7.4, tiene un diámetro hidrodinámico promedio aproximado de 10 nm a aproximadamente 200 nní. En algunas modalidades, el portador polimérico, en medio acuoso y a un pH aproximado de 7.4, tiene un diámetro hidrodinámico promedio aproximado de 20 nm a aproximadamente 100 nm. En ciertas modalidades, el portador polimérico, en medio acuoso y a un pH aproximado de ¡7.4, tiene un diámetro hidrodinámico promedio aproximado de 30 nm a aproximadamente 80 nm. ! En algunas modalidades, se proporciona aquí un portador polimérico que comprende al menos 1, al menos 2, al menos 5, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200 o al menos 250 polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos o ARNsij . En algunas modalidades, se proporciona aquí un portador polimérico que comprende aproximadamente entre ¡1 y aproximadamente 250, entre 2 y aproximadamente 250, entre 5 y aproximadamente 250, entre 20 y aproximadamente 250, entre 25 y aproximadamente 250, entre 30 y aproximadamente 250, entre 40 y aproximadamente 250, entre 50 y aproximadamente 250, entre 100 y aproximadamente 250, entre 200 y aproximadamente 250 polinucleótidos individuales: (por j i ejemplo, oligonucleótidos o AR si) . En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un portador polimérico que contiene al menos 2 polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos o ARNsi). En ciertas modalidades, estos polinucleótidos están unidos, de cualquier manera adecuada, con los portadores poliméricos y/o los polímeros de éstos. En algunas modalidades, el polinucleótido es un ARNsi.
En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, comprende un copolímero de bloque en el que la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido es aproximadamente de 1:5 a aproximadamente 5:1 o aproximadamente de 1:1 a aproximadamente 5:1 (ó por ejemplo, aproximadamente 5:4 a 5:1) . En algunas modalidades, la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido es aproximadamente de 3:2 a aproximadamente 3:1. En modalidades específicas, la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido es de aproximadamente 2:1.
En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente comprende un bloque portador de polinucleótido que es un bloque portador de ARNsi. En algunas modalidades, el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 7,000 a aproximadamente 50,000 daltones. En algunas modalidades, el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 7,000 a aproximadamente 20,000 daltones. En ciertas modalidades, el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 20,000 daltones. En algunas modalidades, el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 daltones. En ciertas modalidades, el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 20,000 daltones. En algunas modalidades, el bloque hidrofóbico tiene un peso molecular promedio numérico , (Mn) de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 200,000 daltones, aproximadamente 2,000 a 200,000 daltones, aproximadamente 2,000 a 100,000 daltones o aproximadamente 10,000 a 100,000 daltones. En algunas modalidades, el bloque hidrofóbico tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 a 50,000 daltones. En ciertas modalidades, el bloque hidrofóbico tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 20,000 a 50,000 daltones. En algunas modalidades, el portador polimérico proporcionado aquí comprende una pluralidad de copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana con un bloque central que tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) mayor de 100,000 daltones. En algunas modalidades, el portador polimérico proporcionado ¡aquí comprende una pluralidad de copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana con un bloque de envoltura que tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) mayor de 50, 000 daltones .
En algunas modalidades, los copolímeros de bloque de cualquier portador polimérico proporcionado eri la presente, tienen un índice de polidispersidad menor de 2, menor de 1.8, menor de 1.6, menor de 1.5, menor de 1.4 o menor de 1.3.
En algunas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, es estable a un pH aproximado de 7.4. En ciertas modalidades, el portador polimérico es mucho menos estable a un pH aproximado de 5.8 que a un pH aproximado de 7.4. En algunas modalidades más de 90% del portador polimérico se desestabiliza a un pH aproximado de 5.8 y a una concentración aproximada de 18 µg/mL y menos de 10% del portador polimérico se desestabiliza a un pH aproximado de 7.4 y una concentración aproximada de 18 µg/mL.
En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, es estable en suero humano al 50%, durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, o más. En algunas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, es estable I en plasma humano al 50%, durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 i horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, o más. En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, es estable en suero de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, al menos 4 ? horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menqs 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, o más. En ciertas modalidades, cualquier portador i polimérico proporcionado en la presente, es estable en j plasma de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menós 12 horas, al menos 18 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, o más. En algunas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente, es estable en suero humano al 50%, durante al menos 2 horas, en p!Lasma humano al 50%, durante al menos 2 horas, en suero de ratón i al 50%, durante al menos 2 horas, en plasma de ratón al j 50%, durante al menos 2 horas, o una combinación de los mismos .
En ciertas modalidades descritas en la presente, se encuentra cualquiera de los polímeros que constituyen los portadores poliméricos descritos aquí. Es decir,! las subunidades poliméricas (por ejemplo, los copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana) o los polímeros individuales (estén o no en la forma de portador polimérico) también son modalidades descritas aquí. Para ser explícitos, todos y cada uno de los copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana que se presenten aquí, están dentro del alcance de las invenciones descritas en la presente, como polímero individual y como componente, hebra o unidad monomérica de los portadores poliméricos descritos aquí .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las novedosas particularidades de la invención se exponen en forma más detallada en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las particularidades y ventajas de la presente invención se obtendrán a partir de la siguiente descripción detallada que expone modalidades ilustrativas en las cuales se utilizan los principios de la invención, y de los dibujos que la acompañan, eni los cuales: Figura 1A: Es un ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de polímeros sintetizados' por transferencia de cadena por adición- fragmentación reversible (RAFT o reversible addition-fragmentation chain transfer) Figura IB: Es un ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de copolímeros PEGMA-DMAEMA.
Figura 2: Es un ejemplo ilustrativo de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR O nuclear magnetic resonance) del copolímero de bloque PRx0729v6. | Figura 3: Es un ejemplo ilustrativo de la determinación por dispersión luminosa dinámica (DLS o dyna ic light scattering) del tamaño de partícula de polímero PRx0729v6 acomplejado con ARNsi. j I Figura 4: Es un ejemplo ilustrativo del análisis por desplazamiento en gel de complejos PRx0729v6/ARNsi a diferentes relaciones de carga. I Figura 5: Es un ejemplo ilustrativo de la concentración de estabilidad crítica (CSC o critical stability concentration) del polímero PRx0729v6. · ' Figura 6: Es un ejemplo ilustrativo de la estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en disolventes orgánicos . j Figura 7: Es un ejemplo ilustrativo de la actividad de silenciamiento génico (knock-down) d los complejos AR si - micelas, en células de mamífero cultivadas .
Figura 8: Es un ejemplo ilustrativo que demuestra la actividad desestabilizante de membrana de las micelas poliméricas y sus complejos con ARNsi.
Figura 9: Es un ejemplo ilustrativo del análisis por microscopía electrónica de transmisión (TEM o transmission electrón microscopy) del polímero PRx0729v6.
Figura 10: Es un ejemplo ilustrativo de microscopía de fluorescencia de la captación celular !y la distribución intracelular de los complejos de polímero-ARNsi .
Figura 11: Es un ejemplo ilustrativo del efecto del pH en la estructura polimérica.
Figura 12 : es un resumen ilustrativo de datos de silenciamiento génico (knock-down) para complejos ARNsi -micelas, en células de mamífero cultivadas.
Figura 13: Es un ejemplo ilustrativo de poli [DMAEMA] -macro CTA con galactosa como grupo funcional terminal .
Figura 14: Es un ejemplo ilustrativo de [PEGMA-MAA(NHS) ] - [B-P-D] Figura 15: Es un ejemplo ilustrativo de copolimerización RAFT de PEGMA y MAA-NHS.
Figura 16: Ejemplo ilustrativo de DMAEMA-MAA (NHS) con galactosa como grupo terminal o copolímeros dibloque PEGMA-MAA (NHS) .
Figura 17: Es un ejemplo ilustrativo de las estructuras conjugables de ARNsi, pép idos y piridil disulfuro amina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente portadores poliméricos adecuados para el suministro de polinucleótidos (que incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos ) a una célula viva. En algunas modalidades, los portadores poliméricos comprenden una pluralidad de unidades poliméricas y opcionalmente al menos un polinucleotido. En ciertas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente, son biocompatibles, estables (ya sea química y/o físicamente estables) y/o reproducibles por síntesis. Por otra parte, en algunas modalidades, los portadores de la presente son atóxicos (por ejemplo, presentan baja toxicidad) , protegen la carga útil del polinucleotido (por ejemplo, del oligonucleótido) contra la degradación, entran a la célula viva a través de procesos naturales (por ejemplo, por endocitosis) y/o suministran la carga útil del polinucleotido (por ejemplo, el oligonucleótido) en el citoplasma de una célula viva después de entrar en contacto con la célula. En ciertos casos, el polinucleotido (por ejemplo, oligonucleótido) es un ARNsi y/u otro agente "con base nucleotídica" que altera la expresión de al menos un gen en la célula. Por consiguiente, en ciertas modalidades, los portadores que aquí se proporcionan son útiles para el suministro de ARNsi a una célula. En ciertos casos, la célula es in vitro y en otros casos la célula es in vivo. En algunas modalidades, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del portador polimérico que comprende un ARNsi, a un individuo que lo necesite (por ejemplo, que necesite tener un gen silenciado {knodked-down) , en donde el gen sea susceptible de ser silenciado (knocked-down) por el ARNsi administrado) . En casos específicos, los portadores poliméricos descritos aquí, son útiles o están específicamente diseñados para suministrar ARNsi a las células de un individuo seleccionadas de manera específica.
De manera específica, en ciertas modalidades de la presente se proporciona un portador polimérico con una estructura en una parte central y una envoltura que comprende: (i) una pluralidad de copolímeros en bloque ensamblados formando un portador polimérico; (ii) y al menos un oligonucleótido que está en la envoltura del portador. En ciertas modalidades, el portador polimérico es una nanopartícula . En modalidades específicas, el portador polimérico es una micela y en particular una micela auténtica. En algunas modalidades, un portador polimérico proporcionado en la presente, comprende: a.) una pluralidad de polímeros que son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico I comprende una parte central y una envoltura, ; los copolímeros de bloque comprenden (i.) al menos un bloque hidrofóbico y (ii.) una pluralidad de unidades monoméficas que contienen una primera especie aniónica a un pH ¦ I aproximado al neutro y b.) al menos un polinucleótido .
En una modalidad, los portadores poliméricosj (por ejemplo, núcelas) proporcionados aquí o las pártes componentes de los mismos, son desestabilizantes de membrana (por ejemplo, contienen un bloque, grupo, entidad, o lo similar, desestabilizante de membrana) . En otras modalidades alternas, la pluralidad de copolímeros de bloque forman la envoltura y la parte central de un portador polimérico (por ejemplo, una micela) J En modalidades específicas, el portador polimérico comprende una envoltura hidrofílica y/o con carga. En otras modalidades alternas, el portador polimérico comprende una parte central en esencia hidrofóbica (por ejemplo, la parte i central contiene grupos, unidades monoméricas, entidades, bloques, o lo similar, hidrofóbicos ) . En modalidades específicas, uno o más de los copolímeros de bloque comprenden cada uno (1) un bloque hidrofílico con carga que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico que forma la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) . En algunas modalidades, uno o más de los copolímeros de bloque contienen una pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga y una pluralidad de intensificadores de hidrofobicidad . En modalidades específicas, las primeras especies susceptibles de adquirir carga son especies susceptibles de adquirir carga (por ejemplo, están o adquieren carga a un pH específico) aniónicas. En otras modalidades, el o los copolímeros de bloque comprenden una segunda especie susceptible de adquirir carga (es decir, el bloque hidrofílico puede tener más de un tipo diferente de especies aniónicas) . En ciertas modalidades, el portador polimérico (por ejemplo, micela) comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En modalidades específicas, el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) no está en la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) .
En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente comprende polímeros que tienen un bloque hidrofóbico, en donde el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga es prácticamente aniónica a pH aproximado al neutro. En ciertas modalidades, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga está prácticamente sin carga a pH ácido o pH endosómico. En algunas modalidades, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga está prácticamente sin carga a pH de aproximadamente 7 o menor, aproximadamente 6.8 o menor, aproximadamente 6.6 o menor, aproximadamente 6.4 o menor, aproximadamente 6.2 o menor, aproximadamente 6 o menor, aproximadamente 5.8 o menor, o aproximadamente 5.6 o menor. En modalidades especificas, la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga está prácticamente sin carga a un pH aproximado de 6 o menor. En ciertas modalidades, un portador polimérico proporcionado en la presente comprende un bloque hidrofóbico que contiene primeras y segundas especies susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la primera especie susceptible de adquirir carga es tal como se describe aquí y la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al protonarse . En modalidades específicas, el pKa de la segunda especie susceptible de adquirir carga es aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 9 , aproximadamente de 5 a aproximadamente 9 , aproximadamente de 6 a 9 , aproximadamente de 6 a aproximadamente 8 o aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 8.
En algunas modalidades, cualquiera de los portadores poliméricos proporcionados en la presente i comprende una pluralidad de unidades monoméricas i hidrofóbicas , las unidades monoméricas hidrofóbicas| son parte del bloque hidrofóbico o son adicionales al bloque hidrofóbico.
En algunas modalidades, el portador polimérico I (por ejemplo, una micela) y/o los polímeros de éste son no peptídicos . I En algunas modalidades, un portador polimerico (por ejemplo, micelas) proporcionado en la presente, comprende una pluralidad de polímeros monobloque ¿ En ciertas modalidades, los polímeros monobloque y/o el portador polimerico (por ejemplo, unidades monoméricas, entidades, especies y/o grupos del mismo) j son desestabilizantes de membrana. En ciertas modalidades, al menos uno de los polímeros monobloque comprende j una pluralidad de especies susceptibles de adquirir carga aniónicas y una pluralidad de especies hidrofóbicas . El portador polimérico (por ejemplo, micela) comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En modalidades específicas, el polinucleótido (por ejem Iplo, oligonucleótido) no está en la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) . i i i En una modalidad, los portadores poliméricos desestabilizantes de membrana (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, comprenden una pluralidad de copolímeros de bloque. En algunas modalidades, estos copolímeros de bloque forman la envoltura y la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela). En ciertas modalidades, la envoltura y/o el bloque de envoltura es hidrofílico y/o está cargado. En algunas modalidades, la parte central y/o el bloque central es en esencia hidrofóbico. En modalidades específicas, la parte central en esencia hidrofóbica comprende cargas positivas y/o negativas. En modalidades más específicas, la parte central y/o el bloque hidrofóbicos comprenden un número prácticamente igual de cargas positivas y negativas (es decir, la carga de la parte central y/o bloque central es carga neta prácticamente neutra). En algunas modalidades, i uno o más o todos los copolímeros de bloque comprenden cada uno (1) un bloque hidrofílico con carga que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico que forma la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) . En algunas modalidades, los copolímeros de bloque comprenden una pluralidad de especies susceptibles de adquirir carga aniónicas, una pluralidad de entidades hidrofóbicas y son desestabilizantes de membrana. La parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) o bloque central de un copolímero de bloque opcionalmente comprende especies catiónicas. En algunas modalidades, el portador polimérico (por ejemplo, micela) o bloque central de un copolímero de bloque opcionalmente comprende especies aniónicas . En modalidades específicas, el portador polimérico (por ejemplo, micela) o bloque central de un copolímero de bloque comprende al menos una especie catiónica y al menos una especie aniónica. Las micelas también comprenden al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En modalidades específicas, el o los polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) no están en la parte central de la micela.
En algunos casos, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) se forman a partir de una pluralidad de copolímeros de bloque que se autoasocian a través de interacciones de los bloques hidrofóbicos (por ejemplo, bloques centrales) de los copolímeros de bloque y/o se estabilizan a través de sus interacciones hidrofóbicas en la parte central. En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) comprenden dos o más diferentes especies de copolímeros de bloque que tienen diferentes estructuras y funciones.
En ciertas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente son útiles para suministrar polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a un individuo que los necesite. En algunas modalidades, el polímero (por ejemplo, copolímero de bloque o polímero monobloque) de un portador polimérico descrito aquí, comprende un bloque portador de polinucleótido (o sección portadora de polinucleótido en el caso de un polímero monobloque) . En algunas modalidades, el bloque idrofílico o bloque de envoltura del copolímero de bloque es o comprende el bloque portador de polinucleótido. El bloque portador de polinucleótido comprende uno o más tipds de unidades monoméricas (por ejemplo, es un bloque homopolimérico o un bloque heteropolimérico) . En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) que está unido en forma no covalente y/o covalente al bloque portador de polinucleótido de uno o más copolímeros de bloque del portador polimérico. En modalidades específicas, un ARNsi está unido por covalencia a un copolímero de bloque del portador polimérico (por ejemplo, micela) . En algunas modalidades específicas, un ARNsi está unido en forma no covalente a un copolímero de bloque del portador polimérico (por ejemplo, micela) . En modalidades específicas, un ARNsi está unido en forma no covalente y covalente a un copolímero de bloque del portador polimérico (por ejemplo, micela) . En algunas modalidades específicas, el ARNsi forma (por ejemplo, si está presente) al menos una porción de la envoltura del portador polimérico. En algunas modalidades específicas, el ARNsi está unido por covalencia al bloque hidrofóbico. i En ciertas modalidades, cualquier portador polimérico proporcionado en la presente comprendé un copolímero de bloque en donde la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico ¡ y/o bloque central y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido y/o bloque de envoltura, es aproximadamente de 1:10 a aproximadamente |5:1, aproximadamente de 1:5 a aproximadamente ' 5 : 1 , aproximadamente de 1:1 a aproximadamente 5:1 (o: por ejemplo, aproximadamente de 5:4 a aproximadamente 5:1)|. En algunas modalidades, la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y/o bloque central y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido y/o bloque de envoltura, , es aproximadamente de 3:2 a aproximadamente 3 : 1. En modalidades específicas, la relación entre el ¡peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico . y/o bloque central y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido y/o bloque de envoltura, es aproximadamente 2:1.
En ciertas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente comprenden una pluralidad de copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana. En sí, los portadores poliméricos también se describen aquí como desestabilizantes de membrana porque, al menos en parte, están constituidos por copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana.
En algunas modalidades, un copolímero de bloque desestabilizante de membrana comprende: (i) una pluralidad de residuos monoméricos hidrofóbicos , (ii) una pluralidad de residuos monoméricos aniónicos que tienen especies susceptibles de adquirir carga, las especies susceptibles de adquirir carga son aniónicas al pH fisiológico y son prácticamente neutras o sin carga a un pH endosómico y (iii) opcionalmente, una pluralidad de residuos monoméricos catiónicos. En algunas modalidades, la modificación de la relación entre las especies aniónicas y catiónicas en un copolímero de bloque, permite la modificación de la actividad desestabilizante de membrana de un portador polimérico descrito aquí. En algunas de estas modalidades, la relación entre las especies aniónicas y catiónicas en un copolímero de bloque varía de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:4, al pH fisiológico sérico. En algunas de estas modalidades, la modificación de la relación entre especies aniónicas y catiónicas en un bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque, permite la modificación de la actividad desestabilizante de membrana de un portador polimérico descrito aquí. En algunas de estas modalidades, la relación entre especies aniónicas y catiónicas en un bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque descrito aquí , varía de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 3.1 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2.1, al pH fisiológico sérico.
En algunas modalidades, los portadores poliméricos descritos aquí desestabilizan una membrana endosómica de una manera dependiente del pH. En varias modalidades, los copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana, desestabilizan una membrana cuando están ensamblados en el portador polimérico y/o cuando están presentes de forma independiente de la forma ensamblada del portador polimérico (por ejemplo, cuando el portador polimérico está disociado y/o desestabilizado) . En algunas modalidades, al pH fisiológico o a un pH cercano a éste (por ejemplo, pH fisiológico circulante) , los polímeros que constituyen el portador polimérico son desestabilizantes de membrana en mínimo grado pero al exponerse a un pH disminuido (por ejemplo, pH endosómico) , el polímero es desestabilizante de la membrana. En ciertos casos, esta transición a un estado desestabilizante de membrana se da a través de la protonacion de residuos débilmente ácidos que se incorporan en los polímeros, esta protonacion provoca un aumento en la hidrofobicidad de los polímeros. En ciertos casos, el aumento en la hidrofobicidad del polímero da como resultado un cambio conformacional del portador polimérico que lo hace desestabilizante de la membrana (por ejemplo, provoca desestabilización de la membrana) . En algunas modalidades, el mecanismo de desestabilización de la membrana de los portadores poliméricos proporcionados en la presente, no depende meramente de un mecanismo desestabilizante de membrana esponja-protón de policationes como PEI u otros policationes.
En ciertas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente, comprenden uno o más polinucleótidos , por ejemplo, uno o más oligonucleótidos , uno o más agentes ARNi, uno o más ARN, uno o más ADN, uno o más ADNc, uno o más ARNmi uno o más AR si, uno o más AR sh, uno o más ARNa, uno o más sustratos Dicer, o lo similar, o una combinación de los mismos.
Portadores poliméricos En ciertas modalidades, el portador polimérico es una nanopartícula . En modalidades específicas en portador polimérico es una micela. En otras modalidades más, el portador polimérico es una micela con un tamaño de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm o aproximadamente 30-80 nm. El tamaño de partícula se puede determinar de cualquier manera, que incluye entre otras, cromatografía por permeacion en gel (GPC o gel permeation chroma.togra.phy) , dispersión luminosa dinámica (DLS o dyna ic light scattering) , técnicas de microscopía electrónica (por ejemplo, TEM) y otros métodos.
En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionadas en la presente, se preparan por autoensamblado espontáneo de los polímeros descritos aquí. En ciertas modalidades,: los polímeros descritos aquí se ensamblan formando los portadores poliméricos de la presente: (a) al diluir en medio acuoso una solución del polímero en disolvente orgánico miscible en agua, o (b) disuelto directamente en una solución acuosa. En algunas modalidades, los polímeros descritos aquí se ensamblan formando los portadores poliméricos proporcionados en la presente, en ausencia de polinucleótidos .
En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) son estables al diluirse en una solución acuosa. En modalidades específicas, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) son estables al diluirse a un pH aproximado al neutro, en una concentración de estabilidad crítica (por ejemplo, concentración micelar crítica (CMC o critical micelle concen ation) ) de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 µ9/p?]_? o aproximadamente 10 a aproximadamente 50 µ9/???-, menos de 10 µ9/t?1?, menos de 5 µ9/t??[-, menos de 2 menos de 0.5 µ9/?t??? o menos de 0.1 µ /??]_?. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "desestabilización de i una micela" significa que las cadenas poliméricas- que i forman una micela, al menos en forma parcial se disgregan, se alteran estructuralmente (por ejemplo, expanden su tamaño y/o cambian de forma) y/o pueden formar estructuras supramoleculares amorfas (por ejemplo, estructuras supramoleculares no micelares) . j i.
Los términos concentración de estabilidad crítica (CSC) y concentración micelar crítica (CMC) se usan ¡ aquí indistintamente .
En modalidades específicas, el portador polimérico (por ejemplo, micela) comprende una pluralidad de copolímeros de bloque que forman una envoltura y una parte central del portador polimérico (por ejemplo, ¡ una micela) . En ciertas modalidades, la envoltura o bloque de I envoltura es hidrofílico y/o tiene carga (por ejemplo, catiónica, policatiónica o zwiteriónica) . En modalidades específicas, la envoltura y/o bloque de envoltura tiene carga neta positiva. En algunas modalidades, la parte central y/o bloque central es hidrofóbica y/o comprende grupos, entidades, unidades monoméricas, especies, q lo ¦similar, hidrofóbicas . En modalidades específicas, la parte central y/o bloque central comprende una pluralidad de grupos, entidades, unidades monoméricas, especies, p lo similar, hidrofóbicas y una pluralidad de especies o unidades monoméricas susceptibles de adquirir cargaj. En modalidades más específicas, la pluralidad de unidades monoméricas o especies susceptibles de adquirir carga comprende una pluralidad de unidades monoméricas o especies susceptibles de adquirir carga, aniónicas . En modalidades aun más específicas, la pluralidad de unidades monoméficas o especies susceptibles de adquirir carga comprende; una pluralidad de unidades monoméricas o especies susceptibles de adquirir carga, catiónicas y aniónicas. En algunas modalidades, cada uno de los copolímeros de bloque tiene: (1) un bloque hidrofílico con carga (por ejemplo, catiónico o policatiónico) que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) , (2) un bloque hidrofóbico y (3) una pluralidad de especies susceptibles de adqúirir carga aniónicas y son desestabilizantes de membrana ] (por ejemplo, se convierten en desestabilizantes de membrana en i función del pH) . En ciertas modalidades, la parte central y/o bloque hidrofóbicos , como característica opcional comprenden unidades monoméricas espadadoras que pueden o no tener grupos hidrofóbicos , grupos susceptibles de adquirir carga o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, un bloque polimérico que constituye o está presente en la parte central del portador polimérico (por ejemplo, micela) (por ejemplo, uno o más bloques centrales del copolímero) es susceptible de adquirir carga (por ejemplo, contiene especies catiónicas y/o aniónicas al pH fisiológico) . En la presente, las especies y/o unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga incluyen especies y unidades monoméricas tanto con carga como sin carga. En algunos casos, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, se forman a partir de una pluralidad de copolímeros de bloque que se autoasocian. En ciertos casos, la autoasociación se da a través de las interacciones de los bloques hidrofóbicos de los copolímeros de bloque y los portadores poliméricos resultantes (por ejemplo, micelas) se estabilizan a través de interacciones hidrofóbicas de los bloques hidrofóbicos presentes en la parte central del portador polimérico.
En algunas modalidades, el portador polimérico proporcionado en la presente, es estable a un pH aproximado de 7.4 y es mucho menos estable a un pH aproximado de 5.8 que a un pH aproximado de 7.4. En algunos casos, más de 90% del portador polimérico se desestabiliza a un pH aproximado de 5.8 y a una concentración aproximada de 10 µg/mL y menos de 10% del portador polimérico se desestabiliza a un pH aproximado de 7.4 y una concentración aproximada de 10 En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados efi la presente, mantienen su actividad (por ejemplo, la actividad del portador polimérico para suministrar un polinucleótido) en suero humano al 50%, durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En otras modalidades o alternas, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) i proporcionados en la presente, mantienen su actividad (por ejemplo, la actividad del portador polimérico jpara suministrar un polinucleótido) en plasma humano al '50%, i durante al menos 2 horas, al menos 4 horas, al menjos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En otras modalidades alternas, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, mantienen su actividad (por ejemplo, la actividad del portador polimérico para suministrar un polinucleótido) i en suero de ratón al 50%, durante al menos 2 horasj, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. Incluso en otras modalidades alternas, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, mantienen su actividad [ (por ejemplo, la actividad del portador polimérico ¡para suministrar un polinucleótido) en plasma de ratón al 50%, durante al menos 2 horas , al menos 4 horas , al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas o al menos 24 horas. En modalidades específicas, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados eh la presente, mantienen su actividad (por ejemplo, la actividad del portador polimérico para suministrar un polinucleótido) en suero humano al 50%, durante al menos 2 horas, en plasma humano al 50%, durante al menos 2 horas, en suero de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, en plasma de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, o una combinación de los j mismos. j En algunas modalidades, un portador polimérico (por ejemplo, micela) proporcionado en la presentei, se caracteriza por uno o más de los siguientes puntos: (í) el portador polimérico (por ejemplo, micela) se formal por autoasociación espontánea de copolímeros de bloque y forma unidades organizadas (por ejemplo, micelas) al diluirse de un disolvente miscible en agua (como etanol, entre otros) a disolventes acuosos (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfatos, pH 7.4) ; (2) el portador polimérico (por ejemplo, micela) es estable al dilüirse (por ejemplo, disminuir a una concentración de polímero de 100 µg /mL, 50 µg /mL, 10 µg/ml, 5 µg/mL, 2 µg/mL, 0.5 g/mL ó 0.1 µg/mL que constituye la concentración de estabilidad crítica o la concentración micelar crítica (CMC)); (3) el portador polimérico (por ejemplo, micela) es estable a la elevada potencia iónica del medio circundante (por ejemplo, NaCl 0.5 M) ; y/o (4) el portador polimérico I (por ejemplo, micela) tiene una creciente inestabilidad a i medida que aumenta la concentración de los disolventes orgánicos, estos disolventes orgánicos incluyen, entre otros, dimetilformamida (DMF o dimethylformamide) , sulfóxido de dimetilo (DMS o dimethylsu.ltoxide) y dioxano .
En algunas modalidades, un portador polimérico ¡ (por I ejemplo, micela) proporcionado en la presente,; se I caracteriza por tener al menos dos de las propiedades anteriormente mencionadas. En algunas modalidades,; un I portador polimérico (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente, se caracteriza por tener al menos tres de las propiedades anteriormente mencionadas . En algunas modalidades, un portador polimérico (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente, se caracteriza por tener todas las propiedades anteriormente mencionadas. [ i En ciertas modalidades, los portadores i poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionadas en la presente, también se caracterizan por otros criterios: (1) el peso molecular de los bloques individuales y su relación de longitud relativa se disminuye o se aumenta con e fin de controlar el tamaño de la micela formada y su estabilidad relativa y (2) el tamaño del bloque polimérico catiónico que forma la envoltura se modifica a fih de permitir una eficaz formación del complejo y/o neutralización de carga del medicamento oligonucleótidó.
En ciertas modalidades, las micelas dd la presente invención de manera selectiva captan hacia su i centro hidrofóbico moléculas hidrofóbicas pequeñas ¡ como i pireno. ! I Portadores polimericos que comprenden polinucleotidos ¡ I En algunas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente son útiles j para suministrar polinucleotidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a un individuo que los necesite. En ciertas modalidades, se proporciona en la presente un portador poliméricoj que comprende al menos un polinucleótido . En modalidades más específicas, el portador polimérico comprende al menos 2, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos i 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100 polinucleotidos.
En algunas modalidades, el portador polimérico proporcionado en la presente, comprende 2 a: 50 1 polinucleotidos , 5 a 40 polinucleotidos, 5 a¡ 30 polinucleotidos , 5 a 25 polinucleotidos, 20 a 40 i polinucleotidos, o lo similar. En ciertas modalidades, el i polinucleótido es un modulador de la expresión génica de un I oligonucleótidó. En otras modalidades, el polinucleótido es un agente de silenciamiento génico (knockdown) dé un oligonucleótido . En modalidades específicas, el polinucleótido es un agente ARNi, un sustrato Dicer o ARNsi. En otras modalidades especificas, el polinucleótido es ARNai (Asymetric RNA duplexes medíate RNA interference i in mammalian cells. Xiangao Sun, Harry A. Rogoff, Chiáng J Li Nature Biotechnology 26, 1379-1382 (2008)). En ciertas modalidades, el portador polimérico es una nanopartícula (por ejemplo, una micela) que comprende una parte central, una envoltura y uno o más polinucleótidos , en donde el i polinucleótido no está en la parte central de la micelá. En modalidades específicas, el polinucleótido se incorpora (por ejemplo, está presente y/o forma una porción) en la envoltura del portador polimérico. En algunas modalidades, i uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) están unidos al bloque portador del polinucleótido ARNsi de los copolímeros multibloque que forman el portador polimérico. En varias modalidades, la unión se logra a través de uno o más enlaces covalentes, una o! más interacciones no covalentes, o una combinación dej los mismos. En algunas modalidades, el ARNsi se une; por covalencia a un bloque hidrofóbico del copolímero de bloque (por ejemplo, un bloque central) . En modalidades específicas, el ARNsi está unido por covalencia a un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) del copolímero de bloque que forma al menos una porción de la envoltura del portador polimérico. En modalidades más específicas, el ARNsi es un bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) del copolímero de bloque. En otras modalidades, el ARNsi está unido al bloque hidrofílico de un copolímero de bloque o a un bloque polimérico opcional.
