CN111801321A - 三环-dna核苷前体和其制备方法 - Google Patents

三环-dna核苷前体和其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备tc‑DNA核苷前体的方法、得到的tc‑DNA核苷和包含这样的tc‑DNA核苷的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括使用碳烯前体。在一个实施方案中，本发明包括制备式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)的tc‑DNA核苷前体的方法。

Description

三环-DNA核苷前体和其制备方法
发明领域
本发明涉及三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷前体化合物和作为寡聚物的结构单元制备这样的化合物的方法。
发明背景
反义技术为用于减少特定基因产物表达的有效手段，并因此可用于治疗、诊断和研究应用。通常，反义技术背后的原理为反义寡聚化合物(核苷酸或其类似物的序列)与靶核酸杂交并调节基因表达活性或功能(比如转录和/或翻译)。
反义寡聚化合物可从化学修饰的反义寡核苷酸制备，后者根据治疗策略可包括各种不同的结构变化。例如，三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)是构象上受约束的DNA类似物。
本领域需要允许批量制备tc-DNA核苷前体的方法，所述前体可用作用于基于含tc-DNA的反义寡核苷酸的疗法的结构单元。
发明概述
在一个实施方案中，本发明包括用于制备式I、式II、式III、式IV、式V或式VI的tc-DNA核苷前体的方法：
Figure 233730DEST_PATH_IMAGE001
Figure 885292DEST_PATH_IMAGE002
其中X可以是烷氧基；
T1和T2可以是OR1，其中R1是H或羟基保护基；
q1、q2、q3、q4和q5各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R2，其中n是0-6和其中R2选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z1和z2可各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一个实施方案中，本发明包括用于制备式VII、式VIII或式IX的tc-DNA核苷前体的方法：
Figure 399450DEST_PATH_IMAGE003
。
在一个实施方案中，本发明包括制备式I-IX的任一个的tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 在环丙烷化温度下将式X、式XI或式XII的化合物：
Figure 529080DEST_PATH_IMAGE004
加入碳烯前体；和
c. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y可以是烷氧基；
T3和T4可各自是OR5，其中R5可以是H或羟基保护基；
q6、q7和q8可各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；以及z3和z4可各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一个实施方案中，本发明包括制备式I-IX的任一个的tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 制备式X、式XI或式XII的化合物的溶液：
Figure 202506DEST_PATH_IMAGE005
；
c. 在环丙烷化温度下将碳烯前体加入式X、式XI或式XII的化合物的溶液；和
d. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y可以是烷氧基；
T3和T4可各自是OR5，其中R5可以是H或羟基保护基；
q6、q7和q8可各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6可选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；以及z3和z4可各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一个实施方案中，制备碳烯前体的步骤可包括在溶剂中合并路易斯酸催化剂(例如ZnEt2)和R7I2。在一些实施方案中，R7可选自CH2、CH-C1-6烷基、CH-C2-6烯基、CH-C2-6炔基、取代的CH-C1-6烷基、取代的CH-C2-6烯基、取代的CH-C2-6炔基和CH-(CH2)n-C(O)-R8，其中n是0-6和其中R8选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基。在一些实施方案中，R7是烷基。在一些实施方案中，R7是CH2。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤包括将碳烯添加剂加入路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)和R7I2的混合物的步骤，其中碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤包括将路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)加入碳烯添加剂和R7I2的混合物的步骤，其中碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤包括将R7I2加入路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)和碳烯添加剂的混合物的步骤，其中碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤包括将路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)和R7I2加入碳烯添加剂的步骤，其中碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤包括合并路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)、R7I2和碳烯添加剂的步骤，其中碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是脂族醇(例如，取代的或未取代的烷基醇)、芳族醇(例如，取代的或未取代的酚)、取代的或未取代的羧酸(例如，三氯乙酸)或取代的或未取代的磷酸酯(例如，(烷基-O)2P(O)OH或(芳基-O)2P(O)OH)。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCO2H的取代的羧酸，其中每个Q可独立地选自H、Cl、Br和F。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCO2H的取代的羧酸，其中Q3C可定义为CCl3、CHCl2、CH2Cl或CF3。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCH2OH的取代的烷基醇，其中每个Q可独立地选自H、Cl、Br和F。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCH2OH的取代的羧酸，其中Q3C可定义为CCl3、CHCl2、CH2Cl或CF3。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是三氯乙酸、2,2,2-三氟乙醇、三氯苯酚或(n-BuO)2P(O)OH。
在一些实施方案中，碳烯前体是Q3CCO2ZnR7I、Q3CCH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I、(烷基-O)2P(O)OZnR7I、(芳基-O)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I，其中每个Q独立地选自H、Cl、Br和F，和R7选自CH2、CH-C1-6烷基、CH-C2-6烯基、CH-C2-6炔基、取代的CH-C1-6烷基、取代的CH-C2-6烯基、取代的CH-C2-6炔基和CH-(CH2)n-C(O)-R8，其中n是0-6和其中R8选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基。
在一些实施方案中，碳烯前体是CCl3CO2ZnR7I、CF3CH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I。
在一些实施方案中，碳烯前体是CCl3CO2ZnCH2I、CF3CH2OZnCH2I、(n-BuO)2P(O)OZnCH2I或2,4,6-Cl3C6H2OZnCH2I。
在一个实施方案中，本发明包括根据本文描述的方法制备的tc-DNA核苷前体。
在一个实施方案中，本发明包括从本文描述的tc-DNA核苷前体制备的tc-DNA核苷。
在一个实施方案中，本发明包括含有tc-DNA的寡核苷酸，其包含本文描述的tc-DNA核苷。
附图简述
前文的概述以及随后的发明详细描述当结合附图阅读时将得到更好理解。
图1说明了从D-甘露糖到双环糖中间体10的合成路线。合成路线中使用的试剂和条件如下：(a) Me2C(OMe)2 (4.4 eq.)，TsOH (0.003 eq.)，50℃，1 h；(b) Ac2O (2 eq.)，吡啶，rt，16h；(c) 64% aq. AcOH，55℃，4h；(d) HC(OMe)3 (5 eq.)，回流，1h；(e) Ac2O(7.4 eq.)，130℃，3h；(f) MeOH，t-BuOK (0.4 eq.)，rt，从D-甘露糖为46%；(g) NaH (1.7eq.)，DMSO (3 eq.)，BrCH2P(Ph)3 (2 eq.)，THF，65℃，4 h，60%收率；(h) Grubbs I (0.005eq.)，CH2Cl2，rt，16h，97%收率；(i) 10% Pd/C，H2，MeOH，rt，16 h，97%收率；和(j) PCC (1.7eq.)，CH2Cl2，rt，16 h，85%收率。从D-甘露糖经10个步骤为20%收率。
图2说明了从D-核糖到双环糖中间体10的备选合成路线。合成路线中使用的试剂和条件如下：(a) Br2 (1.04 eq.)，NaHCO3 (2 eq.)，H2O，0-5℃，粗制；(b) DMP，丙酮，H2SO4(cat.)，Amberlyst，rt，(结晶，经2个步骤为67%收率)；(c) NaIO4 (1.05 eq.)，NaOH (1.1eq.)，0℃，BaCl2 (粗制，78%收率)；(d) iPrOH，PPTS (0.02 eq.)，回流(色谱，63%收率)；(e) LiCH2(O)P(OMe)2 (1.1 eq.)，THF，-78℃至rt (粗制，约60%收率)；和(f) 10% Pd/C，H2，EtOAc，rt (色谱，95%收率)。从D-核糖经6个步骤为16%收率。
图3说明了从中间体10到醇中间体15的合成路线。合成路线中使用的试剂和条件如下：(a) (EtO)2P(O)CH2CO2Et (1 eq.)，THF，0℃至rt，88 %收率；(b) MCPBA (2.2 eq.)，CH2Cl2，0至40℃，18 h；(c) LiAlH4 (1.5 eq.)，THF，0℃至rt，1 h (色谱，86%收率)；(d)IBX，THF/DMSO，rt，2.5 h，91%收率；和(e) MeOH，Amberlite IR-120 (H+)，在rt下16 h然后60℃持续2 h (色谱，77%收率)。
图4 说明了叔丁基二甲基甲硅烷基烯醇醚中间体17的合成路线。合成路线中使用的试剂和条件如下：(a) TCCA (0.35 eq.)，TEMPO (0.007 eq.)，AcONa (3 eq.)，CH2Cl2，丙酮，-15至0℃，1 h；和(b) TBDMSCl (1.4 eq.)，DBU (1.6 eq.)，KI (0.1 eq.)，THF，rt，2h。或者，合成路线中使用的试剂和条件可以是：(a) DMP，CH2Cl2，rt；和(b) (1) LDA，-65℃，然后(2) TBDMSCl，THF，-65℃至0℃。
发明详述
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。本文使用的标题仅是出于便利的原因，而不应解释为限制本发明的任何方面和实施方案的公开。本文提及的所有专利和出版物通过引用以其整体并入。
