JP6326433B2 - 三環式ヌクレオシド及びそれから調製されるオリゴマー化合物 - Google Patents

Description

本発明は、以下に記載の一般式Ｉで表される三環式ヌクレオシド及びそれから調製されるオリゴマー化合物に関する。

アンチセンステクノロジーは、特定の遺伝子産物の発現を低下させるのに有効な手段であり、したがって治療、診断、及び研究の用途において有用であり得る。一般に、アンチセンステクノロジーを支持する原理は、アンチセンス化合物（一連のオリゴヌクレオチド又はその類似物質）が標的核酸にハイブリダイズして、遺伝子の発現活性又は機能、例えば転写及び／又は翻訳などを調節することにある。特異的なメカニズムにかかわらず、その配列特異性は、アンチセンス化合物を、標的検証及び遺伝子機能化のためのツールとして、並びに疾患の病因に関与する遺伝子の発現を選択的に調節するための治療剤として魅力あるものにする。

化学的修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物に、その特性、例えばヌクレアーゼ耐性、薬物動態又は標的ＲＮＡに対する親和性などを高めるために日常的に組み込まれる。

化学修飾は、アンチセンス化合物の効力及び有効性を改善し、その経口送達又は皮下投与の可能性を改善し、あるいはその副作用の可能性を低下させている。アンチセンス化合物の効力を増大させる化学修飾は、毒性の可能性を低下させるより低い用量の投与を可能にする。その耐分解性を増大させる修飾は、体内からのより遅いクリアランスをもたらし、より少ない頻度の投与を可能にする。

三環式ヌクレオシドの合成（Steffensら, Helvetica Chimica Acta, 1997, 80, 2426−2439）及びそのオリゴマー化合物への組み込みは、文献に報告されている（Steffensら, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 11548-11549；Steffensら, J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3249-3255；Rennebergら, J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5993−6002；Scheideggerら, Chem. Eur. J., 2006, 12, 8014−8023）。完全修飾三環式オリゴヌクレオチドが、未修飾オリゴデオキシヌクレオチドと比べてウシ胎児血清中での核酸分解に対して安定であること及び細胞アッセイにおいて生物学的アンチセンス効果、例えば変異β−グロビンのスプライス修復（Rennebergら、Nucleic Acids Res., 2002, 30, 2751-2757）；又はシクロフィリンＡのエキソンスキッピング（Ittigら, Nucleic Acids Research, 2004, 32, 346−353）を生じることが明らかにされた。

式Ｉを有する三環式ヌクレオシド及びそれから調製されるオリゴマー化合物が、本明細書において提供される。さらに詳しくは、式Ｉを有する三環式ヌクレオシドは、オリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の位置での組み込みに有用である。特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、ヌクレアーゼ安定性、細胞透過性、生体利用性又は毒性などの１つ又はそれ以上の高められた特性によって特徴づけられる。特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、標的ＲＮＡの一部分にハイブリダイズして標的ＲＮＡの正常な機能の喪失をもたらす。また、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、診断用途においてプライマー及びプローブとしても有用である。特定の実施態様において、本明細書において提供される三環式ヌクレオシドを含むオリゴマーは、リポソームなどのトランスフェクション試薬に依存しないで（未修飾ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴマーと比べて）著しく改善された細胞取り込みを示す。

複数の変数（variables）は、本明細書において個々にさらに詳しく定義される。本明細書において提供される式Ｉを有する三環式ヌクレオシド及びオリゴマー化合物は、本明細書において開示される実施態様及び定義される変数の全ての組み合わせを含むことが、理解されるべきである。

本発明の第１の態様によれば、一般式Ｉ：

〔式中：
− Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
− Ｔ^１及びＴ^２の１つは、ヒドロキシル（−ＯＨ）又は保護されたヒドロキシルであり並びにＴ^１及びＴ^２の残りは、リン酸基又は反応性リン基であり、
− ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の少なくとも１つは、Ｆであり、
− ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の残りは、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌから選択され、
− ｚ^１及びｚ^２の１つは、Ｈ又はＦであり並びにｚ^１及びｚ^２の残りは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃｌ、ＯＣＨ_３、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＦ_３、ＯＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_２−ＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)ＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２又はＯＣＨ_２−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ_２である〕
で表される三環式ヌクレオシドが提供される。

特定の実施態様において、Ｂｘは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリンまた置換プリンである。１つの実施態様によれば、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンから選択される。１つの実施態様において、Ｂｘは、塩基ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンの代わりにＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴマーに組み込まれると塩基対を形成することができる芳香族複素環部分である。

特定の実施態様において、Ｔ^１はヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり及びＴ^２は、Ｈ−ホスホネート又はホスホロアミダイトから選択される反応性リン基である。特定の実施態様において、Ｔ^１は三リン酸基であり及びＴ^２はＯＨである。特定の実施態様において、Ｔ^１は４,４'−ジメトキシトリチルであり及びＴ^２はジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトである。特定の実施態様において、Ｔ^１は制御多孔質ガラス表面である。この実施態様の好ましい別の実施態様によれば、Ｔ^１は、３'−Ｏ−スクシニル化ヌクレオシドがアミド官能基を介して結合される長鎖アルキルアミン制御多孔質ガラス表面である。

特定の実施態様において、ｑ^１及びｑ^２はＨであり、ｑ^３、ｑ^４及びｑ^５の１つはＦであり並びにｑ^３、ｑ^４及びｑ^５の残りはＨである。特定の実施態様において、ｑ^１、ｑ^２、ｚ^１及びｚ^２はＨであり、ｑ^３、ｑ^４及びｑ^５の１つはＦであり並びにｑ^３、ｑ^４及びｑ^５の残りはＨである。

特定の実施態様において、ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４及びｑ_５はＨであり、ｚ^１及びｚ^２の１つはＦであり並びにｚ^１及びｚ^２の残りはＨである。

特定の実施態様において、ｑ^１及びｑ^２はＨであり、ｑ^３、ｑ^４及びｑ^５の１つはＦであり、ｚ^１及びｚ^２の１つはＦであり、並びにｑ^３、ｑ^４、ｑ^５、ｚ^１及びｚ^２の残りはＨである。

特定の実施態様において、ｑ^１、ｑ^２、ｑ^４及びｑ^５はＨであり、ｑ^３、ｚ^１及びｚ^２の１つ又は２つはＦであり、並びにｑ^３、ｚ^１及びｚ^２の残りはＨである。

１つの実施態様によれば、ｚ^１及びｚ^２の１つは、Ｆ、ＯＣＨ_３又はＯ(ＣＨ_２)_２−ＯＣＨ_３である。１つの実施態様によれば、ｚ^１及びｚ^２の１つはＦである。１つの実施態様によれば、ｚ^１及びｚ^２の１つはＦであり並びに残りはＨである。１つの実施態様によれば、ｚ_１及びｚ_２はそれぞれＨである。

１つの実施態様によれば、ｑ^１及びｑ^２は共にＨである。１つの実施態様によれば、ｑ^１及びｑ^２の１つはＦであり並びに残りはＨである。

また、実施例１の化合物１１により例示されるヌクレオシド前駆体化合物、特に：

（式中、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンから選択される）
が、本明細書において提供される。

特定の実施態様によれば、前記三環式ヌクレオシドは、

（式中、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンから選択される）
の群から選択される。

本発明の第２の態様によれば、式ＩＩ：

を有する少なくとも１つの三環式ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であって、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて独立して、
− Ｂｘが、複素環塩基部分であり、
− Ｔ^３及びＴ^４の１つが、式ＩＩの前記三環式ヌクレオシドを前記オリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり並びにＴ^３及びＴ^４の残りが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、５’もしくは３’末端基、又は前記三環式ヌクレオシドを前記オリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、
− ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の少なくとも１つが、Ｆであり、
− ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の残りが、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌから選択され、
− ｚ^１及びｚ^２の１つがＨ又はＦであり並びにｚ^１及びｚ^２の残りが、Ｈ、−ＯＨ、Ｃｌ、ＯＣＨ_３、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＦ_３、ＯＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_２−ＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)ＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２又はＯＣＨ_２−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ_２であり、
並びに前記オリゴマー化合物が８−４０個のモノマーサブユニットを含む、オリゴマー化合物が提供される。

本発明のこの態様の特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｚ^１及びｚ^２の１つはＦである。本発明のこの態様の特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｚ^１及びｚ^２はそれぞれＨである。

本発明のこの態様の特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ^１及びｑ^２はＨである。

本発明のこの態様の特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ^１及びｑ^２の１つはＦであり並びに残りはＨである。

本発明のこの態様の特定の実施態様において、Ｂｘは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン又は置換プリンである。１つの実施態様によれば、Ｂｘは、 ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンから選択される。１つの実施態様によれば、Ｂｘは、塩基ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンの代わりにＤＮＡオリゴマー又はＲＮＡオリゴマーに組み込まれると塩基対を形成することができる芳香族複素環部分である。

特定の実施態様において、それぞれのヌクレオシド間結合基は、独立して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基又はホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。特定の実施態様において、本質的にそれぞれのヌクレオシド間結合基は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である。