En algunas modalidades, uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) está unido a un copolímero de bloque, proporcionado en la presente, de cualquier manera adecuada, por ejemplo, por asociación no covalente. La asociación no covalente entre (i) un polímero y/o un ensamble de polímeros de la presente (por ejemplo, una micela formada por una pluralidad de polímeros) y (ii) uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido) , se logra de cualquier manera que sea adecuada, que incluye, entre otras, interacción electrostática (incluida la interacción electrostática con un polímero que tenga grupos catiónicos y un polinucleótido que tenga grupos aniónicos) , interacción hidrofóbica, interacción por afinidad, o una combinación de los mismos. En ciertas modalidades, el o los polinucleótidos y/o polímeros del portador polimérico (por ejemplo, micela) se modifican con entidades químicas que proveen uno o más polinucleótidos y/o polímeros que tienen afinidad entre sí (por ejemplo, y son comercialmente viables) , como ácido arilborónico-ácido salicilhidroxámico, cierre de leucina u otros motivos peptídicos, interacciones iónicas entre cargas positivas y negativas en la micela y el polinucleótido u otro tipo de enlaces por afinidad química no covalente. Por otra parte, en algunas modalidades, un polinucleótido bicatenario se asocia 1 (por I ejemplo, forma complejos) con un polímero o un portador polimérico (por ejemplo, micela) descrito aquí. En algunas j modalidades, un polímero o portador polimérico i (por ejemplo, micela) se asocia (por ejemplo, forma complejo) con un agente de unión al surco menor de ácido nucleico o i un agente de intercalado que está unido (por ejemplo,! por i covalencia) a un componente (por ejemplo, un polímero) del i portador polimérico (por ejemplo, micela) . j En algunas modalidades, el polinucleótido : (por i ejemplo, oligonucleótido) tiene al menos una carga negativa (por ejemplo, comprende una cadena principal con carga I negativa) y está asociado con una envoltura catiónicá del portador polimérico (por ejemplo, micela) y/o un bloque de 1 envoltura catiónic de un copolímero de bloque del portador polimérico. En modalidades específicas, la envoltura catiónicá o el bloque de envoltura catiónico, al menos en forma parcial, neutraliza las cargas negativas presentes en el o los polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) unidos al portador polimérico o presentes en éstej. En ciertas modalidades, uno o más polinucleótidos ' (por i ejemplo, uno o más oligonucleótidos , uno o más AR si, p una combinación de los mismos) forma una asociación (por ejemplo, un complejo) con los bloques portadores de polinucleótido policatiónicos del portador poliméricó ¡ (por I ejemplo, micela) . En algunas modalidades, la asociación (por ejemplo, complejo) entre el portador poliméricó | (por ejemplo, micela) y el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) se d a cualquier relación de carga deseada entre el copolímero de bloque que forma el portador poliméricó (por ejemplo, micela) y el polinucleótido i (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi), por ejemplo, entre 1:1 y 16:1. En modalidades específicas, el complejo entre la j micela y el ARNsi se forma a la relación de carga de j 2:1, 4:1 u 8:1. En otras palabras, en algunas modalidades, la relación entre el número de cargas catiónicas presentes en la envoltura del portador poliméricó y el número de cargas i aniónicas presentes en el polinucleótido, tiene cualquier valor que se desee, por ejemplo, aproximadamente l!:l a aproximadamente 16:1, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1, aproximadamente 4:1 a aproximadamente 12:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 8:1. En algunas modalidades, el ARNsi tiene carga neutralizada por un bloque policatiónico de un copolímero de bloque que forma la micela. Por ejemplo, en algunas modalidades específicas, un polinucleótido de 20 pares de bases (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) que tiene 40 cargas negativas al pH fisiológico está asociado (por ejemplo, forma complejo) con un portador polimérico (por ejemplo, micela) que comprende un bloque portador de polinucleótido poli-DMAEMA (80 unidades monoméricas de longitud, PM = 11,680) con un pKa aproximado de 7.4. A este pH, el poli-DMAEMA tiene 40 cargas negativas, por lo cual se produce la asociación polinucleótido-bloque portador de polinucleótido (por ejemplo, complejo) que prácticamente tiene carga neta neutra. En ciertos casos, evitar u ! gran número de cargas positivas de más, ayuda a reducir la toxicidad in vitro e in vivo. En algunas modalidades, un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) se asocia de manera espontánea con una envoltura con carga positiva de un portador polimérico (por ejemplo, micela) proporcionado en la presente .
En algunas modalidades, un polinucleótido ¦ (por ejemplo, oligonucleótido) se conjuga químicamente con el portador polimérico (por ejemplo, micela) y/o uno o más polímeros del portador polimérico (por ejemplo, micela) mediante cualquier técnica de conjugación química adecuada. En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) que contienen un agente ARNi se forman por conjugación del ARNi con un portador polimérico ya formado (por ejemplo, micela) que comprende una pluralidad de polímeros (por ejemplo, copolímeros de bloque) . En otras modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) que contienen un agente ARNi se forman por conjugación del AR i con un polímero (por ejemplo!, un copolímero de bloque) y después forman el portador polimérico (por ejemplo, micela) de alguna manera adecúada, por ejemplo, por el autoensamblado de los conjugados resultantes que produce un portador polimérico I (por ejemplo, micela) que contiene el agente AR i. En varias modalidades, este portador polimérico, como característica opcional, también comprende polímeros sin conjugar j (por ejemplo, copolímeros de bloque) que son similares, idénticos o diferentes de los conjugados con el agente ARNi. El enlace covalente entre un polímero y un polinucleótido de un portador polimérico descrito aquí, opcionalmente, es escindible o no escindible. En ciertas modalidades, un precursor de uno o más agentes ARNi (por ejemplo, un sustrato Dicer) está unido al portador polimérico (por ejemplo, micela) o a las unidades poliméricas del portador polimérico (por ejemplo, a la micela por un enlace no escindible) . En algunas modalidades, uno o más agentes ARNi están unidos a través de un enlace escindible. En ciertas modalidades, ¡ los enlaces escindibles utilizados en los portadores poliméricos descritos aquí, como ejemplo incluyen, entre otros, enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro que se disocian en el entorno reductor del citoplasma) . En algunas modalidades, la asociación covalente entre un portador polimérico (incluidos los componentes del mismo) y Í un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNsi) , se logra a través de cualesquier métodp de conjugación química que sea adecuado, que incluye, entre otros, ligantes amino-carboxilo, amino-sulfhidrilo, amino-carbohidrato, amino-hidroxilo, amino-amino, carboxilo-sulfhidrilo, carboxilo-carbohidrato, carboxilo-hidroxilo, carboxilo-carboxilo, sulfhidrilo-carbohidrato, sulfhidfilo-hidroxilo, sulfhidrilo-sulfhidrilo, carbohidrato-hidroxilo, carbohidrato-carbohidrato e hidroxilo-hidroxilo . En alg Iunas modalidades, la conjugación también se puede llevar a | cabo con enlaces y ligantes sensibles al pH, que incluyen, entre otros, enlaces acetal e hidrazona. Como opción, se utiliza también cualquier otro método de conjugación adecuado, por ejemplo, en la técnica se dispone de una gran variedad de técnicas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds . Macmillan, 1998 y los capítulos que contiene) . ¡ En ciertas modalidades, un conjugado de uno ó más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) con un polímero (por ejemplo, un copolímero de bloque) , en donde el polímero es unímero o está presente en un portador polimérico ensamblado, proporcionado en la presente, se prepara según un proceso que comprende las siguientes dos etapas: (1) activación de un grupo terminal modificable (por ejemplo, grupo 5'- ó 3 ' -hidroxilo) de un oligonucleótido, mediante el uso de cualquier reactivo de activación adecuado, entre los que se incluyen, l-etil-3,3-dime ilaminopropil carbodiimida (EDAC) , imidazol, N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) , HOBt (1-hidroxibenzotriazol) , p-nitrofenilcloroformato, carbonildiimidazol (CDI) y N, 1 -disuccinimidil carbonato (DSC) ; y (2) unión covalente de un copolímero de bloque con el extremo del oligonucleótido. En algunas modalidades, el grupo modificable 5'- o 3'- de un oligonucleótido se sustituye con otros grupos funcionales antes de la conjugación con el copolímero de bloque. Por ejemplo, el grupo hidroxilo (--OH), opcionalmente , se sustituye con un grupo que tenga un ligante sulfhidrilo (--SH), carboxilo (--COOH) o amino ( - -NH2) .
Incluso en otra modalidad, un oligonucleótido que tiene un grupo funcional introducido en una o más de las bases (por ejemplo, 5-aminoalquilpirimidina) se conjuga con un polímero (por ejemplo, copolímero de bloque) , en donde el polímero es un unímero o está presente en el portador polimérico ensamblado, proporcionado en la presente, mediante el uso de un agente de activación o un ligante bifuncional reactivo, según cualquiera de los procedimientos adecuados. Comercialmente, existe 1 una variedad de estos agentes activantes y ligantes bifuncionales y se pueden adquirir de Sigma, Pierce, Invitrogen y otros.
En algunas modalidades, el portador polimérico (por ejemplo, micela) que comprende un oligonucleótido o i una pluralidad de oligonucleótidos se forma por medio de autoensamblado espontáneo. El autoensamblado espontáneo del i portador polimérico se logra, en algunas modalidades, en un solo reactor. Por ejemplo, en algunas modalidades; un portador polimérico (por ejemplo, micela) autoensamblado mediante dilución de una solución de un polímero ¡ (por ejemplo, un copolímero de bloque) descrito aquí en i disolvente orgánico (por ejemplo, etanol) , con un iedio acuoso (por ejemplo, agua o PBS) , se combina con uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) , y por ello se forma de manera espontánea el portador polimérico que comprende los polímeros y uno o más polinucleótidos. En otras modalidades, el autoensamblado espontáneo se produce: (1) al poner en contacto uno ó más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) de interés con un polímero (por ejemplo, un copolímero de bloque o un polímero monobloque) descrito aquí, para formar un conjugado polímero-polinucleótido,- y (2) someter los conjugados polímero-polinucleótido a condiciones adecuadas para propiciar el autoensamblado de los conjugados polímero-polinucleótido que forma del portador polimérico descrito aquí. j ' Estructura polimérica En modalidades específicas, el portador polimérico proporcionado en la presente, comprende copolímeros de bloque, por ejemplo, copolímeros que tienen bloques distintos y copolímeros gradiente. En ciertas modalidades, los copolímeros de gradiente son aquellos que tienen un segmento hidrofílico (el cual deberá considerarse como una especie de un bloque hidrofílico de un copolímero de bloque descrito aquí) y un segmento hidrofóbico (el¡ cual deberá considerarse como una especie de bloque hidrofóbico I de un copolímero de bloque descrito aquí) . En ciertas modalidades, el segmento hidrofílico es un bloque j hidrofílico y el segmento hidrofóbico es un bloque hidrofóbico. En algunas modalidades, estos polímeros son no peptídicos. En otras modalidades, el segmento hidrofílico y el segmento hidrofóbico son diferentes regiones djs un copolímero de gradiente monobloque . En varios casos, un "segmento polimérico" es una sección polimérica con una propiedad física dada (por ejemplo, una propiedad física dada de un bloque descrito aquí, por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, susceptibilidad de adquirir carga, etc.) o que comprende uno o más bloques con propiedades físicas similares (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, susceptibilidad de adquirir carga, etc.¡).
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque de un portador polimérico descrito aquí tienen cada i uno: I (1) un bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de ' i envoltura) que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma la parte central hidrofóbica del portador polimérico ¡ (por ejemplo, micela) que se estabiliza por medio; de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que j forman la parte central .
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque i de un portador polimérico descrito aquí, tienen cada uno : (1) un bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) neutro o sin carga (prácticamente sin cairga) , i que forma la envoltura del portador polimérico ¡ (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma la parte central hidrofóbica del portador polimérico (por ejemplo, micela) que se estabiliza por medio de interacciones hidrofóbicas de los segmentos que forman el centro. En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico neutro o sin carga i I comprende una unidad monomérica de residuos monoméricos neutros como HPMA. i En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque j de un portador polimérico descrito aquí, tienen cada juno: (1) un bloque hidrofílico con carga (por ejemplo, un bloque I de envoltura) , catiónico o policatiónico que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela.) ; y i (2) un bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo], un i bloque central) que forma el centro hidrofóbico ! del i portador polimérico (por ejemplo, micela) que se estabiliza por medio de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman la parte central. En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico comprende una unidad i monomérica de residuos catiónicos como DMAEMA. En algunas modalidades, el bloque hidrofílico también comprendé una especie que protege, al menos en parte, la carga del bloque hidrofílico. Esta protección incluye protección dé : tipo estérica. ! En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque de un portador polimérico descrito aquí, tienen cada; uno: (1) un bloque hidrofílico con carga (por ejemplo, un bloque de envoltura) aniónico o polianiónico, que forma la i envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo,, un bloque central) que forma el centro hidrofóbico1 del portador polimérico (por ejemplo, micela) que se estabiliza por medio de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman el centro. En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico con carga, aniónico o polianiónico, comprende una unidad monomérica con residuos aniónicos como ácido acrílico o anhídrido maleico hidrolizado .
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque de un portador polimérico descrito aquí tienen cada uno: (1) un bloque hidrofílico con carga (por ejemplo, un bloque de envoltura) . zwiteriónico o polizwiteriónico, que forma la envoltura del portador polimérico (por ejemplo, micela) ; y (2) un bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma el centro hidrofóbico del portador polimérico (por ejemplo, micela) que se estabiliza por medio de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman el centro.
En modalidades específicas, la naturaleza del bloque hidrofílico (por ejemplo, catiónico, aniónico, neutro o zwiteriónico) es prácticamente idéntica a pH ácido (por ejemplo, a pH endosómico) que a un pH aproximado al neutro. Como resultado, al introducirse un portador polimérico en un endosoma, el bloque hidrofílico básicamente está en una forma idéntica a la que se encontraba antes de la captación por el endosoma.
En algunos casos, el segmento hidrofílico puede tener al menos dos funciones: una es formar la envoltura de la estructura micelar y la otra es unir uno o más polinucleótidos (por ejemplo, moléculas terapéuticas de tipo oligonucleótido, como ARNsi, o agentes de diagnóstico de tipo oligonucleótido como ARNsi marcado con un componente detectable, por ejemplo, radiomarcado, marcador de masa, fluoróforo, marcador PET, cromóforo, o lo similar) . En algunas modalidades, los copolímeros de bloque también comprenden especies susceptibles de adquirir carga o especies con carga (por ejemplo, especies y/o unidades monoméricas aniónicas y/o catiónicas, a pH fisiológico) y son desestabilizante de membrana (por ejemplo, desestabilizantes de membrana en función del pH)¦. En algunas modalidades, el bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo, bloque central) y/o la parte central del portador polimérico es en esencia de carga neta neutra (es decir, considerado en su conjunto, las cargas positivas y negativas están prácticamente balanceadas) . En algunas modalidades, el bloque en esencia hidrofóbico (por ejemplo, el bloque central) y/o la parte central del portador polimérico comprende una o más especies susceptibles de adquirir carga (por ejemplo, unidad monomérica, entidad, grupo, o lo similar) . En modalidades más específicas, el bloque en esencia hidrofóbico y/o parte central del portador polimérico comprende una pluralidad de especies catiónicas y una pluralidad de especies aniónicas. En modalidades aun más específicas, el bloque en esencia hidrofóbico y/o parte central del portador polimérico comprende un número prácticamente similar de especies catiónicas y aniónicas (es decir, el bloque hidrofóbico y/o la parte central son en esencia de carga neta neutra) .
En ciertas modalidades, un portador polimérico proporcionado en la presente, comprende un bloque hidrofóbico que contiene primeras y segundas especies susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la primera especie susceptible de adquirir carga es tal como se describe aquí y la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al protonarse . En modalidades específicas, la primera especie susceptible de adquirir carga está sin carga a pH ácido (por ejemplo, a pH endosómico, a pH inferior a aproximadamente 6.5, a pH inferior a aproximadamente 6.0, a pH inferior a aproximadamente 5.8, a pH inferior a aproximadamente 5.7, o lo similar). En modalidades específicas, el pKa de la segunda especie susceptible de adquirir carga es aproximadamente de 6 a aproximadamente 10, aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 9, aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 8 , aproximadamente de 6.5 a aproximadamente 7.5, o cualquier otro pKa adecuado. En ciertas modalidades, al menos una de las primeras especies susceptibles de adquirir carga y al menos una de segundas espécies susceptibles de adquirir carga, está presente en una , sola unidad monomérica. En algunas modalidades, la primera especie susceptible de adquirir carga se encuentra eri una primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga y la segunda especie susceptible de adquirir carga eíi la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga. En ciertas modalidades, la primera especie susceptible de adquirir carga es una especie aniónica al desprotonarse, la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al protonarse y la relación entré las i I especies aniónicas y las especies catiónicas es entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:2 y 3:2 o aproximadamente 1:1, a un pH aproximado al neutroi. En algunas modalidades, la relación entre la primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga y la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga es entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente 1:2 y aproximadamente 3:2 o aproximadamente 1:1. ! En el sentido que se utiliza en la presente, el término "copolímero" significa que el polímero es resultado de la polimerización de dos o más monómeros diferentes.
Un "polímero monobloque" es un producto sintético de una sola etapa de polimerización. El término polímero monobloque incluye un copolímero (es decir, un producto de la polimerización de más de un tipo de monómeros) y un homopolímero (es decir, un producto de polimerización de un solo tipo de monómeros) .
Un copolímero de "bloque" se refiere a: una estructura que comprende una o más combinaciones secundarias de unidades monoméricas o unidades constitutivas. En algunas modalidades, las unidades constitutivas se derivan de procesos adicionales a partir de uno o más monómeros polimerizables . En algunas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí, comprende unidades constitutivas o unidades monoméricas no lipídicas. En algunas modalidades, el copolímero de bloque de un copolímero dibloque. Un copolímero dibloque comprende dos bloques; una generalización esquemática de un polímero de este tipo de polímero representa así: [AaBbCc ...]m - [XxYyZz ...] n en donde cada letra designa un monómero o una unidad monomérica o constitutiva, y en donde cada subíndice dé una unidad constitutiva representa la fracción molar de esa unidad en el bloque particular, los tres puntos indican que puede haber más unidades constitutivas en cada bloque (por supuesto puede haber menos) y m y n indican el peso molecular de cada bloque en copolímero dibloque. Como lo sugiere el esquema, en algunos casos, el número y la naturaleza de cada unidad constitutiva se controla por separado para cada bloque. Se entiende que el esquema no significa ni deberá interpretarse como inferencia de alguna relación, cualquiera que esta sea, entre el número de unidades constitutivas o el número de diferentes tipos de unidades constitutivas en cada uno de los bloques. Ni tampoco el esquema describe ningún número o configuración particular de las unidades constitutivas dentro de un bloque particular. En cada bloque las unidades constitutivas pueden disponerse en una configuración meramente al azar, al azar alternante, alternante regular, un bloque regular o bloque al azar, a menos que expresamente se indique de otro modo. Una configuración meramente al azar seria, entre otras, por ejemplo: x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z-... Una configuración al azar alternante sería, entre otras, por ejemplo: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z... y una configuración alternante regular ej emplificativa sería, entre otras: x-y-z-x-y-z-x-y-z... Una configuración de bloque regular puede tener la siguiente configuración general': ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x-..., mientras que una configuración de bloque al azar puede tener la siguiente configuración general: x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-... En un polímero gradiente, el contenido de una o más unidades monoméricas aumenta o disminuye en forma gradual desde el extremo del polímero hasta el extremo ? . En ninguno de los ejemplos genéricos que anteceden ni la yuxtaposición particular de unidades constitutivas individuales o bloques ni el número de unidades constitutivas en un bloque ni el número de bloques, significan ni deberán interpretarse que de alguna manera influyen o limitan la estructura real de los copolímeros de bloque que forman el portador polimérico de esta invención.
En el sentido que se utiliza en la presente, los paréntesis que contienen las unidades constitutivas no significan ni deberán interpretarse en el sentido de que las unidades constitutivas por sí mismas forman bloques. Es decir, las unidades constitutivas dentro de los paréntesis cuadrados se pueden combinar de alguna manera con las otras unidades constitutivas dentro del bloque, es decir, configuraciones meramente al azar, al azar alternante, alternante regular, bloque regular o bloque al azar. Los copolímeros de bloque descritos aquí son opcionalmente , copolímeros de bloque alternantes, gradientes o al azar. En algunas modalidades, los copolímeros de bloque son copolímeros dendrímeros, de estrella o de injerto.
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque comprenden monómeros con instauraciones etilénicas. El término "monómero etilénicamente insaturado" se define en la presente como un compuesto que tiene al menos un doble enlace o un triple enlace entre carbonos. Ejemplos no limitativos de monómeros etilénicamente insaturados son: alquil (alquil) acrilato, metacrilato, acrilato, alquilacrilamida, metacrilamida, acrilamida, estireno, alilamina, alilamonio, dialilamina, dialilamonio, N-vinilformamida, éter vinílico, vinil sulfonato, ácido acrílico, sulfobetaína, carboxibetaína, fosfobetaíria o anhídrido maleico.
En varias modalidades, se usa cualquier monómero adecuado para proporcionar los polímeros y/o portadores poliméricos descritos aquí. En algunas modalidades, los monómeros adecuados para utilizarse en la preparación de los polímeros y portadores poliméricos de la presente, incluyen entre otros, uno o más de los siguientes monómeros: metacrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros) , metacrilato de butilo (todos los isómeros) , metacrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de isobornilo, ácido metacrílico, metacrilato de bencilo, metacrilato de fenilo, metacrilonitrilo, alfa-metilestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo (todos los isómeros) , acrilato de butilo (todos los isómeros) , acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de isobornilo, ácido acrílico, acrilato de bencilo, acrilato de fenilo, acrilonitrilo, estireno, acrilatos y estírenos seleccionados a partir de metacrilato de glicidilo, metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros) , metacrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros) , metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo, metacrilato de trietilenglicol , metacrilato de oligoetilenglicol , anhídrido itacónico, ácido itacónico, acrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de hidroxipropilo (todos i los isómeros) , acrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros) , acrilato de N, -dimetilaminoetilo, acrilato de N,N-dietilaminoetilo, acrilato de trietilenglicol, metacrilamida, N-metilacrilamida, N, N-dimetilacrilamida, N-ter-butilmetacrilamida, N-n-butilmetacrilamida, N-metilolacrilamida, N-etilolacrilamida , ácido vinil benzoico (todos los isómeros) , dietilaminoestireno (todos los isómeros) , ácido alfa-metilvinil benzoico (todos los isómeros) , dietilamino alfa-metilestireno (todos los isómeros) , ácido p-vinilbencensulfónico, sal sódica del ácido p-vinilbencensulfónico, metacrilato de trimetoxisililpropilo , metacrilato de trietoxisililpropilo , metacrilato de tributoxisililpropilo, metacrilato de dimetoximetilsililpropilo, metacrilato de dietoximetilsililpropilo, metacrilato de dibutoximetilsililpropilo, raetacrilato de diisopropoximetilsililpropilo, metacrilato de dimetoxisililpropilo, raetacrilato de dietoxisililpropilo, metacrilato de dibutoxisililpropilo, metacrilato de diisopropoxisililpropilo, acrilato de trimetoxisililpropilo, acrilato de trietoxisililpropilo, acrilato de tributoxisililpropilo , acrilato de dimetoximetilsililpropilo, acrilato de dietoximetilsililpropilo, acrilato de dibutoximetilsililpropilo, acrilato ' de diisopropoximetilsililpropilo, acrilato de dimetoxisililpropilo, acrilato de dietoxisililpropilo, acrilato de dibutoxisililpropilo, acrilato de diisopropoxisililpropilo, acetato de vinilo, butirato de vinilo, benzoato de vinilo, cloruro de vinilo, fluoruro de vinilo, bromuro de vinilo, anhídrido maleico, N- I arilmaleimida, N-fenilmaleimida, N-alquilmaleimida, N-butilmaleimida, N-vinilpirrolidona, N-vinilcarbazol , butadieno, isopreno, cloropreno, etileno, propileno, 1,5-hexadienos, 1, -hexadienos, 1, 3 -butadienos, 1,4-pentadienos, alcohol vinílico, vinilamina, N-alquilvinilamina, alilamina, N-alquilalilamina, dialilamina, N-alquildialilamina, alquilenimina, ácidos acrílicos, alquilacrilatos, acrilamidas, ácidos metacrílieos , alquilmetacrilatos , metacrilamidas , N- alquilacrilamidas , N-alquilraetacrilamidas , estireno, N-isopropilacrilamida, vinilnaftaleno, vinilpiridina, etilvinilbenceno, aminoestireno, vinilimidazol , vinilpiridina, vinilbifenilo, vinilanisol, vinilimidazolilo, vinilpiridinilo, vinilpolietilenglicol , dimetilaminometilestireno, metacrilato de etil trimetilamonio, acrilato de etiltrimetilamonio, dimetilaminopropilacrilamida, acrilato de \ etil trimetilamonio, metacrilato de etil trimetilamonio, trimetilamonio propil acrilamida, acrilato de dodecilo, acrilato de octadecilo o monómeros de metacrilato de octadecilo, o combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, como opción, se utilizan versiones de estos monómeros modificados con grupos funcionales. Un monómero modificado con grupos funcionales, en el sentido que se utiliza en la presente, es un monómero que comprende un grupo funcional enmascarado o no, por ejemplo, un grupo al que se le han unido otras entidades después de la polimerización. Los ejemplos no exclusivos de estos grupos son grupos amino primarios, carboxilos, tioles, hidroxilos, azidas y ciano. Existen varios grupos enmascarantes adecuados (véase, por ejemplo, T.W. Greene & P.G. . Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd Ed. J. Wiley & Sons, 1991 y P.J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994) .
Los polímeros descritos aquí se preparan de cualquier forma que sea adecuada. Los métodos sintéticos adecuados utilizados para producir los polímeros de la presente, incluyen, entre otros, los de polimerización catiónica, aniónica y de radicales libres. En algunos casos, cuando se usa un proceso catiónico, el monómero se trata con un catalizador que inicia la polimerización. Como opción, se usan uno o más monómeros para formar un copolímero. En algunas modalidades, este catalizador es un iniciador, que incluye, por ejemplo, ácidos protónicos (ácido de Bronsted) o ácidos de Lewis, si se usan los ácidos de Lewis, opcionalmente también se puede usar algún promotor como agua o alcoholes. En algunas modalidades, el catalizador es, por ejemplo, yoduro de hidrógeno, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, fluoruro de hidrógeno, ácido clorosulfónico, ácido metansulfónico , ácido trifluorometansulfónico, tricloruro de aluminio, cloruros de alquil aluminio, complejos de trifluoruro de boro, tetracloruro de estaño, pentacloruro de antimonio, cloruro de cinc, tetracloruro de titanio, pentacloruro de fósforo, oxicloruro de fósforo u oxicloruro de cromo. En ciertas modalidades, la síntesis del polímero se hace en limpio o en cualquier disolvente adecuado. Los disolventes adecuados incluyen, entre otros, pentano, hexano, diclorometano, cloroformo o dimetilformamida (DMF) . En ciertas modalidades, la síntesis del polímero se lleva a cabo a cualquier temperatura de reacción adecuada, que incluye, por ejemplo, desde aproximadamente -50°C a aproximadamente 100°C o desde aproximadamente 0°C a aproximadamente 70°C.
En ciertas modalidades, los polímeros se preparan por medio de una polimerización por radicales libres. Cuando se usa un proceso de polimerización por radicales libres, se proporciona (i) el monómero, (ii) opcionalmente, el comonómero y (iii) una fuente opcional de radicales libres para iniciar un proceso de polimerización por radicales libres. En algunas modalidades, la fuente de radicales libres es opcional porque algunos monómeros pueden autoinciarse con un calentamiento a alta temperatura. En ciertos casos, después de formar la mezcla de polimerización, la mezcla se somete a condiciones de polimerización. Las condiciones de polimerización; son aquellas condiciones que hacen que al menos un monómero forme al menos un polímero, tal como se comenta en la presente. Como característica opcional estas condiciones se modifican en cualquier aspecto que sea adecuado, por ejemplo, de manera no exclusiva, temperatura, presión, atmósfera, relación entre los componentes iniciales utilizados en la mezcla de polimerización y tiempo de reacción. La polimerización se lleva a cabo en cualquier forma que sea adecuada, que incluye, por e emplo, en solución, dispersión, suspensión, emulsión o en masa.
En algunas modalidades, los iniciadores están presentes en la mezcla de reacción. Como opción, se utiliza cualquier iniciador adecuado si es útil en el proceso de polimerización descrito aquí. Estos iniciadores incluyen, entre otros, uno o más alquil peróxidos, alquil peróxidos sustituidos, aril peróxidos, aril peróxidos sustituidos, acil peróxidos, alquil hidroperóxidos , alquil hidroperóxidos sustituidos, aril hidroperóxidos, aril hidroperóxidos sustituidos, heteroalquil peróxidos, heteroalquil peróxidos sustituidos, heteroalquil hidroperóxidos, heteroalquil hidroperóxidos sustituidos, heteroaril peróxidos, heteroaril peróxidos sustituidos, heteroaril hidroperóxidos, heteroaril hidroperóxidos sustituidos, alquil perésteres, alquil perésteres sustituidos, aril perésteres, aril perésteres sustituidos, o compuestos azo. En modalidades específicas, se usan ! como iniciadores peróxido de benzoílo (BPO - benzoyl peroxide) y/o AIBN ( 2 , 2 ' -azo-bis - isobutironitrilo) .
En algunas modalidades, los procesos de polimerización se llevan a cabo como polimerización viva, en cualquier forma que sea adecuada, entre las que se encuentran la polimerización por radicales con transferencia de átomos (ATRP - atom transfer radical polymerizatiorí) , polimerización viva por radicales libres mediada por nitróxido (NMP - nitroxide-mediated living free radical polymerization) , polimerización por apertura de anillo (ROP - ring-opening polymerization) , transferencia degenerativa (DT- degrenerative transfer) o transferencia por adición- fragmentación reversible (RAFT - reversible addition fragmentation transfer) . Mediante el usó de métodos de polimerización convencionales y/o polimerización viva/controlada, se pueden producir varias arquitecturas poliméricas, por ejemplo, copolímeros en bloque, de injerto, de estrella y gradiente, en las cuales la unidades monoméricas están distribuidas de forma estadística o en gradiente a lo largo de la cadena u homopolimerizadas en secuencia de bloque o injertos colgantes. En otras modalidades, los polímeros se sintetizan por diseño macromolecular a través de transferencia de cadena por adición - fragmentación reversible de xantatos (MADIX -macromolecular design via reversible addition-fragmentation chain transfer of xanthates) (Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, Núm. 18, 1497-1503 (2001)).