定义
本文使用的术语“寡聚化合物”是指优选地包含通过核苷间连接基团连接的八个或更多个单体亚基的化合物，其中所述八个或更多个单体亚基中的至少两个为三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷。
本文使用的术语“单体亚基”意指包括适合于寡聚物合成的所有方式的单体单元，包括并且一般地和优选地是指单体亚基，比如α-D-核糖核苷、β-D-核糖核苷、α-D-2’-脱氧核糖核苷、β-D-2’-脱氧核糖核苷、天然存在的核苷、修饰的核苷，并且在此特别是三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷和2’-修饰的核糖核酸(2’-修饰的RNA)核苷、锁核酸(LNA)核苷、肽核酸(PNA)核苷、2’-脱氧2’-氟-阿糖核苷、己糖醇核酸(HNA)核苷；和二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)核苷、核苷的模拟物、天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸，并且在此特别是三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷酸和2’-修饰的核糖核酸(2’-修饰的RNA)核苷酸，和核苷酸的模拟物。一般地和优选地，本文使用的术语“单体亚基”是指天然存在的核苷和修饰的核苷，并且在此特别是核糖核苷、脱氧核糖核苷、三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷，2’-修饰的核糖核酸(2’-修饰的RNA)核苷、锁核酸(LNA)核苷、肽核酸(PNA)核苷，2’-脱氧2’-氟-阿糖核苷、己糖醇核酸(HNA)核苷和二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)核苷，以及天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸，并且在此特别是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷酸、2’-修饰的核糖核酸(2’-修饰的RNA)核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)核苷酸、2’-脱氧2’-氟-阿糖核苷酸、己糖醇核酸(HNA)核苷酸和二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)核苷酸。进一步优选地，本文使用的术语“单体亚基”是指修饰的核苷酸，并且在此特别是三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷酸和2’-修饰的核糖核酸(2’-修饰的RNA)核苷酸。
本文使用的术语“烷基磷酸酯部分”是指C3-32烷基-O-P(O)(OH)-O-的基团，其中所述C3-32烷基独立地选自如本文定义的C3-32烷基。
本文使用的术语“烷基膦酸酯部分”是指C1-32烷基-O-P(O)-O-的基团，其中所述C1-32烷基独立地选自如本文定义的C1-32烷基。
本文使用的术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成，不含不饱和，具有1-32个碳原子，并且可以或一般地通过单键连接于分子的其余部分的直或分支烃链基团(例如(C1-32)烷基或C1-32烷基)。每当出现在本文中，数值范围比如“1-32”是指给定范围内的每个整数。例如，“1-32个碳原子”意指烷基可由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等(直至并包括32个碳原子)组成，尽管该定义也旨在涵盖在没有具体指定数值范围而出现术语“烷基”的情况。典型的烷基包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(可与异丙基互换使用；本文可互换地缩写为iPr或Pri)、正丁基、异丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基(可与1,1-二甲基乙基或叔丁基互换使用)、正戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。除非说明书中另外具体说明，否则烷基任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、烷氧基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、羟基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。优选地，本文使用的术语“烷基”是指如本文定义的未取代的烷基。
本文使用的术语“亚烷基”是指衍生自如本文定义的烷基的直或分支烃链双基，其中所述烷基的一个氢被切掉产生所述亚烷基的第二个基。作为说明，亚烷基的实例为-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(CH3)-CH2-或-CH(CH2CH3)-。
本文使用的术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成，含有至少一个双键，和具有2-32个碳原子，并且可以或一般地通过单键连接于分子的其余部分的直或分支烃链基团(即(C2-32)烯基或C2-32烯基)。每当出现在本文中，数值范围比如“2-32”是指给定范围内的每个整数——例如“2-32个碳原子”意指烯基可由2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子等(直至并包括32个碳原子)组成。典型的烯基包括(但不限于)乙烯基(即乙烯基)、丙-1-烯基(即烯丙基)、丁-1-烯基、戊-1-烯基和戊-1,4-二烯基。每当适用时，例如当取代时，每个双键可具有(E)-或(Z)-构型。因此，如果适用，烯基可包括所述双键以其(E)-构型、以其(Z)-构型及其任何比率的混合物中的每一种。除非说明书中另外具体说明，否则烯基任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、烷氧基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、羟基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。优选地，本文所用的术语“烯基”是指如本文定义的未取代的烯基。
本文使用的术语“亚烯基”是指衍生自如本文定义的烯基的直或分支烃链双基，其中所述烯基的一个氢被切掉产生所述亚烯基的第二个基。
术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成，含有至少一个三键，具有2-10个碳原子的直或分支烃链基团(即(C2-32)炔基或C2-32炔基)。每当出现在本文中，数值范围比如“2-32”是指给定范围内的每个整数——例如“2-32个碳原子”意指炔基可由2个碳原子、3个碳原子等(直至并包括32个碳原子)组成。典型的炔基包括(但不限于)乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基。除非说明书中另外具体说明，否则炔基任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。优选地，本文所用的术语“炔基”是指如本文定义的未取代的炔基。
本文使用的术语“亚炔基”是指衍生自如本文定义的炔基的直或分支烃链双基，其中所述炔基的一个氢被切掉产生所述亚炔基的第二个基。
术语“烷氧基”是指基团-O-烷基，包括通过氧连接于母体结构的1-32个碳原子的直链、分支构型及其组合。实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、环丙氧基和环己氧基。“低级烷氧基”是指含有1-6个碳的烷氧基，也称为(C1-6)烷氧基或O-C1-6烷基。
术语“取代的烷氧基”是指其中烷基成分被取代的烷氧基(即-O-(取代的烷基))。除非说明书中另外具体说明，否则烷氧基的烷基部分任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。
术语“酰基”是指基团(烷基)-C(O)-、(芳基)-C(O)-、(杂芳基)-C(O)-和(杂烷基)-C(O)-，其中所述基团通过羰基官能团连接于母体结构。除非说明书中另外具体说明，否则酰基的烷基、芳基或杂芳基部分任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。
除非说明书中另外具体说明，否则术语“氨基”或“胺”是指-N(Ra)2基团，其中每个Ra独立地为氢、烷基、氟烷基、碳环基、碳环基烷基、芳基、芳烷基、杂环烷基、杂环烷基烷基、杂芳基或杂芳基烷基。当-N(Ra)2基团具有除氢以外的两个Ra取代基时，其可与氮原子结合形成4-、5-、6-或7-元环。例如，-N(Ra)2旨在包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。除非说明书中另外具体说明，否则氨基或胺基任选地被一个或多个独立地为以下的取代基取代：烯基、羧基(-COOH)、杂烷基、杂烯基、磷酸酯基(-OP(O)(OH)O-)、膦酸酯基(-OP(O)O-)、任选地被卤素(优选地被碘)或羧基取代的苯基(-C6H4)。
术语“芳族”或“芳基”或“Ar”是指具有6-10个环原子的芳族基团(例如C6-C10芳族或C6-C10芳基)，其具有至少一个具有为碳环的共轭π电子系统的环(例如苯基、芴基和萘基)。由取代的苯衍生物形成并在环原子上具有自由价的二价基团称为取代的亚苯基。通过从具有自由价的碳原子去除一个氢原子衍生自一价多环烃基(其名称以“-基(-yl)”结尾)的二价基团，通过对相应的一价基团的名称添加“亚(-idene)”来命名，例如具有两个连接点的萘基称为亚萘基。每当出现在本文中，数值范围比如“6-10”是指给定范围内的每个整数，例如“6-10个环原子”意指芳基可由6个环原子、7个环原子等(直至并包括10个环原子)组成。该术语包括单环或稠环多环(即共享相邻的环原子对的环)基团。
术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指(芳基)烷基基团，其中芳基和烷基如本文公开的那样，并且其任选地被一个或多个分别描述为芳基和烷基的合适取代基的取代基取代。
本文可互换使用的术语“羧基”或“羧基的”是指-(C=O)OH基团。
术语“环烷基”是指仅含有碳和氢，并且可为饱和或部分不饱和的单环或多环基团。环烷基包括具有3-10个环原子的基团(即(C3-10)环烷基或C3-10环烷基)。每当出现在本文中，数值范围比如“3-10”是指给定范围内的每个整数——例如“3-10个碳原子”意指环烷基可由3个碳原子等(直至并包括10个碳原子)组成。环烷基的说明性实例包括(但不限于)以下部分：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、降冰片基等。
术语“氟烷基”是指被一个或多个如以上定义的氟基团取代的如以上定义的烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、2,2,2-三氟乙基、1-氟甲基-2-氟乙基等。氟烷基的烷基部分可如以上对烷基定义的那样被任选地取代。
本文使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，优选为碘。在一个优选的实施方案中，卤素取代基为碘。
本文使用的术语“杂烷基”和“杂烯基”是指任选取代的烷基和烯基，并且其具有一个或多个选自除碳以外的原子的骨架链原子，例如氧、氮、硫、磷或其组合。可给出数值范围，例如C1-C4杂烷基，其是指总的链长，在该实例中其为4个原子长。
术语“杂芳基”或“杂芳族”或“HetAr”是指5-18元芳族基团(例如C5-C13杂芳基)，其包含一个或多个选自氮、氧和硫的环杂原子，并且其可为单环、双环、三环或四环系统。每当出现在本文中，数值范围比如“5-18”是指给定范围内的每个整数——例如“5-18个环原子”意指杂芳基可由5个环原子、6个环原子等(直至并包括18个环原子)组成。通过从具有自由价的原子去除一个氢原子衍生自一价杂芳基(其名称以“-基”结尾)的二价基团，通过对相应的一价基团的名称添加“亚”来命名——例如具有两个连接点的吡啶基为亚吡啶基。