１つの実施態様によれば、本発明のオリゴマー化合物は、式ＩＩを有する少なくとも２個の連続した三環式ヌクレオシドを有する第１の領域を含む。１つの実施態様によれば、本発明のオリゴマー化合物は、式ＩＩを有する少なくとも２個の連続した三環式ヌクレオシドを有する第１の領域と、少なくとも２個の連続したモノマーサブユニットを有する第２の領域とを含み、第２の領域のそれぞれのモノマーサブユニットは、前記第１の領域の式ＩＩの三環式ヌクレオシドと異なる修飾ヌクレオシドである。この実施態様の別の実施態様によれば、本発明のオリゴマー化合物は、前記第１の領域と前記第２の領域の間に配置された第３の領域を含み、前記第３の領域のそれぞれのモノマーサブユニットは、独立して、前記第１の領域の式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシド及び前記第２の領域のそれぞれのモノマーサブユニットと異なるヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドである。

１つの実施態様によれば、本発明のオリゴマー化合物は、１−５個の連続したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接して配置されている６−１４個の連続したモノマーサブユニットの内部領域を有するギャップ導入（gapped）オリゴマー化合物を含み、それぞれの外部領域のそれぞれのモノマーサブユニットは、式ＩＩの三環式ヌクレオシドであり及び前記内部領域のそれぞれのモノマーサブユニットは、独立して、ヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドである。

特定の実施態様において、前記内部領域は、約８−約１４個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。１つの実施態様によれば、前記内部領域は、約９−約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。

特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ^３はＦである。１つの実施態様によれば、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ_４及びｑ_５の１つはＨであり並びにｑ_４及びｑ_５の残りはＦである。

特定の実施態様において、本発明のオリゴマー化合物は、

又は
（式中、Ｔ^３及びＴ^４は、前記に概説した意味を有する）
からなる群から選択される１個又は数個のヌクレオチドブロックを含む。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の第１の態様の三環式ヌクレオシドの使用を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法が提供される。

特定の実施態様において、ギャップ導入オリゴマー化合物であって、１−５個の連続したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接して配置されている６−１４個の連続したモノマーサブユニットの内部領域を含み、それぞれの外部領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、式ＩＩの三環式ヌクレオシドであり及び内部領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、独立して、ヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドであるギャップ導入オリゴマー化合物が提供される。特定の実施態様において、前記内部領域は、約８−約１４個の連続したβ−Ｄ−２'−デオキシリボヌクレオシドを含む。特定の実施態様において、前記内部領域は、約９−約１２個の連続したβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを含む。

特定の実施態様において、遺伝子の発現を抑制する方法であって、細胞を、本明細書において提供される５’修飾ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物と接触させるか、又は本明細書において提供される５’修飾ヌクレオシドを含む少なくとも１つのオリゴマー化合物を含む二本鎖組成物と接触させることを含み、前記オリゴマー化合物が、約８−約４０個のモノマーサブユニットを含む及び標的ＲＮＡに相補的である、遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。特定の実施態様において、細胞は、動物の細胞である。特定の実施態様において、細胞は、ヒトの細胞である。特定の実施態様において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、プレ−ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡから選択される。特定の実施態様において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。特定の実施態様において、標的ＲＮＡはヒトｍＲＮＡである。特定の実施態様において、標的ＲＮＡは、切断され、それによってその機能が抑制される。特定の実施態様において、前記方法は、さらに、標的ＲＮＡのレベルを検出することを含む。

特定の実施態様において、１つ又はそれ以上の細胞又は組織を、本明細書において提供されるオリゴマー化合物又は二本鎖組成物と接触させることを含む生体外（in vitro）で遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物又は二本鎖組成物は、１つ又はそれ以上の細胞、組織又は動物を、本明細書において提供されるオリゴマー化合物又は二本鎖組成物と接触させることを含む生体外で遺伝子の発現を抑制する方法での用途に使用される。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物又は二本鎖組成物は、薬物療法において使用される。

特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、置換位置ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の１つでの置換基弗素の配置は、オリゴマーの生体内分布、細胞取り込み又は送達を高める。特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、置換位置ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ_１又はｚ_２の１つでの置換基Ｆの配置は、オリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の特性、例えば、限定されないが、安定性、耐ヌクレアーゼ性、結合親和性、特異性、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷、薬力学及び薬物動態などを高める。特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、置換位置ｑ_１、ｑ_２、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ_１又はｚ_２の１つでのＦの配置が結合親和性を高めることが期待される。

特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ_３でのＦの配置が、オリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の特性、例えば限定されないが、安定性、耐ヌクレアーゼ性、結合親和性、特異性、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷、薬力学及び薬物動態を高めることが期待される。特定の実施態様において、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて、ｑ_３でのＦの配置が結合親和性を高めることが期待される。

式Ｉを有する新規三環式ヌクレオシド及びそれから調製されるオリゴマー化合物が、本明細書において提供される。式Ｉを有する三環式ヌクレオシドは、これらが組み込まれるオリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の特性、例えば限定されないが耐ヌクレアーゼ性などを高めるのに有用である。特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、標的ＲＮＡの一部分にハイブリダイズして、標的ＲＮＡの正常な機能の喪失をもたらす。特定の実施態様において、三環式ヌクレオシドであってアンチセンスオリゴマー化合物に組み込まれてメッセンジャーＲＮＡなどの標的ＲＮＡを生体外で及び生体内（in vivo）で減少させることができる三環式ヌクレオシドが、提供される。１つの態様において、標的ＲＮＡの機能の低下又は喪失は、多数の経路を介した遺伝子発現の抑制に有用である。このような経路は、例えば、ｍＲＮＡの転写及び／又は翻訳の立体的遮断（blocking）並びに一本鎖又は二本鎖オリゴマー化合物によるｍＲＮＡの切断を含む。また、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、診断用途においてプライマー及びプローブとして有用であると期待される。

特定の実施態様において、二本鎖組成物であって、それぞれの二本鎖組成物が、
− 第１のオリゴマー化合物及び第２のオリゴマー化合物（この場合、第１のオリゴマー化合物は第２のオリゴマー化合物に相補的であり、及び第２のオリゴマー化合物は核酸標的に相補的である）
を含み；
− 第１のオリゴマー化合物及び第２のオリゴマー化合物の少なくとも１つが、少なくとも１つの式ＩＩの三環式ヌクレオシドを含み；並びに
― 前記組成物が、場合により１個又はそれ以上の末端基を含む；
二本鎖組成物が提供される。

本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、以下に限定されないが、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む未修飾又は天然の核酸塩基を指す。本明細書で使用する用語「複素環塩基部分」は、未修飾又は天然の核酸塩基及び修飾核酸塩基又は非天然核酸塩基並びにこれらの合成ミメティック（例えば、フェノキサジン類など）を指す。１つの実施態様において、複素環塩基部分は、核酸の複素環塩基に水素結合することができる１個又はそれ以上の原子又は原子の基を含有する任意の複素環系である。

特定の実施態様において、複素環塩基部分は、限定されないが修飾核酸塩基、例えば５−メチルシトシン(５−ｍＣｙｔ)、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン；アデニン及びグアニンの６−メチル及びその他のアルキル誘導体；アデニン及びグアニンの２−プロピル及びその他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン；５−プロピニル(−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_３)ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体；６−アゾウラシル、シトシン及びチミン；５−ウラシル(プソイドウラシル)、４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及びその他の８−置換アデニン及びグアニン；５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他の５−置換ウラシル及びシトシン；７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別(promiscuous)塩基、サイズ拡張塩基、並びに本明細書において定義されるような弗素化塩基を含む。

特定の実施態様において、複素環塩基部分は、限定されないが三環式ピリミジン類、例えば１,３−ジアザフェノキサジン−２−オン、１,３−ジアザフェノチアジン−２−オン及び９−(２−アミノエトキシ)−１,３−ジアザフェノキサジン−２−オン(Ｇ−クランプ)を含む。また、複素環塩基部分は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環化合物、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されているものも含む。別の複素環塩基部分は、限定されないが、当業者に公知のものを含む（例えば：米国特許第３６８７８０８号明細書；Swayzeら、 The Medicinal Chemistry of Oligonucleotides in Antisense a Drug Technology, Chapter 6, p.143-182, Crooke, S.T.編, 2008参照）； The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J.I.編, John Wiley & Sons, 1990, 858-859； Englischら, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613；Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crooke, S.T.及びLebleu, B.編, CRC Press, 1993, 273-302.参照）。

本明細書で使用する用語「ヌクレオシド」は、核酸塩基−糖の組み合わせを指す。このような核酸塩基の２つの最も一般的な分類は、プリンとピリミジンである。

本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、修飾又は未修飾リン酸ヌクレオシド間結合基又は非リン酸ヌクレオシド間結合基をさらに含むヌクレオシドを指す。ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドについて、ヌクレオシド間結合基は、前記糖の２’、３’又は５’ヒドロキシル部分のいずれかに結合させることができる。リン酸ヌクレオシド間結合基及び／又は非リン酸ヌクレオシド間結合基は、隣り合ったヌクレオシド同士を互いに共有結合させて線状ポリマー化合物を形成するのに日常的に使用される。

本明細書で使用する用語「ヌクレオチドミメテック」は、糖及び結合代用基、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ〔−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝Ｏ)−Ｏ−によって結合される〕などを用いてオリゴマー化合物に組み込むモノマーを含むことを意図する。一般に、それぞれの位置の複素環塩基は、核酸標的へのハイブリダイゼーションのために維持されるが、糖及び結合は、天然の基（native groups）と同様に機能するが１つ又はそれ以上の高められた特性を有することが期待される代用基で置換される。