En ciertas modalidades, se usa la transferencia de cadena por adición- fragmentación reversible o RAFT, en la síntesis de los polímeros de cadena principal etilénica, de esta invención. La polimerización RÁFT es un proceso de polimerización viva. La RAFT consiste en un proceso degenerativo de transferencia de cadena por radicales libres. En algunas modalidades, los procedimientos RAFT para preparar un polímero descrito aquí, emplean compuestos tiocarboniltio, entre los cuales se encuentran, por ejemplo, ditioésteres , ditiocarbamatos , tiocarbonatós y xantatos que participan en la polimerización mediante un mecanismo de transferencia de cadena reversible. En ciertos casos, la reacción de un radical polimérico con el grupo C=S de cualquiera de los compuestos precedentes da lugar a la formación de radicales intermedios estabilizados. Por lo general, estos intermediarios de radicales estabilizados, no llevan a cabo las reacciones de terminación típicas de la polimerización estándar por radicales, sino más bien, reintroducen un radical con capacidad de reiniciación o propagación con monómero, regenerando el enlace C=S en el proceso. En la mayoría de los casos, este ciclo de adición al enlace C=S seguido de la fragmentación del radical resultante, continúa hasta que todos los monómeros se han consumido o la reacción se ha detenido. Por lo general, la baja concentración de radicales activos en cualquier momento particular, limita las reacciones de terminación normal.
En algunas modalidades, los copolímeros de bloque utilizados en los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionados en la presente, tienen índice de polidispersidad (PDI o polydispersity índex) bajo o diferencias en la longitud de la cadena. El índice de polidispersidad (PDI) se puede determinar de cualquier manera adecuada, por ejemplo, dividiendo el peso molecular promedio en peso de las cadenas de polímero entre el peso molecular promedio numérico. El peso molecular promedio numérico es la suma de pesos moleculares de las cadenas individuales, dividido entre el número de cadenas. El peso molecular promedio en peso, es proporcional al cuadrado del peso molecular dividido entre el número de moléculas de ese peso molecular. Puesto que el peso molecular promedio en peso siempre es mayor que el peso molecular promedio numérico, la polidispersidad siempre es mayor o igual a uno. A medida que los números se acercan y se acercan al mismo valor, es decir, a medida que la polidispersidad se acerca al valor de uno, el polímero está más cerca de ser monodisperso, en donde cada cadena tiene exactamente el mismo número de unidades constitutivas. Los valores de polidispersidad que se acercan a uno se logran por medio de polimerización viva por radicales. Los métodos para determinar la polidispersidad, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión luminosa dinámica, espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas de electropulverización acoplada a cromatografía, entre otros, son muy conocidos en la técnica. En algunas modalidades, los copolímeros de bloque de los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) que aquí se proporcionan, tienen un índice de polidispersidad (PDI) menor de 2.0 o menor de 1.5 o menor de 1.4 o menor de 1.3 o menor de 1.2.
Los procesos de polimerización descritos aquí opcionalmente se llevan a cabo en cualquier disolvente o mezcla de disolventes. Los disolventes adecuados incluyen agua, alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, butanol, tetrahidrofurano (THF) , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , dimetilformamida (DMF) , acetona, acetonitrilo, hexametilfosforamida, ácido acético, ácido fórmico, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, dioxano, cloruro de metileno, éter (por ejemplo, éter dietílico) , cloroformo y acetato de etilo. En un aspecto, el disolvente incluye agua y mezclas de agua y disolventes orgánicos miscibles con agua, como DMF.
En ciertas modalidades, el poli (DMAEMA) y otras entidades poliméricas utilizadas en la presente (por ejemplo, copolímeros o bloques de copolímero de BMA, DMAEMA y PAA) se preparan en cualquier forma que sea adecuada. En una modalidad, el poli (DMAEMA) se preparó por polimerización de DMAEMA en presencia de RAFT CTA, ECT y un iniciador de radicales. En algunas modalidades, se usó un bloque, poli (DMAEMA) macroCTA, para preparar una serie de copolímeros dibloque en donde el segundo bloque contenía BMA, DMAEMA y PAA. En otras modalidades específicas, se invirtió la orientación de los bloques del polímero dibloque, de manera que al autoensamblarse , el extremo ? del polímero se expone al segmento hidrofílico de la micela o portador polimérico. En varias modalidades, esto se logra de cualquier manera que sea adecuada, incluidas varias vías de síntesis. Por ejemplo, en algunas modalidades, la síntesis de los copolímeros de bloque descritos aquí, comienza con la preparación del bloque hidrofóbico PAA/BMA/DMAEMA que forma la parte central y el bloque hidrofílico con carga, que forma la envoltura, se adiciona en la segunda etapa de síntesis sometiendo el PAA/BMA/DMAEMA macroCTA resultante a una segunda etapa de polimerización RAFT. Otros enfoques alternos incluyen reducir el producto PAA/BMA/DMAEMA macroCTA para formar un extremo tiol y luego unir por covalencia un polímero hidrofílico preformado, con carga, al tiol obtenido. Este enfoque sintético aporta un método para la introducción de un grupo reactivo en la terminal co de la cadena polimérica expuesta a la superficie de la micela, ofreciendo así enfoques alternos para la conjugación química de la micela.
En algunas modalidades, los copolímeros de bloque se sintetizan por conjugación química de varios bloques poliméricos que se preparan por procesos de polimerización independientes .
Especies con carga y parte central hidrofobica En ciertas modalidades, el bloque hidrofóbico también comprende uno o más tipos de especies susceptibles de adquirir carga. En modalidades específicas, las especies susceptibles de adquirir carga, al cargarse se convierten en especies catiónicas. Los portadores poliméricos descritos aquí, que comprenden especies susceptibles de adquirir carga incluyen portadores poliméricos en los que cada especie susceptible de adquirir carga, de manera individual, está presente en el portador polimérico en su estado con carga o en su estado sin carga. Por otra parte, si los portadores poliméricos descritos aquí comprenden una población de una primera especie susceptible de adquirir carga, una población de una segunda especie susceptible de adquirir carga y/o una población de cualquier especie adicional susceptible de adquirir carga, los portadores poliméricos descritos aquí, incluyen portadores poliméricos en los que cada una de las poblaciones de la primera, segunda y cualquier otra especie susceptible de adquirir carga, de manera individual, está presente en el portador polimérico en un estado de carga completa, un estado de carga parcial o un estado totalmente sin carga.
En algunas modalidades, la especie susceptible de adquirir carga, aniónica, es cualquier residuo de ácido orgánico o inorgánico que, opcionalmente está presenté, ya sea como especie protegida, por ejemplo, un éster o como ácido libre, en el proceso de polimerización seleccionado. En algunas modalidades, la especie susceptible de adquirir carga aniónica es un ácido débil, como por ejemplo, los siguientes grupos: ácido borónico, sulfonamida, ácido fosfónico, ácido arsónico, ácido fosfónico, fosfato, ácido carboxílico, xantenos, tetrazol o sus derivados (por ejemplo, ésteres) . En ciertas modalidades, monómeros como el anhídrido maleico (Scott M. Henry, ohamed E. H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Alian S. Hoffman y Patrick S. Stayton "pH-Responsive Pol (styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery" Bio acromolecules 2006, 7, 2407-2414) se usan para la introducción de las primeras especies susceptibles de adquirir carga, por medio de hidrólisis, posterior a la polimerización, de las unidades monoméricas de anhídrido maleico. En modalidades específicas, las especies susceptibles de adquirir carga que son aniónicas al pH fisiológico normal, son los ácidos carboxílieos , por ejemplo, ácido 2 -propilacrílico o con más exactitud, la unidad constitutiva derivada de éste, el ácido 2-propilpropiónico, -CH2C( (CH2)2CH3) (COOH) (PAA) .
En algunas modalidades, la especie susceptible de adquirir carga es catiónica. En ciertas modalidades, la especie susceptible de adquirir carga es catiónica al pH fisiológico. En modalidades específicas, las especies catiónicas a pH fisiológico con especies nitrogenadas como amonio, -NRR'R", guanidinio ( -NRC ( =NR ' H) +NR"R 1 " , incluidas las formas ortodoxas que son conocidas para los expertos en la técnica) en donde los grupos R son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo o dos grupos R unidos al mismo átomo de nitrógeno o a átomos de nitrógeno adyacentes que también se pueden unir entre sí y formar especies heterocíclicas , por ejemplo, entre otras, pirrol, imidazol, indol . En algunas modalidades, la combinación de dos mecanismos de disgregación de membrana, (a) un policatión (como DMAEMA) y (b) un polianión hidrofobizado (como ácido propilacrílico) , al actuar juntos tienen un efecto aditivo o sinérgico sobre la potencia de desestabilización de membrana conferida por el polímero.
En algunas modalidades, los copolímeros de bloque comprenden una pluralidad de especies hidrofóbicas . En algunas modalidades, el copolímero de bloque comprende unidades monoméricas hidrofóbicas . En ciertas modalidades, la unidad monomérica hidrofóbica es un compuesto aromático o heteroaromático sustituido con vinilo. En otras modalidades específicas, los monómeros hidrofóbicos son alquil (alquil) acrilatos . En modalidades específicas, el monómero hidrofóbico es un derivado estireno.
En algunas modalidades, el polímero comprende unidades, monoméricas zwiteriónicas en donde una especie susceptible de adquirir carga aniónica y catiónica, está presente en la misma unidad monomérica.
En algunos casos, los copolímeros de bloque contienen monómeros que tienen grupos reactivos que se pueden usar para introducir, después de la polimerización, grupos funcionales adicionales mediante técnicas químicas conocidas, por ejemplo, química "click" (por ejemplo, reacciones "click", véase Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition : Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17) . En ciertas modalidades, un grupo reactivo es un grupo activado, que incluye, entre otros, grupos N-hidrosuccinimida (NHS) éster, HOBt (1-hidroxibenzotriazol) éster, p-nitrofenil éster, tetrafluorofenil éster, pentafluorofenil éster, piridil disulfuro, o lo similar.
En casos específicos, se proporcionan en la presente polímeros con la siguiente estructura: a- [Ds-Xt]b- [Bx-Py-Dj a-o¡> [Estructura 1] a- [Bx-Py-Dz] B- [D8-Xt]b-G> [Estructura 2] en donde x,y,z,s y t son la composición molar en % (por lo general, 0-50%) de las unidades monoméricas individuales D(DMAEMA), B(BMA), P(PAA) y un monómero neutro hidrofílico (X) en el bloque polimérico, a y b son los pesos moleculares de los bloques, [Ds-Xt] es el bloque hidrofílico y a y ? representan los extremos opuestos del polímero. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas modalidades, x es 60%, y es 20% y z es 20%. En ciertas modalidades, x es 70%, y es 15% y z es 15%. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas modalidades, x es 33%, y es 33% y z es 33%. En ciertas modalidades, x es 50%, y es 20% y z es 30%. En ciertas modalidades, x es 20%, y es 40% y z es 40%. En ciertas modalidades, x es 30%, y es 40% y z es 30%. En algunas modalidades, un portador polimérico descrito aquí comprende un bloque hidrofílico de aproximadamente 2,000 Da a aproximadamente 30,000 Da, aproximadamente 5,000 Da a aproximadamente 20,000 Da o aproximadamente 7,000 Da a aproximadamente 15,000 Da. En modalidades específica^, el bloque hidrofílico es de aproximadamente 7,000 Da, 8,000 Da, 9,000 Da, 10,000 Da, 11,000 Da, 12,000 Da, 13,000 Da, 14,000 Da o 15,000 Da. En ciertas modalidades, un portador polimérico descrito aquí comprende un bloque hidrofóbico de aproximadamente 2,000 Da a aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 10,000 Da a aproximadamente 50,000 Da, aproximadamente 15,000 Da a aproximadamente 35,000 Da o aproximadamente 20,000 Da a aproximadamente 30,000 Da. En algunas modalidades específicas, el polímero con un bloque hidrofílico de 12,500 Da y un bloque hidrofóbico de 25,000 Da (relación de longitud de 1:2) forma portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) . En algunas modalidades específicas, el polímero con un bloque hidrofílico de 10,000 Da y un bloque hidrofóbico de 30,000 Da (relación de longitud de 1:3) forma portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) . En algunas modalidades específicas, el polímero I con un bloque hidrofílico de 10,000 Da y un bloque hidrofóbico de 25,000 Da (relación de longitud de 1:2.5) forma portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) de aproximadamente 45 nm (según se determina por mediciones de dispersión luminosa dinámica o microscopía electrónica) . En algunas modalidades específicas, las micelas son de 80 ó 130 nm (según se determina por mediciones de dispersión luminosa dinámica o microscopía electrónica) . Por lo general, a medida que el aumenta el peso molecular (o longitud) de [Ds-Xt] , la cual forma la envoltura de la micela, con relación a - [Bx-Py-Dj , el bloque hidrofóbico que forma la parte central, aumenta el tamaño de la micela. En algunos casos, el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la envoltura [Ds-Xt] , es importante para que se permita una eficaz formación de complejo y/o neutralización I de carga con el medicamento oligonucleótido . Por ejemplo, en ciertos casos, para un AR si de aproximadamente 20 pares de bases (es decir, 40 cargas aniónicas) , un bloque catiónico es de una longitud adecuada que permite una unión eficaz, por ejemplo, 40 cargas catiónicas. Para un bloque de envoltura que contiene 80 monómeros DMAEMA (PM = 11., 680) con un valor pKa de 7.4, el bloque contiene 40 cargas catiónicas a pH 7.4. En algunos casos, se forman conjugados de polímero-ARNsi estables (por ejemplo, complejos) mediante interacciones electrostáticas entre cargas opuestas con números similares. En ciertos casos, evitar un gran número de cargas positivas en exceso, ayuda a prevenir toxicidad significativa in vitro e in vivo.
En modalidades específicas, el bloque hidrofóbico del copolímero de bloque comprende una pluralidad de especies susceptibles de adquirir carga, catiónicas, por ejemplo, dimetileminoetilmetacrilato (DMAEMA) . De este modo, en algunas modalidades, la estructura de este segmento polimérico se representa por la Estructura 3 : Qi- [ BMAjj-PAAy- DMAEMA. - ] Q2 [Estructura 3 ] en donde x, y, z son la composición % molar (por lo general, 0 a 50%) de las unidades monoméricas individuales y en donde la designación anterior denota otros bloques poliméricos o grupos funcionales terminales.
En ciertos casos, las unidades monoméricas individuales tienen funciones individuales y sinérgicas. Por ejemplo, el ácido polipropilacrílico, que contiene tanto especies aniónicas como especies hidrofóbicas , con un valor pKa de ~6.7 es hidrofílico arriba de un pH aproximado de 6.7 y se vuelve gradualmente hidrofóbico por debajo de un pH aproximado de 6.7, cuando los carboxilatos se protonan. En ciertos casos, el aumento en la hidrofobicidad del entorno local, por ejemplo, aumentar el % de moles de la unidad monomérica hidrofóbica predominante BMA en el bloque, aumenta la pKa de PAA y da como resultado la protonación del PAA a pH más alto, es decir, el bloque que contiene el PAA se vuelve más desestabilizante de membrana a un pH más alto y en consecuencia más sensible a cambios ácidos más pequeños a pH inferior al pH fisiológico de -7.4. En algunos casos, la protonación de PAA da como resultado un gran aumento en la hidrofobicidad y el posterior cambio conformacional hacia a una forma con propiedades desestabilizantes de la membrana. Una tercera unidad monomérica en el bloque polimérico escrito en lo anterior, es la especie catiónica, por ejemplo, DMAEMA, la cual en algunos casos, tiene varias funciones, entre las que se incluyen las siguientes. Cuando coincide en cuanto a cantidades molares equivalentes con las especies anióhicas de PAA, genera la neutralización de carga y el potencial para formar interacciones electrostáticas que pueden contribuir a la estabilidad del centro hidrofóbico de una estructura micelar, en donde, Qx o Q2 de la estructura anterior, es un bloque de homopolímero hidrofílico, por ejemplo, poli-DMAEMA.
Configuración del bloque En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido es catiónico al pH fisiológico o a un pH cercano a éste (por ejemplo, el pH del plasma humano circulante). En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido contiene un policatión. En algunas modalidades, el ácido nucleico (por ejemplo, ARNsi) es polianiónico y contiene x aniones y el bloque portador de polinucleótido contiene aproximadamente 0.6 x, aproximadamente 0.7 x, aproximadamente 0.8 x, aproximadamente 0.9 x, aproximadamente 1.0 x, aproximadamente 1.1 x cationes, o más. En modalidades específicas, el ácido nucleico (por ejemplo, ARNsi) es polianiónico y contiene x aniones y el bloque portador de polinucleótido contiene aproximadamente 0.7 x cationes, o más. En ciertas modalidades, las especies catiónicas del bloque portador de polinucleótido son especies nitrogenadas, entre otras, por ejemplo, amonio, -NRR'R", guanidinio ( -NRC (=NR ' H) +NR"R 1 " , incluidas las formas ortodoxas que son conocidas para los expertos en la técnica) en donde los grupos R son, de manera independiente, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arílo o dos grupos R unidos al mismo átomo de nitrógeno o a átomos de nitrógeno adyacentes que también se pueden unir entre sí y formar especies heterocíclicas , por ejemplo, pirrol, imidazol o indol . En algunas modalidades, el bloque portador de polinucleótido es una poliamida que se une a ácido nucleico, un intercalador, o un oligonucleótido que forma estructuras bicatenarias o tricatenarias . El bloque portador de polinucleótido puede ser un bloque de extremo o un bloque de extremo ? del copolímero de bloque. En modalidades específicas, el bloque portador de polinucleótido tiene un peso molecular promedio numérico ( n) de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 20,000 daltones. En otras modalidades, el bloque hidrofóbico (tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 50,000 daltones o aproximadamente 10,000 a aproximadamente 50,000 daltones.
En modalidades específicas, el copolímero de bloque (por ejemplo, copolímero dibloque) tiene la Fórmula química I : En algunas modalidades: A0, A1; A2, A3 y A4 se seleccionan a partir del grupo formado por -C-, -C-C-, -C (O) (C) aC (O) 0- , -0(C)aC(0)-y -0(C)b0-; en donde, i a es 1-4; ¡ b es 2-4; Y4 se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C (0) 0 (1C-10C) alquilo, C (0) R6 (1C-10C) , (4C-10C) heteroarilo y (6C- 10C) arilo y cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Yo' Yi, Y2< de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) alquilo, -C(O)0(2C-10C)alquilo, -0C(0) ( 1C- 10C) alquilo , -O(2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- -C(0)NR6(2C-10C) alquilo- , (4C-10C) heteroarilo y (6C-10C) arilo; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) alquilo, (4C-10C) heteroarilo y (6C-10C) arilo; en donde, los tomos de carbono tetravalente Ax-A4 que no están totalmente sustituidos con R^Rs y Y0-Y4 se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; Rlf R2, R3, R4, R5 y Rs se seleccionan, de manera i independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, de los cuales, cualquiera puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor; Q0 es un residuo seleccionado a partir del grupo formado por residuos que son hidrofílicos al pH fisiológico y al menos en forma parcial están cargados positivamente al pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo, o lo similar) ; al menos en forma parcial están cargados negativamente al pH fisiológico pero se protonan a pH inferior (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o lo similar) ; son prácticamente neutros (o sin carga) al pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxietilado , polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o lo similar) ; al menos parcialmente son zwiteriónicos al pH fisiológico (por ejemplo, un residuo monomérico que contiene un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; residuos susceptibles de conjugarse o incluir grupos funcionales (por ejemplo, residuos que comprenden un grupo reactivo, por ejemplo, azida, alquino, éster succinimida, éster tetrafluorofenilo, éster pentafluorofenilo, éster p-nitrofenilo, piridil disulfuro, o lo similar) ; o hidrógeno; Q1 es un residuo que es hidrofílico a pH fisiológico y al menos en forma parcial está cargado positivamente al pH fisiológico (por ejemplo, amino, i alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidma, ímidazolilo, piridilo, o lo similar) ; al menos en forma parcial está cargado negativamente al pH fisiológico pero se protona a pH inferior (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o lo similar) ; es prácticamente neutro (o sin carga) al pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxietilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o lo similar) ; o al menos parcialmente es zwiteriónico al pH fisiológico (por ejemplo, contiene un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; Q2 es un residuo que está cargado positivamente al pH fisiológico, que incluye, entre otros, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y piridilo; Q3 es un residuo que está cargado negativamente al H fisiológico, pero que se protona a un pH inferior, que incluye, entre otros, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato; m es aproximadamente 0 o menos de 1.0 ¦ (por ejemplo, 0 a aproximadamente 0.49); n es mayor de 0 a aproximadamente 1.0 (por ejemplo, aproximadamente 0.51 a 1.0); en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.9 (por ejemplo, aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5); q es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.9 (por ejemplo, aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5); en donde : r es 0 a aproximadamente 0.8 (por ejemplo, 0 a aproximadamente 0.6); en donde p + q + r - i v es aproximadamente de 1 a 25 kDa o aproximadamente de 5 a aproximadamente 25kDa; y w es aproximadamente de 1 a 50 kDa o aproximadamente de 5 a aproximadamente 50kDa.
En algunas modalidades, el número o proporción de residuos monoméricos representados por p y q están dentro de un valor aproximado de 30% uno con respecto a otro, aproximadamente 20% uno con respecto a otro, aproximadamente 10% uno con respecto a otro, o lo similar.
En modalidades específicas, p es prácticamente igual a q. En ciertas modalidades, la carga parcial incluye, en general, más allá de una cantidad traza de especies con carga, que incluye, por ejemplo, al menos 20% de residuos con carga, al menos 30% de residuos con carga, al menos 40% de residuos con carga, al menos 50% de residuos con carga, al menos 60% de residuos con carga, al menos 70% de residuos con carga, o lo similar.
En ciertas modalidades, m es 0 y Qx es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro (sin carga) al pH fisiológico. En algunas modalidades, "prácticamente sin carga" incluye que, por ejemplo, menos de 5% tienen carga, menos de 3% tienen carga, menos de 1% tienen carga, o lo similar. En ciertas modalidades, m es 0 y Qx es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es 0 y Qj es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es >0 y n s >0 y uno, ya sea Q0 o Qlf es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y el otro, ya sea Q0 o Q1( es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es >0 y n es >0 y uno, ya sea Q0 o Qlf es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico y el otro, ya sea Q0 o Qlf es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es >0 y n es >0 y Qj es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es susceptible de conjugarse o tener grupos funcionales. En ciertas modalidades, m es >0 y n es >0 y Q1 es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es susceptible de conjugarse o sustituirse con grupos funcionales.
En ciertas modalidades, un portador polimérico descrito aquí comprende un copolímero de bloque de Fórmula II: En algunas modalidades: A0, Ax, A2, A3 y A4 se seleccionan a partir del grupo formado por -C-C-, -C (O) (C) aC (O) O- , -0(C)aC(0)- y -0(C)bO-; en donde, a es 1-4; b es 2-4; Y0 y Y4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C- 10C) alquilo, C (O) NR6 ( 1C-10C) , (4C-10C) heteroarilo y (C6-C10) arilo y cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Y1; Y2, de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) lquilo, -C (O) O (2C-10C) lquilo, -OC(O) ( 1C- 10C) lquilo , -O(2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- , -C(0)NR6(2C-10C) alquilo- , (4C-10C) heteroarilo y (C6-C10) arilo; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) alquilo, (4C-10C) heteroarilo y (C6 -CIO) arilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente A1-Ai que no están totalmente sustituidos con í^-Rs y se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; Rlf R2, R3, R4, R5 y R6 se selecciona, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, de los cuales, cualquiera puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor .
Qi Y ¾ son residuos que al pH fisiológico tienen carga positiva, que incluyen, entre otros, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y piridilo .
Q3 es un residuo que al pH fisiológico tiene carga negativa pero que se protona a un pH inferior, que incluye, entre otros, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato. m es 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a 1.0; en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; en donde : p es prácticamente igual a q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 1 v es aproximadamente 5 a 25 aproximadamente kDa; w es aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En ciertas modalidades, un portador polimérico descrito aquí comprende un copolímero de bloque (por ejemplo, al pH fisiológico normal) de Fórmula III: En ciertas modalidades, A0, Ax, A2, A3 y A4 sustituidas como se indica, son las unidades constitutivas (indistintamente denominadas en la presente como "unidades monoméricas" o "residuos monoméricos " ) del polímero de Fórmula III. En modalidades específicas, las unidades monoméricas que constituyen los grupos A de la Fórmula III, en cuanto a polimerización, son compatibles en las condiciones apropiadas. En ciertos casos, una cadena principal o unidad constitutiva etilénica, -(C-C-)m-polímero, en donde cada C está disustituido con H y/o cualquier otro grupo adecuado, se polimeriza por medio de monómeros que contienen un doble enlace carbono-carbono, >C=C< . En ciertas modalidades, cada grupo A (por ejemplo, cada A0, A1( A2, A3 y A„) se puede seleccionar (de manera independiente) a partir de -C-C- (es decir, una unidad monomérica o cadena principal polimérica etilénica) , C(0) (C)aC(0)0- (es decir, una unidad monomérica o cadena polimérica principal polianhídrido) , -0(C)aC(0)- (es decir, una unidad monomérica o cadena polimérica principal poliéster) y -0(C)bO- (es decir, una unidad monomérica o cadena polimérica principal polialquilenglicol) o lo similar (en donde cada C está disustituido con H y/o con otro grupo adecuado como los que se describen en la presente, que incluyen, R12 y/o R13 según se describen n lo anterior) . En modalidades específicas, el término "a" es un entero de 1 a 4 y "b" es un entero de 2 a 4. En ciertos casos, cada grupo "Y" y "R" unido a la cadena principal de la Fórmula III (es decir, cualquiera de Y0, Y1# Y2, Y3, Y4, R1# R2, R3, R4, R5) está unido a cualquier "C" (que incluye cualquier (C)a o (C)b de la unidad monomérica específica. En modalidades específicas, tanto Y como R de una unidad monomérica específica están unidos al mismo "C" . En ciertas modalidades específicas, tanto Y como R de una unidad monomérica específica están unidos al mismo "C", el "C" es alfa respecto al grupo carbonilo de la unidad monomérica, en caso de estar presente.
En modalidades específicas, R^Rn se seleccionan, de manera independiente, a partir de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, 1C-5C alquilo, cicloalquilo (por ejemplo, 3C-6C-cicloalquilo) o fenilo, en donde cualquiera de Rj-Rn está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor, cicloalquilo o fenilo, los cuales, como opción, pueden estar también sustituidos con uno o más grupos alquilo.
En ciertas modalidades específicas, Y0 Y4, se seleccionan, de manera independiente, a partir de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, lC-10C-alquilo) , cicloalquilo (por ejemplo, 3C-6C-cicloalquilo) , O-alquilo (por ejemplo, O- (2C-10C) alquilo, -C (O) O-alquilo f (por ejemplo, -C (O) O- (2C-10C) -alquilo) o fenilo, de los cuales cualquiera, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor.
En algunas modalidades, Ylr Y2, se seleccionan, de manera independiente, a partir de un enlace covalénte, alquilo, de preferencia (1C-10C) -alquilo, -C (O) O-alquilo, de preferencia -C (0) 0- (2C-10C) -alquilo, -0C (0) alquile-, de preferencia -0C (0) - (2C-10C) alquilo, 0-alquilo, j de preferencia -O (2C-10C) alquilo y S-alquilo, de preferencia S- (2C-10C) alquilo . En ciertas modalidades, Y3 se selecbiona a partir de un enlace covalente, alquilo, de preferencia j (1C-5C) -alquilo y fenilo. j i En algunas modalidades, Z- está o no presente. En ciertas modalidades, en donde Rx y/o R4 es hidrógeno, Z- es 0H-. En ciertas modalidades, Z" es un contraión | (por ejemplo, uno o más contraiones) , de preferencia] un j contraión biocompatible, por ejemplo, cloruro, fosfato orgánico o inorgánico, sulfato, sulfonato, acetato, propionato, butirato, valerato, caproato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmitato, estearato, palmitoleato, oleato, linoleato, araquidato, gadoleato, vaccmato, lactato, glicolato, salicilato, desaminofenilalanina, desaminoserina, desaminotreoniná, e-hidroxicaproato, 3 -hidroxibutirato, -hidroxibutirato jo 3-hidroxivalerato, entre otros. En algunas modalidades, cuando cada Y, R y fluoro opcional están unidos! por covalencia a un carbono de la cadena principal i í seleccionada, cualquiera de los carbonos que no esté sustituido totalmente, se completa con el número correspondiente de átomos de hidrógeno. Los números m, n, p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en su bloque, v, w, representan el peso molecular de cada bloque.
En ciertas modalidades, A0, Alf A2, A3 y A4 se seleccionan a partir del grupo formado por -C-, -C-C-, -C(0) (C R12R13) aC (0) 0- , -0(C R12R13)aC(0) - y 0(C R12R13)bO; en donde : a es 1-4; b es 2-4; Rj , R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7, R8 , R9 , io/ ^-íii ^12» Y ^13 se seleccionan, de manera independiente, del grupo formado por hidrógeno, (1C-5C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, (5C-10C)arilo, (4C-10C) heteroarilo, de los cuales cualquiera, como opción, puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor; Y0 y Y4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C-10C) alquilo y fenilo y cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Yj y Y2, de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) alquilo, -C (O) O (2C-10C) alquilo, -OC(O) (1C-10C) alquilo, -O (2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- ; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-5C) alquilo y fenilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente A1-A4 que no están totalmente sustituidos con Ri-Rs y Y0~Y se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno ; Z es uno o más contraiones fisiológicamente aceptables, ! m es 0 a aproximadamente 0.49; n es de aproximadamente 0.51 a 1.0; en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; en donde : ' p es prácticamente igual a q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = l v es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa o aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y w es aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En una modalidad específica, A0, Ax, A2, A3 y A4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por -C-C-, C(O) (C)aC(0)0-, -0(C)aC(0)- y -0(C)bO-; en donde, a es 1-4; b es 2-4,- R-L, R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7, R8 , R9, R10 y 11( se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-5C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo y fenilo, de los cuales, como opción, cualquiera puede Í estar sustituido con uno o más átomos de flúor; ' Y0 y Y„ se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C-10C) alquilo y fenilo, cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Y1 y Y2, de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-lOOalquilo, -C (O) 0 (2C-10C) alquilo, -OC(0) (1C-10C) alquilo, -O(2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- ; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-5C) alquilo y fenilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente Ax-A4 que no están totalmente sustituidos con R^Rs y 0-Y4 se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; Z es un contraión fisiológicamente aceptable, m es de 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente de 0.51 a aproximadamente en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; p es prácticamente igual a q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; w es aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa. En algunas modalidades, Ai es -C-C- ; i Y1 es -C(0) OCH2CH2- ; ' R6 es hidrógeno; R7 y R8 son cada uno -CH3; y R2 es -CH3.