术语“立体异构体”是指具有相同的化学组成，但原子或基团的空间排列不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心(其中化合物不是彼此的镜像)的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质以及化学和生物反应性。非对映异构体的混合物可以高分辨率分析程序(比如电泳和色谱法)分离。
“对映异构体”是指为彼此不能重叠的镜像的化合物的两种立体异构体。
本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P. Parker, Ed., McRaw-Hiff Dictionary of Chemical Terms (1984), McGraw-Hill Book Company, New York以及Eliel, E.和Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley &Sons, Inc., New York, 1994。
化学式中的符号(*)、(#)和(§)表示i) 连接点，ii) 基，和/或iii) 未共享电子。
本文使用的术语“反义寡核苷酸(AON)”是指能够与具有互补核苷酸序列的前-mRNA或mRNA相互作用和/或杂交从而修饰基因表达的寡核苷酸或寡聚化合物。
本文使用的术语“保护基”旨在意指选择性地封闭多官能化合物的一个或多个反应位点，使得可在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应，并然后该基团可在选择性反应完成之后易于去除或脱保护的基团。多种保护基被例如公开于Protecting Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene和P.G.M. Wuts, 第3版, John Wiley &Sons, New York 1999。
本文可互换使用的术语“用于氨基的保护基”、“用于氨基基团的保护基”或“氨基保护基”为本领域众所周知的，并且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W. Greene和P.G.M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, New York (1999)；Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis, P.G.M. Wuts, 第5版, John Wiley &Sons, (2014)；和Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S.L. Beaucage等人编辑，06/2012中，并且在此特别是在Chapter 2中详细描述的那些保护基。用于本发明的合适的“氨基保护基”包括并且一般地和优选地在每次出现时独立地选自氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、9-(2-磺基)芴基甲基氨基甲酸酯、2,7-二叔丁基-[9-(10,10-二氧代-10,10,10,10-四氢噻吨基)]甲基氨基甲酸酯(DBD-Tmoc)、4-甲氧基苯甲酰甲基氨基甲酸酯(Phenoc)、2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(Troc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、2-苯基乙基氨基甲酸酯(hZ)、1,1-二甲基-2,2-二溴乙基氨基甲酸酯(DB-t-BOC)、1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙基氨基甲酸酯(TCBOC)、氨基甲酸苄酯(Cbz)、对甲氧基苄基氨基甲酸酯(Moz)和2,4,6-三甲基苄基氨基甲酸酯、(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMTr)；以及甲酰胺、乙酰胺、苯甲酰胺。
本文可互换使用的术语“用于羟基的保护基”、“用于羟基基团的保护基”或“羟基保护基”为本领域众所周知的，并且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W. Greene和P.G.M. Wuts, 第3版, John Wiley & Sons, New York (1999)；Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis, P.G.M. Wuts, 第5版, John Wiley &Sons, (2014)；和Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S.L. Beaucage等人编辑，06/2012中，并且在此特别是在Chapter 2中详细描述的那些保护基。在某个实施方案中，本发明的“羟基保护基”包括并且一般地和优选地在每次出现时独立地选自乙酰基、苯甲酰基、苄基、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基、[双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基](DMTr)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基](MMT)、对甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基(三苯基甲基，Tr)、甲硅烷基醚，比如叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚；甲基醚、乙氧基乙基醚(EE)。
本发明的“羟基保护基”的优选实例包括并且在每次出现时独立地选自乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4’-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、4-单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4’,4’’-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯磺酰基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4’,4’’-三(苯甲酰氧基)三苯甲基、二苯基氨基甲酰基、乙酰丙基(levulinyl)、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基呫吨-9-基(pixyl)或9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。
本文使用并且缩写为Bx的术语“核碱基”是指未修饰的或天然存在的核碱基以及修饰的或非天然存在的核碱基及其合成模拟物。核碱基为含有一个或多个能够与核酸的杂环碱基氢键合的原子或原子团的任何杂环碱基。
核碱基的典型和优选的实例为嘌呤碱基或嘧啶碱基，其中优选地所述嘌呤碱基为嘌呤或取代的嘌呤，和所述嘧啶碱基为嘧啶或取代的嘧啶。更优选地，核碱基为(i) 腺嘌呤(A)、(ii) 胞嘧啶(C)、(iii) 5-甲基胞嘧啶(MeC)、(iv) 鸟嘌呤(G)、(v) 尿嘧啶(U)或(vi)5-甲基尿嘧啶(MeU)或者(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物。术语“(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物”和“核碱基衍生物”本文可互换使用。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的衍生物和核碱基衍生物分别为本领域的技术人员已知的，并且描述于例如Sharma V.K. et al., Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1454-1471中，并且非限制性地包括5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、烷基腺嘌呤(比如6-甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤)、烷基鸟嘌呤(比如6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤)、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、炔基嘧啶碱基(比如5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)胞嘧啶)、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶；8-取代的嘌呤碱基(比如8-卤代-、8-氨基-、8-巯基-、8-硫代烷基-、8-羟基-腺嘌呤或鸟嘌呤)、5-取代的嘧啶碱基(比如5-卤代-、特别是5-溴-、5-三氟甲基-尿嘧啶或-胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基或氟化碱基。在某些实施方案中，核碱基非限制性地包括三环嘧啶，比如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮或9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-clamp)。术语“核碱基衍生物”还包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环置换的那些衍生物，例如7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶或2-吡啶酮。本发明的其他核碱基非限制性地包括技术人员已知的那些(例如美国专利3687808; Swayze et al., The Medicinal Chemistry of Oligonucleotides, 载于Antisense a DrugTechnology, Chapter 6, pp. 143-182 (Crooke, S.T., ed., 2008); The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., JohnWiley & Sons, 1990, pp. 858-859; Englisch et al., Angewandte Chemie,International Edition, 1991, Vol. 30 (6), pp. 613-623; Sanghvi, Y.S.,Antisense Research and Applications, Crooke, S.T.和Lebleu, B., Eds., CRCPress, 1993, pp. 273-302)。术语“核碱基衍生物”还包括其中嘌呤或嘧啶碱基被对应于本发明的间隔基(特别是用于连接所述寡聚化合物(优选地所述寡核苷酸)内部的所述一个或多个脂质部分)的部分取代的那些。对应于间隔基的所述部分的特定连接为本领域技术人员已知的。优选的核碱基衍生物包括甲基化腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶及核碱基衍生物(优选地为(i)、(ii)、(iii)或(iv)的衍生物)，其中各个氨基(优选地为环外氨基)被酰基保护基或二烷基甲酰胺基(dialkylformamidino)(优选地为二甲基甲酰胺基(DMF))保护，并且进一步包括核碱基衍生物，比如2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶和嘧啶类似物(比如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)。修饰的核碱基的制备为本领域已知的，并且描述于美国专利号3,687,808、4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,645,985、5,750,692、5,830,653、5,763,588、6,005,096和5,681,941中。