本明細書で使用する用語「ヌクレオシドミメティック」は、オリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の位置で糖及び塩基を置換するのに使用される構造体を含むことを意図する。ヌクレオシドミメティックの例としては、限定されないが、複素環塩基部分が、フェノキサジン部分〔例えば、９−(２−アミノエトキシ)−１,３−ジアザフェノキサジン−２−オン基（グアノシン塩基とハイブリダイズすると４個の水素結合を形成するＧ−クランプとも呼ばれる）〕で置換されているヌクレオシド及び例えばモルホリノ、シクロヘキセニル又はビシクロ[３．１．０]ヘキシルなどの基による糖部分のさらなる置換体が挙げられる。

本明細書で使用する用語「修飾ヌクレオシド」は、オリゴマー合成を使用してオリゴマー化合物に組み込むことができるあらゆる種類の修飾ヌクレオシドを含むことを意図する。この用語は、本明細書のいずれかに記載される代用基の使用とは対照的に、ヌクレオシドに対してなされた修飾、例えば種々の基の修飾された立体化学配置、１つ又はそれ以上の置換、及び欠失などを含むことを意図する。この用語は、フラノース糖（又は４’−Ｓ類似物質）部分を有するヌクレオシドを包含し、複素環塩基を含むことができるし、又は脱塩基ヌクレオシドであることができる。代表的な修飾ヌクレオシドの１つの群は、限定されないが、置換ヌクレオシド（２’、５’及び／又は４’置換ヌクレオシドなど）、４’−Ｓ−修飾ヌクレオシド（４’−Ｓ−リボヌクレオシド、４’−Ｓ−２’−デオキシリボヌクレオシド及び４’−Ｓ−２’−置換リボヌクレオシドなど）、二環式修飾ヌクレオシド〔例えば、糖部分が２’−Ｏ−ＣＨＲ_ａ−４’架橋基（式中、Ｒ_ａは、Ｈ、アルキル又は置換アルキルである）を有する二環式ヌクレオシドなど〕及び塩基修飾ヌクレオシドを含む。糖は、例えば５’−置換をさらに含む二環式修飾ヌクレオシド、あるいは２’置換基をさらに含む５’又は４’置換ヌクレオシドなどの列挙されたこれらの修飾の１つよりも多くで修飾することができる。また、用語「修飾ヌクレオシド」は、これらの修飾の組み合わせ、例えば塩基及び糖修飾ヌクレオシドも含む。これらの修飾は、他の修飾が当分野で公知であり、また本明細書に記載の修飾ヌクレオシドの可能な修飾として想定されることから、例証となるものであり、網羅するものではないことを意図する。

本明細書で使用する用語「モノマーサブユニット」は、モノマーサブユニット、例えばβ−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−２'−デオキシリボヌクレオシド、修飾ヌクレオシド〔置換ヌクレオシド(２'、５'及びビス置換ヌクレオシド)、４'−Ｓ−修飾ヌクレオシド(４'−Ｓ−リボヌクレオシド、４'−Ｓ−２'−デオキシリボヌクレオシド及び４'−Ｓ−２'−置換リボヌクレオシドなど）、二環式修飾ヌクレオシド（糖部分が２'−Ｏ−ＣＨＲ_ａ−４'架橋基を有する二環式ヌクレオシドなど、式中のＲ_ａはＨ、アルキル又は置換アルキルである）、その他の修飾ヌクレオシドを含む〕、ヌクレオシドミメティック、糖代用物を有するヌクレオシド及び本明細書において提供される三環式ヌクレオシドを含む１つの好ましいリストを用いてオリゴマー合成することができるあらゆる種類のモノマー単位を含むことを意図する。

多数のその他の単環式、二環式及び三環式の環系が、当分野で公知であり、本明細書において提供されるオリゴマー化合物に組み込むためのヌクレオシドを修飾するのに使用できる糖代用物として適している（例えば、総説：Leumann, Christian J. Bioorg. & Med. Chem., 2002, 10, 841-854参照）。このような環系は、種々の追加の置換を行いその活性をさらに高めることができる。

本明細書で使用する用語「反応性リン」は、例えばホスホジエステル及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含めヌクレオシド間結合を形成するのに有用なオリゴマー化合物にさらに結合させることができるモノマーサブユニットに共有結合される基を含むことを意図する。このような反応性リン基は、当分野で公知であり、以下に限定されないが、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、リン酸トリエステル及びキラル助剤を含有するリンを含めＰ^ＩＩＩ価状態又はＰ^Ｖ価状態のリン原子を含有する。 特定の実施態様において、反応性リン基は、ジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイト〔−Ｏ^＊−Ｐ[Ｎ[(ＣＨ(ＣＨ_３)_２]_２]Ｏ(ＣＨ_２)_２ＣＮ〕及びＨ−ホスホネート〔−Ｏ^＊−Ｐ(＝Ｏ)(Ｈ)ＯＨ〕(式中、Ｏ^＊は、モノマーについての前記マーカッシュ群から提供される）から選択される。好ましい合成固相合成では、ホスホロアミダイト（Ｐ^ＩＩＩ化学物質）を反応性ホスファイトとして利用する。中間体ホスファイト化合物は、その後に公知の方法を使用してホスフェート又はチホスフェート（Ｐ^Ｖ化学物質）に酸化させて、ホスホジエステル又はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を生成させる。さらなる反応性ホスフェート及びホスファイトは、Tetrahedron Report Number 309（Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311）に開示されている。

本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」とは、複数の結合されたヌクレオシドを含む化合物を指す。特定の実施態様において、複数のヌクレオシドの１つ又はそれ以上が、修飾される。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１個又はそれ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。

用語「オリゴヌクレオシド」は、リン原子を有していないヌクレオシド間結合によって連結されているヌクレオシドの配列を指す。このタイプのヌクレオシド間結合は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混成異種原子アルキル、混成異種原子シクロアルキル、１個又はそれ以上の短鎖異種原子及び１個又はそれ以上の短鎖複素環を含む。これらのヌクレオシド間結合は、限定されないが、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミド、並びに混成Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成部分を有するその他のものを含む。

本明細書で使用する用語「オリゴマー化合物」は、結合された複数のモノマーサブユニットの連続配列を指す。それぞれの結合されたモノマーサブユニットは、標準的には複素環塩基部分を含むが、脱塩基モノマーサブユニットなどの複素環塩基部分を有していないものも含む。オリゴマー化合物の複素環塩基の少なくとも幾つか及び本質的に全部でない場合には一般に大部分は、核酸分子に、標準的には予め選択されたＲＮＡ標的にハイブリダイズすることができる。 したがって、用語「オリゴマー化合物」は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似物質及びオリゴヌクレオシドを含む。この用語はまた、１つ又は複数のヌクレオシドミメティック及び／又は糖代用基を有するクレオシドを有するポリマーも含む。

特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、天然ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、ヌクレオシドミメティック、及び糖代用基を有するヌクレオシドから独立して選択される複数のモノマーサブユニットを含む。特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、一本鎖である。特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、二本鎖二重鎖(double−stranded duplex）を含む二本鎖である。特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、１個又はそれ以上の共役基及び／又は末端基を含む。

本明細書で使用する用語「ヌクレオシド間結合」又は「ヌクレオシド間結合基」は、以下に限定されないが、ホスホジエステル及びホスホロチオエートなどのリン含有ヌクレオシド間結合基、並びにホルムアセチル及びメチレンイミノなどの非リン含有ヌクレオシド間結合基を含め当分野で公知のあらゆる種類のヌクレオシド間結合基を含むことを意図する。また、ヌクレオシド間結合は、リン原子が必ずしも存在していない中性の非イオン性ヌクレオシド間結合、例えばアミド−３(３'−ＣＨ_２−Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−５')、アミド−４(３'−ＣＨ_２−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝Ｏ)−５')及びメチルホスホネートも含む。

特定の実施態様において、修飾された例えば非天然ヌクレオシド間結合を含有する１個又はそれ以上のヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物が、調製ができる。ヌクレオシド間結合の２つの主要な分類は、リン原子が存在するか又は存在しないかによって定義される。リン原子を有する修飾ヌクレオシド間結合は、限定されないが、典型的な３’−５’結合を有している、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及びその他のアルキルホスホネート(３'−アルキレンホスフェート、５'−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む)、ホスフィネート、ホスホロアミデート(３'−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含む)、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホロトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェート、これらの２’−５’ 結合類似物質、並びに１個又はそれ以上のヌクレオチド間結合が３’−３’結合、５’−５’結合又は２’−２’結合である逆極性を有するものを含む。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’−末端ヌクレオチド間結合において単一の３’−３’結合、すなわち塩基が脱落しているかもしれない単一の逆転ヌクレオシド残基（核酸塩基が、脱落しているか又はその代わりにヒドロキシル基を有する）を含むことができる。種々の塩、混成塩及び遊離酸の形態も含まれる。

特定の実施態様において、１個又はそれ以上の非リン含有ヌクレオシド間結合を有する本明細書において提供されるオリゴマー化合物が、調製できる。 このようなオリゴマー化合物は、限定されないが、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混成異種原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１個又はそれ以上の短鎖異種原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成されるものを含む。これらは、シロキサン主鎖（backbone）；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；並びに混成Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ_２構成部分を有するその他の主鎖を有するものを含む。