En algunas modalidades, Y2 es -C(0)OCH2CH2-; R9 es hidrógeno; Rio Y R son cada uno -CH3; y R3 es -CH3.
En algunas modalidades, A3 es -C-C-; Y3 es un enlace covalente; y Z" es un anión fisiológicamente aceptable. En algunas modalidades: A4 es -C-C-; R5 se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno y -CH3; y Y4 es -C(O) 0(CH2) 3CH3.
En algunas modalidades: A0 es -C-C-; Ri se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno y (1C-3C) alquilo; y Y0 se selecciona a partir del grupo formado por -C(0)0(lC-3C)alquilo.
En algunas modalidades, m es 0.
En algunas modalidades, r es 0.
En algunas modalidades, m y r son 0.
En varias modalidades descritas aquí, las unidades constitutivas descritas aquí, que son catiónicas o tienen carga positiva al pH fisiológico ( incluidas ,¡ por ejemplo, ciertas unidades constitutivas hidrofílicas) contienen uno más grupos amino, alquilamino, guanidina, imidazolilo, piridilo, o lo similar, o las formas de éstos protonadas, alquiladas o cargadas de otro modo. En algunas modalidades, las unidades constitutivas que son catiónicas al pH fisiológico normal y que se utilizan en la presente, incluyen, por ejemplo, residuos monoméricos de dialquilaminoalquilmetacrilatos (por ejemplo, DMAEMA) . En varias modalidades descritas aquí, las unidades constitutivas que son aniónicas o tienen carga negativa a pH fisiológico (incluidas, por ejemplo, ciertas unidades i constitutivas hidrofílicas) , descritas aquí, comprenden uno o más grupos ácidos o bases conjugadas de los mismos ¡ que incluyen, por ejemplo, carboxilato, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o lo similar. En algunas modalidades, las unidades constitutivas utilizadas aquí, que son aniónicas o tienen carga negativa al pH fisiológico normal, incluyen entre otras, por ejemplo, residuos monoméricos de ácido acrílico, ácido alquilacrílico (por ejemplo, ácido metilacrílico, ácido etilacrílico, ácido propilacrílico , etc.), o lo similar. En varias modalidades descritas aquí, las unidades constitutivas que son neutras al pH fisiológico, comprenden uno o más grupos hidrofílieos , por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxietilado , polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o lo similar. En algunas modalidades, las unidades constitutivas hidrofílicas que son neutras al pH fisiológico normal y que se utilizan en la presente, incluyen entre otras, por ejemplo, residuos monoméricos de ácido acrílico PEGilado, ácido metacrílico PEGilado, ácido hidroxialquilacrílico , ácido hidroxialquilalcacrílico (por ejemplo, HPMA) , ¡o lo similar. En varias modalidades descritas aquí, las unidades constitutivas hidrofílicas que son zwiteriónicas l pH fisiológico, comprenden, a pH fisiológico, un ¡grupo aniónico o con carga negativa y un grupo catiónico o con carga positiva, a pH fisiológico. En algunas modalidades , las unidades constitutivas hidrofílicas que j son zwiteriónicas al pH fisiológico normal y que se utilizan en la presente, incluyen entre otras, por ejemplo, residuos monoméricos que contienen un grupo fosfato y un ¡grupo amonio a pH fisiológico, como se expone en la Patente de los Estados Unidos Núm. 7,300,990, la cual se considera parte de la presente, para la exposición o lo similar.
En ciertas modalidades, los polímeros proporcionados en la presente también comprenden una más unidades constitutivas que tienen una cadena lateral conjugable o susceptible de recibir grupos funcionales| (por ejemplo, un grupo colgante de un residuo monomérico) . En algunos casos, una cadena lateral conjugable o susceptible de recibir grupos funcionales es un grupo que tiene µ?? o más grupos reactivos que se pueden usar para introducir, después de la polimerización, grupos funcionales adicionales mediante técnicas químicas conocidas, por ejemplo, química "click" (por ejemplo, reacciones "click", véase Wu, P. ; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17). En ciertas modalidades, las cadenas laterales conjugables o susceptibles de recibir grupos funcionales contienen uno o más grupos activados adecuados, que incluyen, entre otros, grupos N-hidrosuccinimida (NHS) éster, HOBt (1-hidroxibenzotriazol) éster, p-nitrofenil éster, tetrafluorofenil éster, pentafluorofenil éster, piridil disulfuro, o lo similar.
En ciertas modalidades, se proporciona un copolímero de bloque que es un copolímero dibloque que tiene la Fórmula química I (a pH fisiológico normal o : a pH aproximado al neutro) : (IV1 En ciertos casos, las unidades constitutivas del compuesto IVl son como se muestran dentro de los paréntesis cuadrados a la izquierda y los paréntesis curvos a la i derecha y se derivan de los monómeros : J Las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva del bloque. Las letras ;v, w representan el peso molecular (promedio numérico) de ' cada bloque en el copolímero dibloque. j En algunas modalidades, se proporciona aquí un compuesto que tiene la estructura: 1 Como se comentó en lo anterior, las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en el bloque. Las letras v, w representan el peso molecular (promedio numérico) de cada bloque en el copolímero dibloque .
En algunas modalidades, se proporcionan aquí los siguientes polímeros: i [DMAEMA] v- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV3 1 [PEGMA]V- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV4 [PEGM^- / -DMAEMAjJ v- [Bp- /Pq- / -Dr] w IV5 [PEGMAm-/-MAA(NHS)Jv- [Bp- /Pq- / -Dr] w IV6 [DMAEMA,.- /-MAA(NHS) n] v- [Bp- /Pq- / -Dr] w IV7 [HPMA^Z-PDSMJ,- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV8 [PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/Pq-/-Dr]w IV9 En algunas modalidades, B es un residuo de metacrilato de butilo; P es un residuo de ácido propilacrílico; D y DMAEMA son residuos de metacrilato de dimetilaminoetilo; PEGMA es un residuo de metacrilato de polietilenglicol (por ejemplo, con 1 a 20 unidades de óxido de etileno, como se ilustra en el compuesto IV2 o 4 a 5 unidades de óxido de etileno ó 7 a 8 unidades de óxido de etileno) ; MAA(NHS) es un residuo de N-hidroxisuccinimida de ácido metacrílico; HPMA es un residuo de N- (2-hidroxipropil)metacrilamida; y PDSM es un residuo metacrilato de piridil disulfuro. En ciertas modalidades, los términos m, n, p, q, r, w, v son según se describen aquí. En modalidades específicas, w es aproximadamente 0. lx a 5x aproximadamente lx a 5x v.
Los compuestos IV1-IV9 son ejemplos de polímeros que se proporcionan en la presente, que comprenden una variedad de unidades constitutivas que forman el primer bloque del polímero. En algunas modalidades, las unidades constitutivas del primer bloque se modifican o se tratan químicamente a fin de generar polímeros en donde el primer bloque es o comprende una unidad constitutiva que es neutra (por ejemplo, PEGMA) , catiónica (por ejemplo, DMAÉMA) , aniónica (por ejemplo, PEG A-NHS, en donde NHS se hidróliza para obtener el ácido o ácido acrílico) , anfolítica (por ejemplo, DMAEMA-NHS, en donde NHS se hidróliza para obtener el ácido) o zwiteriónica (por ejemplo, poli [2-metacriloiloxi-21 -trimetilamoniometil fosfato]). En algunas modalidades, los polímeros contienen grupos funcionales piridil disulfuro en el primer bloque, por ejemplo, [PEGMA-PDSM] - [B-P-D] que pueden reaccionar y opcionalmente reaccionan con un derivado tiol de ARNsi y forman un conjugado de polímero-ARNsi .
En una modalidad específica, un compuesto de Fórmula IV3 es un polímero de clase P7, tal como se describe en la presente, y tiene el peso molecular, la polidispersidad y composición monomérica que se presentan en la Tabla 1. 3 Según se determina con columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Mongomeryville, PA) conectadas en serie a un equipo Viscotek GPCmax VE2001 y refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) .
Como fase móvil se usó DMF grado HPLC {high performance liquid chromatography o cromatografía de líquidos de alta resolución) que contenía 0.1% en peso de LiBr. Los pesos moleculares de los copolímeros sintetizados se determinaron utilizando una serie de estándares de poli (metacrilato de metilo).
Según se determina por espectroscopia XH RMN (3% en peso en CDC13; Bruker DRX 499) .
En algunas modalidades específicas, un polímero de Fórmula IV3 es un polímero clase P7 según la Tabla 2 · Tabla 2 En una modalidad específica, un compuesto de Fórmula IV3 es un polímero de clase P7 denominado PRx0729v6. En esta solicitud y en varias solicitudes de prioridad, las designaciones PRx0729v6 y P7v6 se usan indistintamente .
Bloque espaciador En algunas modalidades, los copolímeros de bloque de la presente invención comprenden uno o más bloques opcionales . Estos bloques pueden ser bloques espaciadores .
En ciertas modalidades, al menos un copolímero de bloque descrito aquí comprende también un bloque espaciador. En algunas modalidades, el bloque espaciador es un bloque hidrofílico entre el bloque hidrofóbico y un bloque portador de polinucleótido .
Protección del segmento/bloque hidrofílico En ciertas modalidades, los portadores poliméricos descritos aquí comprenden uno o más agentes de protección. En algunas modalidades, el bloque o segmento portador de polinucleótido, comprende una unidad monomérica sustituida con PEG (por ejemplo, el PEG es una cadena lateral y no constituye la cadena principal del bloque portador del polinucleótido) . En algunos casos, uno o más de los polímeros (por ejemplo, copolímeros de bloque) utilizados en los portadores poliméricos descritos aquí contienen cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1,000 a aproximadamente 30,000. En algunas modalidades, el PEG se conjuga con grupos terminales de los polímeros o con uno o más de los grupos modificables colgantes presentes en un polímero de un portador polimérico de la presente. En algunas modalidades, los residuos PEG se conjugan con grupos modificables dentro del segmento o bloque hidrofílico (por ejemplo, un bloque de envoltura) de un polímero (por ejemplo, copolímero de bloque) de un portador polimérico de la presente. En ciertas modalidades, un monómero que contiene un residuo PEG de 2 a 20 unidades de óxido de etileno, se copolimeriza para formar la porción hidrofílica del polímero que constituye el portador polimérico de la presente.
En algunos casos, un agente de protección aumenta la estabilidad del agente terapéutico (por ejemplo, polinucleótido o péptido, etc.) frente a la digestión enzimática en el plasma. En algunos casos, un agente de protección reduce la toxicidad de los portadores poliméricos descritos aquí (por ejemplo, de un copolímero de bloque unido a polinucleótidos) . En algunos casos, un agente protector imparte una propiedad superficial favorable al portador polimérico. En algunas modalidades, un agente protector comprende una pluralidad de residuos monoméricos hidrofílicos neutros. En algunos casos, un polímero protector está unido por covalencia a un copolímero de bloque desestabilizante de membrana a través de un grupo terminal del polímero. En algunas modalidades, un agente protector es una entidad colgante unida por covalencia a uno o más residuos monoméricos del polímero. En algunas modalidades, una pluralidad de residuos monoméricos en un portador polimérico descrito aquí contiene especies protectoras colgantes (por ejemplo, un oligómero de polietilenglicol (PEG) (por ejemplo, que tenga 20 o menos unidades repetidas) o un polímero de polietilenglicol (por ejemplo, que tenga más de 20 unidades repetidas) ) unidas por covalencia a través de un grupo funcional al oligómero o polímero de polietilenglicol. En algunos casos, un copolímero de bloque comprende un oligómero o polímero de polietilenglicol (PEG) unido por covalencia al extremo alfa o al extremo omega del bloque desestabilizante de membrana del copolímero.
En ciertas modalidades, el bloque/segmento portador de polinucleótido comprende una unidad monomérica que sirve para proteger, al menos en parte, la carga (por ejemplo, cargas catiónicas) en el bloque/segmento portador de polinucleótido. En modalidades particulares, la i protección se genera, al menos en parte, a partir de una entidad colgante de la unidad monomérica que constituye, al menos en parte, el bloque/segmento portador de polinucleótido. Esta protección, opcionalmente , disminuye la toxicidad celular derivada de las cargas excesivas en este segmento.
Unión del polinucleótido a los polímeros del portador polimérico En algunas modalidades, un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) está unido (por ejemplo, por unión covalente o no covalente) a uno o más de la pluralidad de polímeros de cualquier portador polimérico descrito aquí. En estas modalidades, el polinucleótido se puede unir al o los polímeros mediante cualquier técnica adecuada (por ejemplo, técnica de conjugación química) . En modalidades específicas, el polinucleótido está unido a un segmento o bloque portador de polinucleótido de un polímero del portador polimérico. En ciertas modalidades específicas, el polinucleótido está unido al extremo alfa del polímero o a uno cercano (es decir, el extremo en donde se inició la polimerización) o al extremo omega del polímero o a uno cercano (es decir, el extremo en donde se terminó la polimerización) de un polímero de cualquier portador polimérico descrito en la presente. En algunas modalidades específicas, un polinucleótido está unido a un polímero de cualquier portador polimérico descrito aquí, por conjugación del polinucleótido con una entidad conjugable en el extremo alfa del polímero. En ciertas modalidades específicas, un polinucleótido está unido a un polímero de cualquier portador polimérico descrito aquí, por conjugación del polinucleótido con una entidad conjugable en el extremo omega del polímero. En varias modalidades, un polinucleótido es un polinucleótido que está unido a un polímero de cualquier portador polimérico descrito aquí por conjugación del polinucleótido con una entidad conjugable en el extremo alfa del polímero unido al polímero a través de una entidad ligante (por ejemplo, un enlace covalente o una entidad química) . En algunas modalidades, los polinucleótidos se conjugan a grupos colgantes unidos a las unidades monoméricas del polímero. En varias modalidades, la entidad enlazante o ligante es, opcionalmente, escindible o no escindible. En ciertas modalidades, un enlace escindible que une el polinucleótido con un polímero de un portador polimérico descrito aquí, incluye entre otros, por ejemplo, enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro que se disocian en el entorno reductor del citoplasma) . El algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o tiene un enlace que es escindible en las condiciones endosómicas. En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o tiene un enlace que es escindible por la acción de una enzima específica (por ejemplo, una fosfatasa o una proteasa) . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o tiene un enlace que es escindible frente a un cambio en un parámetro intracelular (por ejemplo, pH, potencial redox) . En algunas modalidades, la asociación covalente entre un polímero (por ejemplo, el grupo conjugable terminal alfa u omega del polímero) y un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNsi) se logra a través de cualquier método de conjugación química adecuado, que incluye, entre otros, ligantes amino-carboxilo, amino-aldehído, amino-cetona, amino carbohidrato, amino-hidroxilo, amino-amino, carboxilo-sulfhidrilo, carboxilo-carbohidrato, carboxilo-hidroxilo, carboxilo-carboxilo, sulfhidrilo-carbohidrato, sulfhidrilo-hidroxilo, sulfhidrilo- sulfhid ilo, carbohidrato-hidroxilo, carbohidrato-carbohidrato e hidroxilo-hidroxilo. En algunas modalidades, se emplea un reactivo reticulante bifuncional para lograr la conjugación covalente entre los grupos conjugables adecuados de un polinucleótido y un polímero de un portador polimérico descrito aquí. En algunas modalidades, la conjugación también se lleva a cabo con enlaces y ligantes sensibles al i pH, que incluyen, entre otros, enlaces hidrazona y ac^tal. En ciertas modalidades, un polinucleótido se une| por covalencia a un grupo funcional de ácido borónico ' (por ejemplo, un residuo de ácido fenilborónico) incorporado en el extremo alfa u omega del polímero a través djs la formación de un éster del ácido borónico con el hidróxilo 2' y 3' del residuo de ribosa terminal del polinucleótido. Como opción, también se puede usar cualquier otro método de unión/conjugación que sea adecuado, por ejemplo, se dispone de una gran variedad de técnicas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, < Eds . Macmillan, 1998 y los capítulos que contiene) . Por ! otra parte, en ciertas modalidades, un polinucleótido se une a un polímero de un portador polimérico o al bloque portador de polinucleótido del mismo (por ejemplo, un bloque portador de polinucleótido con carga catiónica) , formando en complejo del polinucleótido con el polímero a través de interacciones iónicas (es decir, aniónicas-catiónicas) Suministro dirigido En casos específicos, los portadores poliméricos i proporcionados en la presente, son útiles para suministrar polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a las células de un individuo, los cuales se pueden dirigir de manera específica a un tipo de célula seleccionada. En ciertos casos, la eficiencia de la captación celular de los portadores poliméricos (por ejemplo, portadores poliméricos que comprenden un polinucleótido, como oligonucleótidos o ARNsi) se mejora por la incorporación de entidades dirigidas (targeting moieties) en el interior o en la superficie del portador polimérico. Así, en algunas modalidades, se proporciona en la presente un portador polimérico que comprende un agente dirigido o dirigible ( targeting agent) . Una "entidad dirigida" (término utilizado de manera indistinta con "agente dirigido o dirigible") reconoce la superficie de una célula (por ejemplo, de una célula seleccionada) . En modalidades específicas, las entidades dirigidas se unen a la superficie de una célula (por ejemplo, una célula seleccionada) . En algunas modalidades, las entidades dirigidas reconocen un antígeno de superficie celular jo se unen a un receptor en la superficie de la célula diana. Las entidades dirigidas adecuadas incluyen, entre otras, anticuerpos, moléculas tipo anticuerpos o péptidos, como los péptidos que se unen a integrina, por ejemplo, péptidos que contienen RGD o moléculas pequeñas como vitaminas; por ejemplo, folato, azúcares como lactosa y galactosa u otras moléculas pequeñas. Los antígenos de superficie celular incluyen una molécula de superficie celular como una proteína, un azúcar, lípido u otro antígeno en la superficie celular. En modalidades específicas, el ant,ígeno de superficie celular es objeto de internalización. Ejemplos de antígenos de superficie objetivados por las entidades dirigidas de los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) descritos aquí incluyen, entre otros, el receptor de transferrina tipo 1 y 2, el receptor de' EGF, HER2/Neu, receptores VEGF, integrinas , NGF, CD2 , CD3 , CD4 , CD8, CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69 y el receptor de asialoglucoproteína.
La entidades dirigidas están unidas, en varias modalidades, a un extremo del polímero (por ejemplo, copolímero de bloque) o a una cadena lateral de una unidad monomérica o bien está incorporado en un bloque polimérico. La unión al polímero de la entidad dirigida se logra de cualquier manera que sea adecuada, por ejemplo, por cualquiera de varios enfoques de reacciones químicas de conjugación, que incluyen, entre otras, ligantes amino-carboxilo, amino-sulfhidrilo, amino-carbohidrato, amino-hidroxilo, amino-amino, carboxilo-sulfhidrilo, carboxilo-carbohidrato, carboxilo-hidroxilo, carboxilo-carboxilo, sulfhidrilo-carbohidrato, sulfhidrilo-hidroxilo, sulfhidrilo-sulfhidrilo, carbohidrato-hidroxilo, carbohidrato-carbohidrato e hidroxilo-hidroxilo . En modalidades específicas, se usan técnicas químicas como química "click" para unir el ligando dirigido con los copolímeros de bloque de los portadores poliméricos descritos aquí (por ejemplo, reacciones "click", véase Wu, P. ; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition : Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17) . Opcionalmente , se puede utilizar una amplia variedad de técnicas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds . Macmillan, 1998 y los capítulos que contiene) . En algunas modalidades, los ligandos dirigidos se unen a un monómero y el compuesto resultante se usa entonces en la síntesis de polimerización de un polímero (por ejemplo, copolímero de bloque) que se utiliza en un portador polimérico descrito aquí. En algunas modalidades, las entidades dirigidas se unen a un bloque del primer copolímero de bloque o a un bloque del segundo copolímero de bloque (por ejemplo, cuando el primer copolímero de bloque se une a un polinucleótido, por ejemplo, un ARNsi) . En algunas modalidades, el ligando dirigido se une a una hebra codificante o a una hebra antisentido de un ARNsi unido a un copolímero de bloque. En ciertas modalidades, el agente dirigido se une a un extremo 51 ó 3 ' de la hebra codificante o de la hebra antisentido.
En modalidades especificas, los copolímeros de bloque que forman los portadores poliméricos descritos aquí, son biocompatibles . En el sentido que se utiliza en la presente, "biocompatible" se refiere a la propiedad de un polímero caracterizado porque éste o sus productos de degradación in vivo no perjudican al tejido vivo o lo hacen en forma mínima y/o reparable; y/o no causan una reacción inmunológica en el tejido vivo o lo hacen en forma mínima o controlable. Con respecto a las sales, de preferencia, tanto las especies catiónicas como las aniónicas, son biocompatibles. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "fisiológicamente aceptable" se usa indistintamente con el término "biocompatible". En algunos casos, los portadores poliméricos y polímeros utilizados en aquellos (por ejemplo, copolímeros de bloque) exhiben baja toxicidad en comparación con los lípidos catiónicos.
En algunas modalidades, los portadores poliméricos proporcionados en la presente tienen mayor viabilidad comercial en comparación con otras tecnologías propias para el suministro de polinucleótidos , entre los factores se incluyen, menor inmunogenicidad del portador después de repetir la administración in vivo; se requieren menos pasos para unir los múltiples elementos del vehículo de suministro, lo cual da como resultado un costo menor de los productos; y reproducibilidad durante la fabricación, por ejemplo, al evaluar la capacidad para fabricar lotes repetidos de producto con menos de 5%, menos de 10% o menos de 20% de variabilidad entre lote y lote en cuanto a la valoración de propiedades biofísica (que incluye, por ejemplo, el uso de HPLC, GPC, DLS y TEM) .
Captación celular En algunas modalidades, los portadores poliméricos que comprenden polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos o AR si) se suministran a la célula por endocitosis. Los términos "vesículas intracelulares" y "endosomas" se usan indistintamente en esta especificación. El suministro exitoso de polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) al citoplasma, por lo general, tiene un mecanismo de escape endosómico. En ciertos casos, los portadores poliméricos que comprenden los polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) descritos aquí, son sensibles al bajo pH del compartimiento endosómico durante la endocitosis. En ciertos casos, la endocitosis desencadena la protonacion o neutralización de carga de especies susceptibles de adquirir carga que se convierten en unidades o especies aniónicas (por ejemplo, unidades de ácido propil acrílico) del portador polimérico, dando lugar a una transición conformacional del portador polimérico. En ciertos casos, esta transición conformacional da como resultado una forma más desestabilizante de la membrana hidrofóbica que participa en la liberación del polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) de los endosomas al citoplasma. En aquellos portadores poliméricos que comprenden otro tipo de oligonucleótidos , el suministro al citoplasma permite que se presente la acción deseada. I i Polinucleótidos j Los portadores poliméricos descritos aquí también son útiles para el suministro de polinucleótidos a un individuo que los necesite. Los polinucleótidos son polímeros de ácido nucleico que tienen una pluralidad de nucleótidos, por ejemplo, más de 200 nucleótidos. En una I modalidad, el polinucleótido es un vector de expresión de mamífero. En otra modalidad, el polinucleótido 'está diseñado para recombinarse con una secuencia génica endógena y corregirla en un humano. En algunas modalidades, un polinucleótido incorporado en un portador polimérico descrito aquí, es un modulador de expresión génicaj. En ciertas modalidades , un polinucleótido incorporado e'n un portador polimérico descrito aquí, es un agente de silenciamiento génico (knockdown agent) (por ejemplo, un oligonucleótido de silenciamiento génico, como ARNsi) Los polinucleótidos utilizados en la presente, como opción, I incluyen también ARN mensajero (ARNm) , señuelos ARN o ADN (por ejemplo, que compiten por la unión de una secuencia de ácido nucleico endógena con su objetivo intracelular) o aptámeros de ácido nucleico (por ejemplo, que se unen a macromoléculas intracelulares) .
Un vector de expresión de mamífero comprende una secuencia de ADN complementaria (un "ADNc" o un "mini-gen") que está unido funcionalmente a una región promotora, de manera que el promotor dirige la expresión del ADNc. En ciertos casos, los vectores de expresión de mamífero también contienen una señal de poliadenilación en el extremo 3' del ADNc. Una región promotora es un segmento nucleotídico que es reconocido por una molécula de ARN polimerasa a fin de iniciar la síntesis de ARN (es decir, la transcripción) y puede incluir también otros elementos reguladores transcripcionales como los activadores. Se puede utilizar cualquier número de secuencias reguladoras para mediar la expresión de genes unidos a vectores de expresión de mamífero. Los promotores incluye, entre otros, promotores retrovirales , otros promotores virales como los que se derivan de HSV o CMV y promotores derivados de genes celulares endógenos. Los vectores de expresión de mamífero, por lo general, también tienen un origen de replicación a partir de E. Coli que permite la propagación como plásmidos en bacterias.
Es deseable tener la posibilidad de introducir vectores de expresión de mamífero en células de mamífero, en cultivo o in vivo. En algunas modalidades, los vectores de expresión se transfectan en células de mamífero mediante el uso de los portadores poliméricos de la presente invención.
Tal como se describe aquí, los portadores poliméricos proporcionados en la presente, en algunas modalidades, se utilizan para el suministro de polinucleótidos a una célula o a un individuo que los necesite. En ciertas modalidades, los bloques policatiónicos de los portadores poliméricos se unen al ADN del vector de expresión de mamífero y se forma el complejo de ADN con el portador polimérico. En ciertos casos, los policationes de unen y forman complejos con el ADN de los vectores de expresión de mamífero. En algunas modalidades, un portador polimérico que comprende un polinucleótido tiene carga neutralizada (por ejemplo, la envoltura del portador polimérico o el bloque de envoltura de un polímero del portador polimérico y el polinucleótido, en esencia, tienen carga neutralizada) . Dependiendo de la longitud del polinucleótido, opcionalmente , se ajusta la longitud del bloque policatiónico para producir la neutralización de carga del polinucleótido. En algunos casos, la neutralización de carga se logra por adición de cationes y/o policationes a la formulación. En algunas modalidades, un portador polimérico que comprende un polímero y un polinucleótido (por ejemplo, un 200+mer) se diluye, al grado necesario, en un amortiguador y se adiciona directamente a las células en cultivo. La expresión del gen o ADNc transfectado en las células resultantes se puede medir con facilidad incluyendo en el vector de expresión de mamífero un cásete de expresión que guíe un gen indicador como luciferasa, cloranfenicol acetil transferasa o |GFP. Estos genes se consiguen con facilidad y están descritos los ensayos de reporteros .
En algunas modalidades, los portadores poliméricos descritos aquí, se usan en terapia génica. El tratamiento de enfermedades y trastornos mediante terapia génica, por lo general, incluye la transferencia de nueva información genética a las células. Los "vectores de terapia génica" contienen el nuevo material genético que se va a introducir, el cual, como opción, se encuentra en un vector de expresión de mamífero. Los usos de los portadores poliméricos incluyen el suministro de secuencias de ADN para reemplazo génico, inhibición de la expresión génica, corrección génica o aumento génico o la introducción de genes que tengan algún otro efecto deseado, como la modulación de respuestas inmunes . El inhibidor de la expresión génica se lleva a cabo de cualquier forma adecuada, entre las que se incluyen, por ejemplo, expresión de casetes génicos en células que expresan ARNsh u otros agentes AR i. ¡ i En algunas modalidades, los portadores poliméricos que tienen un bloque policatiónico no central, se combinan con vectores de terapia génica, de tal manera que se llegan a unir al portador polimérico. El complejo I portador polimérico - vector de terapia génica, en un excipiente adecuado (véase más adelante) se administra entonces a un individuo vivo por vías que incluye, entre otras, intravenosa, intraarticular, intratecal, j intracraneal, inhalación, subcutánea o intraocular. i Usos - Terapia génica I I Los portadores poliméricos que comprenden un Í polinucleótido son útiles para tratar varias enfermedades. j Una lista no exhaustiva de estas enfermedades que, son adecuadas para tratarse con los complejos portador polimérico - vector de terapia génica, proporcionados én la presente, incluyen, entre otras: hemofilias A y B, fibrosis quística, hipercolesterolemia, hemoglobinopatías ¡ como i talasemias y anemia drepanocítica, cáncer, enfermedad inflamatoria y trastornos de almacenamiento liposómicoj i I Familias de genes elegidos como objetivo y enfermedades Las enfermedades que opcionalmente se tratan utilizando portadores poliméricos (por ejemplo, aquellos que contienen AR si) proporcionados en la presente, incluyen, entre otros, trastornos patógenos, cáncer, enfermedades inflamatorias, deficiencias enzimáticas, enzimopatía congénita, enfermedades autoinmunes, enfermedades cardiovasculares, neurológicas , degenerativas, neuromusculares , hemopatías y trastornos de coagulación. En algunas modalidades, los ejemplos no exhaustivos de la disminución o descenso de la expresión de ARNsi, se pueden originar a partir de PTP1B, fosfatasas de especificidad dual (DSP o dual-specificity phosphatases) , c-myc, c-myb, c-fos, c-jun, c-raf, c-src, bcl-2, factor de proliferación endotelial vascular (VEGF o vascular endotelial growth factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o PIGF.
En algunas modalidades, los portadores poliméricos . (por ejemplo, micelas) proporcionadas en la presente, son útiles para tratar a un individuo que esté en riesgo o padezca trastornos causados o asociados con altos niveles plasmáticos de colesterol, apolipoproteína b y/o colesterol LDL (LDL o low density lipoproteins) , por ejemplo, hipercolesterolemia . En algunas modalidades, el tratamiento consiste en suministrar un portador polimérico que comprende un polinucleótido (por ejemplo, un agente oligonucleótido) , en donde el polinucleótido produce el silenciamiento (por ejemplo, por escisión) de un gen o un producto génico que promueve esa afección. En algunas modalidades, el polinucleótido produce el silenciamiento del gen proproteína convertasa subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) , responsable de la regulación de los niveles ¡y la función de la lipoproteína de baja densidad (LDLR ó low density lipoproteína regulation) y por ello los portadores poliméricos que comprenden este polinucleótido se usan para tratar un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del PCSK9, por ejemplo trastornos asociados o causados por altos niveles plasmáticos de colesterol, apolipoproteína b y/o colesterol LDL, por ejemplo, hipercolesterolemia . En algunas modalidades, el portador polimérico suministra el polinucleótido de silenciamiento del PCSK9 (por ejemplo, ARNsi) a una célula que expresa PCSK9. En algunas modalidades, la célula es una célula hepática.
En algunas modalidades, los portadores poliméricos (por ejemplo, micelas) proporcionadas en la presente, son útiles para tratar a un individuo que esté en riesgo de padecer o padezca proliferación celular indeseada (por ejemplo, proliferación celular maligna o no maligna) . El tratamiento consiste en administrar un portador polimérico que comprende un agente polinucleótido (por ejemplo, un agente oligonucleótido) , en donde el polinucleótido es homólogo respecto a un gen que promueve la proliferación celular indeseada y/o puede silenciarlo (por ejemplo, por escisión) ; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del portador polimérico a un individuo (por ejemplo, a un ser humano) .