本文使用的术语“核苷间连接基团”是指本领域已知的能够将所述三环-脱氧核糖核酸(tc-DNA)核苷连接(优选地连接)于另一tc-DNA核苷、除tc-DNA核苷以外的核苷、非核苷(包括肽、蛋白)的任何连接基团。教导这种可能的连接基团的代表性专利非限制性地为美国专利5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,677,439、5,646,269和5,792,608。因此，术语“核苷间连接基团”包括磷连接基团和非磷连接基团。非磷连接基团不含磷原子，并且非磷连接基团的实例包括并且一般地和优选地选自烷基、芳基(优选地为苯基、苄基或苯甲酰基)、环烷基、亚烷基芳基、亚烷基二芳基、烷氧基、烷氧基亚烷基、烷基磺酰基、炔、醚，各自彼此独立地任选地被氰基、硝基、卤素取代；羧基、酰胺、胺、氨基、亚胺、巯基、硫化物、亚砜、砜、氨基磺酸酯、磺酸酯、磺酰胺、硅氧烷或其混合。一般地和优选地，所述核苷间连接基团为磷连接基团，并且所述磷连接基团是指包含PIII或PV价态的磷原子的部分。进一步优选地，所述核苷间连接基团为磷连接基团。再进一步优选地，所述核苷间连接基团选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团、二硫代磷酸酯连接基团、膦酸酯连接基团，优选地为H-膦酸酯连接基团或甲基膦酸酯连接基团；硫代膦酸酯连接基团，优选地为H-硫代膦酸酯连接基团、甲基硫代膦酸酯连接基团；次膦酸酯连接基团、硫代氨基磷酸酯连接、氨基磷酸酯连接基团或亚磷酸酯连接基团。在另一个非常优选的实施方案中，所述核苷间连接基团选自磷酸二酯连接基团、磷酸三酯连接基团、硫代磷酸酯连接基团或膦酸酯连接基团，其中膦酸酯优选地为H-膦酸酯连接基团或甲基膦酸酯连接基团。
本文使用的术语“核苷”是指包含核碱基和共价连接于所述核碱基的糖的化合物。进一步地，术语“核苷”意指包括可使用天然或化学寡聚物合成而掺入到寡聚物中的所有方式的天然存在的或修饰的核苷或核苷模拟物。一般地和优选地，本文使用的术语“核苷”是指天然存在的核苷、修饰的核苷或核苷模拟物。术语“修饰的核苷”旨在包括如本领域的技术人员已知和本文所述对核苷的糖和/或核碱基进行的修饰。术语“核苷模拟物”旨在包括用于置换糖和核碱基的那些结构。核苷模拟物的实例包括其中核碱基被吩噁嗪部分(例如9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮基团)置换和糖部分被环己烯基或双环[3.1.0]己基部分置换的核苷。术语“核苷”还包括修饰的组合，比如多于一个核碱基修饰、多于一个糖修饰或者至少一个核碱基和至少一个糖修饰。
核苷的糖非限制性地包括单环、双环或三环系统，优选地为三环或双环系统或单环核糖或脱氧核糖。糖的修饰进一步包括(但不限于)修饰的立体化学构型、基团的至少一个取代或基团的至少一个缺失。经修饰的糖一般地和优选地为天然存在于RNA和DNA中的核糖基部分(即呋喃糖基部分)的修饰形式，比如双环糖、四氢吡喃、2’-修饰的糖、3’-修饰的糖、4’-修饰的糖、5’-修饰的糖或4’-取代的糖。合适的糖修饰的实例为技术人员已知的，并且包括(但不限于)2’、3’和/或4’取代的核苷(例如4’-S-修饰的核苷)；2’-O-修饰的RNA核苷酸残基，比如2’-O-烷基或2’-O-(取代的)烷基，例如2’-O-甲基、2’-O-(2-氰基乙基)、2’-O-(2-甲氧基)乙基(2’-MOE)、2’-O-(2-硫代甲基)乙基；2’-O-(卤代烷氧基)甲基，例如2’-O-(2-氯乙氧基)甲基(MCEM)、2’-O-(2,2-二氯乙氧基)甲基(DCEM)；2’-O-烷氧基羰基，例如2’-O-[2-(甲氧基羰基)乙基](MOCE)、2’-O-[2-(N-甲基氨基甲酰基)乙基](MCE)、2’-O-[2-(N,N-二甲基氨基甲酰基)乙基](DMCE)，特别是2’-O-甲基修饰或2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)；或其他经修饰的糖部分，比如吗啉代(PMO)、阳离子吗啉代(PMOPlus)或经修饰的吗啉代基团，比如PMO-X。术语“PMO-X”是指包含至少一个3’或5’末端修饰的修饰的吗啉代基团，比如3’-荧光标记、3’猝灭剂(例如3’-羧基荧光素、3’-Gene Tools Blue、3’-丽丝胺、3’-dabcyl)、3’-亲和标签和用于化学连接的官能团(例如3’-生物素、3’-伯胺、3’-二硫化物酰胺、3’-吡啶基二硫代)、5’-末端修饰(5’-伯胺、5’-dabcyl)、3’-叠氮化物、3’-炔、5’-叠氮化物、5’-炔或者如WO2011/150408和US2012/0065169所公开的。
“双环糖部分”包含两个相互连接的环系统，例如双环核苷，其中糖部分具有2’-O-CH(烷基)-4’或2’-O-CH2-4’基团、锁核酸(LNA)、木糖-LNA、α-L-LNA、β-D-LNA、cEt (2’-O,4’-C约束乙基) LNA、cMOEt (2’-O,4’-C约束甲氧基乙基) LNA、亚乙基桥连核酸(ENA)、己糖醇核酸(HNA)、氟化HNA (F-HNA)、吡喃糖基-RNA (p-RNA)或3’-脱氧吡喃糖基-DNA (p-DNA)。
在一个优选的实施方案中，寡聚化合物为寡核苷酸。本文使用的术语“寡核苷酸”是指包含至少两个通过核苷间连接基团各自彼此连接的核苷的化合物。因此，本文使用的术语“寡核苷酸”包括并且一般地和优选地是指包含至少两个通过核苷间连接基团连接的核苷的寡聚化合物，其中所述至少两个核苷独立地选自天然存在的核苷、修饰的核苷或核苷模拟物。
寡聚化合物可为单链或双链的。在一个实施方案中，寡聚化合物为双链的(即双链体)。在一个优选的实施方案中，寡聚化合物为单链的。
术语“’末端”是指寡聚化合物的末尾或末端，其中整数(3’、5’等)表示寡聚化合物的核苷中包含的糖的碳原子。本文使用的术语“5’末端基团”或“3’末端基团”是指分别位于5’末端或3’末端的基团。
本文可互换使用的术语“天然的”或“天然存在的”是指为天然来源的化合物。
术语“互补的”是指可在互补核苷或核苷酸之间通过传统的Watson-Crick碱基配对或其他非传统类型的配对(例如Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合)与另一个核酸分子形成氢键的核酸分子。“互补的”(或“可特异性杂交的”)为表示足够程度的互补性或精确配对使得在寡聚化合物与前-mRNA或mRNA靶标之间发生稳定和特异性结合的术语。本领域应当理解，核酸分子不需要与靶核酸序列100%互补以可特异性杂交。也就是说，两个或更多个核酸分子可不完全互补。互补性可通过核酸分子中可与第二核酸分子形成氢键的连续残基的百分比来表示。例如，如果第一核酸分子具有10个核苷酸和第二核酸分子具有10个核苷酸，则第一和第二核酸分子之间5、6、7、8、9或10个核苷酸的碱基配对分别表示50%、60%、70%、80%、90%和100%的互补性。“完美”或“完全”互补核酸分子意指其中第一核酸分子的所有连续残基将与第二核酸分子中相同数量的连续残基形成氢键的那些核酸分子，其中核酸分子两者均具有相同数量的核苷酸(即具有相同长度)或者两个分子具有不同长度。
术语“外显子跳跃”是指通过用一种或多种互补反义寡核苷酸或寡聚化合物靶向前-mRNA内的剪接供体和/或受体位点来修饰前-mRNA剪接。通过阻止剪接体接近一个或多个剪接供体或受体位点或者剪接定义中所牵涉的外显子或内含子内的任何其他位点，寡核苷酸可防止剪接反应并导致完全加工的mRNA中外显子的缺失。在前-mRNA的成熟过程期间，在细胞核中实现了外显子跳跃。外显子跳跃包括通过使用与前-mRNA内的剪接供体序列互补的反义寡核苷酸来掩蔽靶向的外显子的剪接中所牵涉的关键序列。例如，包含本文提供的所述寡聚化合物的本发明组合物可通过掩蔽肌营养不良蛋白前-mRNA内的内含子/外显子接合处的剪接位点而适合用于外显子跳跃，从而促进前-mRNA加工为成熟mRNA期间突变外显子的缺失。
术语“外显子包含”是指寡核苷酸介导的过程，比如反义寡核苷酸与靶前-mRNA碱基配对，以阻断外显子或内含子剪接增强子和阻断相应的剪接抑制因子和/或破坏不利的二级结构，导致剪接体更有效地识别外显子和恢复外显子表达。
术语“体内”是指在受试者的体内发生的事件。
术语“体外”是指在受试者的体外发生的事件。体外测定包括其中采用活细胞或死亡细胞的基于细胞的测定，并且也可包括其中不采用完整细胞的无细胞测定。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现预期的应用(包括(但不限于)疾病治疗)的本文所述的化合物或化合物的组合的量。治疗有效量可根据预期的应用(体外或体内)或所治疗的人类受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重性、给予方式等而变化，其可由本领域的普通技术人员容易地确定。该术语还适用于将在靶细胞中诱导特定反应(例如减少血小板粘附和/或细胞迁移)的剂量。具体剂量将根据所选择的特定化合物、要遵循的给药方案、该化合物是否与其他化合物组合给予、给予时机、给予的组织以及携带化合物的物理递送系统而变化。
如本文使用的术语“治疗作用”包括在人类受试者的治疗益处和/或预防益处。预防作用包括延迟或消除疾病或病症的出现、延迟或消除疾病或病症的症状的发作、减慢、停止或逆转疾病或病症的进展或其任何组合。
术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域已知的多种有机和无机反荷离子的盐。药学上可接受的酸加成盐可用无机酸和有机酸形成。可衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。药学上可接受的碱加成盐可用无机和有机碱形成。可衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝。可衍生盐的有机碱包括例如伯、仲和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂。具体实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐选自铵、钾、钠、钙和镁盐，优选地所述药学上可接受的盐为钠盐。
在羟基(OH)或巯基(SH)(其一般地和优选地与P(III)或P(V)结合并存在于所述一个或多个脂质部分中，一般地和优选地作为所述一个或多个脂质部分的基团B的一部分，或存在于所述间隔基中，或存在于本发明的所述寡聚化合物中，优选地存在于本发明的所述寡核苷酸中，作为所述核苷间连接基团(一般地和优选地选自硫代磷酸酯或磷酸二酯)的一部分)的情况下，每个所述羟基(OH)或巯基(SH)可彼此独立地作为所述OH基团或以其离子状态(比如O-阴离子和药学上可接受的阳离子)，或者作为所述SH基团或以其离子状态(比如S-阴离子和药学上可接受的阳离子)存在。进一步包括本发明组合物的上述情况之间的任何组合和任何平衡状态，特别是考虑所述P(III)或P(V)上的其他含氧或含硫基团，比如(=O)、(=S)、另一个OH或SH基团，这是本领域技术人员已知的。为了简单起见，在本发明的方面和实施方案中，一般地仅描述上述情况之一。举例来说，本发明的优选间隔基本文表示为#-NH-C2-12亚烷基-OP(O)(SH)-§。如非限制性地所示，本文包括的是其中氢位于氧处的间隔基，因此为#-NH-C2-12亚烷基-OP(OH)(S)-§及所有其药学上可接受的盐。
因此，在羟基(OH)和/或巯基(SH)(其一般地和优选地与P(III)或P(V)结合并存在于所述一个或多个脂质部分中，一般地和优选地作为所述一个或多个脂质部分的基团B的一部分，或存在于所述间隔基中，或存在于本发明的所述寡聚化合物中，优选地存在于本发明的所述寡核苷酸中，作为所述核苷间连接基团(一般地和优选地选自硫代磷酸酯或磷酸二酯)的一部分)的情况下的药学上可接受的盐，是指本发明的组合物，其中一个或多个所述OH基团或所述SH基团彼此独立地作为所述OH基团或以其离子状态(比如O-阴离子及其药学上可接受的阳离子)，或者作为所述SH基团或以其离子状态(比如S-阴离子和药学上可接受的阳离子)存在，和其中一般地和优选地所述药学上可接受的阳离子选自质子化的三甲胺、质子化的二乙胺、质子化的甲胺、铵、钠或钾，进一步优选地其中所述药学上可接受的阳离子为钠。
“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂以及惰性成分。这种药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药用成分的用途为本领域众所周知的。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药用成分不相容，否则考虑将其用于本发明的治疗组合物中。另外的活性药用成分(比如其他药物)也可掺入到所述的组合物和方法中。
除非另外说明，本文描述的化学结构意图包括仅在一个或多个同位素富集的原子的存在方面不同的化合物。例如，其中一个或多个氢原子被氘或氚替换或其中一个或多个碳原子被13C-或14C-富集的碳替换的化合物在本发明的范围内。