上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許として、限定されないが、米国特許第５０３４５０６号明細書；第５１６６３１５号明細書；第５１８５４４４号明細書；第５２１４１３４号明細書；第５２１６１４１号明細書；第５２３５０３３号明細書；第５２６４５６２号明細書；第５２６４５６４号明細書；第５４０５９３８号明細書；第５４３４２５７号明細書；第５４６６６７７号明細書；第５４７０９６７号明細書；第５４８９６７７号明細書；第５５４１３０７号明細書；第５５６１２２５号明細書；第５５９６０８６号明細書；第５６０２２４０号明細書；第５６０８０４６号明細書；第５６１０２８９号明細書；第５６１８７０４号明細書；第５６２３０７０号明細書；第５６６３３１２号明細書；第５６３３３６０号明細書；第５６７７４３７号明細書；第５６７７４３９号明細書；第５６４６２６９号明細書及び第５７９２６０８号明細書が挙げられ、これらのあるものは、本出願と所有者が共通し、これらのそれぞれは、参照することによって本明細書に組み込まれる。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、１個又はそれ以上の共役基（conjugate group）の共有結合によって修飾することができる。一般に、共役基は、これらが結合されるオリゴマー化合物の１つ又はそれ以上の特性を修飾する。このようなオリゴヌクレオチド特性は、限定されないが、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷及びクリアランスを含む。 共役基は、化学技術において日常的に使用され、オリゴマー化合物のような親化合物に、直接に結合されるか又は任意の結合部分もしくは結合基によって結合される。共役基の好ましい一覧は、限定されないが、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、チオコレステロール、コール酸部分、葉酸、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素を含む。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、１個又はそれ以上の末端基を５’又は３’−末端基に共有結合させることによって修飾することができる。末端基はまた、オリゴマー化合物の末端の１つの任意の他の位置で結合させることもできる。本明細書で使用する用語「５’−末端基」、「３’−末端基」、「末端基」及びこれらの組み合わせは、様々な目的のために、例えばオリゴマー化合物の追跡を可能にするために（蛍光標識又はその他のレポーター基）、オリゴマー化合物の薬物動態又は薬力学（例えば：取り込み及び／又は送達など）を改善するために、あるいはオリゴマー化合物の１つ又はそれ以上のその他の望ましい特性を高めるために（ヌクレアーゼ安定性又は結合親和性を改善するための基）、以下に限定されないが、オリゴマー化合物の５’−末端及び３’−末端それぞれを含め、末端の１つ又は両方に配置することができる当業者に公知の有用な基を含むことを意図する。特定の実施態様において、５’及び３’−末端基は、限定されないが、修飾又は未修飾ヌクレオシド；独立して修飾されているか又は修飾されていない２個又はそれ以上の結合されたヌクレオシド；共役基；キャッピング基；リン酸部分；及び保護基を含む。

本明細書で使用する用語「リン酸部分」は、リン酸及び修飾リン酸を含め末端リン酸基を指す。リン酸部分は、いずれかの末端に配置されることができるが、５’−末端ヌクレオシドに配置されるのが好ましい。１つの態様において、末端リン酸は、修飾されておらず、式−Ｏ−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)ＯＨを有する。別の態様において、末端リン酸は、Ｏ基及びＯＨ基の１つ又はそれ以上が、Ｈ、Ｏ、Ｓ、Ｎ(Ｒ)又はアルキル（式中、Ｒは、Ｈ、アミノ保護基又は非置換もしくは置換アルキルである）で置換されるように修飾される。 特定の実施態様において、５’及び又は３’末端基は、それぞれ独立して修飾されていない（二リン酸又は三リン酸）又は修飾されている１−３個のリン酸部分を含むことができる。

本明細書で使用する用語「リン部分」は、式：

（式中：
Ｒ_ｘ及びＲ_ｙは、それぞれ独立して、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル基、チオール、保護チオール基、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、保護アミノ又は置換アミノであり；並びに
Ｒ_ｚは、Ｏ又はＳである）
を有する基を指す。

ホスホロアミダイト又はＨ−ホスホネートなどのモノマーとして、保護リン部分は、 オリゴマー合成中に安定性を維持することが好ましい。オリゴマー化合物に組み込み後には、リン部分は、脱保護基を含むことができる。

本明細書に含まれるリン部分は、オリゴマー化合物の調製に使用できるモノマーに結合させることができ、このモノマーは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_ｄ又はＣＲ_ｅＲ_ｆ（式中、Ｒ_ｄは、限定されないが、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル、置換Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル又は置換アシルを含み、Ｒ_ｅ及びＲ_ｆは、それぞれ独立して、限定されないが、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、置換Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ又は置換Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシを含む）を使用して結合させ得る。このような結合リン部分は、限定されないが、リン酸、修飾リン酸、ホスホロチオエート、修飾ホスホロチオエート、ホスホネート、修飾ホスホネート、ホスホロアミデート及び修飾ホスホロアミデートを含む。

天然オリゴヌクレオチドと比べた、化学修飾オリゴマー化合物の相補的核酸鎖に結合する相対能力は、前記化学修飾オリゴマー化合物とその相補的未修飾標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体の融解温度を得ることによって測定される。融解温度（Ｔ_ｍ）（二重らせんの特徴的な物理的性質である）は、５０％へリックス形対コイル形（ハイブリダイズしていない）が存在する摂氏温度を示す。Ｔ_ｍ（一般的に結合親和性とも呼ばれる）は、ＵＶスペクトルを使用してハイブリダイゼーションの形成と破壊（融解）を決定することによって測定される。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基スタッキングは、ＵＶ吸収の低下（淡色性）を伴う。その結果、ＵＶ吸収の低下は、高いＴ_ｍを示す。

アンチセンス化合物：ＲＮＡ標的の二重鎖の相対二重鎖安定性を、化学修飾ヌクレオシドをアンチセンス化合物に組み込むことによって調節できることは、当分野で公知である。糖修飾ヌクレオシドは、アンチセンス化合物のＴ_ｍをその標的ＲＮＡを用いて調節する最も有効な手段を提供している。Ｃ３’−エンド（ノーザン、ＲＮＡ様糖パッカー）配置の糖の集団を増加させるか又は固定する（lock）糖修飾ヌクレオシドは、主として、相補的ＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の修飾当たりＴ_ｍの上昇を提供している。Ｃ２’−エンド（サザン、ＤＮＡ様糖パッカー）配置の糖の集団を増加させるか又は固定する糖修飾ヌクレオシドは、相補的ＲＮＡ標的に対するアンチセンス化合物の修飾当たりＴ_ｍの低下を提供する。所定の糖修飾ヌクレオシドの糖パッカーは、ヌクレオシドが相補的ＲＮＡに対するアンチセンス化合物のＴ_ｍを上昇又は低下させる能力を決定する唯一の因子ではない。例えば、糖修飾ヌクレオシドトリシクロＤＮＡは、主として、Ｃ２’−エンド立体配置にあるが、それは、相補的ＲＮＡ標的に対する修飾当たりＴ_ｍの１.９〜３℃の上昇を与える。Ｃ３’−エンド立体配置を採用しない糖修飾高親和性ヌクレオシドは、α−Ｌ−ＬＮＡである。

本明細書で使用する「Ｔ_ｍ」（融解温度）は、二重鎖核酸の２つの鎖が分離する温度である。Ｔ_ｍは、多くの場合、相補的ＲＮＡ分子に対するアンチセンス化合物の二重鎖安定性の尺度として使用される。

核酸塩基に関連して本明細書で使用する「相補的」とは、別の核酸塩基と塩基対を形成することができる核酸塩基を指す。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に相補的である。特定の実施態様において、相補的核酸塩基とは、その標的核酸の核酸塩基と塩基対を形成することができるアンチセンス化合物の核酸塩基を指す。例えば、アンチセンス化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合することができる場合には、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、その核酸塩基対で相補的であるとみなされる。 特定の修飾を含む核酸塩基、より広範には複素環塩基部分は、対応核酸塩基と対合する能力を維持し得、したがって依然として相補性の能力がある。

核酸塩基に関連して本明細書で使用する「非相補的」とは、互いに水素結合を形成しないか又はハイブリダイゼーションを支持しない核酸塩基の対を指す

結合ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴマー化合物、又は核酸に関連して本明細書で使用する「相補的」とは、核酸塩基、より広範には複素環塩基を介して別のオリゴマー化合物又は核酸にハイブリダイズするオリゴマー化合物の能力、すなわち相補性を指す。特定の実施態様において、アンチセンス化合物とその標的は、それぞれの分子の十分な数の対応位置が、互いに結合してアンチセンス化合物と標的の間で安定な会合を可能にすることができる核酸塩基によって占有されている場合に、互いに相補的である。当業者は、オリゴマー化合物が会合に残る能力を除外することなく誤対合の含有が可能であることを認識する。したがって、誤対合している（すなわち、標的の対応ヌクレオチドに相補的な核酸塩基ではない）最大約２０％のヌクレオチドを含んでいてもよいアンチセンス化合物が、本明細書に記載される。アンチセンス化合物は、好ましくは約１５％以下、さらに好ましくは約１０％以下、最も好ましくは５％以下の誤対合を含有するか又は全く含有しない。残りのヌクレオチドは、相補的な核酸塩基であるか、あるはその逆でハイブリダイゼーションを破壊しない核酸塩基（例えば、ユニバーサル塩基）である。当業者は、本明細書において提供される化合物が、標的核酸と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％相補的であることを認識するであろう。