En ciertas modalidades, el gen es, entre otros, un factor de crecimiento o un gen receptor de un factor de crecimiento, una fosfatasa, cinasa, por ejemplo, una proteína tirosina, un gen de serina o treonina cinasa, un gen de proteína conectora, un gen que codifica para una molécula de la superfamilia de proteína G o un gen que codifica para un factor de transcripción. En algunos casos, el portador polimérico comprende un polinucleótido que produce el silenciamiento de un gen que se expresa en un órgano o tejido específico, que incluyen, entre otros, pulmón, páncreas, hígado, riñon, ovario, músculo, piel, mama, colon, estómago, y lo similar.
En algunas modalidades, el oligonucleótido produce el silenciamiento de uno o más de los siguientes genes: del gen PDGF beta, y por ello puede utilizarse para tratar un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del PDGF beta, por ejemplo, cáncer testicular y pulmonar; del gen Erb-B (por ejemplo, Erb-B-2 o Erb-B-3) y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Erb-B, por ejemplo, cáncer de mama o pulmonar; del gen Src, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Src, por e emplo, cáncer de colon; del gen CRK, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de CRK, por ejemplo, cáncer pulmonar y de colon; del gen GRB2, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de GRB2, por ejemplo, carcinoma de célula escamosa; del gen RAS, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAS, por ejemplo, cáncer de páncreas, de colon y pulmonar y leucemia crónica; del gen MEKK, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MEKK, por ejemplo, carcinoma de célula escamosa, melanoma o leucemia; del gen JNK, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de JNK, por ejemplo, cáncer de páncreas o de mama; del gen RAF, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAF, por ejemplo, cáncer pulmonar o leucemia; del gen Erkl/2, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Erkl/2, por ejemplo, cáncer pulmonar; del gen PCNA(p21) , y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PCNA, por ejemplo, cáncer pulmonar; del gen MYB, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MYB, por ejemplo, cáncer de colon o leucemia mielogenosa crónica; del gen c-MYC, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de c-MYC, por ejemplo, linfoma de Burkitt o neuroblastoma; del gen JU , y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de JUN, por ejemplo, cáncer de ovario, de próstata o de mama; del gen FOS, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de FOS, por ejemplo, cáncer de piel o de próstata; del gen BCL-2, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de BCL-2, por ejemplo, cáncer pulmonar o cáncer de próstata o linfoma no hodgkiniano; del gen de ciclina D, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de ciclina por ejemplo, cáncer de colon y esofágico; del gen de VEGF, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de VEGF, por ejemplo, cáncer esofágico y de colon; del gen de EGFR, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de EGFR, por ejemplo, cáncer de mama; del gen de ciclina A, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de ciclina A, por ejemplo, cáncer pulmonar y cervical; del gen de ciclina E, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de ciclina E, por ejemplo, cáncer pulmonar y de mama; del gen WNT-1, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de WNT-1, por ejemplo, carcinoma basocelular; del gen de beta-catenina, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de beta-catenina, por ejemplo, adenocarcinoma o carcinoma hepatocelular; del gen de cLMET, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de c-MET, por ejemplo, carcinoma hepatocelular; el gen PKC, y por i ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PKC, por ejemplo, cáncer de mama; del gen NFKB, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de NFKB, por ejemplo, cáncer de mama; del gen STAT3 , y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de STAT3 , por ejemplo, cáncer de próstata; el gen de survivina, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de survivina, por ejemplo, cáncer cervical o pancreático; del gen Her2/Neu, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de Her2/Neu, por ejemplo, cáncer de mama; el gen de topoisomerasa I, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de topoisomerasa I, por ejemplo, cáncer de ovario y de colon; el gen de topoisomerasa II alfa, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de topoisomerasa II, por ejemplo, cáncer de mama y de colon.
En otras modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de mutaciones en uno de los siguientes genes: del gen p73, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p73, por ejemplo, adenocarcinoma colorrectal; del gen p21 (WAF1/CIP1) , y por ello puede utilizarse¦ para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p21 ( AF1/CIP1) , por ejemplo, cáncer hepático; del gen p27(KIPl), y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de p27(KIPl), por ejemplo, cáncer hepático; del gen PPM1D, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de PPM1D, por ejemplo, cáncer de mama; del gen RAS, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de RAS, por ejemplo, cáncer de mama; del gen de caveolina I, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de caveolina I, por ejemplo, carcinoma de célula escamosa esofágica; del gen IB I, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MIB I, por ejemplo, carcinoma de mama masculino (MBC o male breast carcinoma) ; del gen MTAI , y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de MTAI, por ejemplo, carcinoma ovárico; del gen M68, y por ello puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada de M68, por ejemplo, adenocarcinomas humanos de esófago, estómago, colon y recto.
En algunas modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de mutaciones en genes supresores de tumor y así puede usarse como un método para promover actividad apoptósica en combinación con antineoplásicos . En algunas modalidades, el gen supresor de tumor se selecciona a partir de uno o más de los siguientes genes supresores de tumores: el gen supresor de tumores p53, el miembro DN-p63 de la familia p53, el gen supresor de tumores pRb, el gen supresor de tumores APC1, el gen supresor de tumores BRCA1 , el gen supresor de tumores PTEN.
En algunas modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de uno de los siguientes genes de fusión; genes de fusión mLL, por ejemplo, mLL-AF9 que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión mLL, por ejemplo, leucemias agudas; el gen de fusión BCR/ABL, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión BCR/ABL, por ejemplo, leucemias agudas y crónicas; el gen de fusión TEL/AMLl, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión TEL/AMLl, por ejemplo, leucemias infantil aguda; el gen de fusión EWS/FLI1, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión EWS/FLI1, por ejemplo, sarcoma de Ewing; el gen de fusión TLS/FUS1, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión TLS/FUS1, por ejemplo, liposarcoma mixoide; el gen de fusión PAX3/FKHR, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión PAX3/FKHR, por ejemplo, liposarcoma mixoide; el gen de fusión AML1/ETO, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión no deseada del gen de fusión AML1/ETO, por ejemplo, leucemia aguda.
En algunos aspectos, los portadores poliméricos suministran agentes terapéuticos para tratar a un individuo, por ejemplo, una persona que esté en riesgo de padecer o padezca una enfermedad o trastorno que pueda beneficiarse por la inhibición de angiogénesis , por ejemplo, cáncer o degradación retinal. El tratamiento comprende proporcionar un portador polimérico que contiene un agente oligonucleótido, en donde el oligonucleótido es homólogo respecto a un gen que participa en la angiogénesis i (por ejemplo, VEGF-R1, VEGF-R2 o un gen que codifica ! para proteínas de señalización para las vías de estos receptores) y/o puede silenciarlo, por ejemplo, por escisión; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del portador polimérico que contiene el agente i oligonucleótido, por ejemplo, a un ser humano. j En algunas modalidades, el agente oligonucleótido I produce el silenciamiento de uno de los siguientes genes: el gen de alfa v-integrina, que puede utilizarse 1 para i tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la alfa V integrina no deseada, por ejemplo, tumores cerebrales o tumores de origen epitelial; el gen del receptor Flt-1, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por, los receptores Flt-1 no deseados, por ejemplo, cáncer y i artritis reumatoide; el gen de tubulina, que puede utilizarse para tratar a un individuo que padece o está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la tubulina no deseada, por ejemplo, cáncer y neovascularización retinal. ' En algunos aspectos los portadores poliméricos que comprenden los agentes oligonucleótidos proporcionados en la presente, se relacionan con un método para tratar a un individuo infectado con un virus que padece o está en riesgo de padecer un trastorno o enfermedad asociados con una infección viral. El método consiste en proporcionar un portador polimérico que comprende un agente oligonucleótido, en donde el agente oligonucleótido es homólogo respecto a un gen viral o a un gen celular que participa en la función viral, por ejemplo, la introducción o la proliferación y/o que puede silenciarlo, por ejemplo, por escisión; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente oligonucleótido, por ejemplo, a un individuo, por ejemplo, un sujeto humano En algunas modalidades, los portadores poliméricos que comprenden un agente oligonucleótido, son i útiles en el tratamiento de individuos infectados con el virus de papiloma humano (VPH) o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por VPH, por ejemplo, cáncer cervical.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido de silenciamiento que reduce la expresión de un gen del VPH. En algunas modalidades, el gen de VPH se selecciona a partir del grupo formado por E2, E6 o E7.
En otra modalidad, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación de VPH.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil en el tratamiento de pacientes infectados por el virus de inmunodeficiéncia humana (VIH) o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por el VIH, por ejemplo, el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen de VIH. En otras modalidades, el gen de VIH es CCR5, Gag o Rev. En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación del VIH. En algunas modalidades, el gen es CD4 o TsglOl.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados por el virus de hepatitis B (VHB) o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por el VHB, por ejemplo, cirrosis y carcinoma hepatocelular . En una modalidad, se reduce la expresión de un gen del VHB. En otra modalidad, el gen del VHB elegido codifica para uno de los grupos de la región de colar de la proteína nuclear del VHB, la región pre-c (pre-c) o la región c (c) . En otras modalidades una secuencia de ARN-VHB está constituida por la cola poli (A) . En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación del VHB.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por un virus seleccionado a partir de los siguientes virus: virus de hepatitis A (VHA) , virus de hepatitis C (VHC) , cualquier virus del grupo de cepas de hepatitis viral que comprende D, E, F, G o H; el virus sincicial respiratorio (RSV o respiratory syncytial virus) ; el citomegalovirus de herpes (C V o cytomegalovirus) ; el virus de herpes de Epstein Barr (EVB o Epstein Barr virus) ; el virus de herpes asociado con el sarcoma de Kaposi (KSHV o Kaposi ' s Sarcoma-associated Herpes Virus) ; el virus JC (JCV o JC virus) ; mixovirus (por ejemplo, el virus causante de influenza), rinovirus (por ejemplo, virus causante del catarro común) o coronavirus (por ejemplo, el virus causante del catarro común) ; el flavivirus de la encefalitis de San. Luis; el flavavirus de la encefalitis transmitida por garrapatas; el flavavirus de la encefalitis Murray Valley; el flavavirus del dengue: el virus 40 de simio (SV40) ; el virus de encefalomiocarditis (EMCV o encephalomyocarditis) ; el virus del sarampión ^MV o measles virus) ; el virus de varicela zóster (VZV o varicella zoster virus) ; un adenovirus (por ejemplo, virus causante de infección de vías respiratorias) ; el poliovirus; o un poxvirus (un poxvirus causante de viruela) . En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación de éstos virus .
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados por el virus de herpes simples (HSV o herpes simplex virus) o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por HSV,' por ejemplo, herpes genital y herpes labial así como enfermedades potencialmente mortales o deficiencia visual, sobre todo, por ejemplo, en pacientes inmunocomprometidos . En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen del HSV. En otra modalidad, el gen del HSV elegido codifica para ADN polimerasa o helicasa primasa. En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación del HSV.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados por el virus del Nilo occidental o que padecen o están en riesgo de padecer un trastorno mediado por el virus del Nilo occidental. En algunas modalidades, se reduce la expresión del gen del virus del Nilo occidental. En otras modalidades preferidas, el gen del virus del Nilo occidental se selecciona a partir del grupo formado por E, NS3 o NS5. En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano que se requiere para la replicación del virus del Nilo occidental. ¡ • j En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el i tratamiento de pacientes infectados por el virus I linfotrófico de célula T humana (HTLV o Human T Cell Lymphotropic Virus) o que padecen o están en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno asociado con este virus, por ejemplo, leucemia o mielopatía. En algunas modalidades, i se reduce la expresión de un gen del HTLV. En algunas modalidades, el gen del HTLV1 es el activador transcripcional Tax. En algunas modalidades, se reduce la I expresión de un gen humano que se requiere para la replicación del HTLV.
En algunos aspectos, el portador polimerico comprende un portador polimérico útil para el tratamiento I de un individuo infectado con un patógeno, por ejemplo, un patógeno bacteriano, amibiano, parasitario o fúngicc-. El método de tratamiento consiste en proporcionar un portador polimérico que comprende un agente oligonucleótido, en donde el oligonucleótido es homólogo respecto a un gen i patógeno o a un gen que participa en la proliferación de patógenos, y/o que puede silenciarlo, por ejemplo por escisión; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente oligonucleótido, por ejemplo, a un individuo, por ejemplo, un sujeto humano. El gen objetivo se puede seleccionar a partir de un gen que participe en la proliferación de patógenos, en la síntesis de la pared celular, en la síntesis de proteínas, en transcripción, metabolismo energético, por ejemplo, en el ciclo de Krebs, o en la producción de toxinas.
Así, en algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados por un plasmodio que causa malaria. En algunas modalidades, se reduce la . I expresión de un gen del plasmodio. En otras modalidades, el gen es un antígeno 1 de la membrana apical (AMA1) . En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen humano requerido para la replicación del plasmodio.
En algunas modalidades, el portador polimérico comprende un agente oligonucleótido útil para el tratamiento de pacientes infectados con Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chalmydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, o una enfermedad o trastorno asociado con cualquiera de estos patógenos. En algunas modalidades, se reduce la expresión de un gen bacteriano y/o humano que se requiere para la replicación de estas bacterias.
En algunas modalidades, las enfermedades tratadas con los portadores poliméricos proporcionados en la presente, pueden ser sistémicas o estar presentes en un tejido específico, por ejemplo, pulmón, piel, hígado, mama, riñon, páncreas, sistema nervioso central (SNC) , o lo similar. En ciertos aspectos, el oligonucleótido produce el silencíamiento de un gen que participa o está implicado en una enfermedad o trastorno metabólico, por ejemplo, diabetes, obesidad, y lo similar. En ciertas modalidades, el oligonucleótido produce el silencíamiento de un gen que participa o está implicado en una enfermedad o trastorno pulmonar, por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , fibrosis quística o cáncer pulmonar.
En algunos aspectos de la presente, los portadores poliméricos comprenden un agente oligonucleótido útiles en el tratamiento o relacionados con un método para tratar a un individuo, por ejemplo, una persona, que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno caracterizado por una respuesta inmune no deseada, por ejemplo, una enfermedad o trastorno inflamatorio o una enfermedad o trastorno autoinmune. El método consiste en proporcionar un portador polimérico que comprende un agente oligonucleótido, en donde el agente oligonucleótido es homólogo respecto a un gen que participa en una respuesta inmune no deseada, y/o que puede silenciarlo, por ejemplo, por escisión; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente oligonucleótido, como a un individuo; por i ejemplo, a una persona. En algunas modalidades ,j la enfermedad o trastorno es isquemia o lesión '¦ por revascularización, por ejemplo, isquemia o lesión' por revascularizacion asociadas con infarto al miocardio agudo, angina inestable, marcapasos cardiopulmonar, intervención quirúrgica, por ejemplo, angioplastia, por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutaneá, j la i respuesta al trasplante de un órgano o tejido, por ejemplo, tejido cardiaco o vascular trasplantado; o trombólisis. En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es la restenosis, por ejemplo, restenosis asociada ' con intervención quirúrgica, por ejemplo, angioplastia,] por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutáne . En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es la enfermedad inflamatoria intestinal, por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es inflamación asociada con una infección o una lesión. En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es asma, alergia, lupus, esclerosis múltiple, diabetes, por ejemplo, diabetes tipo II, artritis,] por ejemplo, reumatoide o soriática. En ciertas modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de, una integrina o un ligando complementario (co-ligand) de ésta, por ejemplo, VLA4 , VCAM, ICAM. En otras modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de una selectina o un ligando complementario {co-ligand) de ésta, por ejemplo, P-selectina, E-selectina (ELAM) , I-selectina, P-selectina glicoproteína-1 (PSGL-1) . En ciertas modalidades, el agente oligonucleótido produce1 el I silenciamiento de un componente del sistema - del complemento, por ejemplo, C3 , C5, C3aR, C5aR, C3 convertasa y C5 convertasa. En algunas modalidades, el agente oligonucleótido produce el silenciamiento de una quimocina o un receptor de la misma, por ejemplo, TNFI, TNFJ, IL-1I, i IL-1J, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI , TNFRII, IgE, SCYA11 y CCR3. En otras modalidades, el agente i oligonucleótido produce el silenciamiento de GCSF, Grol, Gro2 , Gro3 , PF4 , MIG, proteína básica Pro-plaqueiaria (PPBP) , MIP-1I, MIP-1J, RA TES, MCP-1, MCP-2, CP-3, C BKR1, CMBKR2, CMB R3 , CMBKR5 , AIF-1 ó 1-309. ! En algunos aspectos, los portadores poliméricos comprenden un oligonucleótido útil para el tratamiento de un individuo, por ejemplo, un ser humano, que padece o está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno neurológico. El método consiste en administrar un portador polimérico que comprende un agente oligonucleótido en donde el oligonucleótido es homólogo respecto a un gen que interviene en una enfermedad o trastorno neurológico y/o que puede silenciarlo, por ejemplo, por escisión; y administrar una dosis terapéuticamente eficaz del agente oligonucleótido, como a un individuo, por ejemplo1, un I. humano. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno i es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. i En ciertas modalidades el agente oligonucleótido próduce i silenciamiento de un gen de la familia amiloide,! por ejemplo, APP, un gen de presenilina, por ejemplo, PSÉN1 y PSEN2 o I-sinuclein . En otras modalidades, la enfermedad o trastorno es el trastorno degenerativo de repetición de trinucleótido, por ejemplo, enfermedad de Hungtington, atrofia dentato-rubro-pálido-Luysiana o la ataxia espinocerebelosa, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3 (enfermedad i de Machado-Joseph) , SCA7 o SCA8. En algunas modalidades, el agente oligonucleótido produce silenciamiento de HD, DRPLA, I SCA1, SCA2, MJD1, CACNL1A , SCA7 o SCA8. ¡ En ciertos aspectos, el portador polimérico proporcionado en la presente comprende un agente oligonucleótido con capacidad para escindir o producir el silenciamiento de más de un gen. En estas modalidades, el agente oligonucleótido se selecciona de tal manera; que tenga suficiente homología con una secuencia qué se encuentre en ese o esos genes, por ejemplo, una secuencia conservada entre esos genes. Así, en algunas modalidades, el agente oligonucleótido dirigido a esas secuencias produce eficazmente el silenciamiento de toda la colección de genes .
En algunos aspectos, los portadores poliméricos proporcionados en la presente comprenden dos o más tipos de principios activos oligonucleótidos , en donde éstos producen el silenciamiento de diferentes genes de la †isma enfermedad o de diferentes enfermedades.
I En algunas modalidades, un portador polimérico (por ejemplo, que comprende un oligonucleótido) dé la presente, se administra junto con otros tratamientos ¡para un proceso patológico determinado. En algunas modalidades, un portador polimérico (por ejemplo, que comprende un oligonucleótido) de la presente, se administra conjuntamente con agentes terapéuticos eficaces contra enfermedades inflamatorias, como RA o soriasis. Ejemplos de : i principios activos terapéuticos útiles y eficaces en combinación, en el contexto de la presente, incluyen los antiinflamatorios no esteroides (AINE) , metrotexato, compuestos áureos, D-penicilamina, antimaláricos, sulfasalazina, glucocorticoides y otros agentes! de i neutralización de TNF-oc, como infliximab y entracepti. En ciertos casos, el principio activo distinto ! del oligonucleótido está encapsulado en el centro de la micela.
En casos en los que se prevén tratamiento|s de combinación o métodos de prevención, no se pretende qué los agentes descritos aquí queden limitados por la naturaleza particular de la combinación. Por ejemplo, los agentes descritos aquí, opcionalmente, se administran j en combinación como simples mezclas y también como híbridos i químicos. Por otra parte, los tratamientos de combinación, como opción, se administran por separado o de manera simultánea. j En el sentido que se utiliza en la presente,; los términos "combinación farmacéutica", "administración dé una ¦ I terapia adicional", "administración de un agente terapéutico adicional" y lo similar, se refieren a! una i terapia farmacéutica que resulta de la mezcla o combinación i de más de un ingrediente activo e incluye combinaciones fijas y no fijas de los ingredientes activos. El término "combinación fija" se refiere a que al menos uno dé los i agentes descritos aquí y al menos uno de los agentes complementarios, se administran al paciente de manera simultánea en forma de una sola entidad o forma farmacéutica. El término "combinación no fija" se refiere a que al menos uno de los agentes descritos aquí y al menos uno de los agentes complementarios, se administra al paciente de manera independiente, ya sea en forma simultánea, concurrente o secuencial con límites de tiempo de intervención variables, en donde la administración proporciona al organismo del paciente concentraciones eficaces de los dos o más agentes. En algunos casos, el agente complementario se administra una vez durante un periodo de tiempo, después del cual el agente se administra una vez durante un periodo de tiempo. En otros caso?, el agente complementario se administra durante un periodo de tiempo, después del cual, la terapia incluyej la administración del agente y del agente complementario. En otras modalidades, el agente se administra una vez durante un periodo de tiempo, después del cual, el agente s complementario se administra una vez durante un periodo de tiempo. Esto también se aplica a terapias múltiples (cocktail therapies) , por ejemplo, la administración de tres o más ingredientes activos. ! En el sentido que se utiliza en la presente,1 los j términos "coadministración", "administrado en combinación con" y sus equivalentes gramaticales, se refieren a1 que abarcan la administración de los agentes terapéuticos seleccionados a un solo paciente y también incluyen esquemas de tratamiento en los que los agentes^ se administran por la misma vía o por diferentes vías de i administración al mismo tiempo o en momentos diferentes. En algunas modalidades, los agentes descritos aquí! se administrarán conjuntamente con otros agentes. Estos términos abarcan la administración de dos o más agentes a un animal, de manera que los dos agentes y sus metabolitos estén presentes en el animal al mismo tiempo. Incluyen la administración simultánea en composiciones individuales, la administración a diferentes tiempos en composiciones individuales y/o la administración en una composición en la que los dos agentes estén presentes. De este modot en algunas modalidades, los agentes descritos aquí y el o los otros agentes, se administran en una sola composición. En algunas modalidades, los agentes descritos aquí y el o los otros agentes, se mezclan en la composición. j Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad I terapéuticamente eficaz", En el sentido que se utiliza en I la presente, se refieren a una cantidad suficiente de al menos un agente que se administra, que logra el resultado deseado, por ejemplo, para aliviar en cierto grado uno o más síntomas de la enfermedad o padecimiento que se tirata. i En ciertos casos, el resultado es la reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad de cualquier otra determinada alteración de un sistema biológico. En casos específicos, el resultado es un silenciamiento suficiente de un gen dirigido que produzca un resultado, por ejemplo, la reducción de una enfermedad o trastorno que se trata o los síntomas asociados con ésta. En ciertos casos, una "cantidad eficaz" para ¡usos terapéuticos es la cantidad de la composición que comprende un agente tal como se expone en la presente, requerido para producir una disminución clínicamente significativa dé una enfermedad. Una cantidad "eficaz" apropiada en un caso individual se determina mediante el uso de cualquier i técnica que sea adecuada, por ejemplo, un estudió de aumento de la dosis. I En el sentido que se utiliza en la presente,; los i términos "administrar", "administración" y lo similar, se refieren a los métodos que se pueden usar para lograr el i suministro de los agentes o la composición en el punto I deseado de la acción biológica. Estos métodos incluyen, entre otros, vías de administración oral, intraduodénal , inyección parenteral (que incluye, intravenosa, subcutánea, ¦ i intraperitoneal , intramuscular, intravascular o infusión) , transdérmica, tópica y rectal. Los expertos en la técnica están familiarizados con las técnicas de administración que se pueden emplear con los agentes y métodos descritos aquí, i por ejemplo, como lo exponen Goodman y Gilman, j The Pharmacological Basis of Therapeutics , ed. actual, i Pergamon; y Remington's P armaceutical Sciences (edición actual), Mack Publishing Co., Easton, Pa. En ciertas modalidades, los portadores poliméricos descritos aquí se i administran por inyección parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, i intravascular o infusión) . | j i Formulaciones Las composiciones de portadores poliméricos y oligonucleótidos de la presente, se pueden administrarla un I paciente en cualquier presentación adecuada, por ejemplo, con o sin estabilizantes, amortiguadores, y lo similar; que formen una composición farmacéutica. En algunas modalidades, los portadores poliméricos proporcionadas en la presente se formulan y se usan como tabletas, cápsulas o elíxires para la administración oral, supositorios ! para administración rectal, soluciones estériles, suspensiones i inyectables y cualquier otro tipo de composición adecuada.
Se proporcionan formulaciones farmacéuticamente aceptables de las composiciones descritas aquí. Éstas i formulaciones incluyen sales de los compuestos mencionados i en lo anterior, por ejemplo, sales de adición, por ejemplo, sales de ácido clorhídrico, bromhidrico, acético y bencensulfónico . Una composición farmacológica! o formulación, se refiere a una composición o formulación en una forma adecuada para la administración, por ejemplo, administración sistémica, a una célula o paciente, j que incluye, por ejemplo, un humano. En parte, las formas adecuadas dependen del uso o la vía de introducción,! por ejemplo, oral, transdérmico o por inyección. Así; en modalidades específicas en las que el portador polimérico I I comprende y suministra un polinucleótido, la formulación se presenta en una forma que no impida que el portador polimérico y de manera más específica, el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) llegue intacto y/o funcional a la célula elegida como objetivo. Por ejemplo, en ciertas modalidades, las composiciones farmacológicas inyectadas al torrente sanguíneo son solubles I y/o i dispersables . Por otra parte, las composiciones farmacéuticas descritas aquí son, de preferencia/ no tóxicas. En algunas modalidades, si el portador polimérico descrito aquí se administra para lograr un beneficio i terapéutico, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del portador polimérico que comprende] el polinucleótido (por ejemplo, ARNsi) . En una modalidad ejemplificativa, una cantidad terapéuticamente eficaz incluye una cantidad suficiente de portador polimérico que i proporcione aproximadamente 10 mg o menos de ARNsi por kg de peso del individuo.
En algunas modalidades, las composiciones i farmacéuticas que comprenden un portador polimérico,1 que I contiene un polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNsi), se administran en forma sistémica. En el sentido i que se utiliza en la presente, el término "administración sistémica" se refiere a la absorción o acumulación i sistémica in vivo de medicamentos en el torrente sanguíneo i i I , I i j y la posterior distribución a través de todo el organismo. Las vías de administración que producen absorción sistémica incluyen, entre otras: intravenosa, subcutánea, intraperitoneal , inhalación, oral, intrapulmonar e i intramuscular. En algunas modalidades, las composiciones i de oligonucleótido - portador polimérico, se administran por vía tópica.
En algunas modalidades, las composiciones se preparan para almacenarse o para administración e incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición oligonucleótido - portador polimérico en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Cualquier vehículo o diluyente aceptable se utiliza aquí, de manera opcional. Vehículos y diluyentes específicos se describen, por ejemplo, en Remington "s Pharmaceutical Sciences (edición actual), Mack Publishing Co., A.R. Gennaro Ed. , 1985.| Por ejemplo, conservadores, estabilizantes, colorantes y saborizantes se adicionan de manera opcional. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ásteres del ácido p-hidroxibenzoico . Por otra parte, como opción!, se utilizan antioxidantes y agentes de suspensión. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un sólido, semisólido, líquido no tóxico e inerte, diluyente o; aun material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo. Algunos ejemplos de materiales que se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables son: azúcares como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones como almidón de i maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados como carboximetilcelulosa sódica, etil celulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo, malta, gelatina, talco; excipientes como manteca de cacao y ceras de supositorio ,- i aceites como aceite de cacahuate, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceitie de maíz y aceite de soya; glicoles como propilenglicol ,-ásteres como oleato de etilo y laurato de etilo; ágar; detergentes como Tween 80; amortiguadores como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; ¡agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de i Ringer; alcohol etílico; y soluciones amortiguadoras fosfatadas así como lubricantes atóxicos compatibles ; como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, también pueden estar presentes en la composición colorantes, desmoldantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes, conservadores ! y antioxidantes, a criterio del formulador. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente se administran a humanos y/o animales por vía oral, rectal, parenteral, intrasistémica, intravaginal , intranasal, intraperitoneal , tópica (en forma de polvos, cremas, ungüentos o gotas), subcutánea, bucal o como atomización oral o nasal.
En varias modalidades, las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones , soluciones, suspensiones farmacéuticamente aceptables, jarabes y elíxires. Además de los ingredientes activos (es decir, los complejos micela-oligonucleótido de j la presente invención) , las formas farmacéuticas líquidas también pueden contener diluyentes inertes o excipientes, entre otros, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes I solubilizantes y emulsificantes como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, i alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1, 3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites j (en i particular, de algodón, cacahuate, maíz, germen, oliva, ricino y ajonjolí), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres acido grasos de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir auxiliares como humectantes, emuslificantes y agentes de suspensión, edulcorantes, saborizantes y aromatizantes.
En algunas modalidades, las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, se formulan de cualquier manera que sea adecuada, por ejemplo, mediante el uso de agentes dispersantes, humectantes y/o agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril, es, opcionalmente , una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril, en un diluyente o disolvente atóxico aceptable para uso parenteral, por ejemplo, una solución en 1 , 3 -butanodiol . Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer, la solución isotónica USP de cloruro de sodio. Además, de manera convencional se emplean aceites fijos estériles como disolventes o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo blando, entre los que se incluyen los mono o diglicéridos sintéticos. En otras modalidades, se usan ácidos grasos como el ácido oleico en la preparación de inyectables . En una modalidad específica, las partículas de portador j polimérico se suspenden en un vehículo líquido que contiene carboximetilcelulosa sódica 1% (p/v) y Tween 80 al 0.1% (v/v) .
En algunas modalidades, las formulaciones inyectables se esterilizan, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias o se incorporan esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u ' otro medio inyectable estéril, antes de utilizarse.
En ciertas modalidades, las composiciones para administración rectal o vaginal con supositorios. Los supositorios se pueden preparar mezclando los complejos portador polimérico - oligonucleótido con excipientes o vehículos no irritantes como manteca de cacao, polietilenglicol o cera grado supositorio, los cuales son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura del cuerpo y por lo tanto se funden en la cavidad rectal o vaginal y liberan las micropartículás de portador polimérico. ! Las formas farmacéuticas sólidas adecuadas para la administración oral incluyen entre otras, por ejemplo, cápsulas, tabletas, pastillas, polvos y granulos. En estas formas farmacéuticas sólidas, los portadores poliméricos que contienen el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) se mezclan con al menos un excipiente o vehículo inerte farmacéuticamente aceptable como citrato de sodio o fosfato de calcio y/o: a) cargas o extensores como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma acacia, c) humectantes como glicerol, d) agentes disgregantes ¡ como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de papa o tapioca, ácido algínico, algunos silicatos y carbonato de sodio, e) retardantes de disolución como parafina, f) aceleradores de absorción como compuestos de amonio cuaternario, g) humectantes, como por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes como caolín y arcilla bentonítica, y i) lubricantes como talco, estearato de calcio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de las cápsulas, tabletas y pastillas, la forma farmacéutica puede tener también agentes amortiguadores . j Composiciones sólidas similares también se pueden emplear como carga en cápsulas de gelatina dura y blanda utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y lo similar .