“异构体”是具有相同的分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅在原子在空间中排列的方式上不同的异构体 – 即，具有不同的立体化学构型。“对映异构体”是一对立体异构体，其为彼此不能重叠的镜像。一对对映异构体的1:1混合物是“外消旋”混合物。术语“(±)”用于在合适时指定外消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子，但彼此不为镜像的立体异构体。绝对立体化学根据Cahn-Ingold-Prelog R-S系统指定。当化合物是纯的对映异构体时，在每个手性碳处的立体化学可通过(R)或(S)指定。绝对构型未知的拆分化合物可根据它们在钠D线的波长下旋转平面偏振光的方向(右旋或左旋)指定为(+)或(-)。本文描述的某些化合物含有一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构体形式，其可根据绝对立体化学定义为(R)或(S)。本发明的化学实体、药物组合物和方法意指包括所有这样可能的异构体，包括外消旋混合物、光学纯形式和中间体混合物。光学活性(R)-和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。当本文描述的化合物含有烯属双键或其他几何不对称中心时，并且除非另外指明，预期化合物包括E和Z几何异构体二者。
本文使用的“对映异构体纯度”是指特定对映异构体相对于另一种对映异构体的存在的相对量，表示为百分比。例如，如果可潜在地具有(R)-或(S)-异构体构型的化合物作为外消旋混合物存在时，对于(R)-或(S)-异构体，对映异构体纯度为约50%。如果所述化合物的一种异构体形式超过另一种而占优势，例如80% (S)-异构体和20% (R)-异构体，该化合物对于(S)-异构体形式的对映异构体纯度为80%。化合物的对映异构体纯度可以本领域已知的多种方式测定，包括但不限于使用手性载体的色谱、偏振光的旋转的偏振测量、使用手性转移试剂(包括但不限于含有镧系元素的手性复合物或Pirkle试剂)的核磁共振光谱法或使用手性化合物例如Mosher酸的化合物的衍生接着色谱或核磁共振光谱法。
在优选的实施方案中，对映异构体富集的组合物在每单位质量的治疗功用方面具有比所述组合物的外消旋混合物更高的效力。对映异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物分离，所述方法包括手性高压液相色谱(HPLC)和手性盐的形成和结晶；或优选的对映异构体可通过不对称合成制备。参见例如Jacques, et al., Enantiomers,Racemates and Resolutions, Wiley Interscience, New York (1981); E. L. Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds, McGraw-Hill, New York (1962); 以及E. L.Eliel和S. H. Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, Wiley-Interscience,New York (1994)。
本文使用的术语“对映异构体富集的”和“非外消旋”是指其中一种对映异构体的重量百分比大于在外消旋组合物的对照混合物中所述一种对映异构体的量(例如，按重量大于1:1)的组合物。例如，(S)-对映异构体的对映异构体富集的制备物是指相对于(R)-对映异构体具有大于50%重量、例如至少75%重量或例如至少80%重量的(S)-对映异构体的化合物的制备物。在一些实施方案中，富集可以是显著大于80%重量，提供“显著对映异构体富集的”或“显著非外消旋”制备物，其是指相对于另一种对映异构体具有至少85%重量、例如至少90%重量或例如至少95%重量的一种对映异构体的组合物的制备物。术语“对映异构体纯的”或“显著对映异构体纯的”是指包含至少98%的单一对映异构体和少于2%的相对对映异构体的组合物。
“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分是通常公认的化学实体，其嵌入或附加至分子。
“互变异构体”是结构上不同的异构体，其通过互变异构化而互变。“互变异构化”是一种形式的异构化，并且包括质子移变或质子移动互变异构化，其被认为是酸-碱化学的子集。“质子移变互变异构化”或“质子移动互变异构化”包括质子的迁移，伴随键级变化，通常是单键与相邻双键的交换。在互变异构化是可能的时(例如，在溶液中)，可达到互变异构体的化学平衡。互变异构化的实例是酮-烯醇互变异构化。酮-烯醇互变异构化的具体实例是戊烷-2,4-二酮和4-羟基戊-3-烯-2-酮互变异构体的互变。互变异构化的另一个实例是酚-酮互变异构化。酚-酮互变异构化的具体实例是吡啶-4-醇和吡啶-4(1H)-酮互变异构体的互变。
除非本文更具体地定义，“取代的”是指所提及的基团可已附接了一个或多个另外的基团、基或部分，其各自并独立地选自例如酰基、烷基、烷基芳基、环烷基、芳烷基、芳基、碳水化合物、碳酸酯、杂芳基、杂环烷基、羟基、烷氧基、芳基氧基、巯基、烷硫基、芳硫基、氰基、卤代、羰基、酯、硫代羰基、异氰酸根合、硫代氰酸根合、异硫代氰酸根合、硝基、氧代、全卤代烷基、全氟烷基、磷酸酯、甲硅烷基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰胺基、次硫酰基、磺酸酯、脲和氨基，包括单-和二-取代的氨基，和其受保护的衍生物。取代基本身可以是取代的，例如环烷基取代基可本身在一个或多个其环碳上具有卤代取代基。术语“任选取代的”是指用指定基团、基或部分任选取代。
本发明的化合物还包括这些化合物的晶体和无定形形式，包括例如所述化合物的多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、非溶剂化的多晶型物(包括无水合物)、构象多晶型物和无定形形式，以及其混合物。“晶体形式”和“多晶型物”意图包括所述化合物的所有晶体和无定形形式，包括例如多晶型物、假多晶型物、溶剂合物、水合物、非溶剂化的多晶型物(包括无水合物)、构象多晶型物和无定形形式，以及其混合物，除非提及特定的晶体或无定形形式。
当本文使用范围来描述例如物理或化学性质(比如分子量或化学式)时，旨在包括范围的所有组合和亚组合以及其中的具体实施方案。当提及数字或数值范围时，使用术语“约”意指所提及的数字或数值范围为在实验可变性内(或在统计实验误差内)的近似值，并且因此数字或数值范围可以变化。该变化一般地为所述数字或数值范围的0%-15%、0%-10%、0%-5%。
tc-DNA核苷前体
在一个实施方案中，本发明包括用于制备式I、式II、式III、式IV、式V或式VI的tc-DNA核苷前体的方法：
Figure 759390DEST_PATH_IMAGE006
其中X可以是烷氧基；
T1和T2可各自是OR1，其中R1是H或羟基保护基；
q1、q2、q3、q4和q5各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R2，其中n是0-6和其中R2选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；
R4可以是羟基保护基；和
z1和z2各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一些实施方案中，T1是OR1和R1是羟基保护基。在一些实施方案中，每个羟基保护基独立地选自乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、2,6-二氯苄基、二苯基甲基、对硝基苄基、三苯基甲基(三苯甲基)、4,4'-二甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、三苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、苯甲酰基甲酸酯、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基、9-芴基甲基碳酸酯、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、4-单甲氧基三苯甲基(MMTr)、4,4'二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4',4"-三甲氧基三苯甲基(TMTr)、2-氰基乙基(CE或Cne)、2-(三甲基甲硅烷基)乙基(TSE)、2-(2-硝基苯基)乙基、2-(4-氰基苯基)乙基、2-(4-硝基苯基)乙基(NPE)、2-(4-硝基苯基磺酰基)乙基、3,5-二氯苯基、2,4-二甲基苯基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2,4,6-三甲基苯基、2-(2-硝基苯基)乙基、丁基硫代羰基、4,4',4"-三(苯甲酰基氧基)三苯甲基、二苯基氨基甲酰基、乙酰丙基、2-(二溴甲基)苯甲酰基(Dbmb)、2-(异丙基硫代甲氧基甲基)苯甲酰基(Ptmt)、9-苯基呫吨-9-基(pixyl)和9-(对-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一些实施方案中，羟基保护基是TBDMS。
在一些实施方案中，q1、q2、q3、q4和/或q5是氢。
在一些实施方案中，z1和/或z2是氢。
在一些实施方案中，T2是OR1和R1是H。在一些实施方案中，T2是羟基。
在一些实施方案中，X是OR3，其中R3是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基或己基。在一些实施方案中，R3是甲基。在一些实施方案中，X是甲氧基。
在一些实施方案中，R4是TBDMS。
在一个实施方案中，本发明包括用于制备式VII、式VIII或式IX的tc-DNA核苷前体的方法：
Figure 760844DEST_PATH_IMAGE007
。
式I-IX的tc-DNA核苷前体可用于制备tc-DNA核苷，其包括核碱基，和可用于制备反义寡核苷酸治疗剂。
tc-DNA核苷前体的制备
在一个实施方案中，本文描述的tc-DNA核苷前体(例如，式I-IX的化合物)可根据一种或多种以下方法制备。
在一个实施方案中，本发明包括制备式I-IX的任一个的tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 在环丙烷化温度下将式X、式XI或式XII的化合物：
Figure 694165DEST_PATH_IMAGE008
加入碳烯前体；和
c. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y是烷氧基；
T3和T4可以是OR5，其中R5是H或羟基保护基；
q6、q7和q8各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z3和z4各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一个实施方案中，本发明包括制备式I-IX的任一个的tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 制备式X、式XI或式XII的化合物的溶液：
Figure 222098DEST_PATH_IMAGE009
；
c. 在环丙烷化温度下将碳烯前体加入式X、式XI或式XII的化合物的溶液；和
d. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y是烷氧基；
T3和T4可以是OR5，其中R5是H或羟基保护基；
q6、q7和q8各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z3和z4各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
在一个实施方案中，所述方法可包括将路易斯酸催化剂加入式X、式XI或式XII的化合物和碳烯前体的混合物的步骤。在一些实施方案中，路易斯酸催化剂可选自Et2AlCl、Et2Zn、ZnI2、ZnCl2、ZnBr2、Ti(OiPr)4、Me2AlCl、TMSOTf、TiCl4和其组合。
在一个实施方案中，制备碳烯前体的步骤可包括在溶剂中合并路易斯酸催化剂(例如，Et2Zn)和R7I2。在一些实施方案中，R7可选自CH2、CH-C1-6烷基、CH-C2-6烯基、CH-C2-6炔基、取代的CH-C1-6烷基、取代的CH-C2-6烯基、取代的CH-C2-6炔基和CH-(CH2)n-C(O)-R8，其中n是0-6和其中R8选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基。在一些实施方案中，R7是烷基。在一些实施方案中，R7是CH2。