オリゴマー化合物の配列が、特異的にハイブリダイズできるためにはその標的核酸の配列と１００％相補的である必要がないことは、当分野では理解される。さらに、オリゴマー化合物は、１個又はそれ以上のセグメントに、介在又は隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないようにハイブリダイズし得る（例えば、ループ又はヘアピン構造）。特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、標的とする標的核酸配列内の標的領域と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０個の核酸塩基の１８個が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろうオリゴマー化合物は、９０％の相補性を示すであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基とクラスター形成していてもよいし又は相補的核酸塩基に点在していてもよく、相互に又は相補的核酸塩基に連続している必要はない。それゆえに、標的核酸と完全相補性の２つの領域が隣接して配置されている４個の非相補的核酸塩基を有する１８個の核酸塩基の長さのオリゴマー化合物は、標的核酸と７７.８％の全体的相補性を有するのであろう、したがってこの範囲に入るであろう。オリゴマー化合物の標的核酸の領域との％相補性は、当分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所的アラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang及びMadden, Genome Res., 1997, 7, 649−656）を使用して日常的に決定することができる。

本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」とは、相補的オリゴマー化合物（例えば、アンチセンス化合物及びその標的核酸）の対合を指す。特定のメカニズムに限定されないが、対合の最も一般的なメカニズムは、相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）同士の間の水素結合を伴い、この水素結合（これは、ワトソン・クリック型、フーグスティーン型又は逆フーグスティーン型の水素結合であってもよい）を伴う。例えば、天然塩基アデニンは、水素結合の形成によって対合する天然核酸塩基チミジン及びウラシルに相補的な核酸塩基である。天然塩基グアニンは、天然塩基シトシン及び５−メチル シトシンに相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、種々様々な環境下で生じることができる。

本明細書で使用する「標的核酸」とは、その発現、量、又は活性をアンチセンス化合物によって調節することができる任意の核酸分子を指す。特定の実施態様において、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。 特定の実施態様において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、pre−ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ、プライマリーマイクロＲＮＡ（pri-microRNA）、プレマイクロＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ又は天然アンチセンス転写物である。例えば、標的核酸は、発現が特定の疾病又は疾患状態と関連がある細胞遺伝子（又は遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、又は感染因子由来の核酸分子であり得る。特定の実施態様において、標的核酸は、ウイルス核酸又は細菌核酸である。

さらに、オリゴマー化合物、例えばアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズするその他のオリゴマー化合物が、本明細書に含まれる。それゆえに、これらのオリゴマー化合物は、一本鎖オリゴマー化合物、二本鎖オリゴマー化合物、環状オリゴマー化合物又はヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入し得、内部もしくは末端バルジ又はループなどの構造要素を含有し得る。一旦、系に導入されると、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、１個又はそれ以上の酵素又は構造タンパク質の作用を誘発して標的核酸の修飾を行い得る。あるいは、オリゴマー化合物は、占有に基づいた方法によって活性標的核酸を阻害し、このようにして標的核酸の活性を妨害し得る。

このような酵素の１つの非限定的な例は、ＲＮアーゼＨ、すなわちＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。「ＤＮＡ様」の一本鎖オリゴマー化合物がＲＮアーゼＨを誘発することは、当分野で公知である。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド介在阻害の効率を著しく高める。同様の役割が、ＲＮアーゼＩＩＩ及び酵素のリボヌクレアーゼＬファミリーなどのその他のリボヌクレアーゼについて仮定されている。

オリゴマー化合物の１つの形態は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種では、二本鎖 ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子などの二本鎖構造の導入が、遺伝子又はその関連遺伝子産物の機能の強力で特異的なアンチセンス介在低下を誘導することが明らかにされている。この現象は、植物と動物の両方で生じ、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングと進化論的な関係があると思われる。

本明細書で使用する「調節」とは、調節前の機能又は活性と比べた場合の機能又は活性の量又は質の撹乱を指す。 例えば、調節として、遺伝子発現の変化、すなわち遺伝子発現の増加（刺激又は誘導）又は減少（抑制又は低下）が挙げられる。別の例として、発現の調節として、撹乱されなかった状態と比べて存在する特定のスプライスバリアントの量の変化をもたらすｐｒｅ−ｍＲＮＡ処理のスプライス部位選択の撹乱が挙げられる。別の例として、調節として、タンパク質の翻訳の撹乱が挙げられる。

本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」は、化合物の所望の活性を保持し、化合物に対して望まれない毒物効果を与えない塩を指す。用語「薬学的に許容される塩」は、無機又は有機酸及び無機又は有機塩基を含め、薬学的に許容される無毒性の酸又は塩基から調製される塩を含む。

本明細書に記載のオリゴマー化合物の薬学的に許容される塩は、当分野で周知の方法で調製し得る。薬学的に許容される塩の概説については、Stahl及びWermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use（Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002）が参照される。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩が、有用であり、ヒトへの治療投与に十分に許容される。したがって、１つの実施態様において、本明細書に記載のオリゴマー化合物は、ナトリウム塩の形態である。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、長さで約８−約８０個のモノマーサブユニットを含む。当業者は、これは長さで８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、もしくは８０個のモノマーサブユニット又はその任意の範囲内のモノマーサブユニットのオリゴマー化合物を具体的に表すことを認めるであろう。

オリゴマー化合物は、液相法とは対照的に固体支持体法を使用して日常的に調製される。固体支持体法を利用するオリゴマー化合物の調製に一般的に使用される商業的に入手できる装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を含め幾つかの販売業者から販売されている。当分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段を、追加的に又は代替として用いてもよい。自動合成技術を含め適当な固相技術は、Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, F. Eckstein編, Oxford University Press, New York, 1991に記載されている。

ＤＮＡ及び関連類似物質の合成と比べてＲＮＡ及び関連類似物質の合成は、ＲＮＡ干渉及びマイクロＲＮＡにおける努力が増大するにつれて増加してきている。現在商業的に使用されている主なＲＮＡ合成戦略として、５'−Ｏ−ＤＭＴ−２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル(ＴＢＤＭＳ)、５'−Ｏ−ＤＭＴ−２'−Ｏ−[１(２−フルオロフェニル)−４−メトキシピペリジン−４−イル](ＦＰＭＰ)、２'−Ｏ−[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル(２'−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ(ｉＰｒ)_３(ＴＯＭ)及び５'−Ｏ−シリルエーテル−２'−ＡＣＥ(５'−Ｏ−ビス(トリメチルシロキシ)シクロドデシルオキシシリルエーテル(ＤＯＤ)−２'−Ｏ−ビス(２−アセトキシエトキシ)メチル(ＡＣＥ)が挙げられる。ＲＮＡ産物を現在提供している主要な会社の幾つかの原稿リストには、Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．が含まれる。１つの会社Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、特にＴＯＭ及びＴＢＤＭＳ化学薬品とのカップリング時間を減少させると宣伝されているＲＮＡ合成活性化物質を市販している。商用ＲＮＡ合成に使用されている主要な基は、ＴＢＤＭＳ：５'−Ｏ−ＤＭＴ−２'−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル；ＴＯＭ：２'−Ｏ−[(トリイソプロピルシリル)オキシ]メチル；ＤＯＤ／ＡＣＥ：(５'−Ｏ−ビス(トリメチルシロキシ)シクロドデシルオキシシリルエーテル−２'−Ｏ−ビス(２−アセトキシエトキシ)メチル；及びＦＰＭＰ：５'−Ｏ−ＤＭＴ−２'−Ｏ−[１(２−フルオロフェニル)−４−エトキシピペリジン−４−イル]である。特定の実施態様において、前述のＲＮＡ合成戦略のそれぞれが、本明細書において使用することができる。特定の実施態様において、前述のＲＮＡ合成戦略が、例えばある戦略由来の５’−保護基を別の戦略由来の２’−Ｏ−保護と共に使用して、混成様式で一緒に行うことができる。

幾つかの実施態様において、「適当な標的セグメント」が、選択されたタンパク質の発現を調節するさらなるオリゴマー化合物のスクリーニングに使用し得る。「モジュレーター」とは、タンパク質をコードする核酸分子の発現を低下又は上昇させ、適当な標的セグメントに相補的な少なくとも８個の核酸塩基部分を含むオリゴマー化合物である。このスクリーニング方法は、タンパク質をコードする核酸分子の適当な標的セグメントを１つ又はそれ以上の候補モジュレーターと接触させ、タンパク質をコードする核酸分子の発現を低下又は上昇させる１つ又はそれ以上の候補モジュレーターを選択する工程を含む。候補モジュレーター（１つ又は複数）が、ペプチドをコードする核酸分子の発現を調節する（例えば、低下させるか又は上昇させる）ことができることが一旦示されると、モジュレーターは、本明細書において、ペプチドの機能のさらなる調査研究において用いてもよいし、又は研究、診断もしくは治療剤として使用するために用いてもよい。マイクロＲＮＡを標的にしたオリゴマー化合物の場合には、候補モジュレーターは、マイクロＲＮＡ標的ＲＮＡ又はタンパク質の発現を上昇させる程度によって評価し得る（マイクロＲＮＡの活性への干渉が、マイクロＲＮＡの１つ又はそれ以上の標的の上昇した発現をもたらすからである）。