En algunas modalidades, las formas farmacéuticas sólidas como tabletas, grageas, cápsulas, pastillas y gránulos se preparan con recubrimientos y cubiertas, como recubrimientos entéricos u otros adecuados . Pueden contener agentes opacificantes . En ciertas modalidades, tienen una composición tal que permite liberar el o los ingredientes activos o de preferencia en una determinada zona del tracto intestinal y opcionalmente de manera retardada. Ejemplos de composiciones de incorporación adecuadas incluyen ntre i otras, por ejemplo, sustancias polimericas y ceras.
Composiciones sólidas similares también se pueden emplear como carga en cápsulas de gelatina dura y blanda utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y lo similar .
Las formas farmacéuticas para administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen entre otras, por ejemplo, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, atomizaciones, inhalantes o parches. En algunas modalidades, el portador polimérico que contiene el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o AR si) se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente uno o más conservadores, uno o más amortiguadores o una combinación de los mismos (por ejemplo, según se requiera) . También se prevé que queden dentro del alcance de la invención las formulaciones oftálmicas y gotas para los ojos.
Los ungüentos, pastas, cremas y geles proporcionados en la presente pueden contener, además del portador polimérico que contiene un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) , excipientes tales como grasas de origen animal o vegetal, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y rocíos (sprays) pueden contener, además del portador polimérico que contiene un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido o AR si) , excipientes como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. En algunas modalidades, las preparaciones para atomización también contienen propelentes de uso común como clorofluorohidrocarburos .
Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de ofrecer el suministro controlado dé un compuesto en el organismo. Estas forma farmacéuticas se preparan de cualquier manera que sea adecuada, por ejemplo, disolviendo o depositando las micropartículas o nanopartículas en un medio adecuado. Como opción, se pueden usar intensificadores de absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel . La velocidad se puede controlar disponiendo una membrana de control de velocidad o dispersando los complejos portador polimérico-oligonucleótido en una matriz polimérica o un gel.
En algunos aspectos, los portadores poliméricos ofrecen algunas propiedades que, por lo general, se consiguen con los excipientes (por ejemplo, mecánicas, térmicas, etc.), debido a lo cual disminuye la requerida cantidad de estos excipientes en la formulación.
Uso como reactivos de investigación.
Los portadores poliméricos proporcionados en la presente, también se pueden usar como reactivos de investigación o juegos (kits) para la introducción de oligonucleótidos o polinucleótidos en células de mamífero. Los métodos existentes para introducir ( transfectar) oligonucleótidos o polinucleótidos como vectores de expresión de mamífero en células de mamífero in vitro, se pueden realizar por transfección con fosfato de calcio (Graham y Vander Eb. (1973) Virol . 52:456-467), transfección con DEAE-dextrana (Lopata, M.A. et al., (1984) Nució Acids Res. 12:5707) y electroporación (Potter, H. et al. (184) PNAS 81:7161), así como mediante el uso de reactivos comerciales como Lipofectamina (ref.). Estos métodos tienen como desventaja los aspectos de toxicidad y sería conveniente disponer de un sistema de transfección menos tóxico pero eficiente como el que se describe en la presente. Otros oligonucleótidos o polinucleótidos que se pueden suministrar con los portadores poliméricos proporcionados aquí incluyen, entre otros, ARN que codifica para proteínas, ribozimas, aptámeros, agentes de silenciamiento (knock down) y señuelos. Los portadores poliméricos proporcionados en la presente pueden ser especialmente útiles como reactivos de investigación para el suministro de agentes ARNi en cultivo celular o in vivo.
ALGUNAS DEFINICIONES Se deberá entender que con respecto a esta solicitud, el uso del singular incluye el plural y viceversa, a menos que expresamente se indique de otro modo. Es decir, "un, una" y "el, la" se refieren a uno o más del objeto que modifiquen. Por ejemplo, "el polímero" o "un nucleótido" se refiere a un polímero o nucleótidó o a una pluralidad de polímeros o nucleótidos. En el mismo i sentido, "polímeros" y "nucleótidos" se referirán !a un polímero o un nucleótido y también a una pluralidad de polímeros o nucleótidos, a menos que expresamente se indique de otra forma o que por el contexto sea obvio que es de otro modo.
En el sentido que se utiliza en la presente, dos entidades o compuestos que están "unidos" o "asociados", términos que se usan indistintamente, si están juntos por cualquier interacción que incluye, como ejemplo no limitativo, uno o más enlaces covalentes, una o más interacciones no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, fuerzas estáticas, interacciones de van der Waals, combinaciones de los mismos, o lo similar) o una I combinación de los mismos. i En el sentido que se utiliza en la presenté, un portador polimérico se describe como "estable" sí el polímero no se disocia o se desestabiliza. En ciertos casos, un portador polimérico estable es aquel que tiene un tamaño de partícula hidrodinámico que está dentro de 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% del tamaño de partícula hidrodinámico de un portador polimérico que tiene el mismo AR si y los mismos copolímeros de bloque formados inicialmente , en una solución acuosa a un pH de 7.4. En algunos casos, un portador polimérico estable es aquel que tiene una concentración de ensamblado que está dentro de 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% de la concentración de ensamblado de un portador polimérico que tiene el mismo ARNsi y los mismos copolímeros de bloque iniciales, en una solución acuosa a un pH de 7.4.
En el sentido que se utiliza en la presente, una "especie susceptible de adquirir carga", un "grupo susceptible de adquirir carga" o una "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" es una especie, grupo u unidad monomérica en su estado con carga o sin carga. En ciertos casos, una "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" es aquella que puede pasar a un estado con carga (ya sea en su estado con carga aniónico o catiónico) por la adición o eliminación de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) , por ejemplo, de una forma dependiente del pH o sea, en función del pH) . El uso de cualquiera de los términos "especie susceptible de adquirir carga", "grupo susceptible de adquirir carga" o "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" incluye la descripción de cualquier otra "especie susceptible de adquirir carga", "grupo susceptible de adquirir carga" o "unidad monomérica susceptible de adquirir carga", a menos que se indique de otro modo. Una "especie susceptible de adquirir carga" que sea "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en anión" o "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en una especie aniónica", es una especie o grupo que está en un estado con carga aniónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de convertirse a un estado con carga aniónico, por ejemplo, al eliminar un electrófilo, por ejemplo, un protón (H+) . En modalidades específicas, una especie susceptible de adquirir carga es una especie que se carga y se convierte en anión a un pH aproximado al neutro . Cabe enfatizar que no todas las especies susceptibles de adquirir carga en un polímero serán aniónicas a un pH cercano a la pKa (constante de disociación ácida) de la especie susceptible de adquirir carga, sino más bien coexistirá un equilibrio entre las especies aniónicas y no aniónicas. Una "especie susceptible de adquirir carga" que sea "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en catión" o "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en especie catiónica" , es una especie o grupo que está en un estado cargado catiónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de convertirse a un estado cargado catiónico, por ejemplo, por la adición de un electrófilo, por ejemplo, un protón (H+) . En modalidades especificas, una especie susceptible de adquirir carga es una especie que se carga y se convierte en catión a un pH aproximado al neutro. Cabe enfatizar que no todas las especies con carga catiónicas en un polímero, serán catiónicas a un pH cercano a la pKa (constante de disociación ácida) de la especie con carga catiónica, sino más bien coexistirá un equilibrio entre las especies catiónicas y no catiónicas. La expresión "unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga" en la presente, se usa indistintamente con la expresión "residuos monoméricos susceptibles de adquirir carga" .
En el sentido que se utiliza en la presenté, el término "carga neutralizada" se refiere a una partícula con un potencial zeta que está entre ± 10 a ± 30 mV y/o la presencia de un primer número (z) de especies susceptibles de adquirir carga que se cargan a una carga negativa (por ejemplo, especies ácidas que se vuelven aniónicas al desprotonarse) y un segundo número (0.5 -z) de especies que se cargan a una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas al desprotonarse) .
Modulador de expresión génica de oligonucleótido: En el sentido que se utiliza en la presente, un "modulador de expresión génica de oligonucleótido" es un agente capaz de inducir la modulación selectiva de la expresión génica en una célula viva a través de mecanismos que incluyen, entre otros, un mecanismo antisentido o mediante la vía de interferencia de ARN (ARNi) que puede incluir (i) inactivación de transcripción; (ii) degradación o secuestro de ARNm,- (iii) inhibición o atenuación transcripcional o (iv) inhibición o atenuación de traducción. Los moduladores de expresión génica de oligonucleótidos incluyen ARN regulador (por ejemplo, prácticamente cualquier ARN de regulación) , por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ARNmi, ARNi, ARNsh, sustratos Dicer, aptámeros y cualquier análogo o precursor de los mismos .
Agente de silenciamiento génico (knockdown) oligonucleotídico : en el sentido que se utiliza en la presente un "agente de silenciamiento génico {knockdown) oligonucleotídico" es una especie oligonucleótida que puede inhibir la expresión génica al dirigirse y unirse a un ácido nucleico intracelular en una forma que es específica para la secuencia. Ejemplos no limitativos de agentes de silenciamiento génico oligonucleotídicos , incluyen, ARNsi, ARNmi, ARNsh, sustratos Dicer, oligonucleótidos antisentido, ADN o ARN señuelos, oligonucleótidos antígenos y cualquier análogo y precursor de los mismos.
Inhibición: Los términos "inhibición", "silenciamiento" y "atenuación", En el sentido que se utiliza en la presente, se refieren a una reducción medible de la expresión de un ARNm elegido como objetivo o la proteína correspondiente, en comparación con la expresión del ARNm elegido como objetivo o la proteína correspondiente en ausencia el agente de silenciamiento génico (knockdown agent) . El silenciamiento génico (knockdown) o reducción de la expresión del ARNm elegido como objetivo o la proteína correspondiente, se puede evaluar midiendo los niveles de ARNm mediante procedimientos muy conocidos en la técnica, por ejemplo, amplificación de la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) , hibridación de solución de ARN, protección de nucleasa, transferencia northern e hibridación y monitoreo de la expresión génica con micromatrices ; y en el caso de proteínas mediante procedimientos muy conocidos en la técnica como SDS-PAGE, unión de anticuerpos, análisis por transferencia western, inmunoprecipitación, radioinmunoanálisis o análisis inmunoenzimatico en adsorbente (ELISA) , análisis de células activadas por fluorescencia e inmunocitoquímica .
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "nucleótido" en su sentido amplio se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena de polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En algunas modalidades, es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o se puede incorporar en una cadena de polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) a través de un enlace fosfodiéster . En algunas modalidades, "nucleótido" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos) . En ciertas modalidades, la expresión "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más nucleótidos presentes; en varias modalidades, el o los nucleótidos son nucleótidos independientes, están unidos entre sí por un enlace distinto de la covalencia o están unidos entre sí por covalencia. Así, en ciertos casos, la expresión "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido) . En algunos casos, un polinucleótido es un polímero que comprende al menos dos unidades monoméricas nucleotídicas .
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un polímero que comprende 7 a 200 unidades monoméricas nucleotídicas. En algunas modalidades, el término "oligonucleótido" abarca ARN mono y/o bicatenario así como ADN mono y/o bicatenario. Por otra parte, los términos "nucleótido", "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen una cadena principal modificada, que incluyen, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (peptide nucleic acids o PNA) , ácidos nucleicos cerrados (locked nucleic acids o LNA) , fosfono-PNA, ácidos morfolino nucleicos o ácidos nucleicos con grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos, fosfonatos, enlaces 51 -N-fosforamidita) . Los nucleótidos se pueden purificar a partir de fuentes naturales, producidas por medio de sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificados, sintetizados químicamente, etc. En el sentido que se utiliza en la presente, "nucleósido" es el término que describe un compuesto que comprende un monosacárido y una base. El monosacárido incluye, entre otros, los monosacáridos pentosa y hexosa. El monosacárido también incluye pseudomonosacáridos y monosacáridos modificados por sustitución de grupos hidroxilo con grupos halógeno, metoxilo, hidrógeno o amino o por esterificación de grupos hidroxilo adicionales. En algunas modalidades, un nucleótido es o comprende un fosfato nucleosídico natural (por ejemplo, fosfatos de adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) . En algunas modalidades, la base incluye cualesquier base que se encuentre en forma natural en varios ácidos nucleicos, así como otras modificaciones que simulen o se parezcan a estas bases naturales. Ejemplos no exclusivos de bases modificadas o derivatizadas incluyen: 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina; 4-acetilcitosina, ( 5 -carboxihidroxilmetil ) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopentiladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2 -metilguanina, 3 -metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, | 5-metilaminometiluracilo, 5 -metoxiaminometil-2 - iouracilo , beta-D-manosilqueosina, 51 -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2 -tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5 -metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, 2-aminoadenina, pirrolpirimidina y 2 , 6-diaminopurina . Las bases nucleósidas también incluyen nucleobases universales como difluorotolilo, nitroindolilo, nitropirrolilo o nitroimidazolilo . Los nucleótidos también incluyen nucleótidos que alojan una etiqueta o contienen monómeros sin base, es decir, carecen de una base. La secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5' a 3', a menos que se indique de otro modo. Un nucleótido se puede unir a otro nucleótido en una forma que es específica respecto a la secuencia, mediante un enlace de hidrógeno a través de pares de bases Watson-Crick . Se dice que estos pares de bases son complementarios entre sí. Un oligonucleótido puede ser mono, bi o tricatenario .
En ciertos casos, un portador polimérico (o material/composición polimérica) descrito aquí, comprende una pluralidad de copolímeros ensamblados formando un portador polimérico y opcionalmente , al menos un nucleótido, oligonucleótido, polinucleótido, o lo similar.
En el sentido que se utiliza en la presente, "pH fisiológico normal" se refiere al pH de los fluidos predominantes en el organismo de los mamíferos, ; como sangre, suero, citosol de las células normales, etc. En ciertos casos, el pH fisiológico es un pH aproximadamente neutro, que incluye, por ejemplo, un pH aproximado de 7.2 a aproximadamente 7.4. En el sentido que se utiliza én la presente, los términos pH neutro, fisiológico y pH fisiológico son sinónimos y se usan indistintamente.
ARN de interferencia (AR i) : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "ARN de interferencia" o "ARNi" se refiere a la inhibición y/o reducción, especifica para la secuencia, de la expresión génica en el ARNm elegido como objetivo y de los niveles de proteína mediados por un ARN al menos parcialmente bicatenario, que también tiene una porción que es, en esencia, complementaria a un ARN elegido como objetivo.
Agente AR i : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "agente ARNi" se refiere a un oligonucleótido que puede mediar la expresión genética a través de un mecanismo de ARNi e incluye, entre otros, ARNsi, micro ARN (ARNmi) , ARN de horquilla corta (ARNsh) , ARN de interferencia asimétrica (ARNai) , sustrato Dicer y sus precursores. ¡ ARN de interferencia corta (ARNsi) : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "ARN de interferencia corta" o "ARNsi" se refiere a un agente ARNi que comprende un nucleótido bicatenario que tiene una longitud aproximada de 15 a 50 pares de bases y como característica opcional también comprende de cero a dos salientes monocatenarias . Una hebra del ARNsi incluyé una porción que se híbrida con un ARN elegido como objetivo o diana, de una manera complementaria. En algunas modalidades, pueden existir una o más incompatibilidades entre el ARNsi y la porción seleccionada del ARN objetivo. En algunas modalidades, los ARNsi participan en la inhibición de la expresión génica provocando la degradación de transcritos elegidos como objetivo.
ARN de horquilla corta (ARNsh) : ARN de horquilla corta (AR sh) se refiere a un oligonucleótido que tiene al menos dos porciones complementarias hibridadas o capaces de hibridarse entre sí para formar una estructura bicatenaria (dúplex) y al menos una porción monocatenaria . Él gen inhibidor de expresión: En el sentido que se utiliza en la presente, la frase "gen inhibidor de expresión" se refiere a que causa cualquier reducción susceptible de medirse en la cantidad de un producto de expresión del gen. El producto de expresión puede ser un ARN transcrito a partir i del gen (por ejemplo, un ARNm) y/o un polipéptido traducido i a partir de un ARNm transcrito a partir del gen. El nivel i de expresión se puede determinar mediante el uso de técnicas estándar para determinar ARNm o proteína. I Sustrato Dicer: Un "sustrato Dicer" es un ARN bicatenario con más de aproximadamente 25 pares de bases bicatenarios dúplex de aproximadamente 21 pares de bases que recuerdan un efecto de interferencia de ARN que da, como resultado el silenciamiento génico (knockdown) mediante el silenciamiento de ARNm. ¡ Agente terapéutico: En el sentido que se utiliza en la presente, la expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra : a un individuo, órgano, tejido o célula tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico.
Cantidad terapéuticamente eficaz: En el sentido que se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico que es i suficiente, cuando se administra a un individuo que padece o es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retardar la aparición del o los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.
Nanopartícula : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro menor de 1000 nanómetros (nm) . En general, las nanopartículas deberán tener dimensiones suficientemente pequeñas que permitan su captación por células eucariotas . Por lo general, la dimensión recta más larga (por ejemplo, diámetro) de las nanopartículas es de 200 nm o menor. En algunas modalidades, las nanopartículas tienen un diámetro de 100 nm o menor. En algunas modalidades se usan nanopartículas más pequeñas, por ejemplo, con diámetros de aproximadamente 10 a 200 nm, aproximadamente 20 a 100 nm o 50 nm o menos, por ejemplo, 5 a 30 nm.
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "micela" incluye una partícula que comprende un centro y una envoltura hidrofílica, en donde el centro se mantiene unido al menos en forma parcial, predominante o considerable a través de interacciones hidrofóbicas| . En ciertos casos, en el sentido que se utiliza en la presente, una "micela" es una nanopartícula multicomponentej que comprende al menos dos dominios, el dominio interno o centro y el dominio externo o envoltura. La parte central se mantiene unida al menos en forma parcial, predominante o considerable a través de interacciones hidrofóbicas y¡ está J en el centro de la micela. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "envoltura de una micela" se define i como la porción no central de la micela. J Monómero aniónico: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "monómero aniónico" o "unidad monomérica aniónica" , se refieren a una unidad monomerica que tiene un grupo que está presente en un estado con carga aniónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de convertirse en aniónico con carga,: por ejemplo, al eliminar un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) ) , por ejemplo, de una forma dependiente del pH ó sea en función del pH) . En ciertos casos, el grupo esí, en esencia, de carga negativa a un pH aproximado al fisiológico pero se protona y se vuelve prácticamente neutro a un pH débilmente ácido. Los ejemplos no exclusivos i I de estos grupos incluyen grupos carboxilo, ácido barbitúrico y sus derivados, xantina y sus derivados, ácidos borónicos, ácidos fosfínicos, ácidos fosfónicos, ácidos sulfínicos, fosfatos y sulfonamidas .
Especie aniónica: En el sentido que se utiliza en la presente, el término "especie aniónica", es un grupo, residuo o molécula que está presente en un estado aniónico con carga a un pH aproximado al neutro (por ejemplo, aproximadamente 7, por ejemplo, aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.4) o al pH fisiológico pero que se protona y se vuelve prácticamente neutro a un pH débilmente ácido.
Sin limitarlo a alguna teoría que no se mencione expresamente en las reivindicaciones, un polímero desestabilizante de membrana, de manera directa o indirecta, puede provocar un cambio (por ejemplo, un cambio de permeabilidad) en una estructura de membrana celular (por ejemplo, una membrana endosómica) y así sea posible que un agente (por ejemplo, un polinucleótido) ¡ en asociación o independientemente de un portador polimérico (o un polímero constitutivo del mismo) , pase a través de la estructura de la membrana, por ejemplo, que entre á una célula o salga de una vesícula celular (por ejemplo, un endosoma) . Un polímero desestabilizante de membrana puede ser (aunque no necesariamente) un polímero que disgregue la membrana. Un polímero que disgregue la membrana puede, de manera directa o indirecta, provocar la lisis de una vesícula celular o la disgregación de una membrana celular (por ejemplo, que se observe para una fracción considerable de una población de membranas celulares) .
En general, las propiedades desestabilizantes de membrana o disgregantes de membrana de los polímeros o los portadores poliméricos, se pueden evaluar por diversos medios. En un enfoque no limitativo, un cambio en una estructura de membrana celular se puede observar por su evaluación en ensayos que miden (de manera directa o indirecta) la liberación de un agente (por ejemplo, un polinucleótido) de las membranas celulares (por ejemplo, membranas endosómicas) , por ejemplo, determinando la presencia o ausencia de ese agente o su actividad, n un medio externo a la membrana. Otro enfoque no limitativo incluye la medición de la lisis de eritrocitos (hemolisis) , por ejemplo, como un ensayo alterno para una membrana celular de interés. Estos ensayos se pueden hacer a Un solo valor de pH o en un intervalo de valores de pH.
Especie hidrofóbica: En el sentido que se utiliza en la presente, el término "especie hidrofóbica" (utilizado indistintamente con el término "entidad que aumenta la hidrofobicidad" ) , es una entidad tal como un sustitUyente , residuo o grupo, el cual cuando se une por covalencia a una molécula, por ejemplo, un monómero o un polímero, aumenta la hidrofobicidad de la molécula o sirve como una entidad que aumenta la hidrofobicidad.
El término "hidrofobicidad" es un término utilizado en la técnica que describe la propiedad física de un compuesto medida por la energía de transferencia libre del compuesto, entre un disolvente no polar y agua (Hydrophobicity regained. Karplus P.A., Protein Sci., 1997, 6: 1302-1307). La hidrofobicidad de un compuesto se puede medir por su valor logP, el logaritmo de un coeficiente de partición (P) , que se define como la relación de concentraciones de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos disolventes inmiscibles, por ejemplo, octanol y agua. Los expertos en la técnica conocen los métodos experimentales de determinación de hidrofobicidad así como los métodos de cálculo por computadora de los valores logP . Las especies hidrofóbicas de la presente invención incluyen, entre otros, grupos heteroalif ticos , arilo y heteroarilo .
Alifático o grupo alif tico: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "alifático" o "grupo alifático", se refieren a una entidad que puede ser de cadena recta (es decir, sin ramificar) , ramificada o cíclica (que incluye, fusionada, puenteada y policíclica espirofusionada) y puede estar totalmente saturada o puede tener una o más unidades de insaturación, pero que no es aromática. A menos que se especifique de otro modo, los grupos alif ticos contienen 1 a 20 átomos de carbono.
Heteroatomo: El termino "heteroatomo" se refiere a un átomo distinto del hidrógeno o el carbono,: por ejemplo, un átomo de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, boro, arsénico, selenio o silicio. ¡ Arilo o grupo arilo: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "arilo" o "grupo arilo" se refieren a sistemas de anillo monocíclicos , bicícliéos y tricíclicos que tienen en total de cinco a catorce I miembros, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el sistema tiene de tres a siete miembros. j Heteroalquilo : El término "heteroalquilo1!1 se refiere a un grupo alquilo, en donde, al menos uno de los átomos de carbono de la cadena principal está sustituido con un heteroátomo.
Heteroarilo: El término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo, en donde, al menos uno de los miembros del anillo es un heteroátomo.
Los siguientes ejemplos tienen fines ilustrativos y no deberán interpretarse como limitativos de la i invención. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan como referencia respecto a la información por las cuales se citan.
EJEMPLOS : En toda la descripción de la presente invención se usan varios acrónimos y abreviaturas para describir monómeros y residuos monoméricos derivados de la polimerización de dichos monómeros. Sin ninguna limitación y a menos que se indique de otro modo: "BMA" (o la letra "B" como designación simplificada equivalente) representa metacrilato de butilo o residuo monomérico derivado del mismo; "DMAEMA" (o la letra "D" como designación simplificada equivalente) representa metacrilato de N, redimetilaminoetilo o residuo monomérico derivado del mismo; "Gal" se refiere a galactosa o a un residuo galactosa, que opcionalmente incluye entidades con hidroxilo protegido (por ejemplo, acetilo) o un derivado PEGilado del mismo (como se describe más adelante) ; "HPMA" representa metacrilato de 2-hidroxipropilo o residuo monomérico derivado del mismo; "MAA" representa ácido metacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "MAA(NHS)" representa éster N-hidroxil-succinimida de ácido metacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "PAA" (o la letra "P" como designación simplificada equivalente) i representa ácido 2 -propilacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "PEGMA" se refiere al monómero raetacrílico PEGilado, CH30(CH20) 7.8OC(0) C (CH3) CH2 o residuo raonomérico derivado del mismo. En cada caso, cualquiera de estas designaciones se refiere al monómero (incluidas todas las sales o sus análogos iónicos) o a un residuo monomérico derivado de la polimerización del monómero (incluidas todas las sales o sus análogos iónicos) y la forma específica indicada evidente por el contexto para un experto en la técnica .
Ejemplo 1: Preparación de copolímeros Los polímeros y copolímeros dibloque dé la siguiente fórmula general, se preparan como se indica: [Alx-/-A2y]n - [Blx-/-B2y-/-B3j1.5n En donde [A1-A2] es el primer copolímero de bloque formado por residuos de los monómeros Al y A2 , [Bl-B2-B3] es el segundo copolímero de bloque, formado por residuos de los monómeros Bl, B2 , B3. x, y, z es la composición del polímero en % de moles de residuo monomérico n es peso molecular Copolímeros dibloque ejemplificativos : [DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEGMAJ - [B-/-P-/-D] [PEGMA„-DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEGMA„- / -MAA (NHS) ] - [B-/-P-/-D] [DMAEMA- /- AA (NHS) ] - [B-/-P-/-D] [HPMA-/-PDSM] - [B-/-P-/-D] en donde : B es metacrilato de butilo P es ácido propilacrílico D es DMAEMA, metacrilato de dimetilaminoetilo PEGMA es metacrilato de polietilenglicol en donde, por ejemplo, w = 4-5 o 7-8 unidades de óxido de etileno) MAA (NHS) es N-hidroxisuccinamida de ácido metacrílico HPMA es N- ( 2 -hidroxipropil ) metacrilamida PDSM es metacrilato de piridil disulfuro Estos polímeros representan estructuras en donde la composición del primer bloque del polímero o copolímero está modificada o tratada químicamente con el fin de formar polímeros en los que el primer bloque es neutro (por ejemplo, PEGMA) , catiónico (DMAEMA) , aniónico (PEGMA- HS , en donde NHS se hidroliza a ácido), anfolítico (DMAEMA-NHS, en donde NHS se hidroliza a ácido) o zwiteriónico (por ejemplo, poli [2-metacriloiloxi-2 ' - trimetilamonioetil fosfato]). Por otra parte, el polímero [PEGMA-PDSM] - [B-P-D] contiene un grupo funcional piridil disulfuro en el primer bloque que puede reaccionar con un ARNsi con función tiol y formar un conjugado de polimero-ARNsi .
Ejemplo 1.1: Síntesis de copolímeros de bloque por medio de polimerización RAFT A. Agente de transferencia de cadena RAFT La síntesis del agente de transferencia de cadena (CTA o chain transfer agent) , 4-ciaho-4- (etilsulfaniltiocarbonil) sulfanil pentanoico (ECT) , utilizado en las siguientes polimerizaciones RAFT, se adaptó a partir de un procedimiento de Moad et al., Polymer, 2005, 46 (19) : 8458-68. En resumen, se adicionó etanotiol (4.72 g, 76 mmoles) durante 10 minutos a una suspensión en agitación de hidruro de sodio (60% en aceite) (3.15 g, 79 mmoles) en éter dietílico (150 mi) a 0°C. La solución se dejó en agitación durante 10 minutos antes de adicionar disulfuro de carbono (6.0 g, 79 mmoles). El S-etil tritiocarbonato crudo (7.85 g, 0.049 moles) se recuperó por filtración, se suspendió en éter dietílico (100 mL) y se hizo reaccionar con yodo (6.3 g, 0.025 moles) . Después de 1 hora, la solución sé filtró, se lavó con tiosulfato de sodio acuoso y se secó en sulfato de sodio. El disulfuro de bis- (etilsulfaniltiocarbonilo) crudo se aisló por evaporación rotativa. Una solución de disulfuro de bis- (etilsulfaniltiocarbonilo) (1.37 g, 0.005 moles) y ácido 4 , 4 ' -azobis (4 -cianopentanoico) ( 2.10 g, 0.0075 moles) en acetato de etilo (50 mL) se calentó a reflujo durante 18 horas. Después de la evaporación del disolvente en rotavapor, se aisló el ácido 4-ciano-4-(etilsulfaniltiocarbonilo) sulfanilpentanoico (ETC) crudo, por cromatografía en columna utilizando como fase estacionaria gel de sílice y como eluyente acetato de etilo - hexano, 50:50.
B. Agente de transferencia de cadena macro poli (metacrilato de N, -dimetilaminoetilo) (poli-DMAEMA macro CTA) La polimerización RAFT de DMAEMA se hizo en DMF (dimetilfor amida) a 30°C y en atmósfera de nitrógeno, durante 18 horas utilizando ECT y 2 , 21 -azobis (4-metoxi-2 , 4-dimetilvaleronitrilo) (V-70) (Wako Chemicals) como iniciador de radicales . La relación entre monómero inicial y CTA ( [CTA] o/ [ ] 0 fue tal que la n teórica a una conversión de 100% fue 10,000 g/mol) . La relación entre CTA inicial e iniciador ( [CTA] 0/ [I] D) fue 10 a 1. El agente de transferencia de cadena poli-DMAEMA macro resultante, se aisló por precipitación en éter dietílico/pentano 50:50 v:v. El polímero resultante se redisolvió en acetona y después se precipitó en pentano (x3) y se seco a vacío durante la noche .
C. Copolimerización en bloque de DMAEMA, PAA y BMA a partir de poli (DMAEMA) macro CTA.
Las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA y BMA se adicionaron al poli (DMAE A) macro CTA disuelto en N, -diraetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . En todas las polimerizaciones las relaciones [M]0/[CTA]0 y [CTA]0/[I]0 fueron 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de V70, las soluciones se purgaron con nitrógeno durante 30 minutos y se dejaron reaccionar a 30°C durante 18 horas. Los copolímeros dibloque resultantes se aislaron por precipitación en una mezcla de éter dietílico/pentano 50:50 v/v. Los polímeros precipitados se redisolvieron en acetona y después se precipitaron en pentano (x3) y se secaron a vacío durante la noche. Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC o gel permeation chromatography) para determinar los pesos moleculares y los índices de polidispersidad (PDI o polydispersity Índex) (PDI, M„/Mn) de las muestras de poli (DMAEMA) macroCTA y de copolímero dibloque en DMF, con respecto a los estándares de polimetacrilato de metilo (columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville , PA) conectadas en serie a un equipo Viscotek GPCmax VE2001 y refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . Como fase móvil se utilizó DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr. La Figura 1A resume los pesos moleculares, composiciones y relaciones entre bloques de algunos de los polímeros sintetizados por medio de RAFT.