在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤可包括以任何顺序合并碳烯添加剂、路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)和R7I2。在一些实施方案中，制备碳烯前体的步骤可包括将碳烯添加剂加入路易斯酸催化剂(例如，ZnEt2)和R7I2的混合物。
在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是脂族醇(例如，取代的或未取代的烷基醇)、芳族醇(例如，取代的或未取代的酚)、取代的或未取代的羧酸(例如，三氯乙酸)或取代的或未取代的磷酸酯(例如，(烷基-O)2P(O)OH或(芳基-O)2P(O)OH)。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCO2H的取代的羧酸，其中每个Q可独立地选自H、Cl、Br和F。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCO2H的取代的羧酸，其中Q3C可定义为CCl3、CHCl2、CH2Cl或CF3。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCH2OH的取代的烷基醇，其中每个Q可独立地选自H、Cl、Br和F。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是式Q3CCH2OH的取代的羧酸，其中Q3C可定义为CCl3、CHCl2、CH2Cl或CF3。在一些实施方案中，碳烯添加剂可以是三氯乙酸、2,2,2-三氟乙醇、三氯苯酚或(n-BuO)2P(O)OH。
在一些实施方案中，溶剂可包含己烷、甲苯、二氯甲烷(CH2Cl2)、四氢呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙醚、二甲氧基乙烷(DME)或其组合。在一些实施方案中，溶剂是二氯甲烷、DME或其组合。在一些实施方案中，溶剂可以是极性非质子溶剂。在一些实施方案中，极性非质子溶剂可包含二氯甲烷(CH2Cl2)、四氢呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙醚、二甲氧基乙烷(DME)或其组合。
在一些实施方案中，碳烯前体是Q3CCO2ZnR7I、Q3CCH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I、(烷基-O)2P(O)OZnR7I、(芳基-O)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I，其中每个Q可独立地选自H、Cl、Br和F。在一些实施方案中，碳烯前体是Q3CCO2ZnR7I、Q3CCH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I、(烷基-O)2P(O)OZnR7I、(芳基-O)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I，其中Q3C可定义为CCl3、CHCl2、CH2Cl或CF3。在一些实施方案中，碳烯前体是CCl3CO2ZnR7I、CF3CH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I。在一些实施方案中，碳烯前体是CCl3CO2ZnCH2I、CF3CH2OZnCH2I、(n-BuO)2P(O)OZnCH2I或2,4,6-Cl3C6H2OZnCH2I。
在一些实施方案中，制备式X、式XI或式XII的化合物的溶液的步骤可包括将ZnEt2加入式X、式XI或式XII的化合物。
在一些实施方案中，碳烯制备温度可以是选自约-80℃至约0℃的范围的温度。在一些实施方案中，碳烯制备温度可以是约-80℃至约0℃。在一些实施方案中，碳烯制备温度可以大于-80、-79、-78、-77、-76、-75、-74、-73、-72、-71、-70、-69、-68、-67、-66、-65、-64、-63、-62、-61、-60、-59、-58、-57、-56、-55、-54、-53、-52、-51、-50、-49、-48、-47、-46、-45、-44、-43、-42、-41、-40、-39、-38、-37、-36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0℃。在一些实施方案中，碳烯制备温度可以小于-80、-79、-78、-77、-76、-75、-74、-73、-72、-71、-70、-69、-68、-67、-66、-65、-64、-63、-62、-61、-60、-59、-58、-57、-56、-55、-54、-53、-52、-51、-50、-49、-48、-47、-46、-45、-44、-43、-42、-41、-40、-39、-38、-37、-36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0℃。在一些实施方案中，碳烯制备温度可以为约-80、-79、-78、-77、-76、-75、-74、-73、-72、-71、-70、-69、-68、-67、-66、-65、-64、-63、-62、-61、-60、-59、-58、-57、-56、-55、-54、-53、-52、-51、-50、-49、-48、-47、-46、-45、-44、-43、-42、-41、-40、-39、-38、-37、-36、-35、-34、-33、-32、-31、-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0℃。
在一些实施方案中，碳烯制备温度可包括第一碳烯制备温度和第二碳烯制备温度，其中反应的温度在第一碳烯制备温度开始，并增加至第二碳烯制备温度，其中第一碳烯制备温度小于第二碳烯制备温度。然而，在一些实施方案中，反应的温度在第一碳烯制备温度开始，并降低至第二碳烯制备温度，其中第一碳烯制备温度大于第二碳烯制备温度。
在一些实施方案中，环丙烷化温度可以是选自约-30℃至约室温(即25℃)的范围的温度。在一些实施方案中，环丙烷化温度可以是约-30℃至约室温(即25℃)。在一些实施方案中，环丙烷化温度可大于-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃。在一些实施方案中，环丙烷化温度可小于-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃。在一些实施方案中，环丙烷化温度可以是约-30、-29、-28、-27、-26、-25、-24、-23、-22、-21、-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、-0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30℃。
在一些实施方案中，环丙烷化温度可包括第一环丙烷化温度和第二环丙烷化温度，其中反应的温度在第一环丙烷化温度开始，并增加至第二环丙烷化温度，其中第一环丙烷化温度小于第二环丙烷化温度。然而，在一些实施方案中，反应的温度在第一环丙烷化温度开始，并降低至第二环丙烷化温度，其中第一环丙烷化温度大于第二环丙烷化温度。
在本文描述的方法的一些实施方案中，加入至式X、式XI或式XII的化合物的碳烯前体的量为约1.0至约10摩尔当量的碳烯前体:式X、式XI或式XII的化合物。
在本文描述的方法的一些实施方案中，加入至式X、式XI或式XII的化合物的碳烯前体的量为小于1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9或10摩尔当量的碳烯前体:式X、式XI或式XII的化合物。
在本文描述的方法的一些实施方案中，加入至式X、式XI或式XII的化合物的碳烯前体的量为大于1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9或10摩尔当量的碳烯前体:式X、式XI或式XII的化合物。
在本文描述的方法的一些实施方案中，加入至式X、式XI或式XII的化合物的碳烯前体的量为约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9或10摩尔当量的碳烯前体:式X、式XI或式XII的化合物。
从tc-DNA核苷前体制备的tc-DNA核苷
在一个实施方案中，tc-DNA核苷可从本文描述的tc-DNA核苷前体制备。
在一个实施方案中，本发明包括从式I-IX的一种或多种tc-DNA核苷前体制备式XIII、式XIV或式XV的化合物的方法：
Figure 949883DEST_PATH_IMAGE010
其中Bx是核碱基；
T5和T6之一是核苷间连接基团，和T5和T6中的另一个是OR9、OR10、5'末端基团、3'末端基团或核苷间连接基团，其中R9是H或羟基保护基，和R10是磷部分；
q9、q10、q11、q12和q13各自独立地选自氢(H)、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R11，其中n是0-6和其中R11选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z5和z6各自独立地选自H、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基。
在一个实施方案中，本文描述的tc-DNA核苷包含式XIII、式XIV或式XV的化合物，其中Bx选自胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶。在一个实施方案中，本文描述的tc-DNA核苷包含式XIII、式XIV或式XV的化合物，其中Bx是修饰的碱基。在一个实施方案中，本文描述的tc-DNA核苷包含式XIII、式XIV或式XV的化合物，其中Bx是选自5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、肌苷和2,6-二氨基嘌呤的修饰的碱基。
在一个实施方案中，本发明包括含有tc-DNA核苷的寡聚化合物，其包含式XIII、式XIV、式XV的一种或多种tc-DNA核苷或其药学上可接受的盐。
尽管本文显示和描述了本发明的优选实施方案，但这样的实施方案仅通过实例提供，并且不意图以其他方式限制本发明的范围。本发明的所述实施方案的各种备选方案可用于实施本发明。
实施例
现参考以下实施例描述本文包括的实施方案。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且本文包括的公开绝不应解释为限于这些实施例，而应解释为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。
实施例1 –双环糖前体的制备
中间体10可根据图1描述的合成路线从D-甘露糖开始制备。
实施例2 –双环糖前体的制备
中间体10可根据图2描述的备选合成路线从D-核糖开始制备。
实施例3 –叔丁基二甲基甲硅烷基烯醇醚中间体的制备
甲硅烷基烯醇醚17可从中间体10根据图3和4描述的合成路线制备。
实施例4 –用在不存在添加剂的情况下从CH2I2和Et2Zn制备的类碳烯将化合物17 环丙烷化
根据以下方案，使用实施例4-7所示的环丙烷化条件将化合物17转化为tc-DNA核苷前体18：
Figure 438633DEST_PATH_IMAGE011
将1.07 g纯化的α-异头物(3.736 mmol) 17溶于37 ml的无水CH2Cl2并冷却至0℃(冰)。随后，将22.3 ml (22.3 mmol, 6 eq.) Et2Zn 1.0 M/己烷(Aldrich)在0℃逐滴加入并在Ar下搅拌30分钟。然后，将3.02 ml (37.2 mmol, 10 eq.)的CH2I2在相同的温度下经15分钟逐滴加入，并在0℃搅拌另外2 h。之后除去冷却浴和在环境温度下将混合物搅拌另外21 h。TLC显示大量未反应的α-17。通过加入EtOAc将其稀释，并用50 mL的饱和NH4Cl水溶液淬灭。萃取后处理提供1.79 g的粗制品，其通过硅胶色谱纯化，得到0.43 g (39%)的18和0.49 g的化合物17和18 (大约20:80)的混合物。
实施例5 –用从CH2I2和活化Zn制备的碳烯将化合物17环丙烷化