本明細書で使用する「発現」とは、遺伝子が最終的にタンパク質をもたらすプロセスを指す。発現は、以下に限定されないが、転写、スプライシング、転写後修飾、及び翻訳を含む。

「適当な標的セグメント」は、安定化させた二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成させるために、本明細書において提供されるそれぞれの相補的オリゴマー化合物と組み合わせてもよい。このような二本鎖オリゴヌクレオチド部分がアンチセンスメカニズムによって標的発現を調節すること並びに翻訳及びＲＮＡプロセシングを制御することが、当分野で明らかにされている。さらに、二本鎖部分は、化学修飾に供してもよい（Fireら, Nature, 1998, 391, 806-811；Timmons及びFire, Nature, 1998, 395, 854；Timmonsら, Gene, 2001, 263, 103-112；Tabaraら, Science, 1998, 282, 430-431；Montgomeryら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15502−15507；Tuschlら, Genes Dev., 1999, 13, 3191-3197；Elbashirら, Nature, 2001, 411, 494−498；Elbashirら, Genes Dev., 2001, 15, 188-200）。例えば、このような二本鎖部分は、二重鎖のアンチセンス鎖と標的との伝統的なハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、それによって標的の酵素的分解を誘発することが明らかにされている（Tijstermanら, Science, 2002, 295, 694-697）。

本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、創薬及び標的検証の分野に適用することもできる。特定の実施態様において、タンパク質と疾患状態、表現型又は状態との間に存在する関係を解明するための創薬努力における本明細書で同定されるオリゴマー化合物及び標的の使用が、本明細書において提供される。これらの方法は、標的ペプチドの検出又は調節であって、試料、組織、細胞又は生物を本明細書において提供される１つ又はそれ以上のオリゴマー化合物と接触させ、処理後のある時点で標的の核酸又はタンパク質レベル及び／又は関連する表現型又は化学終点を測定し、測定値を、未処理試料又は本明細書において提供されるさらなるオリゴマー化合物で処理した試料と、任意選択的に比較することを含む標的ペプチドの検出又は調節を含む。これらの方法は、他の実験と並行して又は組み合わせて行って、標的検証のプロセスのために未知遺伝子の機能を決定するか、あるいは特定の疾患、状態もしくは表現型の治療又は予防のための標的としての特定の遺伝子産物の有効性を決定することもできる。特定の実施態様において、オリゴマー化合物は、治療に使用するために提供される。特定の実施態様において、治療は、標的メッセンジャーＲＮＡを減少させることである。

本明細書で使用する用語「用量」は、単回投与で提供される医薬品の特定量を指す。特定の実施態様において、用量は、２回又はそれ以上のボーラス、錠剤又は注射剤で投与し得る。例えば、特定の実施態様において、皮下投与が望まれる場合には、所望の用量は、１回の注射では容易に適合されない容量を必要とする。このような実施態様において、２回又はそれ以上の注射を使用して所望の用量を達成してもよい。特定の実施態様において、用量は、個体の注射部位の反応を最小限にするために２回又はそれ以上の注射で投与してもよい。

特定の実施態様において、標的ＲＮＡに対して非修飾ＤＮＡよりも高い親和性を有し得る化学修飾オリゴマー化合物が、本明細書において提供される。特定のこのような実施態様において、高親和性は、次々に、このような化合物の低用量の投与を可能にさせる効力の増大、毒性の可能性の減少、治療指数の改善及び治療の全体コストの低下を提供する。

ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の効果は、現存する文献（Elbashirら, Nature, 2001, 411, 494-498；Nishikuraら, Cell, 2001, 107, 415-416；及びBassら, Cell, 2000, 101, 235-238.）に従って評価される。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、診断、治療、予防のために利用することができ並びに研究試薬及びキットとして利用することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチド（これは、この上なく優れた特異性で遺伝子発現を抑制することができる）は、多くの場合、特定の遺伝子の機能を解明するために又は生物学的経路の種々の構成員の機能を識別するために当業者によって使用される。特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、単独であるいは他のオリゴマー化合物又は他の治療法と組み合わせて、細胞及び組織内で発現された遺伝子の一部又は完全補体の発現パターンを解明するための層別解析及び／又は組み合わせ解析のツールとして利用することができる。また、オリゴマー化合物は、遺伝子の増幅又は検出それぞれに都合の良い条件下でプライマー及びプローブとして効果的に使用することもできる。これらのプライマー及びプローブは、タンパク質をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において及び検出のため又はさらなる研究で使用するための核酸分子の増幅において有用である。本明細書において提供されるオリゴマー化合物、特にプライマー及びプローブと核酸とのハイブリダイゼーションは、当分野で公知の手段で検出することができる。このような手段として、酵素とオリゴヌクレオチドの複合、オリゴヌクレオチドの放射標識又は任意のその他の適当な検出手段が挙げ得る。試料中の選択されたタンパク質のレベルを検出するためのこのような検出手段を使用するキットも調製し得る。

１つの非限定的な例として、本明細書において提供されるオリゴマー化合物の１つ又はそれ以上を用いて処理された細胞又は組織内の発現パターンが、オリゴマー化合物を用いて処理されていないコントロール細胞又は組織と比較され、生成したパターンが、例えば調べられる遺伝子の疾患関係、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造又は機能に関係することから、遺伝子発現の異なるレベルについて解析される。これらの解析は、刺激細胞又は未刺激細胞について、発現パターンに影響を及ぼす他の化合物及び／又はオリゴマー化合物の存在下又は不在下で行うことができる。

当分野で公知の遺伝子発現解析の方法の例として、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイ法（Brazma及びVilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24；Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の遂次解析）法（Maddenら, Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅）法（Prashar及びWeissman, Methods Enzymol, 1999, 303, 258-72）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現解析）法（Sutcliffeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 1976-81）、タンパク質アレイ及びプロテオミクス法（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16；Jungblutら, Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10）、発現配列標識（ＥＳＴ）配列決定法（Celisら, FEBS Lett., 2000, 480, 2-16；Larssonら, J. Biotechnol, 2000, 80, 143-57）、消去式ＲＮＡフィンガープリント（ＳｕＲＦ）法（Fuchsら, Anal. Biochem., 2000, 286, 91−98；Larsonら, Cytometry, 2000, 41, 203−208）、消去式クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）法（Jurecic及びBelmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21）、比較ゲノムハイブリダイゼーション法（Carulliら, J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286−96）、ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）テクノロジー（Going及びGusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895−904）及び質量分析法（To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41）が挙げられる。

本開示を所有する当業者は、本質的に任意の実行可能な長さの結合されたモノマーサブユニットの連続配列を含むオリゴマー化合物を調製して本明細書に開示された方法を実施することができるであろう。このようなオリゴマー化合物は、本明細書において提供される三環式ヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは複数含有するであろうし、以下に限定されないが、ヌクレオシド、修飾ヌクレオシド、糖代用基を含むヌクレオシド及びヌクレオシミメティックを含め他のモノマーサブユニットも含有していてもよい。

特定の実施態様において、本明細書において提供されるオリゴマー化合物は、記載のように利用することができるが、以下の実施例は、単に例証するために役立てるだけであり、限定することを意図するものではない。

実施例（一般的方法）
^１Ｈ及び^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚ及び７５ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ分光計それぞれで記録した。

ヌクレオシドホスホロアミダイトの合成
ヌクレオシドホスホロアミダイトの調製は、本明細書並びに以下に限定されないが米国特許第６４２６２２０号明細書及び国際公開第０２／３６７４３号パンフレットなどの当分野で例証されている手順に従って行う。

オリゴマー化合物の合成
本発明に従って使用されるオリゴマー化合物は、固相合成によって都合よく、日常的に調製し得る。

オリゴマー化合物： 非置換及び置換ホスホジエステル(Ｐ＝Ｏ)オリゴマー化合物は、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ型式３９４）でヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホロアミダイト化学を使用して合成することができる。

特定の実施態様において、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（Ｐ＝Ｓ）は、以下を除いてホスホジエステルヌクレオシド間結合と同様に合成する：チオ化は、ホスファイト結合を酸化するためにアセトニトリル：ピリジン １：１（容量／容量）中フェニルアセチルジスルフィドの０．２５Ｍ溶液を利用することにより行う。チオ化反応工程の時間を１８０秒に増加させ、通常のキャッピング工程を先行させる。ＣＰＧカラムから切断し、５５℃で、濃水酸化アンモニウム中で脱ブロッキング（１２−１６時間）後に、オリゴマー化合物を、１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ溶液から３倍よりも多い容量のエタノールを用いて沈殿させることによって回収する。