Ejemplo 1.2. Preparación de del segundo bloque (B1-B2-B3) por copolimerización de D AEMA, PAA y BMA a partir de poli (PEGMA) macroCTA Las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA y BMA se adicionaron al poli (PEGMA) macro CTA disuelto en N, -dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . En todas las polimerizaciones las relaciones [M]0/[CTA]0 y [CTA]ó/[I fueron 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de AIBN, las soluciones se purgaron con nitrógeno durante 30 minutos y se dejaron reaccionar a 68 °C durante 6 a 12 horas. Los copolímeros dibloque resultantes se aislaron por precipitación en una mezcla de éter dietílico/pentano 50:50 v/v. Los polímeros precipitados se redisolvieron en acetona y después se precipitaron en pentano (x3) y se secaron a vacío durante la noche. Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC o gel permeation chro atography) para determinar los pesos moleculares y las polidispersidades (PDI, Mw/Mn) de las muestras de poli (PEGMA) macroCTA y de copolímero dibloque en DMF utilizando un equipo Viscotek GPCmax VE2001 y un refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . Como fase móvil se utilizó DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr. Por medio de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) en CDC13 se confirmó la estructura polimérica y se calculó la composición del segundo bloque.
Ejemplo 1.3. Preparación y caracterización de copolímeros PEGMA-DMAEMA La síntesis de los polímeros se llevó a cabo mediante un procedimiento similar al descrito en los Ejemplos 1.1 y 1.2. La relación entre PEGM y DMAEMA en el primer bloque se modificó utilizando diferentes proporciones de alimentación de monómeros individuales para obtener los copolímeros descritos en la Figura IB.
Ejemplo 1.4. Preparación y caracterización de copolímeros PEGMA-MAA (NHS) La síntesis de los polímeros se llevó a cabo tal como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2, utilizado relaciones de alimentación de monómero adecuadas para obtener la composición deseada del primer copolímero de bloque. En algunos casos, el polímero [PEGMA^MAA (NHS) ] - [B-P-D] se preparó utilizando una relación de los monómeros del copolímero en el primer bloque de 70:30. Los polímeros que contienen NHS se pueden incubar en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 durante 1 a 4 horas y a temperatura ambiente o 37°C para obtener la forma hidrolizada (acida) .
Ejemplo 1.5 Preparación y caracterización de copolímeros DMAEMA-MAA ( HS) ¡ La síntesis del polímero se realizó como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2 utilizando proporciones de monómeros adecuadas para obtener la composición deseada en el copolímero del primer bloque. En ciertos casos, el polímero [DMAEMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] se preparó utilizando una relación de los monómeros del copolímero en el primer bloque de 70:30. Los polímeros que contienen NHS se pueden incubar en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 durante 1 a 4 horas y a temperatura ambiente o 37°C para obtener la forma hidrolizada (ácida) . Ejemplo 2. Preparación y caracterización de conjugados copolímero HPMA-PDS (ARN) para suministro de medicamentos AR si A. Síntesis de monómero metacrilato de piridil disulfuro (PDSMA) Se disolvió Adrithiol-2™ (5 g, 22.59 mmoles) en 40 mi de metanol y 1.8 mi de AcOH. La solución se adicionó como una solución de 2 -aminoetanotiol . HC1 (1.28 g, 11.30 mmoles) en 20 mi de metanol durante más de 30 minutos. La reacción se mantuvo en agitación en atmósfera de N2 durante 48 horas a temperatura ambiente. Después de la evaporación de los disolventes, el aceite residual se lavó dos veces con 40 mi de éter dietílico. El compuesto crudo se disolvió en 10 mi de metanol y el producto se precipitó dos veces con 50 mi de éter dietílico y se obtuvo el compuesto 1 esperado, como un sólido ligeramente amarillo. Rendimiento: 95%. I Se disolvieron piridina ditioetilamina ( 6 -j*7 g, 30.07 mmoles) y trietilamina (4.23 mi, 30.37 mmoles) en DMF (25 mi) y piridina (25 mi) y lentamente se adicionó cloruro de metacriloilo (3.33 mi, 33.08 mmoles) por medio dé una jeringa a 0°C. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. DeSpués de la reacción, la reacción se interrumpió mediante NaHC03 saturado (350 mi) y se extrajo con acetato de etilo; (350 mi) . La fase orgánica combinada se lavó después con HCl 10% (100 mi, 1 vez) y agua pura (100 mi, 2 veces) y se secó en NaSO¾ . El producto puro se purificó por cromatografía en columna (EA/Hex : 1/10 a 2/1) y se obtuvo como jarabe de color amarillo. Rf = 0.28 (EA/Hex : 1/1). Rendimiento: 55%. B . Síntesis de copolímeros HPMA-PDSMA La polimerización RAFT de N- (2- i hidroxipropil)metacrilamida (HP A) y metacrilato de piridil disulfuro (normalmente en una relación monomérica de 70:30) se llevó a cabo en DMF (50 por ciento en peso de monómero : disolvente) a 68 °C y en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas y utilizando 2 , 2 ' azo-bis- isobutironitrilo (AIBN) como iniciador de radicales libres. La relación molar entre CTA y AIBN es de 10 a 1 y la relación molar entre CTA y monómero se fija de tal manera que se logre un peso molecular de 25,000 g/mol si hay 100% de conversión. El poli (HPMA-PDS) macro-CTA se aisló por precipitación repetida en éter dietílico a partir de metanol.
El macro-CTA se secó a vacío durante 24 horas y luego se usó para la copolimerización en bloque del metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA) , ácido propilacrílico (PAA) y metacrilato de butilo (BMA) . Se adicionaron cantidades equimoleculares de DMAEMA, PAA y BMA ([M]0/[CTA] 0 = 250) al HPMA-PDS macroCTA disuelto en N,N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . El iniciador de radicales AIBN se adicionó con un CTA en una relación respecto al iniciador de 10 a 1. La polimerización se dejó avanzar en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas a 68°C. Después, el polímero dibloque resultante se aisló por precipitación realizada 4 veces en una mezcla de éter dietílico/pentano 50:50, entre las cuatro precipitaciones, se redisolvió en etanol. Luego, el producto se lavó una vez con éter dietílico y se secó a vacío durante la noche.
C . Conjugación de ARNsi con el copolímero HPMA- PDSMA El derivado tiol de ARNsi se adquirió de manera comercial (Agilent, Boulder, CO) como ARN bicatenario con una hebra 51 -codificante modificada con disulfuro. La forma tiol libre que se usará en la conjugación, se prepara disolviendo en agua el compuesto liofilizado y se trata durante 1 hora con el agente reductor de disulfuro i TCEP j (tris (2-carboxietil) fosfina) inmovilizado en gelj de agarosa. El ARN reducido (400 µ?) se hace reaccionar durante 24 horas con el polímero funcionalizado con piridil disulfuro, en un amortiguador de fosfato (pH 7) que contiene 5 mM de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) .
La reacción del polímero piridil disulfuro cbn el ARN tiol da lugar a la 2 -piridintiona que se puede medir por espectrofotometría para caracterizar la eficiencia de conjugación. Para validar después el intercambió de i disulfuro, los conjugados se corren en gel SDS-PAGE (gkl de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) 16.5% tricina. En paralelo, se tratan alícuotas de las reacciones de conjugación con TCEP inmovilizado, antes de someterías a SDS-PAGE para verificar la liberación del ARN del polímero en un ambiente reductor. Las reacciones de conjugación se hicieron con una estequiometría de polímero/ARN de 1; 2 y i 5. Se utilizaron mediciones de absorbancia ! por espectrofotometría UV a 343 nm de la liberación de 2-piridintiona para medir la eficiencia de conjugación. i Ejemplo 3: Síntesis de polímeros con agentes dirigidos a la célula: reacción click de polímero de terminal azida, con folato de propargilo Se usa una combinación de polimerización por radicales controlada y química click azida-alquino para preparar micelas de copolímero de bloque conjugados con ligandos biológicos (por ejemplo, folato) con potencial para dirigirse en forma activa a tejidos/células específicos que contienen el receptor específico de interés (por ejemplo, folato) . Los copolímeros de bloque se sintetizan por polimerización de transferencia por adición fragmentación reversible (RAFT) , tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que se usa un agente de transferencia (CTA) azida. La terminal azida del polímero se hace reaccionar con el derivado alquino del agente dirigido (por ejemplo, folato) para producir el polímero que contiene el agente dirigido. ! Síntesis del agente RAFT.
El agente de transferencia de cadena (CTA) ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metil-propiónico 3-azido propil éster (C12-CTA 3) se prepara de la forma siguiente : Síntesis de 3 -azidopropanol . Se hacen reaccionar 3 -cloro-1-propanol (5.0 g, 53 mmoles, 1.0 equivalentes) y azida de sodio (8.59 g, 132 mmoles, 2.5 equivalentes) en D F (26.5 mL) a 100°C durante 48 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se vierte en éster etílico (200 mL) y se extrae con una solución saturada de NaCl (500 mL) . La fase orgánica se separa, se seca en MgS04 y se filtra. El sobrenadante se concentra para obtener el producto (5.1 g, 95% de rendimiento).
Síntesis de cloruro del ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfañil-2 -metil-propiónico (DMP-Cl) . Se disuelve ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanilo-2-metilpropiónico (DMP, Noveon > 95%) (1.0 g, 2.7 mmoles, 1.0 equivalentes) en cloruro de metileno (15 mL) en un matraz de fondo redondo de 50 mL y la solución se enfría aproximadamente a, 0°C. Lentamente, se adiciona cloruro de oxalilo (0.417 g, 3.3 mmoles, 1.2 equivalentes) en atmósfera de nitrógeno y la solución se deja a temperatura ambiente y se mantiene en agitación durante 3 horas en total. La solución resultante se concentra a presión reducida y se obtiene como producto el cloruro del ácido (1.0 g, 99% de rendimiento) .
Síntesis de ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2 -metil-propiónico 3 -azidopropil éster. Se disolvió 3 -azidopropanol (265 mg, 2.62 mmoles, 1.0 equivalentes) en cloruro de metileno (5 mL) en un matraz de fondo redondo de 50 mL y la solución se enfrió aproximadamente a 0°C. Gota a gota, durante 10 minutos, se adicionó una solución de trietilamina (0.73 mL) en cloruro de metileno (5 mL) . Gota a gota se adicionó una solución de DMP-C1 (1.0 g, 2.6 mmoles) en cloruro de metileno (5 mL) y la solución se dejó a temperatura ambiente mientras se mantenía en agitación durante 3 horas. La solución se concentró a presión reducida, se diluyó con éter etílico (100 mL) y se lavó sucesivamente con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 mL) , agua (50 mL) y solución saturada de NaCl (50 mL) . La fase orgánica se separó, se secó en MgS04 (1.0 g) y se filtró!. El sobrenadante se concentró a presión reducida y se obtuvo el producto (1.05 g, 90% de rendimiento) como aceite residual.
Síntesis de folato de propargilo Se disuelve ácido fólico (1.0 g, 0.0022 mmoles) en DMF (10 mL) y se enfría en un baño de agua con hielo. Se adicionan N-hidroxisuccinimida (260 mg, 0.0025 mmoles) y EDC (440 mg, 0.0025 mmoles) y la mezcla resultante se mantiene en agitación en un baño de hielo durante 30 minutos, después de los cuales se obtiene un precipitado blanco. Se adiciona una solución de propargilamina (124 mg, 2.25 mmoles) en DMF (5.0 mL) y la mezcla resultante se deja a temperatura ambiente y en agitación durante 24 horas . La mezcla de reacción se vierte en agua (100 mL) y se agita durante 30 minutos para formar un precipitado. El precipitado de color amarillo naranja, se filtra, se lava con acetona y se seca a vacío durante 6 horas para obtener 1.01 g de producto (93% de rendimiento) .
Reacción click de polímeros de terminal azido con folato de propargilo.
El polímero de terminal azida se hace reaccionar con folato de propargilo mediante el siguiente procedimiento ej emplificativo . Una solución de N3-cc-[Ds-Xjb- [Bx-Py-Dj a-co (0.0800 mmoles) en DMF (7 mL) y pentametildietilentriamina (PMDETA, Aldrich, 99%), (8.7 mg, 0.050 mmoles) se purga con nitrógeno durante 60 minutos y se transfiere mediante jeringa a un vial, acondicionado con una barra magnética, que contiene CuBr (7.2 mg, 0.050 mmoles) y folato de propargilo (42 mg, 0.088 mmoles) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a 26°C durante 22 horas en ausencia de oxígeno. La mezcla de reacción se expone al aire y la solución se hace pasar a través de una columna de alúmina neutra. El DMF se elimina a vacío y el producto se precipita en hexanos. El copolímero de bloque con folato terminal, folato-a- [DS-X b-[Bx-Py-Dz] a-a>, se disolvió en THF y se filtró para eliminar el exceso de folato de propargilo. El THF se eliminó y luego el polímero se disolvió en agua desionizada (DI) y se dializó durante 6 horas con una membrana de peso molecular límite de 1000 Da. El polímero se aisló por liofilización .
Ejemplo 4: Espectroscopia RMN del copolímero de bloque PRx0729v6 (también denominado P7v6) . (Figura 2) Este ejemplo aporta evidencia, por medio de i espectroscopia RMN, que el polímero PRx0729v6 en solución acuosa forma una estructura tipo micela.
El espectro 1H RMN se obtuvo en un equipo Bruker AV301, en cloroformo deuterado (CDC13) y agua deutprada (D20) a 25 °C. Se usó bloqueo de deuterio (CDC13, D20) y los i desplazamientos químicos se determinaron en ppm a partir del tetrametilsilano (para CDC13) y ácido 3-(trimetilsilil) -propiónico-2 , 2 , 3 , 3-d4 , sal sódica J(para D20) . La concentración del polímero fue 6 mg/ml.
La espectroscopia RMN del polímero sintetizado, con polímero PRx0729v6 como ejemplo, en amortiguador acuoso, aportó evidencia de que los polímeros dibloqijiie de la presente invención forman micelas en solución acuosa. La formación de micelas da lugar a la formación de un núcleo o centro interno viscoso protegido que restringe el desplazamiento de los protones que forman los segmentos centrales e impide el intercambio de deuterio entre el disolvente y los protones de la parte central. Estío se i refleja por la significativa supresión o desaparición de las señales XH RMN de los protones correspondientes. Utilizamos esta propiedad inherente de la espectroscopia RMN en solución, para demostrar que el bloque hidrofóbico del centro de la micela está protegido de manera eficaz. Si las micelas se forman en medio acuoso, las señales podrían desaparecer debido al bloque de copolímero hidrofóbico .
La Figura 2 muestra los experimentos de ^ RMN I del polímero PRx0729v6 en CDC13 (disolvente orgánico) y D20 i (disolvente acuoso) . El espectro H RMN del polímero en I CDC13 a temperatura ambiente (Figura 2A) muestra! las señales atribuidas a todos los protones del polímero que indican que las cadenas poliméricas permanecen dispersas (sin agregarse) en CDC13 y conservan su movilidad dei tal manera que los protones se pueden intercambiar con el disolvente. Esto indica que las micelas estables córi los centros protegidos no se forman a partir del PRx0729v6 en disolvente orgánico. La Figura 2B muestra el espectro XH RMN de PRx0729v6 en D20. La señales que representan los protones del bloque hidrofóbico (BMA, PAA, DMAEMA) desaparecen del espectro. Esto indica que se forman micelas estables con centros protegidos a partir de PRx0729v6 en solución acuosa. Por otra parte, en el mismo espectro, la señal atribuida a la resonancia de los protones de los dos grupos metilo del DMAEMA (2.28 ppm) se suprime de manera significativa, lo que implica que sólo el primer bloque poli DMAEMA que constituye la envoltura, se expone al agua, es decir, principalmente el grupo con carga del DMAEMA. Un cálculo simple indica que el porcentaje integrado de i PAA, i DMAEMA del bloque hidrofóbico (2900) restado de la señal en CDCI3 (5600) da el valor aproximado para la misma señal en D20 (2811) , congruente con esta conclusión.
Considerados en su conjunto, los resultados de los experimentos de XH RMN indican que el polímero PRx0729v6 forma micelas con una estructura centro-envoltura ordenada, en donde el primer bloque poli-DMAEMA forma una envoltura externa hidratada que rodea una parte central compuesta de unidades hidrofóbicas (BMA) y unidades i electrostáticamente estabilizantes de carga opuesta (PAA, DMAEMA) .
Ejemplo 5: Determinación por dispersión luminosa dinámica (DLS) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 acomplejado con AKNsi (Figura 3) El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 forma partículas uniformes con un tamaño de 45 nm si están solas o de 47 nm después de unirse al AR si.
Los tamaños de partícula del polímero solo o de los complejos polímero/ARNsi se determinaron por dispersión luminosa dinámica (DLS) mediante un equipo Malvern Zetasizer Nano ZS. El polímero liofilizado se disolvió en etanol al 100% a 10-50 mg/mL, luego se diluyó 10 veces en amortiguador de fosfato, pH 7.4. Los polímeros se determinaron en solución salina amortiguada de fosfató, pH 7.4 (PBS) a 1 mg/ml para PRx0729v6 solo o a 0.7 mg/ml para PRx0729v6 acomplejado con 1 uM de ARNsi-21 mer específico para GAPDH (Ambion) , con una relación de carga teórica de 4:1 entre cargas positivas en el polímero y cargas negativas en ARNsi. El PRx0729v6 solo (45 nm) y el PRx0729v6 acomplejado con ARNsi (47 nm) (Figura 3) muestran tamaños de partícula similares y con una distribución uniforme, PDI <0.1.
Ejemplo 6: Análisis del desplazamiento en gel de los complejos polímero PRx0729v6/ARNsi a diferentes relaciones de carga (Figura 4) El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 se une a ARNsi a varias relaciones de carga y forma un complejo con movilidad electroforética reducida.
La unión polímero-ARNsi se analizó por electroforesis en gel (Figura 4) y demuestra que la unión completa del ARNsi con el polímero se da a una relación de carga polímero/ARNsi de 4:1 y más altas.
Ejemplo 7. Concentración micelar crítica (CMC) del polímero PRx0729v6 (Figura 5) El siguiente ejemplo demuestra que las micelas formadas por el polímero PRx0729v6 son estables a 100 diluciones.
Tamaños de partícula del polímero PRx0729v6 en amortiguador PBS, pH 7.4, a una concentración de 1 mg/ml + NaCl 0.5 M. El tamaño de partícula se determinó; por dispersión luminosa dinámica en un intervalo de 5 diluciones en serie de 1 mg/ml a 1.6 ug/mL con PBS ± NaCl 0.5 M. La Figura 5 muestra que un tamaño de partícula aproximado de 45 nm es estable por debajo de una concentración aproximada de 10 µg/mL. Al parecer el polímero PRx0729v6 es inestable por debajo' de aproximadamente 5 ug/mL (la CMC) en donde las cadenas poliméricas se disocian y forman agregados no específicos.
Ejemplo 8: Estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en disolventes orgánicos (Figura 6) Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6 se disocia en disolventes orgánicos, consistente con la naturaleza hidrofóbica del centro micelar .
El polímero PRx0729v6 se disolvió en varios disolventes orgánicos a una concentración de 1 mg/ml y se determinó el tamaño de partícula mediante dispersión luminosa dinámica. La Figura 6 muestra que aumentar la concentración de la dimetilformamida (DMF) da como resultado la disociación de la micela y se forman cadenas agregadas.
Ejemplo 9: Actividad de silenciamiento génico {knock-down) de los complejos ARNsi -micela en células de mamífero cultivadas .
(Figura 7 y Figura 12) La actividad de silenciamiento génico (KD o knock-down) de los complejos ARNsi/polímero PRx0729v¿, se I evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica específica después de 24 horas de tratamiento con los complejos PRx0729v6: AR si. El polímero y el ARNsi dirigido a GAPDH o el ARNsi de control negativo (Ambion) se mezclaron en 25 µ?? para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron reaccionar durante 30 minutos antes de su adición a células HeLa en 100 µ?. de medio normal que contenía suero fetal de bovino (FBS o fetal bovine serum) 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero se adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1: l o a concentraciones fijas de polímero de 18, 9, 4.5 y 2.2 ug/ml para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD. Para las relaciones de carga (Figura 7A) , los complejos se prepararon a concentraciones mayores, se incubaron durante 30 minutos y se diluyeron en serie 5 veces con respecto a la concentración de las gráficas justo antes de adicionarse a las células. Para la concentración de polímero fija (Figura 7B) , el AR si y el polímero se acomplejaron a concentraciones 5 veces mayores con respecto a las concentraciones que se muestran en la gráfica, se incubaron durante 30 minutos y luego se adicionaron á las células para obtener las concentraciones finales que se presentan en La Figura 7. La Figura 7C es el control negativo. El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión GAPDH se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por reapción i en cadena de polimerasa (PCR o polymerase chain reac ion) j cuantitativa. Los resultados en las Figuras 7, 12A 12B, indican una actividad KD >60% (sombreado) obtenida con el polímero PRx0729v6 en concentraciones de 9 µg/ml y mayores i a todas las concentraciones de ARNsi analizadas. I Esta I concentración coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula. Coii 4.5 µg/mL PRxO 729v6 /ARNsi 12.5 nM se observó actividad KD elevada, sólo cuando los complejos se prepararon a concentraciones altas y se diluyeron en serie (relación de carga 4:1) , en comparación con la formación de complejos a i concentraciones inferiores (concentración de polímero fija de 4.5 µg/ml) . Por dtra parte, sólo con ARNsi 100 ntó con 4.5 µg/mL de PRx0729v6, se observó alta activida^ KD mientras que con concentraciones de ARNsi inferiores; no. j En resumen, las micelas de PRx0729v6 fueron estables a una dilución inferior a -10 µ9/?t?:[- y la actividad KD se perdió por debajo de ~5 g/ml, lo que indica que se requieren micelas estables para lograr una buena actividad KD.
Ejemplo 10: Actividad de silenciamiento génico {knock-down) de complejos AR si sustrato dicer específico de GAPDH/polímero, en células de mamíferos.
La actividad de silenciamiento génico (KD o knock-down) de complejos ARNsi sustrato dicer específico de GAPDH/polímero se evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica de GAPDH después de 24 horas de tratamiento con los complejos de polímero: ARNsi dicer GAPDH. La secuencia ARNsi dicer GAPDH es: hebra codificante : rGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC, hebra antisentido: ¡ rGrArUrArCrCrArArArGrürUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrU¿ E1 polímero y el ARNsi dirigido a GAPDH o el ARNsi de control negativo (IDT) se mezclaron en 25 µL para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron reaccionar durante 30 minutos antes de su adición a células HeLa en 100 µL de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero se adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 µg/mL para determinar cuáles condiciones tienen la mayor actividad KD. El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y « la expresión GAPDH se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por PCR cuantitativa. Los resultados indican una actividad KD >60% obtenida con el polímero en concentraciones de 10 µg/mL y mayores a todas las concentraciones de AR si analizadas. Esta concentración coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula.
Ejemplo 11: Actividad de silenciamiento génico (knock-down) de complejos ApoBlOO ARNsi/polímero, en células de mamíferos cultivadas.
La actividad de silenciamiento génico (KD o knock-down) de ARNsi o ARNsi sustrato dicer específicos para ApoBlOO acomplejados con el polímero, se evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con los complejos de polímero: ARNsi ApoB. La secuencia ARNsi ApoBlOO es: hebra codificante: 5'-rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-31 , hebra antisentido: 51 -rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-31. El ARNsi sustrato dicer ApoBlOO es: hebra codificante: 5 ' -rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA, hebra antisentido: 5'-rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3 ' . El polímero y el ARNsi dirigido a ApoB o el AR si de control negativo (IDT) se mezclaron en 25 µ?. para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron reaccionar durante 30 minutos antes de su adición a células HepG2 en 100 µ??, de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero de adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 µ9/t?1-1 para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD. El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión de ApoBlOO se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por PCR cuantitativa. Los resultados indican una actividad KD >60% obtenida con el polímero en concentraciones de 10 g/mL y mayores a todas las concentraciones de ARNsi analizadas. Esta concentración del polímero coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula.
Ejemplo 12: Actividad de silenciamiento génico {knock-down) de complejos ApoBlOO ARNsi/polímero, en un modelo de ratón.
La actividad de silenciamiento génico de los complejos ARNsi específico para ApoBlOO/polímero,; se determinó en un modelo de ratón por medición de la expresión ApoBlOO en tejido hepático y los niveléis de colesterol sérico. A ratones Balb/C se les administró en la vena de la cola por vía intravenosa 1, 2 ó 5 mg/kg de ARNsi específico para ApoB acomplejado con polímero a una relación de carga de 1:1, 2:1 ó 4:1 (polímero: ARNsi ) o solución salina de control. 48 horas después de la dosis final los ratones se sacrificaron y se aislaron muestras de sangre y hepáticas. Se midieron los niveles de colesterol sérico. El ARN total se aisló del hígado y se midió la expresión de ApoBlOO con relación a 2 genes normalizantes, HPRT y GAPDH, por PCR cuantitativa.
Ejemplo 13: Actividad de silenciamiento génico {knock-down) de complejos oligonucleótido ADN antisehtido ApoBlOO/polímero, en células de mamífero cultivadas.
La capacidad de silenciamiento génico (KD¡) de oligonucleótido ADN antisentido específico para ApoBlOO acomplejado con polímero, se evaluó en formato de 96 pocilios por medición de la expresión génica de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con complejos polímero: oligonucleótido ADN antisentido ApoB. Dos oligonucleótidos antisentido ApoBlOO específicos para ApoB de ratón, son: (1) 5 ' -GTCCCTGAAGATGTCAATGC-31 , posición 541 de la región codificante y (2) 5 ' -ATGTCAATGCCACATGTCCA-31 , posición 531 de la región codificante.
El polímero y el oligonucleótido ADN antisentido dirigido a ApoB o el oligonucleótido ADN de control negativo (secuencia desordenada) se mezclaron en 25 µ?? para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron reaccionar durante 30 minutos antes de su adición a células HepG2 en 100 µ?? de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de oligonucleótido se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero de adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 µg/mL para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD. El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión de ApoBlOO se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por PCR cuantita iva.
Ejemplo 14: Demostración de la actividad desestabilizante de membrana de las micelas poliméricas y sus complejos con A Nsi (Figura 8) La actividad desestabilizante de membrana, ¦ i sensible al pH, se evaluó por titulación del polímero solo o de los complejos PRx0729v6: ARNsi en preparaciones de eritrocitos humanos (RBC o red j lood cells) y por determinación de la actividad lítica en la membrana por liberación de hemoglobina (lectura de absorbancia a 540 nm) . Se usaron tres diferentes condiciones de pH para simular los entornos de pH endosómico (pH extracelular = 7.4, endosómico anticipado pH = 6.6 y endosómico tardío pH 5.8). Los eritrocitos humanos (RBC) se aislaron por centrifugación a partir de sangre completa en tubos a vacío {vaccutainers) que contenían EDTA. Los RBC se lavaron 3 veces con solución salina normal y se llevaron a una concentración final de 2% de RBC en PBS a pH específico (5.8, 6.6 ó 7.4). El PRx0729v6 solo o los complejos PRx0729v6/ARNsi se evaluaron a concentraciones justo por arriba y por debajo de la concentración de estabilidad crítica (CMC) como se muestra en la Figura 5. Para el complejo polímero/ARNsi , se adicionaron 25 nM de ARNsi al polímero PRx0729v6 a relaciones de carga de 1:1, 2:1 y 4:1 y 8:1 (se usaron las mismas concentraciones de polímero en el caso del polímero solo) . Las soluciones de polímero solo o de complejos polímero-AR si se obtuvieron durante 30 minutos a la concentración final 20X evaluada y se diluyeron en cada preparación RBC. Se compararon dos preparaciones diferentes de solución madre de polímero PRx0729v6 respecto a la estabilidad de la actividad, a los 9 y 15 días posteriores a la preparación, se almacenaron a 4°C a partir del día de la preparación. Los RBC con el polímero solo o con el complejo polímero/ARNsi , se incubaron a 37°C durante. 60 minutos y se centrifugaron para eliminar los RBC intactos. Los sobrenadantes1 se transfirieron a celdas y la absorbancia se determinó a 540 nm. El por ciento de hemolisis se expresó como A540 de muestra/A540 de RBC tratados con Tritón X-100 al 1% (control para 100% de lisis) . Los resultados muestran que el polímero PRx0729v6 solo (Figura 8A) o el complejo PRx0729v6/ARNsi (Figura 8B) no es hemolítico a pH 7.4 y se vuelve más hemolítico a valores de pH inferiores asociados con endosomas y a concentraciones más altas de polímero.
Ejemplo 15: Análisis por microscopía electrónica de transmisión (TEM) del polímero PRx0729v6 (Figura 9) Mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión este ejemplo proporciona evidencia de que el polímero PRx0729v6 forma partículas esféricas tipo micéla.
Se aplicó una solución de 0.5 mg/ml del polímero PRx0729v6 en una rejilla de cobre recubierta de carbono, durante 30 minutos. La rejilla se fijó en solución de Karnovsky y se lavó una vez con amortiguador de cacodilato y luego 8 veces con agua. La rejilla se tiñó con una solución al 6% de acetato de uranilo durante 15 minutos y luego se secó hasta su análisis. La microscopía electrónica de transmisión (TE ) se llevó a cabo en un microscopio JEOL. La Figura 9 ilustra una micrografía electrónica típica del polímero PRx0729v6 que muestra partículas esféricas con dimensiones aproximadas similares al tamaño esperado para los centros de las micelas con relación a las determinadas en solución por dispersión luminosa dinámica.
Ejemplo 16. Microscopía de fluorescencia de la captación celular y la distribución intracelular de los complejos polímero-ARNsi (Figura 10) Este ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 puede intervenir para una captación celular de ARNsi marcado con fluorescentes y de liberación endosómica; más eficientes que un reactivo de transfeccion lipídico.
Se depositaron células HeLa en portaobj etos ¡ para cámara de cultivo Lab-Tek II. Después de la incubación durante la noche, las células se transíectaron con: FAM- ARNsi 100 nM/lipofectamina 2000 o con FAM 100 nM - ARNsi a una relación de carga polímero-ARNsi de 4:1. Los complejos se formaron en PBS, pH 7.4, durante 30 minutos a una concentración 5X, se adicionaron a las células para obtener una concentración final IX y se incubaron durante la noche . Las células se tiñeron con DAPI (para visualizar el núcleo) durante 10 minutos y luego se fijaron en formaldehído 3.7% - PBS IX, durante 5 minutos y se lavaron con PBS. Las muestras se analizaron en un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert. La Figura 10B muestra la microscopía de fluorescencia de la captación celular y la distribución intracelular del complejo polímero-ARNsi comparadas con la lipofectamina (Figura 10A) . La tinción particulada de los complejos lipofectamina-ARNsi sugiere una ubicación endosómica, mientras que la tinción citoplásmica difusa de los complejos polímero-ARNsi indica que se han liberado de los endosomas al citoplasma.
Ejemplo 17. Captación de moléculas hidrofóbicas pequeñas en las micelas de polímero PRx0729v6 Este ejemplo demuestra que las moléculas hidrofóbicas pequeñas son captadas por el centro de la micela predominantemente hidrofóbico del polímero PRx0729v6.