在70℃将AgOAc (60 mg)溶于浓AcOH (60 ml)，并一次性加入Zn (10 g; 粒度约0.5mm，用0.1M HCl短暂侵蚀，用H2O和EtOH洗涤，并在r.t./0.01托下干燥15分钟)。将混合物搅拌1分钟，倾析并用AcOH (40 ml)和无水Et2O (3 × 40 ml)洗涤。将当前的深灰色Ag-Zn电偶在Ag棉上储存于无水Et2O中。通过注射器向Ag-Zn电偶(6.3 g, 96.4 mmol)/Et2O (11ml)中加入CH2I2 (8.41 g, 31.4 mmol)，并将混合物在r.t下在Ar下搅拌1 h。将17 (1.5 g,5.23 mmol, 两种异头物的混合物)在无水Et2O (11 ml)中的溶液逐滴加入至碳烯溶液。在10分钟内，并且将混合物在Ar下回流3 h。然后将灰色悬浮液冷却至0℃并用Et2O (30 ml)稀释，然后在0℃逐滴加入吡啶(6.6 ml)。白色沉淀物经Celite滤出，用饱和NaHCO3 (2 ×50 ml)洗涤滤液，并用Et2O (50 ml)萃取水相。将合并的有机相干燥(MgSO4)，蒸发和残余物通过快速色谱(硅胶(50g), Et2O/己烷1:1)纯化，提供908 mg (58%)的2:1比率(α/β; 1H-NMR)的化合物18，为无色油。
实施例4 –用从CH2I2和Et2Zn和(n-BuO)2P(O)OH制备的稳定类碳烯将化合物17环丙烷化
(n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液的制备
在-10℃ (干冰/丙酮)下向8 ml甲苯逐滴加入2.4 ml (2.4 mmol)二乙基锌1.0 M/甲苯(Acros)。随后，缓慢逐滴加入用5 ml甲苯稀释的0.5 ml (0.53 g, 2.44 mmol) (n-BuO)2P(O)OH 97% (Aldrich)。在-10℃下在Ar下将混合物搅拌20分钟。然后，在-10℃下在Ar下将0.20 ml (0.65 g, 2.44 mmol) CH2I2 (Alfa Aesar)逐滴加入并搅拌30分钟。澄清溶液在冰箱中储存。
在r.t下将粗制未纯化的化合物17溶于反应溶剂并与根据上文描述的程序制备的类碳烯(n-BuO)2P(O)OZnCH2I的溶液混合。将混合物搅拌，持续表1给出的时间，接着通过萃取进行水性后处理。如果指出，收率为在FC后的。
表1给出的实例证实了不切实际的长反应时间和过量的类碳烯对于完成反应是必需的。
表1：在不存在路易斯酸的情况下的环丙烷化条件
实验 s.m.的浓度 [Zn]的当量数 温度 溶剂 时间 注释
1 0.022 M 7 eq RT DCM/PhCH<sub>3</sub>, hex 8 d 17和18的混合物，收率约10%
2 0.008 M 25 eq RT DCM/PhCH<sub>3</sub>, hex 7 d 反应完全
3 0.008 M 25 eq 40 ℃ DCM/PhCH<sub>3</sub>, hex 1 h + 8 h RT 反应完全
4 0.042 M 5 eq 40 ℃ DCM/PhCH<sub>3</sub> 48 h 反应不完全，大量分解，收率约81%
5 0.042 M 5 eq RT DCM/PhCH<sub>3</sub> 48 h 反应不完全，大量分解，收率约38%
实施例5 –在各种溶剂中用从CH2I2和Et2Zn和(n-BuO)2P(O)OH制备的稳定类碳烯将化合物17环丙烷化
(n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液的制备
根据上文描述的程序制备类碳烯，在指出的情况下用CH2Cl2替换甲苯。二乙基锌1.0M/甲苯(Acros)用于所有实验。
在r.t下将粗制未纯化的化合物17溶于反应溶剂并与根据上文描述的程序制备的类碳烯(n-BuO)2P(O)OZnCH2I的溶液混合。在0-10℃下将混合物搅拌，持续表2给出的时间，接着通过萃取进行水性后处理。17/18比率从粗制品的1H NMR进行评价。
表2给出的实例证实了用于环丙烷化的溶剂范围，无论溶剂如何，17的转化都不完全。
表2：在不存在路易斯酸的情况下的环丙烷化条件，溶剂的影响
Figure 769120DEST_PATH_IMAGE013
实施例6 –在各种溶剂中用从CH2I2和Et2Zn和(n-BuO)2P(O)OH制备的稳定类碳烯将化合物17环丙烷化
(n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液的制备
在-20℃ (干冰/丙酮)下在30分钟内将二乙基锌(1.5 M/甲苯, 14.0 ml, 20.95mmol) (Acros)逐滴加入至4.3 ml (n-BuO)2P(O)OH (4.54 g, 20.95 mmol, 97 %,Aldrich)在22.8 ml CH2Cl2中的溶液。在-20℃下在Ar下将混合物搅拌30分钟。然后，在-20℃在Ar下将1.69 ml (5.61 g, 20.95 mmol) CH2I2 (Alfa Aesar)逐滴加入并搅拌30分钟。澄清溶液在冰箱中储存。
将粗制未纯化的化合物17 (0.272 g, 0.70 mmol)溶于反应溶剂并在0℃ (冰浴)下加入表3所示的路易斯酸。在相同的温度下将混合物搅拌15分钟。然后在相同的温度下加入根据上文描述的程序制备的类碳烯(n-BuO)2P(O)OZnCH2I的溶液。在0-10℃下将混合物搅拌，持续表3给出的时间，接着通过萃取进行水性后处理。17/18比率根据粗制品的1H NMR进行评价。
表3给出的实例证实了在存在路易斯酸的情况下化合物17的环丙烷化的加速。
表3：在存在/不存在路易斯酸的情况下的环丙烷化条件
Figure 26926DEST_PATH_IMAGE015
实施例7 – tc-DNA核苷前体的制备
表4：环丙烷化条件
实验号 碳烯前体/类碳烯 反应条件 18的收率(色谱后) 注释
1 CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>ZnCH<sub>2</sub>I ZnEt<sub>2</sub>, CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-40℃, 1h; 然后三氯乙酸,DME, CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-15℃, 1h; 然后纯化的17(α/β 1:1),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, rt,21h - 2 eq. ZnEt<sub>2</sub>,4 eq. CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,0.2 eq.CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H, 1eq. DME (痕量的α-17未转化)
2 CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>ZnCH<sub>2</sub>I ZnEt<sub>2</sub>, CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -40℃, 1h; 然后三氯乙酸,DME, CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-15℃, 1h; 然后纯化的17(α/β 1:1),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, rt,3h - 3 eq. ZnEt<sub>2</sub>,6 eq. CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,0.25 eq.CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H, 1eq. DME (α-17未完全转化)
3 CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>ZnCH<sub>2</sub>I ZnEt<sub>2</sub>, 三氯乙酸, CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -20℃, 20分钟;然后CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>, -10℃, 15分钟;然后纯化的17(α/β 1.08:1),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, rt,3h 46 % β-异头物 3 eq. ZnEt<sub>2</sub>,3 eq. CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,3 eq.CCl<sub>3</sub>CO<sub>2</sub>H (痕量的α-17未转化)
4 CF<sub>3</sub>CH<sub>2</sub>OZnCH<sub>2</sub>I +路易斯酸 ZnEt<sub>2</sub>, CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -78℃直至- 15℃,1h; 然后2,2,2-三氟乙醇,CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -15℃, 40分钟;然后纯化的17(α/β 1:1),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -15℃, 15分钟;然后0.3 eq.Et<sub>2</sub>AlCl, rt,21h 48 % β-异头物 3 eq. ZnEt<sub>2</sub>,6 eq. CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>,3eq. 三氟乙醇(痕量α-17未转化)
5 (n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I+ 路易斯酸 纯化的17 (α/β1:1),Et<sub>2</sub>Zn (1eq.), CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-10℃, 10分钟;然后(n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I-溶液,-10℃, 10分钟;然后Et<sub>2</sub>AlCl, -10℃直至rt,21h. - 2.1 eq. 类碳烯, 0.5 eq.Et<sub>2</sub>AlCl (α和β17未完全转化)
6 (n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I+ 路易斯酸 纯化的17 (α/β1:1),Et<sub>2</sub>Zn (1eq.), CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-10℃, 10分钟;然后(n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I-溶液,-10℃, 10分钟;然后Et<sub>2</sub>AlCl, -10℃直至rt,24h. 77.1 % (q-NMR) 两种非对映异构体的1:1混合物 3 eq. 类碳烯,0.5 eq.Et<sub>2</sub>AlCl; Zn-杂质未分离(痕量的α-17未转化)
7 (n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I+ 路易斯酸 纯化的17 (α/β1.2:1),Et<sub>2</sub>Zn(1 eq.),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -10℃, 10分钟;然后(n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I-溶液, -10℃, 10分钟;然后Et<sub>2</sub>AlCl, -10℃直至rt,21h. - 2.2 eq. 类碳烯, 1 eq.Et.<sub>2</sub>AlCl (α和β 17未完全转化)
8 2,4,6-Cl<sub>3</sub>C<sub>6</sub>H<sub>2</sub>OZnCH<sub>2</sub>I 2,4,6-三氯苯酚, Et<sub>2</sub>Zn,CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, -10℃, 15分钟;然后CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub>, -10℃, 15分钟;然后纯化的17(α/β 1:1),CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>, rt,20h 62.8 % (q-NMR) β-异头物 3 eq. 三氯苯酚, 3 eq.Et<sub>2</sub>Zn, 3 eq.CH<sub>2</sub>I<sub>2</sub> (痕量的α-17未转化)