ホスフィネートヌクレオシド間結合は、米国特許第５５０８２７０号明細書に記載のように調製することができる。アルキルホスホネートヌクレオシド間結合は、米国特許第４４６９８６３号明細書に記載のように調製することができる。３'−デオキシ−３'−メチレンホスホネートヌクレオシド間結合は、米国特許第５６１０２８９号明細書又は第５６２５０５０号明細書に記載のように調製することができる。ホスホロアミダイトヌクレオシド間結合は、米国特許第５２５６７７５号明細書又は米国特許第５３６６８７８号明細書に記載のように調製することができる。アルキルホスホノチオエートヌクレオシド間結合は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号明細書（それぞれ、国際公開第９４／１７０９３号パンフレット及び国際公開第９４／０２４９９号パンフレットそれぞれとして公開されている）に記載のように調製することができる。３'−デオキシ−３'−アミノホスホロアミデートヌクレオシド間結合は、米国特許第５４７６９２５号明細書に記載のように調製することができる。リン酸トリエステルヌクレオシド間結合は、米国特許第５０２３２４３号明細書に記載のように調製することができる。ボラノリン酸ヌクレオシド間結合は、米国特許第５１３０３０２号明細書及び第５１７７１９８号明細書に記載のように調製することができる。

限定されないがメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、メチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）、及びメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても特定される）を含め１つ又はそれ以上の非リン含有ヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物、並びに例えば交互ＭＭＩ及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓ結合を有する混成主鎖オリゴマー化合物は、米国特許第５３７８８２５号明細書、第５３８６０２３号明細書、第５４８９６７７号明細書、第５６０２２４０号明細書及び第５６１０２８９号明細書に記載のように調製することができる。

ホルムアセタール及びチオホルムアセタールヌクレオシド間結合は、米国特許第５２６４５６２号明細書及び第５２６４５６４号明細書に記載のように調製することができる。エチレンオキシドヌクレオシド間結合は、米国特許第５２２３６１８号明細書に記載のように調製することができる。

オリゴマー化合物の単離及び精製
制御多孔質ガラス固体支持体又は他の支持媒体から切断し、濃水酸化アンモニウム中で、５５℃で１２−１６時間脱ブロックキングの後に、３倍を超える容量のエタノールを用いて１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃから沈殿させることにより、オリゴマー化合物（限定されないがオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドを含む）を回収する。合成したオリゴマー化合物を、エレクトロスプレー質量分析法（分子量決定）及びキャピラリーゲル電気泳動で分析する。合成で得られたホスホロチオエート結合とホスホジエステル結合の相対量を、−１６ａｍｕ生成物（＋／−３２＋／−４８）に対する補正分子量の比により決定する。幾つかの試験のために、オリゴマー化合物を、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162−18171に記載のようにＨＰＬＣで精製する。ＨＰＬＣ精製物質を用いて得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製物質を用いて得られた結果にほぼ類似している。

実施例１
化合物１１の調製（スキーム１）
化合物１を、Steffensら, Helvetica Chimica Acta, 1997, 80, 2426-2439により公表された手順に従って調製する。臭素化し、次いで臭素を弗素交換することにより化合物４を得、これをＣＨ_２Ｉ_２とジエチル亜鉛を用いてシクロプロパン５に転化させる。次いで、化合物５を、エノールエーテル６に転化させ、これをＮＩＳ介在ヌクレオシド化に供し、ラジカル還元後に高立体選択的方法でヌクレオシド８を得る。標準的な手順に従って脱シリル化、トリチル化及びホスフィチル化して、核酸塩基チミンを含有するホスホロアミダイト１１を得、これをその後にオリゴヌクレオチド合成に使用した。
スキーム１：

実施例２
化合物１８の調製（スキーム２）
化合物１８は、実施例１由来の化合物８から出発して調製する。化合物８の塩基を、２工程でトリアゾリド１２を経由して５−メチルシトシン含有ヌクレオシド１３に転化させ、次いでこれをベンゾイル化することにより塩基保護して、３’ＴＭＳ基の存在又は不存在それぞれによってのみ相違する２つの化合物１４及び１５に導く。次いで、化合物１４及び１５の両方を、実施例１と同様にシリル脱保護し、トリチル化し、ホスフィチル化してホスホロアミダイト１８を得る。
スキーム２：

実施例３
化合物３１の調製（スキーム３）
公知化合物１９を、メトキシ基のルイス酸介在脱離によってエノールエーテル２０に転化させる。脱シリル化し（→２１）、得られるヒドロキシ基を、無水酢酸を用いて再保護した後に、化合物２２を得、これをセレクトフルオル（selectfluor）(商標）を用いて弗素化して弗素置換基をリボ配置（２３）又はアラビノ配置（２４）のいずれかで有する２つの糖構成要素をほぼ１：１の混合物として得た。次いで、化合物２４を、アセトキシ誘導体２５を経由してブロモアセタール２６に転化させた。これは、アセテート２５がヌクレオシド化に十分に反応しないので必要であった。ブロモアセタール２６を、その場でペルシリル化チミンで処理し、ヌクレオシド２７を得た。これは、１：２．５のα，β比の分離不可能なアノマー混合物として得られた。ヌクレオシド２７の保護基を除去して、標準的なクロマトグラフィーで分離することができる遊離のヌクレオシド２８及び２９に導いた。β−ヌクレオシド２９を標準的な方法でさらにトリチル化して化合物３０を得、これを最終的にホスフィチル化してオリゴヌクレオチド合成で使用できる状態のホスホロアミダイト構成要素３１を得た。
スキーム３:

実施例５
化合物３６の調製（スキーム４）
ホスホロアミダイト３６の合成は、リボ配置のフルオロ置換基を示す糖２３を用いて開始した。化合物２３を、ヌクレオシド化のためにアセチル化を経由して調製してアセテート３２を得た。その後にＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ法によるアセテート３２のヌクレオシド化により、高選択性（α：βが１ : １２）を有するヌクレオシド３３を得た。次いで、ヌクレオシド３３を脱保護し（→３４）、標準的なトリチル化（→３５）及びホスフィチル化によってホスホロアミダイト構成要素３１に転化させた。
スキーム４：

実施例６
オリゴマー化合物の調製
当分野で周知の合成手順（その幾つかは本明細書において例証される）に従って、ＤＭＴホスホロアミダイトなどの実施例で例証されるホスホロアミダイト化合物（化合物１１、化合物１８、化合物３１又は化合物３６参照）の１つ又はそれ以上を使用して、少なくとも１個の三環式ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物を調製した。

実施例７
Ｔｍ試験用のオリゴマー化合物の調製（表１）
標準的な自動ＤＮＡ合成プロトコールに従って、Ｔｍ試験用の１個又はそれ以上の三環式ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物を調製した。固体支持体から切断した後に、オリゴマー化合物を、標準的な手順を使用してイオン交換ＨＰＬＣで精製し、ＬＣＭＳで分析した。修飾１０ｍｅｒオリゴマー化合物のＴｍを、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかと二重鎖形成させた場合の未修飾１０ｍｅｒＤＮＡオリゴヌクレオチドと比較した。Ｔｍは、Ｃａｒｙ １００ Ｂｉｏ分光計を使用して決定し、Ｃａｒｙ Ｗｉｎ ＵＶサーマルプログラムを使用して吸光度対温度を測定した。Ｔｍ実験用に、オリゴマー化合物を、ｐＨ７の１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの緩衝液中１．２μＭの濃度で調製した。８５℃で決定された濃度は、同じ容量の選択したオリゴマー化合物と相補的ＲＮＡ又はＤＮＡとを混合した後に１．２μＭであった。オリゴマー化合物は、二重鎖を９０℃で５分間加熱し、次いで室温に冷却することによって相補的ＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズさせた。Ｔｍ測定値は、二重鎖溶液をキュベット中で、１５℃で開始して温度が８５℃になるまで０．５℃／分の速度で加熱しながら分光光度計を使用して採取した。Ｔｍ値は、二重鎖に関連した最小吸光度と非二重鎖一本鎖に関連した最大吸光度とをプログラムに手動で組み込んだ、非自己相補配列を使用するファントホッフ計算（Ａ_２６０対温度曲線）を使用して測定した。

未修飾オリゴマー化合物Ａ０１のＴｍは、ＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖形成させるとそれぞれ４３．５℃及び４５．１℃である。完全修飾オリゴマー化合物Ａ０５のＴｍは、ＤＮＡ及びＲＮＡと二重鎖形成させるとそれぞれ５５.０℃及び６６.２℃である。未修飾オリゴマー化合物Ａ１５のＴｍは、ＤＮＡ及びＲＮＡと二重鎖形成させるとそれぞれ４５.６℃及び４２.２℃である。完全修飾二重鎖Ａ０５−Ａ０８は、５’−ホスホリル化されている。Ａ０５−Ａ０８を含有する二重鎖のΔＴｍ／修飾は、Ａ０５を基準とする。Ａ０２−Ａ０４及びＡ０９−Ａ１４のΔＴｍ／修飾は、Ａ０１を基準とする。それぞれのヌクレオシド間結合基は、ホスホジエステルである。下付き文字が付いていないそれぞれのヌクレオシドは、 β−Ｄ−２'−デオキシリボヌクレオシドであり、下付き文字「ａ」又は「ｂ」又は「ｃ」又は「ｄ」が付いたそれぞれのヌクレオシドは、以下に定義するとおりである。ΔＴｍデータから、６'−弗素化ヌクレオシド（サブタイプｂ）及び２'−フルオロリボヌクレオシド（サブタイプｃ）は、修飾当たり＋１.６〜＋３.１℃のΔＴｍを示して相補的ＤＮＡとの二重鎖形成を安定化させ、修飾当たり＋０.４〜＋３.４℃のΔＴｍを示して相補的ＲＮＡとの二重鎖形成を安定化させることが明らかになる。トリシクロ−ＤＮＡ主鎖（Ａ０５−Ａ０８）内で、Ｃ６’の弗素原子は、相補的ＲＮＡとの二重鎖を、同じ位置の水素原子と比べて修飾当たり最大＋０．７℃まで安定化させることができる（Ａ０７対Ａ０６）。この安定化は、配列依存性である。相補体としてＤＮＡを用いると、Ｃ６’の弗素の効果は、わずかに不安定化しつつある。単一のアラビノフルオロヌクレオシド残基（下付き文字ｄ）は、修飾当たり−２.７〜−４.５℃のΔＴｍを示して相補的ＤＮＡとの二重鎖を不安定化させ、修飾当たり−２.５〜−４.７℃のΔＴｍを示して相補的ＲＮＡとの二重鎖を不安定化させる。しかし、５個の連続するアラビノフルオロ残基を含有する配列（Ａ１６）は、＋０.６のΔＴｍ／修飾で相補的ＲＮＡとの二重鎖を安定化させる。