La formación de las micelas poliméricas con o sin ARNsi se confirma mediante una técnica con sonda de fluorescencia que utiliza pireno (C16H10, PM = 202) , en la cual la partición del pireno en el centro micelar se puede determinar mediante la razón de máxima emisión 2 del espectro del pireno. El espectro de emisión de fluorescencia del pireno en la solución de la micela polimérica, se mide entre 300 y 360 nm utilizando una longitud de onda de excitación fija de 395 nm con una concentración de pireno constante de 6 x 10"7 M. El polímero varía de 0.001% a 20% (p/p) con o sin 100 íiM de ARNsi . Los datos espectrofotométricos se obtuvieron en un espectrofotómetro de fluorescencia Varían. Todos 1 los experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo a 25°C. La concentración micelar crítica (CMC) se determinó graficando la relación de intensidad I336/I333 como función de la concentración del polímero. Se calculó que los valores CMC eran aproximadamente 2 µg/mL.
Del mismo modo, un modelo de medicamento de molécula pequeña, el dipiridamol, (2- { [9- (bis (2-hidroxietil) amino) -2 , 7 -bis (1-piperidil) -3,5,8,10-tetraazabiciclo [4.4.0] deca-2 ,4,7,9, ll-pentaen- - il] -2 -hidroxietil) amino}etanol; C24H40N8O4, PM = 505) se incorpora en el centro de la micela de PRx0729v6 de la manera siguiente. El polímero (1.0 mg) y el dipiridamol (DIP) (0.2 mg) se disuelven en THF (0.5 mL) . Gota a gota, se adiciona agua desionizada (10 mL) y la solución se agita a 50°C durante 6 horas para incorporar el medicamento en el centro hidrofóbico de la raicela. La solución (2.5 mL) se divide y la absorbancia del dipiridamol se mide a 415 nm por espectroscopia UV a 25 y 37 °C. También se realizan mediciones de control determinando la reducción en función del tiempo de la absorbancia de dipiridamol en agua desionizada en ausencia del copolímero. La absorbancia a 25°C y a 37°C se mide en cada punto de evaluación y el valor se resta de la observada en la solución.
Ejemplo 18. Efecto del pH en la estructura polimerica (Figura 11) Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6.2 se disocia al disminuir el pH de 7.4 a 4.7.
El tamaño de partícula del polímero PRx0729v6.2 se determinó por dispersión luminosa dinámica a pH 7.4 y una serie de valores de pH ácido inferiores a pH 4.7 en PBS a diluciones en serie equivalentes a 5 veces de 0.5 mg/ml a 0.004 mg/ml. La Figura 11A muestra que a pH de 7.4, el polímero es estable a diluciones por debajo de 4 µg/mL en donde comienza a disociarse en una forma que produce agregados. La Figura 11B muestra que a valores crecientes de pH ácido por debajo de pH 4.7, aumenta la disociación de i la estructura micelar del polímero, es decir, sucede a concentraciones poliméricas más altas y produce niveles crecientes de monómeros de polímero con tamaños de 1-8 nm.
Ejemplo 19. Métodos para conjugar ligandos dirigidos y polinucleótidos con un copolímero Los siguientes ejemplos muestran métodos para conjugar un ligando dirigido (por ejemplo, galactosa) o un agente terapéutico polinucleótido (por ejemplo, AR si) con un copolímero diblogue. (1) El polímero se prepara por transferencia por adición fragmentación reversible (RAFT) (Chiefari et al. Macromolecules, 1998 ; 31 (16) : 5559-5562) y se forma un copolímero dibloque con grupo galactosa terminal, utilizando un agente de transferencia de cadena con galactosa como grupo sustituyente R. (2) El primer bloque de un copolímero dibloque se prepara como un copolímero que contiene ácido metilacrílico-N-hidroxisuccinimida (MAA(NHS)) en donde una galactosa-PEG-amina se conjuga con los grupos NHS o en donde un ARNsi amino disulfuro se conjuga con el NHS o en donde una piridil disulfuro amina se hace reaccionar con grupos NHS para formar un piridil disulfuro que luego reacciona con ARN tiol y forma un conjugado polímero-ARN.
Ejemplo 19.1: Preparación de galactosa-PEG-amina y galactosa-CTA El esquema 1 ilustra la síntesis esquemática de la galactosa-PEG-amina (compuesto 3) y la galactosa-CTA (agente de transferencia de cadena) (compuesto 4) .
Compuesto 1: Pentaacetato de galactosa (10 g, 25.6 mmoles) y 2- [2- (2-cloroetoxi) etoxi] etanol (5.6 mL, 38.4 mmoles) se disolvieron en CH2C12 anhidro (64 mL) y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 1 h. Gota a gota se adicionó a la mezcla anterior BF3.OEt2 (9.5 mL, 76.8 mmoles) y se mantuvo en baño de hielo durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (RT o room temperature) 48 horas. Al término de la reacción, se adicionaron 30 mL de CH2C12 para diluir la reacción. La fase orgánica se neutralizó con NHC03<acuoso) saturado, se lavó con salmuera y luego se secó con MgS04. Se eliminó el CH2C12 a presión reducida y se obtuvo el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna flash y se obtuvo el producto final 1 como un aceite de color amarillo claro. Rendimiento. 55% por cromatografía en capa fina (TLC o t in layer chromatography) (I2 y p-anisaldehído) : EA/Hex : 1/1 (Rf: ß = 0.33; a = 0.32; sin reaccionar S.M. 0.30).
Compuesto 2 : El compuesto 1 (1.46 g, 2.9 mmoles) se disolvió en DMF seco (35 mL) y se adicionó NaN3 (1.5 g, 23.2 mmoles) a la mezcla a RT. La mezcla de reacción se calentó a 85-90°C durante la noche. Al término de la reacción, se adicionó EA (15 mL) a la solución y se usó agua (50 mL) para lavar la fase orgánica 5 veces. La fase orgánica se secó con MgS04 y se purificó por cromatografía en columna flash obteniéndose el compuesto 2 como un aceite incoloro. Rendimiento: 80%, TLC (I2 y p-anisaldehído) :EA/Hex : 1/1 (Rf: 0.33).
Compuesto 3 : El compuesto 2 (1.034 g, 2.05 mmoles) se disolvió en MeOH (24 mL) y se burbujeó N2 durante 10 min, luego se adicionó Pd/C (10%) (90 mg) y TFA (80 µL) a la solución anterior. La mezcla de reacción se burbujeó otra vez con H2 durante 30 minutos y luego la reacción se agitó a RT en atmósfera de H2 durante 3 horas más. El Pd/C se eliminó con celite y el MeOH se evaporó obteniéndose el compuesto 3 como un gel pegajoso. El compuesto 3 se puede usar sin purificación adicional. Rendimiento: 95%. TLC (p-anisaldehído) : eOH/CH2Cl2 : 1/4 (Rf : 0.05) .
Compuesto 4 : ECT (0.5 g, 1.9 mmoles), NHS (0.33 g, 2.85 mmoles) y DCC (0.45 g, 2.19 mmoles) se disolvieron en CHC13 (15 mL) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó en forma continua a RT durante la noche. El compuesto 3 (1.13 g, 1.9 mmoles) y TEA (0.28 mL, 2.00 mmoles) en CHC13 (10 mL) se adicionaron lentamente a la mezcla de reacción anterior, a 0°C. La mezcla de reacción se agitó en forma continua a RT durante la noche. El CHC13 se eliminó a presión reducida y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna flash obteniéndose el compuesto 4 como un gel de color amarillo. .Rendimiento (35%) . TLC: MeOH/CH2Cl2 : 1/9 (Rf: 0.75).
Esquema 1. Síntesis de galactosa-PEG-amina (compuesto 3 ) y galactosa-CTA (compuesto 4) Ejemplo 19.2: Síntesis de [DMAE A] - [BMA-PAA-D AEMA] ; A. Síntesis de DMAEMA macroCTA.
Polimerización: En un vial de vidrio de 20 mL (con tapón septa) se adicionaron 33.5 mg de ECT (CTA RAFT) , 2.1 mg de AIBN (recristalizado dos veces en metanol), 3.0 g de DMAEMA (Aldrich, 98%, se hizo pasar a través de una pequeña columna de aluminio, justo antes de utilizarse, para eliminar el inhibidor) y 3.0 g de DMF (de alta pureza y sin inhibidor) . El vial de vidrio se cerró con el tapón septa y se purgó con nitrógeno seco (se llevó a cabo en baño de hielo y con agitación) durante 30 minutos. El | vial de reacción se colocó en una placa de reacción precalentada a 70 °C. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante 2 horas 40 minutos. El tapón septa se abrió y la mezcla de agitó en el vial en un baño de hielo durante 2-3 minutos para detener la reacción de polimerización.
Purificación: Se adicionaron 3 mL de acetona a la mezcla de reacción. En un matraz de 300 mL se adicionaron 240 mL de hexano y 60 mL de éter (80/20 (v/v) ) y con agitación la mezcla de reacción se adicionó gota a gota al matraz. Inicialmente se produce un aceite que se recolecta al sedimentar por agitación la solución turbia; rendimiento = 1.35 g (45%). Se realizaron varias precipitaciones (por ejemplo, 6 veces) en disolventes mezclados hexano/éter (80/20 (v/v)) a partir de solución de acetona. Por último, el polímero se secó a vacío durante 8 horas a RT; rendimiento «1 g.
Resumen: (Mn te6rico = 11,000 g/mol a 45% de conversión) Nombre FW (g/mol) Equiv mol Peso Peso real DMAEMA 157.21 150 0.0191 3.0 g 3.01 g ECT 263.4 1 1.2722 x 10"4 33.5 mg 33.8 mg DMF = 3.0 g; Purga con N2 : 30 min; Polimerización a 70°C durante 2 h 45 min.
B. Síntesis de [BMA-PAA-DMAEMA] a partir de DMAEMA macroCTA Todas las sustancias químicas y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Company, excepto cuando se especifique de otro modo. Metacrilato de butilo (BMA) (99%) y metacrilato de 2- (dimetilamino) etilo (DMAEMA) (98%) se hicieron pasar a través de una columna de alúmina básica (malla 150) para eliminar el inhibidor de polimerización. El ácido 2-propilacrílico (PAA) (>99%) se compró sin inhibidor y se uso tal como se recibió. El azobisisobutironitrilo (AIBN) (99%) se recristalizó de metanol y se secó a vacío. El DMAEMA macroCTA se sintetizó y se purificó tal como se describe en lo anterior (Mn -10000; PDI -1.3; >98%) . La N, N-dimetilformamida (DMF) (99.99%) (de EMD) fue grado reactivo y se utilizó tal como se recibió. El hexano, pentano y éter de EMD, se utilizaron, tal como se recibieron, para la purificación del polímero.
Polimerización: BMA (2.1 g, 14.7 mmoles) , PAA (0.8389 g, 7.5 mmoles), DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmoles), macroCTA (0.8 g, 0.0816 mmoles), AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmoles; CTA: AIBN 10:1) y DMF (5.34 mL) se adicionaron en atmósfera de nitrógeno en un vial cerrado herméticamente.
La relación CTA: Monómeros utilizada fue 1:360 (suponiendo 50% de conversión) . La concentración de monómeros fue 3 M. La mezcla se desgasificó por burbujeo de nitrógeno én la mezcla durante 30 minutos y luego se colocó sobre una placa de calentamiento (termómetro: 67°C; visualización: 70-71; velocidad de agitación 300-400 rpm) . La reacción se dejó durante 6 horas, luego se detuvo colocando el vial en hielo y exponiendo la mezcla al aire.
Purificación: La purificación del polímerp se hizo de acetona/DMF 1:1 a hexano/éter 75/25 (tres veces) . El polímero resultante se secó a vacío durante un mínimo de 18 horas. El espectro RMN mostró alta pureza en el polímero. No se observaron grupos vinílicos. El polímero se dializó a partir de etanol contra agua doblemente desionizada durante 4 días y luego se liofilizó. El polímero se analizó por cromatografía de permeación en gel (GPC) en las siguientes condiciones: Disolvente: DMF/LiBr 1%. Velocidad de flujo: 0.75 ml/min. Volumen de inyección: 100 L.
Temperatura de la columna: 60 °C. Se uso poliestireno para calibrar los detectores. Análisis GPC del polímero resultante: n = 40889 g/mol . PDI = 1.43. dn/dc = 0.049967.
Ejemplo 19.3. Síntesis de gal- [DMAEMA] - [BMA-PAA-DMAEMA] La síntesis se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 19.2. Primero, se preparó galactosa-DMAEMA macroCTA (Ejemplo 19.2. A) pero se usó galactOsa-CTA (Ejemplo 19.1, compuesto 4) en lugar de ECT como agente de transferencia de cadena. Esto dio lugar a la síntesis de poli-D AEMA con un grupo galactosa terminal (Figura 13) . La galactosa- [DMAEMA] -macro-CTA se usó después para sintetizar el segundo bloque [BMA-PAA-DMAEMA] tal como se describe en el Ejemplo 19.2. B. Después de la síntesis, los grupos protectores acetilo en la galactosa se eliminaron por incubación en 100 mM de amortiguador de bicarbonato de sodio, pH 8.5, durante 2 horas, seguida de diálisis y liofilización. Se utilizó espectroscopia RMN para confirmar la presencia en el polímero de la galactosa desprotegida.
; Ejemplo 19.4. Preparación y caracterización de copolímeros dibloque [PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] y DMAEMA-MMA (NHS) - [B-P-D] .
La Figura 14 resume la síntesis del polímero [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] en donde la relación de monómeros en el copolímero en el primer bloque es de 70:30 y la Figura 15 resume la caracterización del polímero [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] en donde la relación de monómeros en el copolímero en el primer bloque es de 70:30.
Ejemplo 19.5. Conjugación de galactosa-PEG-amina con PEGMA-MAA(NHS) para producir el polímero [PEGMA-MAA (Gal) ]- [B-P-D] La Figura 16 ilustra la preparación de copolímeros dibloque DMAEMA-MAA (NHS) o PEGMA-MAA (NHS ) modificados con grupo funcional galactosa. El polímero [DMAEMA-MMA (NHS) ] - [B-P-D] o [PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] se disolvió en DMF a una concentración entre 1 y 20 mg/ml . La galactosa-PEG-amina preparada como se describe en el Ejemplo 19.1 (compuesto 3) se neutralizó con l 2 equivalentes de trietilamina y se adicionó a la mezcla de reacción en una proporción de 5 a 1 con respecto al polímero. La reacción se llevó a cabo a 35°C durante 6 a 12 horas, después se adicionó un volumen igual de acetona, se dializó contra agua desionizada durante 1 día y se liofilizó.
Ejemplo 19.6. Conjugación de ARNsi con [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] para producir polímero [PEGMA-MAA (ARN) ]- [B-P-D] Las Figuras 17A y 17B muestran las estructuras de 2 ARNsi modificados que se pueden conjugar con polímeros que contienen NHS. Los ARNsi se obtuvieron de Agilent (Boulder, CO) . La Figura 17C muestra la estructura de la piridil disulfuro amina utilizada para derivatizar los polímeros que contienen NHS y disponer de un grupo reactivo disulfuro para la conjugación del ARN tiol (Figura 17B) .
Reacción del polímero que contiene NHS con ARNsi-disulfuro-amina. La reacción se lleva a cabo en condiciones estándar en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMF o DMSO o una mezcla de DMSO/amortiguador pH 7.8) a 35°C durante 4 a 8 horas, después se adicionó un volumen igual de acetona, se dializó contra agua desionizada durante 1 día y se liofilizó.
Reacción del polímero que contiene NHS con piridil disulfuro amina y reacción con ARNsi tiol. Se llevó a cabo la reacción de piridil disulfuro amina con polímeros que contienen NHS. Posteriormente, el polímero liofilizado se disolvió en etanol a 50 mg/ml y se diluyó 10 veces en amortiguador de bicarbonato de sodio a pH 8. El ARNsi tiol (Figura 16B) se hizo reaccionar, con un exceso molar de 2 a 5 respecto a los grupos NHS del polímero, a 35°C durante 4 a 8 horas y después se dializó contra amortiguador de fosfato, pH 7.4.
Ejemplo 19.7. Conjugación de un péptido terapéutico con un polímero modificado con piridil disulfuro.
El polímero modificado con piridil disulfuro descrito en el Ejemplo 19.6, [PEGMA-MAA(NHS) ] - [B-P-D] , también se puede usar para la conjugación de un péptido terapéutico (Figura 17D) . El péptido se sintetiza, se prepara para la conjugación y la reacción de conjugación se lleva a cabo como se describe adelante, para producir el polímero [PEG A- AA (péptido) ]- [B-P-D] .
La fusión con el dominio de transducción peptídica, la transportina peptídica (también conocida como secuencia peptídica Antennapedia (Antp) ) , se utilizó para sintetizar una forma de internalización celular del péptido Bak-BH3 (Antp-BH3) que contenía un residuo de cisteína en el carboxilo terminal (NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKMGQVGRQLAIIGDDI RRYDSC-COOH) . ; Para garantizar que haya tioles libres para la conjugación, el péptido se reconstituyó en agua y se trató durante 1 hora con el agente reductor de disulfuro TCEP inmovilizado en gel de agarosa. El péptido reducido (400 µ?) se hizo reaccionar durante 24 horas con el polímero, modificado en el extremo con piridil disulfuro, en amortiguador de fosfato (pH 7) que contenía 5 m de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) .
La reacción del grupo terminal del políjnero, piridil disulfuro, con la cisteína del péptido da lugar a la 2 -piridintiona, que se puede medir por espectrofotometría para caracterizar la eficiencia de conjugación. Para validar después el intercambio de disulfuro, los conjugados se corrieron en gel SDS-PAGE 16.5% tricina. En paralelo, se trataron alícuotas de las reacciones de conjugación con TCEP inmovilizado antes de someterlas a SDS-PAGE para verificar la liberación del péptido a partir del polímero en un ambiente reductor.
Las reacciones de conjugación se hicieron con estequiometrías polímero/péptido de 1, 2 y 5. Se utilizaron mediciones de absorbancia por espectrofotometría UV a 343 nm de la liberación de 2-piridintiona que indicaron eficiencia de conjugación. Luego, se utilizó gel SDS-PAGE para caracterizar los conjugados péptido-polímero . A una relación molar polímero/péptido de 1, una cantidad detectable del péptido formó dímeros por medio de puentes disulfuro a través de la cisteína terminal. Sin embargo, se favoreció la reacción tiol para el piridil disulfuro y la banda de péptido libre ya no fue visible con relaciones polímero/péptido iguales o mayores de 2. Al tratar los conjugados con el agente reductor TCEP, fue posible escindir los enlaces disulfuro polímero-péptido según lo indica la apariencia de la banda de péptido en estas muestras .

Claims (78)

REIVINDICACIONES
1. Un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que 1 son copolímeros de bloque ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden : i. al menos un bloque hidrofóbico; ii. una pluralidad de unidades monoméricas que contienen una primera especie aniónica a un pH aproximado al neutro; y b. al menos un polinucleótido, en donde el polinucleótido no está en la parte central del portador polimérico.
2. Un portador polimérico según la reivindicación 1, en donde la primera especie aniónica es prácticamente neutra o sin carga a un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5.
3. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el o los polinucleótidos son oligonucleótidos .
4. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polinucleótido es i un modulador de expresión génica de un oligonucleótido .
5. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polinucleótido es un agente de silenciamiento génico de un oligonucleótido .
6. El portador poliraérico según la reivindicación 5, en donde el agente de silenciamiento génico es un AR si, un oligonucleótido antisentido, un sustrato Dicer, un ARNmi, ARNai o ARNsh.
7. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que también comprende una entidad dirigida.
8. El portador polimérico según ! la reivindicación 7, en donde la entidad dirigida está unida a la porción de envoltura del portador polimérico.
9. El portador polimérico según la reivindicación 8, en donde la entidad dirigida está unida a la porción de envoltura mediante enlace covalente con el polímero.
10. El portador polimérico según las reivindicaciones 1 a 9, en donde el polímero es un polímero gradiente .
11. El portador polimérico según las reivindicaciones 1 a 10, en donde el polímero tiene un índice de polidispersidad menor de 2, menor de 1.8, menor de 1.5, menor de 1.4 o menor de 1.3.
12. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la pluralidad de polímeros están ensamblados formando una micela.
13. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el portador polimérico es desestabilizante de membrana.
14. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el bloque hidrofóbico comprende una pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga.
15. El portador polimérico según , la reivindicación 14, en donde la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga, están prácticamente sin carga un pH endosómico.
16. El portador polimérico según la reivindicación 14, en donde la pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga, están prácticamente sin carga un pH aproximado de 6 o inferior.
17. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que también comprende una pluralidad de unidades monoméricas hidrofóbicas , las unidades monoméricas hidrofóbicas son parte del bloque hidrofóbico o adicionales al bloque hidrofóbico.
18. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la pluralidad de polímeros se han autoensamblado de manera espontánea formando el portador polimérico.
19. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido es un bloque del polímero.
20. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la envoltura del portador polimérico comprende en polinucleótido.
21. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde al menos uno entre la pluralidad de polímeros comprende un bloque portador de polinucleótido.
22. El portador polimérico según la reivindicación 21, en donde la envoltura del portador polimérico comprende el bloque portador de polinucleótido.
23. El portador polimérico según la reivindicación 22, en donde el o los polinucleótidos están unidos al bloque portador de polinucleótido mediante un enlace covalente, una interacción no covalente, o una combinación de éstos.
24. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde el bloque portador de polinucleótido está sin carga a un pH aproximado al neutro y/o a un pH aproximado al endosómico.
25. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde el bloque portador de polinucleótido es polianiónico a un pH aproximado al neutro y/o a un pH aproximado al endosómico.
26. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde el bloque portador de polinucleotido es zwiteriónico a un pH aproximado al neutro y/o a un pH aproximado al endosómico.
27. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en donde el bloque portador de polinucleotido es policatiónico a un pH aproximado al neutro y/o a un pH aproximado al endosómico.
28. El portador polimérico según j la reivindicación 27, en donde el o los polinucleótidos son un polianión que contiene x aniones y en donde el bloque portador de polinucleotido contiene aproximadamente 0.7·'? cationes, o más.
29. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, en donde el bloque portador de polinucleotido es un bloque homopolimérico.
30. El portador polimérico según la reivindicación 29, en donde el bloque homopolimérico es poli-N, N-di {C1-C6) alquil -amino (C^-CJ alquil -etacrilato, poli-N, N-di (C^-C8) alqui1 -amino (C^-C8) alquil -metacrilato o poli-N, N-di (C^-C8) alquil -amino (C^-C8) alquil -acrilato .
31. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, en donde el bloque portador de polinucleotido es un copolímero que comprende, (i) al menos una unidad monomérica N, N-di (C^-C8) alquil -amino (C-^-C6) alquil-etacrilato, al menos un N,N-di (C^CJ alquil-amino (Ci-Cg) alquil-metacrilato, al menos un N,N-di(C1-C6) alquil-amino alquil-acrilato, o una combinación de los mismos; y (ii) al menos una unidad monomérica espaciadora.
32. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la primera especie aniónica es un grupo ácido carboxílico, un grupo sulfonamida, un ácido borónico, un grupo ácido sulfónico, un grupo ácido sulfínico, un grupo ácido sulfúrico, un grupo ácido fosfórico, un grupo ácido fosfónico o un grupo ácido fosforoso, o una base conjugada de los mismos.
33. El portador polimérico según las reivindicaciones 1 a 6, en donde el bloque hidrofóbico también comprende al menos una unidad monomérica espaciadora .
34. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el bloque hidrofóbico también comprende una segunda especie susceptible de adquirir carga.
35. El portador polimérico según la reivindicación 34, en donde la segunda especie susceptible de adquirir carga es una especie catiónica al protonarse.
36. El portador polimérico según la reivindicación 35, en donde la especie catiónica tiene un valor pKa de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9.
37. El portador polimérico según , la reivindicación 36, en donde la segunda especie susceptible de adquirir carga es una amina o imina acíclica, una amina o imina cíclica o un heteroarilo que contiene nitrógeno.
38. El portador polimérico según la reivindicación 34, en donde al menos una de las primeras especies susceptibles de adquirir carga y al menos una de las segundas especies susceptibles de adquirir carga, están presentes en una sola unidad monomérica.
39. El portador polimérico según ¡ la reivindicación 34, en donde la primera especie susceptible de adquirir carga se encuentra en una primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga y la segunda especie susceptible de adquirir carga está en una segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga.
40. El portador polimérico según la reivindicación 34, en donde la primera especie susceptible de adquirir carga es una especie aniónica al desprotonarse, la segunda especie susceptible de adquirir carga es- una especie catiónica al protonarse y en donde la relación entre las especies aniónicas y catiónicas es aproximadamente de 1:4 a aproximadamente 4:1 a un pH aproximado al neutro.
41. El portador polimérico según la reivindicación 39, en donde la relación entre la primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga y la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga es aproximadamente de 1:4 a aproximadamente 4:1.
42. El portador polimérico según la reivindicación 39, en donde la primera unidad monomérica susceptible de adquirir carga es ácido ' (C2-C8) alquilacrilico .
43. El portador polimérico según la reivindicación 39, en donde menos de 50% de la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga, está cargada y se convierte en catiónica a un pH aproximado de 8. !
44. El portador polimérico según la reivindicación 39, en donde la segunda unidad monomérica susceptible de adquirir carga es N, N-di (C^-C8) alquil -amino (C^Cg) alquil-etacrilato, N, N-di (C^-C8) alquil-amino (Cx-C6) alquil-metacrilato o N, N-di (C^-C8) alquil-amino (C^-C6) alquil -acrilato .
45. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el bloque hidrofóbico comprende al menos una unidad monomérica que no es susceptible de adquirir carga.
46. El portador polimérico según la reivindicación 45, en donde la unidad monomérica no susceptible de adquirir carga es (C2-C8) alquil-etacrilato, (C2-C8) alquil-metacrilato o un (C2-C¡¡) alquil-acrilato .
47. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el polímero también tiene un bloque espaciador.
48. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47, en donde el portador polimérico tiene un diámetro hidrodinámico promedio en medio acuoso y a un pH aproximado de 7.4, de aproximadamente 10 nm a 200 nm.
49. El portador polimérico según la reivindicación 48, en donde el portador polimérico tiene un diámetro hidrodinámico promedio en medio acuoso y a un pH aproximado de 7.4, de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm.
50. El portador polimérico según la reivindicación 49, en donde el portador polimérico tiene un diámetro hidrodinámico promedio en medio acuoso y a ún pH aproximado de 7.4, de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm.
51. El portador polimérico según la reivindicación 5, en donde el agente de silenciamiento génico es un AR si.
52. El portador polimérico según la reivindicación 51, en donde el portador polimérico comprende 1 a 5 ARNsi.
53. El portador polimérico según la reivindicación 51, en donde el portador polimérico comprende 5 a 10 ARNsi.
54. El portador polimérico según : la reivindicación 51, en donde el portador polimérico comprende 10 a 100 ARNsi.
55. El portador polimérico según la reivindicación 20, en donde la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1.
56. El portador polimérico según la reivindicación 20, en donde la relación entre el peso molecular promedio numérico del bloque hidrofóbico y el peso molecular promedio numérico del bloque portador de polinucleótido es de aproximadamente 2:1.
57. El portador polimérico según la reivindicación 20, en donde el bloque portador de polinucleótido es un bloque portador de ARNsi.
58. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, en donde el bloque portador de polinucleótido tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 7,000 a 40,000 daltones.
59. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, en donde el bloque portador de polinucleótido tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 20,000 daltones. '
60. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, en donde el bloque portador de polinucleótido tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 daltones.
61. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 55 a 57, en donde el bloque portador de ARNsi tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 20,000 daltones.
62. El portador polimérico según la reivindicación 1, en donde el bloque hidrofóbico tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 100,000 daltones.
63. El portador polimérico según la reivindicación 62, en donde el bloque hidrofóbico tiene un peso molecular promedio numérico (Mn) de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 50,000 daltones.
64. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 63, en donde el portador polimérico es estable a un pH aproximado de 7.4.
65. El portador polimérico según la reivindicación 65, en donde el portador polimérico es mucho menos estable a un pH aproximado de 5.8 que a un pH aproximado de 7.4.
66. El portador polimérico según la reivindicación 65, en donde el portador polimérico comprende un polinucleótido y en donde más de 90% del portador polimérico pierde la capacidad para suministrar un polinucleótido a una célula a un pH aproximado de 5.8 y a una concentración aproximada de 18 µ9/p??- y menos de 10% del portador polimérico pierde la capacidad para suministrar un polinucleótido a una célula a un pH aproximado de 7.4 y a una concentración aproximada de 18 µg/mL.
67. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 66, en donde el portador polimérico es estable en suero humano al 50%, durante al menos 2 horas, en plasma humano al 50%, durante al menos 2 horas, en suero de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, en plasma de ratón al 50%, durante al menos 2 horas, o una combinación de los mismos.
68. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 67, que comprende al menos dos polinucleótidos diferentes.
69. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 68, en donde el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies susceptibles de adquirir carga, en donde cada primera especie susceptible de adquirir carga está cargada o es susceptible de adquirir carga y convertirse en una especie aniónica.
70. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 69, en donde el portador polimérico comprende más de 5, más de 20, más de 50 ó más de 100 segundas especies susceptibles de adquirir carga, en donde cada segunda especie susceptible de adquirir carga está cargada o es susceptible de adquirir carga y convertirse en una especie catiónica.
71. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 70, en donde el bloque hidrofóbico comprende más de 5, más de 20, más de 50 o más de 100 primeras especies susceptibles de adquirir carga, en donde cada primera especie susceptible de adquirir carga está cargada o es susceptible de adquirir carga y convertirse en una especie aniónica.
72. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 71, en donde el bloque hidrofóbico es un bloque copolimérico .
73. Un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son' copolímeros ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden: i. al menos un bloque hidrofóbico, el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de especies que son aniónicas a un pH aproximado al neutro; ii. un bloque portador de polinucleótido, el bloque portador de polinucleótido es policatiónico a un pH aproximado al neutro; b. al menos un polinucleótido.
74. El portador polimérico según ' la reivindicación 73, en donde el polinucleótido no está en la parte central del portador polimérico.
75. El portador polimérico según cualquiera de las reivindicaciones 73 ó 74, en donde el o los bloques hidrofóbicos comprenden una pluralidad de especies catiónicas a un pH aproximado al neutro.
76. Un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden: i. al menos un bloque hidrofóbico, el bloque hidrofóbico contiene una pluralidad de especies que son aniónicas a un pH aproximado al neutro; ii. un bloque portador de polinucleótido; b. al menos diez polinucleótidos , los polinucleótidos no están en la parte central del portador polimérico.
77. El portador polimérico según la reivindicación 76, en donde el portador polimérico comprende al menos veinte polinucleótidos.
78. Un portador polimérico que comprende: a. una pluralidad de polímeros que son copolímeros ensamblados formando un portador polimérico, el portador polimérico comprende una parte central y una envoltura, los copolímeros de bloque comprenden: i. al menos un bloque hidrofóbico; ii. una pluralidad de unidades monoméricas que comprenden una pluralidad de especies que son aniónicas a un pH aproximado al neutro; y b. al menos un polinucleótido, el portador polimérico tiene un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm en un medio acuoso y a un pH aproximado de 7.4.
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