9 (n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I+ 路易斯酸 纯化的α-17,Et<sub>2</sub>Zn (1eq.), CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>,-10℃, 10分钟;然后(n-BuO)<sub>2</sub>P(O)OZnCH<sub>2</sub>I-溶液,-10℃, 10分钟;然后Et<sub>2</sub>AlCl, -10℃, 25h 69.7 % (q-NMR) α-异头物 3 eq. 类碳烯,0.5 Et<sub>2</sub>AlCl;Zn杂质未分离(几乎没有痕量的未转化的α-17)
(n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液的制备
在-20℃ (干冰/丙酮)下向22.8 ml CH2Cl2逐滴加入14.0 ml (20.95 mmol)二乙基锌1.5 M/甲苯(Acros)。随后，缓慢逐滴加入4.28 ml (4.54 g, 20.95 mmol) (n-BuO)2P(O)OH 97% (Aldrich)。在-20℃下在Ar下将混合物搅拌30分钟。然后，在-15℃下在Ar下将1.69ml (5.62 g, 20.95 mmol) CH2I2 (Reagent Plus, 99 %, Aldrich)逐滴加入并搅拌30分钟。澄清溶液在冰箱中储存。
实验5 –用2.1摩尔当量的碳烯和0.5当量的路易斯酸将化合物17环丙烷化
将181 mg纯化的α-异头物和174 mg β-异头物(355 mg, 1.239 mmol) 17溶于0.7 mlCH2Cl2并冷却至-10℃ (干冰)。随后，在-10℃下将826 µl (1.239 mmol, 1 eq.) Et2Zn1.5 M/甲苯(Acros)逐滴加入并在Ar下搅拌10分钟。然后，在-10℃将5.312 ml (2.602mmol, 2.1 eq.) (n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液逐滴加入并搅拌另外10分钟。随后，将336 µl(298.5 mg, 0.619 mmol, 50 mol-%)二乙基氯化铝溶液25 wt.-%/甲苯(Aldrich)缓慢逐滴加入。在-10℃将混合物搅拌2 h，然后在浴中使之缓慢升温至室温。将混合物搅拌总共21小时。
实验6 –用3摩尔当量的碳烯和0.5当量的路易斯酸将化合物17环丙烷化
将纯化的α-异头物(106 mg)和β-异头物(105 mg) (211 mg, 0.737 mmol) 17溶于0.5ml CH2Cl2并冷却至-10℃。随后，在-10℃将491 µl (0.737 mmol, 1 eq.) Et2Zn 1.5 M/甲苯逐滴加入并搅拌10分钟。然后，在-10℃将4.51 ml (2.211 mmol, 3 eq.) (n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液逐滴加入并搅拌另外10分钟。随后，将201 µl (0.369 mmol, 50 mol-%)二乙基氯化铝溶液25 wt.-%/甲苯缓慢逐滴加入。在-10℃将混合物在Ar下搅拌2 h，然后在rt下搅拌22 h。混合物用4 ml饱和NH4Cl溶液淬灭，在MTBE中溶解和用30 ml饱和NaCl溶液洗涤。水相用2 x 20 ml MTBE萃取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤和浓缩，以及经高真空短时干燥。得到的淡黄色油经20 g硅胶用Hex/EtOAc 3:1通过快速色谱纯化。得到225 mg (~0.749 mmol, 102 %)的1:1非对映异构体混合物化合物18，根据31P-NMR，其被“磷酸二丁酯”污染，呈淡黄色油形式。
1H-q-NMR (24.4 mg产物, 24.9 mg对苯二甲酸二甲酯, 2 ml CD3CH)：具有白色沉淀的浑浊溶液 → 加入150 µl吡啶后，形成具有白色沉淀的澄清溶液。
实验7 –用2.2摩尔当量的碳烯和0.5当量的路易斯酸将化合物17环丙烷化
将纯化的α-异头物(117 mg)和β-异头物(100 mg) (217 mg, 0.758 mmol) 17溶于0.5ml CH2Cl2并冷却至-10℃。随后，在-10℃将505 µl (0.758 mmol, 1 eq.) Et2Zn 1.5 M/甲苯逐滴加入并搅拌10分钟。然后，在-10℃将3.40 ml (1.668 mmol, 2.2 eq.) (n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液逐滴加入并搅拌另外10分钟。随后，将412 µl (0.758 mmol, 1 eq.)二乙基氯化铝溶液25 wt.-%/甲苯缓慢逐滴加入。在-10℃将混合物在Ar下搅拌2 h，然后在rt下搅拌19 h。
实验9 –用3摩尔当量的碳烯和0.5当量的路易斯酸将化合物17环丙烷化
将211 mg (0.737 mmol)纯化的α异头物17溶于0.5 ml CH2Cl2并冷却至-10℃。随后，在-10℃将491 µl (0.737 mmol, 1 eq.) Et2Zn 1.5 M/甲苯逐滴加入并搅拌10分钟。然后，在-10℃将6.01 ml (2.211 mmol, 3 eq.) (n-BuO)2P(O)OZnCH2I溶液逐滴加入并搅拌另外10分钟。随后，将201 µl (0.369 mmol, 50 mol-%)二乙基氯化铝溶液25 wt.-%/甲苯缓慢逐滴加入。在-10℃将混合物在Ar下搅拌2 h，然后在rt下搅拌23 h (→ 淡黄色溶液)。得到202 mg (~ 0.672 mmol, 91 %)的化合物18的α异头物，根据31P-NMR，其被“磷酸二丁酯”污染，呈淡黄色油形式。
1H-q-NMR (37.38 mg产物, 37.24 mg对苯二甲酸二甲酯, 1 ml CDCl3)。
Zn盐的沉淀：将158 mg污染的化合物18、2 ml CH3CN和200 µl (2.47 mmol)吡啶合并。在rt下将混合物搅拌1 h，并在0℃搅拌1 h。用Celite将沉淀物滤出，用冷CH3CN洗涤和将滤液浓缩(吡啶与甲苯共蒸发)以及经过高真空干燥过夜。得到146 mg的化合物18。
实施例8 – tc-DNA核苷前体的制备
在-20℃在7分钟内将1.5 M Et2Zn/甲苯溶液(51.49 ml, 77.24 mmol, 5 eq.;Acros)逐滴加入至无水CH2Cl2 (19.17 ml)。随后经12分钟的时间将磷酸二丁酯97% (12.63ml, 61.79 mmol, 4 eq.; Aldrich)逐滴加入(放热反应，温度从-20℃增加至-10℃)。搅拌30分钟后，将二碘甲烷(4.98 ml, 61.79 mmol, 4 eq.; Aldrich, 99%)在3分钟内逐滴加入并将混合物在-20℃搅拌另外30分钟。接下来，将粗制17 (5.0 g, 纯度88.5%, 15.45mmol, 1 eq.)在无水CH2Cl2(10.51 ml)中的溶液逐滴加入(放热反应，温度从-20℃增加至-10℃)。在- 20℃搅拌15分钟后，将Et2AlCl (25 wt. %在甲苯中的溶液, 4.20 ml, 7.72mmol, 0.5 eq.; Aldrich)加入。将反应混合物在-10℃搅拌2 h。随后，除去冷却浴并将混合物自发升温至室温和在该温度下搅拌22 h。之后，其用己烷(400 ml)稀释并用0.2 M HCl水溶液(2 × 400 ml)洗涤。合并的水相用己烷(300 ml)再次萃取。之后，合并的有机相用0.2 M NaOH水溶液(2 × 400 ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤和蒸发得到5.09 g的TC-003(比率24:76的两种异头物的混合物，通过1H-q-NMR纯度为73.5%，收率 81%)，为暗黄色的粘性液体。

Claims (11)

1.一种制备tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 在环丙烷化温度下将式X、式XI或式XII的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
加入碳烯前体；和
c. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y是烷氧基；
T3和T4各自是OR5，其中每个R5是H或羟基保护基；
q6、q7和q8各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z3和z4各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
2.一种制备tc-DNA核苷前体的方法，所述方法包括以下步骤：
a. 在碳烯制备温度下制备碳烯前体；
b. 制备式X、式XI或式XII的化合物的溶液：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
c. 在环丙烷化温度下将碳烯前体加入式X、式XI或式XII的化合物的溶液；和
d. 提供式I-IX之一的tc-DNA核苷前体，
其中Y是烷氧基；
T3和T4各自是OR5，其中R5是H或羟基保护基；
q6、q7和q8各自独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C2-6烯基、取代的C2-6炔基和–(CH2)n-C(O)-R6，其中n是0-6和其中R6选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基；和
z3和z4各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基、O-C2-6烯基、O-C2-6炔基、取代的C1-6烷基、取代的C1-6烷氧基、取代的O-C2-6烯基和取代的O-C2-6炔基、卤素。
3.前述权利要求中任一项的方法，包括将路易斯酸催化剂加入式X、式XI或式XII的化合物和碳烯前体的混合物的步骤。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中制备碳烯前体的步骤包括在溶剂中合并路易斯酸催化剂和R7I2，其中R7选自CH2、CH-C1-6烷基、CH-C2-6烯基、CH-C2-6炔基、取代的CH-C1-6烷基、取代的CH-C2-6烯基、取代的CH-C2-6炔基和CH-(CH2)n-C(O)-R8，其中n是0-6和其中R8选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基。
5.权利要求4的方法，其中所述溶剂包括己烷、甲苯、二氯甲烷(CH2Cl2)、四氢呋喃(THF)、乙腈(CH3CN)、二甲基甲酰胺(DMF)、二乙醚、二甲氧基乙烷(DME)或其组合。
6.权利要求4的方法，其中制备碳烯前体的步骤包括将碳烯添加剂加入路易斯酸催化剂和R7I2的混合物的步骤，其中所述碳烯添加剂选自取代的或未取代的烷基醇、羧酸和磷酸酯。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述碳烯前体是Q3CCO2ZnR7I、Q3CCH2OZnR7I、(n-BuO)2P(O)OZnR7I、(烷基-O)2P(O)OZnR7I、(芳基-O)2P(O)OZnR7I或2,4,6-Cl3C6H2OZnR7I，其中每个Q独立地选自H、Cl、Br和F，和R7选自CH2、CH-C1-6烷基、CH-C2-6烯基、CH-C2-6炔基、取代的CH-C1-6烷基、取代的CH-C2-6烯基、取代的CH-C2-6炔基和CH-(CH2)n-C(O)-R8，其中n是0-6和其中R8选自OH、NH2、O-C1-32烷基和NH-C1-32烷基。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述碳烯前体是CCl3CO2ZnCH2I、CF3CH2OZnCH2I、(n-BuO)2P(O)OZnCH2I或2,4,6-Cl3C6H2OZnCH2I。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法制备的tc-DNA核苷前体。
10.从权利要求9的tc-DNA前体制备的tc-DNA核苷。
11.含有tc-DNA的寡核苷酸，其包含权利要求10的tc-DNA核苷。
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