実施例８
ｍｄｘマウス由来の初代ｍｄｘ細胞におけるエキソン２３スキッピング用のオリゴマー化合物の調製及び分析
４つのオリゴヌクレオチド１５ｍｅｒ（Ａ２０−Ａ２３）を合成した（表２）：
表２：
下付き文字「ａ」又は「ｂ」の付いたそれぞれのヌクレオシドは、実施例７のように定義される。 全てのオリゴヌクレオチドＡ２０−Ａ２３は、５’末端にリン酸単位（ｐ）を有する。Ａ２０及びＡ２２は、全てリン酸（ＰＯ）ヌクレオシド間結合を有し、一方オリゴヌクレオチドＡ２１及びＡ２３は、全てホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合を有する。オリゴヌクレオチドＡ２０及びＡ２１において、Ｃは塩基シトシンを指し、これに対してオリゴヌクレオチドＡ２２及びＡ２３において、Ｃは塩基５’メチルシトシンを指す。

ｍｄｘマウスは、ヒト遺伝病デュセンヌ筋ジストロフィーのモデルに相当する。それは、未成熟停止コドンを生じさせるマウスジストロフィン遺伝子のエキソン２３の変異を含有する。その結果として、機能的ジストロフィンｍＲＮＡ及びジストロフィンタンパク質は、生成されない。エキソン２３のエキソン／イントロン連結部に結合させるために設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、ｍＲＮＡスプライシング中にエキソン２３のスキッピングを招き、このようにしてマウスジストロフィンタンパク質の機能的変異を招くことは、当分野で公知である（Luら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102, 198-203）。

Ａ２０−Ａ２３のエキソンスキッピング可能性を試験するために、ｍｄｘ初代細胞（ｍｄｘマウス）に、トランスフェクション試薬（ジムノシス）なしで、５０μｇ（約９ナノモル）のそれぞれのオリゴヌクレオチドＡ２０−Ａ２３を移入した。トランスフェクション後４日目に、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出した。エキソン２３（ＥＸ２０Ｆ／Ｅｘ２６Ｒ）の周りのＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＰＣＲを行い、生成物をゲル電気泳動で分析した（図１）。オリゴヌクレオチドＡ２１及びＡ２３は、実質的なエキソンスキッピングを示す。定性的に、フルオロオリゴヌクレオチドＡ２３を用いたスキッピングは、Ａ２１（弗素置換基を含有していない）と比べてわずかに優れている。

ネステッドＰＣＲ後のｍｄｘジストロフィンＲＮＡのエキソン２０−エキソン２６の領域に相当するＰＣＲフラグメントのアガロースゲルを示す。遅い移動バンドは、非スキップＲＮＡ（エキソン２０を含む）に対応し、一方速い移動バンドは、スキップ（エキソン２０が除かれている）ＲＮＡに相当する。

Claims (16)

1. 一般式Ｉ：
   
   〔式中：
   Ｂｘは、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、又は置換プリンであり、
   Ｔ１及びＴ２のうちの１つは、ヒドロキシル（−ＯＨ）又は保護されたヒドロキシルであり、Ｔ１及びＴ２のうちの残りは、リン酸基又は反応性リン基であり、
   ｑ _３ は、Ｆであり、
   ｑ_１、ｑ_２ 、ｑ _４、ｑ _５ は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌから選択され、
   ｚ^１及びｚ^２のうちの１つは、Ｈ又はＦであり、ｚ^１及びｚ^２のうちの残りは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃｌ、ＯＣＨ_３、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＦ_３、ＯＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_２−ＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)ＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２又はＯＣＨ_２−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ_２である〕
   で表される三環式ヌクレオシド。
2. Ｂｘがウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン又はグアニンである、請求項１に記載の三環式ヌクレオシド。
3. Ｔ^１がヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり、及びＴ^２が、Ｈ−ホスホネート又はホスホロアミダイトから選択される反応性リン基である、請求項１又は２に記載の三環式ヌクレオシド。
4. Ｔ^１が４，４’−ジメトキシトリチルであり、Ｔ^２がジイソプロピルシアノエトキシホスホロアミダイトである、請求項１から３の何れか一項に記載の三環式ヌクレオシド。
5. ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２のうちの１つ又は２つがＦであり、ｑ_３、ｑ_４、ｑ_５、ｚ^１及びｚ^２の残りがＨである、請求項１から４の何れか一項に記載の三環式ヌクレオシド。
6. 
   （式中、Ｂｘは、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン及びグアニンから選択される）
   の群から選択される三環式ヌクレオシド。
7. 式ＩＩ：
   
   を有する少なくとも１つの三環式ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物であって、式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシドについて独立して、
   Ｂｘが、ピリミジン、置換ピリミジン、プリン、又は置換プリンであり、
   Ｔ _３ 及びＴ _４ のうちの１つが、式ＩＩの前記三環式ヌクレオシドを前記オリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ_３及びＴ_４の残りが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、５’もしくは３’末端基、又は前記三環式ヌクレオシドを前記オリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、
   ｑ _３ がＦであり、
   ｑ_１、ｑ_２ 、ｑ _４、ｑ _５ が、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌから選択され、
   ｚ^１及びｚ^２のうちの１つがＨ又はＦであり、ｚ^１及びｚ^２のうちの残りが、Ｈ、−ＯＨ、Ｃｌ、ＯＣＨ_３、ＯＣＦ_３、ＯＣＨ_２ＣＨ_３、ＯＣＨ_２ＣＦ_３、ＯＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｏ(ＣＨ_２)_２−ＯＣＨ_３、Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｏ(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)ＣＨ_３、ＯＣＨ_２Ｃ(＝Ｏ)−Ｎ(Ｈ)−(ＣＨ_２)_２−Ｎ(ＣＨ_３)_２又はＯＣＨ_２−Ｎ(Ｈ)−Ｃ(＝ＮＨ)ＮＨ_２であり、
   前記オリゴマー化合物が８−４０個のモノマーサブユニットを含む、オリゴマー化合物。
8. それぞれのＢｘが、独立して、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン又はグアニンである、請求項７に記載のオリゴマー化合物。
9. それぞれのヌクレオシド間結合基が、独立して、ホスホジエステルヌクレオシド間結合基又はホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である、請求項７又は８に記載のオリゴマー化合物。
10. それぞれのヌクレオシド間結合基がホスホロチオエートヌクレオシド間結合基である、請求項７から９の何れか一項に記載のオリゴマー化合物。
11. 式ＩＩを有する少なくとも２個の連続した三環式ヌクレオシドを有する第１の領域を含む、請求項７から１０の何れか一項に記載のオリゴマー化合物。
12. 少なくとも２個の連続したモノマーサブユニットを有する第２の領域を含み、前記第２の領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、前記第１の領域の式ＩＩの三環式ヌクレオシドと異なる修飾ヌクレオシドである、請求項１１に記載のオリゴマー化合物。
13. 前記第１の領域と前記第２の領域の間に配置された第３の領域をさらに含み、前記第３の領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、独立して、前記第１の領域の式ＩＩのそれぞれの三環式ヌクレオシド及び前記第２の領域のそれぞれのモノマーサブユニットと異なるヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドである、請求項１２に記載のオリゴマー化合物。
14. １−５個の連続したモノマーサブユニットの外部領域が両側に隣接して配置されている６−１４個の連続したモノマーサブユニットの内部領域を有するギャップ導入オリゴマー化合物を含み、それぞれの外部領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、式ＩＩの三環式ヌクレオシドであり、前記内部領域のそれぞれのモノマーサブユニットが、独立して、ヌクレオシド又は修飾ヌクレオシドである、請求項７から１３の何れか一項に記載のオリゴマー化合物。
15. 
    （式中、Ｔ^３及びＴ^４ のうちの１つが、ヌクレオチドブロックをオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、Ｔ ^３ 及びＴ ^４ の残りが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、５’もしくは３’末端基、又はヌクレオシドブロックをオリゴマー化合物に結合するヌクレオシド間結合基である）
    からなる群から選択される少なくとも１個のヌクレオチドブロックを含む、請求項７から１４の何れか一項に記載のオリゴマー化合物。
16. 請求項１から６の何れか一項に記載の三環式ヌクレオシドの使用を含む、オリゴヌクレオチドの固相合成方法。